KR20040037611A - 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 그를 이용한 브로콜리식물체싹의 대량 생산 방법 - Google Patents

브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 그를 이용한 브로콜리식물체싹의 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 이를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직을 배 유기용 배지에 배양하여 배를 유기시키는 단계; 2) 단계 1의 배를 절단하여 캘러스 형성 배지에 치상한 후 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계; 3) 단계 2의 캘러스로부터 배발생 세포를 형성시키는 단계; 및 4) 단계 3의 배발생 세포를 호르몬이 제거된 배지에 옮겨 계대배양을 실시하는 단계를 포함하는 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 이를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 브로콜리의 체세포배 배양 방법은 종자로부터 얻을 수밖에 없었던 브로콜리의 식물체싹을 체세포를 이용하여 대량 생산하게 함으로써 짧은 시간 내에 간편하게 무한정으로 브로콜리의 식물체싹을 생산할 수 있으며, 상기의 방법으로 생산된 브로콜리의 유식물체는 항암제성분인 설포라판이 다량 함유되어 있으므로 항암용 건강식품 또는 의약품의 원료로써 값싸게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 브로콜리의 형질전환 등과 같은 생명공학 기술에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 그를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법{Method of culturing somatic embryo of broccoli and method for the mass-production of broccoli sprouts using the same}
본 발명은 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 이를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종자로부터 얻을 수밖에 없었던 브로콜리의 식물체싹을 체세포를 이용하여 대량 생산하게 함으로써 짧은 시간 내에 간편하게 무한정으로 브로콜리의 식물체싹을 생산할 수 있는 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 이를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
암은 미국에서 두 번째로 사망률이 높은 질환이며, 해마다 사망하는 사람들 중 거의 1/4이 암으로 사망한다고 알려져 있다(Parker S.L., et al.,Ca Cancer J. clin.,1997, 47, 5-27). 어떤 종류의 암의 경우에는 발생율이 줄어들고 있기도 하지만, 다른 암의 경우에는 발생율이 증가한다. 따라서, 초기에 진단하고 치료하는 기술이 발전하였음에도 불구하고, 전체적인 암 사망률은 1970년대 이후로 거의 변화되지 않고 있다. 따라서, 암의 예방에 관한 더 많은 연구가 요구되고 있는 실정이다(Bailar J.C.,N. Engl. J. Med.,1997, 336, 1569-1574). 지난 20년 동안 암을 예방하기 위한 식생활로서 과일과 야채의 섭취가 강조되어 왔으며(Nestle M.,J. Natl. Cancer Inst. Monogr.,1992, 12, 153-157), 최근에는표 1에 나열된 것과 같은 식물에 기초한 섭취에 높은 우선권을 부여하고 있다(American Cancer Society Advisory Committee on Diet, Nutrition, and Cancer Prevention,Ca Cancer J. Clin.,1996, 46, 325-341; World Cancer Research Fund and American Institute for Cancer Research,Food, Nutrition and the Prevention of Cancer,1997).
다이어트와 암의 발생을 억제하기 위한 미국 암학회의 지침
섭취할 수 있는 가장 많은 양의 식물을 식품으로 선택할 것매일 다섯 개 이상의 과일 또는 야채를 섭취할 것빵, 곡류제품, 쌀, 파스타 또는 콩과 같은 식물 유래 음식을 매일 수 차례 섭취할 것
고지방 식품, 특히 동물 유래의 식품 섭취를 제한할 것저지방 식품을 선택할 것육류, 특히 고지방 육류의 소비를 제한할 것
육체적으로 활동적일 것: 건강한 체중을 획득하고 유지할 것적어도 30분 동안 또는 그 이상 일주일 중 대부분 동안 적어도 적당하게 활동적일 것건강한 몸무게 범위를 유지할 것
만일 음주를 한다면, 알콜 음료의 소비를 제한할 것
상기와 같은 지침들은 심장질환과 같은 식이와 관련되는 다른 만성질환을 예방하기 위한 권고안과 전적으로 일치하며(Nestle M.,J. Natl. Cancer Inst. Monogr.,1992, 12, 153-157), 이것은 식물의 섭취와 몇몇 주요 부위에서의 암 발생율 감소의 연관성을 보여주는 강력한 증거들에 의해서 확인된다(World Cancer Research Fund and American Institute for Cancer Research,Food, Nutrition and the Prevention of Cancer,1997; Block G., et al.,Nutr. Cancer,1992, 18, 1-29; Steinmetz K.A., et al.,Cancer Causes Control,1991, 2, 325-357). 상기와 같은 사실에 근거하여, 식물에 기초한 식이를 함으로써 20% (World Cancer Research Fund and American Institute for Cancer Research,Food, Nutrition and the Prevention of Cancer,1997) 내지 50% (Steinmetz K.A., 1996,J. Am. Diet.Assoc.,1996, 96, 1027-1039) 정도의 암 발생을 억제할 수 있을 것으로 추정되고 있다.
역학조사 및 동물 모델 연구로부터, 몇몇 식물들이 암의 발생 위험을 현저하게 감소시킨다는 것이 알려져 있다. 이러한 식물들 중에는 배추과(cruciferous) 식물에 속하는 브로콜리, 양배추, 꽃양배추(cauliflower) 및 브루쎌 식물체싹(Brussels sprout)과 같은 브라시카 속(Brassicagenus)의 식물들이 있다. 미국 국가 위원회에서는 1980년대부터 암의 발생을 방지하기 위하여 이러한 식물들을 섭취하도록 권고해왔다(National Research Council,Diet, Nutrition, and Cancer,1982).
브라시카 속의 식물들은 낮은 지방 함유량을 보이며, 에너지가 낮고, 비타민, 미네랄 및 식이섬유가 다량 함유되어 있다. 이러한 모든 특성들은 암 발생의 억제와 관련이 있다. 또한, 이들은 많은 양의 식물화학물질을 포함하는데, 이들 중 어떤 것들은 다양한 시험관내(in vitro) 및 동물 모델에서 암의 발생을 억제한다고 알려져 있다(Steinmetz K.A., 1996,J. Am. Diet. Assoc.,1996, 96, 1027-1039).
파헤이 등의 연구는 브라시카 속의 식물에 존재하는 특정한 식물화학물질을 동정하는데 맞춰져 있는데(Fahey J.W., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1997, 94, 10367-10372), 상기 연구에서는 식물화학물질이 효소 시스템의 활성을 유도하여 발암물질을 중화시킨다고 보고하고 있다. 몇몇 효소 시스템은 산화, 환원또는 가수분해에 관여하며(phase 1), 이후 약재, 대사산물, 발암물질 및 다른 독성 화합물과 결합하거나 또는 다른 방법으로 영향을 미쳐(phase 2) 이들의 극성(polarity) 및 배출성(excretability)을 증가시킨다. 페이스 1 효소들은 실험 조건에 따라서 발암물질들을 활성화시키거나 또는 불활성화시키며, 페이스 2 효소들은 독성을 더 많이 중화시킨다. 현재까지, 배추과의 식물들을 섭취하면 실험적인 시스템에서 효소의 해독(detoxification)을 유도하는 것으로 알려져 있다(National Research Council,Diet, Nutrition, and Cancer,1982).
현재, 페이스 1 및 페이스 2 효소 시스템 모두를 유도할 수 있는 양기능성(bifunctional) 식물화학물질을 페이스 2 효소만을 유도하는 단일기능성(monofunctional) 식물화학물질로부터 구별하기 위한 시험관내 분석 방법을 개발하였으며, 상기 분석방법을 이용하여 브라시카 식물체가 단일기능성 페이스 2 유도자(inducer)를 특별히 풍부하게 함유하고 있고(Prochaska H.J.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89, 2394-2398), 이소티오시아네이트 설포라판(isothiocyanate sulforaphane)이 브로콜리 추출물에서의 주된 페이스 2 유도자임을 밝혔다(Zhang Y., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89, 2399-2403). 또한, 이들은 설포라판이 래트에서 발암물질에 의해서 유도되는 종양의 발생을 농도-의존적으로 억제한다는 것을 확인하였다(Zhang Y., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1994, 91, 3147-3150).
이러한 활성의 대부분은 설포라판 및 글루코라파닌(glucoraphanin)의 글루코시놀레이트(glucosinolate) 전구체로부터 유래된 것이다. 식물체싹 이후에는 페이스 2 효소의 합성이 일어나지 않기 때문에, 식물이 성장할수록 이들 전구체의 농도는 감소된다. 브로콜리 식물체싹의 추출물은 성숙한 브로콜리 식물체보다 페이스 2 유도자 활성이 10-100배 더 높으며, 래트에서의 종양발생을 더 효과적으로 억제하였다. 반면에, 성숙한 브로콜리는 페이스 2 뿐만 아니라 페이스 1 효소도 유도하는 인돌 화합물을 상당량 함유하고 있다. 따라서, 식물체싹은 항암활성에 있어서 성숙한 브로콜리보다 적어도 두가지 장점을 더 가지고 있는 것으로 보인다. 즉, 브로콜리 식물체싹은 높은 농도의 유도자를 포함하고 있으며, 또한 상기 유도자는 페이스 2 효소 시스템에 주로 작용한다. 상기 사실에 기초하여, 파헤이 등은 작은 양의 배추과 식물체의 식물체싹은 동일한 종류의 많은 양의 성숙한 식물체의 경우와 동일한 항암 활성을 가지고 있다고 결론지었다.
브로콜리는 배추과 작물의 하나로서 채소로 이용될 뿐만 아니라 브로콜리 내에 함유하고 있는 설포라판(Sulforaphane)은 항암물질(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1997, 94, 10367-10372)과 위내에서 위암을 일으키는 헬리코박터 세균을 특이적으로 죽인다는 연구 결과가 보고되어 그 효과가 탁월하다는 것이 입증되었다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2002, 99, 7610-7615). 브로콜리 내에 있는 설포라판이라는 물질은 브로콜리 뿐만 아니라 배추과 작물인 배추, 무 등에서도 함유되어 있으나 그 함유량이 극히 미미한 편이며 브로콜리 내에서도 식물체싹이다른 부위보다 50-100배정도 더 높은 설포라판을 함유하고 있다(Marion Nestle,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1997, 94, 11149-11151). 설포라판은 화학적으로 합성하기가 어렵고, 식물체싹은 종자로부터 생산되기 때문에 그 가격이 매우 높아서, 많은 암환자나 암예방을 원하는 사람들에게 충분히 보급되지 못하는 실정이다.
한편, 종자로부터 배를 발생시키는 전통적인 방법 외에 체세포를 이용한 배발생법에 의한 유식물체 생산은 가시오갈피, 인삼 등에서 이미 보고되었으나, 브로콜리의 경우에는 아직 보고된 바가 없다(Plant Cell Reports,1991, 9, 514-516;Korean J. Plant Tissue Culture,1993, 20, 216-266).
이에, 본 발명자들은 브로콜리의 약(anther)을 이용한 브로콜리의 체세포배 배양 방법을 개발하였고, 상기 방법을 이용하여 설포라판의 함유량이 뛰어난 브로콜리의 식물체싹을 대량으로 생산함으로써 지금까지 종자로부터만 생산할 수 있어서 고가였던 브로콜리의 식물체싹을 매우 경제적으로 저렴하게 생산할 수 있으며, 상기 브로콜리 식물체싹을 직접 또는 가공하여 건강식품 또는 의약품으로 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 브로콜리의 체세포배 배양 방법 및 이를 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 건강식품 및 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 약배양 방법을 통하여 형성된 배(embryo)를 이용하여 캘러스를 유도하는 사진이고,
도 2는 절단면으로부터 유기된 캘러스를 보여주는 사진이고,
도 3은 배발생 캘러스(embryogenic callus)가 유기된 것을 보여주는 사진이고,
도 4는 배발생세포(embryogenic cell)의 현탁배양을 보여주는 사진이고,
도 5는 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법을 보여주는 사진이고,
도 6은 체세포 배발생으로부터 유기된 유식물체(plantlet)를 보여주는 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직을 배 유기용 배지에 배양하여 배를 유기시키는 단계; 2) 단계 1의 배를 절단하여 캘러스 형성 배지에 치상한 후 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계; 3) 단계 2의 캘러스로부터 배발생 세포를 형성시키는 단계; 및 4) 단계 3의 배발생 세포를 호르몬이 제거된 배지에 옮겨 계대배양을 실시하는 단계를 포함하는 브로콜리의 체세포배 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 체세포배 배양 방법을 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 브로콜리의 체세포배 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 브로콜리의 체세포배 배양 방법은
1) 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직을 배 유기용 배지에 배양하여 배를 유기시키는 단계;
2) 단계 1의 배를 절단하여 2,4-D를 포함하는 캘러스 형성 배지에 치상한 후 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계;
3) 단계 2의 캘러스로부터 배발생 세포를 형성시키는 단계; 및
4) 단계 3의 배발생 세포를 호르몬이 제거된 배지에 옮겨 계대배양을 실시하는 단계를 포함한다.
단계 1에 있어서, 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직은 브로콜리의 종자, 약(anther), 뿌리, 줄기 및 잎으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중에서 브로콜리의 종자 또는 약인 것이 바람직하고, 브로콜리의 약인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 약을 사용하여 배양한 경우를 예시하였다. 브로콜리의 약은 모든 발생단계의 약을 사용할 수 있으나, 1핵기 전후 시기의 소포자를 가지는 약을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 배 발생용 배지는 MS 배지(Duchefa M0231), Gamborg B5 배지(Duchefa G0210) 및 하기표 2의 조성을 가지는 B5 수정배지로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중에서 B5 수정배지를 사용하는 것이 바람직하다.
B5 수정배지를 사용하는 경우 0.1 ㎎/ℓ NAA, 0.1 ㎎/ℓ 2,4-D 및 125 ㎎/ℓ AgNO3를 포함하는 것이 가장 바람직하지만 상기 농도는 조건에 따라서 어느 정도 변화될 수 있음은 당업자에게 있어서는 자명하다.
단계 2에 있어서, 캘러스 형성 배지는 Chu(N6)(Duchefa C0204), Gamborg B5 및 MS 배지로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중에서 MS 배지를 사용하는 것이 바람직하다. MS 배지를 사용하는 경우 2,4-D가 포함되는 것이 바람직하며, 이때 0.1 내지 1.0 ㎎/ℓ의 농도가 더욱 바람직하고 0.2 내지 0.5 ㎎/ℓ의 농도인 것이 가장 바람직하다.
상기 단계 2에서 생성된 캘러스를 배양함으로써 단계 3의 배발생 세포가 형성된다.
단계 4에 있어서, 배지는 상기 단계 2에서 사용된 것과 동일한 종류의 배지를 사용할 수 있으며, 이 중에서 MS 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 브로콜리의 체세포배 배양을 위하여, 바람직한 실시예로서 브로콜리 약 유래 배로부터 캘러스를 유도한 후 그로부터 체세포배를 생산하였다. 구체적으로, 브로콜리 약을 배양한 후 2O일 정도 경과된 시점부터 배(embryo)가 유기되었으며, 상기 배를 절단한 후 배지에 치상하여 배양(도 1참조)한 결과, 잘린 배 조직이 비대해지고 잘린 부위에 캘러스가 형성되었다(도 2참조). 이렇게 형성된 캘러스를 동일배지에 계대한 결과, 처음 형성된 캘러스는 하얗고 윤기가 없으며 조직이 엉성해 보였는데 수 차례 계대를 할수록 캘러스가 증식되면서 윤기가 나고 돌기를 형성하는 배발생 캘러스(embryogenic callus)가 형성되었다(도 3참조). 상기 배발생 캘러스를 계대 후, 형성된 브로콜리 배발생 세포(embryogenic cells)를 액체배지가 들어있는 삼각플라스크에서 암소(dark condition)에서 현탁 배양하면(도 4참조), 배발생 세포는 세포괴(cell cluster)를 형성하는데, 20일정도 배양하였을 때 최초 중량의 약 10배정도로 생중량이 증가한다. 이들 중 구상형배가 형성된 것들은 동일배지에 계대하여 형광빛 조건에서 배양하고, 나머지 세포는 새 배지에 옮겨 상기와 동일한 방법으로 배양함으로써 배발생세포는 배발생능을 유지하면서 증식된다(도 5참조). 상기의 방법으로 형성된 식물체싹을 배양접시에서 배양하면 브로콜리의 유식물체가 형성된다(도 6참조). 따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 체세포배 배양 방법에 의하여 브로콜리의 배발생 세포가 영구적으로 유지 및 증식이 가능함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 체세포배 배양 방법을 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 대량 생산 방법은
1) 배발생 세포(embryogenic cells)를 선발하여 배양하는 단계;
2) 단계 1의 세포를 증식시키고 형성된 세포괴를 분리하는 단계; 및
3) 단계 2의 세포괴를 대량 배양하는 단계를 포함한다.
단계 1에 있어서, 배발생 세포는 브로콜리의 종자, 약, 뿌리, 줄기 및 잎으로 구성된 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래될 수 있으며, 이 중에서 브로콜리의 종자 또는 약으로부터 유래되는 것이 바람직하고, 브로콜리의 약으로부터 유래되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 대량 생산 방법은 기존에 브로콜리의 종자를 사용하여 얻을 수밖에 없었던 브로콜리의 식물체싹을 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직을 이용하여 체세포 배발생 방법으로 배양함으로써 간편하고 저렴하게 브로콜리의 식물체싹을 대량 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.
앞서 언급한 바와 같이, 브로콜리의 식물체싹은 높은 농도의 설포라판을 함유하고 있다. 따라서, 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 건강식품은 브로콜리의 식물체싹을 그대로 사용하거나 건조시킨 후 분말 형태로 사용할 수 있으며, 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분으로서 브로콜리 식물체싹의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 브로콜리 식물체싹은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용 범위가 없이 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 브로콜리 식물체싹을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 반드시 이에 한정되지 않음은 당업자에게 있어서 자명하다.
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라서 환제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태로 제조할 수 있고, 필요에 따라 사용시에 다른 제형으로 바꾸어 사용할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구로 투여하는 것이 바람직하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 브로콜리의 식물체싹은 실제 임상 투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 브로콜리의 식물체싹에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자의 체중, 연령, 성별, 병증의 경중정도와 소화상태에 따라 복용량을 증감할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 브로콜리의 체세포배발생(somatic embryogenesis)
본 발명자들은 브로콜리의 체세포배 배양을 위하여, 브로콜리 약에서 유래된 배로부터 캘러스를 유도한 후 그로부터 체세포배를 생산하였다. 구체적으로, 브로콜리 약배양을 하기 위하여 브로콜리의 꽃봉오리(bud)를 채취하여 70% 에탄올에 10초간, 2.5% 소디움 하이포클로라이트액(sodium hypochlorite solution)에 15분간 소독한 후 멸균수를 이용하여 수차례 세척하였다. 소독된 봉오리 중 1핵기 전후 시기의 소포자를 가지는 약을 채취하여 14%의 수크로즈(sucrose)(Duchefa S0809), 0.1 ㎎/ℓ NAA (Duchefa N0903), 0.1 ㎎/ℓ 2,4-D (Sigma D4517) 및 125 ㎎/ℓ AgNO3(Duchefa S0536)를 포함하는 B5 수정배지(표 2참조)(pH 5.8로 조정한 후 121℃, 1.2기압 하에서 습열멸균)가 들어있는 페드리디쉬에 치상한 후 32℃에서 24시간동안 고온처리하였으며, 이후 25℃에서 암배양하였다. 상기와 같이 배양 후 2O일이 경과된 시점부터 배가 유기되었다.
상기 배로부터 캘러스를 유도하기 위하여, 배를 절단한 후 3% 수크로즈,0.6% 식물성아가(phytoagar)(Duchefa P1003)를 포함하며, 0.2 ㎎/ℓ 또는 0.5 ㎎/ℓ 2,4-D가 포함된 MS 배지(pH 5.8)에 각각 치상하였다(도 1). 그 결과, 잘린 배 조직이 비대해지고 잘린 부위에 캘러스가 형성되었다(도 2). 상기 캘러스를 3∼4주 간격으로 동일 배지로 계대하였다.
그 결과, 처음 형성된 캘러스는 하얗고 윤기가 없으며 조직이 엉성해 보였는데, 수차례 계대를 할수록 캘러스가 증식되면서 윤기가 나고 돌기를 형성하는 배발생 캘러스가 형성되었다(도 3).
상기 배발생 캘러스로부터 생성된 브로콜리 배발생 세포를 1O ㎖의 호르몬이 첨가되지 않은 MS 액체배지가 들어있는 300 ㎖의 삼각플라스크에서 100 rpm, 25℃, 암소에서 현탁 배양하였다(도 4). 배발생 세포는 상기 배양조건에서 분열증식을 계속하면서 세포괴를 형성하는데, 20일정도 배양하였을 때 최초 중량의 약 10배정도로 생중량이 증가하였다. 이들 중 구상형배가 형성된 것들은 동일배지에 계대하여 형광빛 조건에서 배양하였다. 나머지 세포는 새 배지에 옮겨 상기와 동일한 방법으로 배양하였으며, 이렇게 함으로써 배발생 세포는 배 발생능을 유지하면서 증식되었다(도 5). 상기의 방법으로 형성된 식물체싹을 배양접시에서 배양하면 브로콜리의 유식물체가 형성되었다(도 6). 상기 실험결과를 하기표 3에 요약하였다.
No. 캘러스 유도2,4-D(㎎/ℓ) Sub 1.2,4-D(㎎/ℓ) 배의유기정도 Sub 2.2,4-D(㎎/ℓ) 배의유기정도 Sub 3.2,4-D(㎎/ℓ) 배의유기정도
BB1 0.2 0.2 + 0.2 +++
0.2 0.2 + 0.1 -
0.5 0.5 - 0.5 +++
0.5 0.2 +(Kn 0.1 ㎎/ℓ) + 0.2 -
0.5(2차배 유기) 0 ++
BA12 0.2(2차배 유기) 0 - 0.2 ++ 0.2 ++++
0.1 -
0.2 0 - 0.1 -
0.5 0.5 - 0.5 -
0.5 0.2 - 0.2 -
0.5 0 - 0 -
상기표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 브로콜리 유전자형(genotype) 별로 호르몬의 농도 차이는 있으나, 전체적으로 볼 때 생성된 캘러스를 계대함으로써 배(embryo)의 유기율이 좋아짐을 확인하였다. 즉, BA12는 2,4-D가 0.2 ㎎/ℓ인 경우에 동일배지에 계대를 할수록 배 유기정도가 눈에 띠게 증가하였으며, BB1의 경우에는 0.2 ㎎/ℓ 2,4-D와 0.5 ㎎/ℓ 2,4-D에서 모두 반응을 보였는데, 동일배지에 두차례 이상 계대한 후 배(embryo)가 가장 많이 유기됨을 볼 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명자들은 체세포배 배양 방법에 의하여 브로콜리의 배발생 세포가 영구적으로 유지 및 증식이 가능함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 브로콜리의 체포 배 배양 방법은 종자로부터 얻을 수밖에 없었던 브로콜리의 식물체싹을 브로콜리의 체세포를 이용하여 대량 생산하게 함으로써 짧은 시간 내에 간편하게 무한정으로 브로콜리의 식물체싹을 생산할 수 있으며, 상기의 방법으로 개발된 브로콜리의 식물체싹은 항암식품 또는 의약품의 원료로써 값싸게 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 브로콜리의 형질전환 등 생명공학기술에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1) 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직을 배 유기용 배지에 배양하여 배를 유기시키는 단계;
2) 단계 1의 배를 절단하여 2,4-D를 포함하는 캘러스 형성 배지에 치상한 후 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계;
3) 단계 2의 캘러스로부터 배발생 세포를 형성시키는 단계; 및
4) 단계 3의 배발생 세포를 호르몬이 제거된 배지에 옮겨 계대배양을 실시하는 단계를 포함하는 브로콜리의 체세포배 배양 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1의 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직은 브로콜리의 종자, 약, 뿌리, 줄기 및 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직은 브로콜리의 종자 또는 약인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 배를 형성할 수 있는 브로콜리의 조직은 브로콜리의 약인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2의 캘러스 형성 배지는 0.05 내지 5.0 ㎎/ℓ의 2,4-D를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 배발생 세포를 선발하여 배양하는 단계;
2) 단계 1의 세포를 증식시키고 형성된 세포괴를 분리하는 단계; 및
3) 단계 2의 세포괴를 대량 배양하는 단계를 포함하는 제 1항의 브로콜리의 체세포배 배양 방법을 이용한 브로콜리 식물체싹의 대량 생산 방법.
제 6항의 방법에 의하여 제조된 브로콜리 식물체싹.
제 7항의 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 건강식품.
제 7항의 브로콜리의 식물체싹을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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