KR20040041418A

KR20040041418A - 설폰아미드계 유도체를 함유하는 혈관신생 억제제

Info

Publication number: KR20040041418A
Application number: KR1020020069779A
Authority: KR
Inventors: 박정환; 이호정; 주학규; 이지현; 한선애; 윤엽; 정경환; 박두홍
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2002-11-11
Filing date: 2002-11-11
Publication date: 2004-05-17

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 함유하는 혈관신생 억제제에 관한 것이다. 상기 설폰아미드계 화합물은 시험관내(in vitro)인 내피세포에서 혈관신생 과정인 망상의 튜브 구조의 생성을 현저히 저해하고, 생체내(in vivo) 조건에서 융모요막의 혈관신생 및 쥐의 동맥단편으로부터의 미세혈관의 신생을 억제할 뿐 만 아니라, 전이성 암의 억제 및 고체 종양의 성장을 저해함으로써, 암 전이억제제 또는 항암제로서 유용하다.

화학식 1

(상기식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, X₁및 X₂는 명세서에서 정의한 바와 같다)

Description

설폰아미드계 유도체를 함유하는 혈관신생 억제제{ANGIOGENESIS INHIBITOR CONTAINING SULFONAMIDE DERIVATIVES}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제로서의 용도에 관한 것이다.

(상기식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, X₁및 X₂는 하기에서 정의한 바와 같다.)

신생혈관 생성(angiogenesis)은 이미 존재하는 혈관의 내피 세포 또는 순환하는 내피 간세포(endothelial progenitor cell)로부터 새로운 혈관을 생성하는 생물학적 과정이다. 예를 들어, 태아와 배아의 발달 및 황체, 자궁내막과 태반의 형성과정에서 신생혈관 생성이 매우 중요한 역할을 담당한다. 따라서 이러한 신생혈관의 생성은 여러 가지 조절인자에 의해 엄격하게 조절되는데, 구체적으로는 신생혈관생성 자극인자의 상향조절(up-regulation)과 억제인자의 하향조절(down-regulation)사이의 전체적인 균형에 의해 이루어진다고 보고되어 있다[Folkman,J., Nature Med., 1995,1, 27-31].

그러나 신생혈관생성 과정이 균형을 잃게 되면, 당뇨성 망막병증, 건선, 각종 암 등의 병리학적 장애가 유발될 수 있다고 알려져 있다[Folkman,J., Nature Med., 1995, 1, 27-31].

혈관신생의 과정은 암세포의 초기 증식단계에서 반드시 일어나게 되며, 특히 고체 종양의 성장 및 전이에는 혈관신생이 반드시 일어나게 된다. 그 이유는 통상적으로 고체 종양의 크기가 1∼2 mm³까지는 성장에 필요한 각 성분들을 단순 확산(diffusion)에 의해 공급받을 수 있으나, 그 이상으로 성장하기 위해서는 새로운 혈관을 형성해서 필요한 성분을 공급받아야 하기 때문이다. 따라서, 신생혈관과정에서 생성된 혈관들은 암세포의 성장에 있어 필수적인 산소, 영양분, 성장인자(growth factor) 등을 공급함으로써, 암세포들의 기하급수적인 성장을 가능하도록 한다. 또한 생성된 혈관들은 암세포들이 다른 기관으로 전이되는 통로 역할을 함으로써, 암의 치료를 불가능하게 하는 원인이 되기도 한다.

그러나, 종양이 존재한다 하더라도, 신생혈관생성의 활성이 억제되거나 제거되면, 종양은 더 이상 성장할 수 없게 된다. 이러한 신생혈관생성과정의 억제는 신생혈관생성에 관여하는 상향조절인자(positive regulator)의 발현 및 활성을 저해하거나 또는 하향조절인자 (negative regulator)의 발현 및 활성을 증가시키면, 실험적인 종양(experimental tumor)을 지연시키거나 퇴화시킬 수 있다. 또한, 종양의 발병 상태에서의 신생혈관생성의 저해는 신규 미세혈관의 침윤에 의해 발생되는 손상을 효과적으로 막을 수 있다. 그러므로 신생혈관생성 과정을 조절함으로써 종양의 폐기나 완화까지도 가능할 것이다.

이밖에도, 메트릭스 메탈로프로테이나제들(MMPs)이 과발현되거나 과활성화되면 고체 종양의 침윤, 전이, 생장에 관여하여 각종 질병이 야기되고, 관절염, 류마티즘과 같은 비종양성 질환도 유발된다[R. P. Beckett, et al.,Recent Advances in Matrix Metalloprotease Inhibitor Research, Research Focus, 1996,1, 16-26; Beeley et al.,Curr. Opin. Ther. Patents,4(1):7-16].

상기 메트릭스 메탈로프로테이나제들(MMPs)은 세포의 기질을 분해하는 기능을 가진 효소 집단으로서, 약 20 여가지가 존재한다. 이들은 모두 Zn²⁺이온과 결합하는 활성부위를 갖으며, 비활성형의 자이모겐(zymogen)인 프로-메트릭스메탈로프로테이나제(pro-MMP) 형태로 분비된 후, 프로-펩타이드 부위가 잘려나가는 활성화 과정을 거치면서 단백질 분해능을 가지게 된다. 각각의 메트릭스 메탈로프로테이나제는 그들이 분해하는 기질과 세포막에서의 위치에 따라 콜라게나아제(collagenase), 젤라티나아제(gelatinase), 마트릴리신(matrilysin) 및 스트로멜리신(stromelysin) 등의 효소군으로 분류된다. 또한 상기 효소들은 섬유아세포, 단핵세포, 내피세포 및 종양세포에서 발견되거나, 그와 관련된 결합조직이나 종양 주위의 정상기질에서 많이 발견된다[Egeblad et. al.,Nature Rev. Cancer2002,2, 161-174].

이러한 메트릭스 메탈로프로테이나제들은 정상적인 조건에서는 매우 엄격히 조절된다. 그러나 메트릭스 메탈로프로테이나제들의 과발현 및 과활성화된 조건에서는 암세포 주위의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 분해시키고, 종양 조직과 주위 정상조직과의 인접부위에서 방어막으로 작용하는 기저막(basement membrane)을 용해시켜 암세포로 하여금 침윤(invasion)이 가능하게 할 뿐 아니라, 암세포의 성장과 전이(metastasis)에 반드시 수반되는 신생혈관생성(angiogenesis)에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다[Lisa M. et al.,Science, 2002,295,2387-2392]. 특히 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-1)과 젤라티나아제인 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)는 신생혈관생성 단계에 필수적인 역할을 한다[Heppner, G., et al.,Biochim. Biophys. Acta,1983,695(3-4), 215-226].

상기에서 언급하였듯이, 메트릭스 메탈로프로테이나제의 과발현이나 과활성화에 의해 유발되는 각종 질병들은 신생혈관생성의 불균형에 의해 야기되는 질병들과도 무관하지 않다. 그의 일례로서, 류마티즘, 골관절염, 패혈성 관절염, 각막궤양, 창상 치유 이상, 골질환, 단백뇨, 대동맥계통 질환, 외상성 관절 손상 이후의 퇴행성 연골 손실, 골감소증, 중추신경계통의 염증성 질환, 피부 노화, 건선, 모세관 확장증, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부질환, 간경화증, 신장의 사구체 질환, 태아막의 조기 파괴, 염증성 장 질환, 치주 질환, 당뇨병성 망막증, 증식 유리체 망막증, 미숙아 망막증, 안구 염증, 원추 각막, 근시, 안구 종양, 안구 혈관 형성 및 각막이식편거부 등을 들 수 있다[Damato R. et al.,Ophthalmology., 1995,102(9): 1261-1262, Arbiser J. et al.,J Am Acad Dermatol., 1996,34(3), 486-497; Hanahan D. et al.,Cell, 1996,86(3): 353-364].

최근에는 메트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제를 사용함으로써 천식을 치료하거나[Lee Y. et al.,J. Allergy Clin. Immunol., 2001,108(6), 1021-1026], 급성간염에 의해 유발되는 쇼크사의 위험성을 줄일 수 있다는 결과도 보고되었다[Wielockx. B. et al.,Nat. Med.2001,7(11), 1202-1208].

현재까지 연구되고 있는 메트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제로는 설폰아미드계 유도체들이 주종을 이루고 있으며, 설폰아미드계 유도체는 메트릭스 메탈로프로테이나제의 활성부위에 직접 결합하여 그들의 활성을 억제하며, 특히 신생혈관생성 과정에 필수적으로 관여하는 MMP-1, MMP-2, 및 MMP-9에 선택적으로 작용한다고 알려져 있다[대한민국특허출원 제2000-18328호 및 대한민국특허출원 제2000-18431호].

그러나, 기출원된 설폰아미드 유도체들은 시험관내(in vitro) 조건에서 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 활성을 선택적으로 억제하는 것으로 보고되었을 뿐, 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 조건에서, 메트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제인 설폰아미드계 화합물들이 실질적으로 신생혈관생성을 억제한다는 보고는 없었다.

따라서, 본 발명자들은 메트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제인 설폰아미드 유도체들의 기능을 적용하여 신규한 용도를 얻고자 노력한 결과, 시험관내(in vitro)인 내피세포에서 혈관신생 과정인 망상의 튜브 구조의 생성을 현저히 저해할 뿐만 아니라, 생체내(in vivo) 조건에서 융모요막의 혈관신생 및 쥐의 동맥단편으로부터의 미세혈관의 신생을 억제하고 전이성 암의 억제 및 고체 종양의 성장을 저해한다는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 화학식 1a∼화학식 1d의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제로서 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 설폰아미드계 유도체가 HT1080 세포의 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(Matrix metalloproteinase-2; 이하 "MMP-2"라고 한다) 및 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP-9)의 활성에 미치는 영향을 나타낸 사진이며,

a : DMSO로 처리한 대조군,

b : 화학식 1a의 화합물(10 μM)로 처리한 실험군,

c : 화학식 1b의 화합물(10 μM)로 처리한 실험군,

d : 화학식 1c의 화합물(10 μM)로 처리한 실험군,

e : 화학식 1d의 화합물(10 μM)로 처리한 실험군,

도 2a는 용매인 DMSO를 사람의 제대혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell; 이하 "HUVEC"라고 한다)에 처리한 후, 혈관의 혈관신생 과정인 망상의 관(tube) 구조 형성을 관찰한 사진이며,

도 2b는 본 발명의 화학식 1a의 화합물을 HUVEC에 처리한 후, 혈관신생 과정인 망상의 관 구조 형성을 관찰한 사진이며,

도 2c는 본 발명의 화학식 1b의 화합물을 HUVEC에 처리한 후, 혈관신생 과정인 망상의 관 구조 형성을 관찰한 사진이며,

도 2d는 본 발명의 화학식 1c의 화합물을 HUVEC에 처리한 후, 혈관신생 과정인 망상의 관 구조 형성을 관찰한 사진이며,

도 2e는 본 발명의 화학식 1d의 화합물을 HUVEC에 처리한 후, 혈관신생 과정인 망상의 관 구조 형성을 관찰한 사진이며,

도 3a는 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane)에서의 혈관신생효과를 관찰하기 전, 용매인 식염수로 처리한 대조군이며,

도 3b는 본 발명의 화학식 1b의 화합물로 처리하여 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane)에서의 혈관신생 효과를 관찰한 사진이며,

도 4a는 본 발명의 설폰아미드계 유도체에 의한 쥐 동맥의 단편으로부터의 미세혈관신생을 관찰하기 전, DMSO로 처리한 음성대조군이며,

도 4b는 본 발명의 설폰아미드계 유도체에 의한 쥐 동맥의 단편으로부터의 미세혈관신생을 관찰하기 전, 양성대조군이며,

도 4c는 본 발명의 화학식 1a의 화합물 처리에 의한 쥐 동맥의 단편으로부터의 미세혈관신생을 관찰한 결과이며,

도 4d는 본 발명의 화학식 1b의 화합물 처리에 의한 쥐 동맥의 단편으로부터의 미세혈관신생을 관찰한 결과이고,

도 4e는 본 발명의 화학식 1d의 화합물 처리에 의한 쥐 동맥의 단편으로부터의 미세혈관신생을 관찰한 결과이며,

도 5a는 B16-F10 멜라노마(melanoma) 세포가 주입된 쥐를 0.1% Tween-80이 첨가된 식염수만으로 매일 복강 투여한, 쥐의 폐 사진이며,

도 5b는 화학식 1b의 화합물로 매일 복강 투여 처리하여 B16-F10 멜라노마(melanoma) 세포의 전이를 관찰한, 쥐의 폐 사진이며,

도 6a는 루이스 폐 종양세포가 이식된 쥐를 0.1% 트윈-80이 첨가된 식염수만을 매일 복강 투여한 경우이며,

도 6b는 화학식 1b의 화합물을 처리하여 고체 종양의 성장을 관찰한 것이며,

도 6c는 루이스 폐 종양세포가 이식된 쥐에 0.1% 트윈-80이 첨가된 식염수만을 투여한 대조군과 화학식 1b의 화합물을 투여한 실험군의 고체 종양 성장을 비교한 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제로서의 용도를 제공한다.

화학식 1

(상기 식에서,

R₁은 수소, C₁-C₁₂의 알킬, 카보싸이클로아릴-저급알킬, C₃-C₇의 싸이클로알킬, C₃-C₇의 싸이클로알킬-저급알킬, (옥소, 아미노, 또는 티오)C₃-C₇의 싸이클로알킬, (옥소, 아미노, 또는 티오)C₃-C₇의 싸이클로알킬-저급알킬, C₂-C₁₂의 저급알케닐, C₂-C₁₂의 저급알키닐, 카보싸이클릭아릴, 헤테로싸이클릭아릴, 헤테로싸이클릭아릴-저급알킬, 비아릴, 할로저급알킬, 비아릴-저급 알킬아릴알킬, 히드록시-저급알킬, 알콕시알킬, 아실옥시-저급알킬, 알킬 또는 아릴(티오, 설피닐, 설포닐) 저급알킬, (아미노, 모노 또는 디 알킬아미노)저급알킬, 아실아미노 저급알킬, (N-저급알킬-피페라지노, 또는 N-카보싸이클릭 또는 헤테로싸이클릭 아릴-저급알킬피페라지노) 저급알킬 또는 (모포리노, 티오모포리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페리딜) 저급알킬이고;

R₂는 수소, C1-12의 알킬, 카보싸이클릭 아릴-저급알킬, C3-7의 싸이클로알킬, C3-7의 싸이클로알킬-저급알킬, (옥소, 아미노, 또는 티오)C₃-C₇의 싸이클로알킬, (옥소, 아미노, 또는 티오)C₃-C₇의 싸이클로알킬-저급알킬, 카보싸이클릭아릴, 헤테로싸이클릭아릴, 헤테로싸이클릭아릴-저급알킬, 비아릴, 할로저급알킬, 비아릴-저급알킬아릴알킬, 히드록시-저급알킬, 알콕시알킬, 아실옥시-저급알킬, 알킬 또는 아릴 (티오, 설피닐, 또는 설포닐) 저급알킬, (아미노, 모노 또는 디 알킬아미노) 저급알킬, 아실아미노-저급알킬, (N-저급알킬-피페라지노, N-카복싸이클릭 또는 헤테로싸이클릭 아릴-저급알킬-피페라지노)-저급알킬 또는 (모포리노, 티오모포리노, 피페리디노, 피롤리디노, 또는 피페리딜)-저급알킬이며,

R₃는 α-아미노산의 잔기로서, 수소, C₁-C₄의 카보싸이클릭아릴-저급알킬, C₁-C₄의 헤테로싸이클릭아릴-저급알킬, C₁-C₅의 알콕시페닐-저급알킬, C₁-C₅의 알켄옥시페닐-저급알킬 또는 C₁-C₅알킨옥시페닐-저급알킬이며;

R₄는 Zn에 결합할 수 있는 작용기인-OH, -NHOH, 또는 OR₅(이때, R₅는 C₁-₆의 저급알킬,t-부틸, 벤질 또는 실릴기이다)이고; 및,

X₁및 X₂는 S 또는 O이다.

상기 설폰아미드계 화합물 중에서 바람직하게는

R₁은 C₁-C₁₂의 알킬, C₃-C₇의 싸이클로알킬, 및 C₃-C₇의 싸이클로알킬-저급알킬이고,

R₂는 수소, 또는 (옥소, 아미노, 또는 티오)C₃-C₇의 싸이클로알킬이고,

R₃는 C₁-C₄의 알킬, 또는 C₁-C₄의 헤테로싸이클릭아릴-저급알킬이고,

R₄는 -OH, 또는 -NHOH이고,

X₁및 X₂는 S 또는 O인 것이다.

특히, 하기 화학식 1a ∼ 화학식 1d의 화합물이 가장 바람직하다.

도 1은 본 발명의 화학식 1a∼1d의 화합물이 혈관신생과정 및 암세포의 전이또는 침윤에 중요한 역할을 하는 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(Matrix metalloproteinase-2; 이하 "MMP-2"라고 한다) 및 메트릭스메탈로프로테이나제(MMP-9)의 활성에 미치는 영향을 관찰한 것이다. 상기 결과, 본 발명의 설폰아미드계 화합물 모두 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 저해한다.

본 발명의 설폰아미드계 화합물이 혈관신생억제 효과가 있는지를 시험관내(in vitro)에서 관찰한 결과, 용매 처리된 대조군과 비교할 때, 화학식 1a ∼ 1d의 화합물로 처리하면 혈관신생 과정인 망상의 관(tube) 구조의 생성이 뚜렷이 저해됨을 알 수 있다(도 2a ∼ 도 2e).

또한, 본 발명의 화학식 1a ∼ 1d의 화합물이 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane) 분석방법(도 3a ∼ 도 3b) 및 쥐의 동맥 절편으로부터의 미세혈관 생성 방법(rat aortic ring assay) (도 4a ∼ 도 4e)을 통해 생체 내(in vivo)에서 관찰한 결과, 혈관신생을 억제한다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1a ∼ 1d의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제를 제공한다.

상기 화학식 1a ∼ 1d의 설폰아미드계 화합물이 혈관신생 억제 활성과 더불어 암 전이억제제 또는 항암제로서의 활성을 가지고 있는지를 생체 내(in vivo)에서 입증하는데 목적이 있다.

그 결과, 종양세포의 전이를 억제하는지 여부를 B16-F10 멜라노마 세포를 마우스의 꼬리정맥에 주입하여 폐에 전이된 콜로니의 개수를 통해 확인하였으며(도 5a ∼ 도 5b), 루이스 폐 종양세포(LLC)를 마우스의 피하에 이식하여 만든 고체 종양의 생장이 억제됨을 확인할 수 있다(도 6a ∼ 도 6c).

나아가, 본 발명의 설폰아미드계 화합물은 혈관신생의 불균형으로 인한 각종 질병의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 혈관신생의 불균형으로 인한 질병의 일례로는 류마티즘, 골관절염, 패혈성 관절염, 각막궤양, 창상 치유 이상, 골질환, 단백뇨, 대동맥계통 질환, 외상성 관절 손상 이후의 퇴행성 연골 손실, 골감소증, 중추신경계통의 염증성 질환, 피부 노화, 건선, 모세관 확장증, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부질환, 간경화증, 신장의 사구체 질환, 태아막의 조기 파괴, 염증성 장 질환, 치주 질환, 당뇨병성 망막증, 증식 유리체 망막증, 미숙아 망막증, 안구 염증, 원추 각막, 근시, 안구 종양, 안구 혈관 형성 및 각막이식편거부가 있다.

본 발명의 화학식 1a ~ 1d의 설폰아미드계 화합물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법이 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1a, 화학식 1b, 화학식 1c, 및 화학식 1d를 포함하는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제호는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화합물 중에서 선택된 최소의 하나를 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 화학식 1a ~ 1d의 화합물의 경우, 1회 투여시 10 ∼ 100 mg/kg 이다. 또한, 상기 각 화합물은 하루 1 ∼ 3 회 투여될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 설폰아미드계 화합물을 임상에 적용하기 위하여 실험용 생쥐에 대한 독성실험을 수행한 결과, 독성변화는 관찰되지 않았고 경구 투여 최소 치사량인 (LD₅₀)은 0.5 g/kg 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하여 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 메트릭스 메탈로프로테이나제의 활성에 미치는 효과

본 발명의 화학식 1a ∼ 1d의 화합물이 혈관신생과정 및 암세포의 전이또는 침윤에 중요한 역할을 하는 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

사람의 HT1080(fibrosarcoma) 세포 1 ×10⁶개를 60 mm 배양접시에 심고, 혈청(serum)이 없는 DMEM 배양액으로 갈아준 후, 포화습도를 유지하는 37℃, 5% CO₂배양기에서 24 시간 배양하여 얻은 배양액(conditioned media)으로 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 실시하였다. 전기영동을 위한 젤로서, 0.1%의 젤라틴이 포함된 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)을 사용하였다. 상기 배양액을 젤에 올린(loading) 후, 120 볼트로 약 4시간 동안 전기영동을 실시하였다. 단백질의 분리가 끝나면 젤을 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 2.5% Triton X-100, 및 1 uM ZnCl₂로 구성된 완충용액으로 상온에서 30 분간 두 번 세척하였다. 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 활성을 조사하기 위하여 50 mMTris-Cl, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.02% NaN₃을 포함하는 배양액에 젤을 담그고 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 이 때, 본 발명의 화학식 1 ∼ 1d의 설폰아미드계 화합물을 상기 배양액에 각각 10 μM씩 첨가 후 반응시켰다. 상기 반응 후 0.5%의 쿠마씨 블루(Coomassie brilliant blue R-250)로 염색 후, 탈색하였다. 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)가 있는 부분은 젤라틴의 분해로 인해 투명하게 보이므로, 실제로 메트릭스 메탈로프로테이나제가 어느 정도 젤에 남아 잔존하는 지의 여부는 염색되지 않고 남아있는 투명한 부분으로 분석할 수 있다.

도 1은 용매인 DMSO로 처리한 대조군 및 화학식 1a ∼ 1d의 화합물 10 μM의 동일한 농도로 처리한 결과이다. 본 발명의 설폰아미드계 화합물 모두 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 저해하였다. 특히 화학식 1a의 화합물은 메트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 억제 효과가 가장 높다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 2> 시험관 내( in vitro )에서 튜브(tube) 생성에 미치는 영향

혈관신생 형성의 한 과정인 망상의 튜브(tube) 구조가 본 발명의 설폰아미드계 화합물의 처리에 따라 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 시험관 내(in vitro)에서 실험하였다.

96 웰 플레이트에 100 ㎕ 씩의 마트리겔(Matrigel)을 분주한 다음, 실온에서15 분, 37℃에서 30 분간 젤(gel)화시켰다. 화학식 1a ∼ 1d의 화합물을 최종 처리농도의 2 배인 10 μM 농도로 함유한 배양액 및 사람의 제대혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC) 2 ×10⁵/㎖를 1:1의 비율로 혼합하였다. 상기 혼합액을 젤(gel)화된 마트리겔(Matrigel)이 깔린 웰 플레이트 상에 100 ㎕씩 넣어, 포화습도를 유지하는 37℃, 5% CO₂배양기에서 24 시간 정도 배양한 후 촬영하였다.

도 2a ∼ 도 2e의 결과에서 볼 수 있듯이, 용매인 DMSO로 처리한 대조군은 튜브(tube)가 끊어지지 않고 잘 형성된 것에 비해(도 2a), 화학식 1a ∼ 1d의 화합물을 동일한 농도로 처리하여 비교한 결과, 혈관신생 과정 인 망상의 튜브(tube) 구조의 생성이 뚜렷이 저해됨을 확인할 수 있었다(도 2b ∼ 2e).

<실험예 3> 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane)의 혈관신생에 미치는 영향

본 발명의 설폰아미드계 화합물이 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane)의 혈관신생에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 생체내 (in vivo) 실험하였다.

상기 실험방법은 수정란을 70% 이상의 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 3일 성장시킨 후, 구멍을 내어 주사기로 알부민 4 ㎖를 뽑았다. 4 일 배가 되면 수정란의 공기주머니가 있는 윗부분에 원형 창을 내고 그 부위는 투명테이프로 막았다. 혈관신생 억제 효과를 알아보기 위하여 터마톡스 커버슬립 (thermatox coverslip)에 화학식 1a, 1b 또는 1d의 화합물을 각각 도포 한 후, 이를 건조시켰다.

이때 대조군으로서, 터마톡스 커버슬립만을 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane; CAM)에 부착시켜 준비하였고, 실험군으로서 상기 커버슬립에 각각의 화합물 1.5 ㎍씩 처리하여 비교하였다. 4.5 일 배가 되면 유리테이프를 떼어낸 후, 이 커버슬립을 발생 중인 융모요막(CAM)의 표면에 놓고, 다시 유리테이프로 창을 막았다. 이를 배양기에서 2 일 동안 배양시킨 후, 10% 지방 에멀젼(fat emulsion)을 융모요막(CAM) 안쪽에 주사기로 주입하여, 혈관형성이 어느 정도 억제되었는지를 관찰하였다.

각 실험군 당 60개 이상의 계태자융모요막을 사용하여 실험하였으며, 대조군 및 화학식 1a, 1b 또는 1d의 화합물을 처리한 경우 각각의 억제효과는 표 1에 나타내었다.

계태자융모요막 분석방법(CAM assay)에 의한 혈관신생 억제효과

화합물	저해율(%)
대조군	19.5
화학식 1a의 화합물	78.6
화학식 1b의 화합물	73
화학식 1d의 화합물	59

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 본 발명의 설폰아미드계 화합물을 처리한 경우, 계태자융모요막(Chorioallantoic membrane)에서 혈관신생이 월등하게 억제됨을 확인하였다. 특히, 화학식 1a의 화합물은 가장 높은 효과를 보이고 있었다.

도 3a는 용매인 식염수만을 처리한 대조군의 결과이며, 도 3b는 화학식 1b의 화합물을 처리하여 계태자융모요막(Chorioallantoic membran; CAM)에서의 혈관신생효과를 관찰한 결과이다. 상기 도 3a 및 도 3b에서 화살표로 표시된 부분은 식염수 또는 화학식 1b의 화합물로 처리한 터마톡스 커버슬립(thermatox coverslip)의 위치를 나타내는 것이다. 상기 도 3b의 경우, 터마톡스 커버슬립의 위치에 혈관생성이 일어나지 않은 것을 확인하였다.

<실험예 4> 쥐의 동맥 절편으로부터의 미세혈관신생에 미치는 영향

본 발명의 설폰아미드계 화합물이 미세혈관 신생에 미치는 영향을 알아보기 위하여 쥐의 동맥 절편을 이용하여 하기와 같이 생체내(in vivo)에서 실험하였다.

쥐의 심장부근에서 채취된 동맥(aorta)은 내피세포 배양액인 EGM에 세척한 후 횡단면으로 얇게 잘라 준비하였다. 상기 쥐의 동맥 절편을 24 웰 플래이트에서 콜라겐(collagen type I) 젤(gel) 상에 고리(ring) 모양으로 심은 다음 포화습도가유지되는 37℃, 5% CO₂배양기에서 30 분동안 굳혔다. 콜라겐(collagen) 젤(gel)이 굳으면, 그 위에 배양액을 넣어 배양하였다. 음성대조군으로는 배양액에 용매인 DMSO만을 처리하였고(도 4a), 양성 대조군으로서, 배양액으로는 혈관신생 촉진 효과가 있는 PMA(phobol myristate) 10 nM 및 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 10 ㎍/㎖ 넣은 EGM만을 사용하였다(도 4b). 실험군으로서, PMA 및 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 첨가된 배양액에 화학식 1a, 1b 및 1d의 화합물을 5 μM씩 첨가하여 배양하였다(도 4c ∼ 도 4e). 2 ∼ 3 일 간격으로 한 번씩 배양액을 갈아주면서 관찰하였고, 14 일 경과 후, 촬영하였다.

상기 실험 결과, 음성대조군에 비해 양성대조군은 미세혈관의 생성이 월등히 적게 나타났고, 더 나아가 화학식 1a, 1b 및 1d의 화합물로 처리한 각각의 실험군은 양성대조군에 비해 미세혈관의 생성이 뚜렷하게 억제됨을 확인하였다. 특히, 화학식 1a 및 1d의 화합물의 경우, 혈관생성억제 효과가 두드러지게 나타났다. (도 4c 및 도 4e)

<실험예 5> B16-F10 멜라노마 세포의 전이에 미치는 영향

본 발명의 설폰아미드계 화합물이 B16-F10 멜라노마 세포의 전이를 억제하는 지에 관찰하기 위하여 하기와 같이 생체내 (in vivo) 실험하였다.

2 ×10⁵개의 B16-F10 멜라노마 세포를 6 ∼ 8 주령의 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥에 주입(injection)하였다. 대조군은 용매인 0.1% 트윈-80을 함유한 식염수를 복강에 주사하였고, 실험군은 화학식 1a ∼ 1d의 화합물 100 mg/kg/day의 농도로 각 실험군 당 다섯마리의 마우스에 14 일동안 복강에 주사하였다. 14 일 경과 후, 마우스를 희생시켜 폐를 적출하고 보잉스 용액(Bouin's Solution)으로 염색하여 종양이 전이된 부분인 콜로니를 해부현미경으로 관찰하면서 그 개수를 세어 종양의 전이 정도를 분석하였다. 각 실험군의 종양 전이 정도를 대조군과 비교하여 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

종양 전이의 저해 효과

화합물	전이억제율(%)
화학식 1a의 화합물	56
화학식 1b의 화합물	52
화학식 1c의 화합물	55
화학식 1d의 화합물	88

상기 표 2에서 화학식 1a ∼ 1d의 화합물을 처리한 결과, 실험군은 대조군에 비하여 52 ∼ 58% 정도로 B16-F10 멜라노마 세포의 전이를 억제한다는 것을 관찰하였다.

도 5a는 적출한 폐를 염색하기 이전에 촬영한 대조군으로서, 종양이 전이된 부분인 콜로니가 폐 사진 전반에 검게 퍼져 있었다.

그러나 도 5b는 화학식 1b의 화합물을 처리한 실험군으로서, 대조군에 비하여 전이가 많이 억제되었음을 육안으로 확인할 수 있었다.

<실험예 6> 고체 종양의 성장에 미치는 영향

본 발명의 설폰아미드계 화합물이 고체 종양의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 루이스 폐 종양세포를 이용하여 하기와 같이 생체내 (in vivo) 실험하였다.

1 ×10⁶개의 루이스 폐 종양세포(Lewis lung carcinoma cell; LLC)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 대조군은 용매인 0.1% 트윈-80이 첨가된 식염수만을 매일 복강 투여하였으며, 실험군은 화학식 1a ∼ 1d의 화합물을 100 mg/kg씩 매일 복강 투여하였다. 상기 실험 결과를 표 3에 기재하였다.

루이스 폐 종양(LLC)의 성장 억제 효과

화합물	성장억제율(%)
화학식 1a의 화합물	32
화학식 1b의 화합물	59
화학식 1c의 화합물	19
화학식 1d의 화합물	32

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 화학식 1a ∼ 1d의 화합물에 따라 루이스 폐 종양(LLC)의 성장 억제 효과의 차이를 보였다. 그러나 대조군과 비교할 때, 상기화합물로 처리한 실험군은 고체 종양의 성장이 억제되었다.

도 6a는 대조군으로서, 고체 종양의 부피가 매우 커지는 것에 반해, 도 6b는 가장 효과적으로 고체 종양의 성장을 억제하는 화학식 1b의 화합물로 처리한 실험군으로서, 고체 종양의 성장이 현저히 억제되었다. 또한, 도 6c는 화학식 1b의 화합물을 투여한 실험군에 이식된 고체 종양의 크기를 3 ∼ 4 일 간격으로 측정한 것으로, 대조군에 비해 종양의 생장이 억제되는 효과를 뚜렷하게 볼 수 있었다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 및 경구로 투여될 수 있으며, 하기에 비경구용 제형으로 주사제, 경구용 제형으로 정제를 제조하였다.

<제제예 1> 주사약제의 제조방법

유효성분 50 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다

화학식 1a∼1d 중에서 선택된 하나의 화합물 50 ㎎, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 60 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

화학식 1a∼1d 중에서 선택된 하나의 화합물 1000 g, 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10 % 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 메트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제인 설폰아미드계 화합물들은 시험관내(in vitro)인 내피세포에서 혈관신생 과정인 망상의 튜브 구조의 생성을 현저히 저해하고, 생체내(in vivo) 조건에서 융모요막의 혈관신생 및 쥐의 동맥단편으로부터의 미세혈관의 신생을 억제할 뿐 만 아니라, 전이성 암의 억제 및 고체 종양의 성장을 저해함으로써, 혈관신생의 불균형에 의한 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있으며, 암 전이억제제 또는 항암제로서 유용하다.

Claims

하기 화학식 1a로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제.

화학식 1a
하기 화학식 1b로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제.

화학식 1b
하기 화학식 1c으로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제.

화학식 1c
하기 화학식 1d로 표시되는 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제.

화학식 1d
제 1 항의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제.
제 2 항의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제.
제 3 항의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제.
제 4 항의 설폰아미드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제제 또는 항암제.