KR102334943B1 - 신규 이소퀴놀린 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 이소퀴놀린 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 이소퀴놀린 퓨라논 유도체는 오토파지 활성 조절이 가능한 바, 이를 유효성분으로 하여 오토파지 관련 질환, 예를 들어, 신경 퇴행성 질환, 암, 대사성 질환, 염증성 질환, 또는 멜라닌형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 또는 미백 기능의 화장료 조성물로 제공될 수 있는 유용한 효과가 있다.

Description

신규 이소퀴놀린 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel isoquinoline derivative, preparing method thereof, and pharmaceutical composition for preventing or treating autophagy related diseases containing the same as an active ingredient}

본 발명은 신규 이소퀴놀린 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

오토파지(autophagy; 자가포식)는 기아상태에서의 생존 및 감염성 세균으로부터의 보호, 신경붕괴조절 등의 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 오토파지는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다고 알려져 있다.

오토파지가 활성화되면 atg12-atg5 복합체 및 LC3 결집에 의해 오토파고좀 막구조가 형성된다. LC3의 사이토졸 형태(LC3-I)는 막 결합 형태(LC3-II)로 갈라지고 그 막은 분해 대상 성분을 둘러싸는 오토파고좀(autophagosome)으로 성숙되어진다. 그 다음 오토파고좀은 리소좀과 융합되어 오토리소좀 (autolysosome)을 형성하고, 세포내 성분의 리소좀성 분해를 일으킨다. 이러한 과정에 관여하는 복잡한 분자적 메커니즘을 규명하기 위하여 현재 다양한 연구가 진행중이다.

한편, 오토파지는 신경퇴행성 질환, 암 및 멜라닌생성(melanogenesis)과 같은 다양한 병리학적 과정과 관련이 있다. 암에서, 오토파지는 다양한 단계와 연관될 수 있는데, 자라나는 종양세포에서 산소 및 영양분이 제한되기 때문에 혈관신생에 의해 필요한 성분이 제공될 때까지 생존을 위해 오토파지를 사용한다. 이 경우, 오토파지는 종양 세포 생존을 멈추기 위해 억제되어야 한다.

멜라닌생성(melanogenesis)이란 눈, 피부 및 모발 내에서 발견되는 색소인 멜라닌의 형성을 의미한다. 색소 질환 환자에서 오토파고좀 증가가 관찰되는데, 보다 최근 연구는 베클린 1 또는 LC3-I의 결여가 색소 축적을 현저하게 약화시키는 것으로 보고되었다. 인 비보 분석에서 베클린 1 이형접합성 결여는 마우스 coat 색소 결함을 야기하였다. 멜라닌생성 외부 요인으로는 UV와 같은 자극에 의해서 활성화된다. 멜라닌생성에 의해 색소질환(기미, 주근깨, 검버섯 등)이 생길 수 있다. 이 경우, 오토파지는 멜라닌과생성을 멈추기 위해 억제되어야 한다.

상술되는 바와 같이, 오토파지와 관련되는 신경퇴행성 질환, 암 및 멜라닌과생성 질환 등에 있어서, 잠재적 의약 후보로서 오토파지 조절 능력을 가지는 약물 개발이 가능하다.

한편, 오토파지(자가포식) 메커니즘에 관여하는 Beclin 1 관련 특허로, EP 2383294는 Beclin 1의 Thr119 인산화 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 신경퇴행성 질환을 치료 또는 진단하는 기술을 개시하고 있고, US 6432914는 Beclin 1 자체를 단백질 의약품으로 이용하여 암을 치료하는 기술을 개시하고 있으며, US 5858669는 Beclin 1의 돌연변이를 이용하여 암을 진단하는 기술에 대하여 개시하고 있으나, 여전히 오토파지 조절 약물을 이용항 질환 치료제 개발이 요구되고 있다.

EP 2383294 US 6432914 US 5858669

본 발명의 목적은 오토파지 활성 조절 약물을 제공하기 위한 유효성분으로서 신규한 이소퀴놀린 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이소퀴놀린 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이소퀴놀린 유도체를 유효성분으로 함유하는 오토파지(autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이소퀴놀린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이소퀴놀린 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 과색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에서,

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,

R¹은 치환 또는 비치환된 페닐이되,

상기 치환된 페닐은 히드록시, 시아노, 니트로, 아미노, 할로젠 및 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-5의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환되고,

여기서, 상기 치환된 알킬은 할로젠으로 치환되고;

R²은 히드록시, 아미노, 시아노, 할로젠, C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;

n은 0 내지 8이고;

X 및 Y는 각각 독립적으로 CH 또는 N이고; 및

Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다).

또한, 본 발명의 다른 측면에서,

하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

화학식 4로 표시되는 화합물로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법이 제공된다.

[반응식 1]

(상기 반응식 1에 있어서,

R¹, R², n, X, Y 및 Z는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 오토파지(autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 과색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 신규한 이소퀴놀린 퓨라논 유도체는 오토파지 활성 조절이 가능한 바, 이를 유효성분으로 하여 오토파지 관련 질환, 예를 들어, 신경 퇴행성 질환, 암, 대사성 질환, 염증성 질환, 또는 멜라닌형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 또는 미백 기능의 화장료 조성물로 제공될 수 있는 유용한 효과가 있다.

도 1은 Raw 264.7 마우스 대식세포에 본 발명에 따른 실시예 1 화합물 1, 5, 10, 및 20 μM 처리에 따른, LC3-I 및 LC3-II의 변환을 확인한 웨스턴 블롯 그래프이다.
도 2는 Raw 264.7 마우스 대식세포에 염증 반응을 조절한 후(LPS 처리), 본 발명 실시예 화합물 1의 5, 10, 20, 50 μM 처리 후, 관측되는 오토파고좀의 변화를 확인한 형광현미경 사진이다.
도 3은 (a): LPS에 의한 NO 생성 조절(염증 반응 조절) 후, 본 발명 실시예 1 화합물을 각각 0.1, 0.5, 1, 10, 및 100 μM로 처리하고, 그리스 시약을 사용하여 흡광도로 측정된 NO 생성율을 LPS 기준 환산하여 백분율로 나타낸 그래프, 및 (b): 각각 LPS, 본 발명 실시예 1 화합물을 각각 0.1, 0.5, 1, 10, 및 100 μM 처리에 따른 세포 생조률을 대조군(Control) 대비 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1 화합물 처리에 의한 염증반응 관련 사이토카인 IL-6의 유전자 발현량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 실시예 1 화합물 0.1, 1, 및 10 μM에 의한 염증반응 관련 단백질 IL-6와 IL-1β의 단백질 측정량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 (a): 수정 후 10시간 시점의 제브라피쉬 수정란을 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물을 처리하여 22시간 후의 수정 후 32시간 시점에서 멜라닌 세포 형성 저해 효과를 확인한, 제브라 피쉬의 사진이고, 및 (b)는 수정 후 60시간 시점의 제브라피쉬 치어를 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물을 처리하여 12시간 후의 수정 후 72시간 시점에서 멜라닌 합성 저해 효과를 확인한, 제브라 피쉬의 사진이다.
도 7은 수정 후 5일된 제브라피쉬 치어를 대상으로, DMSO, 타목시펜, 본 발명 실시예 1을 각각 처리한 뒤, 관측한 일반 현미경 이미지, 형광 현미경 이미지, 및 히트맵 변환 이미지이다.
도 8은 수정 후 5일된 제브라피쉬 치어를 대상으로, DMSO, 타목시펜, 본 발명 실시예 1을 각각 처리한 뒤, 관측한 제브라피쉬 치어 이미지상의 간 면적(a) 및 형광 세기(b)를 ImageJ 1.50i 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이다(p 값은 타목시펜 처리군 대비 각 실험군에 대한 t-검정 결과임. *p ≤ 0.01, **p ≤ 0.001).
도 9는 VERO, HFL-1, L929, NIH 3T3, CHO-K1, HMV-II 세포주를 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물의 농도별 처리에 따른 세포생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명 실시예 1 화합물에 의한 허그 채널단백질의 결합과 활성저해를 각각 리간드 바인딩 및 패치 크램프 곡선으로 나타낸 그래프이다.
도 11은 인공피부 조직에 염색된 MTT를 이소프로판올을 이용하여 용출한 후, 측정한 흡광도를 기반으로 비히클, ARB, SDS, 본 발명 실시예 1 화합물 10, 20, 및 50 μM 처리군의 생존률을 산출한 그래프이다.
도 12는 인공각막 조직에 염색된 MTT를 이소프로판올을 이용하여 용출한 후, 측정한 흡광도를 기반으로 비히클, ARB, 아세트산, 본 발명 실시예 1 화합물 10, 20, 및 50 μM 처리군의 생존률을 산출한 그래프이다.
도 13은 비만 조절 설치류 모델에서, 각각 비히클, 양성대조군(10 mpk Rosi), 본 발명 실시예 1 화합물(10 mpk 및 100 mpk) 투여 후, 간손상 지표인 ALT(aminotransferase) 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 비만 조절 설치류 모델에서, 각각 비히클, 양성대조군(10 mpk Rosi), 본 발명 실시예 1 화합물(10 mpk 및 100 mpk) 투여 후, 산화 스트레스 지표인 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substance)의 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하 설명은 발명의 이해를 돕기 위해서 제시하는 것이며, 본 발명이 이하 설명의 내용으로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에서,

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,

R¹은 치환 또는 비치환된 페닐이되,

상기 치환된 페닐은 히드록시, 시아노, 니트로, 아미노, 할로젠 및 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-5의 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환되고,

여기서, 상기 치환된 알킬은 할로젠으로 치환되고;

R²은 히드록시, 아미노, 시아노, 할로젠, C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C_1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;

n은 0 내지 8이고;

X 및 Y는 각각 독립적으로 CH 또는 N이고; 및

Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다).

본 발명의 일 구체예에서,

상기 R¹은 F, Cl, Br, I, 및 CF₃로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환된 페닐일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서,

상기 X 및 Y 중 어느 하나가 CH이면, 다른 하나는 N일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서,

상기 X가 CH이면, Y는 N이다.

본 발명의 다른 구체예에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:

(1) 1-((4-플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린;

(2) 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린;

(3) 1-((4-플루오로페닐)설포닐)이소퀴놀린;

(4) 4-((4-플루오로페닐)설피닐)퀴놀린;

(5) 1-((2,4-디플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린;

(6) 1-((4-클로로페닐)설피닐)이소퀴놀린; 및

(7) 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)설피닐)이소퀴놀린.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에서,

하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

화학식 4로 표시되는 화합물로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법이 제공된다.

[반응식 1]

(상기 반응식 1에 있어서,

R¹, R², n, X, Y 및 Z는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).

본 발명의 일 구체예에서,

상기 Z가 S인 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1'로 표시되는 화합물인 것으로 이해될 수 있고,

상기 반응식 1로 표시되는 제조방법은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1'로 표시되는 화합물을 제조하는 제조방법일 수 있다.

[반응식 2]

(상기 반응식 2에 있어서,

R¹, R², n, X 및 Y는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다).

상기 화학식 4로 표시되는 화합물 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1'로 표시되는 화합물을 제조하는 단계에 있어서,

상기 단계는, 이에 제한되지 않으나, 사용 가능한 용매로는 H₂O, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 디클로로메탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 5시간 내지 30시간, 10시간 내지 20시간, 또는 약 12시간 동안 반응하는 것이 바람직하다. 나아가, 반응 온도는 특별히 제약되지 않으나, 실온 또는 20 내지 30℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

가장 바람직한 양태로, 본 발명의 하기 실시예와 같이 수행할 수 있되, 이로부터 실험의 양태, 조건 등의 변경될 수 있는 방법 역시 본 발명 범위에 포함된다.

본 발명의 다른 구체예에서,

상기 Z가 설피닐, 또는 설포닐인 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1''로 표시되는 화합물인 것으로 이해될 수 있고,

상기 반응식 1로 표시되는 제조방법은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,

화학식 4로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1'로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및

상기 단계에서 제조된 화학식 1'로 표시되는 화합물로부터 화학식 1''로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는 제조방법일 수 있다.

[반응식 3]

(상기 반응식 3에 있어서,

R¹, R², n, X 및 Y는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고; 및

W는 설피닐, 또는 설포닐이다).

상기 화학식 4로 표시되는 화합물 및 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1'로 표시되는 화합물을 제조하는 단계에 있어서,

상기 단계는, 이에 제한되지 않으나, 사용 가능한 용매로는 H₂O, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 디클로로메탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 5시간 내지 30시간, 10시간 내지 20시간, 또는 약 12시간 동안 반응하는 것이 바람직하다. 나아가, 반응 온도는 특별히 제약되지 않으나, 실온 또는 20 내지 30℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

가장 바람직한 양태로, 본 발명의 하기 실시예와 같이 수행할 수 있되, 이로부터 실험의 양태, 조건 등의 변경될 수 있는 방법 역시 본 발명 범위에 포함된다.

나아가, 상기 단계에서 제조한 화학식 1'로 표시되는 화합물로부터 화학식 1''로 표시되는 화합물을 제조하는 단계에 있어서,

상기 단계는, 이에 제한되지 않으나, 설피닐 기, 또는 설포닐 기를 도입하는 반응으로 생각될 수 있고, 예를 들어 m-클로로퍼옥시벤조산 등을 사용하여 반응시킬 수 있다. 사용 가능한 용매로는 C₁-C₄의 알콜, 아세톤, 아세토니트릴, 벤젠, 2-부타논, 클로로벤젠, 클로로폼, 사이클로핵산, 톨루엔, 1,2-디클로로메탄(DCM), 헵탄, 헥산 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 클로로폼을 사용할 수 있다. 또한, 반응시간은 특별한 제약은 없으나, 5시간 내지 30시간, 10시간 내지 20시간, 또는 약 12시간 동안 반응하는 것이 바람직하다. 나아가, 반응 온도는 특별히 제약되지 않으나, 실온 또는 20 내지 30℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

가장 바람직한 양태로, 본 발명의 하기 실시예와 같이 수행할 수 있되, 이로부터 실험의 양태, 조건 등의 변경될 수 있는 방법 역시 본 발명 범위에 포함된다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 오토파지(autophagy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 오토파지 활성을 조절하는 유효성분로 이해될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 실험예 1에서 보인 바와 같이, 오토파지 활성이 조절됨을 보였다.

구체적으로, 오토파지(자가포식)은 세포가 스트레스에 노출되어, 예를 들어 영양분 공급의 차단, 세균 등의 침습 등의 스트레스에 노출되어, 매개되는 단계일 수 있는데, 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물은 이러한 오토파지 활성을 조절하는 것으로부터, 하기 실험예에서 입증한 바와 같이, NO 생성 억제, IL-6, IL-β 등의 염증 관련 인자의 억제를 통하여, 염증 반응을 억제할 수 있는 항염증 효과를 나타내고, 다르게는 멜라닌생성 억제 효과가 있으며, 또 다르게는 지방간 억제, 비만 억제 등의 대사성증후군 억제 효과가 있으며, 이외의 오토파지 관련 질환에 유의미한 효과를 나타내는 유효성분으로 이해된다.

나아가, 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물은 일반 세포독성 실험, 심장독성 평가, 피부독성 평가, 안구독성 평가, 간손상 평가에서 안전한 화합물인 것으로 규명된 바, 생체에 보다 안전한 치료제 유효성분으로 제공될 수 있음을 시사하였다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 오토파지 관련 질환은 현재까지 오토파지 활성 조절에 의해, 또는 오토파지 활성과 관계된 것으로 규명되거나, 연구, 보고된 바 있는 질환을 모두 포함하며, 예를 들어, 암, 아테롬성 동맥 경화증, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위측성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조(spinocerebellar ataxia), 안인후증 이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy), 프라이온병, 치명적 가족성 불면증, 알파-1 안티트립신 결핍증, 담창구 시상하부 위측증(dentatorubral pallidoluysian atrophy), 전측두엽 치매, 전진성 상핵 마비(progressive supranuclear palsy), 척추 인경 근위축증(x-linked spinobulbar muscular atrophy) 및 신경핵내 유리질 봉입증(neuronal intranuclear hyaline inclusion disease)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 오토파지 관련 질환은 대사증후군과 관계된 질환(다르게는 대사성 질환)일 수 있고, 예를 들어, 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 알코올성 지방간, 비알콜성 지방간, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증 및 고인슐린혈증 등을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 오토파지 관련 질환은 염증성 질환일 수 있고, 예를 들어, NO 생성 억제, IL-6 또는 IL-1β 발현 억제 등으로부터 개선, 예방, 치료될 수 있는 질환일 수 있고, 예를 들어, 상기 염증성 질환은 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 피부염, 아토피 피부염, 안염, 각막염, 간염, 비알코올성 간염 등일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 오토파지 관련 질환은 멜라닌생성과 관계되는 질환일 수 있고, 멜라닌과생성으로부터 야기되는 피부 질환, 예를 들어, 피부 과색소 침착 질환일 수 있다.

다르게는, 상기 멜라닌과생성으로 야기되는 피부 질환이란 기미, 주근깨, 흑자, 노인성 색소반과 같은 색소 침착으로 인한 병변을 포함하는 질환으로 이해될 수 있다.

상술된 오토파지 질환에 있어서, 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 질환의 예방, 개선, 치료 등의 의학적으로 유용한 효과를 나타낼 수 있으며, 이는 본원 명세서, 실시예 및 실험예에 의하여 뒷받침 되는 바, 이를 유효성분으로 함유되는 약학적 조성물이 제공될 수 있는 것이다.

한편, 본원에서 설명되는 오토파지와 관련된 효과 및 설명에 벗어나, 상기 오토파지 관련 질환에 국한되지 않는, 즉 상술된 오토파지 관련 이론이나, 메카니즘에 무관하게, 순수하게 본 발명 하기 실험예에 보이는 바를 근거하여, 다음과 같은 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 염증성 질환은, 예를 들어, NO 생성 억제, IL-6 또는 IL-1β 발현 억제 등으로부터 개선, 예방, 치료될 수 있는 질환일 수 있고, 예를 들어, 상기 염증성 질환은 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 피부염, 아토피 피부염, 안염, 각막염, 간염, 비알코올성 간염 등일 수 있다.

본원 하기 실험예 및 도 3, 4, 및 5에서 보인 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물은 NO 생성 억제, IL-6 또는 IL-1β 발현 억제 효과를 확인하였고, 이는 이는 오토파지 조절 효과와 관계되는 것으로, 또는 그렇지 않은 독립적인 효과로 설명될 수도 있으나, 이러한 설명에 제한되는 것은 아니고, 오히려 이와 무관하게 본원에서 입증하는 염증 반응 억제 효과로부터, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.

또한, 상기 대사성 질환은, 대다성증후군으로도 이해될 수 있고, 비제한적인 예를 들어, 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 알코올성 지방간, 비알콜성 지방간, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 고인슐린혈증, 등일 수 있다.

본원 하기 실험예 및 도 7, 도 8에서 보인 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 화합물은 지방간 억제 효과가 확인되고, 이는 오토파지 조절 효과와 관계되는 것으로, 또는 그렇지 않은 독립적인 효과로 설명될 수도 있으나, 이러한 설명에 제한되는 것은 아니고, 오히려 이와 무관하게 본원에서 입증하는 지방간 억제 효과, 간손상 억제 효과 등을 토대로, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 과색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 피부 과색소 침착 질환은 예를 들어 멜라닌과생성으로 야기되는 피부 질환일 수 있고, 기미, 주근깨, 흑자, 노인성 색소반과 같은 색소 침착으로 인한 병변을 포함하는 질환일 수 있다.

본원 하기 실험예 및 도 9에서 보인 바와 같이, 멜라닌세포 형성 이전 이후 모든 시점에서 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌 형성을 우수하게 억제하는 것으로 확인되는 바, 이를 유효성분으로 함유하여 피부 과색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

이 외에도, 크림제, 연고제, 겔, 로오션제, 액제 또는 패치 등 경피용 제제를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료학적으로 유효한 양으로 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 오토파지 관련 질환의 치료 방법이 제공된다.

이때, 상기 오토파지 관련 질환은 본 명세서에서 설명된 바와 같다.

상기 치료학적 유효량은 투여 방법에 따라, 체내로 투여시 대상(subject)의 증상 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선시킬 수 있을 정도의 양을 말한다. 또한 상기 양은 투여하는 대상의 체중, 나이, 성별, 상태, 가족력에 따라 상이할 수 있고, 본 발명에서 상기 치료 방법은 이처럼 대상별로 상이한 조건에 따라 다른 양의 투여량을 정할 수 있다.

상기 "유효한 양"은 오토파지 관련 질환, 예를 들어 암, 아테롬성 동맥 경화증, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위측성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조(spinocerebellar ataxia), 안인후증 이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy), 프라이온병, 치명적 가족성 불면증, 알파-1 안티트립신 결핍증, 담창구 시상하부 위측증(dentatorubral pallidoluysian atrophy), 전측두엽 치매, 전진성 상핵 마비(progressive supranuclear palsy), 척추 인경 근위축증(x-linked spinobulbar muscular atrophy) 또는 신경핵내 유리질 봉입증(neuronal intranuclear hyaline inclusion disease)과 같은 질환을 치료하는데 유효한 양이다. 다른 구체예에서, 화합물의 "유효한 양"은 오토파지 활성을 조절시킬수 있는 최소한의 양 이상을 의미한다.

본 발명의 방법에 따른 화합물 및 조성물은 질환을 치료하는데 유효한 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상(subject)의 종, 연령, 및 일반적인 병태, 감염의 중증도, 특정한 제제, 그것의 투여 방식, 등에 따라 대상별로 변할 것이다. 본 발명의 화합물은 복용량의 투여 용이성 및 균일성에 대해 투약량 단위 형태로 빈번하게 제형화된다. 표현 "투약량 단위 형태"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 치료될 대상에 적절한 제제의 물리적으로 별개의 단위를 의미한다. 또한, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 사용량이 건전한 의료 판단의 범위 내에 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정한 대상 또는 유기체에 대한 특정 유효한 투여 수준은 하기를 포함하는 다양한 인자에 의존된다: 치료될 질환 및 질환의 중증도; 이용된 특정 화합물의 활성; 특정 조성물 이용된; 연령, 체중, 일반적인 건강, 대상의 성별 및 다이어트; 투여 시간, 투여 경로, 및 이용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료의 지속시간; 이용된 특정 화합물 단독 또는 공동투여된 약물, 및 의료 기술에서 잘 알려진 이 외의 요인.

용어 "대상(subject)"은, 본 발명에서 제공되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 약학적 조성물이 요구되는 대상을 말하는 것일 수 있고, 다르게는 오토파지 관련 질환의 예방, 개선, 호전, 또는 치료의 효과가 필요한 대상을 의미하는 것으로 이해될 수 있고, 상기 대상은 예를 들면 동물, 바람직하게 비포유동물, 또는 포유동물, 더 바람직하게 가축, 인간일 수 있고, 가장 바람직하게 인간을 의미한다.

또 다른 측면에서, 하기와 같은 건강기능식품 조성물, 또는 화장료 조성물 등이 제공될 수 있다.

먼저, 본 발명의 일 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 오토파지(autophagy) 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 오토파지 관련 질환은 현재까지 오토파지 활성 조절에 의해, 또는 오토파지 활성과 관계된 것으로 규명되거나, 연구, 보고된 바 있는 질환을 모두 포함하며, 예를 들어, 암, 아테롬성 동맥 경화증, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위측성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조(spinocerebellar ataxia), 안인후증 이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy), 프라이온병, 치명적 가족성 불면증, 알파-1 안티트립신 결핍증, 담창구 시상하부 위측증(dentatorubral pallidoluysian atrophy), 전측두엽 치매, 전진성 상핵 마비(progressive supranuclear palsy), 척추 인경 근위축증(x-linked spinobulbar muscular atrophy) 및 신경핵내 유리질 봉입증(neuronal intranuclear hyaline inclusion disease)을 포함한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 염증성 질환은 예를 들어, NO 생성 억제, IL-6 또는 IL-1β 발현 억제 등으로부터 개선, 예방, 치료될 수 있는 질환일 수 있고, 예를 들어, 상기 염증성 질환은 장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 피부염, 아토피 피부염, 안염, 각막염, 간염, 비알코올성 간염 등일 수 있다.

또한, 상기 대사성 질환은, 대다성증후군으로도 이해될 수 있고, 비제한적인 예를 들어, 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 알코올성 지방간, 비알콜성 지방간, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 고인슐린혈증, 등일 수 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 미백용 화장료 조성물이 제공된다.

여기서, 상기 화장료 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것으로부터, 멜라닌생성을 억제할 수 있고, 이로부터 피부, 모발, 특수하게 안구에 멜라닌형성 저해를 목적으로 하는 경우에도, 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

여기서, 상기 미백용 화장료 조성물의 성분인 화학식 1로 표시되는 화합물은 독성학적 측며에서, 본원 실험예에 보인 바와 같이, 세포, 피부, 안구 등의 생체에 안전한 성분인 것으로 확인된 바, 멜라닌세포 형성, 멜라닌 합성을 억제하기 위하여 적용되는 부위에 특별한 제약이 없이, 적용될 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서,

하기 실험예 및 도 6에 확인되는 바와 같이, 본 발명 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌 세포 형성을 우수하게 억제할 수 있고, 이미 생성된 멜라닌 세포의 멜라닌 합성을 억제할 수 있는 바, 상기 화장료 조성물은 미백용 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

특히, 피부 과색소 침착 질환을 앓고 있는 대상에 유용할 수 있고, 예를 들어 기미, 주근깨, 흑자, 노인성 색소반과 같은 색소 침착으로 인한 병변에 유용하게 사용될 수 있다.

또 다르게는, 상기 질환을 앓고 있는 대상이 아니더라도, 단순히 피부 미백 등의 목적으로 용이하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않고 임의로 선택하여 적용될 수 있고, 종래의 화장료 제형인 피부외용연고, 에센스, 미백 크림, 로션, 에멀젼, 팩, 일반 화장수, 스킨밀크, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 헤어토닉, 전신세정제, 오일젤과 같은 여러가지 제형으로 제조하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 1-((4-플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

에탄올 중 1-클로로이소퀴놀린 (2g, 12.225mmol)의 용액에 4-플루오로벤젠티올 (1.436mL, 13.447mmol)을 첨가 하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 수득하였다(686mg, 22%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.28 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.81-7.85 (m, 1H), 7.72-7.77 (m, 1H), 7.61-7.66 (m, 3H), 7.29-7.35 (m, 2H).

단계 2: 1-((4-플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린 (850 mg, 3.329 mmol)을 THF/물에 녹여주었다. 이 혼합물에, 옥손 (Oxone) (574.53 mg, 3.329 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 물로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 순수 화합물을 수득하였다(218mg. 24%).

¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ 8.79 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.52-7.76 (m, 6H), 6.99 (t, J = 8.54 Hz, 2H).

<실시예 2> 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

에탄올 중 1-클로로이소퀴놀린 (2g, 12.225mmol)의 용액에 4-플루오로벤젠티올 (1.436mL, 13.447mmol)을 첨가 하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 수득하였다(686mg, 22%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.28 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.81-7.85 (m, 1H), 7.72-7.77 (m, 1H), 7.61-7.66 (m, 3H), 7.29-7.35 (m, 2H).

<실시예 3> 1-((4-플루오로페닐)설포닐)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

에탄올 중 1-클로로이소퀴놀린 (2g, 12.225mmol)의 용액에 4-플루오로벤젠티올 (1.436mL, 13.447mmol)을 첨가 하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 수득하였다(686mg, 22%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.28 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.81-7.85 (m, 1H), 7.72-7.77 (m, 1H), 7.61-7.66 (m, 3H), 7.29-7.35 (m, 2H).

단계 2: 1-((4-플루오로페닐)설포닐)이소퀴놀린의 제조

1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린 (850 mg, 3.329 mmol)을 THF/물에 녹여주었다. 이 혼합물에, 옥손 (2.2 eq, 7.3238 mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 희석시키고 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 목적 화합물을 수득하였다(4c, 66 %).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.79 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.52-7.76 (m, 6H), 6.99 (t, J = 8.54 Hz, 2H).

<실시예 4> 4-((4-플루오로페닐)설피닐)퀴놀린의 제조

단계 1: 4-((4-플루오로페닐)티오)퀴놀론의 제조

상기 실시예 1의 단계 1과 같이 수행하되, 1-클로로이소퀴놀린을 대신하여 4-클로로퀴놀린 (250 mg, 1.528 mmol)을 사용하였다.

에탄올 중 4-클로로퀴놀린 (250 mg, 1.528 mmol)의 용액에 4-플루오로벤젠티올 (250 mg, 1.528 mmol)을 첨가 하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 수득하였다 (185.0 mg, 47.4%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.565 (d, J = 4.88 Hz, 1H), 8.178 (d, J = 9.16 Hz, 1H), 8.069 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.730 (m, 1H), 7.583 (m, 3H), 7.181 (t, J = 17.40, 2H), 6.673 (d, J = 4.58, 1H).

단계 2: 4-((4-플루오로페닐)설피닐)퀴놀린의 제조

상기 실시예 1의 단계 2와 같이 수행하되, 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린을 대신하여 상기 단계 1에서 제조한 4-((4-플루오로페닐)티오)퀴놀론 (280mg, 1.097 mmol)을 사용하여 목적 화합물을 수득하였다 (47%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.124 (d, J = 4.58 Hz, 1H), 8.156 (m, 2H), 7.974 (d, J = 8.85 Hz, 1H), 7.711 (m, 3H), 7.572 (m, 1H), 7.096 (t, J = 17.09 Hz, 2H).

<실시예 5> 1-((2,4-디플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((2,4-디플루오로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

상기 실시예 1의 단계 1과 같이 수행하되, 4-플루오로벤젠티올을 대신하여 2,4-디플루오로벤젠티올 (1.527 mmol)을 사용하였다.

에탄올 중 1-클로로퀴놀린 (0.25g, 1.527 mmol)의 용액에 2,4-디플루오로벤젠티올 (1.527 mmol)을 첨가 하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물을 수득하였다 (42%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.308 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.159 (d, J = 5.95 Hz, 1H), 7.778 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.690 (t, J = 14.95 Hz, 1H), 7.602 (m, 2H), 7.367 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 6.961 (m, 2H).

단계 2: 1-((2,4-디플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1-((2,4-디플루오로페닐)티오)이소퀴놀린 (200 mg)을 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1의 단계 2와 같이 수행하여, 최종 목적 화합물을 수득하였다 (57%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.685 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.579 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 8.085 (m, 1H), 7.898 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.742 (m, 3H), 7.074 (m, 1H), 6.747 (m, 1H).

<실시예 6> 1-((4-클로로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((4-클로로페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

상기 실시예 1의 단계 1과 같이 수행하되, 4-플루오로벤젠티올을 대신하여 4-클로로벤젠티올 (1.527 mmol)을 사용하여 목적 화합물을 수득하였다 (48%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.313 (d, J = 8.24, 1H), 8.220 (d, J = 5.80 Hz, 1H), 7.782 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.690 (m, 1H), 7.607 (m, 1H), 7.510 (m, 2H), 7.379 (m, 3H).

단계 2: 1-((4-클로로페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1-((4-클로로페닐)티오)이소퀴놀린 (200 mg)을 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1의 단계 2와 같이 수행하여, 최종 목적 화합물을 수득하였다 (25%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.903 (d, J = 8.54Hz, 1H), 8.558 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.871 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.750 (m, 3H), 7.706 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.648 (m, 1H), 7.374 (d, J = 8.54 Hz, 2H).

<실시예 7> 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

단계 1: 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)티오)이소퀴놀린의 제조

상기 실시예 1의 단계 1과 같이 수행하되, 4-플루오로벤젠티올을 대신하여 4-(트리플루오로메틸)벤젠티올 (1.527 mmol)을 사용하여 목적 화합물을 수득하였다 (59%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.335 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 8.269 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.811 (d, J = 7.93 Hz, 1H), 7.710 (m, 1H), 7.630 (m, 5H), 7.465 (d, J = 5.49 Hz, 1H)

단계 2: 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)설피닐)이소퀴놀린의 제조

상기 단계 1에서 제조한 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)티오)이소퀴놀린 (250 mg)을 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 1의 단계 2와 같이 수행하여, 최종 목적 화합물을 수득하였다 (62%).

¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.972 (d, J = 8.54 Hz, 1H), 8.558 (d, J = 5.49 Hz, 1H), 7.946 (d, J = 8.24 Hz, 2H), 7.880 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.714 (m, 5H).

상기 실시예 1-7에서 제조한 화합물의 화학 구조식을 하기 표 1에 나타내었다.

실시예	화학 구조식	실시예	화학 구조식
1		5
2		6
3		7
4

<실험예 1> 오토파지 조절 활성 평가

본 발명에 따른 신규 이소퀴놀린 유도체의 오토파지 조절 활성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

<1-1> 오토파지 지표 분석

오토파지 지표인 LC3-I에서 LC3-II로의 변환을 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다.

구체적으로, 웨스턴 블롯은 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 60 mm 세포배양 플레이트에 20 × 10⁵ 개로 분주하고 하루 동안 배양하였다. DMSO 용액을 이용하여 본 발명 실시예 1 화합물을 1, 5, 10, 및 20 μM 처리한 후, 하루 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 0.1% Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 떼어낸 후, 원심분리하여 세포를 포집하였다. 세포는 용해완충액 (RIPA lysis buffer) (50 mM Tris, pH 7.4, 0.1％ SDS, 1％ NP-40, 150 mM NaCl, 1mM PMSF, 10 mM NaF, 10 ug/ml aprotinin, 10 ug/ml leupeptin, 10 mM Na₃VO₄)를 사용하여 용해시킨 후, 원심분리하여 세포용해물(cell lysate)을 얻었다. 얻어진 세포용해물을 단백질 정량하여 동량 (50 ug)의 단백질을 함유한 세포용해물(cell lysate)을 4-12％ Bis-Tris 아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질들은 PVDF 막에 전이시킨 후, 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하였다. PVDF 막의 블록킹(blocking)은 5% 스킴 밀크가 함유된 TBST (25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-200)에서 1시간 동안 수행하였다. 1차 항체로서 항 LC3 항체(anti-LC3 antibody)를 사용하였다. 내부 표준 단백질로 Santacruz 사로부터 구입한 항 GAPDH (anti-GAPDH)를 사용하였다. 1차 항체는 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후 TBST 완충 용액으로 3회 세척하고, 2차 항체 (horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG)와 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 PVDF 막은 TBST 완충액으로 3회 세척하고 ECL 용액과 반응시킨후 화학적발광 (Chemiluminescence)을 이미지 장비를 이용하여 획득하였고, 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1은 Raw 264.7 마우스 대식세포에 본 발명에 따른 실시예 1 화합물 1, 5, 10, 및 20 μM 처리에 따른, LC3-I 및 LC3-II의 변환을 확인한 웨스턴 블롯 그래프이다.

<1-2> 세포내 오토파고좀 시각화 분석

오토파지 조절에 의한, 오토파고좀을 탐지하기 위하여, 세포질 내 산성소포제를 선택적으로 염색하는 아크리딘 오렌지(acridine orange)를 이용하여 관찰 분석하였다.

구체적으로, 오토파고좀은 세포질내에서 산성화로 인하여 축적된 아크리딘 오렌지의 프로토네인션에 의하여 형광특성의 변화가 발생하는데, 이러한 형광 특성을 이용하여 다음과 같이 실험하였다.

Raw 264.7 마우스 대식세포를 96-웰 플레이트에 5 × 10⁴개/웰이 되도록 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 안정화시켰다. Raw 264.7 세포에 5, 10, 20, 50 μM 농도별로 실시예 1 화합물을 처리하고, 1시간 후 LPS 1 ug/ml을 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 5 μM 아크리딘 오렌지를 포함하는 배지로 교체한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 15분간 염색하였다. 염색이 완료된 후 PBS 완충액을 이용하여 세척한 후, 형광현미경을 이용하여 세포내 오토파고좀 형성을 관찰하였다. 아크리딘 오렌지 형광에 의하여 시각화된 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2는 Raw 264.7 마우스 대식세포에 염증 반응을 조절한 후(LPS 처리), 본 발명 실시예 화합물 1의 5, 10, 20, 50 μM 처리 후, 관측되는 오토파고좀의 변화를 확인한 형광현미경 사진이다.

<실험예 2> 질환 관련 약효 평가

<2-1> 항염증 (NO) 활성 측정

대식세포는 염증반응을 일으키는 세포로, 스트레스나 자극이 일어났을 때 NO와 사이토카인을 생성하여 생체방어적인 역할을 한다. NO는 바이러스, 세균 등의 병원균에 대응하여 선천 면역 반응에 필수적인 역할을 수행하며 NO synthase(NOS)에 의하여 L-arginine이 생성되며, NOS는 cNOS(constitutive NOS)와 iNOS(inducible NOS)로 나뉜다. 이중 iNOS는 스트레스나 사이토카인 등의 자극시 다량의 NO를 생성하여 염증반응을 유발시킨다.

LPS에 의한 염증반응이 조절된 대식세포인 Raw 264.7에서 본 발명 실시예 1 화합물의 NO 생성에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

대식세포인 Raw 264.7 세포를 1 × 10⁵ 개/웰씩 96-웰 플레이트에 준비하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 안정화시켰다. Raw 264.7 세포에 농도별로 실시예 1 화합물을 처리하고 1시간 후 LPS 1 μg/ml을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. NO 생성 측정을 위하여 그리스(Griess) 시약을 40 mg/ml 준비하고 배양상등액과 동비로 혼합하고 상온에서 15분간 반응시킨후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이로부터 얻어진 결과를 토대로, LPS 기준 환산하여 NO 생성의 저해 효과를 백분율로 나타내었다(도 3의 (a)).

한편, 본 발명 실시예 화합물 1 농도별 처리에 따른, 세포 생존률을 계측하여, 대조군(Control) 대비 백분율로 나타내었다(도 3의 (b)).

도 3은 (a): LPS에 의한 NO 생성 조절(염증 반응 조절) 후, 본 발명 실시예 1 화합물을 각각 0.1, 0.5, 1, 10, 및 100 μM로 처리하고, 그리스 시약을 사용하여 흡광도로 측정된 NO 생성율을 LPS 기준 환산하여 백분율로 나타낸 그래프, 및 (b): 각각 LPS, 본 발명 실시예 1 화합물을 각각 0.1, 0.5, 1, 10, 및 100 μM 처리에 따른 세포 생조률을 대조군(Control) 대비 백분율로 나타낸 그래프이다.

도 3의 (a)를 살펴보면, 본 발명 실시예 1 화합물 처리로부터 NO 생성이 저해되는 것을 확인할 수 있고, 처리 농도가 증가됨에 따라 NO 생성 저해 효과 역시 큰 것으로 확인된다. 한편, 도 3의 (b)를 살펴보면, 본 발명 실시예 1 화합물은 유의할만한 세포독성이 확인되지는 않았는데, 10 μM 처리의 경우, 60%의 NO 생성 저해 효과가 확인되며, 세포독성은 12% 정도로써 NO 생성의 저해 효과가 세포독성에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

<2-2> 염증반응 관련 사이토카인 유전자 발현 측정

LPS는 그람음성균의 세포외막에 있는 내독소로 대식세포를 자극하여 염증매개성 사이토카인들의 분비를 자극하며, 이러한 전염증성 인자들은 면역세포를 활성화시켜 세균의 침입에 효과적으로 방어하도록 도와준다. 또한, LPS의 자극을 받은 대식세포에서 방출하는 사이토카인들은 정상적인 세포의 기능을 저하시킬 수 있으므로 LPS로 자극된 대식세포의 면역작용을 억제할 수 있는 약물의 발견은 매우 중요하다.

Raw 264.7 세포를 1 × 10⁵ 개/웰로 96-웰 플레이트에 준비하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 안정화시켰다. Raw 264.7 세포에 실시예 1 화합물-1을 1 μM 또는 10 μM로 처리하고, 1시간 후 LPS 1 μg/ml을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 세포는 PBS 완충액으로 세척하고, 0.1% Trypsin-EDTA를 이용하여 떼어낸후 원심분리하여 포집하였다. 세포 침전에 트라이졸 용액 (Trizole reagent) 을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA의 양을 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 약 100 ng의 RNA를 Verso SYBR Green 1-Step qRT-PCR Low ROX Mix와 혼합한 후, Real-time PCR기기 (ABI 7500 fast-real time PCR, Applied biosystem, USA)를 이용하여 수행하였다.

실시간 중합효소 연쇄반응에 사용한 유전자들은 Bioneer사에서 주문하였다. 중합효소 반응은 50℃에서 15분, 95℃에서 15분 수행한 후, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 15초, 효소반응 72℃인 사이클을 40회 반복 수행하였고, 상기 실험 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 본 발명에 따른 실시예 1 화합물 처리에 의한 염증반응 관련 사이토카인 IL-6의 유전자 발현량을 측정하여 나타낸 그래프이다.

<2-3> 염증반응 관련 단백질 발현 측정

본 발명 신규 이소퀴놀린 유도체에 의한 항염증 효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

대식세포인 Raw 264.7 세포에서 LPS 처리에 의한 염증반응 조절로부터, 염증성 단백질인 인터루킨-6 (IL-6)와 인터루킨-1베타 (IL-1β) 등이 세포 외부로 분비된다. 이 실험은 LPS에 의한 염증반응 조절 후, 분비되는 염증성 단백질들의 양을 효소결합면역흡착측정법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정함으로써 항염증 활성을 평가하는 방법이다.

구체적으로, Raw 264.7 세포를 1 × 10⁵ 개/웰로 96-웰 플레이트에 준비하고 24시간 동안 5% CO₂를 유지하는 37℃배양기에서 안정화시켰다. Raw 264.7 세포에 본 발명 실시예 1 화합물을 0.1, 1, 및 10 μM로 처리하고, 1시간 후 LPS 1 μg/ml을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포배양액만을 취한후 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 분비된 인터루킨의 정량은 시판되는 Elabscience사의 키트를 사용하였고, 시험과정은 제조사 매뉴얼에 준하여 수행하였다. 배양세포로부터 얻어진 배양액 100 μl를 제공된 웰에 분주한 후, 37℃에서 90분간 배양하였다. 배양액을 제거하고 100 μl의 biotin이 표지된 선택적 항체를 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 씻어주었다. HRP가 표지된 100 μl 용액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 5회 씻어주었다. HRP의 특이적 기질을 포함한 용액을 90 μl 첨가한 후, 37℃에서 15분간 배양하였고, 50 μl의 종결 용액을 첨가한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 상기 실험 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 본 발명 실시예 1 화합물 0.1, 1, 및 10 μM에 의한 염증반응 관련 단백질 IL-6와 IL-1β의 단백질 측정량을 나타낸 그래프이다.

<2-4> 미백 효능 평가

본 발명 신규 이소퀴놀린 유도체의 미백 효능 평가를 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

제브라피쉬의 검은색 멜라닌 세포는 각질세포로 이동하지 않고 멜라닌 세포에 국한되어 존재하는 특성을 지녔다. 이는 멜라닌 색소의 재생성을 관찰할 때, 멜라닌 색소 형성을 억제시킨 뒤, 멜라닌 세포 생성 경로에 국한시켜 조사할 수 있고, 초기 발생단계에서 합성된 멜라닌 관찰이 용이하기 때문에, 제브라피쉬는 다른 동물 모델과 비교하여 멜라닌 색소 변화 연구에 보다 유용하다(Logan DW, Burn SF, Jackson IJ. (2006) Regulation of pigmentation in zebrafish melanophores. Pigment Cell Res. 2006 Jun;19(3):206-13.).

구체적으로, 수정 후 10시간 시점의 제브라피쉬 수정란을 24-웰 플레이트에 10 개체씩 넣고, 사육수인 egg water를 1 ml 첨가한다. 각 웰에 실시예 1 화합물 0.1 μM, 1 μM을 희석하여 각 웰 최종 부피는 2 ml로 첨가한다. 이어서, 각 24-웰 플레이트를 호일로 감싸 빛을 차단시켜준 뒤, 28℃ 배양기에서 22시간 동안 배양한다. 수정 후 32시간의 시점에서, 검은색 멜라닌 세포의 형성을 촬영하기 위하여, Forcep(Fine Science Tools)을 이용하여 발생배의 양막(chorion)을 벗겨내고, Tricaine(4 g/L)으로 발생배를 마취한 뒤 3% 메틸 셀룰로즈(Methyl cellulose) 위에 발생배를 옮겨 촬영하였다. 발생배 촬영 장비는 LEICA MZ10F 형광 현미경, LEICA DFC425 카메라, Leica Application Suite 소프트웨어(v4.5)를 사용하였다. 모든 실험과정에서 발생배 배양에 쓰인 용액은 3차 증류수에 60 mg/L의 sea salt(Sigma-Aldrich, S9883)를 녹인 뒤, 멸균처리한 egg water를 사용하였다. 대조군으로 용매대조군(0.4% DMSO), 티로시나제 저해제로 알려진 페닐티오우레아(Phenylthiourea) (200 μM PTU)를 사용하였다(도 6의 (a)).

한편, 이미 생성된 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 저해능력을 확인하기 위해 수정 후 60시간 시점의 치어에서 실험을 진행하였다. 구체적으로, 수정 후 60시간째 치어를 24-웰 플레이트에 10 개체씩 넣고, 사육수인 egg water를 1 ml 첨가한다. 이어서, 실시예 1 화합물 10 μM, 20 μM을 희석하여 각 웰에 최종 부피 2ml로 첨가한다. 화합물을 넣어준 24-웰 플레이트를 호일로 감싸 빛을 차단시켜준 뒤, 28℃ 배양기에서 12시간 동안 배양한다. 검은색 멜라닌 세포의 형성을 촬영하기 위하여, Tricaine(4 g/L)으로 발생배를 마취한 뒤 3% 메틸 셀룰로즈(Methyl cellulose) 위에 발생배를 옮겨 촬영하였다. 촬영에는 상기에서 서술한 장비를 사용하였다(도 6의 (b)).

도 6은 (a): 수정 후 10시간 시점의 제브라피쉬 수정란을 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물을 처리하여 22시간 후의 수정 후 32시간 시점에서 멜라닌 세포 형성 저해 효과를 확인한, 제브라 피쉬의 사진이고, 및 (b)는 수정 후 60시간 시점의 제브라피쉬 치어를 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물을 처리하여 12시간 후의 수정 후 72시간 시점에서 멜라닌 합성 저해 효과를 확인한, 제브라 피쉬의 사진이다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 신규 이소퀴놀린 유도체의 우수한 멜라닌 합성 저해 효과가 확인된다. 특히, 수정 후 32시간 시점에서, PTU 0.2 mM 처리군과 비교하여, 본 발명 실시예 1 화합물 처리군은 1 μM의 처리에도 PTU 처리군과 유사한 수준으로 멜라닌의 합성이 저해됨을 확인하였다. 또한, 수정 후 72시간 시점에서, PTU 0.2 mM 처리군과 비교하여, 본 발명 실시예 1 화합물 처리군은 특히 20 μM 처리에서 PTU 대비 우수한 멜라닌 합성 저해 효과가 확인된다.

<2-5> 지방간 억제 효능 평가

본 발명 신규 이소퀴놀린 유도체의 지방간 억제 효능을 평가하기 위해, 지방방울(lipid droplet)을 염색할 수 있는 LipidGreen2 염색약을 사용하여 다음과 같이 실험하였다.

정상 간의 경우 지방이 차지하는 비율은 5% 정도인데, 이보다 많은 지방이 축적된 상태를 지방간(fatty liver)이라고 한다. 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간(alcoholic fatty liver)과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver)로 나눌 수 있다. 주요 원인은 음주와 비만이며, 혈중 지방질의 농도가 높은 고지혈증이나 당뇨병 등의 질병이 동반되어 나타나기도 하고, 부신피질 호르몬제(스테로이드제)나 여성 호르몬제 등의 약제도 원인이 될 수 있다.

타목시펜(tamoxifen)은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor α/β)에 대해, 에스트로겐(estrogen)과 경합, 결합하는 비스테로이드계 항에스트로겐제로서 영국ICI회사가 개발하여, 1980년대부터 여성호르몬 의존성 암에 내분비요법제로 가장 많이 이용되었다. 특히, 타목시펜을 처리한 제브라피쉬 치어에서는 간세포의 괴사가 일어나는 것이 알려졌으며, 성체 간에서 지방증의 소견이 확인되었다(Nam et al., (2016) Expression of miRNA-122 induced by liver toxicants in zebrafish. BioMed Research International. 2016:1-7.).

구체적으로, 본 실험예에 사용된 제브라피쉬는 수정 후 5일 시점의 치어이다. 건강한 치어 10 개체를 24-웰 플레이트에 넣고, egg water를 1 ml 넣어준다. 지방간이 조절되지 않은 음성대조군으로 DMSO를 0.4% 희석하여 치어에 노출시켜주었고, 알코올성 지방간을 조절하기 위해 타목시펜(Sigma-Aldrich, T5648)을 5 μM 희석하여 치어에 노출시켰다. 본 발명 실시예 1 화합물의 지방간 억제 효능을 알아보기 위해, 5 μM 타목시펜과 혼합하여 0.5 μM, 1 μM, 5 μM의 실시예 1 화합물을 치어에 노출시켰다(각 웰 최종 부피는 2 ml). 화합물을 넣어준 24-웰 플레이트를 호일로 감싸 빛을 차단시켜준 뒤, 28℃ 배양기에서 24시간동안 배양한다. 각 웰의 화합물을 제거하기 위해 egg water로 5분간 3회 수세한다. 지방 특이적 염색을 위하여 LipidGreen2를 5 μM로 희석하여 치어에 30분간 노출시킨 뒤, egg water로 5분간 3회 수세한다. 제브라피쉬 치어의 지방간을 평가하기 위해 Tricaine(4 g/L)으로 발생배를 마취한 뒤 3% 메틸 셀룰로즈(Methyl cellulose) 위에 발생배를 옮겨 촬영하였다. 발생배 촬영 장비는 LEICA MZ10F 형광 현미경, LEICA DFC425 카메라, Leica Application Suite 소프트웨어(v4.5)를 사용하였다. 사용된 형광 파장은 GFP Plants 필터 셋트(Excitation 470/40 nm, Emmision 525/50 nm)를 사용하였다. 이미지상 치어의 간 면적 및 지방 염색 정도를 정량하기 위해 각 이미지의 간 부분을 ImageJ 1.50i 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 면적 및 형광 세기를 정량하였고, 히트맵 이미지로 변환하였다. 상기 실험 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

도 7은 수정 후 5일된 제브라피쉬 치어를 대상으로, DMSO, 타목시펜, 본 발명 실시예 1을 각각 처리한 뒤, 관측한 일반 현미경 이미지, 형광 현미경 이미지, 및 히트맵 변환 이미지이다.

도 8은 수정 후 5일된 제브라피쉬 치어를 대상으로, DMSO, 타목시펜, 본 발명 실시예 1을 각각 처리한 뒤, 관측한 제브라피쉬 치어 이미지상의 간 면적(a) 및 형광 세기(b)를 ImageJ 1.50i 소프트웨어(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이다(p 값은 타목시펜 처리군 대비 각 실험군에 대한 t-검정 결과임. *p ≤ 0.01, **p ≤ 0.001).

도 7에서 일반 현미경 이미지와 형광 현미경 이미지상의 흰색 점선과 히트맵 변환 이미지상의 검은색 점선은 같은 치어의 간 부위를 표시하였으며, 특히, 히트맵 변환 이미지상에서 붉은색 계열로 표시될수록 형광 세기가 강하고, 푸른색 계열로 표시될수록 형광 세기가 약다는 것을 의미한다.

도 7에서, 본 발명 실시예 1 화합물 처리군으로부터 LipidGreen2 지방 염색 결과 타목시펜에 의해 조절된 지방간이 정상 수준으로 회복되는 효과가 확인된다.

또한, 도 8에서, 본 발명 실시예 1 화합물 처리군으로부터 정상 치어 수준의 간 면적이 유지되는 것을 확인할 수 있고, 지방 염색 결과 형광의 세기가 타목시펜 조절 지방간 치어에 비해 정상 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 3> 독성 평가

<3-1> 비선택적 일반 세포독성 평가

본 발명 실시예 1 화합물에 의한 다양한 세포주에서의 비선택적 세포독성을 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

본 실험은 각 다른 종으로부터 기원한 세포주인 VERO (African green monkey kidney cell line), HFL-1 (human embryonic lung cell line), L929 (mouse fibroblast cell line), NIH 3T3 (mouse embryonic fibroblast cell line), CHO-K1 (Chinese hamster ovary cell line), HMV-II (human malignant melanoma cell line)를 사용하였다.

구체적으로, VERO, HFL-1, L929, NIH 3T3 세포주는 DMEM 배지, CHO-K1은 RPMI1640 배지, HMV-II 세포는 DME/F-12 배지로 하였고, 각 배지에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 100 μg/mL의 항생제를 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂의 습윤화된 배양기에서 적응시켜 배양하였으며, 2-3일 마다 배양 접시(culture dish)의 70-80% 정도 성장 시점에서 PBS (Phosphate buffer solution)로 세척 후, Trypsin-EDTA(Gibco, USA)을 처리하여 계대 배양하였다.

본 실험예에 사용한 세포들은 개수가 15,000 - 25,000개가 되도록 96-웰에 분주한 후, 24시간동안 37℃, 5% CO₂의 습윤화된 배양기에서 적응시켜 배양하였다. 본 발명 실시예 1 화합물은 DMSO를 이용하여 10 mM이 되도록 제조한 후, 순차적으로 희석하고, 최종 농도가 되도록 각각의 세포에 처리하였고 24시간동안 배양하였다. 세포생존률 측정은 Cyto XTM cell viability assay kit (LPS solution)의 표준방법에 따라 수행하였다. 각각의 웰에 10 μl의 발색시약을 첨가하고 37℃, 5% CO₂의 습윤화된 배양기에서 2시간 배양한 뒤, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. DMSO 단독 처리군에서 측정된 흡광도에 비하여 변화된 흡광도의 비율을 계산하여 생존률을 산출하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 VERO, HFL-1, L929, NIH 3T3, CHO-K1, HMV-II 세포주를 대상으로, 본 발명 실시예 1 화합물의 농도별 처리에 따른 세포생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 9를 살펴보면, 본 발명 실시예 1 화합물은 10 μM의 까지 모든 세포주에서 유의할만한 독성이 없는 것으로 나타났다.

<3-2> 심장독성 평가

본 발명 실시예 1 화합물의 생체내 유입시 심장독성 유발 가능성을 평가하기 위하여, 부정맥의 주 원인으로 알려진 허그 (hERG, human ether-a-go-go related gene) K⁺ 채널 단백질에 대한 저해 가능성을 실험하였다.

먼저, 시험관 조건에서 허그 채널단백질에 결합하는 실시예 1 화합물의 결합력을 평가하는 리간드 결합력 시험을 수행하였다. 상온에서 허그 채널단백질을 포함하는 생체막을 10 μl씩 384-블랙 웰 플레이트에 분주한 후, DMSO, 양성 대조구인 E-4031, 실시예 1 화합물을 최종 시험농도의 4배가 되도록 제조한 후 5 μl씩 첨가하였다. 두 용액의 혼합액에 허그 채널단백질의 선택적 결합 물질로 알려진 아스테미졸(astemizole)에 형광물질이 부착되어진 트레이서 물질을 5 μl씩 분주한 후, 빛이 차단된 상온의 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 반응액에 포함된 트레이서 물질을 여기하기 위하여 530 nm의 빛을 조사한 후 되돌아 나오는 585 nm의 빛을 편광법으로 측정하였다. 본 실험에서 트레이서의 물질에 의한 높은 편광값은 허그 단백질과 트레이서와의 많은 결합을 의미하며, 반대로 낮은 편광값은 허그 단백질과 시험물질과의 많은 결합을 의미한다. 시험물질에 의한 허그 단백질 결합력은 DMSO 처리구 대비 저해율(%)로 표시하였다.

다음으로, 허그 채널단백질의 활성을 전기생리학적 방법을 이용하여 평가하기 위해, 패치클램프 시험을 수행하였다. 허그 채널단백질의 활성 측정은 허그 채널 단백질을 과발현시킨 HEK-293 세포주를 이용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂의 습윤화된 배양기에서 적응시켜 배양하였으며, 2-3일 마다 배양 접시(culture dish)의 70-80% 정도 자랐을 때, PBS (Phosphate buffer solution)로 세척 후, Trypsin-EDTA을 처리하여 계대 배양하였다. 시험을 위하여 2 × 10⁵개의 세포를 60 mm 세포 배양 접시에 분주한 후, 48시간 동안 5% CO₂의 습윤화된 배양기에서 배양한다. 배양된 세포는 Trypsin-EDTA(Gibco, USA)을 처리하여 떼어낸 후, 자동화 패치클램프 장비 (PatchXpress, Molecular device 사)에 적용하여 허그 채널단백질에 의한 K⁺의 흐름을 측정하였다.

상기 두 실험법에 의한 실험 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10은 본 발명 실시예 1 화합물에 의한 허그 채널단백질의 결합과 활성저해를 각각 리간드 바인딩 및 패치 크램프 곡선으로 나타낸 그래프이다.

도 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 실시예 1 화합물은 허그 채널단백질에서의 결합 및 활성저해가 10 μM에서 약 10% 정도인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 일반적인 독성 판단의 기준인 10 μM에서 50% 저해율에 크게 못미치는 바, 본 발명 실시예 1 화합물은 생체내에서 허그 채널단백질 저해에 의한 심장독성 유발 가능성이 낮은 것으로 판단된다.

<3-3> 피부독성 평가

본 발명 실시예 1 화합물의 피부접촉시 유발될 수 있는 피부독성의 가능성을 평가하기 위해, 생체의 피부와 유사한 구조로 제조된 인공피부를 이용하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, 실험은 OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 439, OECD (2010)과 제작사 (테고사이언스)의 추천 방법에 준하여 수행하였다.

먼저, 아가로스 배지에서 배양된 인공피부를 12-웰 세포배양 플레이트로 옮기고 배양배지를 첨가한 후, 5% CO₂의 습윤화된 37℃ 배양기에서 하루동안 배양하였다. 인공피부 배양면의 배지를 제거한 후, PBS 완충액을 이용하여 희석된 90 μl의 본 발명 실시예 1 화합물을 피부면에 골고루 도포하고, 상온에서 15분간 배양하였다. 세포표면을 10 ml PBS 완충액을 이용하여 2회 씻어주고, 새로운 배양배지를 첨가한 후, 5% CO₂의 습윤화된 37℃ 배양기에서 42시간 동안 배양하였다. 피부의 생존률을 측정하기 위하여 2 ml MTT 용액 (0.3 mg/ml)을 포함하는 12-웰 플레이트로 인공피부를 옮긴 후 3시간 동안 배양하였다. 염색된 인공피부 조직을 떼어내 500 μl의 0.04N-이소프로판올을 포함하는 튜브로 옮긴 후, 4시간 동안 진탕배양하여 탈색하였다. 용액은 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하고, 100 μl의 상등액을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험에 의한 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11은 인공피부 조직에 염색된 MTT를 이소프로판올을 이용하여 용출한 후, 측정한 흡광도를 기반으로 비히클, ARB, SDS, 본 발명 실시예 1 화합물 10, 20, 및 50 μM 처리군의 생존률을 산출한 그래프이다.

도 11에서, 양성 대조군인 5% SDS 처리에서는 피부 조직의 괴사로 인한 MTT 발색의 현저한 감소가 보여지는 반면, 본 발명 실시예 1 화합물은 20 μM까지 유의할만한 생존률 감소는 없었고, 단지 최대 농도인 50 μM에서만 소폭의 생존률 감소가 확인되었다.

<3-4> 안구독성 평가

본 발명 실시예 1 화합물의 안구 노출시 유발될 수 있는 안구독성 가능성을 평가하기 위해, 배양된 인공각막을 이용하여 다음과 같이 실험하였다.

아가로스 배지에서 배양된 인공각막 조직을 12-웰 세포배양 플레이트로 옮기고 배양배지를 첨가한 후, 5% CO₂의 습윤화된 37℃ 배양기에서 하루동안 배양하였다. 인공각막 배양면의 배지를 제거한 후, PBS 완충액을 이용하여 희석된 30 μl의 본 발명 실시예 1 화합물을 인공각막 표면에 골고루 도포하고 상온에서 30분간 배양하였다. 세포표면을 10 ml PBS 완충액을 이용하여 2회 씻어주고 새로운 배양배지를 첨가한 후, 5% CO₂의 습윤화된 37℃ 배양기에서 30분간 배양하였다. 각막의 생존률을 측정하기 위하여 2 ml MTT 용액 (1 mg/ml)을 포함하는 12-웰 플레이트로 인공각막을 옮긴 후, 3시간 동안 배양하였다. 염색된 인공각막 조직을 떼어내 1.5 ml의 이소프로판올을 포함하는 튜브로 옮긴 후, 진탕배양하여 탈색하였다. 용액은 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하고, 100 μl의 상등액을 96-웰 플레이트에 옮긴 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험에 의한 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12는 인공각막 조직에 염색된 MTT를 이소프로판올을 이용하여 용출한 후, 측정한 흡광도를 기반으로 비히클, ARB, 아세트산, 본 발명 실시예 1 화합물 10, 20, 및 50 μM 처리군의 생존률을 산출한 그래프이다.

도 12에서, 양성 대조군인 10% 아세트산 처리에서는 각막 조직의 괴사로 인한 MTT 발색의 현저한 감소가 보여지는 반면, 본 발명 실시예 1 화합물은 최대 농도인 50 μM 까지 생존률 감소가 관측되지 않았다.

<3-5> 간손상 지표 ALT(Aminotransferase) 활성 평가

본 발명 실시예 1 화합물의 간손상 지표 활성을 평가하기 위하여, 비만 조절 설치류 모델인 ob/ob 마우스에서 간손상 지표인 ALT(aminotransferase) 활성을 분석하였다.

ALT는 알라진 아미노기 전달효소로 케토산과 아미노산간의 아미노기 교환을 돕는 효소이다. 세포손상시 혈액내로 새어나간 효소를 측정하게 되며, 바이러스성 간염 같은 간 손상시 상승된다.

구체적으로, 실험 동물은 C57B/6 마우스에 렙틴이 결핍된 ob/ob 마우스를 사용하였고, 3주간 본 발명 실시예 1 화합물 10 mpk 또는 100 mpk를 투여하였다. 투여가 완료된 후, CO₂ 가스로 기절시키고 간을 수집하였다. 간 조직은 식염수로 세척한 뒤, 50 mg을 떼어내어 균질화 하였다. 원심분리하여 용해물만 따로 수집하였다. 용해물과 효소 반응을 위한 기질을 넣어주고 535/587 nm로 형광값을 측정하였고, 그 결과를 도 13의 그래프로 나타내었다.

도 13은 비만 조절 설치류 모델에서, 각각 비히클, 양성대조군(10 mpk Rosi), 본 발명 실시예 1 화합물(10 mpk 및 100 mpk) 투여 후, 간손상 지표인 ALT(aminotransferase) 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

<3-6> 산화스트레스 평가

본 발명 실시예 1 화합물의 산화 스트레스 평가를 위하여, 비만 조절 설치류 모델인 ob/ob 마우스에서 산화 스트레스 지표인 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substance) 활성을 분석하였다.

지질의 과산화는 잘알려진 세포손상의 메카니즘으로 산화적 스트레스의 지표로 사용된다. TBARS의 측정은 지질의 과산화 확인법으로 MDA와 TBA(Thiobarbituric acid)가 결합하여 MDA-TBA 생성물을 형성하는데 이것을 측정함으로써 지질의 과산화 정도를 알 수 있다.

구체적으로, 실험 동물은 C57B/6 마우스에 렙틴이 결핍된 ob/ob 마우스를 사용하였고, 3주간 본 발명 실시예 1 화합물 10 mpk 또는 100 mpk를 투여하였다. 투여 완료 후, CO₂ 가스로 기절 시키고 간을 수집하였다. 간 조직은 식염수로 세척한 뒤 50mg을 떼어내어 균질화 하였다. 원심분리하여 용해물만 따로 수집하였다. 95℃의 산성조건에 MDA와 TBA의 반응의 결과로 형성된 MDA-TBA 생성물은 532 nm O.D 값으로 측정하였고, 그 결과는 도 14에 나타내었다.

도 14는 비만 조절 설치류 모델에서, 각각 비히클, 양성대조군(10 mpk Rosi), 본 발명 실시예 1 화합물(10 mpk 및 100 mpk) 투여 후, 산화 스트레스 지표인 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substance)의 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

Claims (11)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식 1에 있어서,
   R¹은 치환된 페닐이되,
   상기 치환된 페닐은 2번 및 4번 위치 중 하나 이상의 위치가 할로젠으로 치환되거나, 또는 상기 치환된 페닐 4번 위치가 트리할로젠메틸로 치환되고;
   X 및 Y 중 어느 하나는 CH이고, 다른 하나는 N이고; 및
   Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이되,
   다만, 상기 화학식 1에 따른 화합물로서 4-[(4-플루오로페닐)티오]퀴놀린은 제외한다.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
   (1) 1-((4-플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린;
   (2) 1-((4-플루오로페닐)티오)이소퀴놀린;
   (3) 1-((4-플루오로페닐)설포닐)이소퀴놀린;
   (4) 4-((4-플루오로페닐)설피닐)퀴놀린;
   (5) 1-((2,4-디플루오로페닐)설피닐)이소퀴놀린;
   (6) 1-((4-클로로페닐)설피닐)이소퀴놀린; 및
   (7) 1-((4-(트리플루오로메틸)페닐)설피닐)이소퀴놀린.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이되,
   상기 대사성 질환은 비만, 알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식 1에 있어서,
   R¹은 치환된 페닐이되,
   상기 치환된 페닐은 2번 및 4번 위치 중 하나 이상의 위치가 할로젠으로 치환되거나, 또는 상기 치환된 페닐 4번 위치가 트리할로젠메틸로 치환되고;
   X 및 Y 중 어느 하나는 CH이고, 다른 하나는 N이고; 및
   Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 과색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식 1에 있어서,
   R¹은 치환된 페닐이되,
   상기 치환된 페닐은 2번 및 4번 위치 중 하나 이상의 위치가 할로젠으로 치환되거나, 또는 상기 치환된 페닐 4번 위치가 트리할로젠메틸로 치환되고;
   X 및 Y 중 어느 하나는 CH이고, 다른 하나는 N이고; 및
   Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다.
10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 함유하는 미백용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    

    

    
    상기 화학식 1에 있어서,
    R¹은 치환된 페닐이되,
    상기 치환된 페닐은 2번 및 4번 위치 중 하나 이상의 위치가 할로젠으로 치환되거나, 또는 상기 치환된 페닐 4번 위치가 트리할로젠메틸로 치환되고;
    X 및 Y 중 어느 하나는 CH이고, 다른 하나는 N이고; 및
    Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다.
    
11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이되,
    상기 대사성 질환은 비만, 알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    

    

    
    상기 화학식 1에 있어서,
    R¹은 치환된 페닐이되,
    상기 치환된 페닐은 2번 및 4번 위치 중 하나 이상의 위치가 할로젠으로 치환되거나, 또는 상기 치환된 페닐 4번 위치가 트리할로젠메틸로 치환되고;
    X 및 Y 중 어느 하나는 CH이고, 다른 하나는 N이고; 및
    Z는 S, 설피닐 또는 설포닐이다.
    

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