KR20040028601A - 파골세포-관련 수용체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골조직의 성장, 발달, 치유, 분해 및 항상성과 관련된, 파골세포와 같은 세포의 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 따라서, 이 조성물을 사용하여 이러한 과정을 조절하거나 골성장 관련 질환(예를 들어, 골다공증 및 골화석증)을 치료할 수 있다. 특히, 본 발명은, 파골세포에 의해 특이적으로 발현되고 파골세포 활성을 조절하는 파골세포 관련 수용체 또는 OSCAR라 하는 신규한 폴리펩티드를 제공한다. OSCAR 핵산(벡터 포함), 융합 펩티드 및 OSCAR 특이적 항체와, 이러한 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 사용한 진단 및 스크리닝 분석법도 제공된다.

Description

파골세포-관련 수용체{OSTEOCLAST-ASSOCIATED RECEPTOR}

골(bone)의 발달 및 항상성은 주로 두 가지의 서로 다른 세포 형태: 골아세포 및 파골세포에 의해 제어된다. 현존하는 골 매트릭스의 표면에 놓여 있으며 표면 상에 골의 신규층을 증착시키는 세포인 파골세포는 골 매트릭스를 분비한다. 성숙한 파골세포는 석회화된 골 매트릭스를 재흡수하는 단핵세포/마크로파지 기원의 다핵 세포이다. 대개, 이 두 가지 세포 형태의 활성은 단단히 배위결합되어 있어 유기체 내에서 골의 구조 및 완전성을 유지한다. 그러나, 이 두 가지 세포 형태의 활성을 제어하는 메카니즘은 완전히 이해되지 않은 채로 남아 있으며 주로 알려지지 않았다.

수많은 질병 및 장애는 비정상적인 골 성장 또는 골 질량에 있어서의 비정상적인 증가 또는 감소와 관련되어 있다. 예를 들어, 골화석증은 골 매트릭스가 농화되는 것이며, 골을 흡수하지 못하게 하는 파골세포의 성숙에 있어서의 결함과 관련되어 왔다(예를 들어, Kong et al. Nature, 1999, 397:315-323; Sorino et al., Cell 1991, 64: 693-702; Iotsova et al., Nat. Med. 1997, 3:1285-1289 참조). 이와 대조적으로, 골다공증은 극히 다공성이고, 쉽게 골절되고, 좀처럼 치유하기 힘든 골을 야기하는 골아세포 활성에 있어서의 증가를 특징으로 하는 질병이다. 비정상적인 골 성장 및 재흡수에 관여하거나 이와 관련된 수많은 다른 질병 및 장애는 또한, 파제트병, 불완전골형성증, 섬유성골이형성, 저포스파테이스증, 일차적 부갑상선항진증, 관절염 및 치주 질환을 포함하는 몇몇 명칭으로 공지되어 있다. 또한, 골용해는 예를 들어, 유방암, 폐암, 전립선암, 갑상선암, 및 신장암에서의 골격성 전이, 악성 종양 동안의 칼슘과잉혈증, 및 다발성골수종과 같이 골에 존재하거나골과 멀리 떨어진 곳에 존재하는 많은 악성 종양에 의해 유도될 수 있다.

이러한 질병 및 장애는 미국에서 및 다른 나라에서 공중 보건에 대한 주요한 관심사를 나타낸다. 예를 들어, 80% 이상이 여성인 1000만 명의 미국인이 이미 골다공증에 시달리고 있으며, 다른 1000만 명의 개인이 낮은 골질량을 가져 상기 질환에 대한 증가된 위험에 노출되어 있는 것으로 평가되어 왔다.

따라서, 골아세포 및/또는 파골세포와 같은 세포(예를 들어, 세포 또는 조직 시료에 있는)를 확인하고 이러한 세포의 활성을 제어 또는 조절하는 데에 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 요구된다. 또한 예를 들어, 골아세포 및 파골세포의 활성을 조절함으로써, 상기 논의된 질병을 포함하는 비정상적인 골 성장 및 재흡수와 관련된 질병 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 요구된다. 본 기술분야에 있어서 상기 요구 및 그 밖의 요구는 본 발명에 의해 제시된다.

본 발명은, 본 명세서에서 "파골세포 관련 수용체" 유전자 또는 "OSCAR"라고 불리우는 신규 유전자, 및 이의 유전자 산물에 관한 것이다. OSCAR 유전자는 파골세포에 의해 특이적으로 발현된다. 따라서, 본 발명은 또한 특이적으로 OSCAR 유전자 또는 유전자 산물을 발현하는 세포를 확인함으로써 파골세포를 확인 및 분리하는 방법에 관한 것이다.

OSCAR 유전자 및 유전자 산물은 또한 파골세포의 성숙을 제어 또는 조절하는 데에 관여한다. 따라서, 본 발명은 또한 파골세포의 성숙 및/또는 활성을 조절하거나 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어, 골다공증 및 골화석증과 같은 파골세포-관련 질환을 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 질병을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 OSCAR 유전자 또는 유전자 산물에 결합하거나 및/또는 OSCAR 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 조절하여 파골세포의 성숙 및/또는 활성을 조절하는 데 사용될 수 있는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝 방법에 의해 확인될 수 있으며, 따라서 또한 본 발명의 분야에 속하는 화합물은 OSCAR 리간드 및 막내외 신호 어댑터를 포함한다.

도 1A 내지 1C는 마우스의 OSCAR 유전자의 1.8 kb (도 1A; SEQ ID NO:1) 및 1.1 kb (SEQ ID NO:2) 접합 변형체의 cDNA 서열을 나타낸다. 각 서열의 출발(AGT) 및 정지(TGA) 코돈은 볼드체 형태로 나타낸다. 양쪽의 cDNA 전사에 의해 암호화된 OSCAR 폴리펩티드 서열은 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있다.

도 2A 내지 2B는 클론 OCL178 내에 포함된 마우스의 OSCAR 단편의 cDNA 서열(도 2A; SEQ ID NO:4)를 나타낸다. SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 161 내지 265의 서열에 대응하는, 이 클론에 의해 암호화된 OSCAR 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열은 도 2B(SEQ ID NO:5)에 나타나 있다.

도 3A 내지 3B는 인간의 OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 C18 동질이성체의 cDNA 서열(도 3A; SEQ ID NO:6) 및 예측된 아미노산 서열(도 3B; SEQ ID NO:7)을 나타낸다.

도 4A 내지 4B는 인간의 OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 C16 동질이성체의 cDNA 서열(도 4A; SEQ ID NO:8) 및 예측된 아미노산 서열(도 4B; SEQ ID NO:9)을 나타낸다.

도 5A 내지 5B는 인간의 OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 C16 동질이성체의 cDNA 서열(도 5A; SEQ ID NO:10) 및 예측된 아미노산 서열(도 5B; SEQ ID NO:11)을 나타낸다.

도 6은 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 마우스의 OSCAR 폴리펩티드 서열및 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 인간의 OSCAR 폴리펩티드의 C18 동질이성체의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 마우스 및 인간의 OSCAR 폴리펩티드 서열은 각각 OSCAR(상단선) 및 hOSCAR(하단선)으로 명기된다.

도 7A 내지 7D는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 인간의 OSCAR 유전자가 분리된 인간의 염색체 19 클론 CTD-3093(GenBank Accession No. AC012314.5; GI:7711547)로부터의 뉴클레오티드 잔사 117001-124920의 서열(SEQ ID NO:12)을 나타낸다. 인간의 OSCAR 유전자의 엑손 서열은 상부-경우 특징에서 지시된다. 인간의 OSCAR 유전자의 번역(즉, 단백질 코딩) 영역은 밑줄로 표시된다.

도 8A 내지 8B는 골수 유도 마크로파지(도 8A) 및 골수 유도 파골세포(도 8A)로부터의 총체적인 cDNA 탐침을 사용하여 공제(substraction)(마우스의 OC 빼기 MØ) cDNA 라이브러리에서 임의로 선택된 250개의 클론으로부터의 플라스미드 DNA의 서던 블롯(Southern Blot) 분석을 나타낸다.

도 9는 마우스의 OSCAR 단편 OCL178(상단), 파골세포 특이적 유전자 TRAP(중앙) 및 파골세포 특이적 유전자 카텝신 K(하단)으로부터 표지화된 cDNA가 각각 골수 유도 마크로파지(BMM), 골수 유도 파골세포(BMOC) 및 골수 유도 모수석 세포(BMDC)에 하이브리디제이션된 노던 블롯(Northern Blot) 분석법의 결과를 나타낸다.

도 10은 인간의 OSCAR 단편 OCL178(상단), 및 파골세포 특이적 유전자 TRAP(중앙) 및 카텝신 K(하단)으로부터 표지화된 cDNA가 근육, 신장, 뇌, 심장, 간, 폐, 장, 흉선, 비장, 림프절, 및 파골세포(OCL)을 포함하는 다양한 서로 다른 조직으로부터 유도된 mRNA에 하이브리디제이션된 노던 블롯 분석법의 결과를 나타낸다.

도 11A 내지 11C는 TRANCE로 생체 외 처리함으로써 파골세포형 세포로 분화되는 RAW264.7 세포(RAW)와 비교하여, 마우스의 OSCAR 단편 OCL178로부터 표지화된 cDNA가 골수 유도 마크로파지(BMM) 및 파골세포(OCL)로부터 유도된 mRNA에 하이브리디제이션된 노던 블롯 분석법을 나타낸다. 도 11A는 마크로파지와 파골세포로부터의 mRNA와 TRANCE 투여한지 O, 3 및 24시간 후에 추출한 RAW264.7 세포 mRNA의 노던 블롯을 비교한다. 도 11B는 TRNACE 투여한지 1, 2, 3 및 4일 후에 RAW264.7 세포 mRNA로부터의 노던 블롯을 나타낸다. 도 11C는 두개골 및 장골 조직으로부터 추출한 mRNA와 골수 유도 파골세포(BMOC)로부터의 mRNA의 노던 블롯을 비교한다.

도 12A 내지 12B는 표지화된 마우스의 OSCAR 뉴클레오티드 탐침을 사용하여 EcoRI 및 Bg1Ⅱ 분해된 마우스(도 12A) 및 인간(도 12B) 지놈의 DNA의 서던 블롯 분석을 나타낸다.

도 13A 내지 13B는 동질이성체 대조구 인간 IgG1(도 13A) 또는 가용성 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 13B)로 염색한 후 PE-접합된 항-인간 IgG1 항체가 뒤따르는 일차 파골세포의 FACS 분석으로부터의 결과를 나타낸다.

도 14는 가용성 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(■) 또는 인간 IgG1(□)의 존재하에 골수 세포를 파골세포와 공-배양하고 지시된 양의 비타민 D₃로 처리하였을 때 관찰된 TRAP(+) 다핵성 파골세포의 수를 나타내는 도표를 나타낸다.

도 15A 내지 15C는 비타민 D₃(□), 비타민 D₃및 가용성 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(◇)의 존재하에 6, 7, 8 및 9일 동안 배양한 후 파골세포(도 15A 내지 15C) 또는 비타민 D₃및 대조구 IgG1 폴리펩티드(○)를 사용하여 다핵성 파골세포의 수를 파골세포 전구체의 공-배양으로 계산한 TRAP(+) 동역학 실험으로부터의 데이타를 도표로 제시한다. 도 15C에서 M-CSF-의존 골수 부유물 세포가 공-배양 실험에 사용된 반면, 도 15A 내지 15B에서는 전체 골수가 파골세포 전구체에 사용되었다. 도 15B는 배양 7일 후 공-배양 실험에서 관찰된 TRAP(+) 다핵성 파골세포의 수를 나타내는 막대 도표이다.

도 16A 내지 16J는 마우스의 골수 및 파골세포의 공-배양을 사용한 상아질 재흡수 분석법으로부터의 현미경사진이다(Tamura et al., J. Bone Miner. Res. 1993, 8:953-960 참조). 도 16A 내지 16E는 상아질 절편에 있는 TRAP(+) 파골세포의 현미경사진이다. 도 16F 내지 16J는 세포가 제거된 후의 대응하는 상아질 절편의 현미경사진이다. 이 현미경사진에 있는 검은 얼룩은 상아질이 재흡수된 영역을 나타낸다. 보다 상세히 말하자면, 도 16A 및 16F는 각각, 성장 매질에서 단독으로 배양된 TRAP(+) 세포 및 상아질 절편을 나타낸다. 도 16B 및 16G는 비타민 D₃와 함께배양된 TRAP(+) 세포 (도 16B) 및 상아질 절편(도 16G)의 현미경사진이다. 비타민 D₃로 배양된 TRAP(+) 파골세포와 상아질 절편 및 가용성 마우스의 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드의 현미경사진은 각각 도 16C와 16H에 나타나 있다. 도 16D 및 16I는 비타민 D₃및 TR-Fc 융합 폴리펩타이드와 함께 배양된 TRAP(+) 파골세포(도 16D)와 상아질 절편(16I)의 현미경사진이다. 도 16E 및 16J는 각각, 비타민 D₃및 대조구 IgG1 융합 폴리펩타이드와 함께 배양된 TRAP(+) 파골세포(도 16D)와 상아질 절편(16I)의 현미경사진이다.

도 17은 도 16A 내지 16J에 나타난 상아질 재흡수 데이타로부터의 정량적 결과를 제시하는 막대 도표이다. 마우스의 파골세포 전구체와 파골세포의 공-배양액을 성장 매질에서 단독으로("매질"), 비타민 D3, 비타민 D3와 OSCAR-Ig("비타민 D3+OSCAR-IgG")와 함께, 또는 비타민 D3와 대조구 IgG1 폴리펩티드(비타민 D3+IgG)와 함께 배양한 상아질 절편에 대한 재흡수 피트(pit)가 계산된다.

도 18A 및 18B는 (a) M-CSF 단독("M"); (b) M-CSF와 TRANCE("MT"); (c) M-CSF, TRANCE 및 가용성 인간 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드("MT+hOSCAR-IgG"); M-CSF, TRANCE 및 가용성 마우스 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드("MT+mOSCAR-IgG"); (c) M-CSF, TRANCE 및 대조구 IgG1 폴리펩티드("MT+IgG"); 및 (d) M-CSF, TRANCE 및 TR-Fc 융합 폴리펩티드("MT+TR-Fc")로 배양된 인간의 단핵세포 배양액을 사용한 실험으로부터의 데이타를 제시한다.

도 19A 내지 19F는 M-CSF(도 19A)의 존재하에서; M-CSF 및 TRANCE와 함께(도 19B); M-CSF, TRANCE 및 가용성 인간 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 19C)와 함께; M-CSF, TRANCE 및 가용성 마우스 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 19D)의 존재하에; M-CSF, TRANCE 및 TR-Fc 융합 폴리펩티드와 함께(도 19E); 및 M-CSF, TRANCE 및 인간의 IgG1 폴리펩티드(도 19F)와 함께 5일 동안 배양된 인간의 단핵세포의 현미경사진을 나타낸다. 다핵성 TRAP(+) 파골세포는 도 19B 및 19F에 화살표로 나타낸다.

도 20A 내지 20F는 M-CSF(도 20A)의 존재하에서; M-CSF 및 TRANCE와 함께(도 20B); M-CSF, TRANCE 및 가용성 인간 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 20C)와 함께; M-CSF, TRANCE 및 가용성 마우스 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 20D)의 존재하에; M-CSF, TRANCE 및 TR-Fc 융합 폴리펩티드와 함께(도 20E); 및 M-CSF, TRANCE 및 인간의 IgG1 폴리펩티드(도 20F)와 함께 10일 동안 배양된 인간의 단핵세포 배양액의 현미경사진을 나타낸다. 다핵성 TRAP(+) 파골세포는 도 20B 및 20F에 화살표로 나타낸다.

도 21A 내지 21J는 인간의 단핵 세포를 사용한 상아질 재흡수 분석법(Taruma et al., J. Bone. Miner. Res. 1993, 8:953-960)으로부터의 현미경사진이다. 도 21A 내지 21E는 상아질 절편 상에서 배양된 TRAP(+) 인간 파골세포의 현미경사진이다. 도 21F 내지 21J는 세포가 제거된 후의 대응하는 상아질 절편의 현미경사진이다. 이 현미경사진에 있는 검은 얼룩은 상아질이 재흡수된 영역을 나타낸다. 보다 상세히 말하면, 도 21A 및 21F는 각각, M-CSF 단독 존재하에 배양된 TRAP(+) 인간 세포 및 상아질 절편을 나타낸다. 도 21B 및 21G는 M-CSF 및 TRANCE와 함께 배양된 TRAP(+) 인간 세포(도 21B) 및 대응하는 상아질 절편(도 21G)의 현미경사진이다. 가용성 마우스 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드의 존재 하에 배양된 TRAP(+) 인간 세포의 현미경사진은 각각 도 21C 및 21H에 나타나 있다. 도 21D 및 21I는 TR-Fc 융합 폴리펩티드와 함께 배양된 TRAP(+) 인간 세포(도 21D) 및 대응하는 상아질 절편(도 21I)의 현미경사진이다. 도 21E 및 21J는 IgG1 폴리펩티드와 함께 배양된 TRAP(+)인간 세포(도 21E) 및 대응하는 상아질 절편(도 21J)의 현미경사진이다.

도 22A 내지 22F는 성장 매질에서 단독으로(도 22A); 비타민 D₃와 함께(도 22B); 비타민 D₃및 인간의 0SCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 22C)와 함께; 비타민 D₃및 마우스의 0SCAR-Ig 융합 폴리펩티드(도 22D)와 함께; 비타민 D₃및 TR-Fc 융합 폴리펩티드(도 22E)와 함께; 및 비타민 D₃및 인간의 IgG1 폴리펩티드(도 22F)와 함께 6일 동안 배양한 마우스의 파골세포 및 골수 세포의 공-배양액으로부터의 현미경사진이다.

도 23은 도 22A 내지 22F에 나타난 마우스의 공-배양 실험으로부터의 정량적인 데이터를 도표로 제시한다. 특히, 성숙한 TRAP(+) 다핵성 파골세포의 수는 도 22A 내지 22F에 대해 상기한 각각의 공-배양액에 대해 나타낸다.

도 24A 내지 24B는 인간의 OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 S1 절편 변형체의 cDNA 서열(도 24A; SEQ ID NO:26) 및 예측된 아미노산 서열(도 24B; SEQ ID NO:25)을 나타낸다. 각 서열의 출발(ATG) 및 정지(TGA) 코돈은 볼드체로 나타낸다.

도 25A 내지 25B는 인간의 OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 S2 절편 변형체의 cDNA 서열(도 25A; SEQ ID NO:28) 및 예측된 아미노산 서열(도 25B; SEQ ID NO:27)을 나타낸다. 각 서열의 출발(ATG) 및 정지(TGA) 코돈은 볼드체로 나타낸다.

도 26A는 마우스의 OSCAR 유전자의 M3 절편 변형체의 cDNA 서열을 나타낸다(도 26A; SEQ ID NO:30). 각 서열의 출발(ATG) 및 정지(TGA) 코돈은 볼드체로 나타낸다. 양쪽의 cDNA 전사에 의해 암호화되는 OSCAR 폴리펩티드 서열은 도 26B(SEQID NO:29)에 나타나 있다.

도 27A는 마우스의 OSCAR 유전자의 M4 절편 변형체의 cDNA 서열을 나타낸다(도 27A; SEQ ID NO:32). 각 서열의 출발(ATG) 및 정지(TGA) 코돈은 볼드체로 나타낸다. 양쪽의 cDNA 전사에 의해 암호화되는 OSCAR 폴리펩티드 서열은 도 27B(SEQ ID NO:31)에 나타나 있다.

본 발명은 골 조직의 성장, 발달, 회복, 재흡수 강등 또는 항상성과 관련된 과정에 관여하여 이러한 과정의 조절에 유용한 조성물 및 방법을 제공함으로써, 본 기술분야에 있어서의 상기 논의 및 그 밖의 문제를 극복한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 골 조직의 비정상적인 성장, 발달, 회복, 재흡수, 강등, 재흡수 또는 항상성에 관여하는 장애(즉, "골 성장 관련 장애")를 치료하는 데에 유용할 수 있다. 이러한 장애의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 골다공증 및 골화석증이 포함된다. 이러한 장애의 다른 비-제한적 예로는, 파제트병, 불완전골형성증, 섬유성골이형성증, 저포스파테이스증, 일차적 부갑상선항진증, 관절염, 치주 질환 및 골용해(예를 들어, 악성 종양으로부터)가 포함된다.

특히, 본 발명은 파골 세포에 의해 발현되는, 본 명세서에서 OSCAR 폴리펩티드로 언급되는 신규한 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 골 조직의 파골세포의 활성 뿐만 아니라, 재흡수와 같이 파골세포와 관련된 성장 및 성숙을 조절한다.

어떤 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 마우스의(즉, 마우스) 폴리펩티드이며 마우스의 파골세포에 의해 발현되는 OSCAR 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, 도 2B에 나타난 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 도 1C에 나타난 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 도 26B 및 27B에 나타난 아미노산 서열(각각, SEQ ID NO:29 및 31)을 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 인간의 폴리펩티드인 OSCAR 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 7A 내지 7D에 나타난 유전자 서열(SEQ ID NO:12)에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다. 어떠한 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 3B(SEQ ID NO:7), 도 4B(SEQ ID NO:9), 도 5B(SEQ ID NO:11), 도 24B(SEQ ID NO:25) 또는 도 25B(SEQ ID NO:27)에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 신호 펩티드 서열, Ig-형 도메인 서열, 막내외 도메인 서열, 세포질 근미 도메인 서열 또는 전장 OSCAR 폴리펩티드를 위한 이의 임의의 조합(예를 들어, 도1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B 및 SEQ ID NOS: 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31에 나타난 임의의 폴리펩티드로부터)과 같이, 전장 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 OSCAR 폴리펩티드의 변형체를 제공한다. 특히, 본 발명은, 예를 들어, 도 1C, 2B, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B, 및 SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31에 제공되는 바와 같이, 한정된 하이브리디제이션 조건 하에서 OSCAR 폴리펩티드의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 도 7A-D(SEQ ID NO:12)에 나타난 지놈의(genomic) OSCAR 핵산 서열 뿐만 아니라, 예를 들어, 도 1A-B, 2A, 3A, 4A, 5A, 24A, 25A, 26A 및 27A(SEQ ID NOS: 각각 1-2, 4, 6, 8, 10, 26, 28, 30 및 32)에 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 핵산을 포함하여, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 핵산, 및 상기 OSCAR 핵산에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하여 이루어지는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 OSCAR 폴리펩티드, 핵산 및 항체의 단편에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 세포 배양액(예를 들어, 세포 배양 매질), 세포 배양 추출물 또는 세포 용해액에서 세포의 표면(예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 OSCAR) 상에서, OSCAR 핵산 및 OSCAR 폴리펩티드의 세포에서의 존재 또는 발현을 검출하기 위한 스크리닝 분석법을 포함하는, 본 발명의 OSCAR 핵산 및 OSCAR 폴리펩티드를 검출 및 확인하기 위한 스크리닝 분석법에 관한 것이며 이를 제공한다. 이 방법은변형된 OSCAR 폴리펩티드 및 핵산: 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드; 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 검출 및 확인하기 위한 방법을 포함한다. 이 방법에 의해 확인될 수 있는 다른 변형된 OSCAR 폴리펩티드 및 핵산은 상동적인 OSCAR 폴리펩티드 및 핵산(예를 들어, 다른 종의 유기체로부터, 및 바람직하게는 인간과 같은 다른 포유류성 유기체로부터의)을 포함한다. 이러한 변형된 OSCAR 폴리펩티드 및 핵산, 및 이것 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명에 의해 제공되며 본 발명의 부분으로 생각된다.

본 발명은 또한 본 발명의 OSCAR 핵산 또는 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인하기 위한 방법(예를 들어, 스크리닝 분석법)을 제공한다. 이러한 스크리닝 분석법에 의해 확인될 수 있는 화합물은 소분자(예를 들어, 분자량에 있어서, 약 2kD 이하의 분자, 및 보다 바람직하게는 약 1kD 이하의 분자) 및 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 고분자를 포함한다. 이러한 스크리닝 방법에 의해 확인될 수 있는 화합물은 또한, OSCAR 유전자 또는 OSCAR 유전자 산물(예를 들어, OSCAR 핵산 또는 OSCAR 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하는 천연 리간드와 같은 세포내 화합물을 포함한다. 또한, 다른 스크리닝 분석법은, OSCAR 폴리펩티드 및 특이적 결합 파트너 간, 또는 OSCAR 핵산 및 특이적 결합 파트너 간의 결합 상호작용을 방해하는 화합물(소분자, 고분자, 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드)을 확인하기 위해 제공된다. 따라서, 이러한 스크리닝 방법은 본 발명의 부분으로 생각된다. 또한, 결합 화합물(예를 들어, OSCAR-특이적 리간드)을 포함하여, 이 분석법에 의해 확인되는 화합물, 및 OSCAR-특이적 결합 상호작용을 방해하는 화합물은 또한 본 발명의 부분이다.

다른 측면에서, 본 발명은 파골세포 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 파골세포를 OSCAR 유전자(예를 들어, OSCAR 유전자의 발현) 또는 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하여 이루어진다. 이 방법에 사용된 화합물은, OSCAR 신호화 및/또는 파골세포의 성숙 및 파골세포 활성을 촉진시키는 OSCAR 길항근(OSCAR 특이적 리간드) 뿐만 아니라, OSCAR 신호화를 저해하여 파골세포 활성화(예를 들어, 성숙)를 저해하는 OSCAR 길항물질을 포함한다. 이 방법은, 세포에 의한 OSCAR 유전자 또는 OSCAR 유전자 산물의 발현을 증진 또는 저해하도록, 파골세포를 화합물{예를 들어, 안티센스(antisense), 리보자임, 삼중-나선 형성 핵산, 또는 다른 작은 화합물}과 접촉시키는 것을 포함하여 이루어질 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 파골세포를 OSCAR 유전자 산물에 결합시키거나 및/또는 이의 활성을 증가시키는 화합물과 접촉시켜, 파골세포 활성을 증가시키는 방법을 포함할 수 있다. 이 방법의 바람직한 일 실시형태에서, 파골세포를 OSCAR-특이적 리간드에 접촉시킨다.

본 발명의 방법은 또한 파골세포의 활성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 방법은 파골세포를 OSCAR 유전자 산물의 활성을 저해하거나 감소시키는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하여 이루어질 수 있다. 어떠한 바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은 OSCAR-특이적 리간드를 OSCAR 유전자 산물에 결합시키는 것을 저해하거나 방해하는 화합물이 될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 일 실시형태에서, 상기 화합물은 OSCAR-특이적 리간드와 0SCAR 유전자 산물 간의 결합을 저해하도록 OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR-특이적 리간드에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 화합물은 가장 바람직하게는 OSCAR 폴리펩티드의 리간드-결합 도메인(예를 들어, 세포외부 및/또는 신호 서열 도메인)을 포함하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하여, 하나 이상의 가용성 OSCAR 폴리펩티드 핵산 서열을 호함하여 이루어진다. 특히 바람직한 실시형태에서, 투여된 화합물은 면역글로불린 Fc 영역 또는 다른 소분자와 관련한 아미노산 서열을 갖는 가용성 융합 폴리펩티드를 포함하여 이루어진다.

본 발명은, 본 명세서에서 "파골세포 관련 수용체" 또는 OSCAR 유전자로 언급되는 신규 유전자 및 이의 산물에 관한 것이다. 본 명세서에 최초로 기재되는 OSCAR 유전자 및 이의 산물은 파골세포에서 특이적으로 발현된다. 또한, 본 출원인은 또한 본 명세서에서 "OSCAR 리간드" 또는 "OSCAR-L"로 언급되는 파골세포에 의해 생산되는 OSCAR 특이적 리간드가 존재한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 OSCAR 특이적 리간드는 또한 예를 들어, 마우스의 태아의 섬유아세포, 마우스의 NIH 3T3 섬유아세포, 마우스의 ST2 파골세포-유사 세포, 밍크 폐 상피 세포, 래트 UMR106 파골세포-유사 세포, 인간 HEK293 및 HEK293T 세포, hFOB1.19, 및 원숭이 COS-1 세포를 포함하는 다른 세포에 의해 발현될 수도 있다. OSCAR 리간드는 OSCAR 유전자 산물에 결합한다. 하기의 실시예에 기재되는 실험에서, OSCAR 리간드를 발현하는 파골세포에 미성숙 파골세포를 접촉시키는 것은 파골세포 성숙을 효과적으로 자극하여, 성숙한 다핵성 파골 세포의 수를 증가시킨다. 그러나, OSCAR 유전자 산물의가용성 융합 단백질을 투여하면 OSCAR 리간드가 이 파골세포에 의해 발현된 OSCAR 폴리펩티드에 결합하는 것을 저해하며, 그로 인해 파골세포의 성숙을 저해한다. 따라서, OSCAR 유전자 및 유전자 산물은 파골세포 활성을 조절(즉, 증가 또는 감소)하는 데에 사용될 수 있으며 따라서, 예를 들어, 골다공증과 골화석증을 포함하는 비정상적인 골 성장과 관련된 질병 및 장애를 치료하는 방법에 유용하다.

일반적으로, OSCAR 폴리펩티드는 상기한 바와 같은 OSCAR 핵산 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 본 발명의 전장 OSCAR 폴리펩티드는 약 35kDa, 또는 선택적으로 약 40kDa의 뚜렷한 분자량을 가진다. 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 실시예에 기재한 바와 같이 파골세포의 성숙을 제어할 수도 있다.

OSCAR 폴리펩티드는 하기한 바와 같이, 또한 두 개의 면역글로불린 도메인 및 막내외 도메인을 포함하여 이루어지는 면역글로불린 상과(superfamily) 성분으로 특징화된다. 따라서, 바람직한 실시형태에서 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 마우스의 PirA 및 FcαR과 같은 다른 면역글로불린 단백질 및 폴리펩티드와 아미노산 서열 상동성 및/또는 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 예를 들어, 제한적 의미는 아니지만, 도 1C에 나타나 있는 특정한 OSCAR 폴리펩티드와 유사한 폴리펩티드를 확인하기 위해 BLASP 알고리즘(표준 파라미터)을 사용한 NCBI 단백질 데이터베이스의 조사는 상기 폴리펩티드가 마우스의 PirA6 (GenBank Acession No. AAC53217.1)과 26.4% 서열 동일성 및 폴리펩티드 소의 FcαR(GenBank Acession No. P24071)과 24.2% 서열 동일성을 공유함을 나타낸다.

OSCAR 폴리펩티드는 또한 세포 내에서 이의 발현 패턴에 의해 특징화될 수 있다. 특히, OSCAR 폴리펩티드는 파골세포에 의해 특이적으로 발현되며, 바람직하게 OSCAR 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 숙주 세포를 제외한 임의의 다른 세포 형태에 의해서는 발현되지 않는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 마크로파지 및 상아질 세포를 포함하는 다른 골수 유도 세포에 의해 발현되지 않는 것이 바람직하다.

특정한 일 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 마우스의(즉, 마우스) 세포로부터 유도되거나 마우스의 세포로부터 유도된 펩티드의 아미노산 서열을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 마우스의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타난 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 이러한 서열은 5개 이상의 별개의 도메인에 대응하는 서열: 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 1-16을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 17-122 및 123-228을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 229 내지 247을 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 248-264)을 포함하여 이루어진다.

이러한 특정 실시형태의 다양한 측면에서, 성숙한 OSCAR 폴리펩티드에는 신포 펩티드 서열이 결여되어 있다. 따라서, 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타난 서열의 아미노산 잔사 17-264에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 가용성 OSCAR 폴리펩티드에는 막내외 도메인(대부분의 실시형태에서) 및 세포질 근미 도메인이 결여되어 있다. 따라서, 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔사 17-228 및, 선택적으로 아미노산 잔사 248-264에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.

다른 특정한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 인간의 세포로부터 유도되거나 실질적으로 인간의 세포로부터 유도된 폴리펩티드에 대응한다. 예를 들어, 본 발명의 인간 OSCAR 폴리펩티드는 본 명세서에서 "C18 인간 OSCAR 동질이성체"로 언급되며 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 바람직하게, 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타난 바와 같이, C18 인간 OSCAR 아미노산 서열의 아미노산 잔사 97은 세린(Ser 또는 S)이다. 그러나, 또다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 서열의 아미노산 잔사 97은 이소류신(Ile 또는 I)이 될 수 있다. C18 인간 OSCAR 아미노산 서열은 또한, 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 마우스의 OSCAR 폴리펩티드에 대해 상기한 4가지의 도메인에 대응하는 4가지 이상의 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수도 있다. 특히, C18 인간 OSCAR 동질이성체는 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:7의 아미노산 잔사 1-18을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:7의 아미노산 잔사 19-123및 124-229를 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:7의 아미노산 잔사 230-248을 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:7의 아미노산 잔사 249-263을 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

선택적으로, 본 발명의 인간 OSCAR 폴리펩티드는 본 명세서에서 "C16 인간 OSCAR 동질이성체"로 언급되며 도 4B(SEQ ID NO:9)에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 인간 OSCAR 폴리펩티드는 본 명세서에서 "C10 인간 OSCAR 동질이성체"로 언급되며 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 바람직하게, 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타난 바와 같이, C18 인간 OSCAR 아미노산 서열의 아미노산 잔사 86은 세린(Ser 또는 S)이다. 그러나, 또다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 서열의 아미노산 잔사 86은 이소류신(Ile 또는 I)이 될 수 있다. 이러한 인간 OSCAR 폴리펩티드 각각은 도 1C(SEQ ID NO:3)에 도시된 마우스 OSCAR 폴리펩티드 및 도 3B(SEQ ID NO:7)에 도시된 C18 인간 OSCAR 동질이성체에 대해 상기한 도메인에 대응하는 4개 이상의 도메인에 대응한다.

특히, C18 인간 OSCAR 동질이성체는 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:8의 아미노산 잔사 1-18을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 19-127 및 128-233을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 234-252를 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 253-267을 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

C10 인간 OSCAR 동질이성체는 또한, 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 1-13을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ IDNO:11의 아미노산 잔사 14-112 및 113-218을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 219-237을 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 238-252를 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

본 실시형태의 다양한 측면에서, 본 발명의 마우스 OSCAR 폴리펩티드에 대해 상기한 바와 같이, 성숙한 인간 OSCAR 폴리펩티드에는 신호 펩티드 서열이 결여되어 있다. 따라서, 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 인간 OSCAR 폴리펩티드는, 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 19-248, 도 4B(SEQ ID NO:9)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 19-252 또는 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 14-252에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 가용성 인간 OSCAR 폴리펩티드에는 막내외 도메인 및(대부분의 실시형태에서) 세포질성 근미 도메인이 결여되어 있다. 따라서, 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 (1) 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 19-229 및, 선택적으로 아미노산 잔기 249-263; (2) 도 4B(SEQ ID NO:9)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 19-233 및, 선택적으로 아미노산 잔기 234-252; 또는 (3) 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타나 있는 서열의 아미노산 잔기 14-218 및, 선택적으로 아미노산 잔기 219-237에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 대체적인 실시형태에서 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3), 도 3B(SEQ ID NO:7), 도 4B(SEQ ID NO:9), 도 5B(SEQ ID NO:11), 도24B(SEQ ID NO:25), 도 25B(SEQ ID NO:27), 도 26B(SEQ ID NO:29), 도 27B(SEQ ID NO:31)에 나타나 있는 OSCAR 폴리펩티드 서열과 25% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 75% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상 동일한 펩티드이다.

또다른 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 본 명세서에 기재한 전장 OSCAR 폴리펩티드의 단편(예를 들어, SEQ ID NO:3, 7, 9 또는 11)을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 하기 실시예는 도 2B(SEQ ID NO:5)에 도시된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 전장 OSCAR 유전자 산물의 단편을 암호화하는 OSCAR 유전자 단편(OCL178로 언급됨)을 기재한다. 전장 OSCAR 유전자 산물의 다른 예시적인 단편은 전장 OSCAR 폴리펩티드에 대해 상기한 도메인 중 하나(예를 들어, 신호 서열 도메인, Ig-유사 도메인, 막내외 도메인, 또는 세포질성 근미 도메인의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단편)를 포함하여 이루어지는 폴리펩티드 또는 이러한 도메인 중 하나의 부분을 포함하여 이루어지는 단편이다. 전장 OSCAR 폴리펩티드의 다른 단편은 전장 OSCAR 폴리펩티드에 대해 상기한 도메인의 둘 또는 하나 이상의 임의의 조합을 포함하여 이루어지는 단편; 예를 들어, 신호 서열 도메인, Ig-유사 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:3, 7, 9 또는 11의 제 1 또는 제 2 Ig-유사 도메인), 막내외 도메인, 또는 세포질성 근미 도메인으로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단편을 포함한다.

OSCAR 폴리펩티드의 이러한 단편은 예를 들어, 하기한 바와 같은 다양한 융합 폴리펩티드를 구성하는 데에 유용하다. 예를 들어, 신호 서열 도메인을 포함하여 이루어지는 융합 폴리펩티드는 숙주 세포에 의한 추출 및 정제용 배양 매질 내로의 분비를 위해 융합 폴리펩티드를 표적화하는 데에 사용될 수 있다. 막내외 도메인을 포함하여 이루어지는 융합 폴리펩티드는 세포 표면 상의 발현을 위해 융합 폴리펩티드를 표적화하는 데에 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 전장 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 포함하여 이루어지는 융합 폴리펩티드는 Ig-유사 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 합성하는 데 사용될 수 있으며 파골세포의 표면 상의 OSCAR 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, OSCAR Ig-유사 도메인을 포함하여 이루어지는 가용성 융합 폴리펩티드는 OSCAR 리간드에 결합하는 물질로 합성될 수 있다. 이러한 융합 폴리펩티드는 하기 실시예에 기재되어 있으며, 예를 들어, OSCAR 리간드에 대한 경쟁자로서 및 파골세포의 수 및 활성을 감소시키기기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 OSCAR 유전자 산물 또는 이의 단편의 서열을 포함하여 이루어지는 융합 폴리펩티드를 포함한다.

OSCAR 핵산은 하기의 임의의 변형(예를 들어, 변형된 염기 및/또는 골격)을 포함하여 이루어지는 핵산 분자 뿐만 아니라 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열; 예를 들어, 도 1A 내지 1B(SEQ ID NO:1-2), 또는 도 3A, 4A, 5A, 24A, 25A, 26A 또는 27A(SEQ ID NOS: 각각 6, 8, 10, 26, 28, 30 및 32) 중 어느 하나에 도시된 코딩 서열에 대해 50% 이상, 보다 바람직하게 75% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가진다. 선택적으로, 본 발명의 OSCAR 핵산은 예를 들어, 도 1C(SEQ ID NO:3), 또는 도 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B, 또는 27B(SEQ ID NOS: 각각 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31) 중 어느 하나에 나타나 있는 OSCAR 폴리펩티드 서열에 대해 25% 이상, 보다 바람직하게 50% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 70% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 75% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가진다.

선택적으로, OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 하기에 상세히 설명한 조건 하에 이러한 코딩 서열의 보체 또는 이러한 코딩 서열의 단편과 하이브리디제이션할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예는 아가로스 겔에서 전기이동에 의해 결정된 바와 같이, 각각 클론 OCL178에 함유되며 도 2(SEQ ID NO:4)에 나타난 OSCAR 단편에 하이브리디제이션하는 4.0 kb, 1.8 kb 및 1.0 kb의 분명한 길이의 OSCAR mRNA 분자의 확인을 설명한다.

본 발명의 OSCAR 핵산은 진행되거나 "접합되어" OSCAR 지놈의 서열로부터 인트론의 서열을 제거하는, OSCAR 핵산으로부터 유도된 mRNA 및 cDNA와 같은 핵산을 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 OSCAR 핵산은 핵산, 예를 들어, 엑손과 인트론 서열을 둘 다 포함하여 이루어지는 지놈의 OSCAR 서열, 이로부터 유도된 비접합 OSCAR mRNA 서열 및 cDNA 서열을 진행시키지 않을 수 있다.

예를 들어, 도 7A 내지 7D는 인간의 OSCAR 유전자의 서열을 포함하는 인간 염색체 19 클론 CTD-3093 (GenBank Accession No. AC012314.5; GI771547)로부터의 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:12)을 나타낸다. 인간 염색체 서열의 상기 영역 내에 이러한 OSCAR 지놈의 서열이 존재한다는 사실은 이전에는 알려지지 않았으며 본 명세서에 최초로 기재된다. 따라서, 이러한 OSCAR 지놈의 서열은 본 발명의 OSCAR 핵산 사이에 존재한다. 특히, 도 7A 내지 7D(SEQ ID NO:12)에 나타나 있는 지놈의 서열은 본 발명의 OSCAR 유전자 산물을 암호화하는 RNA로 전사되거나 전사될 수 있는 엑손 서열을 포함한다. 이러한 엑손 서열은 상위 경우 특징에 의해 도 7A 내지 7D에 나타나 있다. 도 7A 내지 7D(SEQ ID NO:12)에 나타나 있는 지놈의 서열은 또한, 모두 하위 경우 특징에 의해 도 7A 내지 7D에 나타나 있는 인트론 서열과 5'- 및 3'-비진행 영역(UPR)의 서열을 포함한다. 특히, 도 7A 내지 7D 및 SEQ ID NO:12에 나타나 있는 OSCAR 지놈의 서열은 표 1에 나타나 있는 인트론과 엑손 도메인을 포함한다.

인간 OSCAR(SEQ ID NO:12)의 인트론/엑손 경계

뉴클레오티드 잔사	영역
1-767768-841842-18181819-18511852-19971998-20092010-44394440-47424743-50135014-52955296-58095810-64996500-7920	5'-UPR엑손 1인트론 1엑손 2인트론 2엑손 3인트론 3엑손 4인트론 4엑손 5인트론 5엑손 63'-UPR

따라서, 본 발명의 OSCAR 핵산은 지놈의 OSCAR 핵산 분자를 포함한다. 이러한 지놈의 OSCAR 핵산 분자는 도 7A 내지 7D(SEQ ID NO:12)에 나타나 있는 OSCAR지놈의 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 본 발명의 지놈의 OSCAR 핵산 분자는 또한, 예를 들어, 도 7A 내지 7D에 나타나 있으며 상기 표 1에서 한정된 하나 이상의 엑손 및 인트론에 대응하는 핵산 서열에 대응하는 핵산 서열을 포함하여, 전장 OSCAR 지놈의 서열의 하나 이상의 엑손 또는 인트론에 대응하는 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 OSCAR 핵산은 또한 전장 OSCAR 서열의 단편을 포함한다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 이러한 OSCAR 핵산 단편은 전장 코딩 OSCAR 핵산 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드 및 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하여 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 단편은 도 1A 내지 1B, 2A, 3A, 4A, 5A, 24A, 25A, 26A, 및 27A(SEQ ID NOS: 각각 1-2, 4, 6, 8, 10, 26, 28, 30 및 32) 중 어느 하나에 도시된 OSCAR 코딩 서열의 부분(예를 들어, 10, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드)에 대응한다. 다른 바람직한 실시형태에서, OSCAR 핵산 단편은 하기에 기재된 조건하에서 예를 들어 도 1A 내지 1B, 2A, 3A, 4A, 5A, 24A, 25A, 26A, 및 27A(SEQ ID NOS: 각각 1-2, 4, 6, 8, 10, 26, 28, 30 및 32)에 도시된 OSCAR 핵산 서열 중 어느 하나, 또는 전장 OSCAR 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 10개 이상, 바람직하게 15개 이상 및 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드의 서열을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 OSCAR 핵산 단편은 또한 OSCAR 지놈의 서열(예를 들어, 도 7A 내지 7D에 도시되고 SEQ ID NO:12에 나타난 서열)의 10, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드의 서열에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어질 수 있다. 선택적으로,OSCAR 핵산 단편은, 하기에 상세히 기재되는 조건 하에서 OSCAR 지놈의 서열(예를 들어, 도 7A 내지 7D에 도시되고 SEQ ID NO:12에 나타나 있는 지놈의 서열), OSCAR 지놈의 서열의 하나 이상의 엑손 또는 인트론(예를 들어, 도 7A 내지 7D에 나타나 있고 상기 표 1에 기재된 엑손) 또는 이러한 OSCAR 지놈의 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 10, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드의 서열을 포함하여 이루어질 수 있다.

이러한 단편을 포함하여 이루어지는 핵산 분자는 예를 들어, OSCAR 유전자를 검출하거나 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 탐침 및 프리머(primer)로 유용하다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 단편은 안티센스 핵산, 삼중-나선 형성 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임으로 사용될 수 있다. 그러나, OSCAR 서열의 하나 이상의 단편을 포함하여 이루어지는 본 발명의 핵산 분자는 또한 OSCAR 유전자 산물에 대한 전장 코딩 서열이 될 수 있다.

정의

일반적 정의.본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 각 용어가 사용되는 기술 분야에서, 본 발명의 본문 안에서 및 특정 본문에서 이의 일반적 의미를 가진다. 몇몇 용어들은, 본 발명의 장치 및 방법 및 이의 제조법 및 사용법에 있어서 실시자에게 부가적인 지침을 제공하기 위해서, 하기, 또는 명세서의 다른 부분에서 논의된다.

"골수 관련 장애", "골 성장 관련 장애", "골 성장 장애", "골 성장 질환" 이라는 용어 및 이의 다른 변이형은 본 명세서에 일반적으로 사용된 바와 같이, 골조직의 비정상적인 성장, 회복 발달, 재흡수, 재흡수, 강등 또는 항상성에 관한 임의의 질병 또는 장애를 의미한다. 따라서, 골 성장 관련 장애는 개체 내의 골 질량의 비정상적인 감소 뿐만 아니라, 비정상적인 증가와 관련된 질병 및 장애를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 대상인 골 성장 관련 장애는, 이에 제한되는 것은 아니나, 파골세포의 비정상적인(예를 들어, 증가되거나 감소된) 활성과 관련된 장애를 포함할 수 있다. 본 발명의 대상인 골 성장 관련 장애는 또한 파골세포의 비정상적인(예를 들어, 증가되거나 감소된) 활성과 관련된 장애를 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 진단되거나 치료될 수 있는 예시적인 골 성장 관련 장애로는 골화석증, 골다공증, 파제트병, 불완전골형성증, 섬유성골이형성증, 저포스파테이스증, 일차적 부갑상선항진증 관절염, 몇몇 명칭의 공지된 치주 질환 및 골수종 혈액 질환이 포함된다. 또한, 예를 들어, 유방암, 폐암, 전립선암, 갑상선암 및 신장암에서의 골격성 전이, 악성 종양 동안의 체액성 칼슘과잉혈증, 및 복합 골수종과 같이, 골 내부 또는 골과 떨어진 곳에 존재하는 수많은 악성 종양에 의해 골용해가 유도될 수 있다.

골 성장 관련 장애는 OSCAR 핵산, 유전자 산물 또는 폴리펩티드와 직접 또는 간접적으로 관련될 수 있다. 이러한 장애는 OSCAR 유전자 또는 이의 유전자 산물의 비정상적 합성 또는 발현과 관련된 장애, 및 또한 예를 들어, OSCAR 유전자 또는 이의 유전자 산물의 비정상적인 생체활성과 관련된 장애와 같이, OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물의 비정상적(예를 들어, 증가되거나 감소된) 활성에 의해 야기되는 질병 및 장애를 포함한다. 본 발명의 다른 OSCAR 관련 장애는 OSCAR 유전자,OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR 폴리펩티드와 상호작용하는 또다른 화합물(예를 들어, 천연 리간드 또는 다른 세포성 화합물)의 비정상적인 합성, 발현 또는 활성과 관련된 장애를 포함한다. 또한, 본 발명의 OSCAR 관련 장애는, 그 자체가 OSCAR 유전자 또는 유전자 산물의 비정상적인 합성, 발현 또는 활성에 의해 또는 이와 관련하여 야기되지 않은 반면, OSCAR 유전자 또는 유전자 산물 또는 OSCAR 폴리펩티드의 합성, 발현 또는 활성을 조절하는(예를 들어, 증가 또는 감소시키는) 방법 또는 OSCAR 유전자 또는 유전자 산물 또는 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물(예를 들어, 천연 리간드 또는 다른 세포성 화합물)의 합성, 발현 또는 활성을 조절하는 방법에 의해 치료될 수 있는 장애를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "분리된" 이라는 용어는 참조된 물질이 정상적으로 발견된 환경으로부터 제거되는 것을 의미한다. 따라서 분리된 생물학적 물질은 세포의 성분, 즉 물질이 발견되거나 생산되는 세포의 성분으로부터 유리될 수 있다. 핵산 분자의 경우, 분리된 핵산은 PCR 산물, 분리된 mRNA, cDNA, 또는 제한 단편을 포함한다. 다른 실시형태에서, 분리된 핵산은 바람직하게, 염색체에서 발견될 경우 분리된 핵산 분자에 포함된 유전자의 상류 및 하류에 위치한 비-제한적, 비-코딩 영역, 또는 다른 유전자에서 발견될 수 있고 보다 바람직하게는 이에 더 이상 접합되지 않는 유전자로부터 제거된다. 또다른 실시형태에서, 분리된 핵산에는 하나 이상의 인트론이 결여되어 있다. 분리된 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 등에 삽입된 서열을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 재조합 핵산은 분리된 핵산이다. 분리된 단백질은 이것이 막-관련 단백질인 경우, 세포와 관련한 다른 단백질 또는 핵산, 또는 양자, 또는 세포의 막과 관련될 수 있다. 분리된 세포기관, 세포, 또는 조직은, 이것이 유기체 내에서 발견되는 해부 부위로부터 제거된다. 분리된 물질은 필요한 것은 아니지만, 정제될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "정제된" 이라는 용어는 상기 물질이 얻어지는 본래 물질을 포함하여, 관련되지 않은 물질, 즉 오염물질의 존재를 감소시키거나 제거하는 조건 하에 분리된 물질을 말한다. 예를 들어, 정제된 단백질은 세포에 관계되는 다른 단백질 또는 핵산과 실질적으로 유리되어 있는 것이 바람직하다; 정제된 핵산 분자는 세포 내에서 발견될 수 있는 단백질 또는 다른 비관련 핵산과 실질적으로 유리되어 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 유리된" 이라는 용어는 물질의 분석적 시험에 대한 본문에서 조작 상 사용된다. 바람직하게, 실질적으로 오염물질과 유리된 정제된 물질은 50% 이상의 순도를 가지고; 보다 바람직하게, 90% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가진다. 순도는 크로마토크래피, 겔 전기이동, 면역분석법, 조성물 분석, 생물학적 분석법, 및 본 기술 분야에 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.

정제 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 침전화, 크로마토그래피(예비 고체상 크로마토그래피, 올리고뉴클레오티드 하이브리디제이션, 및 삼중 나선 크로마토그래피를 포함), 초원심분리, 및 다른 방법으로 핵산을 정제할 수 있다. 제한 없이, 예비 디스크-겔 전기이동, 등전 초점화(isoelectric focusing), HPLC, 역전-상 HPLC, 겔 여과, 이온 교환 및 분획 크로마토그래피, 침전화 및 염석(salting-out) 크로마토그래피, 추출, 및 향류 분포(countercurrentdistribution)를 포함하는 다양한 방법으로 폴리펩티드 및 단백질을 정제할 수 있다. 어떠한 목적을 위해, 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질이 폴리히스티딘 서열 또는 FLAG 및 GST와 같은 항체에 특이적으로 결합하는 서열과 같이 정제를 촉진하는 부가적인 서열 태그(tag)를 포함하는 재조합 시스템 내의 폴리펩티드를 생산하는 것이 바람직하다. 그리고 나서 적절한 고체상 매트릭스 상의 크로마토그래피로 숙주 세포의 조 용해물로부터 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 선택적으로, 단백질 또는 이로부터 유도된 펩티드에 대해 생산된 항체는 정제제로 사용될 수 있다. 원심분리, 매트릭스 분리(예를 들어, 나일론 양모 분리), 패닝(panning) 및 다른 면역선택 기술, 소모(예를 들어, 오염 세포의 상보적인 소모), 및 세포 분류(예를 들어, 형광 활성 세포 분류[FACS])를 포함하는 다양한 기술로 세포를 정제할 수 있다. 정제된 물질은 이것이 본래 관련되는 약 50% 이하, 바람직하게 약 75% 이하, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이하의 세포 성분을 포함할 수 있다. "실질적으로 순수한"은 본 기술 분야에 공지된 통상의 정제 기술을 사용하여 달성될 수 있는 최고의 순도를 나타낸다.

본 명세서에 사용된 "시료"는 예를 들어, 이식유전자의 동물에서 유전자 요법 또는 발현을 평가하기 위해 또는 특이적으로 OSCAR 유전자와 이의 유전자 산물을 발현하는 파골세포와 같은 세포를 확인하기 위해, OSCAR 폴리펩티드 또는 OSCAR 핵산의 존재를 시험할 수 있는 생물학적 물질을 말한다. 이러한 시료는, 순환 조혈모세포(단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는), 복합 분출(plural effusion), 뇌척수액(CSF), 복수, 및 세포 배양액을 포함하는, 조직, 혈액 및 혈액 세포를 포함하는임의의 원천으로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서 골수로부터 시료를 얻을 수 있다.

비-인간 동물은, 제한 없이, 마우스, 래트, 래빗, 햄스터, 기니피그 등과 같은 실험실 동물; 개 및 고양이와 같은 가축; 및, 양, 염소, 돼지, 말, 및 암소, 및 특히 인간 또는 마우스의 OSCAR 이식유전자로 만들어진 동물과 같은 농장 동물을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, "약" 및 "대략"이라는 용어는 일반적으로 주어진 자연값 또는 정확한 측정치를 측정한 양에 대한 수용가능한 정도의 오차를 의미할 것이다. 일반적인 예시적 정도의 오차는 주어진 값 도는 값의 범위에 대해 20 퍼센트(%) 내, 바람직하게 10% 내, 및 보다 바람직하게는 5% 내에 있다. 선택적으로, 및 특히 생물계에서, "약" 및 "대략"이라는 용어는 크기 순서로, 주어진 값에 대해 바람직하게 5배 및 보다 바람직하게는 2배 이하인 값을 의미한다. 본 명세서에 주어진 수량은, 별도의 언급이 없다면, 명백히 표현되지 않은 경우 "약" 또는 "대략"으로 추정될 수 있는 것을 의미한다.

"분자"라는 용어는 하나 이상의 분자를 포함하여 이루어지는 물질의 임의의 개별 또는 구별이 뚜렷한 구조 유닛을 의미하며, 예를 들어, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

분자생물학 정의.본 발명에 따르면, 해당 기술분야 내에서 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 완벽하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌{Sambrook, Fitsch & Maniatis, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (본 명세서에서 "Sambrook et al., 1989"로 안급됨); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes Ⅰ and Ⅱ(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture(R.I Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986); B.E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Joh Wiley & Sons, Inc.(1994)}을 참조한다.

"폴리머"라는 용어는 반복적으로 함께 결합하는 두 개 이상의 빌딩 블록{'머(mer)'}으로 구성된 임의의 물질 또는 화합물을 의미한다. 예를 들어, "다이머"는 두 개의 빌딩 블록이 함께 접합된 화합물이며; "트리머"는 세 개의 빌딩 블록이 함께 접합된 화합물이다.

본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"라는 용어는, 전형적인 폴리뉴클레오티드에 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하는 골격을 갖는 폴리머성 분자를 말하며, 상기 폴리머 골격은 폴리머성 분자와 전형적인 폴리뉴클레오티드{예를 들어, 단일-가닥(single-stranded) DNA} 사이에 특이적 방식으로 수소 결합할 수 있게 하는 방법으로 염기를 제시하는 것을 특징으로 한다. 이러한 염기는 전형적으로 이노신, 아데노신, 구아노신, 사이토신, 우라실 및 티미딘이다. 폴리머성 분자는 이의 골격 변형(예를 들어, 메틸포스포네이트 결합) 뿐만 아니라 "이중 가닥(double-stranded)" 및 "단일 가닥" DNA 및 RNA를 포함한다.

따라서, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산" 서열은 일반적으로 DNA 및 RNA에 있는 일련의 뉴클레오티드 염기(또한 "뉴클레오티드"라 불리는)이며, 두 개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 사슬을 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 종종 단백질 및 효소를 만들기 위해 세포 기관에 의해 사용된 정보를 포함하는 유전학적 정보를 보유한다. 상기 용어는 지놈의 DNA, cDNA, RNA, 임의의 합성 및 일반적으로 조작된 폴리뉴클레오티드, 및 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 양자를 포함한다. 이는 단일- 및 이중-가닥 분자; 즉, 염기를 아미노산 골격에 접합시켜 형성된 "단백질 핵산" 뿐만 아니라 DNA-DNA, DNA-RNA, 및 RNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 이는 또한 변형된 염기, 예를 들어, 티오-우라실, 티오-구아닌 및 플루오로-우라실과 같은 변형된 염기를 함유하는 핵산을 포함한다.

본 명세서의 폴리뉴클레오티드는 천연 조절 서열에 의해 측면접합(flank)될 수 있거나, 프로모터, 인핸서, 반응 원소, 신호 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비코딩 영역 등을 포함하는 이종 서열과 관련될 수 있다. 핵산은 본 기술 분야에 공지된 다수의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형의 비제한적 예는 메틸화, "캡스(caps)", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 유사체으로 치환하는 것, 및 예를 들어, 비전하성 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카르바메이트 등) 및 전하성 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 사용한 인터뉴클레오티드 변형을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등), 인터칼레이터(intercalator; 예를 들어, 아크리딘, 소라렌 등), 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화 금속 등) 및 몇몇 명칭의 아크릴화제를 포함할 수 있다. 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미다이트 결합을 형성하여 폴리뉴클레오티드를 유도할 수 있다. 또한, 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 사용한여 본 명세서의 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 예시적인 표지는 방사성동위원소, 형광 분자, 비오틴 등을 포함한다. 가능한 변형의 다른 비제한적 예는 본 발명의 명세서에서 하기에 제공된다.

"폴리펩티드"는 "펩티드 결합"으로 불리는 화학적 결합에 의해 함께 결합되는 아미노산으로 불리는 화학적 빌딩 블록의 사슬이다. "단백질"이라는 용어는 유전자에 의해 또는 상기 유전자로부터 직접 또는 간접적으로 전사된 핵산 분자(예를 들어, mRNA 또는 cDNA)에 의해 암호화된 아미노산 잔사를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 선택적으로, 단백질에는 유전자 또는 mRNA에 의해 암호화되는 특정 아미노산 잔사가 결여될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 mRNA 분자는 최종 단백질로부터 분해되어 그의 부분이 될 수 없는, 단백질의 N-말단 상에 있는 아미노산 잔사의 서열(즉, 신호 서열)을 암호화한다. 효소를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드는, 자연적으로 발생하는 것을 의미하는 "원형의" 또는 "와일드-타입"이 될 수 있거나; 또는 원형 단백질 또는 다른 돌연변이체로부터 제조되거나, 변경되거나, 유도되거나, 약간 다르거나 변형된 것을 의미하는 "돌연변이", "변형체" 또는 "변형된" 물질이 될 수 있다.

"리간드"는 광범위하게 말하자면, 다른 분자에 결합하는 임의의 분자이다. 바람직한 실시형태에서, 리간드는 가용성 분자 또는 두 개의 분자 중 더 작은 분자 또는 양자이다. 다른 분자는 "수용체"로 언급된다. 바람직한 실시형태에서, 리간드 및 이의 수용체 양자는 세포에 의해 생산된 분자(바람직하게 단백질 또는 폴리펩티드)이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리간드는 가용성 분자이며 수용체는 통합 막 단백질(즉, 세포의 표면 상에 발현된 단백질)이다. 그러나, 분자가 리간드인 물질과 수용체인 물질 간의 구별은, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드 및 OSCAR-특이적 리간드 양자가 통합 막 단백질이거나 통합 막 단백질이 되는 것처럼 보이는 실시형태에서와 같이, 임의적인 것이다.

리간드가 이의 수용체에 결합하는 것은 종종 세포 내의 신호 형질도입에서의 단계이다. 예시적인 리간드-수용체 상호작용은, 이에 제한되는 것은 아니나, 호르몬 수용체에 호르몬을 결합시키고(예를 들어, 에스트로겐 수용체에 에스트로겐을 결합시킴) 뉴런 표면 상의 수용체에 신경전달물질을 결합시키는 것을 포함한다.

폴리뉴클레오티드의 "증폭"은, 본 명세서에 사용된 바와 같이, DNA 서열의 혼합물 내에서 특정 DNA 서열의 농도를 증가시키기 위한 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 용도를 나타낸다. PCR에 대한 설명은 문헌(Saiki et al., Science 1988, 239:487)을 참조한다.

DNA의 "화학적 시퀀싱"은, 개별 염기-특이적 반응을 사용하여 DNA를 분해하는 Maxam and Gilbert(Maxam-Gilbert 시퀀싱; Maxam & Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1977, 74:560)의 방법과 같은 방법을 나타낸다.

DNA의 "효소적 시퀀싱"은 DNA 폴리머라제를 사용하여 단일-가닥 DNA를 복제하고 무작위로 종결시키는 Sanger(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977, 74:5463)의 방법 및 해당 기술분야에 잘 알려진 이의 변형법과 같은 방법을 나타낸다.

"유전자"는 기능성 "유전자 산물"을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 일반적으로, 유전자 산물은 기능성 단백질이다. 그러나, 유전자 산물은 또한 세포 내에서 RNA(예를 들어, tRNA 또는 rRNA)와 같은 분자의 다른 형태가 될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유전자 산물은 또한 세포 내에서 발견될 수 있는 mRNA 서열을 말한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유전자 발현 수준의 측정은 mRNA 수준을 측정하는 것에 대응할 수 있다. 유전자는 또한 코딩 서열 뿐만 아니라 조절(비-코딩) 서열을 포함할 수도 있다. 예시적인 조절 서열은 예를 들어, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열을 포함한다. 유전자의 전사된 영역은 또한 인트론, 5'-비번역 영역(5'-UTR) 및 3'-비번역 영역(3'-UTR)을 포함하는 비번역 영역을 포함할 수도 있다.

RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은 "코딩 서열" 또는 서열 "암호화" 및 발현 산물은 발현될 때 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 생산을 야기하는 뉴클레오티드 서열; 즉 RNA 또는 그것이 폴리펩티드, 단백질 또는 효소에 대한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 "암호화"이다.

"프로모터 서열"은 세포 내의 RNA 폴리머라제 결합 및 하류(3' 방향) 코딩 서열의 개시 전사가 가능한 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 한정하는 목적을 위해,프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되어 상류(5' 방향)로 연장하여 상기 배경의 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는 데 필요한 염기 및 원소의 최소수를 포함한다. 프로모터 서열 내에서 RNA 폴리머라제의 결합을 전담하는 단백질 결합 영역(교감 서열) 뿐만 아니라 전사 개시 부위(예를 들어, 뉴클레아제 S1에 의해 용이하게 발견되는)가 발견될 것이다.

코딩 서열은, RNA 내로 코딩 서열을 전사하는 경우(인트론을 포함하는 경우) RNA 폴리머라제가 트랜스-RNA 스플라이싱되고, 서열이 단백질을 암호화하는 경우 단백질로 번역되는, 세포 내의 전사 및 번역 제어 서열의 "제어 하"에 있거나 이와 "작동 상 관련된다".

"발현한다" 및 "발현"이라는 용어는, 예를 들어, 대응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전자 및 번역에 관여된 세포의 기능을 활성화시켜 RNA(rRNA 또는 mRNA와 같은) 또는 단백질을 생산하는 것과 같이, 유전자 또는 DNA 서열에 있는 정보가 명확해지도록 하는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포에 의해 발현되어 RNA(예를 들어, mRNA 또는 rRNA) 또는 단백질과 같은 "발현 산물"을 형성한다. 발현 산물은 예를 들어, 생성된 RNA 또는 단백질과 같이 그 자체가 세포에 의해 "발현"되는 것으로 언급될 수 있다.

"트랜스펙션"이라는 용어는 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. "형질 전환"이라는 용어는 "외래"(즉, 외부 또는 세포외) 유전자, 숙주세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여, 본 발명에서 일반적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 RNA, 또한 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는효소인 원하는 물질을 생성하도록, 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 또한 "클로닝된" 또는 "외래" 유전자 또는 서열이라 부를 수 있으며, 조절 또는 제어 서열(예를 들어, 출발, 정지, 프로모터, 신호, 분비 또는 세포의 유전학적 기관에 의해 사용된 다른 서열)을 포함할 수 있다. 유전자 또는 서열은 비기능성 서열 또는 공지된 기능이 없는 서열을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하거나 발현하는 숙주세포는 "형질전환"되며 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포로 도입된 DNA 또는 숙주 세포와 동일한 속 또는 종의 세포 또는 다른 속 또는 종의 세포를 포함하는 임의의 원천으로부터 유래할 수 있다.

"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 숙주를 변형시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 비히클을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 등을 포함할 수 있으며 하기에 보다 상세히 논의된다.

"카세트"는 한정된 제한 부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있는 발현 산물에 대해 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 단편을 말한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에 있는 카세트의 삽입을 확실히 하도록 디자인되어 있다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입되고, 그리고 나서 벡터에 의해 전환가능한 벡터 DNA를 따라 숙주 세포 내로 운반된다. 발현 벡터와 같이, 삽입된 또는 첨가된 DNA를 갖는 DNA 단편 또는 서열은 또한 "DNA 구조"라고 부를 수 있다. 통상적인 형태의 벡터는 일반적으로, 부가적(외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포 내로 쉽게 도입할 수 있는 이중 가닥 DNA, 대개 세균성 기원의 자체-함유 분자인 "플라스미드"이다. 플라스미드 및 곰팡이의 벡터를 포함하는 수많은 벡터는 다양한 진핵성 및 원핵성 숙주 내의 복제 및/또는 발현에 대해 기재되었다. "숙주 세포"라는 용어는 세포에 의한 물질의 생산을 위한 임의의 방법으로 선택되거나, 변형되거나, 형질전환되거나, 성장하거나 사용되거나 조작되는 임의의 유기체의 임의의 세포를 의미한다. 예를 들어, 숙주 세포는 특정 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소를 발현하도록 조작되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 상기한 스크리닝 또는 다른 분석법에 사용될 수 있다. 숙주 세포는 생체 외에서 또는 비인간 동물(예를 들어, 이식유전자 동물 또는 일시적으로 트랜스펙션된 동물) 내의 하나 이상의 세포에서 배양될 수 있다.

"발현 시스템"이라는 용어는 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포로 도입되는 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건 하에서의 숙주 세포 및 친화성 벡터를 의미한다. 통상의 발현 시스템은 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, Sf9, Hi5 또는 S2 세포 및 배큘로바이러스와 같은 곤충 숙주 세포, 초파리 세포(슈나이더 세포) 및 발현 시스템, 및 포유류의 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 예를 들어, OSCAR는 PC12, COS-1, 또는 C₂C₁₂세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 세포는 CHO 세포, HeLa 세포, 293T(인간의 신장 세포), 마우스 일차 근원세포, 및 NIH 3T3 세포에서 발현될 수 있다.

"이종"이라는 용어는 자연적으로 발생한 원소의 조합을 말한다. 예를 들어, 본 발명은, rRNA 서열 및 rRNA 서열의 부분이 아닌 이종 RNA 서열을 포함하여 이루어지는 키메릭 RNA 분자를 포함한다. 이러한 관계에 있어서, 이종 RNA 서열은 리보좀의 RNA 서열 내에 자연적으로 위치하지 않는 RNA 서열을 말한다. 선택적으로, 이종 RNA 서열은 리보좀의 RNA 서열 내에 자연적으로 위치할 수 있지만, 자연적으로 발생하지 않는 rRNA 서열에 있는 위치에서 발현된다. 다른 예로서, 이종 DNA는 세포 내에 또는 세포의 염색체의 부위에 자연적으로 위치하지 않는 DNA를 말한다. 바람직하게, 이종 DNA는 세포에 대해 외래인 유전자를 포함한다. 이종 발현 조절 원소는 본질적으로 조작 상 관련된 서로 다른 유전자가 조작 상 관련된 조절 원소이다.

"돌연변이체" 및 "돌연변이"라는 용어는, 예를 들어, DNA와 같은 유전학적 물질, 또는 임의의 과정에 있어서의 임의의 검출가능한 변화, 이러한 변화의 메카니즘 또는 결과를 의미한다. 이는, 유전자의 구조(예를 들어, DNA 서열)가 변경된 유전자 돌연변이, 임의의 돌연변이 과정으로부터 발생한 임의의 유전자 또는 DNA, 및 변형된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현된 임의의 발현 산물(예를 들어, RNA, 단백질 또는 효소)을 포함한다. "변형체"라는 용어는 또한 변형되거나 변경된 유전자, DNA 서열, RNA, 효소, 세포 등; 즉, 임의의 종류의 돌연변이체을 나타내는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이러한 서열의 자연적 부분이 나니거나 이러한 rRNA 서열의 위치에 자연적으로 놓이지 않은 이종 RNA를 삽입하여 변경시킨 rRNA 서열을 포함하여 이루어지는 변형된 또는 "키메릭" RNA 분자에 관한 것이다.이들을 암호화하는 DNA 및 유전자 뿐만 아니라, 이러한 키메릭 RNA 서열은 또한 본 명세서에서 "돌연변이체" 서열로 언급될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는, 유전자, mRNA, cDNA, 또는 관심 있는 다른 핵산을 암호화하는 지놈의 DNA 분자, cDNA 분자, 또는 mRNA 분자에 하이브리디제이션할 수 있는, 일반적으로 10개 이상, 바람직하게 15개 이상, 및 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 100개 이하의 뉴클레오티드의 핵산을 말한다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어,³²P-뉴클레오티드 또는 비오틴 또는 형광 염료(예를 들어, Cy3 또는 Cy5)와 같은 표지가 공유적으로 접합된 뉴클레오티드로 표지화될 수 있다. 일 실시형태에서, 표지화된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 존재를 검출하기 위한 탐침으로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드(표지화될 수 있는 하나 또는 두 개)는 전장 또는 OSCAR 단편을 클로닝하기 위해, 또는 OSCAR를 암호화하는 핵산의 존재를 검출하기 위해 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 OSCAR DNA 분자를 사용하여 삼중 나선을 형성할 수 있다. 일반적으로, 바람직하게 핵산 합성제 중에 합성에 의해 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 따라서, 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연 발생 포스포에스테르 유사체 결합을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다.

본 발명은 OSCAR 유전자 또는 이의 유전자 산물을 저해하는 데 사용될 수 있는 안티센스 핵산(리보자임을 포함하여)을 제공한다. "안티센스 핵산"은 RNA 또는DNA에 있는 상보적인 염기를 사용하여 세포질성 조건 하에서 하이브리디제이션하는 중에 후자의 역할을 저해하는 단일 가닥 핵산 분자이다. RNA가 전령 RNA 전사일 경우, 안티센스 핵산은 역전사(countertranscript) 또는 mRNA-방해 상보적 핵산이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "안티센스"는 RNA-RNA 상호작용, RNA-DNA 상호작용, 삼중 나선 상호작용, 리보자임 및 RNase-H 매개 정지를 널리 포함한다. 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 발현을 위한 조합 유전자에 의해 암호화될 수 있거나(예를 들어, 미국 특허 제 5,814,500호; 미국 특허 제 5,811,234호), 또는 선택적으로 합성으로 이들을 제조할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 5,7880,607호). 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 다른 특이적 예는 상기에 제공된다.

본 발명에 대해 가시화된 합성 올리고뉴클레오티드의 특이적 비-제한 예는, 또한 상기한 핵산 잔기 뿐만 아니라, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 또는 사이클로알킬 당류간(intersugar) 결합 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당류간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. CH₂-NH-O-CH₂, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂, CH₂-O-N(CH₃)-CH₂, CH₂-N(CH₃)-N(CH₃) 및 O-N(CH₃)-CH₂-CH₂골격(포스포디에스테르가 O-PO₂-O-CH₂인 경우)를 갖는 것이 가장 바람직하다. 미국 특허 제 5,677,437호는 헤테로방향족 올리고뉴클레오시드 결합을 기재한다. 질소 결합 또는 질소를 포함하는 그룹은 또한 올리고뉴클레오티드 모의체를 제조하는 데 사용될 수 있다(미국 특허 제 5,792,844 및 5,783,682호). 미국 특허 제 5,637,684호는 포스포르아미데이트 및 포스포로티오아미데이트 올리고머릭화합물을 기재한다. 또한 모르폴리노 골격 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드가 가시화된다(미국 특허 제 5,034,506호). 다른 실시형태에서, 펩티드-핵산(PNA) 골격과 같이, 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격이 폴리아미드 골격으로 치환될 수 있으며, 염기는 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다(Nielson et al., Science 254:1497, 1991). 다른 합성 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 N이 1 내지 약 20인 OH, SH, SCH₃, F, OCN, O(CH₂)_nNH₂또는 O(CH₂)_nCH₃; C₁내지 C₁₀저차 알킬, 치환된 저차 알킬, 알카릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; O-; S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; 형광 잔기; RNA 분해 그룹; 리포터 그룹; 인터칼레이터(intercalator); 또는 올리고뉴클레오티드의 약물동역학적 특성을 개선하기 위한 그룹, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함하여 이루어지는 치환된 당 잔기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실기를 대신하여 사이클로부틸과 같은 당 모의체 또는 다른 카르보사이클릭을 가질 수 있다. 아데노신, 사이티딘, 구아노신, 티미딘 및 유리딘 외에, 이노신과 같은 뉴클레오시드를 갖는 뉴클레오티드 유닛이 올리고뉴클레오티드 분자에 사용될 수 있다.

핵산 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에서 다른 핵산 분자에 어닐링할 수 있을 경우, 핵산 분자는 cDNA, 지놈의 DNA, 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자에 "하이브리디제이션할 수 있다"(상기한 Sambrook etal. 참조). 온도 및 이온 강도의 조건은 하이브리디제이션의 "스트린젠시(stringency)"를 결정한다. 상동 핵산에 대한 예비 스크리닝을 위해서, 예를 들어, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 및 포름아미드 없이; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS, 55℃의 T_m(융해 온도)에 대응하는 낮은 스트린젠시 하이브리디제이션 조건이 사용될 수 있다. 중간 정도의 스트린젠시 하이브리디제이션 조건은 예를 들어, 5x 또는 6x SCC를 갖는 40% 포름아미드, T_m보다 높은 온도에 대응한다. 높은 스트린젠시 하이브리디제이션 조건은 예를 들어, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC, 최고의 T_m에 대응한다. 하이브리디제이션의 스트린젠시에 따라, 염기 간에 부적절한 짝을 이룰 수 있을지라도, 하이브리디제이션은 두 개 이상의 핵산이 상보적 서열을 포함할 것을 요구한다. 핵산을 하이브리디제이션하기 위한 적절한 스트린젠시는 핵산의 길이 및 상보성의 정도, 본 기술 분야에 잘 알려진 파라미터에 따라 다르다. 두 개의 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 T_m값이 커진다. 핵산 하이브리디제이션의 상대적 안정성(보다 높은 T_m에 해당함)은 RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA의 순서로 감소한다. 길이에서 100개 이상의 뉴클레오티드의 하이브리드에 대해, T_m을 계산하기 위한 방정식이 유도되었다(상기의 Sambrook et al. 9.50-9.51 참조). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 사용한 하이브리디제이션을 위해, 부적절한 짝을 이루는 위치가 보다 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 이의 특이성을 결정한다(상기의 Sambrook et al. 11.7-11.8 참조). 하이브리디제이션할 수 있는 핵산에 대한 최소 길이는 약 10개 이상의 뉴클레오티드; 바람직하게 약 15개 이상의 뉴클레오티드; 및 보다 바람직하게는 약 20개 이상의 뉴클레오티드가다.

특정 실시형태에서, "표준 하이브리디제이션 조건"은 55℃의 T_m을 말하며, 상기한 조건을 사용한다. 바람직한 실시형태에서, T_m은 60℃이며; 보다 바람직한 실시형태에서, T_m은 65℃이다. 특정 실시형태에서, "높은 스트린젠시"는 68℃에서 0.2XSSC 중에서, 42℃에서 50% 포름아미드, 4XSSC 중에서, 또는 이 두 가지 조건 중 하나 하에 관찰된 것과 동등한 하이브리디제이션 수준을 유지하는 조건 하에서의 하이브리디제이션 및/또는 세척 조건을 의미한다.

올리고뉴클레오티드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머)에 적합한 하이브리디제이션 조건은 올리고뉴클레오티드의 낮은 융해 온도로 인해, 일반적으로 전장 핵산(예를 들어, 전장 cDNA)에 대한 조건과 약간 다르다. 올리고뉴클레오티드의 융해 온도는 관여된 올리고뉴클레오티드 서열의 길이에 따라 다르며, 적합한 하이브리디제이션 온도는 사용된 올리고뉴클레오티드 분자에 따라 다양할 것이다. 예시적인 온도는 37℃(14-염기 올리고뉴클레오티드에 대해), 48℃(17-염기 올리고뉴클레오티드에 대해), 55℃(20-염기 올리고뉴클레오티드에 대해) 및 60℃(23-염기 올리고뉴클레오티드에 대해)가 될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대해 예시적인 적합한 하이브리디제이션 조건은 6x SSC/0.05% 피로인산나트륨에서, 또는 하이브리디제이션의 동등한 수준을 유지하는 다른 조건에서의 세척을 포함한다.

OSCAR 폴리펩티드

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 상기에 정의되어 있다. 하나의 바람직한 OSCAR 폴리펩티드는 약 264 개의 아미노산 잔사의 서열을 길이로 포함하여 이루어지며 바람직하게 약 16개의 아미노산 잔사인 신호 펩티드 서열을 길이로 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 약 248개의 핵산 잔사의 서열을 길이로 포함하여 이루어질 수 있으며 신호 펩티드 서열은 포함하지 않는다. 두 가지 실시형태의 폴리펩티드는 각각, 약 28.7 kDa 및 약 27.0 kDa의 분자량(이의 아미노산 서열로부터 계산됨)을 예측할 수 있었을 것이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 예를 들어, 글리코실화에 의해 변형될 수 있다. 이러한 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 명백한 분자량은 이의 아미노산 서열에 의해 단독으로 계산된 분자량과 다를 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서 OSCAR 폴리펩티드는 35kDa 또는 40kDa의 명백한 분자량(예를 들어, SDS-PAGE에 의해 결정된)을 가진다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 파골세포에서의 이의 발현 패턴에 의해 특징화될 수 있다. 특히, 본 발명의 OSCAR 유전자 및 유전자 산물은 예를 들어, 하기의 방법에 따라 OSCAR 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 숙주세포를 제외하고는, 파골세포에서만 발현되는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 마크로파지 및 상아질 세포를 포함하는 다른 골수 유도 세포에서는 발현되지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는, 이에제한되는 것은 아니나, 근육, 신장, 뇌, 심장, 간, 장, 갑상선, 비장 및 림프구를 포함하는 유기체의 다른 세포 및 조직에서는 발현되지 않는다. 그러나, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는, 예를 들어, OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 이러한 세포를 형질전환시키는 상기 및 다른 세포 형태에 의해 발현될 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 이의 특이적 생체활성에 의해 특징화될 수 있다. 특히, 이러한 폴리펩티드는 하기의 실시예에서 증명되는 바와 같이, 파골 세포의 성숙 및 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 파골세포의 존재하에 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드를 투여하여 파골세포의 성숙 및 활성(예를 들어, 감소된 수의 다핵성 파골세포에 의해 결정된 바와 같이)을 감소시킬 수 있다. 이러한 OSCAR 리간드는 이러한 파골세포의 성숙을 유도하도록 일반적으로 파골세포에 의해 발현된 OSCAR 폴리펩티드에 결합할 것이다. 따라서, OSCAR 리간드에 경쟁적으로 결합함으로써, 부가적으로 OSCAR 폴리펩티드를 투여하여 실질적으로 파골세포의 리간드 촉진을 예방할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는, 파골세포에 의해 발현될 경우, 파골세포 성숙 및/또는 OSCAR 리간드와의 결합에 대한 파골세포의 활성을 증가시키는 이의 능력에 의해 특징화될 수 있다.

특정한 일 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 이러한 마우스의 OSCAR 폴리펩티드는 다섯 가지 이상의 별개의 도메인에 대응하는 서열: 신호 펩티드서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 1-16을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 17-122 및 123-228을 포함하여 이루어짐)을 , 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 229 내지 247을 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 잔사 248-264)을 포함하여 이루어진다. 이러한 각 도메인을 표시하기 위해 한정된 아미노산 잔사 수는 대략적인 것으로 생각된다.

다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 인간의 OSCAR 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 특히, 본 발명은 인간의 OSCAR 폴리펩티드의 다섯 가지 이상의 동질 이성체(즉, 변형체)를 제공한다. 이러한 변형체는, 본 명세서에서 각각, C18 인간 OSCAR 동질이성체(도 3B 및 SEQ ID NO:7에 나타나 있음), C16 인간 OSCAR 동질이성체(도 4B 및 SEQ ID NO:9에 나타나 있음), C10 인간 OSCAR 동질이성체(도 5B 및 SEQ ID NO:11에 나타나 있음), 인간 OSCAR 동질이성체 S1(도 24B 및 SEQ ID NO:25에 나타나 있음) 및 인간 OSCAR 동질이성체 S2(도 25B 및 SEQ ID NO:27에 나타나 있음)로 언급된다.

따라서, 특정한 일 실시형태에서 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있다. 이러한 C18 인간 OSCAR 동질이성체는 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:8의 아미노산 잔사 1-18을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 19-127 및 128-233을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 234-252를 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 253-267을 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 4B(SEQ ID NO:9)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 이러한 C16 인간 OSCAR 동질이성체는 또한 다섯 가지 이상의 개별 도메인: 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 1-18을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 19-127 및 128-233을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 234-252를 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:9의 아미노산 잔사 253-267을 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. C10 인간 OSCAR 동질이성체는 또한, 신호 펩티드 서열(SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 1-13을 포함하여 이루어짐), 두 개의 Ig-유사 도메인 서열(각각, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 14-112 및 113-218을 포함하여 이루어짐), 막내외 도메인 서열(SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 219-237을 포함하여 이루어짐) 및 세포질 근미 도메인 서열(SEQ ID NO:11의 아미노산 잔사 238-252를 포함하여 이루어짐)을 포함하여 이루어진다.

또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 24B(SEQ ID NO: 25)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 이 실시형태에는 상기 실시형태에서 발견된 막내외 도메인이 결여되어 있다.

또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 25B(SEQ IDNO: 27)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 이 실시형태에도 상기 실시형태에서 발견된 막내외 도메인이 결여되어 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 나타나 있는 전장 OSCAR 폴리펩티드와 같은 전장 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 개별 도메인의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는, SEQ ID NOS:3, 7, 9 및 11에 나타나 있는 OSCAR 폴리펩티드 중 어느 하나에 대해 상기한 바와 같은 신호 서열 도메인, Ig-유사 도메인 중 하나, 막내외 도메인 또는 세포질 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 이의 개별 도메인의 임의의 조합에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 도메인 각각을 표사하기 위해 한정된 아미노산 잔사 수는 대략적인 것으로 생각된다.

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B( SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 나타나 있는 전장 OSCAR 폴리펩티드 중 어느 하나의 에피토프와 같은 전장 OSCAR 폴리펩티드의 에피토프의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. OSCAR 폴리펩티드의 에피토프는 항체를 생산할 수 있고 항체가 결합하는 폴리펩티드 상의 부위를 나타낸다. 따라서, OSCAR 에피토프의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드는 OSCAR 단백질에 대한 항체를 제조하는 데 유용하다. 바람직하게, 에피토프는 5개 이상, 보다 바람직하게 10, 15, 20, 25, 또는 50개 이상의 아미노산 잔사를 길이로 포함하여 이루어진다. 따라서, OSCAR 단백질의 에피토프를 포함하여 이루어지는 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 바람직하게 OSCAR 단백질 서열의 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상 또는 50개 이상의 아미노산 잔사의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 에피토프가 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 나타나 있는 OSCAR 폴리펩티드 중 하나의 에피토프인 것을 특징으로 하는 바람직한 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드는 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 나타나 있는 서열의 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상 또는 50개 이상의 아미노산 잔사의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드 사이에 있는 또다른 단편이 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 하기의 실시예는 도 2B(SEQ ID NO:5)에 나타나 있는 폴리펩티드 서열을 암호화하는, OCL178로 언급되는 클론을 제공한다. 이 폴리펩티드는 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 전장 폴리펩티드의 아미노산 잔사 161-265의 서열에 대응한다. 이러한 단편은 또한 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드 사이에 존재한다.

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 전장 폴리펩티드의 유사체 및 유도체(예를 들어, SEQ ID NO:3, 7, 9, 11, 25 및 27)를 포함한다. 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드의 유사체 및 유도체는 상기한 OSCAR 폴리펩티드에 대해 동일하거나 상동적인 특징을 가진다.

예를 들어, OSCAR 폴리펩티드의 말단 절단 형태가 제공될 수 있다. 이러한말단 절단 형태는 특이적 결실을 갖는 OSCAR 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 전장 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인(예를 들어, 신호 서열 도메인, 하나 이상의 Ig-유사 도메인, 막내외 도메인 또는 세포질성 근미 도메인)에 대응하는 아니노산 잔사는 OSCAR 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 결실될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 말단 절단 OSCAR 폴리펩티드는 신호-서열 도메인이 결실되거나 다른 방법으로 제거되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드; 즉, 신호-서열 도메인을 포함하지 않는 폴리펩티드이다.

특정 실시형태에서, 유도체는 기능적으로 활성이다; 즉, 본 발명의 전장, 와일드-타입 OSCAR 폴리펩티드와 관련된 하나 이상의 기능적 활성을 나타낼 수 있다.

융합 단백질의 OSCAR 부분이 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 특징을 갖는 OSCAR 키메릭 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 따라서, 이러한 융합 폴리펩티드는 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드의 실시형태를 나타낸다. 예시적인 OSCAR 융합 폴리펩티드는 OSCAR 폴리펩티드 서열의 단편(예를 들어, 에피토프 또는 하나 이상의 도메인에 대응하는 단편)을 포함하여 이루어지는 융합 뿐만 아니라, 전장, 유도 또는 말단 절단 OSCAR 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 포함한다. 이러한 융합 폴리펩티드는 또한 표지 폴리펩티드의 아미노산 서열; 예를 들어, FLAG, 히스티딘 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼레이스(GST), 헤마글루티닌, 또는 인간의 IgG의 Fc 부분을 포함하여 이루어질 수 있다. 다른 실시형태에서, β-갈락토시다제와 같은 세균성 단백질을 사용하여 OSCAR 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 또한, OSCAR 융합 폴리펩티드는 티오리덕타제(thioreductase) 아미노산 서열 또는 하나 이상의 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgG1 또는 IgG2)의 서열과 같이, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다.

예를 들어, 치환, 첨가 또는 결실에 의해 핵산 분자를 암호화하여 변경함으로써 또한 OSCAR 유사체 또는 변형체를 제조할 수도 있다. 이러한 변경된 핵산 분자는 기능적으로 유사한 분자(즉, 하나 이상의 OSCAR 기능을 수행하거나 하나 이상의 OSCAR 생체 활성을 갖는 분자)를 암호화하는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체는 기능-보존 변형체이다.

폴리펩티드의 "기능-보존 변형체"는, 폴리펩티드의 전체 구조 및/또는 기능(예를 들어, 생체활성)을 변형시키지 않고 폴리펩티드에 주어진 아미노산 잔사를 변형시킨 변형체이다. 이러한 변화에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 극성, 수소 결합 포텐셜, 산성, 알칼리성, 소수성, 방향성 등과 같은 유사한 특성을 갖는 물질로 아미노산을 대체하는 것이 포함된다. 예를 들어, 및 제한적 방법은 아니나, 아르기닌, 히스티딘 및 리신은 친수성-염기성 아미노산이며 상호교환될 수 있다. 유사하게, 이소류신, 소수성 아미노산을 류신, 메티오닌 또는 발린으로 대체할 수 있다. 이러한 변화는 단백질 또는 폴리펩티드의 명백한 분자량 또는 등전점에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 생각된다.

아미노산 잔사는, 본 명세서에서 특이적으로 보존되는 것으로 확인된 것과 달리, 단백질 또는 폴리펩티드의 변형체 간에 서로 다를 수 있다. 따라서, 유사한 기는의 임의의 두 가지 OSCAR 폴리펩티드 간의 단백질 또는 아미노산 서열 유사성 비율은 다양할 수 있다. 일반적으로, 서로 다른 OSCAR 폴리펩티드 변형체 간의 단백질 또는 아니노산 서열 유사성 비율은, 클러스터 방법(Cluster Method) 및/또는 MEGALIGN 알고리즘과 같은 정렬도에 따라 결정된 바와 같이, 70% 내지 99%가 될 수 있다. "기능-보존 변형체"는 또한, 예를 들어, BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정된 바와 같이, 50% 이상, 바람직하게 75% 이상, 보다 바람직하게 85% 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 이러한 기능-보존 변형체는 또한 이들이 비교되는 원래의 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 특성, 기능 또는 생체활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 기능-보존 변형체는 본 발명의 전장 OSCAR 단백질의 변형체(예를 들어, 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각, 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 나타나 있는 서열을 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드의 변형체) 뿐만 아니라, 변형된 OSCAR 폴리펩티드의 변형체(예를 들어, 말단절단 및 결실) 및 전장 OSCAR 단백질의 단편의 변형체(예를 들어, 도메인 또는 에피토프에 대응하는)를 포함한다.

또다른 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체는 OSCAR 폴리펩티드의 대립형질 변형체 또는 돌연변이체이다. 대립형질 변형체 및 돌연변이체라는 용어는, 폴리펩티드를 설명하는 데 사용될 경우, 대립형질 변형체 또는 돌연변이체 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 본 발명의 대립형질 변형체 및 돌연변이 OSCAR 폴리펩티드는 본 발명의 OSCAR 핵산 분자의 대립형질 변형체 또는 돌연변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드이다.

또다른 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체는 동종(예를 들어, 대립형질 변형체) 또는 이종(예를 들어, 오르소성(orthologous) 폴리펩티드); 바람직하게는 마우스, 인간, 래트, 래빗, 햄스터 또는 기니피그와 같은 다른 포유류로부터의 실질적으로 상동인 폴리펩티드이다. 그러나, 본 발명의 OSCAR 상동체는 개, 고양이, 양, 염소, 돼지, 말, 소, 닭 및 몇몇 명칭의 두꺼비(xenopus)를 포함하는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 OSCAR 폴리펩티드 서열은 인간의 오르소체이며 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 마우스의 OSCAR 폴리펩티드와 상동적이다. 도 6에 나타난 이러한 두 가지 아미노산 서열의 정렬은 두 가지 서열이 상당한 서열 동일성을 공유한다는 것을 증명한다. 특히, C18 인간 동질이성체(도 6, SEQ ID NO:7에 있는 hOSCAR)에 대한 폴리펩티드 서열은 마우스의 OSCAR 폴리펩티드 서열(도 6, SEQ ID NO:3에 있는 mOSCAR)에 대해 74.6%(즉, 약 75%) 동일하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "상동적"이라는 용어는, 이의 모든 문법적 형태 및 철자의 변형체에 있어서, 상과로부터의 단백질(예를 들어, 면역글로불린 상과) 및 서로 다른 종으로부터의 상동 단백질을 포함하여, "공통의 진화적 기원"을 갖는 것으로 이해되는 단백질 간의 관계를 말한다. 예를 들어, Reeck et al., Cell 1987, 50:667을 참조한다. 서로 다른 종으로부터의 대응 단백질은 "오르소체"로 언급된다. 상동 및 오르소성 단백질, 및 이의 암호화 유전자는 서열 유사성에 의해 반영되는 것과 같은 서열 상동성을 갖는다. 이러한 서열 유사성은 예를 들어, 서열 유사성의 비율에 의해(예를 들어, 아미노산 서열 동일성 또는 상동성의 비율), 또는 보존된 위치에서의 특이적 아미노산 잔사 또는 모티프의 존재에 의해나타날 수 있다.

"서열 유사성"이라는 용어는, 이의 모든 문법적 형태에 있어서, 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치성의 정도를 말한다. 본 명세서에서 별도로 지시되는 것을 제외하고는, "상동적"이라는 용어는 단지 서열 유사성을 말하며 공통의 진화적 기원에 관한 것일 필요는 없다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드가 하나 이상의 고도로 보존된 도메인에서 또는, 대립형질에 대해서는 전체적인 아미노산 서열을 가로질러, 본 명세서에 개시된 알고리즘 중 하나에 의해 결정된 바와 35-40% 이상, 바람직하게 60% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90 내지 95% 이상 유사한 경우, 두 가지 폴리펩티드 서열은 "실질적으로 상동적" 또는 "실질적으로 유사적"이다. 아미노산 또는 핵산 서열을 비교하는 데 사용될 수 있는 서열 비교 알고리즘은 BLAST 알고리즘(예를 들어, BLAST P, BLAST N, BLAST X), FASTA, DNA 스트라이더(Strider), GCG(Genetic Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Maidson, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램 등을 포함한다. 별도의 언급이 없을 경우, 본 명세서에 언급된 모든 서열은 이러한 이러한 알고리즘을 제공한 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하여 비교된다. 이러한 서열의 예는 예를 들어, 도 1C, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각 3, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)에 도시된 OSCAR 폴리펩티드 서열의 대립형질 또는 종 변형체를 포함하는, 본 발명의 OSCAR 유전자 및 유전자 산물의 대립형질 또는 종 변형체이다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 사용하여 서열을 비교함으로써 확인될 수 있다.

다른 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 변형체(유사체 및 상동체를 포함하여)는 예를 들어, 한정된 조건 하에서의 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization) 실험에서 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체 및/또는 상동체는, 도 1A, 1B, 2A, 26A 및 27A(SEQ ID NOS: 각각, 1, 2, 4, 30, 및 31) 및 도 3A, 4A, 5A, 24A 및 25A(SEQ ID NOS: 각각, 6, 8, 10, 26 및 28)에 나타나 있는 코딩 서열 중 어느 하나와 같이, 50% 포름아미드 및 5X 또는 6X SCC를 포함하여 이루어지는 높은 스트린젠시 하이브리디제이션 조건 하에서 OSCAR 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 다른 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체 및/또는 상동체는, 중간 스트린젠시 하이브리디제이션 조건 하에서(즉, 5X 또는 6X SSC를 가진 40% 포름아미드), 또는 낮은 스트린젠시 조건 하에서(예를 들어, 5X SSC, 또는 0.5% SDS) 하에서 OSCAR 핵산 서열(예를 들어, 도 1B, 2A, 3A, 4A, 5A, 24A, 25A, 26A 및 27A 및 SEQ ID NOS; 각각, 1-2, 4, 6, 8, 10, 26, 28, 30 및 31에 나타나 있는 코딩 서열)의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어질 수 있다.

또다른 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 유사체, 상동체 및 오르소체를 포함하는 변형체는 또한 예를 들어, OSCAR 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 디자인되고 하기에 기재된 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR에 의해 변형된 OSCAR 유전자를 분리해냄으로써 확인될 수 있다.

본 발명의 OSCAR 폴리펩티드의 유도체는 또한 제한의 수단으로써가 아니라, 포스포릴화된 OSCAR, 미리스틸화된(myristylated) OSCAR, 메틸화된 OSCAR 및 화학적으로 변형된 다른 OSCAR 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 요오드 또는 인산(Ⅲ)으로 방사성-표지화된 표지화된 변형체(예를 들어, EP 372707B를 참조) 또는 이에 제한되는 것은 아니나, 비오틴, 형광 염료(예를 들어, Cy5 또는 Cy3), 금속 이온과 착물화된 킬레이팅 그룹, 발색단 또는 형광발색단, 금(gold) 콜로이드, 라텍스 비드와 같은 입자, 또는 수용성 폴리머에 부착된 입자와 같은 다른 검출가능한 분자를 포함한다.

생물학적 활성 성분 또는 OSCAR 핵산의 성분 또는 폴리펩티드의 화학적 변형은 특정 환경 하에서 부가적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 1970년 12월 18일 자로 공개된 미국 특허 제 4,179,337호(Davis et al.)을 참조한다. 또한, 재검토를 위해 문헌{Abuchowski et al., in Enzyme as Drug (J.S. Holcerberg and J. Robert, eds. 1981), pp. 367-383}을 참조한다. 단백질 변형 및 융합 단백질을 기재한 논평 기사는 문헌(Francis, Focus on Growth Factors 1992, 3:4-10, Mediscript: Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK)에서 발견된다.

OSCAR 핵산

본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 또한 상기에 한정되어 있으며, 상기한 임의의 변형(예를 들어, 변형된 염기 및/또는 골격)을 포함하여 이루어지는 핵산 분자 뿐만 아니라, DNA 및 RNA 분자를 포함한다. 일반적으로, OSCAR 핵산 분자는 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 보체, 및 이의 단편을 포함하여 이루어진다. 따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 도 1A 및 1B(SEQ ID NO: 각각, 1 및 2)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열과 같이, 도 1C(SEQ ID NO:3)에 나타나 있는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 도 26A(SEQ ID NO:30)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열과 같이, 도 26B(SEQ ID NO:29)에 나타나 있는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 도 27A(SEQ ID NO:32)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열과 같이, 도 27B(SEQ ID NO:31)에 나타나 있는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다.

다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 도 3A(SEQ ID NO:6)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열을 포함하여, 도 3B(SEQ ID NO:7)에 나타나 있는 아미노산 서열을 상기한 C18 인간 OSCAR 동질이성체에 대해 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 바람직하게, 상기 예시적인 OSCAR 서열(즉, 도 3A 및 SEQ ID NO:6에 나타난 예시적인 서열)의 핵산 328은 구아닌이다. 그러나, 예시적인 대체적 실시형태에서 핵산 328은 티민이다.

또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 도 4A(SEQ ID NO:8)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열을 포함하여, 도 4B(SEQ ID NO:9)에 나타나 있는 아미노산 서열을 상기한 C16 인간 OSCAR 동질이성체에 대해 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 도 5A(SEQ ID NO:10)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열을 포함하여, 도 5B(SEQ ID NO:11)에 나타나 있는 아미노산 서열을 상기의 C10 인간 OSCAR 동질이성체에 대해 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다.

다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산은, 도 24A에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열을 포함하여, 도 24B(SEQ ID NO:25)에 나타나 있는 아미노산 서열을 S1 인간 OSCAR 동질이성질체에 대해 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 도 25A(SEQ ID NO:28)에 나타나 있는 특정 OSCAR 핵산 서열을 포함하여, 도 25B(SEQ ID NO:27)에 나타나 있는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다.

또다른 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 OSCAR 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인(예를 들어, 신호 서열 도메인, 하나 이상의 Ig-유사 도메인, 막내외 도메인 또는 세포질 근미 도메인)을 암호화하는 핵산 서열, 또는 OSCAR 폴리펩티드의 도메인의 임의의 조합을 암호화하는 핵산 서열을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 OSCAR 핵산은 또한 OSCAR 유전자를 위한 지놈의 OSCAR 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 도 7A 내지 7D(SEQ ID NO:12)는 인간의 OSCAR 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 인간의 염색체 19의영역으로부터의 서열을 나타낸다. 따라서, 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 핵산 분자는 본 발명의 OSCAR 핵산 사이에 존재한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 0SCAR 핵산은, 상기 표 1에 기재되고 도 7A 내지 7D에 나타나 있는 하나 이상의 인트론 또는 엑손 서열로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 OSCAR 유전자의 엑손 및/또는 인트론의 조합을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다.

본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 또한 OSCAR 폴리펩티드의 단편(예를 들어, 에피토프)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하여 이루어질 수도 있다. 이러한 단편은 도 2B(SEQ ID NO:5)에 나타나 있는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 다른 핵산 서열 뿐만 아니라, 예를 들어, 도 2A(SEQ ID NO:4)에 나타나 있는 핵산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 또한 변형된 OSCAR 폴리펩티드(예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 말단절단을 갖는) 및 OSCAR 폴리펩티드의 변형체(동일하거나 서로 다른 종으로부터의 유사체 및 상동체를 포함하는)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 핵산 분자는 도 1A 내지 1B, 3A, 4A, 5A, 7A 내지 7D, 24A, 25A, 26A 및 27A(SEQ ID NO: 각각, 1 내지 2, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 및 32)에 나타나 있는 코딩 서열과 같은 OSCAR 코딩 뉴클레오티드 서열에 대해 50% 이상, 바람직하게 75% 이상 및 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가진다. 선택적으로, 본 발명의 핵산 분자는 예를 들어, 한정된 조건 하의 서던 블롯 분석법에서 OSCAR 핵산 분자에 하이브리디제이션하는 분자가 될 수 있다.예를 들어, 특정 실시형태에서, 1.65 kb EcoRI 단편 및 5.5 kb BgI Ⅱ 단편을 포함하는, 표지화된 OSCAR cDNA는 하나 이상의 인간의 지놈의 단편에 하이브리디제이션한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는, 50% 포름아미드 및 5X 또는 6X SSC를 포함하여 이루어지는 높은 스트린젠시 하이브리디제이션 조건 하에서, 도 1A 내지 1B, 3A, 4A, 5A, 7A 내지 7D, 24A, 25A, 26A 및 27A(SEQ ID NO: 각각, 1 내지 2, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 및 32)에 나타나 있는 코딩 서열 중 하나와 같은 OSCAR 핵산 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 중간 스트린젠시 하이브리디제이션 조건(즉, 5X 또는 6X SSC를 갖는 40% 포름아미드) 하에서, 또는 낮은 스트린젠시 조건(예를 들어, 포름아미드 없이, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 30% 포름아미드, 5X SSC, 또는 0.5% SDS) 하에서, OSCAR 핵산 서열(예를 들어, 도 1A 내지 1B, 3A, 4A, 5A, 7A 내지 7D, 24A, 25A, 26A 및 27A에 나타나 있는 코딩 서열)의 보체에 하이브리디제이션한다. 특히 바람직한 하이브리디제이션 조건은 낮은 스트린젠시 하이브리디제이션 완충액(예를 들어, 30% 포름아미드, 10 mM Tris pH 7.6, 2.5x Denhardt's 용액, 5x SSC, 0.5% SDS 및 1.5 mg/㎖ 초음파 처리된 연어 정자 DNA) 중에 42 ℃에서의 하이브리디제이션 후 낮은 스트린젠시 세척 완충액(예를 들어, 0.5x SSC 및 1% SDS)을 사용한 세척을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 하기의 실시예는 마우스 및 인간 지놈의 DNA를 OSCAR 클론 OSL178(SEQ ID NO:4)로부터 유도된 OSCAR 핵산 서열에 하이브리디제이션한 실험을 기재한다. 따라서, 이러한지놈의 서열은 본 발명의 OSCAR 핵산 서열의 부분이다.

선택적으로, 본 발명의 핵산 분자는, 동일한 한정된 하이브리디제이션 조건 하에서, 도 2A(SEQ ID NO:4)에 나타나 있는 단편과 같이 전장 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 단편의 보체 또는 도 2B(SEQ ID NO:5)에 도시된 OSCAR 폴리펩티드 단편을 암호화하는 다른 핵산 분자에 하이브리디제이션할 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예는, 클론 OCL178에 포함되며 도 2A(SEQ ID NO:4)에 나타나 있는 OSCAR 핵산 단편에 하이브리디제이션하는 4.0 kb, 1.8 kb 및 1.1 kb의 명확한 길이의 OSCAR mRNA 분자의 확인을 기재한다. 이 실시예는 또한 OCL178 핵산에 하이브리디제이션하는 마우스 및 인간 지놈의 DNA 단편 양자의 확인을 기재한다. 따라서, 이러한 핵산은 본 발명의 OSCAR 핵산 분자의 예시적인 실시형태이다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 전장 OSCAR 서열의 단편을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서 이러한 OSCAR 핵산 단편은 전장 코딩 OSCAR 뉴클레오티드 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 15개 이상의 뉴클레오티드 및 보다 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드의 서열에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 단편은, 도 1A 내지 1B, 3A, 4A, 5A, 7A 내지 7D, 24A, 25A, 26A 및 27A(SEQ ID NO: 각각, 1 내지 2, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 및 32)에 나타나 있는 OSCAR 코딩 서열 또는 도 1C, 2B, 3B, 4B, 5B, 24B, 25B, 26B 및 27B(SEQ ID NOS: 각각, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 27, 29 및 31)의 부분(예를 들어, 10, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오티드)에 대응한다.

다른 실시형태에서, OSCAR 핵산 단편은, 전장 코딩 OSCAR 핵산 서열(예를 들어, 도 1A 내지 1B, 3A, 4A, 5A, 7A 내지 7D, 24A, 25A, 26A 및 27A(SEQ ID NO: 각각, 1 내지 2, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 및 32)에 나타나 있는 서열에 있는) 또는 이의 단편(예를 들어, 도 2A 및 SEQ ID NO:4에 나타나 있는 서열에 있는)에 대해 상보적이거나 및/또는 하이브리디제이션하는, 10개 이상, 바람직하게 15개 이상, 및 보다 바람직하게 20개 이상의 뉴클레오티드의 서열을 포함하여 이루어진다. 이러한 올리고뉴클레오티드에 적합한 하이브리디제이션 조건은 상기에 기재되어 있으며, 6x SSC/0.05% 피로인산염 중에 세척하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 융해 온도는 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 다르기 때문에, 적합한 하이브리디제이션 온도는 사용된 올리고뉴클레오티드에 따라 변화할 것이다. 예시적인 온도는 37 ℃(14-염기 올리고뉴클레오티드에 대해), 48 ℃(20-염기 올리고뉴클레오티드에 대해) 및 60 ℃(23-염기 올리고뉴클레오티드에 대해)가 될 것이다.

본 발명의 핵산은 또한 "키메릭" OSCAR 핵산 분자를 포함한다. 이러한 키메릭 핵산 분자는 하나 이상의 OSCAR 핵산 서열(상기한 전장 또는 부분 OSCAR 핵산 서열 중 하나가 될 수 있는), 및 또한 하나 이상의 비-OSCAR 핵산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드가다. 예를 들어, 비-OSCAR 핵산 서열은 또다른 비-OSCAR 유전자로부터 유도되고 자연 발생 OSCAR 유전자와 정상적으로 관련되지 않은 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)이 될 수 있다. 비-OSCAR 핵산 서열은 또한, FLAG, 히스티딘 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 헤마글루티닌, β-갈락토시다제, 티오리덕타제 또는 면역글로불린 도메인(예를 들어, Fc 영역)과 같은 또다른 비-OSCAR 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키메릭 핵산은 본 발명의 OSCAR 융합 폴리펩티드를 암호화한다.

OSCAR 유사체 및 상동체와 같은 변형체 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하여, 이러한 단편을 포함하여 이루어지는 핵산 분자는 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 다른 핵산 분자를 검출 및 증폭하기 위해, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 탐침 및 프라이머(예를 들어, PCR 프라이머)로 유용하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 단편은 예를 들어, 세포 내에서 OSCAR 유전자 발현 또는 전사의 수준을 조절하기 위해, 예를 들어, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오티드를 형성하는 삼중 나선, 또는 리보자임으로 사용될 수 있다.

지놈의 DNA이거나, cDNA 또는 그 외의 것이든, 본 발명의 OSCAR 핵산 분자는 마우스 및 인간 cDNA 또는 지놈의 라이브러리를 포함하는 임의의 원천으로부터 분리될 수 있다. OSCAR 유전자를 얻는 방법은 상기한 바와 같이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 상기의 Sambrook et al., 1989).

DNA는 본 기술 분야에 공지된 표준 방법으로, 클로닝된 DNA(예를 들어, DNA "라이브러리")로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게, 단백질의 높은 수준 발현을 갖는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리(이러한 세포는 최고 수준의 OSCAR 발현을 증명하기 때문에, 예를 들어, 파골세포 라이브러리)로부터 얻을 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, "서브트랙션" 라이브러리로부터 DNA를 얻어 특정 세포 형태에 의해 특이적으로 발현되 유전자의 cDNA에 대한 라이브러리를 풍부하게 할 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 파골세포-마크로파지 서브트랙션 라이브러리는, 또한 마크로파지의 의해 발현되는 파골세포로부터 유도된 cDNA의 상당 부분이 제거되도록 구성될 수 있다. 이러한 서브트랙션 라이브러리를 사용하여, 파골세포에 의해 특이적으로 발현되며 마크로파지에 의해서는 발현되지 않는 OSCAR와 같은 유전자에 대해 cDNA를 분리해낼 수 있는 가능성을 증가시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 화학적 합성, cDNA 클로닝, 또는 지놈의 DNA 또는 이의 단편의 클로닝에 의해 라이브러리를 제조하여 원하는 세포로부터 정제할 수 있다(예를 들어, 상기의 Sambrook et al., 1989; Glover, D.M. ed., 1985, DNA 클로닝: Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. Ⅰand Ⅱ 참조).

지놈의 DNA로부터 유도된 클론은 코딩 영역 뿐만 아니라, 조절 및 인트론 DNA 영역을 포함할 수 있다. cDNA로부터 유도된 클론은 일반적으로 인트론 서열릉 포함한다. 원천이 무엇이든지, 유전자는 유전자의 증식에 적합한 벡터로 분자에 의해 클로닝되어야 한다. 원하는 OSCAR 유전자를 포함하는 특이적 DNA 단편의 확인은 수많은 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 표지화된 탐침을 제조하기 위해 하기에 예시된 OSCAR 유전자의 부분을 정제 및 표지화할 수 있다(Benton & Davis, Science 1977, 196:180; Grunstein & Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1975, 72:3961). 또다른 개체로부터의 대립형질 변형체와 같이, 탐침에 대해 실질적 상동성을 가진 이러한 DNA 단편은 하이브리디제이션할 것이다. 특정 실시형태에서, 최고 스트린젠시 하이브리디제이션 조건은 상동적 OSCAR 유전자를 확인하는 데 사용된다.

예를 들어, 유전자가 등전, 전기영동, 아미노산 조성물, 부분적 또는 완전한 아미노산 서열, 항체 결합 활성, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 OSCAR 단백질의 리간드 결합 프로필을 갖는 단백질 산물을 암호화하는 경우와 같이, 유전자의 특성에 기초하여 선택할 수 있다. 따라서, 이의 발현된 산물의 물리적, 화학적, 면역학적, 또는 기능적 특성에 기초한 분석법으로 유전자의 존재를 검출할 수 있다.

OSCAR 유전자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 대립형질 변형체, 종 변형체, 서열 보존 변형체, 및 기능적 변형체를 포함한다. 특히, 본 발명의 핵산 서열은 "기능-보존적 변형체" 및 "서열-보존적 변형체" 양자를 포함한다. 핵산의 기능-보존적 변형체는 상기한 바와 같이 폴리펩티드의 기능-보존적 변형체를 암호화흐는 핵산이다. 핵산의 "서열-보존적 변형체"는 서로 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 갖지만 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이다.

특히 바람직한 특성을 갖는 아미노산을 치환하기 위해 아미노산 치환을 도입할 수 있다. 예를 들어, Cys는 또다른 Cys를 갖는 디술파이드 브리지(bridge)에 대한 잠재적 부위에 도입될 수 있다.

본 발명의 OSCAR 유도체 및 유사체를 암호화하는 유전자는 본 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들의 생산을 야기하는 조작은 유전자 또는 단백질 수준에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 클로닝된 OSCAR 유전자 서열은 본 기술 분야에 공지된 수많은 기술 중 어느 하나에 의해 변형될 수 있다(상기, Sambrook et al., 1989). 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적절한 부위에서 서열을분해한 후, 필요한 경우 효소에 의해 변형시켜 분리시키고 생채 외에서 결찰시킬 수 있다. OSCAR의 유도체 및 유사체를 암호화하는 유전자를 생산할 때, 변형된 유전자가 원하는 활성이 암호화되는 유전자 지역에서 번역 정지 신호에 의해 방해되지 않은 OSCAR 유전자와 동일한 번역 판독 프레임 내에 확실히 남아있도록 하는 것을 주의해야 한다.

또한, 번역, 개시, 및/또는 종결 서열을 제조 및/또는 파괴하기 위해, 또는 코딩 영역에서 변형체를 제조하거나 및/또는 신규한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 기존의 것을 파과하기 위해, 또한 생체외에서의 변형을 용이하게 하기 위해, 생체 외 또는 생체 내에서 OSCAR-암호화 핵산 서열을 돌연변이시킬 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 생체 내의 부위-지시된 돌연변이유발(Hutchinson, C., et al., J. Biol. Chem. 253:6551, 1978; Zoller and Smith, DNA 3:479-488, 1984; Oliphant et al., Gene 44:177, 1986; Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710, 1986) TAB" 링커(Pharmacia) 등을 포함하는, 본 기술 분야에 공지된 돌연변이유발을 위한 임의의 기술이 사용될 수 있다. PCR 기술이 부위 지시된 돌연변이유발에 바람직하다(Higuchi, 1989, "Using PCR to Engeener DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70 참조).

그리고 나서 확인 및 분리된 유전자를 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입할 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 수많은 벡터-숙주 시스템을 사용할 수 있다. 가능한 벡터로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되지만, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포와 양립할 수 있어야 한다. 벡터의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 대장균, 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 유도체 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드, 예를 들어, pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG, pKK 플라스미드(Clontech), pET 플라스미드(novagen, Inc., Madison, WI), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA), 또는 pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Berverly, MA) 등이 포함된다. 예를 들어, DNA 단편을 상보적 접착 말단을 갖는 클로닝 벡터 내에 결합시켜 클로닝 벡터 내로 삽입한다. 그러나, 상보적 제한 부위가 단편으로 사용된 경우, DNA가 클로닝 벡터에 존재하지 않으며, DNA 분자의 말단이 효소에 의해 변형될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단 상에 결합시켜(상기 결합된 링커는, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 화학적으로 합성된 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다) 원하는 임의의 부위를 제조할 수 있다.

유전자 서열의 수많은 복제가 생성되도록, 변형, 트랜스펙션, 감염, 전기충격법(electroporation) 등을 통해 재조합 분자를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 클로닝된 유전자는 예를 들어, 대장균과 같은 클로닝 세포에서 팽창하며 필요한 경우, 이어서 적절한 발현 세포주 내로 삽입하기 위한 정제를 용이하게 하는, 셔틀 벡터 플라스미드에 포함되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대장균 및 활성효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서의 복제를 위해 대장균 플라스미드로부터의 서열을 이스트 2m 플라스미드로부터의 서열과 결합시킴으로써, 하나 이상의 형태의 유기체에서 복제할 수 있는 벡터인 셔틀 벡터를 제조할 수 있다.

OSCAR 폴리펩티드의 발현

OSCAR, 또는 이의 키메릭 단백질을 포함하여, 항원의 단편, 이의 유도체 또는 유사체, 또는 기능적 활성 유도체에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입된 단백질-코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 원소를 포함하는 벡터 내로 삽입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 OSCAR를 암호화하는 핵산은 본 발명의 벡터의 발현에 있어서의 프로모터와 조작 상 관련될 수 있다. cDNA 및 지놈의 서열 양자는 이러한 조절 서열의 제어 하에 클로닝 및 발현될 수 있다. 이러한 벡터는 기능적 또는 기능적으로 활성화되지 않은 OSCAR 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다.

필요한 전사 및 번역 신호가 재조합 발현 벡터에 제공될 수 있다.

잠재적 숙주-벡터 시스템은 이에 제한되는 것은 아니나, 발현 플라스미드로 트랜스펙션되거나 또는 바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 등)로 감염된 포유류의 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 이스트 벡터를 포함하는 이스트와 같은 미생물; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 변형된 박테리아를 포함한다. 벡터의 발현 원소는 이의 강도 및 특이성에 따라 다르다. 사용한 숙주-벡터 시스템에 따라, 수많은 적합한 전사 및 번역 원소 중 어느 하나를 사용할 수 있다.

OSCAR 단백질의 발현은 본 기술 분야에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 원소에 의해 제어될 수 있지만, 조절 원소는 발현을 위해 선택된 숙주에서 기능적이어야 한다. OSCAR 유전자 발현을 제어하는 데 사용될 수 있는 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(미국 특허 제 5,385,839호 및 제 5,168,062호), SV40 초기 프로모터 영역(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 로우스육종바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 장단의 반복(long terminal repeat)에 포함된 프로모터(Yamamoto, et al., Cell 22:787-797, 1980), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1981), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., Nature 296:39-42, 1982); b-락타메이스 프로모터와 같은 원핵성 발현 벡터(Villa-Komaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731, 1978), 또는 tac 프로모터(DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, 1983); 또한 "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242:74-94, 1980 참조; 이스트 또는 Gal 4 프로모터와 같은 다른 곰팡이로부터의 프로모터 원소, ADC(알콜 탈수소효소) 프로모터, PGK(포스포그리세롤 키나제) 프로모터, 알칼린 포스포테이스 프로모터; 및 조혈 조직 특이성을 나타내는 전사 제어 영역, 특히: 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al., Nature 315:338-340, 1985; Kollias et al., Cell 46:89-94, 1986), 조혈근세포 분화 인자 프로모터, 에리스로포이에틴 수용체 프로모터(Maouche et al., Blood, 15:2557, 1991) 등을 포함한다.

실제로, OSCAR 유전자 산물의 발현이 필요한 세포, 또는 조직에 도입할 수 있는 재조합 핵산 구조를 제조하기 위해 임의의 형태의 플라스미드, 코스미드, YAC또는 바이러스의 벡터를 사용할 수 있다. 선택적으로, 특정한 형태의 세포 또는 조직에서 재조합 OSCAR 유전자 산물의 발현이 필요한 경우, 선택적으로 원하는 세포 형태 또는 조직 형태를 감염시키는 바이러스의 벡터를 사용할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 내에서 내생적 OSCAR 유전자의 발현을 제어하기 위한 비-내생 프로모터를 사용하여 OSCAR 폴리펩티드를 발현하는 방법을 제공한다. 세포 내의 내생적 OSCAR 유전자는 이러한 세포의 지놈에서 일반적으로(즉, 자연적으로) 발견되는 본 발명의 OSCAR 유전자이다. 그러나, 비-내생 프로모터는, 유전자의 발현을 제어하는 데 사용될 수 있지만 일반적으로 또는 자연적으로 내생 OSCAR 유전자와 관련되지 않는 프로모터 또는 다른 뉴클레오티드가다. 예로써, 내생적 OSCAR 유전자 부근에 있는 증폭가능한 유전자 또는 조절 서열을 삽입하기 위해 상동 재조합의 방법을 사용할 수 있다(바람직하게 본 발명의 OSCAR 핵산 서열을 암호화는 비-단백질 사용). 그리고 나서, 삽입된 서열은, 예를 들어, 상기 세포에서 정상적으로 발생하는 것보다 높은 수준의 OSCAR 유전자 발현을 제공하는 데에, 또는 정상 수준의 OSCAR 유전자 발현을 방지하는 내생 OSCAR 조절 서열에서(예를 들어, 파골세포에서)의 하나 이상의 돌연변이를 극복하는 데에 사용될 수 있다. 상동 재조합의 이러한 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 1991년 5월 16일 자로 공개된 국제 특허 출원 WO 91/06666호(Skoultchi); 1991년 6월 11일 자로 공개된 국제 특허 출원 WO 91/099555호(Chappel); 및 1990년 11월 29일 자로 공개된 국제 특허 출원 WO 90/14092호(Kucherlapti 및 CAmpbell)을 참조한다.

상기한 바와 같이. 예를 들어, 세제로 처리하고, 필요한 경우 초음파처리하거나 다른 기계적 공정을 수행하는 것처럼, 배양액을 수집하거나, 함유체를 용해시켜 단백질의 가용성 형태를 얻을 수 있다. 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(PAGE), 등전 초점화, 2차원적 겔 전기이동, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 면역친화성, 및 정량 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 미분 용해도, 면역침강, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 사용하여 용해되거나 가용성 단백질을 분리해낼 수 있다.

발현 벡터

본 발명의 DNA 서열을 발현하는 데에는 매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합물을 사용할 수 있다. 유용한 발현 벡터는 예를 들어, 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열의 단편으로 구성될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어, 대장균 플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pGEX(Smith et al., Gene 67:31-40, 1988), pMB9 및 이의 유도체, RP4와 같은 플라스미드와 같은 SV40의 유도체 및 공지된 박테리아성 플라스미드; 예를 들어, 파지 1의 수많은 유도체, NM989, 및 다른 파지 DNA, M13 및 필라멘트성 단일 가닥 파지 DNA와 같은 파지 DNA; 2m 플라스미드와 같은 이스트 플라스미드 또는 이의 유도체; 곤충 또는 포유류의 세포에 유용한 벡터와 같이, 진핵 세포에 유용한 벡터; 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열을 사용하도록 변형된 플라스미드와 같이, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터 등을 포함한다.

바람직한 벡터는, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 바이러스의 벡터 및 바람직한 세포의 친화성을 가진 다른 재조합 바이러스이다. 따라서, 바이러스의 벡터를 사용하여 또는 DNA의 직접적 도입을 통해, 기능적 또는 돌연변이체 OSCAR 단백질 또는 이의 폴리펩티드 도메인 단편을 암호화는 유전자를 생체 내, 생체 외에서 도입할 수 있다. 바이러스의 벡터 또는 수용체 리간드를 사용하는 것처럼 이식유전자의 벡터를 특이적 세포에 표적화함으로써, 또는 조직-특이적 프로모터, 또는 둘 다를 사용함으로써, 표적화된 조직에서의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 표적화된 유전자 운반은 1995년 10월에 공개된 국제 특허 출원 WO 95/28494에 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 예를 들어, OSCAR-특이적 항체(즉, OSCAR 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체)를 사용하거나 OSCAR-특이적 리간드와 같은 OSCAR 결합 파트너를 사용하여 벡터를 파골세포에 특이적으로 표적화할 수 있다. 또한, OSCAR 결합 상태의 단편(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 단편), 특히 OSCAR 결합 서열을 포함하여 이루어지는 단편을 사용하여 벡터를 파골세포에 특이적으로 표적화할 수 있다. 이러한 방법은, 이에 제한되지는 않으나, OSCAR 안티센스 핵산 또는 OSCAR 특이적 리보자임을 발현하는 벡터를 포함하여, 임의의 유전자를 발현하는 벡터를 파골세포에 표적화하는 데 사용될 수 있다.

유사하게, 본 발명은 또한 표적화체와 같은 OSCAR 폴리펩티드를 사용하여, 파골세포 및 태아의 섬유아세포, 또한 세포 표면 상에 OSCAR 특이적 리간드 또는 OSCAR 결합 파트너를 발현하는 다른 세포(NIH 3T3, ST2, Mlg, UMR106, HEK293,HEK293T, hfOB1.19, 및 COS-1 세포와 같은)를 특이적으로 표적화할 수 있게 한다.

생체 내 또는 생체 외에서 표적화 및 치료법 과정에 흔히 사용되는 바이러스의 벡터는 DNA-계 벡터 및 레트로바이러스의 벡터이다. 바이러스의 벡터를 구성 및 사용하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Miller and Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992). 바람직하게, 바이러스의 벡터는 복제 결함이 있으며, 즉, 표적 세포에서 자발적으로 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 복제 결함성 바이러스의 벡터의 지놈에는 감염된 세포에 바이러스의 복제에 필요한 하나 이상의 영역이 결여되어 있다. 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 이러한 영역을 제거하거나(전체적으로 또는 부분적으로) 또는 비-기능적으로 만들 수 있다. 이러한 기술에는 전체적 제거, 치환(다른 서열에 의한, 특히 삽입된 핵산에 의한), 필수적(복제를 위해) 영역에 대한 하나 이상의 염기의 결실 또는 첨가가 포함된다. 유전학적 조작을 사용하거나 돌연변이 약제로 처리하여, 생체 내에서(분리된 DNA 상에서), 또는 그 자리에서 이러한 기술을 수행할 수 있다. 바람직하게, 복제 결함 바이러스는 바이러스의 입자를 단백질막으로 둘러싸는 데 필요한 이의 지놈의 서열을 보유한다.

DNA 바이러스의 벡터는 이에 제한되지는 않으나, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 유듀종 바이러스, 엡스타인바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 등과 같이, 감독되거나 결함이 있는 DNA 바이러스를 포함한다. 전체적 또는 거의 전체적으로 바이러스의 유전자가 결여되어 있는 결함성 바이러스가 바람직하다. 결함성 바이러스는 세포 내로 도입된 후에 감염성이 없다. 결합성바이러스를 사용하면, 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 염려를 하지 않고, 특이적, 국소 지역에 있는 세포에 투입하는 것이 가능하다. 따라서, 특이적 조직을 특이적으로 표적화할 수 있다. 특별한 벡터의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 결함성 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터(Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330, 1991), 글리코-단백질 L 유전자가 결여된 결함성 헤르페스 바이러스 벡터(특허 출원 RD 371005 A), 또는 다른 결합성 헤르페스 바이러스 벡터(1994, 9월 29일 자로 공개된 국제 특허 출원 WO 94/21807; 1994년 4월 2일 자로 공개된 국제 특허 출원 WO 92/05263); 문헌{Stratford-Perricaudet et al.(J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992); 또한 La Salle et al., Science 259:988-990, 1993 참조}; 및 결함성 아데노-관련 바이러스 벡터(Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988)가 포함된다.

이에 제한되는 것은 아니나, Avigen, Inc.(Alameda, CA; AAV 벡터), Cell Genesys(Foster City, CA; 레트로바이러스의, 아데노바이러스의, AAV 벡터, 및 렌티바이러스의 벡터), Clontech(레트로바이러스 및 배큘로바이러스의 벡터), Genovo, Inc.(Sharon Hill, PA; 아데노바이러스 및 AAV 벡터), Genvec(아데노바이러스의 벡터), IntroGene(Leiden, Netherland; 아데노바이러스의 벡터), Molecular Medicine(레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 및 헤르페스 바이러스의 벡터), Norgen(아데노바이러스의 벡터), Oxford BioMedica(Oxford, United Kingdom; 렌티바이러스의 벡터), 및 Transgene(Strasbourg, France; 아데노바이러스, 백시니아,레트로바이러스, 및 렌티바이러스의 벡터)를 포함한 다양한 회사들이 바이러스의 벡터를 상업적으로 생산한다.

다른 실시형태에서, 원형(naked) DNA와 같이 리포펙션(lipofection)하거나, 다른 트랜스펙션 촉진제(펩티드, 폴리머 등)를 사용하여 벡터를 생체 내로 도입할 수 있다. 마커를 암호화하는 유전자의 생체 내 트랜스펙션을 위한 리포좀을 제조하기 위해 합성 양이온성(cationic) 지질을 사용할 수 있다(Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417, 1987; Felgner and Ringold, Science 337:387-388, 1989; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031, 1988; Ulmer et al., Science 259:1745-1748, 1993 참조). 핵산의 운반에 유용한 지질 화합물 및 조성물은 국제 특허 출원 WO 95/18863 및 WO 96/17823, 및 미국 특허 제 5,459,127호에 기재되어 있다. 표적화할 목적으로, 지질을 다른 분자에 화학적으로 결합시킬 수 있다(상기의 Mackey, et. al.). 예를 들어, 호르몬 또는 신경전달물질과 같은 표적화된 펩티드, 및 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩티드 분자를 리포좀에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 다른 분자는 양이온성 올리고펩티드(예를 들어, 국제 특허 출원 WO 95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유도된 펩티드(예를 들어, 국제 특허 출원 WO 96/25508), 또는 양이온성 폴리머(예를 들어, 국제 특허 출원 WO 95/21931)과 같은 핵산 분자의 생체 내 트랜스펙션을 촉진하는 데 유용하다.

또한 생체 내에서 벡터를 원형 DNA 플라스미드로 도입할 수 있다. 유전자 요법의 원형 DNA 벡터는, 예를 들어, 전기충격법, 현미주사, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 유전자 총(gene gun)의 사용, 또는 DNA 벡터 운송물질의 사용과 같이, 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다(예를 들어, Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988; Hartmut et al., 1990년 3월 15일에 출원된 캐나다 특허 출원 제 2,012,311호; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991 참조). 또한 수용체-매개 DNA 운반 접근법이 사용될 수 있다(Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987). 미국 특허 제 5,580,859호 및 제 5,589,466호는 포유류에 트랜스펙션 촉진제가 없는 외인성 DNA 서열의 운반을 개시한다. 최근, 전기운반이라 부르는, 상대적으로 낮은 전압, 높은 효율성의 생체 내 DNA 운반 기술이 기재되어 왔다(Mir et al., C.P. Acad. Sci., 321:893, 1998; WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).

바람직하게, 바이러스의 벡터 및 트랜스펙션된 세포의 면역-탈활성화를 방지하기 위해, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스의 벡터와 함께 적절한 면역억제 처리를 생체 내 투여에 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스의 벡터에 대한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 차단하기 위해 인터류킨-12(IL-12), 인터페론-g(IFN-γ), 또는 항-CD4 항체와 같은 면역억제 사이토킨을 투여할 수 있다(예를 들어, Wilson, Nature Medicine, 1995 참조). 이 점에 있어서, 최소수의 항원을 발현하도록 조작된 바이러스의 벡터를 사용하는 것이 유리하다.

OSCAR에 대한 항체

OSCAR에 대한 항체, 특히 진단학 및 OSCAR 활성의 세포내 조절에 유용한 OSCAR에 대한 항체는 하기에 기재한 바와 같다. 본 발명에 따르면, 융합 단백질을 포함하여, 재조합 또는 화학적 합성에 의해 제조된 OSCAR 폴리펩티드, 및 이의 단편 또는 다른 유도체 또는 유사체는 OSCAR 폴리펩티드를 인식하는 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 항체에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리클로날, 모노클로날, 키메릭, 단일 사슬, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리가 포함된다. 이러한 항체는 인간의 OSCAR 또는 마우스의 OSCAR에 대해 특이적(즉, 특이적으로 결합하는) 것이 바람직하다. 그러나, 선택적으로 항체는 유기체의 일부 다른 종, 바람직하게는 포유류 종으로부터의 OSCAR 오르소체에 대해 특이적일 수 있다. 항체는 OSCAR의 돌연변이체 형태, 또는 야생-형태 OSCAR, 또는 양자를 인식할 수 있다.

OSCAR 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 유사체에 대한 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 본 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 항체의 제조를 위해, OSCAR 폴리펩티드, 또는 이의 유도체(예를 들어, 단편 또는 융합 단백질)를 주입하여, 이에 제한되는 것은 아니나, 래빗, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하여 다양한 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 일 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드 또는 이의 단편을 예를 들어, 소혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)와 같은 면역원성 캐리어에 접합시킬 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 프로인트 (완전 또는 불완전), 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질. 플루로닉(pluronic) 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG(칼메트-게란 우형결핵균) 및 코리네박테리움 파르붐과 같이 잠재적으로 유용한 인간 인핸서를 포함하는 다양한 인핸서를 사용할 수 있다.

OSCAR 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 유사체, 또는 유도체를 향해 지시된 모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주에 의핸 항체 분자의 제조를 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 이는, 이에 제한되는 것은 아니나, Kohler 및 Milstein(Nature 1975, 256:495-497)에 의해 최초로 개발된 하이브리도마 기술, 또한 트리오마 기술, 인간의 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunology Today 1983, 4:72; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983, 80:2026-2030), 및 인간의 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96)을 포함한다. 본 발명의 부가적 실시형태에서, 모노클로날 항체는 무균 동물에서 제조될 수 있다(국제 특허 출원 WO 89/12690). 사실상, 본 발명에 따르면, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자와 함께 OSCAR 폴리펩티드에 특이적인 마우스 항체 분자로부터 스플라이싱하여 "키메릭 항체"를 제조하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., J. Bacteriol. 1984, 159:870; Neuberger et al., Nature 1984, 312:604-608; Takeda et al., Nature 1985, 314:452-454)을 사용할 수 있다; 이러한 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 인간의 또는 인간화된 항체는 이종개체 항체보다 그 자체로 훨씬 더 쉽게 면역 반응, 특히 알러지 반응을 유도하기 때문에, 이러한 인간의 또는 인간화된 키메릭 항체를 인간의 질병 또는 장애(하기에 기재됨)의 치료요법에 사용하는 것이 바람직하다.

항체 분자의 유전자형을 포함하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은, 이에 제한되는 것은 아니나, 항체 분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')₂단편; F(ab')₂단편의 디술파이드 브릿지를 감소시켜 생성될 수 있는 Fab 단편, 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다.

본 발명에 따르면, OSCAR 폴리펩티드-특이적 단일 사슬 항체를 제조하기 위해 단일 사슬 항체의 제조에 대해 기재된 기술(미국 특허 제 5,476,786호, 제 5,132,405호, 및 제 4,946,778호)을 채택할 수 있다. 본 발명의 부가적 실시형태는, OSCAR 폴리펩티드, 또는 이의 유도체, 또는 유사체에 대해 바람직한 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 위해 Fab 발현 라이브러리의 구성에 대해 기재된 기술(Huse et al., Science 1989, 246:1275-1281)을 사용한다.

항체의 제조 및 사용에 있어서, 예를 들어, 방사선면역분석법, ELSA(효소-결합 면역흡수 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사선측정 분석법, 그 자리에서의 면역분석법(예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석법(예를 들어, 겔 응집 분석법, 혈액응집 분석법), 보체 고정 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법, 및 면역전기이동 분석법 등과 같이 본 기술 분야에 공지된 기술에 의해 바람직한 항체에 대한 스크리닝 또는 바람직한 항체를 사용한 시험을 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 일차적 항체에 대한 표지를 검출함으로써 항체 결합을 검출할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이차적 항체 또는 일차적 항체에 대한 약제의 결합을 검출함으로써 일차적 항체를 검출할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 이차적 항체를 표지화한다. 면역분석법에서 결합을 검출하기 위한 본 기술 분야에 공지된 수많은 방법이 공지되어 있으며 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, OSCAR 폴리펩티드의 특이적 에피토프를 인식하는 항체를 선택하기 위해 이러한 에피토프를 포함하는 OSCAR 폴리펩티드 단편에 결합하는 산물에 대해 생성된 하이브리도마를 분석할 수 있다. 특정 종의 동물로부터의 OSCAR 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체의 선택을 위해, 그러한 종의 동물의 세포에 의해 발현되거나 이로부터 분리된 OSCAR 폴리펩티드와의 양성(positive) 결합에 기초하여 선택할 수 있다.

상기 항체를 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 본래 위치에서의 OSCAR 폴리펩티드 상표현(imaging), 적절한 생리학적 시료에서의 이의 수준 측정 등과 같이, OSCAR 폴리펩티드의 국소화 및 활성에 관한 기술에 공지된 방법에 사용할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 미국 특허 제 5,679,582호에 기재된 바와 같은 리간드 결합에 대한 분석법에 사용될 수 있다. 항체 결합은 일반적으로 예를 들어, pH 약 7 내지 8의 생리학적 조건 하에서, 생리학적 이온 강도 하에서 가장 쉽게 발생한다. 완충 용액 중에 캐리어 단백질이 존재하면 분석법이 안정화된다. 예를 들어, 이온 강도의 증가 또는 감소, 온도, 또는 pH, 또는 세제 또는 무질서유발성(chaotropic) 염과 같이, 최적 조건의 혼란에 대한 어떠한 내성이 존재하면, 이러한 혼란은 결합 안정성을 감소시킨다.

또다른 실시형태에서, 항-OSCAR 항체는 또한 면역흡수 기술을 패닝하거나 관련시킴으로써 예를 들어, 파골세포와 같이 OSCAR 폴리펩티드를 발현하는 세포를 분리해내는 데 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, OSCAR 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나(agonize) 길항화하는(antagonize) 항체가 생성될 수 있다. 특히, OSCAR 활성을 제어(저해)하기 위해 세포내 단일 사슬 Fv 항체를 사용할 수 있다(Maraso et al.., Proc. Natl. et al., Anticancer Res. 1996, 16:3415-22; Indolfi et al., Nat. Med. 1996. 2:634-635; Kijma et al., Pharmacol. Ther. 1995, 68:247-267). 리간드를 확인하기 위해, 상기한 분석법을 사용하여 이러한 항체를 시험할 수 있다.

또한 상기 스크리닝 분석에 대한 부분에서 논의한 바와 같이, 면역 독소를 생산하기 위해 항체를 사용할 수 있다.

이식유전자 동물을 새용한 생체 내 시험

OSCAR의 분자 메카니즘, 및 특히 인간의 OSCAR-유도 신호화를 평가하기 위해 이식유전자 포유류를 제조할 수 있다. 이러한 포유류는 약물 후보를 스크리닝 또는 시험하기 위한 훌륭한 모델을 제공한다. 따라서, 이러한 시스템의 분자 생물학을 인간의 주제로 가능한 것보다 상세히 평가하기 위해 인간의 OSCAR "녹인(knock-in)" 포유류를 제조할 수 있다. 또한 예를 들어, OSCAR 활성에 있어서의 결함을 보충할 수 있는 화합물을 확인하는 것과 같이, "녹아웃(knockout)" 동물에 대한 화합물 또는 질병을 평가할 수 있다. 두 가지 기술 모두 세포 지놈에서의 이의 자연 위치에 있는 유전학적 정보의 단일 유닛의 조작을 가능하게 하며 말단 분화된 유기체를 배경으로 하는 조작의 결과를 검사할 수 있게 한다. 이식 유전자 포유류는 이에 제한되지는 않으나, 태아근세포(ES)의 변형 및 헤테로핵의 아세포 내로의 주입을 포함하는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.

"녹인" 포유류는 내생 유전자가 이종유전자로 치환되는 포유류이다(Romer et al., New Biol. 1991, 3:331). 바람직하게, 이종유전자는 이종유전자의 발현의 평가(유전자가 리포터 유전자가 될 수 있는 경우; Elegant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:11897 참조)의 흥미로운 문제 또는 기능인 유전자 좌(locus)에 "녹인"되며, 그로 인해, 이종유전자 발현을 적절한 프로모터로부터의 전사에 결합시킨다. 이는 돌연변이체 재조합 부위(Araki et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:868) 또는 PCR(Zhang and Henderson, Biotechniques 1998, 25:784)을 사용하여 상동성 재조합, 트랜스포슨(Westphal and Leder, Curr Biol 1997, 7:530)에 의해 성취될 수 있다.

"녹아웃 포유류"는 이의 유전자 내에 유전자 표적화의 방법에 의해 불활성화된 특이적 유전자를 포함하는 포유류(예를 들어, 마우스)이다(예를 들어, 미국 특허 제 5,777,195 및 5,616,491호 참조). 녹아웃 포유류는 이질접합체 녹아웃(즉, 하나의 결함성 대립형질 및 하나의 야생-형 대립형질) 및 동질접합성 돌연변이체 양자를 포함한다. 녹아웃 포유류의 제조는 처음에 태아근세포라 불리우는 미분화된 세포 형태 내의 특정 유전자의 발현을 억제하는 데 사용될 핵산 구조를 도입할 것이 요구된다. 그리고 나서 이 세포를 포유류의 태아 내로 주입한다. 그리고 나서 잉태하는 동안 통합된 세포를 갖는 포유류의 태아를 배양 모체 내로 이식한다.Zhou, et al. (Genes and Devrlopment, 1995, 9:2623-34)는 PPCA 녹아웃 마우스를 기재한다.

"녹아웃"이라는 용어는, 최소한 세포 내의 내생 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질의 부분의 발현을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 것을 말한다. "녹아웃 구조"라는 용어는 세포 내의 내생 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질의 발현을 감소시키거나 억제하도록 디자인된 핵산 서열을 말한다. 녹아웃 구조로 사용된 핵산 서열은 전형적으로 (1) 억제될 유전자의 일부분으로부터의 DNA(엑손 서열, 인트론 서열, 및/또는 프로모터 서열) (2) 세포 내의 녹아웃 구조의 존재를 검출하는 데 사용된 마커 서열로 구성된다. 녹아웃 구조는 세포 내로 삽입되고, 원형 DNA 서열의 전사를 예방하거나 방해하도록 하는 위치에 있는 세포의 지놈의 DNA와 통합된다. 이러한 삽입은 대개 상동 재조합(즉, 녹아웃 구조가 세포 내로 삽입되고 녹아웃 구조가 내생 DNA의 대응하는 위치 내로 병합되도록 내생 DNA 서열에 대해 상동적인 녹아웃 구조의 영역이 서로 하이브리디제이션한다). 녹아웃 구조 핵산 서열은 1) 억제될 유전자의 하나 이상의 엑손 및/또는 인트론의 완전 또는 부분적 서열, 2) 억제될 유전자의 완전 또는 부분적 프로모터, 또는 3) 이의 조합을 포함하여 이루어질 수 있다. 일반적으로, 녹아웃 구조는 대개 상동 재조합의 방법에 의해, 태아근세포(ES 세포) 내로 삽입되고 ES 세포 지놈의 DNA 내로 통합된다. 그리고 나서 이러한 ES 세포는 태아 내로 주입되고 이와 통합되어, 태아를 발생시킨다.

"유전자의 분열" 및 "유전자 분열"이라는 어구는, 유전자의 야생-형 또는 자연 발생 서열과 비교하여 세포 내에서의 이러한 유전자의 발현을 감소시키거나 예방하기 위해 원형 DNA 서열(대개 하나 이상의 엑손)의 영역 및/또는 유전자의 프로모터 영역 내로 핵산을 삽입하는 것을 말한다. 예로써, 분열될 DNA 서열(프로모터 및/또는 코딩 영역)에 상보적인 DNA 서열 내로 삽입되는 항생 내성 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 구조를 제조할 수 있다. 그리고 나서 이 핵산 구조를 세포 내로 트랜스펙션할 경우, 상기 구조는 지놈의 DNA 내로 통합될 것이다. 따라서, 이제 항 내성 유전자에 의해 DNA가 분열되기 때문에, 세포의 수많은 자손은 최소한 세포 내에서 더 이상 유전자를 발현하지 않거나, 감소된 수준으로 발현할 것이다.

일반적으로, 상동 재조합을 위해, DNA는 약 1 킬로베이스(kb) 이상 및 바람직하게 3-4kb의 길이가 되어, 녹아웃 구조가 ES 세포의 지놈의 DNA 내로 삽입될 겨우 재조합에 대해 충분한 상보적 서열을 제공할 것이다(하기에 논의됨).

둘 이상의 유전자가 녹아웃되거나 녹인된, 또는 둘 다인 포유류는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 각각의 녹아웃 구조에 대해 본 명세서에서 설명한 방법을 반복하거나, 서로에 대해 녹아웃된 단일 유전자를 갖는 각각의 포유류로 번식시키고 이중 녹아웃 유전자형을 갖는 것에 대해 스크리닝함으로써, 이러한 포유류를 생성할 수 있다.

테트-억제제(tet-repressor; 미국 특허 제 5,654,168호 참조) 또는 Cre-Lox 시스템(미국 특허 제 4,959,317호 및 제 5,801,030호 참조) 시스템과 같은 다양한 시스템을 사용하여, 제어된 녹아웃 동물을 제조할 수 있다.

다른 일련의 실시형태에서, (i) 인간 OSCAR가 이식 유전자 동물의 지놈 내로안정하게 삽입되거나; 및/또는 (ii) 내생 OSCAR 유전자가 이의 인간 대응물로 불활성화 및 대체되는 이식유전자 동물을 생성한다(예를 들어, Coffman, Semin. Nephrol. 1997, 17:404; Esther et al., Lab. Invest. 1996, 74:953; Murakami et al., Blood Press. Suppl. 1996, 2:36). 이러한 동물을 후보 화합물로 처리하고 신경 발달, 신경퇴화, 또는 후보 치료용 화합물의 효능에 대해 감시한다.

적용분야 및 용도

여기에서는 OSCAR 유전자 서열(전장 OSCAR 유전자 서열의 단편을 포함하는), OSCAR 폴리펩티드(전장 OSCAR 단백질 및 OSCAR 융합 폴리펩티드의 단편을 포함하는) 및 OSCAR 핵산 및 OSCAR 폴리펩티드에 대해 지시된 항체(전장 OSCAR 유전자 및 단백질의 단편을 포함하는)에 대한 다양한 적용분야 및 용도를 기재한다. 이러한 적용분야는 이러한 장애를 갖거나 이러한 질병에 대한 소질을 갖는 대상의 확인을 포함하여, 예를 들어, OSCAR 유전자, 및 OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR 폴리펩티드와 관련된 골성장 관련 장애를 평가하기 위한 예후 및 진단학 적용분야 양자를 포함한다. 또한, 이러한 적용분야는 OSCAR 유전자, OSCAR 유전자 산물, OSCAR 폴리펩티드 또는 이의 조합을 조절하는 화합물(천연 리간드 및 다른 세포의 화합물)을 확인하는 스크리닝 방법 뿐만 아니라, OSCAR 유전자, OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR 폴리펩티드와 관련된 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다.

하기의 실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 OSCAR 유전자, 유전자 산물 및 폴리펩티드는 파골세포의 성숙을 조절하는 이의 능력, 및 결과적으로, 골 조직의 성장, 회복, 발달, 재흡수, 강등 및 항상성을 조절하는 능력에 의해 특징화될수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 이러한 OSCAR 핵산 및 폴리펩티드에 대해 지시된 항체 뿐만 아니라, 본 발명의 OSCAR 핵산 및 폴리펩티드는 골 성장 장애를 갖거나 골 성장 장애에 대한 소질을 갖는 개체를 확인하기 위한 예후적 및 진단학적 적용분야에서; 골 성장 관련 장애를 치료하는 방법에서; 및 파골세포의 성숙을 조적하는 화합물(합성된 화학적 화합물 뿐만 아니라 천연 리간드 및 다른 세포의 화합물을 포함하는), 및 골의 성장, 회복 발달, 재흡수, 강등 또는 항상성을 조절하는 화합물(합성된 화학적 화합물 뿐만 아니라 천연 리간드 및 다른 세포의 화합물을 포함하는)을 확인하기 위한 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다.

진단적 적용

골화석증과 골다공증과 같은 골성장관련질환의 진단 및 예후 평가를 위하여, 및 그러한 질환에 대한 소인을 가지는 환자의 확인을 위하여 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 상기 기재된 OSCAR 핵산과 폴리펩티드와 같은 시약(그 단편, 키메라 및 융합물을 포함한다)과, 이들 폴리펩티드에 대한 항체를 이용한다. 예를 들면, 그러한 시약은 (1) 세포 내에서 OSCAR 유전자의 복제 또는 결실의 검출, OSCAR 유전자 돌연변이의 존재, 또는 영향을 받지 않은 상태에서의 발현에 비해 OSCAR 유전자 산물(예를 들면 OSCAR mRNA)의 과발현 또는 미발현의 검출(즉, 골성장관련질환을 가지지 않거나 가지기 쉬운 환자에서); (2) 영향을 받지 않은 상태에서의 풍부함에 비해 OSCAR 유전자 산물의 과풍부 또는 미풍부의 검출; 및 (3) 영향을 받지 않은 상태에 비해 비정상적인 OSCAR 유전자 산물 활성의 검출을 위해 특이적으로 사용될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 그러한 시약은 골화석증 또는 골다공증과 같은 골성장관련질환을 진단하거나, 골성장관련질환을 발현시키는 환자의 소인을 평가하는데 사용될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 미리 패키지된 진단키트를 사용하여 행해질 수 있다. 그러한 키트는 본 발명의 하나 이상의 특이적 OSCAR 핵산 또는 OSCAR 특이적 항체시약을 포함할 수 있다. 키트와 그 속에 함유된 임의의 시약(들)은 골성장관련질환(예를 들면, 골화석증 또는 골다공증)과 같은 비정상성을 나타내는 환자를 진단하기 위하여, 예를 들면 임상환경에서 사용될 수 있다.

개인으로부터 (임의의 세포형태의) 핵으로 된 세포를 포함하는 시료는 게놈 핵산에 대한 출발원으로서 그러한 진단방법에서 및 OSCAR 유전자의 돌연변이를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. OSCAR 유전자가 발현되는 임의의 세포형태의 세포 또는 임의의 조직형태의 조직을 포함하는 시료는 예를 들면, OSCAR 유전자 또는 OSCAR 유전자 산물을 발현하는 세포, 특히 파골세포를 확인하는데 뿐 아니라 OSCAR 유전자 발현 또는 (OSCAR 단백질과 같은) OSCAR 유전자산물을 검출하기 위한 그런한 진단방법에서 사용될 수도 있다. 예를 들면 바람직한 실시형태에서, 세포에 의해 OSCAR 유전자 또는 OSCAR 유전자 산물이 발현되는 것은 그 세포가 파골세포라는 것을 나타낸다.

OSCAR 핵산의 검출.시료 중의 OSCAR 돌연변이를 검출하거나 OSCAR 핵산서열의 수준을 평가하기 위하여, 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, OSCAR 유전자 내의 돌연변이는 당해 기술분야에서 공지된 많은 기술을 이용하고 임의의 핵으로 된 세포로부터 유래된 핵산으로 검출할 수 있다. 핵산은 당업자에게 이미 공지된 표준핵산제조방법에 따라 분리될 수 있다.

OSCAR 핵산서열은 그러한 생물학적 시료의 하이브리디제이션 또는 증폭분석에서 OSCAR 유전자 구조를 포함하는 비정상성을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 방법에서 검출될 수 있는 예시적인 비정상성에는 점돌연변이, 단일뉴클레오티드다형성(SNPs), 삽입, 결실, 역위, 전좌 및 염색체 재배열이 포함된다. 이들 비정상성을 검출하는데 사용될 수 있는 예시적인 분석법에는 서던 분석, 형광 그자리 하이브리디제이션(FISH), 단일가닥 구조 다형성 분석(SCCP) 및 중합효소연쇄반응(PCR) 분석이 포함된다.

OSCAR 유전자-특이적 돌연변이를 검출하기 위한 진단방법은 시료로부터 얻어진 핵산(재조합 DNA 분자, 클로닝된 유전자, 또는 이의 축퇴 변형체를 포함)을 재조합 OSCAR DNA 분자, 클로닝된 유전자 또는 이의 축퇴변형체와 같은 하나 이상의 표지된 핵산시약과, 이들 시약이 시료 핵산 중의 이의 상보적 서열에 특이적으로 어닐링하거나 하이브리디제이션하기에 바람직한 조건하에서, 접촉시키고 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 핵산 시약의 길이는 적어도 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 배양 후, 모든 어닐링되지 않거나 하이브리디제이션되지 않은 핵산을 제거한다. 그 다음에 임의의 그러한 분자가 존재한다면, 하이브리디제이션한 ㅂ핵산의 존재를 검출하고, 핵산시약이 어닐링된 OSCAR 유전자 서열을 OSCAR 유전자 돌연변이가 존재하는지 여불르 확인하기 위하여 정상적인(즉, 와일드-타입) OSCAR 유전자 서열로부터 예측된 어닐링패턴과 비교할 수 있다.

그러한 검출방법의 바람직한 실시형태에서, 관심있는 세포형태 또는 조직으로부터의 핵산을 예를 들면, 막 또는 플라스틱표면(예를 들면 미세역가 플레이트 상 또는 폴리스티렌 비드 상)과 같은 고체지지체에 고정화시킬 수 있다. 배양 후, 어닐링되지 않은, 표지된 OSCAR 핵산 시약을 쉽게 제거할 수 있고, 당해 기술분야에서 공지된 표준기술을 사용하여 남은 어닐링링되고 표지된 OSCAR 핵산시약을 검출할 수 있다.

환자 시료에서 또는 다른 세포공급원에서 OSCAR 유전자 특이적 핵산을 검출하기 위한 다른 진단방법에는 PCR(예를 들면, 미국특허 제4,683,202호에 개시된 실험적 실시형태를 참조)에 의해 이를 증폭한 후 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 증폭된 분자를 검출하는 방법이 포함될 수 있다. 생성된 증폭된 서열은 증폭된 핵산이 OSCAR 유전자의 정상적인 사본만을 포함한다면 예상되는 서열과 비교하여 OSCAR 돌연변이가 시료 중에 존재하는지 여부를 확인할 수 있다.

다른 공지된 유전자형확인 기술도 OSCAR 돌연변이를 가진 개인을 확인하는데 사용될 수 있다. 그러한 기술에는 예를 들면, 제한단편길이다형성(RFLPs)를 사용하는 것이 포함된다. DNA 다형성을 분석하는 다른 방법이 OSCAR 돌연변이가 제한효소부위들 사이에 다양한 수의 짧은 세로 반복 DNA 서열의 존재를 이용하는지 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,075,217호는 짧은 세로 반복의 블럭 내의 길이 다형성에 기초한 DNA 표지를 기재하고 있다. 그러한 블럭의 평균 분리는 30 내지 70kb인 것으로 추정된다. 그렇게 밀접하게 이격된 표지들은 높은 빈도의 공동-유전적 성질을 나타내고, 예를 들면 OSCAR 유전자 내의 돌연변이를 포함하는 유전적 돌연변이의 확인에서 및 예를 들면 OSCAR 유전자 내의 유전적 돌연변이와 관련된 질병과 질환을 진단하는데 매우 유용하다.

본 발명의 진단 및 예후방법에는 OSCAR 유전자 발현의 수준을 분석하는 방법도 포함된다. 예를 들면, OSCAR 유전자를 발현하는 것으로 생각되거나 발현하는 것으로 알려진 파골세포와 같은 세포형태 또는 조직으로부터의 RNA를 상기 기재된 바와 같은 하이브리디제이션이나 PCR 기술을 이용하여 분리하여 시험할 수 있다. 세포배양물로부터 얻은 세포의 분석은 예를 들면 OSCAR 유전자의 발현에 대한 화합물들의 효과를 시험하거나, 선택적으로 세포가 OSCAR 유전자를 발현하는 특정 세포형태 중 하나라는 것을 입증하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예들은 OSCAR 유전자가 파골세포에서 특이적으로 발현된다는 것을 나타낸다. 따라서, OSCAR 유전자 발현의 수준을 분석하는 방법은 (세포배양물로부터 또는 환자와 같은 개인으로부터 유래된) 세포가 파골세포인지 여부를 확인하는데 특히 유용하다.

그러한 검출방법의 바람직한 일실시형태에서, cDNA 분자를 관심있는 RNA 분자로부터 (예를 들면, 역전사에 의해) 합성한다. 그 다음에 cDNA 내의 서열은 PCR과 같은 핵산 증폭반응을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 그러한 분석의 역전사와 증폭단계에서 합성개시제로 사용되고 된 핵산시약(예를 들면, 프라이머)은 본 명세서에 기재된 OSCAR 핵산서열로부터 선택되는 것이 바람직하고 또는 이의 단편이다. 바람직하게는 핵산시약은 길이가 적어도 약 9 내지 30 뉴클레오티드이다. 증폭은 검출을 위해, 예를 들면 방사선표지되거나 형광표지된 뉴클레오티드를 사용하여 행해질 수 있다. 선택적으로 충분히 증폭된 산물은 그 산물이 표준 에티디움 브로마이드나 다른 착색방법으로 가시화될 수 있도록 만들어질 수 있다.

본 발명의 OSCAR 유전자 발현 분석은 그 자리(즉, 고정되거나 및/또는 동결될 수 있는, 환자 조직의 조직절편 상에 직접)에서 행해져 핵산을 정제할 필요성이 없도록 할 수도 있다. OSCAR 핵산 시약은 그 자리 절차를 위한 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있다(예를 들면, Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications, 1992, Raven Press, New York 참조). 선택적으로, 충분한 양의 적합한 세포가 얻어질 수 있다면, OSCAR mRNA의 수준을 검출함으로써 OSCAR 유전자 발현의 수준을 확인하기 위해 노던 분석을 행할 수 있다.

OSCAR 유전자산물의 검출.본 발명의 진단 및 예후 방법은 OSCAR 단백질 또는 다른 OSCAR 폴리펩티드의 수준을 검출하는 단계와 기능적으로 보존된 변형체와 이의 단편을 포함하는 단계를 포함하는 것을 포함한다. 예를 들면, 손상되지 않은 와일드-타입 또는 돌연변이 OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR 유전자 산물의 기능적으로 보존된 변형체 또는 폴리펩티드 단편에 대한 항체를 골석화증과 골다공증과 같은 골성장관련질환에 대한 진단 및 예후시약으로 사용할 수 있다. 그러한 시약은 예를 들면 OSCAR 유전자 산물 합성 또는 발현의 수준에서의 비정상성을 검출하거나, 또는 OSCAR 유전자 산물의 구조, 일시적 발현 또는 물리적 위치에서의 비정상성을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 것과 같은 항체 및 면역분석법은 골석화증과 골다공증과 같은 골성장관련질환에 대한 치료의 효능을 평가하기 위한 시험관 내 적용분야에서도 중요하다. 예를 들면, 항체 또는 항체의 단편은 OSCAR 유전자 발현 및 OSCAR 폴리펩티드 생산에 대한 화합물의 효과를 확인하기 위하여 시험관 내에서 잠재적 치료화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다. OSCAR 관련 질환에 유용한 효과를 나타낼 수 있는 화합물을 확인할 수 있고 그러한 화합물에 대한 치료적 유효투여량을 그러한 분석법을 사용하여 확인할 수 있다.

시험관 내 면역분석은 OSCAR 관련 질환에 대한 세포계 유전자치료의 효능을 평가하는데도 사용할 수 있다. 예를 들면, OSCAR 폴리펩티드에 대한 항체는 OSCAR 폴리펩티드를 생산하도록 유전적으로 조작된 세포에서 얻어지는 OSCAR 유전자 또는 폴리펩티드 발현의 수준을 확인하기 위하여 시험관 내에서 사용될 수 있다. 그러한 방법은 바람직하게는 세포 용해물 또는 추출물을 사용하여 세포내 OSCAR 유전자 산물을 검출하거나, 세포 표면의 OSCAR 유전자 산물의 발현을 검출하거나, 세포배약배지 속으로 분비되는 OSCAR 유전자 산물을 검출하는데 사용될 수 있다. 그러한 평가는 유전자 대체 프로토콜의 최적화 뿐 아니라 생체 내 치료적 효능을 달성하는데 필요한 형질전환된 세포의 수를 확인하는데 사용할 수 있다.

일반적으로 그러한 방법을 사용하여 분석되는 조직 또는 세포형태에는 OSCAR 유전자 산물을 발현하는 것으로 알려진 파골세포와 같은 것이 포함될 것이다. 문헌[Harlow & Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)에 기재된 바와 같은 단백질분리법이 사용될 수 있다. 분리된 세포는 세포배양물로부터 또는 개인(예를 들면 OSCAR 관련질환을 가진 것으로 생각되거나 OSCAR 관련질환에 대한 경향을 가진 것으로 생각되는 환자)으로부터 유래된 세포일 수 있다.

한 예로서, 항체 또는 항체의 단편을 예를 들면, 광현미경, 유세포분석 또는형광측정법과 결합된 형광표지된 항체를 사용하는 면역형광기술을 사용하여, OSCAR 유전자 산물, OSCAR 유전자 산물의 변형체 또는 이의 단편의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 그러한 기술은 세포의 표면 상의 OSCAR 유전자 산물을 검출하는데 특히 바람직하다.

항체 또는 그 단편은 OSCAR 유전자 산물의 그 자리 검출을 위하여, 예를 들면 면역형광 또는 면역전자현미경기술에서 조직학적으로 사용될 수도 있다. 그자리 검출은 환자로부터 조직학적 표본(즉, 조직시료)를 제거하고 본 발명의 표지된 항체 또는 그러한 항체의 단편을 거기에 적용함으로써 행해질 수 있다. 항체 또는 항체단편은 생물학적 시료 위에 표지된 항체 또는 항체단편을 놓음으로써 적용되는 것이 바람직하다. 그러한 절차를 사용함으로써, OSCAR 유전자 산물의 존재 뿐 아니라 검사된 조직 내의 유전자산물의 분포도 검출할 수 있다. 그러한 그 자리 검출을 위하여 당해 기술분야에서 공지된 다양한 조직학적 방법(예를 들면, 착색방법)을 당업자가 과도한 실험없이 쉽게 변형시킬 수 있다.

일반적으로 OSCAR 유전자 산물에 대한 면역분석은 OSCAR 유전자 산물(예를 들면 기능적으로 보존된 변형체 또는 이의 펩티드 단편을 포함)에 특이적으로 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 항체의 존재 하에 생물학적 시료(예를 들면, 생물학적 유체, 조직추출물, 새로 수입된 세포 또는 세포 용해물)를 배양하는 단계를 포함할 것이다. 그 다음에 결합된 항체는 당해 기술분야에서 공지된 많은 방법 중 어느 것에 의해 검출될 수 있다.

스크리닝 분석법

본 명세서에서 하기된 스크리닝 분석법을 사용하여, OSCAR 유전자 산물과 상호작용하는 세포내 화합물(예를 들어, 단백질 또는 단백질의 부분), OSCAR 유전자 산물에 대한 자연 및 합성 리간드, OSCAR 유전자 산물과 다른 화합물과의 상호작용을 방해하는 화합물(예를 들어 자연 리간드 또는 세포내 화합물), 및 OSCAR 유전자의 활성 또는 OSCAR 폴리펩티드 또는 OSCAR 유전자 산물의 활성(예를 들어 생활성)을 조절하는 화합물(예를 들어 OSCAR 유전자 발현 수준을 조절함으로써)을 포함하는, OSCAR 유전자 산물에 결합하거나 이와 달리 상호작용하는 화합물을 확인하는 것도 가능하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 스크리닝 분석법은, 프로모터 또는 OSCAR 유전자의 다른 조절 서열에 결합하고 OSCAR 유전자 발현의 수준을 조절할수 있는 화합물을 확인하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, Platt, J.Biol. Chem. 1994, 269:28558-28562).

이러한 스크리닝 분석법으로 확인할 수 있는 화합물의 종류에는 소형 분자(예를 들어, 분자량 약 2kd 이하인 유기 또는 무기 분자가 분자량 약 1kd 이하보다 더 바람직하고, 및/또는 혈액-뇌 배리어를 가로지르거나 적당한 세포에 입장이 허가되어 OSCAR 유전자, OSCAR 조절 경로와 관련있는 몇가지 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다) 및 거대분자(예를 들어 분자량 약 2kd 이상인 분자)가 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 이러한 스크리닝 분석법으로 확인된 화합물은 펩티드 및 폴리펩티드를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 가용성 펩티드, 순열조합(combinatorial) 라이브러리의 융합 펩티드의 성분(members)(예를 들어 문헌(Lamet al., Nature 1991, 354:82-84; 및 Houghtenet al., Nature 1991, 354:84-86)에 기재된 것); D-및/또는 L-배치 아미노산의 분자 라이브러리와 같은 순열조합 화학에서 유래한 라이브러리의 성분; 무작위 또는 일부 변성물의 성분과 같은 포스포펩티드, 지시된 포스포펩티드 라이브러리(예를 들어 Songyanget al., Cell 1993, 72:767-778); 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 항-유전인자, 키메라, 또는 단일 사슬 항체; FAb, F(ab')₂, FAb 발현 라이브러리 단편 및 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 항체 단편(이에 제한되지 않음)이 있다.

이하의 실시예에서 증명되는 바와 같이, OSCAR 유전자 산물은 파골세포의 성숙 및 활성을 조절하고, 더욱이 OSCAR 유전자 산물에 대한 리간드와 같은 화합물은 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하는 능력을 가짐으로써, 파골 세포의 성숙 및/또는 활성을 조절한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 스크리닝 분석법에서 확인되는 화합물은 파골세포의 활성을 조절하기에 유용할 수 있으며, 특히 골 조직의 성장, 치유 발달, 분해, 재흡수, 치유 또는 항상성을 조절하기에 유용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 스크리닝 방법에 의해 확인된 화합물은 또한, 예를 들어 파골세포의 활성을 조절함으로써 및/또는 골 조직의 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해, 치유 또는 항상성을 조절함으로써, 골 성장 관련 질환(예를 들어 골화석증 및 골다공증을 포함)을 치료하기에 유용할 수 있다.

결합 화합물에 대한 분석법.본 발명의 OSCAR 유전자 산물을 결합할 수 있는 화합물을 확인하기 위하여 생체외 시스템을 쉽게 디자인할 수 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어 와일드-타입 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하기 위하여, 또는 선택적으로, 돌연변이체 또는 다른 변형체 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하기 위하여 유용할 수 있다.

일반적으로, 이러한 스크리닝 분석법은, 두 화합물이 상호작용(예를 들어 결합)하기에 충분한 시간동안 조건 하에 OSCAR 유전자 산물 및 시험 화합물을 포함하여 이루어지는 반응 혼합물을 제조함으로써 검출가능한 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 분석법은 다양한 다른 방법 중 어느 것으로 실시할 수 있다. 예를 들어 일실시형태는 OSCAR 폴리펩티드 또는 시험 화합물을 고체 상에 고정하고, 반응 말기에 비결합된 화합물을 제거(에를 들어 세척)한 후 고체 상에 있는 OSCAR 폴리펩티드 및 시험 화합물의 복합체를 검출하는 것을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 이러한 방법의 바람직한 일실시형태에서, OSCAR 유전자 산물을 고체 표면 상에 고정할 수 있으며, 표지된 화합물(예를 들어 상기된 방법 중 어느 것에 따라 표지된 화합물)을 이 표면에 접촉시킨다. 복합체가 OSCAR 유전자 산물 및 시험 화합물 사이에 형성될 수 있는 충분한 조건 하에 충분한 시간동안 시험 화합물을 배양한 후, 시험 화합물의 비결합 분자를 표면에서 제거하고(예를 들어 세척), 남은 표지된 분자를 검출한다.

다른 선택적인 실시형태에서, 하나 이상의 다른 시험 화합물 분자를 고체상에 부착시키고, 표지된 OSCAR 폴리펩티드 븐자를 이에 접촉시킬 수 있다. 이러한 실시형태에서, 다른 시험 화합물의 분자는 고체상 위의 특정 위치에서 고체상에 부착되어, 고체상 또는 표면의 결합된 OSCAR 폴리펩티드의 위치를 확인함으로써 OSCAR 폴리펩티드에 결합하는 시험 화합물을 확인할 수 있는 것이 바람직하다.

OSCAR과 상호작용하는 화합물의 분석법.OSCAR 유전자 산물과 상호작용하는 단백질을 검출 및/또는 확인하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 다양한 공지된 방법 중 어느 것을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 공동-면역침강, 가교결합 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제, 및 본 기술분야에 공지된 다른 기술을 사용할 수 있다. 이러한 분석법을 사용하여 확인 가능한 단백질에는, OSCAR 특이적 리간드와 같은 세포외 단백질 및 신호 변환(transducing) 단백질과 같은 세포내 단백질이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

예를 들어(이에 제한되지 않음), 발현 클로닝 분석법을 사용하여, OSCAR 특이적 리간드 및 OSCAR 유전자 산물과 특이적으로 상호작용하는 다른 단백질을 확인할 수 있다. 이러한 분석법에서, OSCAR 특이적 리간드를 발현하는 어떤 세포주(예를 들어 조골 세포, 배 섬유아세포, NIH 세포, 3T3 세포, ST2 세포, Mlg 세포, UMR106 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, hFOB1.19 세포 및 원숭이 COS-1 세포)으로부터 cDNA 발현 라이브러리를 생성할 수 있다. 이어서, 이러한 발현 라이브러리로부터의 클론을, 정상적으로는 OSCAR 특이적 리간드를 발현시키지 않는 B 세포 림프종 주(예를 들어 CH12 세포, A20.25 세포 또는 LBB1 세포)와 같은 세포에 트랜스펙션 또는 감염시킬 수 있다. OSCAR 특이적 리간드를 암호화하는 클론으로 트랜스펙션된 세포를, FACS 와 같은 표준 기술을 사용하거나, 이에 부착된 OSCAR 폴리펩티드(예를 들어, OSCAR-Fc 융합 폴리펩티드)를 갖는 자석 비드를 사용하여, 확인 및 분리할 수 있다.

선택적으로, OSCAR 특이적 리간드를, 본 기술분야에서 주지되어 있는 면역침강법을 사용하여, 상기 인용한 OSCAR-L 발현 세포주를 포함하는 세포주로부터 분리할 수 있다.

OSCAR 결합 화합물을 확인하기 위하여 상기한 스크리닝 분석법 중 어느 것을 사용하여 OSCAR 특이적 리간드를 분리할 수도 있다. 예를 들어, OSCAR-Fc 융합 폴리펩티드를 고체 표면에 결합시키거나 이와 달리 부착시킬 수 있으며, 표지된 화합물(예를 들어 후보 OSCAR 리간드)을, OSCAR-Fc 융합 폴리펩티드 및 시험 화합물 간에 복합체 형성이 가능하도록 하는 조건하에 충분한 시간동안 표면에 접촉시킬 수 있다. 이어서, 시험 화합물의 미결합된 분자를 표면으로부터 제거(예를 들어 세척)할 수 있으며, 결합된채로 남은 표지 화합물을 검출할 수 있다.

일단 이렇게 분리되면, 표준 기술을 사용하여 이러한 분석법에서 검출된 어떤 단백질을 확인할 수 있다. 예를 들어,OSCAR 유전자 산물과 접촉하는 단백질의 아미노산 서열 중 적어도 일부를, Edman 분해 기술과 같은 본 기술분야에서 주지된 기술(예를 들어 Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., New York, 34-49면)을 사용하여 확인할 수 있다.

일단 이러한 단백질이 확인되었으면, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 생성에 대한 가이드로서 이들의 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 상기된 표준 하이브리디제이션 또는 PCR 기술을 사용하여, 이러한 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 스크리닝할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 혼합물의 생성에 대한 기술 및 스크리닝 분석법에서의 이들의 사용에 대한 설명에 대해서는, 예를 들어 문헌(Ausubel 상기됨; 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Innis et al., eds., Academic Press, Inc. New York(1990))을 참조한다.

OSCAR 폴리펩티드와 상호작용하는 단백질을 암호화하는 유전자를 동시 확인하는 다른 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 발현 라이브러리는 표지된 OSCAR 폴리펩티드로 조사할 수 있다.

다른 실시예(이에 제한되지 않음)로서, 두-하이브리드 시스템을 사용하여, 생체내에서 OSCAR 유전자 산물과의 단백질 상호작용을 검출할 수 있다. 요약하면, 이러한 시스템을 사용하여, 두 하이브리드 단백질(이중 하나는 OSCAR 유전자 산물에 융합된 전사 활성체의 DNA-결합 도메인을 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다)을 암호화하는 플라스미드를 구성할 수 있다. 다른 하이브리드 단백질은, cDNA 라이브러리의 일부로서 플라스미드 라이브러리에 재조합된 cDNA 에 의해 암호화된 공지되지 않은 단백질에 융합된, 첫번째 하이브리드에 사용된 전사 활성체 단백질의 활성화 도메인을 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. DNA-결합 도메인 융합 플라스미드 및 cDNA 라이브러리는 모두, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 균주 또는 리포터 유전자(예를 들어 HBS, lacZ, HIS3 또는 GFP)를 포함하는 다른 적당한 유기체로 공동-형질전환될 수 있다. 이러한 리포터 유전자의 조절 영역이 두 하이브리드 단백질의 전사 활성체 잔기의 결합 부위를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이러한 두-하이브리드 시스템에서, 두 하이브리드 중 어느 하나가 단독으로 존재하면 리포터 유전자의 전사를 활성화시킬 수 없다. 구체적으로, DNA-결합 도메인 하이브리드 단백질은, 필요한 활성화 기능에 국부화될 수 없으므로, 전사를 활성화시킬 수 없다. 유사하게, 활성화 도메인 하이브리드단백질은, 리포터 유전자 상의 DNA 결합 부위에 국부화될 수 없으므로, 전사를 활성화시킬 수 없다. 그러나, 두 하이브리드 단백질 간의 상호작용은, 기능적 전사 활성체 단백질을 재구성하고, 결과적으로 리포터 유전자가 발현된다. 따라서, 본 명세서에서 상세히 설명된 것과 같은 두-하이브리드 시스템에서, OSCAR 폴리펩티드(즉, 전사 활성체의 DNA 결합 도메인에 융합된 OSCAR 폴리펩티드) 및 시험 폴리펩티드(즉, 전사 활성체의 DNA 결합 도메인에 융합된 단백질) 간의 상호작용은, 리포터 유전자의 유전자 산물의 발현을 단순히 검출함으로써 검출가능하다.

이러한 두-하이브리드에서의 스크리닝 및 다른 분석법을 위한 cDNA 라이브러리는 본 기술분야에서 공지된 어떤 적합한 기술에 따라 만들 수 있다. 특정하나 제한되지 않는 실시예로서, 이것이 GAL4의 전사 활성화 도메인에 전사 융합되고, "베이트(bait)" OSCAR-GAL4 융합 플라스미드와 함께, 사카로마이세스 세레비시아 균주 또는 GAL4 활성화 서열을 포함하는 프로모터에 의해 유도된 HIS3 유전자를 포함하는 다른 적합한 유기체 중에 공동-형질전환되도록, cDNA 단편을 벡터에 삽입할 수 있다. OSCAR-GAL4 융합의 OSCAR 폴리펩티드 잔기와 상호작용하는, GAL4 전사 활성화 도메인에 융합된, 이 cDNA 라이브러리로부터의 단백질을 재구성하고 GAL4 단백질을 활성화함으로써, HIS3 유전자를 발현시킬 수 있다. HIS3 유전자를 발현하는 콜로니를, 히스티딘이 결핍된 반-고체 아가 계 매질을 포함하는 페트리 접시 상에서의 이의 성장을 통해 검출할 수 있다. 이어서, cDNA를 이들 균주로부터 정제하고, 시퀀싱하고, OSCAR 폴리펩티드와 상호작용하는 암호화된 단백질을 확인하기 위하여 사용할 수 있다.

일단 본 발명의 OSCAR 유전자 산물에 결합하는 화합물이 확인되었으면, 이들 방법에 기재된 스크리닝 방법을 또한 사용하여, 이들 결합 화합물에 결합하는 다른 화합물(예를 들어 소형 분자, 펩티드 및 단백질)을 확인할 수 있다. 이러한 화합물은 또한, 예를 들어 자연 OSCAR 리간드 또는 결합 파트너에 결합하고 OSCAR 유전자 산물과 이의 상호작용을 억제함으로써, OSCAR-관련 생활성을 조절하기에 유용하다. 예를 들어, OSCAR-L을 발현하는 세포주에 대한 OSCAR-Fc의 결합을 저해하는 이의 능력에 대하여, 이들 화합물을 시험할 수 있다(상기 참조).

OSCAR-리간드 상호작용을 방해하는 화합물의 분석법이하의 실시예는, 본 발명의 OSCAR 유전자 산물이 하나 이상의 분자(즉 리간드)와 생체 내에서 상호작용할 수 있음을 증명한다. 이와 달리 이 결합 상호작용을 방해하는 화합물은 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절할 때 유용하며, 이하 실시예에서 또한 증명된다. 특히, 이러한 화합물은 파골 세포의 성숙 또는 활성을 조절하고, 차례로 골 조직의 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해 또는 항상성을 조절하거나 골 성장 관련 질환을 치료하는데 관련된다.

이러한 화합물에는, 본 명세서에 기재된 다수의 예시적인 화합물 종류 중 어느 것을 포함하는, OSCAR 유전자 산물에 결합하는 화합물을 확인하는 상기된 스크리닝 분석법에 따라 확인된 화합물이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너(예를 들어 리간드) 간의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하는 분석법은, OSCAR 유전자 산물 및 이의 결합 파트너가 결합하여 복합체를 형성하기에 충분한 시간동안 조건 하에 OSCAR 유전자산물 및 이의 결합 파트너를 포함하는 시험 반응 혼합물을 제조하는 것을 포함한다. 저해 활성(즉, 결합 복합체의 형성을 저해하거나 일단 형성된 결합 복합체를 분열하는 능력)을 화합물을 시험하기 위하여, 시험 화합물은 또한 시험 반응 혼합물로 존재하는 것이 바람직하다. 예시적인 일실시형태에서, 시험 화합물은 처음에 OSCAR 유전자 산물 및 이의 결합 파트너와 함께 반응 혼합물 중에 포함될 수 있다. 그러나, 선택적으로, OSCAR 유전자 산물 및 이의 결합 파트너의 첨가에 이어서 이후에 시험 화합물을 시험 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 시험 화합물을 포함하지 않는 하나 이상의 대조구 반응 혼합물을 제조할 수도 있다. 일반적으로, 대조구 반응 혼합물은, 시험 반응 혼합물 중에 있는 것과 동일한 OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너를 포함할 것이지만, 시험 화합물은 포함하지 않을 것이다. 대조구 반응 혼합물은 또한 시험 화합물의 대신 시험 반응 혼합물 중에 존재하지 않는 플라시보을 포함할 수 있다. 이 때, OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너 간의 복합체 형성은 반응 생성물 중에서 검출될 수 있다. 시험 화합물(예를 들어, 조절 반응 혼합물)의 존재 하가 아닌 시험 화합물의 부재 하에 이러한 복합체가 형성되는 것은, 시험 화합물이 OSCAR 폴리펩티드 및 결합 파트너의 상호작용을 방해하거나 조절하는 것임을 나타낸다.

OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너의 상호작용을 조절하는 화합물의 이러한 분석법은, 이종 포맷 또는 선택적으로 동종 포맷으로 실시할 수 있다. 이종 분석법은 일반적으로 OSCAR 유전자 산물 또는 결합 파트너를 고체상(phase)에 고정하고, 반응 끝에 이 고체 상에 고정된 화합물을 검출하는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 분석법은, OSCAR 핵산 및 유전자 산물을 검출 및/또는 확인하고 OSCAR 결합 파트너를 검출 또는 확인하기 위하여 상기한 고체상 분석법과 유사하다. 실제, 당업자는, OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너 간의 상호작용(들)을 조절하는 화합물을 확인하기 위하여, 이러한 분석법을 위해 상기한 많은 원칙 및 기술을, 여기 기재된 고체 상 분석법에 부적절한 실험 없이 변형 및 적용할 수 있음을 인식할 것이다.

사용된 특정 분석법에 상관없이, 예를 들어, 경쟁에 의해 결합 파트너와 OSCAR 유전자 산물의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하거나, 형성된 결합 복합체를 분열하는 화합물을 확인하기 위하여, 반응물이 반응 혼합물에 첨가되는 순서를 변화시킬 수 있다. 경쟁에 의해 결합 파트너와 OSCAR 유전자 산물의 상호작용을 방해하는 화합물은 시험 화합물의 존재 하에 반응을 실시함으로써 확인 가능하다. 구체적으로, 이러한 분석법에서, OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너의 첨가 전 또는 이와 동시에 시험 화합물을 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. OSCAR 유전자 산물 및 결합 파트너의 형성된 복합체를 분열하는 시험화합물은, 복합체가 형성된 후 시험 화합물을 반응 혼합물에 첨가함으로써 시험할 수 있다.

본 명세서에 기재된 스크리닝 분석법은 또한 전장 OSCAR 폴리펩티드 또는 단백질의 일부에 대응하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하거나, 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 포함하여 이루어지는 융합 단백질과 함께 실시할 수 있다. 예를 들어, OSCAR 폴리펩티드와 결합 파트너의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하는 스크리닝 분석법은, 결합 파트너(예를 들어 리간드 "결합 부위")에 결합하는 전장 OSCAR 폴리펩티드의 특정 영역 또는 도메인에 대응하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 일실시형태에서, 전장 OSCAR 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는(예를 들어, SEQ ID NO:3의 OSCAR 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1-228의 서열을 포함하여 이루어지는) 폴리펩티드(또는 이의 융합물)를 사용하여 스크리닝 분석법을 실시할 수 있다.

OSCAR 폴리펩티드의 특이적 결합 부위를 확인하기 위하여 사용가능한 다양한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, OSCAR 유전자를 돌연변이하고 결합의 분열에 대해 상기와 같이 스크리닝함으로써 결합 부위를 확인할 수 있다. 돌연변이로부터의 분열을 상쇄하는 돌연변이를 OSCAR 유전자로 확인하기 위하여, 결합 파트너를 암호화하는 유전자를 또한 돌연변이 할 수 있다. 이 때 이들 돌연변이의 서열 분석을 통해 두 단백질의 결합 영역에 대응하는 돌연변이를 밝혀낼 수 있다.

선택적인 실시형태에서, 단백질(예를 들어, OSCAR 단백질 또는 OSCAR 단백질에 대한 단백질 결합 파트너)을 고체 표면에 고정하거나, 본 명세서에서 상기된 방법을 사용하여 지지할 수 있다. 상기된 결합 분석법에 따라, 고체 표면에 고정된 단백질에 결합하는 다른 표지된 단백질을 단백분해 효소로 처리할 수 있으며, 이의 단편을 고체 표면에 부착된 단백질과 상호작용시킬 수 있다. 세척 후, 처리된 단백질의 짧고 표지된 펩티드 단편은 고정된 단백질과 관련될 수 있다. 이들 펩티드는 분리될 수 있으며, 이들이 유래하는 전장 단백질의 영역을 아미노산 서열로 확인할 수 있다.

다른 실시형태에서, OSCAR-리간드 상호작용을 방해하는 화합물을 또한, 조혈 세포, 배 섬유아세포, NIH 세포, 3T3 세포, ST2 세포, Mlg 세포, UMR106 세포, HEK293T 세포, hFOB1.19 세포 및 COS-1 세포와 같은 OSCAR 특이적 리간드를 발현하는 세포에 대한 OSCAR 폴리펩티드(예를 들어, OSCAR-Fc 융합 폴리펩티드)의 결합을 조절하는 화합물을 스크리닝함으로써 확인할 수 있다.

치료 방법 및 약제학적 제제

본 발명의 OSCAR 핵산 분자, 폴리펩티드 및 항체를 사용하여 예를 들어 파골 세포의 성숙 및 활성을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 OSCAR 핵산 또는 폴리펩티드에 결합하는 화합물, OSCAR 유전자 발현을 조절하는 화합물, 및 OSCAR 핵산 또는 폴리펩티드와 결합 화합물(예를 들어 중성 리간드)과의 결합을 방해하거나 조절하는 화합물은, 예를 들어 파골 세포의 성숙 또는 활성을 조절하는 방법에서 유용할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물을 사용하여 또한, 파골세포 활성과 관련있는 과정, 예를 들어 골조직의 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해 및 항상성을 조절할 수 있다. 이러한 방법은 특히 골다공증, 골화석증 등의 골 성장 관련 질환의 치료에 유용하다.

예를 들어, 본 발명의 OSCAR 유전자 산물에 결합하는 화합물(예를 들어, OSCAR 리간드)은 OSCAR 활성을 증가시키고, 파골 세포의 성숙을 자극하고, 이를 통해 파골세포 관련 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 이러한 화합물을 사용하여, 파골세포 활성의 활성화가 바람직할 수 있는 상태를 치료할 수 있다. 예를 들어,파골세포는 석회화된 골 매트릭스를 재흡수하는 세포이므로, OSCAR 활성을 증가시키고 파골세포의 성숙을 증가시키는 화합물은, 비정상적으로 높거나 상승된 골질량과 관련있는 골화석증과 같은 골 성장 관련 질환을 치료하기에 유용하다. 선택적으로, 예를 들어 OSCAR 유전자 산물 및 리간드 간의 결합 상호작용을 방해함으로써 OSCAR 활성을 감소시키는 화합물은, 파골 세포 성숙 및 파골세포 관련 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이들 화합물을 사용하여 감소된 파골세포 활성이 바람직한 상태를 치료할 수 있다. 예를 들어, OSCAR 활성을 감소시키는 화합물을 사용하여 비정상적으로 낮거나 감소된 골질량과 관련있는 골다공증과 같은 골 성장 관련 질환을 치료할 수 있다.

이러한 방법을 사용하여, 예를 들어 조직 시료 중에서, 화합물이 파골 세포의 수를 실제 증가시키거나 감소시키는지를 확인할 수 있다. 따라서, 이들 방법을 사용하여 특정 치료가 파골세포 활성에 원하는 효과를 나타내는지를 조사할 수 있다.

선택적으로, 개체(예를 들어, 동물 모델 또는 환자)의 골질량을 조사하고, 치료 결과로 골질량이 증가하거나 감소하는지를 확인함으로써, 치료 효과를 확인할 수 있다.

저해 접근법.파골세포 성숙 또는 활성을 조절하는 방법은, 단순히 OSCAR 유전자의 발현, OSCAR 유전자 산물의 합성 또는 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하는 하나 이상의 화합물을 투여하여, 파골 세포 성숙 또는 활성을 조절(예를 들어 증가 또는 감소)하는 것을 포함하여 이루어질 수 있다. 유사하게, 골성장, 치유,발달, 재흡수, 분해 또는 항상성을 조절(예를 들어 증가 또는 감소)하는 방법은, 단순히 OSCAR 유전자의 발현, OSCAR 유전자 산물의 합성 또는 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절하는 하나 이상의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이들 하나 이상의 화합물은, 골 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해 또는 항상성이 원하는만큼 조절될 때까지 투여한다.

OSCAR 핵산의 활성, 발현 또는 합성을 조절하는 능력을 가질 수 있는 화합물에는, 안티센스, 리보자임 및 삼중-나선 분자가 있다. 이러한 분자는 와일드-타입 OSCAR 핵산 및 폴리펩티드를 감소시키거나 저해하도록 디자인되거나, 선택적으로 돌연변이체 OSCAR 핵산 또는 폴리펩티드를 표적으로 할 수 있다.

안티센스 RNA 및 DNA 분자는 표적 mRNA 분자에 하이브리디제이션하고 단백질 번역을 막아, mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 접근법은, 상보적인 표적 유전자 mRNA 전사체에 결합하여 번역을 막을 것이다. 바람직하다고는 하나, 절대적인 상보성이 요구되지는 않는다.

핵산 부분에 "상보적인" 서열은, 핵산과 하이브리디제이션하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 충분한 상보성을 가지는 서열이 바람직하다. 핵산의 하이브리디제이션 능력은 서열 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이 모두에 따라 결정될 것이다. 그러나, 일반적으로 하이브리디제이션하는 핵산이 길수록, 이것이 포함할 수 있으며 안정한 듀플렉스(또는 삼중 나선법에서 트리플렉스)를 형성할 수 있는 염기는 더 많이 부적당하게 짝지워진다. 허용가능한 정도의 부적당한 짝지움은, 예를 들어 표준 절차를 사용하여 하이브리디제이션된 복합체의 용융 온도를측정함으로써 쉽게 확인될 수 있다.

바람직한 일실시형태에서, OSCAR 유전자의 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 접근법에 사용하여, 내인성 OSCAR mRNA 분자의 번역을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산은 6개 이상의 뉴클레오티드 길이가 바람직하고, 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이가 더 바람직하다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상 또는 50 이상의 뉴클레오티드 길이가 될 수 있다.

일반적으로, 유전자 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 정량화하기 위하여 생체외 연구가 우선 실시되는 것이 바람직하다. 이들 연구에서, 안티센스 유전자 저해 및 올리고뉴클레오티드의 비특이적인 생물학적 효과를 구별하는 대조구를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이들 연구는, 표적 RNA 또는 단백질의 수준과 내부 대조구 RNA 또는 단백질의 수준을 비교하는 것이 바람직하다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진 결과를 대조구 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진 결과와 비교하는 것을 생각해 본다. 대조구 올리고뉴클레오티드는 시험 올리고뉴클레오티드와 대략적으로 동일한 길이인 것이 바람직하고, 단지 표적 서열에 대한 특이적 하이브리디제이션을 막기 위해 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 안티센스 서열과 다른 것이 필요하다.

표적 유전자 코딩 영역 서열에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 사용할 수 있으나, 전사되고 비번역된 영역에 상보적인 것이 가장 바람직하다.

안티센스 분자를, 생체내 표적 유전자를 발현하는 파골세포와 같은 세포에전달하는 것이 바람직하다. 안티센스 DNA 또는 RNA를 세포에 전달하기 위하여 다수의 방법이 개발되었다. 예를 들어, 안티센스 분자를 조직 부위에 직접 주입하거나, 원하는 세포(예를 들어 표적 세포 표면 상에 발현되는 수용체 또는 항원을 특이적으로 결합시키는 펩티드 또는 항체에 결합된 안티센스)를 표적화하기 위해 디자인된, 변형된 안티센스 분자를 전신 투여할 수 있다.

바람직한 실시형태는 내인성 mRNA의 번역을 억제하기에 충분한 안티센스 핵산 분자의 세포내 농도를 달성한다. 예를 들어, 바람직한 한 접근법에서, 강한 pol III 또는 pol II 프로모터의 조절 하에 안티센스 올리고뉴클레오티드를 위치시키는 재조합 DNA 구성을 사용한다. 이러한 구성을 환자의 표적 세포에 트랜스펙션하기 위하여 사용하면, 내인성 표적 유전자 전사체와 상보적 염기쌍을 형성할 충분한 양의 단일 가닥 RNA를 전사함으로써, 표적 유전자 mRNA의 전사를 막을 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 벡터는 도입되어 세포에 의해 취해질 수 있으며, 안티센스 RNA의 전사를 지시한다. 이러한 벡터는, 원하는 안티센스 RNA를 생산하기 위하여 전사될 수 있는 한, 에피솜에 남거나 크로모좀 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 본 기술분야의 표준 재조합 DNA 기술법으로 구성할 수 있다. 벡터로는, 플라스미드, 바이러스 또는 포유류 세포에서 복사 및 발현을 위해 사용된 본 기술분야에서 공지된 다른 것이 가능하다. 안티센스 RNA를 암호화하는 서열의 발현은, 특정 세포 타입(예를 들어 인간 파골 세포와 같은 포유류의 파골세포)에서 작용하는 이 기술분야에서 공지된 임의의 프로모터를 사용하여 가능하다. 예를 들어, 재조합 OSCAR 핵산의 발현과 관련하여 상기 논의된 어떤 프로모터도 OSCAR 안티센스 핵산을 발현하기 위하여 사용할 수 있다.

표적 유전자 mRNA 전사체를 촉매 분해하기 위해 디자인된 리보자임 분자를 또한 사용하여 표적 유전자 mRNA의 번역을 막고, 이에 따라 표적 유전자 산물의 발현을 막을 수 있다(예를 들어, 국제 공개 제 WO 90/11364; Sarver,et al., Science 1990, 247:1222-1225).

리보자임은 RNA의 특이적 분해를 촉매작용할 수 있는 효소 RNA 분자이다(검토를 위해 문헌(Rossi, Current Biology 1994, 4:469-471)을 참조). 리보자임 작용 메카니즘은, 상보적인 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열 특이적 하이브리디제이션 후 엔도뉴클레오리틱(endonucleolytic) 분해를 포함한다. 리보자임 분자의 조성은 표적 유전자 mRNA에 대해 상보적인 하나 이상의 서열을 포함해야 하며, mRNA 분해를 일으키는 주지된 촉매 서열을 포함해야 한다. 이러한 서열에 대해서는 예를 들어 미합중국 특허 제 5,093,246호를 참조한다.

부위 특이적 인식 서열에서 mRNA를 분해하는 리보자임이 표적 유전자 mRNAs를 분열하기 위하여 사용될 수 있으나, 해머헤드(hammerhead) 리보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은, 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측면접합(flanking) 영역에 의해 지시되는 위치에서 mRNA를 분해한다. 표적 mRNA가 다음 서열로 두 염기:5'-UG-3'를 갖는 것이 단일 요건이다. 해머헤드 리보자임의 구성 및 생산은 본기술분야에서 주지되어 있으며, 문헌(Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (특히 833면 도 4) 및 Haseloff and Gerlach, Nature 1988,334:585-591)에 보다 완전하게 기재되어 있다.

즉, 비-기능적 mRNA 전사체의 세포내 축척을 최소화하고 유효성을 증가시키기 위하여, 분해 인식 부위가 표적 유전자 mRNA의 5' 말단 근처에 위치하도록, 리보자임을 유전자 조작하는 것이 바람직하다.

본 발명의 리보자임에는 또한 테트라하이메나 써모필리아(Tetrahymena thermophila)(IVS, 또는 L-19 IVS RNA로 공지됨)에서 자연적으로 발생하고 문헌(Zaug, et al., Science 1984, 224:574-578; Zaug and Cech, Science 1986, 231:470-475; Zaug et al., Nature 1986, 324:429-433; 국제 특허 공개 번호 WO 88/04300; Been and Cech, Cell 1986, 47:207-216)에 폭넓게 기재되어 있는 것과 같은 RNA 엔도리보뉴클레아제(이후 "Cech-타입 리보자임"이라 함)가 포함된다. Cech-타입 리보자임은, 표적 RNA 서열에 하이브리디제이션한 후 표적 RNA 분해가 일어나는 여덟 염기 쌍 활성 부위를 갖는다. 본 발명은 표적 유전자 내에 존재하는 여덟 염기-쌍 활성 부위 서열을 표적화하는 Cech-타입 리보자임을 포함한다.

안티센스 접근법에서와 같이, 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있으며(예를 들어 개선된 안정성, 표적화 등을 위해), 생체내에서 표적 유전자를 발현하는 세포에 전달되어야 한다. 바람직한 전달 방법에는, 트랜스펙션된 세포가 충분한 양의 리보자임을 생산하여 내인성 표적 유전자 메시지를 분열하고 번역을 저해하도록, 강한 구성요소인 pol III 또는 pol II 프로모터의 조절 하에 리보자임을 "암호화하는" DNA 구성을 사용하는 것이 포함된다. 리보자임 비유사 안티센스 분자가 촉매작용하므로, 유효성을 위해서는 낮은 세포내 농도가 요구된다. 이러한 구성은 상기된 어떤 벡터를 사용하여 세포에 도입할 수 있다.

포적 유전자 또는 이의 프로모터를 표적화된 상동성 재조합을 사용하여 불활성화하거나 "노킹 아웃(Knocking out)" 함으로써, 내인성 표적 유전자 발현을 또한 감소시킬 수 있다(예를 들어, Smithies, et al., Nature 1985, 317:230-321 참조). 예를 들어, 선택성 표지 및/또는 음성 선택성 표지가 있거나 없이, 내인성 표적 유전자(표적 유전자의 코팅 영역 또는 조절 영역)에 상동성인 DNA에 의해 측면접합된 돌연변이체, 비-기능적 표적 유전자(또는 완전히 관련없는 DNA 서열)를 사용하여, 생체 내에서 표적 유전자를 발현하는 세포를 트랜스펙션할 수 있다. DNA 구성을 표적화된 상동성 재조합을 통해 삽입하면, 표적 유전자가 불활성화된다. 이러한 접근법은 특히, ES(배의 줄기) 세포에 대한 변형을 사용하여 불활성 표적 유전자를 갖는 동물 자손을 생성할 수 있는 농업 분야에서 적합하다(예를 들어 Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 상기됨). 그러나, 재조합 DNA 구성을 적당한 바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에 필요한 부위에 직접 투여하거나 표적화하면, 이러한 접근법을 인간에 사용하기 적합하게 할 수 있다.

선택적으로, 표적 유전자(즉 표적 유전자 프로모터 및/또는 인핸서)의 조절 영역에 상보적인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 표적화하여, 개체 내 표적 세포의 표적 유전자의 전사를 막는 삼중 나선형 구성을 형성함으로써, 내인성 표적 유전자 발현을 감소시킬 수 있다(일반적으로, Helene, Anticancer Drug Des. 1991, 6:569-584; Helene, et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660:27-36; 및 Maher, Bioassays 1992, 14:807-815 참조).

전사를 저해하기 위해 트리플렉스 나선 형성에 사용되는 핵산 분자는 단일 가닥이 되어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은, 일반적으로 듀플렉스 중 한 가닥 상에 존재하는 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘의 스트레치를 필요로 하는 호그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중 나선 형성을 촉진하도록 디자인되어야 한다. 뉴클레오티드 서열은 피리미딘-계가 될 수 있으며, 이는 얻어지는 삼중 나선의 세개의 관련된 가닥을 가로질러 TAT 및 CGC⁺트리플렛이 될 것이다. 피리미딘-풍부 분자는, 듀플렉스의 단일 가닥의 퓨린-풍부 영역에, 이 가닥에 대해 평행한 배향으로 염기 상보성을 제공한다. 또한, 예를 들어 G 잔기의 스트레치를 포함하는, 퓨린-풍부 핵산 분자를 선택할 수 있다. 이들 분자는 GC 쌍이 풍부한 DNA 듀플렉스와 삼중 나선을 형성할 것이며, 이 때 대다수의 퓨린 잔기는 표적화된 듀플렉스의 단일 가닥 상에 위치하여, 트리플렉스의 세가닥을 가로질러 GGC 트리플렛이 얻어진다.

선택적으로, 소위 "스위치백(switchback)" 핵산 분자를 생성함으로써, 삼중 나선 형성을 위해 표적화될 수 있는 잠재적인 서열이 증가될 수 있다. 이들이 듀플렉스 중 우선 한 가닥 및 이어서 다른 것과 염기쌍을 이루어, 듀플렉스의 한 가닥 상에 존재하는 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘의 스트레치가 필요 없도록, 교대의 5'-3', 3'-5' 방식으로 스위치백 분자를 합성한다.

본 명세서에 기재된 안티센스, 리보자임, 및/또는 삼중 나선 분자를 사용하여 돌연변이체 유전자 발현을 저해하는 경우, 이 기술은, 존재하는 정상적인 표적유전자 산물의 농도가 정상적인 표현형에 대해 필요한 것보다 낮을 가능성이 일어날 수 있도록 효율적으로, 정상적인 유전자 대립형질에 의해 생산되는 mRNA의 전사(삼중 나선) 및/또는 번역(안티센스, 리보자임)을 감소 또는 저해할 수 있다. 이 때, 따라서, 실질적으로 정상적인 수준의 표적 유전자 활성을 확실히 유지하기 위하여, 정상적인 표적 유전자 활성을 보이는 표적 유전자 폴리펩티드를 암호화 및 발현하는 핵산 분자가, 하기된 것과 같은 유전자 치료법을 통해 세포에 도입될 수 있으며, 이는 안티센스, 리보자임 또는 삼중 나선 치료가 사용되고 있는 것에 영향받기 쉬운 서열을 포함하지 않는다. 선택적으로, 표적 유전자가 세포외 단백질을 암호화하는 경우, 필요한 수준의 표적 유전자 활성을 유지하기 위하여 정상적인 표적 유전자 단백질을 공동-투여하는 것이 바람직할 수 있다.

유전자 치료.질환이 OSCAR 유전자 돌연변이의 결과인 경우, 그 치료법은 개체에 와일드 타입의 OSCAR 핵산 분자 또는 정상적인 생활성을 갖는 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 것을 공급하여, 질환 증상을 개선하는 것을 포함하여 이루어질 수 있다.

선택적으로, 질환이 OSCAR 유전자 돌연변이의 결과인 경우, 그 치료법은 개체에, 정상적인 생활성을 갖는 와일드-타입 OSCAR 유전자 산물 또는 OSCAR 유전자 산물을 발현하도록 변형된, 파골세포 또는 조골세포와 같은 세포를 공급 또는 주입하여, 질환 증상을 개선하는 것을 포함하여 이루어질 수 있다.

본 기술분야에서 사용가능한 모든 유전자 치료 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 치료법을 일반적으로 고찰하기 위해서는 문헌(Goldspiel etal., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:296-932; Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62:191-217; 및 May, TIBTECH 1993, 11:155-215)을 참조한다. 특히, 세포 내 OSCAR 핵산의 발현을 위해 상기 기재된 바이러스 및 비-바이러스성 벡터 중 어느 것을 이들 유전자 치료법에 사용할 수 있다.

재조합 DNA 기술의 분야에서 일반적으로 알려져 있는 방법을 이러한 유전자 치료법에 사용할 수도 있다. 예를 들어 문헌(Ausubelet al.(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York; 및 Dracopoliet al.(eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, New York)에 기재된 방법을 참조한다.

본 발명의 유전자 치료법의 일면에 있어서, 적당한 숙주 세포의 기능적 OSCAR 유전자 산물을 발현하는 핵산 서열을 포함하여 이루어지는, 본 명세서에 기재된 어떤 발현 벡터를 포함하는 치료 벡터를 사용한다. 특히, 벡터는 본 발명의 기능 OSCAR 폴리펩티드를 위한 코팅 서열에 작용 결합되어 있는 프로모터를 포함하여 이루어지는 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 프로모터로는 유도가능한 프로모터, 구성 프로모터가 될 수 있으며, 선택적으로 조직-특이적이 될 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터는, OSCAR 핵산 서열이 게놈의 원하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진하여, OSCAR 유전자 산물의 염색체내 발현을 제공하는 영역에 의해 측면접합되어 있는 핵산 분자를 포함한다(예를 들어 Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86:8932-8935; Zijlstraet al.,Nature 1989, 342:435-438 참조).

벡터를 개체에 투여하는 실시형태(예를 들어, 골 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해 또는 항상성과 같은 파골세포 활성을 조절하는 방법)에서, 직접 또는 간접적으로 벡터를 개체에 전달할 수 있다. 직접적인 벡터 전달 방법은 개체를 벡터 또는 전달 복합체에 직접 노출시키는 것을 포함하여 이루어진다. 간접 전달 방법에서, 세포는 우선 생체외(예를 들어, 세포 배양액)에서 백터와 형질전환된 후, 환자에게 이식된다. 이러한 직접 및 간접적인 전달 방법은 각각 생체내 및 생체외 유전자 치료법이라고도 한다.

이러한 유전자 치료법에 사용되는 핵산의 정확한 형태 및 양은, 특정한 질병 타입 및 원하는 효과의 강도, 환자 상태 등과 같은 특정 적용에 따라 결정될 것이다. 당업자는 특정 적용 또는 치료를 위한 핵산의 적당한 형태 및 양을 결정할 수 있다.

항-OSCAR 항체 치료법.이하의 특정한 실시형태에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 OSCAR 유전자 산물은 파골세포에서 지배적 또는 독점적으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 치료법은 또한, 파골세포를 표적화하고 일시적으로 제거하기 위하여 OSCAR 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 것을 포함할 수도 있다. 이러한 치료법은 특히, 파골세포-매개 골 재흡수를 억제하는 것이 바람직한 골화석증과 같은 질병 및 질환을 치료하기에 바람직하다.

이러한 치료법에 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 상기된 모든 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법에 사용된 치료 항체는, 세포독성 분자(예를 들어 방사선동위원소 또는 리신과 같은 독소)에 결합된 전장 항체 또는 이의 단편이 될 수 있다. 이 때 항체를 사용하여 표적 세포(즉 파골 세포)에 대한 세포독성을 특이적으로 표적화할 수 있다.

이러한 방법의 다른 실시형태에서, 항체의 내인성 기능(즉, 항체의 Fc 부분에 의해 매개되는 기능)은 예를 들어 항체-매개된 세포독성 등에 의해 표적 파골세포를 깨끗이한다. 이러한 항체-계 치료법은 이미 본 기술분야에 주지되어 있다.

또다른 실시형태에서, 세포내 항체("인트라체(intrabodies)"라고도 함)를 사용하여 OSCAR 유전자 산물의 활성을 조절할 수 있다. 세포내 단백질의 활성을 조절하기 위하여 인트라체를 사용하는 것은 본 기술분야에서 주지되어 있으며, 바이러스 감염(예를 들어 Marasco et al., Hum. Gene Ther. 1998, 9:1627 참조) 및 다른 감염성 질병(예를 들어 Rondon et al., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51:257 참조), 및 p21(예를 들어 Cardinale et al., FEBS Lett. 1998, 439:197-202; 및 Cochet et al., Cancer Res. 1998, 58:1170-6 참조), myb(Kasono et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998, 251:124-30 참조), erbB-2(Graus-Porta et al., Mol Cell Biol. 1995, 15:1182-91)와 같은 종양원 등을 포함하는(이에 제한되지 않음) 다수의 다른 시스템에 기재되었다(예를 들어 Marasco,Gen Ther.1997, 4;11; Chenet al., Hum, Gene Ther.1994, 5:595).

약제학적 제제.OSCAR 유전자 발현 또는 OSCAR 유전자 산물 활성에 영향을주는 것으로 결정된 화합물을 치료적 유효량으로 투여하여(예를 들어 개체에), 파골세포 성숙 또는 파골세포 관련 활성을 조절할 수 있다; 또는 이러한 화합물을 치료적 유효량으로 투여하여, 개체내 골조직의 성장, 치유, 발달, 재흡수, 분해 또는 항상성을 조절할 수 있다. 따라서, 치료적 유효량이란, 이러한 조절된 활성, 및 골다공증 및 골화석증과 같은 골성장 관련 질환의 증상 개선이 얻어지기에 충분한 화합물을 양을 의미한다.

예를 들어, 세포 배양액 분석법에서나, 실험동물을 사용하여 LD₅₀및 ED₅₀을 결정하는 표준 약제학적 절차에 의해 화합물의 독성 및 치료적 효능을 확인할 수 있다. 파라미터 LD₅₀및 ED₅₀는 본 기술분야에서 주지되어 있으며, 각각 집단의 50%에 치명적인 화합물의 양 및 집단의 50%에 치료 유효성이 있는 화합물의 양을 나타낸다. 독성 및 치료효과 간의 투여량 비율은 치료 인덱스라 하며 LD₅₀/ED₅₀비로 표현할 수 있다. 큰 치료 징후를 보이는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 보이는 화합물을 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 경우에는, 다른 세포, 조직 또는 기관에 대한 잠재적 손상을 최소화하고 부작용을 감소시키기 위하여, 영향받는 조직 부위에 이러한 화합물을 특이적으로 표적화하는 전달 시스템을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

세포 배양액 분석법 또는 동물 연구로부터 얻은 데이터를 사용하여, 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 명확히 할 수 있다. 본 발명의 치료법에 사용되는 화합물의 투여량은, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED₅₀농도(예를 들어 LD₅₀농도이하)를 포함하는 순환 농도 범위 이내인 것이 바람직하다. 어떤 적용 분야에 사용되는 특정 투여량은, 사용되는 특정한 투여량 형태, 사용되는 투여 경로, 개체의 상태(예를 들어, 환자) 등과 같은 인자에 따라, 이 범위 내에서 변화될 수 있다.

치료에 유효한 양은, 우선 세포 배양액 분석법로부터 어림잡고 동물 모델에서 명확히 하여, IC₅₀을 포함하는 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 화합물의 IC₅₀농도는, (예를 들어 세포 배양액 분석법으로부터 결정되는 것과 같이) 증상의 최대 저해의 반을 달성하는 농도이다. 이어서, 특정 개체, 예를 들어 인간 환자에게 사용하기 위한 적당한 투여량을 이러한 정보를 사용하여 더 정확히 결정할 수 있다.

혈장 중의 화합물의 측정은, 통상적으로 환자와 같은 개체 내에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 가스 크로마토그래피로 측정할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방법으로 조성할 수 있다.

따라서, 화합물, 이의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매화합물은, 흡입 또는 살포(입 또는 코를 통해), 또는 경구, 협측, 비경구 또는 직장 투여로 투여하기 위해 조성할 수 있다.

경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은, 결합제(예를 들어 전젤라틴화된 옥수수색 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예를 들어 락토오스, 미세결정 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 정제분해물질(disintegrants)(예를 들어감자 전분 또는 소듐 스타치 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어 소듐 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 통상적인 방법으로 제조되는, 예를 들어 정제 또는 캅셀 형태가 될 수 있다. 정제는 본 기술분야에 주지되어 있는 방법으로 코팅할 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태가 될 수 있거나, 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 조성하기 위한 건조 산물로 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들어 솔비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별증류된 야채유); 및 방부제(예를 들어 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 제제는 또한 적당한 완충염, 향미제, 착색제 및 감미제도 포함할 수 있다.

경구 투여용 제제는 활성 화합물의 방출을 조절하기 위하여 적당히 조성할 수 있다. 협측 투여를 위해, 조성물을 통상적인 방법으로 조성된 정제 또는 마름모꼴 형태로 할 수 있다. 흡입 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은, 적당한 추진제(예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 가스)를 사용하여, 가압된 팩 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 투여량 단위를 결정할 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 살포기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는, 화합물 및 락토오스 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스의 분말 혼합물을 포함하여 조성할 수 있다.

화합물을 예를 들어 환괴 주입과 같은 주입 또는 연속 주입을 통해 비경구 투여하도록 조성할 수 있다. 주입용 조성물은, 첨가된 방부제와 함께 예를 들어 앰플 또는 반복투여 용기와 같은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태가 될 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 조성제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 활성 성분은 예를 들어 살균된 무-발열원 수와 같은 적당한 비히클과 함께 사용전에 조성하는 분말 형태가 될 수 있다.

화합물은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 포함하는 좌제 또는 보유 관장제와 같은 직장 조성물로 조성할 수 있다.

상기된 조성물에 추가하여, 화합물은 저류물(depot) 제제로 조성할 수도 있다. 이러한 장기간 작용하는 조성물은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주입으로 투여가능하다. 따라서, 예를 들어, 화합물을 적당한 폴리머 또는 소수성 물질 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 예를 들어 절약(sparingly) 가용성 염과 같이 절약 가용성 유도체로서 조성할 수 있다.

필요시, 조성물은 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어 블리스터(blister) 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함하여 이루어질 수 있다. 팩 또는 디스펜서 기기는 투여용 설명서를 첨부할 수 있다.

본 발명은 또한 특정 실시예를 통해 기재되어 있다. 그러나, 이러한 본 명세서의 실시예는 단지 설명을 위한 것으로, 본 발명의 범위 및 의미를 제한하는 것이 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 어떤 특정한 바람직한 실시형태로 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서를 읽고 당업자는 이의 정신 및 범위를 벗어남 없이 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위와 특허청구범위의 등가물의 전 범위에 의해서만 제한된다.

실시예 1: 쥐의 OSCAR 유전자의 분리 및 특징화

이 실시예를 통해 면역글로불린 (Ig)-유사 수용체를 암호화하고, 구체적으로는 파골세포에서 발현되는 신규한 cDNA 단편의 분리를 설명한다. 이 실시예는 본 명세서에서 OSCAR라 하는 신규한 유전자 및 유전자 산물을 제공한다.

물질 및 방법

파골 세포 및 마크로파지의 생산. 설명된 바에 따라 4 내지 8주령 C57BL/6 수컷 마우스로부터 골수 세포를 분리하였다(Waniet al., Endocrinology 199, 140:1927-1935). 대퇴골 및 경골을 무균하에 제거한다. 뼈 말단을 절단하고, 살균된 31-게이지 바늘을 사용하여 BSS 용액을 주입함으로써 골수 세포를 분출시켰다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해, 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 골수세포를 교반하였다. 메쉬로 여과 후, 골수세포를 게이(Gey's) 용액으로 처리하였다. 골수 세포를 두번 세척하고, 10% FBS 포함 α-MEM 중에 재현탁하고, 750㎖ 플라스크 중에서 M-CSF(5ng/㎖)에서 1×10⁶세포/㎖의 밀도로 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 비부착 세포를 수확하여 동일 배지에서 현탁하였다. 10㎖의 현탁액(3×10⁷세포)을 100mm 페트리 접시에 첨가하여, 파골세포 및 마크로파지 세포를 생산하였다. 인간 M-CSF(30ng/㎖)를 마크로파지 세포에 첨가하고, hM-CSF(30ng/㎖), mTRANCE(1㎍/㎖) 및 PGE2(1μM)를 파골 세포에 사용하였다. PBS로 2회 세척한 3일 후에 배양액을 공급하고, 4일 후에 부착 세포를 수확하였다. 설명된 바와 같이 골수 전구체로부터 성숙한 수상돌기 세포가 발생되었다(Inabaet al.,J. Exp. Med. 1992, 176:1693-1702).

골수 세포로부터의 RNA 분리.TRIZOL(GIBCO)를 사용한 배양 접시로부터 직접적으로, 파골세포 및 마크로파지 세포로부터의 전체 RNA를 분리하였다. 폴리A mRNA를 올리고텍스 mRNA 키트(QIAGEN)를 사용하여 전체 RNA로부터 분리하였다. 폴리A mRNA 용리액을 에탄올로 침전시켜 DEPC-처리 증류수 중에 재현탁하였다. UV 분광광도계를 사용하여 폴리A mRNA 농도를 측정하였다.

두개골 및 장골로부터의 RNA 분리.3 일령 마우스의 두개골을 수집하고, PBS 로 세척하고, TRIZOL로 처리하였다. 4주령 암놈 마우스의 장골을 수집, 동결,베스맨 조직 분쇄기(Bessman tissue pulverizer)(Fisher)를 사용하여 분쇄하고, TRIZOL로 처리하였다. 제조업자의 프로토콜(GIBCO)에 따라 TRIZOL을 사용하여 조직 시료로부터 전체 RNA를 수확하였다.

서브트랙션 cDNA 라이브러리의 생성.골수-유도된 파골세포 및 마크로파지 세포로부터의 폴리A mRNA를 사용하여, 제조업자의 프로토콜(CLONTECH)에 따라 PCR-선택된 서브트랙션으로, 서브트랙션 cDNA 라이브러리를 만들었다. 서브트랙션으로부터의 cDNA를 pCR2.1 TA 클로닝 벡터(INVITROGEN)에 직접 삽입하였다. 14℃에서 밤새 결찰한 후, 결찰 혼합물을 대장균 XLIIB 수용 세포에 형질전환하였다. 이들 세포를 X-gal 및 IPTG와 함께 암피실린을 포함하는 LB 플레이트 상에 도말하였다. 미니프레프(miniprep) 배양을 위해 250개의 백색 콜로니를 임의로 집어냈다.

파골세포 특이적 유전자의 확인. 서브트랙트된 단편을 포함하는 플라즈마 DNA 시료를 QIAprep 스핀 미니프레프 키트(QiAGEN)을 사용하여 분리하였다. EcoRI로 분해 후, DNA를 아가로즈 겔 상에 분리시키고, 나일론 막(NEN)으로 옮기고, 파골세포 및 마크로파지로부터의³²P-표지된 cDNA로 조사하였다. 이전에 설명한 바와 같이 프라이머로서 임의의 헥사머를 사용하여 전체 RNA 각각을 사용하여³²P-표지된 cDNA 탐침을 합성하였다(Sambrooket al., 1989,상기).

하이브리디제이션 완충액(50% 포름아미드, 150mM 인산 나트륨, pH6.8, 2X 덴하르츠(Denhardt's) 용액, 250mM NaCl, 1% SDS, 1mM EDTA, 및 10% PEG 8,000) 중에서 4시간동안 나일론 막을 예비하이브리디제이션하였다. 탈변성 DNA 탐침을 첨가하고, 16시간동안 하이브리디제이션하였다. 필터를 세척하고, 이전에 설명한 바와 같이 자가방사기록하였다(autoradiographed)(Sambrook et al., 1989,상기). 파골세포 탐침으로 선택적으로 하이브리디제이션된 시료를 추가 분석을 위해 선택하였다.

노던 분석. 설명된 바와 같이 노던 하이브리디제이션 완충액(50% 포름아미드, 50mM 인산 나트륨, pH6.8, 5× 덴하르츠 용액, 5×SSC, 및 3mg/㎖ 초음파 처리 연어 정액 DNA)을 사용하여 노던 블롯 분석을 실시하였다(Sambrook et al., 1989,상기). 다른 세포 형태 및 조직 시료로부터의 전체 RNA를 제조업자의 프로토콜(GIBCO)에 따라 TRIZOL을 사용하여 수확하였다. OCL178 및 전장 TRAP 및 카텝신 K cDNA를 표지하고 탐침으로 사용하였다.

결과 및 토론

OSCAR용 cDNA 단편의 분리. 파골세포(OC) 및 마크로파지(Mφ)는 골수 전구체 세포로부터 유래한다. OCs 및 Mφs는 잠재적으로 공통적인 전구체 세포로부터 유래하므로, 제조업자의 프로토콜(CLONTECH)에 따라 PCR-선택 서브트랙션 키트를 사용하여 서브트랙션 cDNA(쥐의 OC-Mφ) 라이브러리를 구성하였다. OC-특이적 유전자를 확인하기 위하여, 서브트랙트된 단편을 포함하는 플라스미드 DNA를 250 클론으로부터 정제하고, 분해하고, 아가로즈겔 상에 분리하고, 나일론막(NEN)으로 옮기고, OCs 또는 Mφ로부터의³²P-표지된 cDNAs로 조사하였다(도 8). 마크로파지보다는 파골세포에서 훨씬 더 잘 발현하는 OCL178라 하는 한 클론을 확인하였다. 이클론을 추가 분석을 위해 선택하였다. 클론은 본 명세서에서 OSCAR라고 하는 신규 유전자의 단편임이 확인되었다.

OSCAR 는 OCs에서 특이적으로 발현되지만, Mφs 또는 수상돌기 세포(DCs)에서는 특이적으로 발현되지 않는다.OCL178이 파골 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자로부터 유래하는지를 시험하기 위하여, OCs 및 Mφs로부터 유래된 mRNA를³²P-표지된 OCL178을 사용하여 하이브리디제이션하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, OCL178 단편은 크기가 4.0kB, 1.8kb 및 1.0kb인 별개의 세 mRNA 종을 검출하였다. OSCAR의 발현은 골수 유래된 OCs(BMOC)에서 특이적으로 검출되었으나, Mφs 유래의 골수세포(BMM)에서는 검출되지 않았다. 또한, OCs 및 Mφs와 동일한 전구체에서 유래한 골수 유래 DCs(BMDCs)에서는 OSCAR 발현이 검출되지 않았다. TRAP 및 카텝신 K는, 이의 발현이 Mφs에서가 아닌 OCs에서 검출되므로, 본 기술분야에서 파골세포 특이 표지로 생각되는 유전자이다(예를 들어 Minkin, C., Calcif. Tissue Int., 1982, 34:285; Ek-Rylander,et al., Biochem J. 1997, 321:305-11; Chambers,et al., Cell Tissue Res., 1985, 241:671-675; Lacey,et al., Cell, 1998, 93:165-176 참조). 그러나, OSCAR와 달리, BMDCs에서도 TRAP 및/또는 카텝신 K의 발현이 검출될 수 있다(도 9 참조). 따라서, 파골 세포에서의 OSCAR 발현은 TRAP 또는 카텝신 K보다 훨씬 더 특이적이고, OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물은 본 기술분야에 공지된 다른 표지(예를 들어 TRAP 및 카텝신 K)보다 개선된 파골세포 특이적 표지임이 증명된다.

OSCAR은 OCs에서 특이적으로 발현되지만, 다른 세포에서는 특이적으로 발현되지 않는다.OSCAR mRNA 발현 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 조직으로부터의 mRNA를 노던 분석으로 분석하였다(도 10).도 10에 도시된 바와 같이, OSCAR mRNA 발현은 OCs(OCL)에서 특이적으로 검출되었으나, 근육, 신장, 뇌, 심장, 간, 폐, 장, 흉선, 지라 및 림프절을 포함하는 다른 시험 조직에서는 안되었다. 이에 비해, 본 기술분야에서 OCs에 특이적인 표지로 생각되는 TRAP 또는 카텝신 K mRNA는, 다른 세포 형태(즉, 파골세포 이외의 조직으로부터 유래한 세포)로부터 유래한 mRNA에서 검출될 수 있다. 따라서, 이러한 결과를 통해, OSCAR 발현은 파골세포에 특이적이고, OSCAR 유전자 및 이의 유전자 산물은 개선된 파골세포 특이적 표지임이 확인할 수 있다.

OSCAR은 생체 내 뿐 아니라 생체 외에서 분화된 세포에서 발현된다.RAW264.7 세포는 TRANCE 로 처리시 파골세포-유사 세포로 분화되는 것으로 나타났다(Hsuet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96:3540-3545). 도 11A-C 에 도시된 노던 블롯 분석을 통해, 이들 세포는 또한 처리 48시간 내에 OSCAR를 발현시키는 것으로 증명된다. 세포가 완전히 분화된 경우, OSCAR은 4일 후에 가장 크게 발현된다.

또한, 두개골 및 장골과 같은 파골세포 풍부 조직을 노던 블롯 분석하면, 상기 다양한 조직(예를 들어, 근육, 신장, 뇌, 심장, 간, 폐, 장, 흉선, 지라 및 림프절)에서 OSCAR 발현이 검출되지 않는다 할지라도, SOCAR mRNA는 검출된다(도 11C).

따라서, OSCAR은 분화된 파골세포에서 발현되며, 또한 생체 내 또는 생체 외에서 분화되는지와 상관없이 이러한 발현이 일어난다.

실시예 2: OSCAR은 신규한 면역글로불린(Ig)-유사 수용체를 암호화한다.

이 실시예에서는 전장의 쥐의 OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 cDNA 분자의 분리 및 특징화를 설명한다.

물질 및 방법

쥐의 cDNA 라이브러리 생성.제조업자의 프로토콜에 따라 골수-유래 숙성 파골세포로부터의 폴리A mRNA(STRATAGENE)를 사용하여 마우스 cDNA 라이브러리를 만들었다. 설명된 바에 따라 OCL178 인서트를 사용하여 스크리닝함으로써 전장 OSCAR cDNAs를 분리하였다(Sambrooket al., 1989,상기).

아미노산 서열 분석.완전한 길이의 쥐 OSCAR 아미노산 서열을 사용하여 NCBI 단백질 데이타베이스에서 대응하는 단백질 서열을 찾아냈다. 디폴트 파라미터값을 갖는 BLAST계 알고리즘을 사용하여 찾아냈다(Altschulet al.,Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402; Altschulet al., 1990, J.Mol.Biol.1990, 215:403-410).

결과 및 토론

OCL178을 사용하여 쥐의 골수 파골세포로부터 유래한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 상기 실시예 1에 기재된 1.8kb 및 1.0kb OSCAR cDNAs에 대응하는 클론을 표준 시퀀싱(sequencing) 기술에 따라 시퀀싱하였다. 이들 클론 각각으로부터의 cDNA 서열을도 1A(1.8kb OSCAR cDNA) 및도 1B(1.0kb OSCAR cDNA) 및 SEQID NOS:1 및 2 각각에 설명한다. 이들 두 핵산 서열을 비교하면, 두 클론은 3'-비번역 영역에서만 상이한 것으로 나타난다. 각 클론은,도 1C(SEQ ID NO:3)에 설명한 동일한 예상 아미노산 서열을 암호화한다. 상기 4.0kb OSCAR cDNA 를 포함하는 클론의 서열 분석에 따르면, 이 클론이 OSCAR 게놈 서열로부터의 인트론 서열을 포함하는 미처리(즉, 스플라이싱되지 않은(unspliced)) OSCAR mRNA로부터 유래한, 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 밝혀졌다.

클론 OCL178의 서열 분석을 통해, 이 클론에 포함된 cDNA가 전장 OSCAR cDNA 서열 단편에 대응한다는 것이 확인되었다. 구체적으로, OCL178에 포함된 OSCAR 핵산 서열(도 2A: SEQ ID NO:4)은,도 1C(SEQ ID NO:3)의 OSCAR 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기 161-165를 암호화하는, 전장의 쥐의 OSCAR cDNA 서열 단편에 대응한다. 이 특정 단편의 아미노산 서열은 또한도 2B및 SEQ ID NO:5에 개별적으로 설명되어 있다.

예상된 쥐 OSCAR 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은, OSCAR 가 264 아미노산 잔기의 신규한 Ig-유사 수용체임을 지시한다. 전장 쥐의 OSCAR 폴리펩티드는, 하나의 신호 펩티드 서열(아미노산 잔기 1-16에 대응), 두개의 Ig-유사 도메인 서열(각각 아미노산 잔기 17-22 및 123-228에 대응), 단일 막내외 도메인 서열(아미노산 잔기 229-247) 및 짧은 세포질 근미 서열(아미노산 잔기 248-264에 대응)을 포함한다. 이들 개별 도메인을 나타내기 위해 사용된 아미노산 잔기는 대략적인 것으로 이해해야 한다.

NCBI 핵산 및 단백질 데이타베이스의 대응 서열에 대한 BLAST 계의 알고리즘을 사용한 연구를 통해,도 1A-C(SEQ ID NOS:1-3)에 설명한 OSCAR 핵산 및 폴리펩티드 서열이 신규한 것으로 확인되었다. 이들 데이타베이스에서는, 본명세서에서 설명한 쥐의 OSCAR 서열에 대응하는 핵산 또는 단백질 서열이 전혀 확인되지 않았다. 그러나, OSCAR 폴리펩티드 서열은 두가지 다른 Ig-유사 수용체에 대해 서열 상동성이 크지 않았다. 특히, BLASTP 알고리즘을 사용한 NCBI 단백질 데이타베이스 연구를 통해, 쥐의 OSCAR 폴리펩티드(도 1C: SEQ ID NO:3)는 쥐의 PirA(기탁 번호 AAC53217.1)에 대해 26.4% 상동성 및 단백질 소 FcαR(기탁번호 P24071)에 대해 24.2% 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

OSCAR 폴리펩티드 서열의 막내외 도메인은, 상기된 바와 같은 쥐의 PirA 및 소의 FcαR를 포함하는 다른 Ig-유사 수용체에 대한 아미노산 서열 유사성을 보인다. 또한, OSCAR 폴리펩티드(도 1C 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 231)의 막내외 서열의 보존된 아르기닌의 존재는, 막내외 신호화 어댑터 모티프와의 관련 활성을 지시한다. 이러한 신호화 어댑터는, 예를 들어 바람직하게는 막내외 서열의 전부 또는 일부를 포함하여 이루어지는 OSCAR 폴리펩티드 또는 OSCAR 폴리펩티드 단편과 공동-면역침강하는 단백질을 확인함으로써, 쉽게 확인할 수 있다(상기 스크리닝 분석법 참조).

Ig-유사 수용체는 이들 수용체를 발현하는 세포의 발달 및/또는 기능 조절에 참여하는 것으로 알려져 있다. 또한, Ig-유사 수용체의 활성은 일반적으로 Ig-유사 도메인(들)에서의 특정 리간드와의 결합을 통해 매개된다. 따라서, 도 1C 및 SEQ ID NO:3의 쥐의 OSCAR 폴리펩티드 서열 분석은, OSCAR 가 OSCAR 특이 리간드(본 명세서에서 OSCAR-L라 함)와 상호작용하고, 이러한 상호작용이 파골세포의 발달 및 기능을 조절한다는 발견을 지지한다.

실시예 3: 쥐 및 인간 게놈 DNA를 쥐의 OSCAR cDNA에 하이브리디제이션한다.

이 실시예는 쥐의 OSCAR cDNA에 하이브리디제이션하는 인간 게놈 DNA의 확인을 개시한다. 또한 본 명세서에 설명되어 있는 BLAST 연구를 통하여 인간 OSCAR 게놈 DNA를 더 특징화하였다.

물질 및 방법

서던 블롯 분석.42℃에서 16시간동안 낮은 스트린젠시 하이브리디제이션 완충액(30% 포름아미드, 10mM Tris, pH7.6, 2.5×덴하르츠 용액, 5×SSC, 0.5% mg/㎖ 초음파 처리된 연어 정액 DNA)을 사용하여 서던 블롯 분석을 실시하였다. 막을 낮은 스트린젠시 세척 완충액(0.5×SSC, 1% SDS)을 사용하여 세척 1회당 20분간 50℃에서 2회 세척하였다.

결과 및 토론

쥐의 OSCAR 는 단일 유전자로부터 유래한다.쥐의 게놈 DNA를 EcoRI 또는 Bgl II 제한 효소로 분해하고, 도1C(SEQ ID NO:3)에 설명되어 있는 전장 쥐의 OSCAR 폴리펩티드 서열을 암호화하는³²P-표지된 cDNA를 사용하여 서던 블롯 분석으로 분석하였다. 이들 결과에 따르면, 상기된 4.0kb, 1.8kb 및 1.0kb 선택적으로 스플라이싱된 cDNAs에서 확인된 쥐의 OSCAR 서열은, 단일 쥐의 유전자의 선택적으로 스플라이싱된 전사체인 것으로 나타난다.

인간 게놈 DNA를 쥐의 OSCAR 핵산에 하이브리디제이션한다.

인간 게놈 DNA 를 또한 EcoRI 및 BglII 제한 효소로 분해하고, 상기 쥐의 게놈 DNA(상기됨)를 분석하기 위하여 사용된 것과 동일한 전장 OSCAR cDNA 탐침 및 하이브리디제이션 조건을 사용하여, 서던 블롯 분석으로 분석하였다. 쥐의 OSCAR cDNA 탐침을 인간 게놈 DNA의 약 1.65kb EcoRI 단편 및 약 5.5kb 단편과 하이브리디제이션한다(도 12B)대 밝혀진다. 따라서, 본 발명의 쥐의 OSCAR 핵산 분자에 하이브리디제이션함으로써 검출 및 확인 가능한 인간 OSCAR 상동체도 존재한다.

인간 OSCAR 유전자의 확인 및 특징화.BLASTN 알고리즘을 디폴트 파라미터와 함께 사용하여 NCBI 핵산 데이타베이스를 연구하고도 1A-B(SEQ ID NOS:1-2)에 도시된 쥐의 SCAR cDNA 서열과 상동성을 갖는 서열을 확인하였다. 이 데이타베이스는 다수의 공지된 인간 유전자의 핵산 서열을 포함할 뿐 아니라 인간 게놈 서열 일부도 포함한다.

BLAST 연구를 통해, 인간 염색체 19 클론 CTD-3093(GenBank 기탁 번호 AC012314.5;GI:711547)에 포함되어 있는 뉴클레오티드 서열의 일부가 쥐의 OSCAR cDNA 서열과 상동성을 공유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 인간 OSCAR 유전자는 이 염색체 상에 위치한다. 이 게놈 인간 OSCAR 핵산 서열의 엑손은, 인간 염색체 19 서열을 쥐의 OSCAR cDNA 서열과 비교함으로써 확인되었다.

도 7A-D및 SEQ ID NO:12 는 신규한 인간 OSCAR 유전자를 포함하는 인간 염색체 19 상의 영역의 뉴클레오티드 서열을 설명한다. 특히 SEQ ID NO:12 및도7A-D의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이타베이스에 기탁된 인간 염색체 19 클론 CTD-3093 서열(기탁번호 AC012314.5; GI:7711547)로부터의 뉴클레오티드 117001-124920 서열에 대응한다. 이 염색체 영역 내에 포함된 신규한 OSCAR 게놈 서열의 엑손은도 7A-D의 대문자로 표시되며, OSCAR 유전자의 인트론 서열은 소문자로 나타낸다.

이 신규한 OSCAR 게놈 유전자의 인트론/엑손 경계의 뉴클레오티드 잔기의 수는 또한 SEQ ID NO:12의 뉴클레오티드 잔기 수에 관한 상기 표 1에 나타낸다.

인간 OSCAR 유전자를 더 특징화하기 위하여, 인간 파골세포로부터 유래한 cDNA 라이브러리를 쥐의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기한 것과 유사한 기술을 사용하여 스크리닝하였다. 인간 OSCAR의 세개의 스플라이싱된 변형체 또는 동질이상체를 확인하였다. 이들 세개의 동질이상체는 본 명세서에서 각각 C18 인간 OSCAR 동질이상체, C16 인간 OSCAR 동질이상체 및 C10 인간 OSCAR 동질이상체라 한다. 이들 세개의 동질이상체의 cDNA 서열은도 3A및 SEQ ID NO:6(C18 인간 OSCAR 동질이상체),도 4A및 SEQ ID NO:8(C16 인간 OSCAR 동질이상체) 및도 5A및 SEQ ID NO:8(C10 인간 OSCAR 동질이상체)에 설명한다. 이들 세개의 동질이상체 각각으로 암호화된 OSCAR 폴리펩티드의 예상된 아미노산 서열은 또한 본 명세서의도 3B및 SEQ ID NO:7(C18 인간 OSCAR 동질이상체),도 4B및 SEQ ID NO:9(C16 인간 OSCAR 동질이상체) 및도 5B및 SEQ ID NO:11(C10 인간 OSCAR 동질이상체)에 제공된다. 이 서열은 이후에 경미한 시퀀싱 수정만으로 재시퀀싱 및 확인되었다. 특히 인간 OSCAR C18 동질이상체의 cDNA(도 3A및 SEQ ID NO:6) 중 핵산 잔기 328은 원래 시퀀싱된 티민이라기보다는 구아니딘(G)로 확인되었다. 이 수정을 통해 C18 스플라이스 변형체의 예상된 아미노산 서열(도 3B및 SEQ ID NO:7)에 경미한 변화가 일어나는데, 이 중 아미노산 잔기 97이 원래 예상된 이소류신(I 또는 Ile)이라기보다는 세린(S 또는 Ser)이다. C18 동질이상체의 수정된 핵산 및 아미노산 서열은 각각도 3A 및 3B및 SEQ ID NOS:6 및 8에 나타낸다.

유사하게, 인간 OSCAR C10 동질이상체 cDNA(도 5A및 SEQ ID NO:10)의 핵산 잔기 295는 원래 시퀀싱된 티민이라기보다는 구아니딘(G)로 확인되었다. 이 수정을 통해 C10 스플라이스 변형체의 예상된 아미노산 서열(도 5B및 SEQ ID NO:11)에 경미한 변화가 일어나는데, 이 중 아미노산 잔기 86이 원래 예상된 이소류신(I 또는 Ile)이라기보다는 세린(S 또는 Ser)이다. C10 동질이상체의 수정된 핵산 및 아미노산 서열은 각각도 5A 및 5B및 SEQ ID NOS:10 및 11에 나타낸다.

이 인간 및 쥐의 OSCAR 폴리펩티드 서열의 정렬(도 6)을 통해, 이들 서열이 고도의 상동성을 공유한다는 것이 확인된다. 특히, 이 두 서열은 74.6%(즉, 약 75%) 상동인 것으로 밝혀졌다.

실시예 4: OSCAR의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질은 파골세포의 돌연변이 및 활성을 조절한다.

이 실시예에는 본 발명의 OSCAR 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 특정 융합 폴리펩티드를 기재한다. 이 실시예에는 또한 이러한 융합 폴리펩티드가 OSCAR 특이적인 리간드를 결합시킬 수 있으며, 파골세포 활성을 조절하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 증명하는 예비 실험을 기재한다.

물질 및 방법

FACS 분석. 문헌(Sharrow, Chapters 5.1-5.2 in Current Protocols in Immunology, Vol. I(Coligan et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc; 및 Kevinet al.,Chapter 5.3 in Current Protocols in Immunology, Vol. I(Coliganet al., eds.) John Wiley & Sons, Inc.)에 기재된 통상적인 방법에 따라 FACS 분석을 실시하였다.

융합 단백질의 생성.OSCAR 의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 하기와 같이 생성하였다. PCR 을 사용하여 허큘라제(Herculase)(STRATAGENE)로 적절한 OSCAR 도메인 및 인간 IgG1 Fc 부분을 증폭하였다.

pcDNA의 OSCAR-Fc의 생성. 도 1C(SEQ ID NO:3; 아미노산 잔기 1-228)에 설명한 쥐의 OSCAR 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열을, 5'OSCAR-Met-RI 및 3'-OSCAR-Ec-Bg1 ii(각각 SEQ ID NOS:13-14)라 하는 프라이머를 사용하여 OSCAR cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 EcoRI 및 BglII로 분해하였다.

인간 IgG1의 Fc 영역을 5'-인간 IgG1(SEQ ID NO:15) 및 3'-인간 IgG1(SEQ ID NO:16)라 하는 프라이머를 사용하여 인간 cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. 이 두번째 PCR 산물을 BglII 및 Xbal로 분해하였다. 두 PCR 반응의 분해 산물을 이어서 EcoRI 및 XbaI을 사용하여 pcDNA1 발현 벡터 중에 결찰하였다.

사용된 프라이머의 핵산 서열은 다음과 같았다.

pMT/V5-His의 OSCAR-Fc의 생성.OSCAR-Fc cDNA 를 초파리 발현 벡터인 pMT/V5-His(Invitrogen)에 EcoRI 및 XbaI를 사용하여 결찰하였다.

pGEX6p-1의 OSCAR-Fc의 생성. 도 1C(SEQ ID NO:3; 아미노산 잔기 1-228)에 설명한 OSCAR 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열을, 5'OSCAR-Fc-HR(SEQ ID NOS:17) 및 3'-OSCAR-Ec-STOP-XhoI(SEQ ID NOS:18)라 하는 프라이머를 사용하여 OSCAR cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI로 분해하고, EcoRI 및 XhoI를 사용하여 pGEX6p-1 벡터에 결찰하였다. 벡터를 IPTG 및 X-gal 도입법을 사용하여 대장균 BL21 주 세포에 트랜스펙션 및 발현시켰다(예를 들어 Sambrooket al., 1989, 상기 참조).

사용된 프라이머의 핵산 서열은 다음과 같았다.

pGEX6p-1의 GST-F-OSCAR의 생성. 도 1C(SEQ ID NO:3)에 설명한 OSCAR 폴리펩티드의 첫번째 Ig-유사 도메인(즉, 아미노산 잔기 17-122)을 암호화하는 핵산 서열을, 5'-OSCAR-Ec-HR(SEQ ID NOS:17, 상기됨) 및 3'-OSCAR-EcI-STOP-XhoI(SEQ ID NOS:19)라 하는 프라이머를 사용하여 OSCAR cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI로 분해하고, pGEX6p-1 벡터에 결찰하였다. 벡터를 IPTG 및 Xgal 도입법을 사용하여 대장균 BL21 주 세포에 트랜스펙션 및 발현시켰다(예를 들어 Sambrooket al., 1989, 상기 참조).

사용된 프라이머의 핵산 서열은 다음과 같았다.

pGEX6p-1의 GST-S-OSCAR의 생성. 도 1C(SEQ ID NO:3)에 설명한 OSCAR 폴리펩티드의 두번째 Ig-유사 도메인(즉, 아미노산 잔기 123-228)을 암호화하는 핵산 서열을, 5'-OSCAR-EcII-HR(SEQ ID NOS:20) 및 3'-OSCAR-Ec-STOP-XhoI(SEQ ID NOS:18, 상기됨)라 하는 프라이머를 사용하여 OSCAR cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI로 분해하고, pGEX6p-1 벡터에 결찰하였다. 벡터를 IPTG 및 Xgal 도입법을 사용하여 대장균 BL21 주 세포에 트랜스펙션 및 발현시켰다(예를 들어 Sambrooket al., 1989, 상기 참조).

사용된 프라이머의 핵산 서열은 다음과 같았다.

OSCAR-Fc의 정제.OSCAR-IgG를 상기된 바와 같은 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 배양액 상등액으로부터 정제하였다(Sambrooket al., 1989, 상기됨).

파골세포 성숙 분열 분석법.문헌(Sudaet al., Methods Enzymolozy 1977, 282:223-35)에 기재된 바와 같이 와일드 타입 및 TRANCE-녹아웃 마우스로부터 파골세포를 분리하였다. 파골세포 및 조혈제 전구체의 공동-배양 실험에서, 골수 세포(1×10⁵세포) 및 파골세포(1×10⁴세포)를, 96 웰 플레이트(0.2㎖/웰) 중에서 1×10^-7M 또는 1×10^-8M 1α,25(OH)₂D₃의 존재 하에 10% FBS를 포함하는 α-MEM 에서 공동-배양하였다. 20㎍/웰의 OSCAR-IgG 또는 인간 IgG1을 배양액에 첨가하여 파골세포의 분화동안의 OSCAR의 역할을 관찰하였다. 160㎕의 전 배지를 새 배지로 대체함으로써 배양액을 3일마다 공급하였다. 6 또는 7일동안 배양한 후, 세포를 TRAP(SIGMA)을 위해 문헌(Waniet al., Endocrinology 1999, 140:1927-1935)에 따라 고정 및 염색하였다. 웰 각각으로부터 세개 이상의 핵으로 TRAP(+) 다핵화된 파골세포를 계수하였다.

결과 및 토론

OSCAR-L은 조골세포 표면 상에서 발현된다.쥐의 두개관으로부터 유래한 일차 조골세포를, 아이소타입-조절 인간 IgG1 단백질(도 13A) 또는 상기된 물질 및 방법 부분(도 13B)에 기재된 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드로 염색한 후(즉, 배양), PE-접합된 항-인간 IgG1 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 FACS로 분석하여 이들 세포와 관련있는 PE-형광 수준을 검출하였다.도 13A-B의 도수분포도에 결과를 도시한다. 이들 도수분포도는 구체적으로, 각 실험에서, 특정 수준의 PE-형광(수평축)을 갖는 관찰된 세포수(수직축)를 나타낸다. 관찰된 형광 수준이 더 높은 세포일수록 이 세포에 결합하고 있는 PE-접합된 항체의 양이 더 많은 것을 나타낸다. 차례로, PE-접합된 항-인간 IgG 항체는, 세포 표면에 결합되어 있는 hIgG(도 13A) 또는 OSCAR-Ig(도 13B)와의 결합(예를 들어 OSCAR 특이적 리간드에 대한 결합)을 통해 세포에 직접 결합된다.

IgG1 대조구와 함께로 배양된 세포 상의 PE 형광에 비하여, 세포가 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드와 함께 배양되는 경우에 PE 형광 수준은 크게 증가하였다. 따라서, 이 데이타는, 조골 세포는 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물(즉, OSCAR 리간드)을 발현한다는 것을 증명한다. 특히, IgG1 폴리펩티드는 조골세포에 결합하지 않았으므로, 이러한 세포에 의해 발현되는 OSCAR 리간드는, 이들 실험에 사용되는 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드의 OSCAR 폴리펩티드 서열에 특이적으로 결합하고, 융합 폴리펩티드의 IgG1 서열에 결합하지 않는다.

조골 세포를 또한, 조골세포 및 파골 세포 활성을 증가시키는 것으로 각각 공지되어 있는 비타민 D₃또는 부갑상선 호르몬으로 처리하는 동일한 실험에서, PE형광 수준은 크게 바뀌지 않았다. 따라서, OSCAR 리간드의 발현은 이러한 화합물에 의해 영향받지 않는다.

OSCAR-Ig 첨가는 파골 세포 활성을 조절한다.파골세포 및/또는 조골세포 활성을 조절하는 OSCAR 폴리펩티드의 능력을 실험하기 위하여, 파일럿 실험을 실시하였다. 파골 세포 성숙 분석법에서 쥐의 골수 및 조골 세포를 상기된 바와 같이 공동-배양하였다. 지정된 단일 시점에서 공동-배양액을 관찰하니, 아이소타입-대조구 인간 IgG1 단백질로 처리되고 TRAP 염색된 공동-배양액에 성숙(즉, 다핵화) 파골세포가 존재하지 않았다. 공동-배양된 골수 및 조골 세포를 비타민 D₃(100nM) 및 대조구 IgG1 단백질로 더 처리하면, TRAP 염색에 의해 검출되는 바와 같이 다핵화된 파골세포의 형성이 유도된다. 공동 배양된 골수 및 조골 세포를 낮은 수준의 비타민 D₃(10nM)으로 처리하면, 파골 전구체 세포가 다소 형성되지만, 성숙 및 다핵화된 파골세포는 TRAP 염색에 의해 전혀 검출되지 않았다. 이러한 결과는, 조골 세포의 활성화된 TRANCE 에 대한 비타민 D₃의 공지된 능력 때문으로 예상되며, 이에 의해 파골 세포 성숙이 유도된다. 실제, TRANCE 녹-아웃 조골 세포가 골수 세포와 공동배양되는 대조 실험에서, 유사한 수준의 비타민 D₃로 처리하면 파골 세포 성숙에 영향이 전혀 없었다.

대조적으로, 상기된 바와 같은 비타민 D₃(10 또는 100nM) 및 OSCAR-Ig 융합 폴리펩티드로 공동-배양된 세포를 처리하면, 상기된 대조구 실험에 비하여, 형성된성숙 및 다핵화된 파골 세포의 수가 크게 증가하였다. 이들 결과는 도 14에 정량적으로 도시한다.

TRAP(+) 다핵화된 세포를 관찰하면 파골세포 성숙이 나타난다. 따라서, OSCAR 융합 폴리펩티드의 존재하의 이들 세포의 증가된 수는, 어떤 점에 있어서는 파골 세포 활성이 이 특정한 파일럿 실험의 특정한 조건 하에서 조절되었음을 제시한다. 어떠한 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 제한되지 않고, 이 실험에 사용된 가용성 OSCAR 폴리펩티드는 조골 세포에 의해 발현되는 OSCAR-특이적 리간드에 경쟁적으로 결합함으로써, OSCAR-특이적 리간드 및 골수 세포(예를 들어, 골수 세포의 파골 전구 세포 및 미성숙 파골세포)에 의해 발현되는 OSCAR 폴리펩티드 간의 상호작용을 방해하는 것으로 생각된다.

따라서, 이들 실험의 데이터는, 본 발명의 OSCAR 특이적 리간드 및 OSCAR 폴리펩티드를 사용하여 파골 세포의 성숙 및/또는 활성을 조절함으로써, 골조직의 성장, 발달, 치유, 분해, 재흡수 또는 항상성과 관련있는 처리를 조절할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: OSCAR의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질은 파골세포의 성숙 및 활성을 억제한다.

이 실시예에는, OSCAR이 파골 세포 활성을 조절할 수 있음을 나타내는 예비 데이타(상기 실시예 4에 기재) 이후에 실시되었던, 추가적이고 더 결정적인 실험을 기재한다. 특히, 파골 세포의 동역학 측정으로부터의 데이타를 나타낸다. 이들 데이타는, 파골 세포 활성을 조절하는 OSCAR 융합 폴리펩티드의 능력을 더 특징화한다.

물질 및 방법

OSCAR-Fc 융합 단백질의 생성 및 정제.실시예 4에 상기한 바와 같이 OSCAR-Ig 융합 단백질을 제조하였다.

파골세포 성숙의 동역학 측정.골수 세포 및 조골 세포를 와일드-타입 및 TRANCE 녹-아웃 마우스로부터 분리하고, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트에서 공동-배양하였다. 일반적인 공동-배양액보다 더 많은 수의 파골 세포 특이적 전구 세포를 포함하는 플로터 세포 배양액을 또한 제조하였다. 요약하면, 전체 골수 배양액(3×10⁵세포)을 5ng/㎖의 마크로파지-콜로니 자극 인자(M-CSF)로 처리한 후 얻어지는 마크로파지 세포를 제거함으로써, 플로터(floater) 배양액을 제조하였다.

10nM 비타민 D₃을 배양액에 첨가하여 파골 세포 성숙을 자극하였다. 20㎍/㎖의 OSCAR-Ig 또는 인간 IgG1을 또한 배양액에 첨가하여, 파골세포 분화동안 OSCAR의 역할을 관찰하였다. 10nM 비타민 D₃만 넣거나(즉, OSCAR 또는 IgG1이 없음), 비타민 D₃또는 단백질을 첨가하지 않고 배지 안에서 배양한 대조구 배양액을 또한 제조하였다. 6일 이상 배양한 후, 웰 안의 TRAP(+) 다핵화된 세포의 수를 실시예 4에서 상기된 바와 같이 매일 계수하였다.

상아질 재흡수 분석법.골 재흡수 활성을 나타내는 상아질 재흡수 분석법을 앞서 기재한 바와 같이 실시하였다. 예를 들어 문헌(Tamuraet al., J. BoneMiner. Res.1993, 8(8): 953-60; 및 Suda et al., Methods in Enzymology1997, 282:223-25)을 참조한다.

요약하면, 마우스 조골세포 및 골수 세포의 공동-배양액을 상아질 절편 상에 10nM 비타민 D₃의 존재 하에 상기와 같이 제조하였다. 20㎍/㎖의 OSCAR-IgG 또는 인간 IgG1을 배양액에 첨가하여 파골세포 활성(즉, 골 또는 상아질 재흡수)에 미치는 OSCAR의 역할을 관찰하였다. 10nM 비타민 D₃단독 존재 하에서나(즉, OSCAR-Ig 또는 IgG1 없이) 비타민 D₃또는 융합 단백질에 노출 없이, 상아질 절편 상에 대조구 배양액을 또한 성장시켰다.

6일동안 상아질 절편을 배양한 후, 세포를 TRAP를 위해 염색하여 다핵화된 파골세포를 검출하였다. 상아질 절편의 재흡수 피트는 광 현미경으로 가시화되었다.

결과 및 토론

OSCAR-Ig의 첨가는 TRAP(+) 다핵화된 세포의 수를 감소시킨다.OSCAR이 파골세포의 성숙 및/또는 활성을 조절할 수 있는 방법을 더 특징화하기 위하여, OSCAR 폴리펩티드의 존재 및 부재시에 모두, 몇일에 걸쳐 파골 세포 성숙을 조사하는 동역학 실험을 실시하였다. 일반적으로 성숙한 파골 세포는 배양액 중에 생육되지 않으므로, OSCAR이 파골 세포 상에 가질 수 있는 작용을 완전히 특징화하기 위하여, 동역학 실험이 필요하다. 따라서, 배양액 중에 관찰되는 성숙한(예를 들어 다핵화된) 파골 세포 수의 최초 증가 후, 후-성숙 세포 사망으로 인한 수의 감소에 의해, 파골 세포를 자극하는 인자가 특징화될 수 있다.도 15A-15C에는, 공동-배양된 쥐의 골수 및 조골세포(도 15A-15B)와, 더 많은 파골세포-특이적 전구 세포 집단을 포함하는 플로터 세포 배양액(도 15C)를 사용한 동역학 실험에 얻어진 데이터를 도시한다.

정량적으로도 15A에 도시된 바와 같이, 다핵화 TRAP(+) 세포의 수로 나타나는, 전체 골수 배양액 중의 비타민 D₃-자극된 파골세포 성숙은, 처리 약 7일 후에 급격하게 최고에 다다른다. 그러나, 이러한 최초 증가 후, 8일 및 9일에 각각 빠르게 증분 감소가 일어났다. 이와 대조적으로, 비타민 D₃및 OSCAR-IG 융합 폴리펩티드로 공동배양액을 처리하면, 대조구 실험에 비해 6 내지 9일에 형성된 TRAP(+) 세포의 수가 크게 감소하였다.

자극된 파골세포 성숙이 최고에 다다른 처리 7일 후 공동-배양액에 존재하는 성숙한(즉, TRAP(+), 다핵화된) 세포의 수를 나타내는 막대 그래프를도 15B에 도시한다. 비타민 D₃단독 또는 비타민 D₃의 존재 하에 대조구 IgG 단백질과 함께 배양된 세포는 성숙한 파골세포의 수가 크게 상승한다(웰당 약 150-200). 성숙한 파골세포의 수는 비타민 D₃및 OSCAR-Ig 융합 단백질과의 공동-배양약에서 크게 감소한다(즉, 웰당 50 세포 이하).

플로터 세포 배양액의 동역학 곡선(도 15C)은, 처리 약 7일 후 및 적어도 9일까지 연속하여 비타민 D₃에 의해 유도된 TRAP(+) 세포의 수가 유사하나 점차 더증가한다. 플로터 세포 배양액을 비타민 D₃및 대조구 인간 IgG1 단백질로 처리하면 예상된 바와 같이 유사한 성장 곡선이 얻어진다. 그러나, 플로터 세포 배양액을 비타민 D₃및 OSCAR-Ig 융합 단백질로 처리하면,도 15A에 도시된 공동-배양된 골수 및 조골 세포 배양액에서 관찰되는 저해와 유사한 방식으로, 파골 세포 성숙이 크게 저해된다.

OSCAR-Ig는 파골 세포에 의한 상아질 재흡수를 저해한다.앞서 기재된 바와 같이 상아질 재흡수 분석법 실험을 또한 실시하여(예를 들어, Yasudaet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1998, 95:3597-3602; 및 Tamuraet al., J. Bone Miner. Res.1993, 8:953-960 참조), OSCAR가 파골세포 및/또는 조골세포 활성에 미치는 효과를 더 완전히 특징화하였다. 더 구체적으로, 분석법은 OSCAR가 골 또는 상아질 재흡수에 미치는 효과를 검출한다.도 16의 패널 A-E는 상아질 절편 상에 공동-배양된, TRAP(+) 염색된 쥐의 조골 세포 및 골수 세포의 현미경사진을 도시한다.도 16의 패널 F-J는 대응하는 상아질 절편의 현미경사진을 도시한다. 현미경사진의 검은 얼룩은 상아질이 재흡수된 절편의 피트(pits)를 나타낸다.

예상대로, 비타민 D₃없이 상아질 절편 상에 공동-배양된 세포(도 16A)는 파골 세포 성숙이 거의 나타나지 않거나 전혀 나타나지 않아, TRAP(+) 세포가 결핍되었음을 나타낸다. 유사하게, 대응하는 상아질 절편 상에 재흡수가 전혀 나타나지 않았다(도 16F). 대조적으로, 10^-8M의 비타민 D₃단독(도 16B) 또는 대조구 IgG 단백질(20㎍/㎖)과 함께 10^-8M의 비타민 D₃(도 16E)에 노출되는 경우에, 상아질 절편 상의 공동-배양액은 TRAP(+) 얼룩이 크게 증가한다. 상아질 재흡수를 나타내는 검은 얼룩이 또한 대응하는 상아질 절편 상에서 관찰된다(각각 도 16G 및 16J). 이들 재흡수 피트는 대응하는 세포 배양액의 TRAP(+) 염색된 영역과 상관관계가 있으며, 예상대로 파골세포 성숙 증가는 재흡수 증가와 상관관계가 있는 것으로 확인된다.

이들 양성 대조구에서 관찰되는 것과 대조적으로, 10^-8M의 비타민 D₃와 함께 OSCAR-Ig(20㎍/㎖)와 배양된 상아질 상의 공동-배양액은 TRAP(+) 얼룩이 거의 없거나 전혀 없고(도 16C), 상아질 재흡수도 거의 없거나 전혀 없다(도 16H). 따라서, OSCAR-Ig로 처리하면 실제 파골세포 활성이 저해되고, 더 구체적으로, 골 또는 상아질 재흡수가 저해된다.

음성 대조구 실험을 또한 실시하여, OSCAR-Ig로 얻은 결과가 사실임을 입증하였다. 구체적으로, 조골 세포 및 골수 세포의 공동-배양액을 10^-8M의 비타민 D₃및 파골 세포 활성에 대해 공지된 저해제인 쥐의 TRANCE 저해제(mTR-Fc)와 함께 배양하였다(Fulleret al., J. Exp. Med.1998, 188:997-1000). 예상대로, 이들 공동-배양액(도 16D)에서 TRAP(+) 얼룩이 거의 또는 전혀 보이지 않았으며, 일어난다 할지라도 상아질 재흡수가 매우 약간 일어났다(도 16I).

도 17에 이들 상아질 재흡수 실험 결과를 정량적으로 나타낸다. 구체적으로, 이 도면의 막대 그래프는 공동-배양된 조골세포 및 골수 세포 각각의 절편 상에 계수되는 상아질 재흡수 피트의 평균 수치를 보여준다. 비타민 D₃단독(102.7±16.8)으로나 또는 대조구 IgG1 단백질(114.7±22.2)과 함께 배양된 절편 상에서 평균적으로 100 피트 이상이 관찰되었다. 대조적으로, OSCAR-Ig로 배양하면 인수 10 이상 재흡수가 저해되며, 이들 각 절편 상에서 10 피트 이하로 관찰된다(7±2).

따라서, 이들 실험 데이타를 통해, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드 및 OSCAR-특이적 리간드를 사용하여, 예를 들어 본 명세서에 기재된 상아질 재흡수 분석법을 통해 측정 또는 평가 가능한 골 또는 상아질 재흡수와 같은 활성을 포함하여, 파골 세포의 성숙 및/또는 활성을 조절할 수 있음을 확인할 수 있다. 특히, 어떤 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 제한되지 않고, 이 실험에 사용된 가용성 OSCAR 폴리펩티드는 조골 세포에 의해 발현되는 OSCAR-특이적 리간드에 경쟁적으로 결합함으로써, 골수 세포(예를 들어 파골 전구 세포 또는 골수 세포 내 미성숙 파골 세포)에 의해 발현되는 OSCAR 폴리펩티드가 활성화되는 것을 막을 수 있는 것으로 생각된다. 결과적으로, 일반적으로 OSCAR가 이의 특이적 리간드에 결합함으로써 활성화 또는 자극되는, 파골세포의 성숙 및 활성이 저해된다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하면, 골조직의 성장, 발달, 치유, 분해, 재흡수 또는 항상성과 관련된 과정을 포함하는(이에 제한되지 않는다) 파골 세포 활성과 관련있는 과정이 쉽게 조절될 수 있다.

실시예 6: OSCAR-Ig 융합 단백질의 파골세포 성숙을 저해하는 능력은 종들에 교차-반응성이 있다 .

상기 실시예 4 및 5는 마우스로부터의 OSCAR 핵산 및 아미노산 서열을 사용하여 가용성 OSCAR 폴리펩티드(OSCAR-Ig 또는 mOSCAR-Ig라 함)를 생산 및 분리하는 것을 설명한다. 이들 실시예는 또한 쥐 세포의 성숙 및 활성을 조절하기 위하여 가용성 OSCAR 폴리펩티드를 사용하는 것을 증명한다.

본 실시예는 인간으로부터의 OSCAR 핵산 및 아미노산 서열을 사용하여 가용성 OSCAR 폴리펩티드(hOSCAR-Ig라 함)를 생산 및 분리하는 것을 설명하며, 인간 세포의 성숙 및 활성을 조절하기 위하여 가용성 인간 OSCAR 폴리펩티드를 사용하는 것을 증명한다. 또한, OSCAR가 다른 종들에 교차-반응성이 있음을 보여주는 데이터를 제시한다. 특히, 본 실시예는 인간 세포의 성숙 및 활성을 조절하기 위하여 가용성 쥐의 OSCAR 폴리펩티드를 사용하는 것을 증명한다. 유사하게, 쥐 세포의 성숙 및 활성을 조절하기 위하여 인간 OSCAR 폴리펩티드를 사용하는 것도 기재한다.

물질 및 방법

pcDNA의 hOSCAR-Fc의 생성

도 3A(SEQ ID NO:6, 아미노산 잔기 1-219)에 설명한 인간 OSCAR 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 5h'OSCAR-Met-XhoI 및 3'-hOSCAR-Ec-HindIII(각각 SEQ ID NOS:21-22)라 하는 프라이머를 사용하여 hOSCAR cDNA 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 XhoI 및 HindIII로 분해하였다.

트롬빈-S 및 트롬빈-AS(각각 SEQ ID NOS: 23-24)라 하는 프라이머를 사용하여 상기 생성된 산물을 더 증폭함으로써, 말단 인간 OSCAR에 트롬빈 부위를 삽입하였다.

5'-인간 IgG1(SEQ ID NO: 15) 및 3'-인간 IgG1(SEQ ID NO: 16)라 하는 프라이머를 사용하여 인간 cDNA 플라스미드로부터 인간 IgG1의 Fc 영역을 PCR 증폭하였다. 이 세번째 PCR 반응 산물을 Bg1II 및 XbaI로 분해하였다. 두 PCR 반응으로부터 분해된 산물을 Ex6 및 XbaI를 사용하여 pcDNA1 발현 벡터에 결찰하였다.

사용되는 프라이머의 핵산 서열은 다음과 같다:

pMT/V5-His의 hOSCAR-Fc의 생성.hOSCAR-Fc cDNA를 초파리 발현 벡터인 pMT/V5-His(Invitrogen)에 XhoI 및 XbaI를 사용하여 결찰하였다.

hOSCAR-Fc의 정제.hOSCAR-IgG를 설명된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 배양액 상등액으로부터 정제하였다(Sambrooket al., 1989, 상기됨).

인간 단핵구 배양액의 생성.백혈구를 연속 여과 백혈구분리반출법으로Leukopak 필터를 사용하여 수집한 후, 대향류 원심성 세정(counterflow centrifugal elutriation)하여 덩어리로 분리된 개별 단편을 얻는다. CD14+ 세포의 약 90% 순도를 포함하는 단편이 단핵구이다. 이 단핵구를 문헌(Maatsuzakiet al., Biochem. Biophys. Res. Comm.1998, 246(1):199-204)에 기재된 바와 같이 인간 파골세포로 분화되도록 유지 및 유도하였다.

쥐의 골수 세포 배양.쥐의 조골 세포 및 골수 세포의 공동-배양액을 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다.

상아질 재흡수 분석법.상기된 바와 같이 제조된 인간 단핵구 세포 배양액을 사용하여, 통상적인 프로토콜(상기 실시예 5 및 문헌(Tamura et al., J. Bone Miner. Res:1993, 8(8):953-960)을 참조)에 따라 상아질 재흡수 분석법을 실시하였다.

결과 및 토론

OSCAR-Ig는 인간 파골세포의 성숙 및 활성을 저해한다. 가용성 쥐 및 인간 OSCAR 폴리펩티드(각각 mOSCAR-Ig 및 hOSCAR-Ig)를 사용하여 상기 실시예 4 및 5에 기재된 실험과 유사한 실험을 실시하여, 인간 세포의 성숙 및/또는 활성을 조절하는 OSCAR 폴리펩티드의 능력을 특징화하였다. 구체적으로, M-CSF(30ng/㎖), TRANCE(200ng/㎖) 및 20ng/㎖의 가용성 hOSCAR-Ig 또는 mOSCAR-Ig의 존재하에 인간 단핵구 세포를 배양하고, TRAP(+) 다핵화된 세포를 노출 5 및 10일 후에 계수하였다. 이들 데이타를도 18A(노출 5일 후) 및도 18B(노출 10일 후)에 각각 그래프로 나타낸다. M-CSF 및 TRANCE 단독(즉, OSCAR-Ig 없이) 또는 M-CSF, TRANCE 및인간 IgG1 폴리펩티드와 함께 인간 단핵구를 배양하는 대조 실험도 실시하였다. 음성 대조구에서, M-CSF 단독(즉, TRANCE 또는 OSCAR-Ig 없이) 및 M-CSF, TRANCE 및 공지된 파골세포 저해제 TR-Fc와 함께 인간 단핵구 세포를 배양하였다(상기 실시예 5 참조).

예상대로, M-CSF 단독(M) 또는 M-CSF, TRANCE 및 TR-Fc(MT-TR-Fc)와 함께 배양된 세포 배양액에서, TRAP(+) 다핵 세포가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.도 18A 및 18B에서 각각 레인 1, 5 및 6을 참조한다. 대조적으로, M-CSF 및 TRANCE 단독(MT;도 18A 및 18B의 레인 2), 또는 M-CSF, TRANCE 및 IgG1(MT+IgG;도 18A 및 18B의 레인 5)와 함께, 인간 단핵구 세포를 배양하였다. 그러나, hOSCAR-Ig(도 18A 및 18B의 레인 3)와 함께 단핵구를 배양하면 이러한 상승된 파골세포 성숙 수준이 저해되었다. mOSCAR-IgG(도 18A 및 18B의 레인 4)와 함께 배양하면 유사한 효과가 나타났다. mOSCAR-Ig로 배양한 10일 후에는 hOSCAR-Ig와 비교하여(각각도 18B의 레인 4 및 3) TRAP(+) 다핵화된 세포가 다소 많이 나타났다. 그럼에도 불구하고, mOSCAR-Ig로 배양한 10일 후에 나타난 TRAP(+) 다핵 세포의 수는, 인간 세포가 M-CSF 및 TRANCE 단독 또는 IgG1과 함께 배양된 경우에 나타나는 수 이하의 차수 이상이다. 인간 및 쥐의 OSCAR 폴리펩티드는 모두 인간 파골세포의 성숙 및 활성화를 효과적으로 조절할 수 있다.

이들 세포 배양액으로부터 현미경사진은도 19(노출 5일 후) 및도 20(노출 10일 후)에 도시한다. M-CSF 및 TRANCE(도 19B 및 20B) 또는 M-CSF, TRANCE 및 IgG1(도 19F 및 20F)와 함께 배양된 배양액은 다핵 세포(화살표로 표시)가 더 많은반면, hOSCAR-Ig(도 19C 및 20C) 또는 mOSCAR-Ig(도 19D 및 20D)로 배양된 배양액으로부터의 현미경사진에서는 다핵 세포가 거의 또는 전혀 보이지 않았다.

인간 단핵구 세포 배양액을 사용하여 상아질 재흡수 분석법(상기 실시예 5에 기재)을 또한 실시하여, 인간 파골세포 활성을 조절하는 쥐의 OSCAR 폴리펩티드의 능력을 확인하였다. 이 실험 결과를도 21A-J에 도시한다. 구체적으로, 도 21의 패널 A-E에 30ng/㎖ M-CSF(도 21A), 30ng/㎖ M-CSF 및 200ng/㎖ TRANCE(도 21B), M-CSF(30ng/㎖), TRANCE(200ng/㎖) 및 20㎍/㎖ OSCAR-Ig(도 21C), M-CSF(30ng/㎖), TRANCE(200ng/㎖) 및 5㎍/㎖의 TR-Fc(도 21D) 및 M-CSF(30ng/㎖), TRANCE(200ng/㎖) 및 20㎍/㎖ hIgG1(도 21E)의 존재 하에, 상아질 절편 상에 배양된 인간 단핵구 세포의 현미경사진을 도시한다.도 21F-J에,도 21A-E의 세포 배양액이 각각 세척된 후의 상아질 절편의 현미경사진을 도시한다. 이들 현미경사진의 검은 얼룩은 상아질이 재흡수된 피트를 나타낸다.

쥐의 세포를 사용한 상아질 재흡수 실험에서 관찰된 것과 유사하게(상기 실시예 5 및도 17A-17J참조), M-CSF 단독(도 21F) 또는 TR-Fc(도 21I)와 함께 인간 단핵구를 배양한 경우에 상아질 재흡수의 증거가 거의 또는 전혀 나타나지 않았다. 그러나, 인간 단핵구 세포를 TRANCE 단독(도 21G) 또는 대조구 IgG1 폴리펩티드(도 21J)와 함께 배양한 경우에 재흡수가 크게 관찰되지 않았다. 그러나, 인간 단핵구 세포가 mOSCAR-Ig와 함께 배양된 경우에, TRANCE 존재하에 관찰되는 상승된 재흡수 수준은 저해되었다(도 21H).

따라서, 이들 실험 결과를 통해, 인간 세포(즉, 인간 파골세포)의 성숙 및활성은 모두, 인간 OSCAR 폴리펩티드 뿐 아니라 마우스와 같은 다른 유기체 종으로부터 유래하는 OSCAR 폴리펩티드도 포함하는 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드에 의해 조절될 수 있는 것으로 증명된다.

인간 OSCAR은 쥐의 세포와 교차-반응성이 있다.다른 유기체 종으로부터의 세포의 성숙 및 활성을 조절하는 인간 OSCAR 폴리펩티드의 능력을 조사하기 위하여, 인간 단핵구 세포를 사용하여 상기된 것과 유사한 역실험(converse experiments)도 실시하였다. 특히, 이들 실험에서 쥐의 파골세포의 성숙 및 활성을 조절하는 hOSCAR-Ig 폴리펩티드의 능력을 조사하였다. 이들 실험은 필수적으로, 쥐의 조골세포 및 골수 세포의 공동-배양액을 사용하는 상기 섹션 4 및 5에 기재된 실험과 동일하다. 그러나, 이들 실험에서, 앞선 실시예에 사용되는 가용성 인간 OSCAR 폴리펩티드보다는 가용성 인간 OSCAR 폴리펩티드(hOSCAR-Ig)와 함께 세포 배양액을 배양하였다. 이 특정 실험 결과는도 22 및 23에 나타낸다.도 22A-22F에는, 성장 배지 단독(도 22A), 비타민 D3(도 22B), 비타민 D₃및 hOSCAR-Ig(도 22C), 또는 비타민 D₃및 mOSCAR-Ig(도 22D)와 함께 6일동안 배양한 후의 TRAP-염색된 쥐의 세포 배양액의 현미경사진을 도시한다. 쥐의 세포의 공동-배양액이 비타민 D₃및 IgG1 폴리펩티드(도 22F), 또는 비타민 D₃및 TR-Fc(도 22E)와 함께 배양되는 양성 및 음성 대조구 실험도 실시하였다. 각 배양액에서 계수된 TRAP(+) 다핵 세포의 수를도 23에 그래프로 나타낸다. 쥐의 세포를 사용하는 다른 실험에서 관찰된 것과 일치하여, 비타민 D₃및 쥐의 OSCAR 폴리펩티드와 함께 배양된 공동-배양액은, 비타민 D₃및 대조구 IgG1 폴리펩티드와 함께 배양된 공동-배양액에서 관찰된 것에 비해, 성숙한 파골세포가 훨씬 적다. 그러나, 흥미롭게도, 비타민 D₃및 인간 OSCAR 폴리펩티드와 배양된 공동-배양액은 파골세포 저해 수준이 비슷하였다.

따라서, 이 실시예에 기재된 실험을 통해, 본 발명의 OSCAR 핵산 및 폴리펩티드는, 교차-반응성이 있으며, OSCAR 핵산 또는 폴리펩티드가 유래되는 유기체 종과 동일하거나 상이할 수 있는 유기체 종의 파골세포 성숙 및/또는 활성을 조절하기 위하여 사용가능한 것으로 증명된다. 따라서, 본 발명의 OSCAR 폴리펩티드 및 핵산을 사용하여, 이들이 유래되는 종과 동일한 유기체 종 또는 이들이 유래되는 종과 상이한 유기체 종의 골조직의 성장, 발달, 치유, 분해, 재흡수 또는 항상성과 관련된 과정을 조절할 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 상기 상세한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자는 본 명세서에 기재된 것에 추가로 본 발명을 다양하게 변형할 수 있음이 명백하다. 이러한 변형도 특허청구범위의 범위에 속한다.

특허, 특허출원 및 다양한 공개문헌을 포함하는 다양한 참조문헌은 본 발명의 상세한 설명 중에 인용 및 논의되어 있다. 이러한 첨조문헌의 인용 및/또는 논의는 단순히 본 발명의 상세한 설명을 명확하게 하기 위하여 제공되는 것으로, 이러한 참조문헌이 본 명세서에 기재된 발명에 대한 "종래 기술"임을 인정하는 것은 아니다. 본 명세서에 인용 및 논의된 모든 참조문헌은, 전반적으로 및 각 참조문헌이 개별적으로 참조 병합되어 있는 것과 동일한 범위로 본 명세서에 참조 병합되어 있다.

Claims (108)

1. 분리된 OSCAR 폴리펩티드.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 쥐의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
3. 제 2항에 있어서,

   SEQ ID NO:5(도 2B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
4. 제 3항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 인간 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
6. 제 5항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 게놈 서열에 포함되어 있는 OSCAR 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
7. 제 6항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
8. 제 6항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
9. 제 6항에 있어서,

   상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
10. 제 1항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-16 서열;

    (b) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 17-122 서열;

    (c) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 123-228 서열;

    (d) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 229-247 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 248-264 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
11. 제 1항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:17(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-18 서열;

    (b) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-123 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 124-229 서열;

    (d) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 230-248 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 249-263 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
12. 제 1항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-18 서열;

    (b) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-127 서열;

    (c) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 128-233 서열;

    (d) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 234-252 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 253-267 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
13. 제 1항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-13 서열;

    (b) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 14-112 서열;

    (c) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 113-218 서열;

    (d) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 219-237 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 238-252 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
14. 스트린젠트 조건 하에서 제 3항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 분리된 폴리펩티드.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4(도 2A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
16. 스트린젠트 조건 하에서 제 4항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 분리된 폴리펩티드.
17. 제 16항에 있어서,

    상기 아미노산 서열은 :

    (a) SEQ ID NO:1 (도 1A); 또는

    (b) SEQ ID NO:1 (도 1A)에서의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
18. 스트린젠트 조건 하에서 제 7항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 분리된 폴리펩티드.
19. 제 18항에 있어서,

    상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6(도 3A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
20. 스트린젠트 조건 하에서 제 8항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 분리된 폴리펩티드.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:8(도 4A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
22. 스트린젠트 조건 하에서 제 9항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 분리된 폴리펩티드.
23. 제 22항에 있어서,

    상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10(도 5A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
24. OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
25. 제 24항에 있어서,

    상기 OSCAR 폴리펩티드는 쥐의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
26. 제 25항에 있어서,

    SEQ ID NO:5(도 2B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
27. 제 20항에 있어서,

    상기 핵산이 SEQ ID NO:4(도 2A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
28. 제 25항에 있어서,

    상기 핵산이 SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
29. 제 28항에 있어서,

    상기 핵산이:

    (a) SEQ ID NO:1(도 1A)의 뉴클레오티드 서열; 또는

    (b) SEQ ID NO:2(도 1B)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을특징으로 하는 분리된 핵산.
30. 제 24항에 있어서,

    상기 OSCAR 폴리펩티드가 인간 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
31. 제 30항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열; 또는

    (c) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
32. 제 31항에 있어서,

    상기 핵산은 SEQ ID NO:6(도 3A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
33. 제 31항에 있어서,

    상기 핵산은 SEQ ID NO:6(도 4A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
34. 제 31항에 있어서,

    상기 핵산은 SEQ ID NO:10(도 5A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
35. 제 24항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-16 서열;

    (b) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 17-122 서열;

    (c) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 123-228 서열;

    (d) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 229-247 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 248-264 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
36. 제 24항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:17(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-18 서열;

    (b) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-123 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 124-229 서열;

    (d) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 230-248 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 249-263 서열을포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
37. 제 24항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-18 서열;

    (b) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-127 서열;

    (c) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 128-233 서열;

    (d) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 234-252 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 253-267 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
38. 제 24항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 1-13 서열;

    (b) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 14-112 서열;

    (c) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 113-218 서열;

    (d) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 219-237 서열; 또는

    (e) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 238-252 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
39. 제 30항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 게놈 OSCAR 뉴클레오티드 서열; 및, 선택적으로,

    (b) 게놈 OSCAR 뉴클레오티드 서열과 자연적으로 관련이 없는 비-내인성 뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된 핵산.
40. 제 39항에 있어서,

    상기 게놈 OSCAR 뉴클레오티드 서열은:

    (a) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 768-841 서열;

    (b) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 842-1818 서열;

    (c) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1819-1851 서열;

    (d) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1852-1997 서열;

    (e) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1998-2009 서열;

    (f) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 2010-4439 서열;

    (g) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 4440-4742 서열;

    (h) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 4743-5013 서열;

    (i) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 5014-5295 서열;

    (j) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 5296-5809 서열;

    (k) SEQ ID NO:12(도 7A-D)의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 5810-6499 서열로 구성되는 그룹에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
41. 스트린젠트 조건 하에서 제 3항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
42. 제 41항에 있어서,

    SEQ ID NO:4 (도 2A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
43. 스트린젠트 조건 하에서 제 4항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
44. 제 43항에 있어서,

    (a) SEQ ID NO:1 (도 1A); 또는

    (b) SEQ ID NO:2 (도 1B)에서의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
45. 스트린젠트 조건 하에서 제 7항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
46. 제 45항에 있어서,

    SEQ ID NO:6 (도 3A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
47. 스트린젠트 조건 하에서 제 8항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
48. 제 47항에 있어서,

    SEQ ID NO:8 (도 4A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
49. 스트린젠트 조건 하에서 제 9항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
50. 제 49항에 있어서,

    SEQ ID NO:10 (도 5A)의 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리디제이션하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
51. 스트린젠트 조건 하에서 제 39항의 핵산의 보체에 하이브리디제이션하는 분리된 핵산.
52. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 24항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
53. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 28항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
54. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 30항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
55. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 35항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
56. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 36항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
57. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 37항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
58. 발현 조절 서열과 작용 관련있는 제 38항의 핵산을 포함하여 이루어지는 발현 벡터.
59. 제 24항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
60. 제 28항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
61. 제 30항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
62. 제 35항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
63. 제 36항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
64. 제 37항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
65. 제 38항의 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
66. OSCAR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
67. 제 3항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
68. 제 67항에 있어서,

    모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
69. 제 4항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
70. 제 69항에 있어서,

    모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
71. 제 7항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
72. 제 71항에 있어서,

    모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
73. 제 8항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
74. 제 73항에 있어서,

    모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
75. 제 9항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
76. 제 75항에 있어서,

    모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
77. 파골 세포에 의해 발현되는 OSCAR 유전자 산물의 활성을 증가시키는 화합물과 파골 세포를 접촉시키는 것을 포함하여 이루어지는, 파골 세포의 활성을 증가시키는 방법.
78. 제 77항에 있어서,

    OSCAR 유전자 산물은:

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:5(도 2B)의 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열;

    (e) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
79. 제 77항에 있어서,

    상기 화합물은 OSCAR-특이적 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
80. 제 79항에 있어서,

    상기 화합물은 OSCAR 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
81. 제 77항의 방법에 따라 파골 세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 골 재흡수를 증가시키는 방법.
82. 파골 세포에 의해 발현되는 OSCAR 유전자 산물의 활성을 감소시키는 화합물과 파골 세포를 접촉시키는 것을 포함하여 이루어지는, 파골 세포의 활성을 감소시키는 방법.
83. 제 82항에 있어서,

    OSCAR 유전자 산물은:

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:5(도 2B)의 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열;

    (e) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
84. 제 82항에 있어서,

    상기 화합물은 OSCAR 유전자 산물에 대한 OSCAR 특이적 리간드의 결합을 방해하는 것을 특징으로 하는 방법.
85. 제 84항에 있어서,

    상기 화합물은 가용성 OSCAR 폴리펩티드를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
86. 제 85항에 있어서,

    상기 가용성 OSCAR 폴리펩티드는:

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 17-122 서열;

    (b) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 123-228 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-123 서열;

    (d) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 124-229 서열;

    (e) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-127 서열;

    (f) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 128-233 서열;

    (g) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 14-112 서열;

    (h) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 113-218 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
87. 제 84항에 있어서,

    상기 가용성 OSCAR 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
88. 제 84항에 있어서,

    상기 화합물은:

    (a) OSCAR 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체; 또는

    (b) OSCAR 특이적 리간드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하여 이루어지는 방법.
89. 제 82항의 방법에 따라 파골세포의 활성을 감소시키는 것을 포함하여 이루어지는, 골 재흡수를 감소시키는 방법.
90. OSCAR 유전자의 발현 검출을 통해 세포를 파골 세포로 확인하는 것을 특징으로 하는, 세포에 의해 OSCAR 유전자의 발현을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포를 파골 세포로 확인하는 방법.
91. 제 90항에 있어서,

    OSCAR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 검출함으로써 상기 OSCAR 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
92. 제 90항에 있어서,

    OSCAR 폴리펩티드를 검출함으로써 상기 OSCAR 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
93. (a) 시험 화합물을 OSCAR 폴리펩티드에 결합시키기에 충분한 조건 하에서 시험 화합물을 OSCAR 폴리펩티드에 접촉시키고; 및

    (b) OSCAR 폴리펩티드에 결합된 시험 화합물을 검출하는 것을 포함하여 이루어지고,

    OSCAR 폴리펩티드에 결합된 시험 화합물의 검출을 통해 시험 화합물을 OSCAR 폴리펩티드에 결합하는 화합물로 확인하는 것을 특징으로 하는, OSCAR 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 확인하는 방법.
94. 제 93항에 있어서,

    상기 OSCAR 폴리펩티드가:

    (a) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:5(도 2B)의 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열;

    (e) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열;

    (f) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 17-122 서열;

    (g) SEQ ID NO:3(도 1C)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 123-228 서열;

    (h) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-123 서열;

    (i) SEQ ID NO:7(도 3B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 124-229 서열;

    (j) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 19-127 서열;

    (k) SEQ ID NO:9(도 4B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 128-233 서열;

    (l) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 14-112 서열;

    (m) SEQ ID NO:11(도 5B)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 113-218 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
95. 제 93항에 있어서,

    상기 시험 화합물은 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
96. 제 95항에 있어서,

    상기 폴리펩티드가 조골세포, 배 섬유아세포, NIH 3T3 섬유아세포, ST2 조골세포-유사 세포, 폐 상피세포, UMR106 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, hFOB1.19 세포 또는 COS-1 세포에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
97. 제 81항의 방법에 따라 개체의 골 재흡수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 개체의 골성장 관련 질환의 치료 방법.
98. 제 97항에 있어서,

    상기 골성장 관련 질환이 골화석증인 것을 특징으로 하는 방법.
99. 제 89항의 방법에 따라 개체의 골 재흡수를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 개체의 골성장 관련 질환의 치료 방법.
100. 제 99항에 있어서,

     상기 골성장 관련 질환이 골다공증인 것을 특징으로 하는 방법.
101. 제 2항에 있어서,

     SEQ ID NO:29(도 26B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
102. 제 2항에 있어서,

     SEQ ID NO:31(도 27B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
103. 제 5항에 있어서,

     SEQ ID NO:25(도 24B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
104. 제 5항에 있어서,

     SEQ ID NO:27(도 25B)의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
105. 제 25항에 있어서,

     상기 핵산이 SEQ ID NO:30(도 26A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
106. 제 25항에 있어서,

     상기 핵산이 SEQ ID NO:32(도 27A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
107. 제 30항에 있어서,

     상기 핵산이 SEQ ID NO:26(도 24A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
108. 제 30항에 있어서,

     상기 핵산이 SEQ ID NO:28(도 25A)의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.