KR20030083360A - 우슬로부터 얻은 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물 - Google Patents
우슬로부터 얻은 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 우슬 (Achyranthes radix, 쇠무릎, 牛膝)로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화 저해용 활성분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비름과 식물인 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화를 저해하여 비만의 원인이 되는 지방의 축적을 저해할 수 있는 활성분획 조성물과 이를 효율적으로 추출, 정제하는 방법 그리고 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료 생약제에 관한 것이다.
Description
본 발명은 우슬로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화 저해용 활성분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비름과 식물인 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화를 저해하여 비만의 원인이 되는 지방의 축적을 저해할 수 있는 활성분획 조성물과 이를 효율적으로 추출, 정제하는 방법 그리고 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료 생약제에 관한 것이다.
최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 위생환경이 개선되고 잦은 인스턴트 음식물 섭취와 육식위주의 식생활 변화 등은 과다한 열량의 섭취를 유발한다. 그러나, 이러한 현대인의 식생활의 변화는 턱없이 부족한 운동부족 등으로 인하여 소모열량이 적기 때문에 빠른 비만인구의 증가경향을 보이고 있다. 비만은 단순히 외형상의 문제 뿐 만 아니라 비만이 지속됨으로써 여러 가지 질환, 즉, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 관상동맥질환 등과 같은 성인성 질병을 비롯하여 유방암, 자궁암 및 대장암 등을 야기하는 것으로 보고되면서 이제는 치명적인 질병 중 하나로 취급되고 있다 [J. Biol. Chem., 273, 32487 ∼ 32490 (1998); Nature, 404, 652 ∼ 660 (2000)].
현재 비만을 치료하는 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물로 나누어 볼 수 있다. 중추신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌(5HT) 신경계를 저해하는 펜플루라민, 덱스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 및 최근에는 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다. 이외에도, 위장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로는 대표적으로 췌장에서 생성되는 리파제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여줌으로써 최근 비만 치료제로 허가된 오를리스타트 등이 있다. 그러나, 기존에 사용되어온 약물 중 펜플루라민 등은 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변과 같은 부작용을 일으켜 최근에 사용이 금지되었으며, 다른 약물들도 혈압감소나 유산산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전, 신질환 등의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다.
따라서, 부작용이 작으며 보다 나은 비만 치료 및 예방법을 찾기 위하여 지방세포 분화 저해제를 탐색하게 되었다. 즉, 지방세포의 형성 과정에 밀접한 관련이 있으나 신경계에 작용하지 않을 가능성이 높은 새로운 약물을 검색하고 동정한 것이다.
지방세포에 저장된 지방은 체내의 중요한 에너지원으로 사용된다. 그러나, 비만이 진행됨에 따라서 지방세포는 수적 증가가 일어날 뿐 만 아니라 과다한 지방세포의 분화에 의한 다량의 트리글리세라이드 합성은 지방세포의 크기증가를 포함한 형태적 변화와 여러 유전자 발현의 변화를 동반한다. 지방세포의 크기증가는 잉여 에너지를 중성지방의 형태로 합성 및 저장함으로써 유도된다. 한편, 지방의 저장에 따라 지방세포의 크기증가는 그 직경이 약 20배까지 늘어날 수 있으며 그 결과세포 용적은 수천 배까지 증가되는 것으로 알려져 있다. 이러한, 지방세포의 크기는 일반적으로 식사 조절로 가능하지만 새로운 전구지방세포가 지방세포로 분화되는 과정은 식사조절로는 효과가 없기 때문에 비만의 근본적 치료 또는 억제를 제어하기 위해서는 지방세포의 분화과정을 조절하는 것이 중요하다. 지방세포 분화는 인슐린이나 인슐린 성장인자-I (insulin like growth factor-1), 성장호르몬 등의 자극에 의하여 촉진되며 이 과정에 CCAAT enhancer-binding protein-β (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor (PPARr)등의 전사인자들의 증가가 관찰된다. 이들, 전사인자들은 지방세포 조절인자와 더불어 지방세포의 분화를 촉진시키며 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH)나 지방산 생합성효소 (fatty acid synthase)과 같은 효소들의 발현량이 증가한다. 한편, 비만이 진행되어 당뇨로 진행되는 제 2 형 당뇨병의 경우에 있어서 중성지방인 팔미테이트들이 점진적으로 췌장의 β세포를 파괴하여 당뇨를 유도한다는 결과들이 알려지고 있으며 [Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 2498 ∼ 2502 (1998)], 지방간의 진행에도 과다한 중성지방의 축적이 관여되고 있음이 보고되고 있다 [J. Clin. Invest., 98, 1575 ∼ 1584 (1996)].
최근, 지방세포의 분화를 저해 할 수 있다면 생성되는 지방세포의 수를 조절할 수 있으며 그에 따라 축적되는 여분의 에너지를 배출할 수 있다는 아이디어를 바탕으로하여 지방세포 분화를 저해하는 물질들을 탐색하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법 중에서 기존약제의 실험적 변형 또는 새로운 물질의 합성과 기능검색은 매우 많은 시간과 투자가 필요하다. 이에 비하여 전통 의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들을 이용할 경우 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발될 약물에 의한 독성 염려가 적다는 장점이 있을 뿐 만 아니라 확인된 약효를 바탕으로 하여 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높다.
이에, 본 발명자들은 동의보감을 비롯한 우리 나라의 전통 의학에서 사용되어온 약제들을 대상으로 지방세포 분화 저해작용을 탐색하고 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료 효과 등을 관찰한 결과, 특이적인 저해활성을 보이는 활성분획 조성물 및 화합물을 비름과 식물인 우슬 (Achyranthis japonica)로부터 획득함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 지방세포 분화 저해, 비만예방 및 치료 등에 뚜렷한 효과가 있는 약물인 우슬 추출물을 활성이 가장 우수한 조성으로 추출하는 방법과 그 추출물을 유효성분으로 함유한 생약제를 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 우슬로부터 70% 에탄올로 추출 분획한 활성분획을 비만 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 체중이 감소된 실험군과 활성물질을 투여하지 않은 비만상태의 대조군과의 차이를 나타낸 선그래프 이다.
도 2는 우슬로부터 추출 분획한 분획을 부탄올 분획을 비만 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 체중이 감소된 실험군과 활성물질을 투여하지 않은 비만상태의 대조군과의 차이를 나타낸 선그래프 이다.
도 3은 우슬로부터 추출 분획한 부탄올 분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로부터 분획한 6번째 활성분획을 비만 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 체중이 감소된 실험군과 활성물질을 투여하지 않은 비만상태의 대조군과의 차이를 나타낸 선그래프 이다.
도 4는 우슬로부터 추출 분획한 부탄올 분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로부터 분획한 활성분획을 다시 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획한 4번째 활성분획을 비만 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 체중이 감소된 실험군과 활성물질을 투여하지 않은 비만상태의 대조군과의 차이를 나타낸 선그래프 이다.
도 5는 우슬로부터 추출 분획한 부탄올 분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로부터 분획한 활성분획을 다시 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획한 4번째 활성분획을 지방세포인 NIH3T3-L1 세포주에 처리하여 지방세포의 분화가 저해된 차이를 보여주는 사진이다.
도 6는 우슬로부터 추출 분획한 부탄올 분획을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로부터 분획한 활성분획을 다시 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획한 4번째 활성분획을 비만 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에 4주간 투여하여 체중이 감소된 실험군과 활성물질을 투여하지 않은 비만상태의 대조군과의 외관상의 차이를 비교한 사진이다.
본 발명은 우슬로부터 얻은 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명은 우슬로부터 알코올성 수용액으로 추출하여 생약제를 제조함에 있어서,
(1) 우슬 (Achyranthis japonica)을 분쇄한 후 알콜 수용액을 우슬 함량대비 3 ∼ 10배를 넣어 3회 용매 추출하는 단계;
(2) 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 증발 농축한 후, 농축액을 50 ∼ 100배 부피의 증류수에 현탁하고 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 통과시켜 흡착시킨 다음 비 활성분획을 10% 메탄올을 사용하여 용출 제거하는 단계;
(3) 상기 흡착된 활성분획을 10 ∼ 20 배량의 에탄올, 메탄올, 아세톤등의 유기용매를 사용하여 용출시킨 후, 농축하여 엑기스를 얻는 단계;
(4) 상기 엑기스를 엑기스 총량의 10 ∼ 100 배의 증류수로 현탁시킨 후 에틸 아세테이트 등의 유기용매로 비활성물질을 추출하여 제거한 뒤, 부탄올을 사용하여 추출하는 단계 및;
(5) 상기 부탄올 추출물을 부탄올/에틸아세테이트/증류수 (15/1/4, upper phase)를 사용하여 실리카겔 칼람 크로마토그래피로 활성물질을 용출하는 단계 및:
(6) 상기에서 나온 활성분획물을 농축하여 30% 메탄올을 용매조건으로 하여 RP-18 칼람 크로마토그래피로 활성분획을 얻는 단계를 포함하는 우슬로부터 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물을 분리 정제하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 추출 정제방법에 따라 분리된 우슬 추출물을 유효성분으로 하는 비만 예방제와 치료제 등으로 사용하는 것을 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 지방세포 분화 저해 및 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료효과를 보이는 우슬의 활성 분획 조성물에 관한 것이다.
즉, 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 분획하여 얻은 활성분획 조성물이 지방세포 분화를 저해하고, 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만 예방 및 치료효과를 갖고 있는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료등을 지닌 활성 조성물을 개발하였다.
본 발명에 따른 활성 조성물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.
상기 활성 분획물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 우슬로부터 활성 분획물의 제조
1. 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 활성 분획물을 제조하기 위한 추출용매의 선정
우슬로부터 지방세포 분화활성을 저해하는 분획물의 추출정도가 가장 좋은 용매를 결정하기 위하여 증류수, 에탄올, 수용성 에탄올 (30%, 70%, 100%), 메탄올, 수용성 메탄올 (30%, 70%, 100%)등의 용매를 사용하여 추출정도를 비교하였다. 시중 한약방으로부터 구입한 생약재 50g을 분쇄한 후 추출 용매로 300 ml의 증류수, 에탄올, 수용성 에탄올, 메탄올, 수용성 메탄올 용액에 넣은뒤 각각 60℃ ∼ 100℃의 온도에서 3시간동안 환류추출 하였다. 이후, 추출 용액을 여과지를 사용하여 여한 뒤 감압 농축하였다. 감압 농축액을 동량의 용매에 녹인뒤 일정량을 취하여 10 ug/ml의 농도로 하여 지방세포 분화저해활성을 검사하였다. 지방세포 분화 저해활성 결과 전체적으로 메탄올, 수용성 메탄올 추출물의 활성이 우수하였으나 의약용 및 식품으로 허가되는 70% 에탄올을 추출용매로 사용하였다. 그러나, 추출용매로서 70% 에탄올 용매를 선정한 것이 본 발명의 용매선정을 한정하는 것은 아니다. 보다 높은 추출효율 및 추출용매가 필요하다면 매탄올, 수용성 메탄올을 추출용매로 사용할 수 있다.
실시예 2. 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 흡착시켜 용출한 활성분획의 비만저해 활성
상기 방법으로 제조된 70% 에탄올 추출액을 에탄올을 제거하기 위하여 감압농축기로 농축한후 동량의 증류수를 가하여 현탁하여 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 통과시켜 활성물질을 흡착시켰다. 이후, 증류수, 30% 에탄올, 70% 에탄올, 에탄올, 메탄올등의 용매를 사용하여 순차적으로 활성물질을 농축하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 20 mg/kg으로 녹여 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료효과를 조사하였다.
투여시작 4주 후에 실험군과 대조군의 체중을 측정하여 분석한 결과, 대조군의 경우 체중이 6.8% 증가 (60.2 ± 2.8g→ 64.4 ± 2.3 g)된 것과 비교하여, 우슬로부터 70% 에타놀로 농축한 활성분획을 투여한 실험군의 체중이 약 12.5% 정도 유의하게 ( p ＜ 0.01) 낮은 수준 (63.2 ± 1.8 g → 55.3 ± 3.1g)을 보여 비만이 예방되는 것을 관찰할 수 있었다 (표 1, 도 1).
[표 1]
각 분획물의Lepr db /Lepr db 마우스에서의 비만 저해효과 검색
| 비만저해 활성 (마우스의 체중변화) | |||
| 투여량 | 실험군 (0 w) | 실험군 (4 w) | |
| 정상군 (무처리군) | (20 mg/kg, per day, ip) | 60.2 ± 2.8 g | 64.3 ± 2.3 g |
| 물 용출액 | 59.9 ± 1.7 g | 63.8 ± 2.0 g | |
| 30% 에탄올 용출액 | 60.8 ± 1.3 g | 62.0 ± 2.4 g | |
| 70% 에탄올 용출액 | 63.2 ± 1.8 g | 55.3 ± 3.1 g | |
| 에탄올 용출액 | 64.7 ± 3.5 g | 65.2 ± 2.9 g | |
| 메탄올 용출액 | 59.2 ± 1.6 g | 60.3 ± 3.2 g |
실시예 3. 우슬의 부탄올 추출물의 비만저해 활성
상기 방법으로 제조된 70% 에탄올 용출액을 감압농축기로 농축한후 동량의 증류수를 가하여 현탁하였다. 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 흡착하여 용출뒤 농축한 분획에 들어있는 비활성 물질을 제거하기 위하여 에틸아세테이트 동량을 사용하여 추출하였다. 이후 활성분획을 부탄올을 용매로 하여 추출 분획한 뒤 농축 하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 10 mg/kg으로 녹여 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료효과를 및 치료효과를 조사하였다.
투여시작 4주 후에 실험군과 대조군의 체중을 측정하여 분석한 결과, 대조군의 경우 체중이 5.8% 증가 (60.3 ± 3.1 g → 63.8 ± 1.7 g)된 것과 비교하여, 우슬로부터 부타놀로 농축한 활성분획을 투여한 실험군의 체중이 약 14.8% 정도 유의하게 ( p ＜ 0.01) 낮은 수준 (60.2 ± 2.6 g → 51.3 ± 2.3g)을 보여 비만이 예방되는 것을 관찰할 수 있었다 (표 2, 도 2).
[표 2]
분획물의Lepr db /Lepr db 마우스에서의 비만 저해효과 검색
| 비만저해 활성 (마우스의 체중변화) | |||
| 투여량 | 실험군 (0 w) | 실험군 (4 w) | |
| 정상군 (무처리군) | (10 mg/kg,per day, ip) | 60.3 ± 3.1 g | 63.8 ± 1.7 g |
| EtOAc 분획 | 59.0 ± 2.9 g | 61.2 ± 2.7 g | |
| BuOH 분획 | 60.2 ± 2.6 g | 51.3 ± 2.3 g | |
| H2O 분획 | 61.5 ± 2.3 g | 63.0 ± 3.9 g |
실시예 4. 실리카겔 칼람 크로마토그래피로 분획후 활성물질의 비만저해 활성
상기 방법으로 제조된 부탄올 추출액을 농축한 후 동량의 실리카겔을 가하여 흡착하였다. 흡착한 실리카겔을 실리카겔 칼람 크로마토그래피의 상단에 흡착하여 부탄올/에틸아세테이트/증류수 (15/1/4, upper phase)를 전개용매로 사용하여 활성물질을 분획하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 5 mg/kg으로 녹여 렙틴 수용체(leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료효과를 조사하였다.
투여시작 4주 후에 실험군과 대조군의 체중을 측정하여 분석한 결과, 대조군의 경우 체중이 4.9% 증가 (56.7 ± 2.1 g → 59.5 ± 2.8 g)된 것과 비교하여, 실리카겔 칼람 크로마토그래피로 분획한 6번째 활성분획을 투여한 실험군의 체중이 약 12.6% 정도 유의하게 (
p
＜ 0.01) 낮은 수준 (56.5 ± 2.5 g → 49.4 ± 3.0 g)을 보여 비만이 예방되는 것을 관찰할 수 있었다 (표 3, 도 3).
[표 3]
실리카겔 칼람 크로마토그래피로 분획한 분획물의Lepr db /Lepr db
마우스에서의 비만 저해효과 검색
| 비만저해 활성 (마우스의 체중변화) | |||
| 투여량 | 실험군 (0 w) | 실험군 (4 w) | |
| 정상군 (무처리군) | (5 mg/kg,per day, ip) | 56.7 ± 2.1 g | 59.5 ± 2.8 g |
| 분획 1 | 54.3 ± 1.7 g | 58.2 ± 3.5 g | |
| 분획 2 | 53.9 ± 3.4 g | 58.8 ± 3.0 g | |
| 분획 3 | 56.5 ± 3.1 g | 60.2 ± 2.1 g | |
| 분획 4 | 54.7 ± 2.1 g | 58.0 ± 3.9 g | |
| 분획 5 | 58.3 ± 3.8 g | 61.1 ± 2.5 g | |
| 분획 6 | 56.5 ± 2.5 g | 49.4 ± 3.0 g | |
| 분획 7 | 55.7 ± 1.9 g | 59.2 ± 2.9 g | |
| 분획 8 | 57.6 ± 3.0 g | 61.2 ± 2.4 g |
실시예 5. RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획후 활성물질의 비만저해 활성
상기 방법으로 제조된 부탄올/에틸아세테이트/증류수 (15/1/4, upper phase)에 용출된 활성분획을 농축하였다. 농축된 활성 분획을 30% 메탄올을 전개용매로하여 RP-18 칼람 크로마토그래피하여 활성물질을 분획하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 3 mg/kg으로 녹여 렙틴 수용체 (leptin receptor) 이상으로 비만을 일으키는 모델동물인Lepr db /Lepr db 마우스에서 비만예방 및 치료효과를 조사하였다.
투여시작 4주 후에 실험군과 대조군의 체중을 측정하여 분석한 결과, 대조군의 체중이 6.7% 증가 (61.3 ± 2.9 g → 65.4 ± 3.5 g)된 것과 비교하여, RP-18 칼럼 크로마토그래피로부터 분획한 4번째 활성분획이 실험군의 체중이 약 13.7% 정도 유의하게 (
p
＜ 0.01) 낮은 수준 (59.7 ± 2.2 g → 51.5 ± 2.5 g)을 보여 비만이 예방되는 것을 관찰할 수 있었다 (표 4, 도 4, 도 6).
[표 4]
실리카겔 칼람 크로마토그래피로 분획한 분획물의Lepr db /Lepr db
마우스에서의 비만 저해효과
| 비만저해 활성 (마우스의 체중변화) | |||
| 투여량 | 실험군 (0 day) | 실험군 (14 day) | |
| 정상군 (무처리군) | (3 mg/kg,per day, ip) | 61.3 ± 2.9 g | 65.4 ± 3.5 g |
| 분획 1 | 62.5 ± 1.5 g | 65.0 ± 2.7 g | |
| 분획 2 | 59.3 ± 3.4 g | 61.9 ± 3.2 g | |
| 분획 3 | 58.2 ± 2.9 g | 62.2 ± 2.7 g | |
| 분획 4 | 59.7 ± 2.2 g | 51.5 ± 2.5 g | |
| 분획 5 | 60.1 ± 1.9 g | 62.5 ± 3.9 g | |
| 분획 6 | 59.5 ± 2.0 g | 63.3 ± 3.1 g | |
| 분획 7 | 62.3 ± 3.3 g | 65.1 ± 3.5 g | |
| 분획 8 | 62.9 ± 3.9 g | 66.3 ± 2.5 g |
실시예 6 : 지방세포 분화 저해활성 측정
지방전구세포인 3T3-L1 또는 F442A 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 지방전구세포가 배양시 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 3T3-L1의 경우 Dexamethasone, IBMX, 인슐린 등을 48 ∼ 55시간 정도 처리하여 지방세포분화를 유도하며, 이어 매 2일마다 세포 배양액을 fetal calf serum과 인슐린이 든 배양액으로 치환한다. F442A 세포의 경우 지방전구세포가 세포 배양시 약 90%정도의 밀도를 보일 때 10%의 fetal calf serum과 인슐린이 포함된 배양액으로 바꾸어 주고 매 2일마다 세포배양액을 갈아주고 지방세포의 분화을 유도한다. 지방세포분화 저해활성의 측정은 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획하여 나온 활성분획을 지방세포분화 유도의 초기단계부터 0.1 ∼ 10 μg/ml의 농도로 처리하여 대조군과 비교해 나간다. 90% 이상의 세포가 지방세포로 분화하기까지는 약 12 ∼ 15일 정도가 걸리며, 각각의 분획물의 활성은 대조군과 같은 시기까지 처리하여 그 효능을 관찰하고 현미경사진을 촬영하여 관찰하였다 (도 5).
(도 5) 우슬로부터 나온 활성 분획을 10 ug/ml 농도로 지방전구세포인 3T3 F442A에처리시 지방세포분화 저해.
대조군 우슬처리군
도 5는 지방세포분화 유도시기에 따라 대조군 과 우슬로부터 나온 활성분획물의 지방세포분화 능력을 비교한 것이다. 대조군의 경우 80 ∼ 90%의 F442A세포가 지방세포로 분화하는데 까지 약 11일이 걸린 반면, 우슬로부터 나온 활성분획물의 경우는 분화초기 단계에서부터 10 ug/ml 농도로 처리로 처리하였을 경우 동시기에 각각 10% 이하의 세포만이 지방세포로 분화하였다. 얻어진 활성 분획물은 지방세포 분화를 50％ 저해하는 농도 (IC50)를 측정한 결과 3 ∼ 4 ㎍/㎖로 나타났다.
실시예 7 : 비만 모델동물인
Lepr
db
/Lepr
db
마우스에서 비만예방 및 치료효과 검정
본 실험에서의 비만 모델동물로서 이용된Lepr db /Lepr db 마우스는 렙틴 수용체의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 이로 인하여 출생 후 약 3개월 정도가 되면 일반적인 마우스 체중의 2배에 달하는 50g 내외를 유지하게 된다. 따라서, 비만예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 체중이 50 g 이상 되는 성숙한Lepr db /Lepr db 마우스를 대상으로 하여 모든 실험군에서 각각 8 마리를 대상으로 하여 우슬로부터 분리한 활성분획을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 희석하여 각각의 투여농도 (20 mg/kg, 10 mg/kg 및 3 mg/kg)로 1일 1회씩 4주 동안 일정한 시간(오전 11:00)에 경구 및 복강으로 투여하고, 대조군 8마리의 경우에는 동일량의 DMSO만을 투여였다. 투여시작 4주 후에 실험군과 대조군의 체중을 측정하여 분석하였다.
실시예 8 : 정제의 제조
유효성분 10 g
락토스 70 g
결정성 셀룰로오스 15 g
마그네슘 스테아레이트 5 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법 (direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.
실시예 9 : 분말제의 제조
유효성분 10 g
옥수수 전분 50 g
카르복시 셀룰로오스 40 g
총 량 100 g
상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 9 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
실시예 10 : 장기 및 조직독성실험
우슬로부터 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획한 활성분획을 하루에 20 mg/kg의 농도로 4주 동안 투여하여 비만예방과 치료 효과 등의 관찰시험에 이용된Lepr db /Lepr db 마우스를 대상으로 하여 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하였다. 우슬 활성분획물을 투여한 실험군과 DMSO만을 투여한 대조군의 동물들로부터 투여 4주 후, 혈액을 채취하여 GOT (glutamate-oxalate-transferase), GPT (glutamate-pyruvate-transferase), 크레아틴 카이네이즈 (creatin kinase) 및 크레아티닌 (creatinine)등의 혈액 내 농도를 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계가 있는 것으로 알려진 GOT 및 GPT에 커다란 변화를 나타내지 않았으며, 신장독성의 지표인 크레아티닌과 근육독성의 지표인 크레아틴 카이네이즈 등의 경우에도 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 심장, 폐, 췌장, 부신, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였다. 그 결과, 간 및 그 외 장기에 대한 조직학적 관찰에서 특이한 이상은 관찰되지 않아 동물의 조직이나 장기에 대한 독성은 없는 것으로 관찰되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 우슬로부터 얻은 활성분획 조성물은 지방세포 분화 저해, 비만예방과 치료 효과가 우수하므로 이를 유효성분으로 함유하는 생약제로 사용할 수 있다.
Claims (15)
- 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 얻은 활성 분획물을 주성분으로 하여 치료 또는 예방적 유효량으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 지방세포 분화 저해 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물
- 제 1항 내지 제 2항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물
- 제 3항에 있어서, 활성 성분의 함량이 성인 체중 1kg 당 1 ∼ 1000 mg/일 범위로 투여됨을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물
- 제 1항의 조성물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 제제
- 제 5항에 있어서, 상기 제제는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것임을 특징으로 하는 제제
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 제제가 정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 비경구 투여용의 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제인 것을 특징으로 하는 제제
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 식용음료 또는 식품의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물
- 우슬 (Achyranthes japonica)로부터 용매 추출하여 조 추출액을 얻는 단계를 포함하는 비만 예방 및 치료용 조성물 제조방법
- 제 9항에 있어서, 상기 농축단계 후 농축된 조 추출물의 부가적인 추출단계를 더욱 포함하는 것임을 특징으로 하는 제조방법
- 제 9항에 있어서, 상기 추출에 사용하는 용매는 정제수, 탄소수 1 내지 5의 알코올류, 또는 유기 용매인 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 11항에 있어서, 상기 알코올성 용매는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄올 수용액, 또는 메탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 9항에 있어서, 생약은 건조약제 혹은 생약제인 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 11항에 있어서, 추출용매는 에틸아세테이트, 클로로포름, 또는 핵산인 것임을 특징으로 하는 제조방법
- 제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 활성 분획물
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