KR20040006812A - 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토펜타오스의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토펜타오스의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 상기 아밀라아제를 이용하여 말토펜타오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 아밀라아제 및 말토펜타오스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 바실러스 츄린겐시스의 재조합 아밀라아제를 이용하여 말토펜타오스를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토펜타오스의 생산 방법{Maltopentaose-Producing Amylase and Process for Producing Maltopentaose}

본 발명은 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 말토펜타오스의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제 및 상기 아밀라아제를 이용하여 말토펜타오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

말토펜타오스 (maltopentaose)는 포도당 5개가 알파 1-4 결합으로 결합된 올리고당이다. 말토펜타오스는 설탕이나 과당 등의 일반 감미료에 비하여 저감미도, 보습성, 저착색성 및 고점도성 등의 성질을 보유하고 있어 건강 식품, 제과, 제빵 및 음료 등의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 말토펜타오스는 인체 내 혈청 아밀라아제의 활성을 측정하기 위한 기질로 의약 산업에서 사용되고 있으며 (미합중국 특허 제 4000042 호), 환자들을 위한 병원식 및 안정한 에스테르화된 지방산을 만드는 데에도 사용되는 (김영민 등,한국생물공학회지, 11:636-643(2001)) 등 산업적인 용도가 다양한 물질이다.

따라서, 말토펜타오스를 생산하기 위한 다양한 방법이 연구되어 왔으며, 슈도모나스 종 KO-8940 (Pseudomonassp. KO-8940, Shida, O. et al.Biosci. Biotech. Biochem.56:76-80(1992)), 바실러스 종 AIR-5 (Bacillussp. AIR-5, 김영민 등,한국생물공학회지, 11:636-643(2001)), 및 바실러스 세레우스 NY-14(Bacillus cereusNY-14, 미합중국 특허 제 4591561 호) 등에서 말토펜타오스 생성 아밀라아제가 보고되었다.

또한, 아밀라아제를 이용하여 말토펜타오스를 생산하는 방법에 대한 연구도 진행되었는데, 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)로부터 유래된 아밀라아제를 이용한 말토펜타오스 제조 방법 (미합중국 특허 제 4039383 호; 및 대한민국 특허 제 5661 호) 등이 그것이다. 그러나 말토펜타오스 생산 아밀라아제는 현재까지 밝혀진 종류가 다양하지 않고 그것을 코딩하는 유전자에 대해서는 전혀 규명되어 있지 않다. 또한, 기존에 보고된 것들도 열 안정성 등의 문제점이 있기 때문에 말토펜타오스 생산 아밀라아제를 이용한 말토펜타오스의 생산에는 아직 해결해야 할 문제들이 많이 남아 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허 문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 아밀라아제로부터 말토펜타오스를 생산하는 방법 및 그러한 아밀라아제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 아밀라아제 및 그것의 신규한 유전자로 형질전환하여 생산한 재조합 아밀라아제가 전분으로부터 말토펜타오스를 생산하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 아밀라아제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 말토펜타오스를 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 명확하게 된다.

도 1은 바실러스 츄린겐시스 7 균주로부터 유래된 아밀라아제를 수용성 전분과 반응시킨 박층 크로마토그래피 결과;

도 2는 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제의 유전자 제한 효소 지도;

도 3은 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제 유전자를 포함하는 발현 벡터;

도 4는 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 대장균에서 발현시켜 전분 분해 환의 생성을 보여주는 사진;

도 5는 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제의 분자량 전기 영동 사진;

도 6은 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제의 최적 pH를 보여주는 그래프;

도 7은 본 발명의 말토펜타오스 생성 아밀라아제의 최적 온도를 보여주는 그래프; 및

도 8은 본 발명의 재조합 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 이용한 말토펜타오스 생산을 보여주는 박층 크로마토그래피 결과이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 제공한다.

본 발명자들은 다양한 종류의 미생물로부터 아밀라아제에 대한 스크리닝을수행한 결과, 바실러스 츄린겐시스가 바람직한 특성을 갖는 아밀라아제를 생성하는 것을 확인하게 되었다. 바실러스 츄린겐시스로부터 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 확인한 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 이루어진 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "말토펜타오스 생성 아밀라아제"는 그 효소의 작용으로서 적합한 기질, 예컨대, 전분을 이용하여 주산물로 말토펜타오스를 생산하는 아밀라아제를 의미하여, 소량으로 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토헥사오스 등을 생산할 수도 있다.

본 발명의 아밀라아제는 다음의 특징을 갖는다: (a) 전분의 내부를 절단하는 엔도타입; (b) 분자량이 49-56 kDa; (c) 최적 pH가 5-6; 및 (d) 최적 온도가 50-60 ℃. 본 발명의 아밀라아제는 변성된 조건 하에서 분자량이 49-56 kDa, 바람직하게는 50-54 kDa이며, 가장 바람직하게는 약 53 kDa이다.

본 발명의 아밀라아제는 바실러스 츄린겐시스의 다양한 아종으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스 아종 알레스티 (B. thuringiensissub.alesti), 솟토 (B. thuringiensissub.sotto), 모리소니 (B. thuringiensissub.morrisoni), 산디에고 (B. thuringiensissub.sandiego), 담스타디엔시스 (B. thuringiensissub.darmstadiensis), 솜프소니 (B. thuringiensissub.thompsoni), 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub.israelensis), 토치지엔시스 (B. thuringiensissub.tochigiensis), 쿠스타키 (B. thuringiensissub.kurstaki), 카나덴시스 (B. thuringiensissub.canadensis), 다코타 (B. thuringiensissub.dakota), 갤러리에 (B. thuringiensissub.galleriae), 엔토모시더스 (B. thuringiensissub.entomocidus), 아이자와이 (B. thuringiensissub.aizawai) 또는 오스트리니에 (B. thuringiensissub.ostriniae)로부터 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub. israelensis)로부터 얻을 수 있다.

또한, 바실러스 츄린겐시스 아종은 계속 발견되고 있으므로 앞으로 발견될 수 있는 바실러스 츄린겐시스 아종으로부터도 아밀라아제 및 그 유전자를 얻을 수 있을 것으로 예측된다. 또한, 바실러스 츄린겐시스와 계통적으로 유사하다고 알려져 있는 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus) 및 바실러스 안쓰라시스 (Bacillus anthracis) (Appl. Environ. Microbial.66:2627-2630(2000))에서도 유사한 아밀라아제 및 그 유전자를 얻을 수 있을 것으로 예측된다.

한편, 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)는 생물 농약 등으로 유용하게 사용되는 그램 양성균이다. 바실러스 츄린겐시스는 살충 활성이 있는 결정형 단백질을 생산하기 때문에 전 세계적으로 생물 농약으로서 사용되며, 발효법 등이 이미 산업적으로 확립되어 있어서 매우 유용할 뿐만이 아니라 그 안전성도 인정받고 있다. 현재까지 바실러스 츄린겐시스의 아밀라아제에 대해서는 바실러스 츄린겐시스의 배양액이 아밀라아제 활성을 보인다는 단 하나의 보고 (Kuppusamy M. 및 Balaraman K.Indian J Med Res91:149-150(1990))가 있으나, 그 특성, 정제 및 유전자 등에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다. 또한, GenBank 데이터베이스에 바실러스 츄린겐시스의 아밀라아제가 단 1개 등록되어 있으나 (access number A27092), 그 특성에 대해서는 보고된 바가 없다. 상기 아밀라아제를 이용하여 상동성 분석을 하면 아밀라아제 도메인과 이소아밀라아제의 N-말단 도메인을 갖고 있는 분지효소 (branching enzyme)와 높은 상동성을 보이므로 이것은 아밀라아제보다는 분지효소로 추정된다. 따라서, 이러한 바실러스 츄린겐시스를 이용하는 본 발명은 상기한 측면에서 다른 미생물을 이용하는 것 보다 유리하다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아밀라아제는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 아밀라아제는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)를 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95.6%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 아밀라아제를 를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit,Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman,Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 바실러스 츄린겐시스 아종 알레스티, 솟토, 모리소니, 산디에고, 담스타디엔시스, 솜프소니, 이스라엘렌시스, 토치지엔시스, 쿠스타키, 카나덴시스, 다코타, 갤러리에, 엔토모시더스, 아이자와이 또는 오스트리니에로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스로부터 유래된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 포함하는 아밀라아제를 코팅하는 것이며, 가장 바람직하게는 서열목록 제 3 서열의 염기 서열을 포함한다. 아밀라아제를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 염기 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 96.3%의 상동성을 나타내는 염기 서열을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아밀라아제를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터,trp프로모터,lac프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서,E. coli가 이용되는 경우,E. coli트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C.,J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.,Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 숙주 세포로서, 바실러스가 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소 단백질 유전자의 프로모터 (Appl. Environ. Microbiol.64:3932-3938(1998) 및Mol. Gen. Genet.250:734-741(1996)) 또는 바실러스에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 발현 벡터는 아세틸-CoA 합성 효소 (ACS) 프로모터를 이용하여 pUC19를 조작하여 제작한 말토펜타오스 생성 아밀라아제 유전자를 포함하는 pACE2-BTA이다. acs 프로모터는 유도물질이 필요 없고, 대장균 숙주 세포 의존성이 없으며, 대수 증식기 후기 및 휴지기에서 과발현되는 특징을 갖는다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 아밀라아제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이며, 그 이유는 이러한 추가적인 서열은 항원성이 없고, 단백질 즉 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위의 폴딩을 방해하지 않기 때문이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대,글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 아밀라아제를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대,E. coliJM109,E. coliRR1,E. coliLE392,E. coliB,E. coliX 1776,E. coliW3110, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂방법 (Cohen, S.N. et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D.,J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al.,Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R.,Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al.,Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al.,Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal,Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 아밀라아제를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가lac프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 아밀라아제를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "재조합 아밀라아제" 또는 "바실러스 츄린겐시스의 재조합 아밀라아제"는 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예컨대, 발현 벡터 pACE2-BTA로 다양한E. coli을 형질전환시켜 얻은 형질전환체에서 생산된 아밀라아제를 의미한다.

본 발명의 재조합 아밀라아제는 전분과 같은 기질에 적용시켜 말토펜타오스를 생산하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 아밀라아제를 전분에 적용하는 것을 특징으로 하는 말토펜타오스의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법의 일 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (a) 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 아밀라아제를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 발현 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 생성하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 아밀라아제를 생산하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 아밀라아제를 기질에 적용시켜 말토펜타오스를 생산하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 형질전환체를 배양하는 배지는 통상의 배양 배지, 예컨대, LB 배지, YT 배지, B 브로스, 트립톤 브로스 및 루리아 브로스 등을 포함하며, 가장 바람직하게는 적합한 항생물질 (예: 암피실린)을 함유한 LB 배지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 말토펜타오스 생산용 기질은 전분이며, 보다 바람직하게는 수용성 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 옥수수 전분 및 고구마 전분 등이며, 가장 바람직하게는 수용성 전분이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 아밀라아제를 기질에 적용시키는 단계는 30℃ 내지 45℃에서 수행되며, 가장 바람직하게는 42℃에서 수행된다.

본 발명의 방법은 높은 말토펜타오스 생성율을 나타내며, 분해 산물 중 말토펜타오스가 36% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 70% 이상을 차지한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 바실러스 츄린겐시스의 아밀라아제에 의한 말토펜타오스 생성

본 발명자들이 스크리닝을 통해 보관 중인 서로 다른 바실러스 츄린겐시스 60개의 아종을 대상으로 아밀라아제에 의한 말토펜타오스의 생성을 확인하였다.

먼저, 0.5%의 수용성 전분을 포함하는 LB 고체 한천 배지에서 상기의 바실러스 츄린겐시스 60개의 아종을 접종하고 30℃에서 24시간 생육시켜 전분이 분해되어 생기는 환의 생성을 통해 전분의 분해능을 조사한 결과, 총 53 아종의 균주에서 아밀라아제 활성을 나타내었다.

상기 활성을 나타낸 바실러스 츄린겐시스 아종을 다시 0.5%의 수용성 전분을 포함하는 LB 배지에서 30℃(배양 온도)에서 15시간 동안 배양한 후 그 배양 상등액을 취하였다. 이어, 상기 상등액, 2% 수용성 전분 및 100 mM 소듐 포스페이트 완충 용액 (pH 6.0)을 1:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 45℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 결과물을 실리카겔 60F 판 (Merck)에 5㎕ 점적하여 전개 용매 (n-부탄올:피리딘:물 = 6:4:1)로 전개한 후 메탄올에 용해한 20% 황산 용액으로 염색하여 박층 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, 주산물로 말토펜타오스 (G5) 및 소량의 말토트리오스 (G3)를 생성하는 것을 확인하였다. 첨부 도 1은 7 균주 (1.Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki; 2.Bacillus thuringiensis subsp.morissoni; 3.Bacillus thuringiensisstrain no. 996; 4.Bacillus thuringiensis subsp.israelensis; 5.Bacillus thuringiensis subsp.tolworthi; 6.Bacillus thuringiensis subsp.aizawai; 및 7.Bacillus thuringiensis subsp.entomocidus)의 박층 크로마토그래피 결과를 나타낸다. 도 1에서 1-7은 상기한 바실러스 츄린겐시스 아종을, G1, G2, G3, G4 및 G5는 각각 글루코스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스를 나타낸다.

실시예 2: 바실러스 츄린겐시스 아밀라아제의 유전자 분석

헬가슨 등은 바실러스 안쓰라시스 (Bacillus anthracis) 및 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)는 바실러스 츄린겐시스와 유전적으로 같은 종에서 분화되었다고 보고하였다 (Helgason E. et al.Appl Environ Microbiol.66:2627-2630(2000)). 이러한 보고를 참조하여, 현재 진행되고 있는 바실러스 안쓰라시스 지놈 시퀀싱의 데이터베이스에서 아밀라아제 유전자를 찾아 이를 기준으로 바실러스 츄린겐시스 아밀라아제 유전자 클로닝을 위한 프라이머 (BTA primer)를 제작하였다 (서열 1 및 서열 2 참조).

상기 바실러스 츄린겐시스 60 균주 중에서 높은 말토펜타오스 생산성을 보인 8 균주 (바실러스 츄린겐시스 아종 쿠스타키 2균주, 모리소니 1균주, 이스라엘렌시스 1균주, 톨워시 1균주, 아이자와이 1균주, 엔토모시두스 1균주, 아종이 동정되지 않은 균주 1균주)의 염색체 DNA를 염색체 DNA 분리 키트 (Promega)로 분리하여 이를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 (서열 1 및 서열 2)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR은 아큐파워 프리믹스 (바이오니아, AccuPower PCR PreMix)를 사용하여 실시하였으며, 어닐링은 50℃에서 1분, 연장반응은 72℃에서 1분 30초, 변성은 95℃에서 1분간으로 하여 총 30사이클을 수행하였고, 최종 연장반응은 72℃에서 5분을 수행하였다.

그 결과 상기 8 균주 모두에서 아밀라아제 유전자가 증폭되었으며, 이 중에서 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillus thuringiensissubsp.israelensis) 균주의 아밀라아제 유전자를 사용하여 후속 실험을 진행하였다.

상기 PCR로 증폭된 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 균주의 아밀라아제 유전자를 DNA 정제 키트 (Roche)를 이용하여 정제한 후, pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 연결하였고 (pGEMT-BTA), 이를E. coliJM109에 열충격 방법(Sambrooket al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor)으로 형질전환하여 100 ㎍/㎕의 암피실린 및 x-gal이 포함된 LB 한천 배지에서 배양한 후 백색 콜로니를 선택하였다. 이렇게 선별된 형질전환 대장균에서 DNA를 취한 다음, ABI 3700 기기를 이용하여 DNA 염기 서열을 분석한 결과, 상기 아밀라아제의 유전자는 총 1539개의 염기 (서열 3 참조)로 구성되어 있으며, 상기 아밀라아제는 총 513개의 아미노산 (서열 4 참조)으로 구성되어 있음을 확인하였다. 상기 아밀라아제 내부의 제한 효소 지도는 도 2에 나타나 있다.

상기 클로닝한 아밀라아제 유전자의 DNA 염기 서열에 대한 상동성 분석 결과, 바실러스 메가테리움 KSM-B404 (Bacillus megateriumKSM-B404)의 아밀라아제 유전자 (GenBank accession number AF220440)와 97% 상동성을 보이는 신규한 아밀라아제 유전자임을 알 수 있었다. 또한, 아밀라아제의 아미노산 서열을 분석한 결과, 상기 바실러스 메가테리움의 아밀라아제와 98% 정도의 상동성을 나타내었으며, 다른 몇몇 바실러스 유래의 아밀라아제들과는 약 70%의 상동성을 나타내었다.

실시예 3: 바실러스 츄린겐시스 아밀라아제 유전자를 포함하는 발현 벡터의 구축 및 대장균에서의 발현을 통한 재조합 아밀라아제 생산

바실러스 츄린겐시스 아밀라아제를 대장균에서 생산하기 위하여 본 발명자들이 개발한 아세틸-CoA 합성 효소 (ACS) 프로모터 (Kumari et al.J. Bacteriol.177:2878-2886(1995))를 이용한 대장균 발현 시스템 (대한민국 특허출원 제 2000-52464 호)을 이용하여 아밀라아제를 대장균에서 발현시켰다.

먼저, ACS 프로모터를 이용한 대장균 발현 시스템용 벡터 pSS112 (KCTC 067BP)에서acs프로모터 부분과 그 앞뒤의nrfA및acs의 유전자의 일부가 포함된 DNA (1.4 kb)를ClaⅠ및XhoⅠ을 이용하여 얻었고, pBluescript Ⅱ KS 벡터 (Stratagene, USA)의ClaⅠ 및XhoⅠ 위치에 서브클로닝 하였다 (pBlue-ACS).

이어,NdeⅠ 처리한 후 클레노우 (klenow) 채움 반응 및 재연결 반응을 실시하여 상기 벡터 내의NdeⅠ 위치를 제거하였다.NdeI 위치가 제거된 pUC19 벡터를HindⅢ 및KpnⅠ으로 절단하고 pBlue-ACS도HindⅢ 및KpnⅠ으로 절단하여acs프로모터를 pUC19에 옮겼다 (pUC-ACS).

그런 다음, 샤인-달가노 서열 (SD sequence, AAGGAG) 및NdeⅠ,EcoRⅠ,XmaⅠ,BamHⅠ,PstⅠ,KpnⅠ 및SacⅠ 위치를 포함하고acs전사 종결 인자의 5' 부분을 포함하는 업스트림 프라이머 (서열 5) 및 종결 인자의 3' 부분을 포함하는 다운스트림 프라이머 (서열 6)를 제작하여 PCR을 수행하였다. 이때 주형으로서 pSS112 (KCTC 067BP)를 사용하였으며, 아큐파워 프리믹스 (바이오니아)를 이용하였고, 어닐링은 60℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 30초, 변성은 94℃에서 60초간으로 하여 총 30 사이클을 수행하였고, 최종 연장반응은 72℃에서 5분을 실시하였다.

이렇게 만들어진 PCR 생성물을NdeⅠ부위가 제거되고acs프로모터가 삽입된 pUC19에XhoⅠ 및NarⅠ을 이용하여 연결시켰다. 이와 같이 pUC19을 근간으로 하여acs프로모터 부분 및 SD 서열, 멀티 글로닝 부위 (multi clonign site, MCS) 그리고acs전사 종결 인자로 이루어진 플라스미드를 "pACE2"라 명명하였다.

한편, 상기 실시예 2에서 제작한 pGEMT-BTA를 제한효소BamHⅠ 및PstⅠ으로 절단하고, 결과 단편 (아밀라아제 유전자 포함)을 상기 제조한 발현 벡터 pACE2의BamHⅠ과PstⅠ 부위에 연결하여 아밀라아제 발현 벡터 (pACE2-BTA)를 제작하였다 (도 3 참조).

상기 pACE2-BTA 발현 벡터로 대장균 JM109를 형질전환시킨 후, 이것을 100 ㎍/㎕의 암피실린 및 0.3%의 수용성 전분을 포함하는 LB 고체 한천 배지에 접종하여 37℃에서 배양한 후 전분 분해 환 (halo)의 생성을 관찰하였다. 그 결과, 형질전환된 대장균은 전분을 분해하여 환을 형성하는 것을 확인함으로써, 아밀라아제가 발현되었음을 알 수 있었다 (도 4 참조). 따라서, pACE2-BTA 벡터에 의해 형질전환된 대장균은 재조합 바실러스 츄린겐시스 아밀라아제를 생산함을 알 수 있다.

실시예 4: 말토펜타오스 생성 재조합 아밀라아제의 정제 및 물리 화학적 성질

상기 재조합 아밀라아제를 보다 신속하고 높은 정제도로 얻기 위하여, 본 발명의 아밀라아제의 C-말단에 6개의 히스티딘 태그 (6 X His tag)를 다음과 같이 융합하였다. 6개의 히스티딘 태그를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 프라이머 (서열 7)를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때 주형으로서 pACE2-BTA를 사용하였으며, 아큐파워 프리믹스 (AccuPower PCR PreMix, 바이오니아)를 사용하여 실시하였으며, 어닐링은 50℃에서 1분, 연장반응은 72℃에서 1분 30초, 변성은 95℃에서 1분간으로 하여 총 30사이클을 수행하였고, 최종 연장반응은 72℃에서5분을 수행하였다. 이렇게 생성된 PCR 생성물을 다시 pACE2 벡터에 연결하고, 이렇게 하여 얻어진 재조합 발현 벡터를 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 100 ㎍/㎕의 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 37℃에서 16시간 배양한 후, 배양액을 초음파 파쇄한 후 Ni-NTA 히스티딘-태그 정제 키트 (Ni-NTA His-tag kit, Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제한 아밀라아제를 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 결과 약 53 kDa의 아밀라아제가 정제되었음을 확인하였다 (도 5 참조).

정제한 재조합 효소의 최적 pH를 확인하기 위해 pH4에서 10까지의 완충용액 (초산나트륨 완충액, pH4; 인산 나트륨 완충액, pH5-8; 트리스-염산 완충액 pH9; 소디움 카보네이트 완충액, pH10)을 사용하여 아밀라아제를 가용성전분과 45℃에서 10분간 반응시켰다. 모든 완충액은 최종 농도가 25mM이 되도록 조정하였으며 일반적으로 아밀라아제 활성에 중요한 영향을 미치는 염화칼슘을 1mM이 되도록 첨가하였다. 그 결과 본 효소는 pH5에서 6사이의 약 산성 부근에서 최고의 활성을 나타내었다 (도 6 참조).

또한, 정제한 재조합 효소의 최적 온도를 확인하기 위해 30 ℃에서 80 ℃의 범위에서 정제한 재조합 아밀라아제를 가용성전분과 10분간 반응시켰다. 반응시 완충액은 인산나트륨 완충액 (pH6)을 최종농도 25mM이 되도록 조정하였으며 염화칼슘을 1mM이 되도록 첨가하였다. 그 결과 본 효소는 50 ℃에서 60 ℃ 사이의 온도에서 최고의 활성을 나타내었다 (도 7 참조).

실시예 5: 바실러스 츄린겐시스의 재조합 아밀라아제를 이용한 말토펜타오스의 생산

상기 실시예 3에서 정제된 바실러스 츄린겐시스의 재조합 아밀라아제 용액 64 unit/㎖, 2% 수용성 전분 및 100 mM 소듐 포스페이트 완충 용액 (pH 7.0)을 1:1:1(v/v/v)로 혼합하여 30℃에서 3시간 동안 반응시키면서 시간의 경과에 따라 30분, 1시간, 1시간 30분, 2시간 및 3시간의 시간대 별로 샘플링 하였다. 이렇게 얻은 반응액 5㎕을 실리카겔 60F 판 (Merck)에 점적하여 전개 용매 (n-부탄올: 피리딘:물 = 6:4:1)로 전개한 후 메탄올에 녹인 20% 황산 용액으로 염색하여 박층 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, 주산물로 말토펜타오스 및 소량의 말토트리오스를 생산하는 것을 확인하였다 (도 8 참조). 따라서, 상기 재조합 아밀라아제는 말토펜타오스를 주로 생산함을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 제공한다. 또한, 본 발명은 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 아밀라아제를 제공한다. 또한, 본 발명은 말토펜타오스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 바실러스 츄린겐시스의 재조합 아밀라아제를 이용하여 말토펜타오스를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (17)

1. 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 말토펜타오스 생성 아밀라아제.
2. 제 1 항에 있어서 상기 아밀라아제는 다음과 같은 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 아밀라아제:

   (a) 전분의 내부를 절단하는 엔도타입;

   (b) 분자량이 49-56 kDa;

   (c) 최적 pH가 5-6; 및

   (d) 최적 온도가 50-60 ℃.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 바실러스 츄린겐시스는 바실러스 츄린겐시스 아종 알레스티 (B. thuringiensissub.alesti), 솟토 (B. thuringiensissub.sotto), 모리소니 (B. thuringiensissub.morrisoni), 산디에고 (B. thuringiensissub.sandiego), 담스타디엔시스 (B. thuringiensissub.darmstadiensis), 솜프소니 (B. thuringiensissub.thompsoni), 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub.israelensis), 토치지엔시스 (B. thuringiensissub.tochigiensis), 쿠스타키 (B. thuringiensissub.kurstaki), 카나덴시스 (B. thuringiensissub.canadensis), 다코타 (B. thuringiensissub.dakota), 갤러리에 (B. thuringiensissub.galleriae), 엔토모시더스 (B. thuringiensissub.entomocidus), 아이자와이 (B. thuringiensissub.aizawai) 및 오스트리니에 (B. thuringiensissub.ostriniae)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 아밀라아제.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 바실러스 츄린겐시스는 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub.israelensis)인 것을 특징으로 하는 아밀라아제.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 아밀라아제는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀라아제.
6. 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 핵산 분자.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 바실러스 츄린겐시스는 바실러스 츄린겐시스 아종 알레스티 (B. thuringiensissub.alesti), 솟토 (B. thuringiensissub.sotto), 모리소니 (B. thuringiensissub.morrisoni), 산디에고 (B. thuringiensissub.sandiego), 담스타디엔시스 (B. thuringiensissub.darmstadiensis), 솜프소니 (B. thuringiensissub.thompsoni), 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub.israelensis), 토치지엔시스 (B. thuringiensissub.tochigiensis), 쿠스타키 (B. thuringiensissub.kurstaki), 카나덴시스 (B. thuringiensissub.canadensis), 다코타 (B. thuringiensissub.dakota), 갤러리에 (B. thuringiensissub.galleriae), 엔토모시더스 (B. thuringiensissub.entomocidus), 아이자와이 (B. thuringiensissub.aizawai) 및 오스트리니에 (B. thuringiensissub.ostriniae)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 아밀라아제.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 바실러스 츄린겐시스는 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 (B. thuringiensissub.israelensis)인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 제 5 항에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아밀라아제를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제 3 서열의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
11. 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 유래된 말토펜타오스 생성 아밀라아제를 코딩하는 상기 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
12. 상기 제 11 항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 형질전환체는 바실러스 속 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
15. 상기 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 형질전환체에 의하여 생산되는 재조합 아밀라아제.
16. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 아밀라아제를 전분에 적용하는 것을 특징으로 하는 말토펜타오스의 제조방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 생성된 말토펜타오스는 전체 생성물 중 최소 36%인 것을 특징으로 하는 말토펜타오스의 제조방법.