KR20030071767A - 에이치에스피90에 결합하기 위한 소분자 조성물 - Google Patents

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Abstract

HSP90 패밀리의 멤버들의 결합 포켓들에 있어 구조적 차이는 HSP90 패밀리 중 적어도 한 종에 대하여 ADP 보다 크고 안사마이신 항생제들과 다른 친화력으로 N-말단 결합 포켓과 상호 작용하는 디자인된 소분자들의 사용을 통하여 카이네이스들과 다른 신호전달 단백질들을 차등 분해하도록 이용될 수 있다. 더욱이, 이들 소분자들은 수성 매질에 가용성이도록 디자인 될 수 있고, 따라서 안사마이신 항생제들을 사용하는데 보다 많은 이점을 제공할 수 있다. 조제 합성물들은 조제적으로 수용 가능한 운반체와 단백질들의 HSP90 패밀리 중 적어도 하나의 멤버의 N-말단 포켓에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 분자를 포함하도록 조직화될 수 있다. 그러한 결합 모이어티들은 작용하기 위해 HSP90 패밀리의 사프롱들을 필요로 하는 단백질들에 의존하는 종양 세포들에 대하여 항증식 활성을 가지는 것으로 발견되었다. 별개의 화학종은 별개의 활성을 가지지만, 예컨대 Raf 카이네이스의 분해 없이 Her2 분해를 선택하도록 한다. 따라서, 결합 모이어티들 고유의 표적능을 가진다. 또한, 소분자들은 세포들의 특이 클래스에 활성을 표적하도록 표적화 모이어티들에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들 조성물들을 투여하여 암을 포함하는 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 결합 모이어티들의 이합체 형태가 또한 사용될 수 있다.

Description

에이치에스피90에 결합하기 위한 소분자 조성물{SMALL MOLECULE COMPOSITIONS FOR BINDING TO HSP90}
본 출원은 단백질들의 HSP90 패밀리(family)에 결합하는 소분자들, 그리고 그러한 소분자들을 만들고 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.
단백질들의 HSP90 패밀리는 포유동물 세포 내에서 4개의 인지된 멤버(members)를 가진다 : Hsp90 α및 β, Grp94 및 Trap-1. Hsp90 α 및 β는 다수의 다른 단백질들과 공동으로 세포질액(cytosol)과 핵 내에 존재한다. Hsp90은 가장 많은 세포 샤프롱(chaperone)이고, 변성되거나 "펴진(unfolded)" 단백질들의 ATP-의존 재접힘에 요구되는 것으로 실험 시스템에서 나타나왔다. 그러므로 그것은 스트레스에 대한 세포 방어의 일부로서 기능하도록 제시되어 왔다. 세포들이 열이나 다른 환경 스트레스에 노출되면, 펴진 단백질들의 집합은 그것들의 재접힘 또는 분해를 촉진시키는 경로에 의해 방해된다. 이 과정은 다수의 샤프롱들(Hsp60, 90 그리고 70 및 p23)과 정렬된 식으로 펴진 단백질의 연합에 의존하고, "리폴도솜(refoldosome)" 그리고 결국 재접힌 단백질로부터 샤프롱들의ATP-의존 유리(release)를 형성한다.
Hsp90은 돌연변이된 단백질들의 안정성과 기능을 유지하는 역할을 또한 할 수 있다. 그것은 돌연변이된 p53 및 v-src의 발현을 위하여 그것들의 야생형들보다 훨씬 많은 정도로 요구되는 것으로 보인다. 이것은 단백질 펴짐으로 이끄는 돌연변이들의 표현형의 hsp90-매개 억제의 결과로서 일어나는 것으로 제시되어 왔다.
Hsp90은 세포 밖의 인자들에 대한 세포의 성장 응답에 포함되는 몇몇 키(key) 단백질들의 입체형태의 성숙에 또한 필요하다. 이것들은 어떤 막횡단 카이네이스들(kinases)(즉, Raf 세린 카이네이스, v-src, Her2)과 스테로이드 수용체들을 포함한다. hsp90이 이들 단백질에 영향을 주는 메커니즘은 충분히 이해되지 않았지만, 단백질 재접힘에서 그것의 역할과 유사한 것으로 나타난다. 프로제스테론(progesterone) 수용체의 경우에, 수용체로부터 hsp90의 결합과 유리는 다른 샤프롱들 및 이뮤노필린들(immunophilins)의 유리와 협력하여 사이클 식으로 일어나고 스테로이드가 수용체에 고친화 결합하는데 요구되는 것으로 나타나 왔다. 따라서, hsp90은 스트레스가 없는 경우에도 신호전달 경로의 생리적 조절자로서 작용할 수 있었다.
Hsp90은 또한 다수의 종양형(tumor types)에서 과발현되고 종양유전자 변형에 작용하는 것으로서 나타나 왔다. 그것이 변형을 유지하는데 필요한 역할을 하는지는 알려지지 않지만, 이와 관련하여 적어도 3가지 기능을 가질 수 있을 것이다. 암세포들은 저산소, 저 pH 및 저영양 농도 환경에서 성장한다. 그것들은 방사선과 세포독성 화학요법제들에 빠르게 적응하거나 내성이 되도록 선택된다. 따라서, 스트레스 하에 단백질들의 안정성을 유지하는데 있어서 hsp90의 일반적인 역할은 이들 조건 하에서 세포 생존력에 필요할 수 있다. 다음으로, 암세포들은 돌연변이된 종양유전자 단백질들을 포함한다. 이것들 중 몇몇은 변형된 표현형에 필요한 기능획득 돌연변이다. Hsp90은 이들 단백질의 접히고 기능적으로 활성인 입체형태를 유지하는데 필요할 수 있다. 세 번째로, 스테로이드 수용체들, Raf 및 다른 hsp90 표적들(targets)로 매개된 신호전달 경로의 활성화는 기능성 hsp90을 또한 십중팔구 필요로 하는 많은 종양의 성장과 생존에 필요하다.
Hsp90의 이러한 특성들은 그것을 치료제들에 대하여 생존성 표적으로 만든다. HSP90 패밀리 멤버들은 박테리아에서 포유동물까지 모든 hsp90에 특유하고 그것들 가운데 보존되지만 다른 분자 샤프롱에는 존재하지 않는 독특한 포켓(pocket)을 그것들의 N-말단 부위에 가진다. 이 포켓에 관한 내재 리간드 알려지지 않았지만, 그것은 ATP와 ADP를 저친화력으로 결합시키고 약한 ATPase 활성을 가진다. 또한, 안사마이신(ansamycin) 항생제 겔다나마이신(geldanamycin : GM) 및 허비마이신(herbimycin : HA)은 이 보존 포켓에 결합하는 것으로 나타나 왔다. 이 결합 친화력은 HPS90 패밀리의 모든 멤버들에 대하여 나타나 왔다. 여기에 참조로서 통합되는 국제특허 공개번호 WO98/51702는 표적화된 세포들에서 단백질들의 분해와 그것들의 사멸로 이끄는 안사마이신의 표적화된 수송(targeted delivery)을 제공하기 위하여 표적화 모이어티(targeting moiety)에 연결되는 안사마이신 항생제들의 사용을 개시한다. 국제특허 공개번호 WO00/61578은 샤프롱 단백질 hsp90과 상호 작용하는 2개의 양기능 모이어티를 가진 분자들에 관한 것이고, 특히 안사마이신 항생제들의 호모 및 헤테로 이량체들을 포함한다. 이들 양기능 분자들은 HER-패밀리 타이로신(tyrosine) 카이네이스의 분해 및/또는 억제를 촉진하도록 작용하고 Her-카이네이스들을 과발현시키는 암 치료에 효과적이다.
겔다나마이신 및 다른 안사마이신 항생제들과 그것들의 유도체들의 사용은 다수의 카이네이스 및 다른 신호전달 단백질들의 효과적인 분해를 제공하지만, 그것들은 중요한 선택성이 일반적으로 결핍되고, 그 대신에 광범위한 단백질들을 분해하는데 효과적이다. 이것은 탐탁지 않은 부작용들의 위험을 증가시킬 수 있다. 또한, 안사마이신 항생제들은 수성 매질에 불용성이거나 최악의 가용성 물질이다. 이것은 투여를 복잡하게 한다. 따라서, 샤프롱 단백질들의 HSP90 패밀리의 멤버들과 상호 작용을 통하여 카이네이스 및 다른 신호전달 단백질들을 분해시키는 치료제들을 개선시킬 여지가 있다.
본 출원은 2000.11. 2.일자로 출원된 미국 가출원 제60/245,177호의 이익을 청구하고, 그것은 여기에 참조로서 통합된다.
도1은 샤프롱 단백질들인 Hsp90 α(Seq. ID No. 1), GRP94(Seq. ID No. 2), Hsp90 β(Seq. ID No. 3) 및 Trap1(Seq. ID. No. 4)의 HSP90 패밀리의 알려진 멤버들에서 N-말단 결합 포켓에 기여하는 아미노산들의 정렬된 서열들을 나타낸 도면이다.
도2는 본 발명의 결합 모이어티가 배치된 포켓의 3차원 도면이다.
도3A 및 B는 분자 모델링으로 결정된 hsp90 포켓 내부 및 x-레이 결정학으로 결정된 상기 포켓의 외부 PU3의 입체형태를 나타낸 도면이다.
도4는 퓨린(purine) 핵에 기초한 대표적인 결합 모이어티/화합물을 나타내고, HSP90 패밀리 멤버들의 N-말단 포켓에서 결합 자리들과 다양한 치환기들의 상호 작용을 나타낸 도면이다.
도5는 본 발명에 따른 화합물들의 구조를 나타낸 도면이다.
도6A는 본 발명에 따른 화합물들을 만드는 합성 절차를 나타낸 도면이다.
도6B는 본 발명에 따른 대표적인 9-N 알킬화 화합물들을 나타낸 도면이다.
도7A는 소형 소수성 결합 자리와 상호 작용을 위한 X3 위치에서 작용기들의 도입을 위한 합성도식(synthetic scheme)을 나타낸다.
도7B는 소형 소수성 결합 자리와 상호 작용을 위한 X3 위치에서 작용기들의 도입을 위한 제2의 합성도식을 나타낸다.
도8A 및 B는 X2 자리에서 변이를 도입하기 위한 합성도식을 나타낸다.
도9는 본 발명에 따른 결합 모이어티들을 생성하기 위한 합성도식을 나타낸다.
도10은 PU 패밀리 화합물들에서 퓨린과 페닐기들 사이 교량(bridge)의 길이와 특성에 있어서 변이를 도입하기 위한 합성도식을 나타낸다.
도11은 이합체화(dimerization) 또는 표적화 모이어티들의 부가(addition)를 나타낸 도면이다.
도12는 결합 모이어티들의 비교 친화력을 평가하기 위한 도식적인 방법론을 나타낸 도면이다.
도14A-C는 유방암세포에 대한 PU3의 항증식 효과를 타나낸 도면이다.
도15는 일실시예에서 시험된 화합물들의 X1치환기들을 나타낸 도면이다.
도16A 및 B는 PU3을 수식하는 절차와 고정화를 위한 바이오티닐레이션(biotinylation)을 사용하는 절차를 나타낸 도면이다.
도17A 및 B는 PU3와 PU24FCl에 의한 Akt 단백질의 분해를 나타낸 도면이다.
도18A 및 B는 성장 저지, Her2 총 단백질 분해 및 Hsp90 결합 효능 사이의 상호관계를 나타낸 도면이다.
도19는 PU24FCl로 Her2 분해를 나타낸 도면이다.
단백질의 HSP90 패밀리 멤버들은 고도로 보존되는 독특한 N-말단 결합 포켓으로 특징되지만, 다양한 멤버들의 포켓들 사이에는 구조적 차이가 있다. 이들 구조적 차이는 ADP보다 크고 안사마이신 항생제들과 다른 친화성으로 포켓을 결합하는 N-말단과 상호 작용하는 디자인된 소분자들을 사용하여 카이네이스 및 다른 신호전달 단백질들을 차별 분해하는데 활용될 수 있는 것으로 현재 밝혀졌다. 더욱이, 이들 소분자들은 수성 매체에 가용성이도록 디자인될 수 있고, 따라서 안사마이신 항생제들의 사용에 보다 많은 이점을 제공할 수 있다.
단백질들 패밀리 중 HSP90의 N-말단 포켓들은 5개의 포텐셜 결합자리(potential binding sites)를 포함한다. Hsp90 α의 경우에, 이들 결합 자리는:
(a) Lys112를 포함하는 상측 결합 자리;
(b) Lys58, Asp54, Phe138 백본(backbone), Gly135 및 Asn106을 포함하는 차상측 결합 자리;
(c) Asp93, Ser52 및 Asn51을 포함하는 바닥 결합 자리;
(d) Val150, Met98, Val186, Phe138, Leu107, Leu103, Val186 및 Trp162를 포함하는 소수성 측면 결합 자리; 및
(e) Thr184, Val186, Val150 및 Ile91을 포함하는 소형 소수성 바닥 결합 자리이다.
본 발명은 조제적으로 수용 가능한 운반체(carrier) 및 단백질들의 HSP90 패밀리의 적어도 하나의 멤버의 N-말단 포켓에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 분자를 포함하는 조제 조성물들을 제공한다. 이 결합 모이어티는 HSP90 패밀리 내의 적어도 하나의 특이 단백질에 대하여 ADP 보다 크지만 겔다나마이신 보다 작은 친화력으로 N-말단 포켓과 상호 작용한다. 또한, 상기 결합 모이어티는 단백질들의 HSP90 패밀리 중 한 멤버의 N-말단 포켓 내에 배치될 때 접힌 C-입체형상을 이룰 수 있는 백본을 가진다. 상기 결합 모이어티는 N-말단 포켓 내의 다수의 포텐셜 결합 자리들과 상호 작용하는 방향으로 향한 백본 상에 치환기들을 또한 가진다.
본 발명의 결합 모이어티들은 작용하기 위해 HSP90 패밀리의 샤프롱들을 필요로 하는 단백질들에 의존하는 암세포들에 대하여 항증식 활성을 가지는 것으로밝혀졌다. 별개의 화학종은 별개의 활성을 가지지만, 예컨대 Raf 카이네이스의 분해 없이 Her2 분해의 선택을 허용한다. 따라서, 본 발명의 결합 모이어티들은 고유의 표적능(targeting capacity)을 가진다. 또한, 소분자들은 세포들의 특이 클래스(classes)에 활성을 표적하도록 표적화 모이어티들에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들 조성물들을 투여하여 암을 포함하는 질병을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 결합 모이어티들의 이합체형들(dimeric forms)이 또한 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 선택적으로 그리고 ADP 보다 크고 겔다나마이신보다 작은 친화력으로 단백질들의 HSP90 패밀리의 하나 이상의 멤버들, 예컨대 하나 이상의 hsp90 α 또는 β, Grp94 및 Trap-1, 또는 DNA 자이레이스(gyrase)와 MutL 같은 유사한 포켓들을 가진 단백질들의 N-말단 포켓에 결합하는 소분자들에 관한 것이다. 본 출원서의 명세서 및 청구항에서 사용되는 용어 "HSP90의 N-말단 포켓"은 겔다마이신 및 다른 안사마이신 항생제들이 결합하는 포켓을 말하고, 그것은 ATP/ADP에 의해 차지된다.
도1은 단백질들의 HSP90 패밀리의 알려진 멤버들 각각의 구조를 비교하는 정렬된 서열들을 나타낸다. Hsp90 α의 경우에, 5개의 포텐셜 결합 자리는:
(a) Lys112를 포함하는 상측 결합 자리;
(b) Lys58, Asp54, Phe138 백본, Gly135 및 Asn106을 포함하는 차상측 결합 자리;
(c) Asp93, Ser52 및 Asn51을 포함하는 바닥 결합 자리;
(d) Val150, Met98, Val186, Phe138, Leu107, Leu103, Val186 및 Trp162를 포함하는 소수성 측면 결합 자리; 및
(e) Thr184, Val186, Val150 및 Ile91을 포함하는 소형 소수성 바닥 결합 자리이다.
도1에 나타난 바와 같이, N-말단 포켓은 단백질들의 HSP90 패밀리에서 고도로 보존되는 동안에 다양한 멤버들 사이에 차이점을 가진다. 본 발명의 결합 모이어티들은 카이네이스 또는 다른 신호전달 단백질들을 차별 분해할 수 있는 화합물들을 제공하기 위해 이들 차이점들을 이용한다. 본 출원서의 명세서와 청구항에서 사용되는 용어 "차별 분해(differential degradation)"는 겔다나마이신의 존재 하에서 분해되는 다른 카이네이스나 신호전달 단백질보다 많은 정도로 카이네이스나 신호전달 단백질을 분해하는 것을 말하거나, 갈다나마이신의 존재 하에서 얻어지는 것과 다른 생성물로 카이네이스나 신호전달 단백질을 분해하는 것을 말한다.
N-말단 결합 포켓의 크기 및 형태는 Stebbins et al., "Hsp90-겔다나마이신 복합체의 결정 구조: 항종양제에 의한 단백질 샤프롱의 표적화(targeting)"Cell89:239-250 (1997)에 상술된다. 거기서 포켓은 평평한 바닥 원추로서 설명될 수 있는 것으로 관찰된다; 그것은 깊이가 약 15 Å, 그것의 표면 근처 직경이 12 Å, 중간쯤에서 아래로 12 Å, 그리고 바닥에서 3개의 물분자들을 수용하기에 충분히 넓다. 본 발명의 조제 조성물들에서 결합 모이어티들은 이 포켓 내에 적합하고 N-말단 포켓 내의 다수의 포텐셜 결합 자리들과 상호 작용하도록 디자인된다.
도2는 분자 디자인 과정을 시각화하는 것을 돕기 위하여 도4에 나타난 타입의 결합 모이어티를 가진 포켓의 3차원 도면을 나타낸다. 도3A 및 B는 각각 포켓 내부, 그리고 도시된 포켓 없이, x-레이 결정학으로 결정된 hsp90 포켓 내부의 퓨린 핵(PU3)에 기초하여 디자인된 결합 모이어티의 입체형태를 나타낸다. 포켓의 개구(10)는 도안의 바닥 가까이에 배치된다. 포켓 자체는 4개의 가지(arm)를 가지고, 가지(11)은 개구(10)에 가장 가까이 있고 바닥 결합 자리를 포함한다. 도4에 나타난 것처럼, 이 가지의 내부는 퓨린 핵의 아미노 치환기와 상호 작용한다.
제2 가지(13)는 약 95-110°의 각으로 제1 가지에 연결된다. 제3 가지(12)는 약 100-120°의 각으로 제1 가지(11)에 연결된다. 이들 2개의 가지들은 2개의 결합 자리들을 포함하고 성질이 일반적으로 친수성이다. 치환기 X2(도4)는 이들 2개의 가지들 중 하나 내에 적합하고, 결합 모이어티를 독특한 C-형으로 굽히는 결과를 가져온다. 이 C-형을 채택하기 위한 능력은 결합 모이어티들로서 작용하는 분자들을 선택할 때 고려되어야 한다. 도2에 표시된 것처럼, 가지(11)와 가지(13) 사이의 분리거리(9.5-11 Å)는 가지(11)와 가지(12) 사이의 분리거리(8-9 Å)보다 크다. 따라서, 가지(12) 위쪽의 가지(13)에 분자를 삽입하는데 보다 긴 치환기(X2)를 선택하는 것이 유리할 수 있다. 제4 가지(14)는 측면 소수성 포켓을 포함하고, 치환기 X3을 수용한다(도4). 이 포켓은 약 100 Å3의 부피를 가지고 특성이 일반적으로 소수성이다. 따라서, 치환기 X1(도4)은 이 포켓을 채우고 소수성 잔기들(residues)과 상호 작용하도록 선택된다.
본 발명의 제1 실시예에 있어서, 결합 모이어티는 완전한 분자이다. 도4는 퓨린 핵에 기초한 이 타입의 대표적인 구조를 나타내고, N-말단 결합 포켓 내의 결합 자리들과 치환기들 사이의 상호 작용을 나타낸다. 도4에서, 치환기 X1은 어떤 소수성 사슬(포켓 내에 적합한 C, H, N, O 및/또는 S 원자들을 포함하는 선형, 분지 지방족, 방향족, 비고리(acyclic), 고리)일 수 있고; X2는 포켓 내에 적합하고 할로겐 같은 그룹들의 활성을 높일 수 있는 전자 공여 그룹을 옵션으로 부가하는 OR, OCOR, NCOR 등과 같은 1에서 5 수소 수용체 기능기들(functionalities)이고, X3은 예컨대 플로린(fluorine) 같은 그룹인, 포켓 내에 적합한 어떤 소형 치환기이다. 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 분자들과 겔다나마이신 항체들 및 유도체들 사이의 구조적 차이는 이들 결합 모이어티들과 소수성 측면 결합 자리 및 소형 소수성 결합 자리 사이의 상호 작용이다. Stebbins et al.에서 관찰된 것처럼, 이들 자리는 포켓의 바닥에 위치하고, 겔다나마이신은 이들 부분을 채우지 않는다. 오히려, 갈다나마이신의 메틸기가 측면 포켓으로 단지 부분적으로 뻗치고, 포켓의 바닥에 물분자들을 위한 장소를 남겨둔다. 반대로, 본 발명의 조성물들에 있어서, 치환기들은 포켓에서 적어도 소수성 측면 결합 자리를 채우도록 선택될 수 있다. 본 출원서에서 사용된 용어 "채우다"는 물분자를 수용하기 위한 장소가 남아있지 않을 정도까지 결합 자리를 차지하는 것을 말한다.
HSP90 단백질들의 N-말단 포켓 내에 적합하고 HSP90 패밀리의 적어도 하나의 멤버에 대하여 겔다나마이신과 ADP의 그것 사이의 친화력으로 포켓들과 상호 작용하도록 디자인된 본 발명의 범위 내의 결합 모이어티들의 다른 실시예는 도5에 나타나 있다. 이들 조성물들에서, X1은 소수성 사슬(포켓 내에 적합한 C, H, N, O및/또는 S 원자들을 포함하는 선형, 분지 지방족, 방향족, 비고리, 고리)이거나, R이 소수성 사슬인 COR이고; X2는 같거나 다를 수 있는 1에서 5 수소 수용체/공여자 기능기들이고; X3은 알킬(alkyl)(포화, 불포화, 고리 또는 선형), 알콕시(alkoxy)(예컨대 메톡시(methoxy) 또는 에톡시(ethoxy)), 할로겐 또는 SR(여기서 R은 메틸(methyl) 또는 에틸(ethyl)) 같은 소형 그룹이고; X4는 H 또는 X3과 같고, X5는 H 또는 X1과 같고; X6은 -NH2, -OR(R은 H 또는 알킬), 또는 -CONH2또는 유사한 수소 공여 기능기이고 R1은 H 또는 알킬이다. 이들 분자들은 C-형 입체형상으로 접히는 것이 모두 가능하고 적어도 3개의 포텐셜 결합 자리들과 상호 작용하며, 소수성 측면 자리를 포함한다. 별개의 핵들을 가지지만 전체 부피(∼200-500 Å3) 및 치수들이 유사한 화합물들이 같은 식으로 디자인될 수 있고 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 평가될 것이다.
도5에서 PU 패밀리로서 나타난 구조를 가진 조성물들은 도6A에 약술된 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 카르복실산(carboxylic acid) 시발 재료는 피리딘/DCM에서 시아누릭 플로라이드(cyanuric fluoride)와 반응하여 산(acid) 플로라이드로 변환되거나 SOCl2와 반응하여 산 클로라이드(chloride)로 변환된다. 본 발명에 따른 유용한 조성물들인 치환된 8-벤질 퓨린(benzyl purine) 유도체들(PU-A, PU-B, PU-C)을 생성하기 위해 고리 닫힘(ring closure) 되는 중간 생성물(도1에서 PY-A, PY-B, PY-C)을 생성하기 위하여, 이 산 할라이드(halide)는 (DIEA/DMF에서 4,5,6-트리아미노피리딘 설페이트(sulfate) 또는 수성 NaOH에서 2,4,5,6-테트라아미노피리미딘 설페이트, 또는 DMF에서 K2CO3을 가진 어느 한 설페이트 같은) 아미노-치환된 피리미딘(pyrimidine)과 반응한다. 원한다면, Mitsonobu 알킬화 같은 알킬화 반응은 알킬기, R을 (작용 치환기들과 함께 또는 없이) 9-위치에서 질소에 부가하여 수행될 수 있다. PU 패밀리 전구체 PU-C의 9-N 알킬화로 만들어진 대표적인 조성물들은 도6B에 나타나 있다.
도7A는 소형 소수성 결합 자리와 상호 작용을 위한 X3 위치에서 작용기들의 도입을 위한 합성도식들을 나타낸다. 도8A 및 B는 X2 자리에서 변이들을 도입하기 위한 합성도식들을 나타낸다.
도9는 도5에서의 화합물들의 RD 클래스의 합성을 위한 합성도식을 나타낸다. 도5에 도시된 다른 클래스들은 유사한 합성 접근법을 사용하여 만들어질 수 있다.
본 발명의 조성물들은 암과 다른 질병을 치료하는데 치료적 이점을 제공하기 위하여 직접 사용될 수 있다. 아래 실시예들에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 조성물들은 SKBr3, MCF-7 및 BT474 유방암 세포들에서 Her2 카이네이스에 있어서의 분해를 유도하는 것으로 나타난다. 또한, 본 발명의 조성물들은 Rb-양성 SKBr3 및 MCF-7 유방암 세포주들(cell lines)이 G1 저지되도록 하는데 효과적이고, 이들 세포주들 및 BT474, MDA-MB468 그리고 전립선암 세포주 TSUPr와 LNCaP에 대하여 항증식 효과를 가지는 것으로 나타난다.
PU 패밀리의 화합물들은 Hsp90에 결합, Her2 전(total)단백질의 분해 및 그것들의 항증식 효과에 대하여 시험되었다. 표1은 이 활성에서 9-N 사슬의 영향을 요약한다. 표에 기재되지 않은 PU 패밀리의 화합물들(도6)은 비활성이거나 불용성이었다.
PU 패밀리의 화합물들은 도7B의 반응 프로토콜을 사용하여 치환기 X3(C-2 플로리네이션(fluorination))으로서 플로린 그룹을 부가하여 수식되었다. 결과는 표2에 요약된다. 보다시피, 플로린 치환기의 도입은 공통 X1 그룹들을 가진 조성물들의 활성을 증가시켰고, 표1에서 활성이 보고되지 않은 X1 치환기들을 가진 조성물들의 활성/용해도를 높였다.
활성에 있어서의 변화는 부가 할로겐 치환기들이 도8B에 나타난 반응도식을 사용하여 페닐 고리에 부가되었을 때 또한 관찰되었다. 표3에서 보는 바와 같이, PU3에서 메톡시 그룹들에 의해 차지되지 않은 위치들의 양쪽이 아닌 한쪽에서 할라이드의 도입은 PU3에 관한 활성을 증가시켰다.
화합물들은 화합물 PU3PhCl에서와 같은 클로린(chlorine) 치환기와 PU24F 또는 PU29F에서와 같은 플로린 치환기로 조제되었다. 표4에서 보는 것처럼, 이들 화합물들은 지금까지 시험된 것들 중 가장 활성적이었다.
분자들의 UP 패밀리에서 포텐셜 변화의 다른 위치는 퓨린 및 페닐기들 사이 교량의 길이와 특성에 있다. 도10은 그러한 변화를 달성하기 위한 합성도식을 나타낸다. 화합물 69는 시험되었고 hsp 90-베타에는 약한 결합이지만 hsp 90-알파에는 탐지불가한 결합을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이것은 화합물 18에 대하여 관찰된 결합 선택성의 반대이다. 이것은 이들 2개의 단백질 사이의 선택성을 제공한다.
개별적으로 본 발명의 조성물들의 사용에 대한 다른 방법으로서, 도5의 일반 구조들에서 나타난 바와 같이 hsp-결합 핵들이 있는 연결된-조성물들은 세포들의 표적 집단에서 발견되는 단백질, 수용체, 표지자(marker)에 특이적으로 결합하도록 선택되는 표적화 모이어티에 연결하여 유도되거나(derivatized) 그것은 이합체화 될 수 있다(도11 참조). 표적화 모이어티는 호로몬, 호로몬 유사체, 단백질 수용체- 또는 표지자-특이 항체 또는 관심 표적에 특이적으로 결합하는 다른 리간드(ligand)일 수 있다. 특정 표적화 모이어티들은 에스트로전(estrogen)과 안드로전(androgen)과 프로제스테론(progesterone) 수용체들을 포함하는 스테로이드 수용체들, 그리고 막횡단 타이로신(tyrosine) 카이네이스들, src-관련 타이로신 카이네이스들, raf 카이네이스들 및 PI-3 카이네이스들에 결합한다. 특이 타이로신 카이네이스들은 HER-2 수용체들과 표피 성장 인자(EGF) 수용체 패밀리의 다른 멤버들, 그리고 인슐린과 인슐린 같은 성장 인자 수용체들을 포함한다. 특이 표적화 모이어티들의 예는 에스트로전, 에스트라디올(estradiol), 프로제스틴(progestin), 테스토테론(testoterone), 타목시펜(tamoxifen) 및 워트마닌(wortmannin)을 포함한다. 표적화 모이어티들은 또한 수용체들에 특이적으로 결합하는 항체들, 예컨대, 여기서 참조로서 통합되는 국제특허 공개번호 WO96/32480, WO96/40789 및 WO97/04801에 개시된 Her2 수용체들에 결합하는 항체들일 수 있다.
세포 기능에 필수적인 단백질들의 분해를 초래하고, 따라서 성장을 방해하고/또는 세포 사멸을 촉진하는 그것들의 능력 때문에, 본 발명의 hsp-결합화합물들은, 표적화 모이어티와 함께 또는 없이, 다양한 질병 조건의 치료적 처리에 사용될 수 있다. 적절한 치료법은 증대한 양으로 발견되거나 질병-관련 세포들에서 돌연변이되거나, 그러한 세포들의 생존력을 좌우하는 카이네이스 또는 단백질을 분해하는 것이다. 대부분의 암세포들에서 악성을 유지하는데 있어서 HSP90 단백질들의 일반적인 역할은 항암제를 개발하는데 있어서 이 표적이 중요함을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 치료적 소분자들은 HSP90 단백질에 의해 조장되거나 그것을 필요로 하는 모든 암의 치료에 새로운 양상을 제공한다. 예컨대, 본 발명의 조성물들은 다양한 형태의 암, 특히 Her2 또는 돌연변이되거나 야생형 스테로이드 수용체들을 과발현시키는 것들, 또는 작용 RB 단백질이 부족한 것들의 치료에 사용될 수 있다. 그러한 암들은 유방암과 전립선암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물들은 선택적 분해에 대한 병인과 관련된 단백질들을 표적화하여 다른 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 표적가능 단백질들의 예는 자기면역 질병들과 관련된 항원들과 알츠하이머병과 관련된 병원성 단백질들을 포함한다.
본 발명의 조성물들은 질병 상태나 중요한 조건과 관련된 특이 단백질들을 분해하는데 적절히 이용된다. 본 발명의 조성물들은 특이 카이네이스들 또는 신호전달 단백질들을 분해하기 위해 선택될 수 있으므로, 적절한 치료법은 병에 걸린 세포들에서 증대한 양으로 발견되는 단백질이나 카이네이스를 분해하는 것이다. 따라서, 예컨대, Her2 카이네이스를 분해하지만 다른 HER 카이네이스들이나 Raf 카이네이스를 분해하니 않는 결합 모이어티의 선택이 Her2-양성 유방암의 치료에적절할 것이다. 하기 실시예들은in vitro관찰되는 특이성에 기초한 특이 화합물들의 선택하는데 지침을 제공한다. 또한, 스크리닝(screening) 기술이 결합 친화력과 분별 분해에 관한 구조들의 평가를 용이하게 하기 위해 후술된다.
본 발명의 조성물들은 치료가 필요한 인간 환자를 포함하는 환자에 원하는 치료 결과를 얻기에 효과적인 양으로 투여된다. 적절한 투여 루트는 정맥 투여이고, 그것은 현재 화학요법에서 일반적으로 사용된다. 또한, 본 발명의 조성물들은 가용성 소분자들이므로, 그것들은 경구 투여에 적합하다. 경구 투여 루트를 사용할 수 있음은 매일 같이 빈번한 치료를 요하는 경우에 특히 바람직하다. 투여되어야 할 어떤 주어진 조성물의 양과 적당한 투여 스케줄은 표준 디자인의 독성 시험과 임상 시험을 사용하여 결정되고 위험 이득 분석으로부터 도출된 결과를 나타낼 것이다. 그러한 분석들은 당업자에 의해 일상적으로 수행되고, 부적당한 실험을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 결합 모이어티들로서 사용하기 위한 분자들의 디자인에 다른 방법이나 부가법으로서, 합성물들을 HSP90의 N-말단 포켓에 그것들의 결합 친화력에 대하여 시험하거나, 단백질들을 포켓의 HSP90 타입의 존재에 대하여 시험하는데 사용될 수 있는 고속 스크리닝 분석을 개발하였다. 도12에 개괄된 것처럼, (96 구멍판들(96 well microtiter plates)의 바닥과 같은) 고형체 기질(substrate)의 표면은 N-옥시서시니미딜(oxysuccinimydyl) 작용기들로 기능화된다. 이것들은 아미노-기능화된 GM(또는 다른 안사마이신 항생제)와 함께 이소프로파놀(isopropanol)에서 반응한다. 웰(wells)에 결합된 GM의 양은 345nm에서 분광계 흡광도 측정에의해 평가될 수 있다. 결합된 GM이 토끼 망상적혈구 용해질로 배양될 때, 보다 특정한 검출법이 선호되더라도, 충분한 hsp90이 비색법(colorimetric methods)으로 검출 가능하도록 포착된다. 예컨대, 결합된 GM은 표지(labeled) 항-HRP 항체를 사용하여 검출될 수 있다. HSP90 결합 효능을 검사하기 위해, 시험 화합물은 토끼 망상적혈구 용해질(또는 다른 hsp90 소스(source))과 함께 웰에 부가되고 포착된 hsp의 양에 있어서의 어떤 차이점들이 기록된다. 만일 상기 시험 화합물이 hsp90을 GM보다 큰 친화력으로 결합한다면, 그것은 고정된 GM과 경합할 것이고 그 결과 포착되는 hsp90의 양은 감소하게 된다. 분석에 사용되는 HSP90 패밀리의 멤버를 변화시킴으로써, 이들 동일한 판들(plates)이 시험 화합물들의 특이성에 있어서의 차이를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 판들은 HSP90 타입의 결합 포켓을 가진 단백질들에 대한 단백질/펩타이드(peptide) 문고를 스크린하는데 또한 사용될 수 있다.
Hsp90-알파 및 Hsp90-베타와 분별 상호 반응하는 화합물들을 확인하도록 하는 시험이 또한 디자인되었다. 이 시험에서, 겔다나마이신(또는 다른 안사미이신 항생제들이나 라디시콜(radicicol) 같은 다른 강한 비식별 hsp90 결합자)은 필요한 만큼 수식되고 비드(beads) 같은 고체 지지물에 부착된다. 알파와 베타형 모두를 포함하는 Hsp90 단백질 조제는 평가될 화합물의 있거나 없이 지지물로 배양된다. 만일 상기 화합물이 Hsp90 단백질에 결합한다면, 그것은 고체 지지물에 단백질이 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 세척 후, 지지물에 결합한 물질은 용리되고 용출액은 SDS/PAGE 젤(gel) 상에서 분리되며 결합 물질의 양을 결정하기 위해 항-Hsp90-알파 및 항-Hsp-90-베타로 면역블롯팅(immunoblotting)에 의하여 시각화된다. 대안으로서, 만일 Hsp90 단백질 조제의 양 또는 Hsp90의 알파 대 베타형의 알려진 비율이 우선적으로 사용된다면, 비결합한 물질은 유사한 기술로 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 후보 화합물들은 Stockwell et al.,Chem Biol.6:71-83 (1999)의 세포 기반 분석(cell-based assay)을 사용하여 암세포주의 패널(panel)에서 암세포들에서 증가한 양으로 발견되거나 상기 세포들의 생존력을 좌우하는 단백질들을 (예컨대 Her2, Her3, Raf-1, ER, Rb, cdk-4, Hsp90, Trap-1 및 Grp94) 감소시키거나 유도하는 그것들의 능력에 대하여 또한 평가될 수 있다. 이 분석에서, 세포들은 웰의 바닥에서 성장하고 고정된다. 고정된 세포들은 용액에서 특이 1차 항체를 사용하여 특이 1차 항원(종양 유전자 단백질)의 존재에 관하여 조사된다. 서양고추냉이 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase)에 공유결합된 2차 항체가 부가되고, 결과 복합체는 루미놀(luminol), 과산화수소 및 p-아이오도페놀(p-iodophenol) 같은 증강자를 부가하여 유발된 화학발광 반응을 통하여 검출된다. 약제의 존재 하에서 검출되는 발광 수준에 있어서 차이는 표적된 단백질의 분해 또는 유도에 관한 약제의 활성을 나타낸다.
약제는 세포 형태에서 관찰되는 매우 특징적인 변화에 기초하여 또한 분석될 수 있다. PU3에 노출된 MCF-7 세포들은 납작해지고, 크기가 증가하며 뚜렷한 세포 경계를 갖는다. 크기의 증가는 대부분 풍부한 세포질 때문이다. 이들 형태적 변화들은 성숙한 상피 분화의 특성이고 변형의 반전이다.
제3의 대안으로서, 약제 효과를 평가하는데 면역 형광법(IF)과 헤마톡실린 & 에오신 염색(Hematoxylin and Eosin stain : H&E)이 사용될 수 있다. 세포들은 8 웰 챔버 슬라이드(8 well chamber slides, Fisher Scientific) 상에서 평판 배양되었고 24시간 동안 씨드되었다(seeded). 약제 또는 비클(vehicle)이 5일 동안 부가되었고, 뒤에 IF를 위해 상기 슬라이드는 빙냉(ice-cold) PBS로 2회 세척되었고 메탄올과 아세톤 용액(1:1)으로 15초 동안 고정되었다. 고정된 단일층들은 증류수로 세척되었고 PBS 용액에서 5% BSA로 차단되었다. 차단(blocking) 후, 세포들은 1차 항체(PBS 내 5% BSA 내 1:100, 항-MFMG, Chemicon, 1:100)로 37℃에서 배양되었고 PBS 내에서 1% BSA로 3회 세척되었고, 다음에 로다민-표지(rhodamime-labeled) 2차 항체로 37℃에서 배양되었다. 핵들은 1 mg/ml의 DAPI로 염색되었다. H&E를 위해, 세포들은 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 RT에서 10분 동안 고정되었고 표준 H&E 염색 프로토콜에 따라 염색되었다. 갖가지 처리를 하여 G1 저지를 유도하는 것은 몇몇 젖 단백질의 발현을 유도하기에 충분하다. 그러나, 오직 안사마이신들, HDAC 저해제 및 hsp90 결합 분자들만이 대량의 형태학적 그리고 생물학적 변화를 유발한다.
본 발명의 치료법의 사용에 대하여, 발명의 조성물들은 조제적으로 수용 가능한 운반체에서 포뮬레이션(formulation)된다. 주입 가능한 포뮬레이션에 대하여, 이것은 멸균 용액(예컨대 멸균 염류)일 수 있고, 또는 화합물들은 지질 운반체에서 포뮬레이션될 수 있다. 경구 포뮬레이션에 대하여, 발명의 조성물들은 적당한 첨가제와 함께 정제나 캡슐 또는 액체 포뮬레이션 같은 편리한 제형 단위 형태로 포장될 수 있다. 후자의 경우에, 액체 제약은 맛을 좋게하는 향미제를 적절하게 포함할 것이고, 색소 및 다른 기존 첨가제들을 또한 포함할 수도 있다.
실시예 1
일반식 1을 가진 조성물들은 도6A에 나타난 도식에 따라 합성되었다. 산 플로라이드를 생성하기 위하여, (비활성 분위기 하에) CH2Cl215 mL 내의 페닐 아세트산 유도체(3mmol) 용액에 1.5 당량의 시아누릭 플로라이드와 피리딘(3 mmol)이 부가되었다. 상기 혼합물은 실온에서 1.5시간 동안 휘젓긴 후 CH2Cl230 mL가 더 부가되었다. 결과 용액은 0.5 mL 물로 1회 세척되었고, 용매를 제거하여 나온 미정제 산 플로라이드 물질은 다음 단계에서 사용되었다.
산 플로라이드는 다음과 같이 PY-A, PY-B 및 PY-C 유도체들을 생성하기 위해 사용되었다: DMF 1.5 mL 내의 4,5,6-트리아미노피리미딘 설페이트 675 mg(2.8 mmol)에 DIEA 1.5 mL(9 mmol)이 부가되었고, (전술한 것처럼 얻은) 산 플로라이드는 5mL CH2Cl2와 촉매 양의 DMAP(0.28 mmol)에 용해되었다. 반응 혼합물은 아르곤 하에 1시간 동안 휘젓겼다. 형성된 고체는 여과되었고 여과액은 건조상태로 농축되었다. 잔여 물질에 10 mL EtOAc가 부가되었고 형성된 침전물은 60-80% 수율인 미황색 물질을 산출하기 위하여 EtOAc 및 CH2Cl2로 수 회 세척되었다. 이 물질은 다음 단계에서 사용되었다. 원하는 순도가 높으면, EtOAc:MeOH=7:1(1% TEA)을 사용하는 속성 크로마토그래피가 실행될 수 있다.
PY 화합물들로부터, PU-A, PU-B 및 PU-C 유도체들이 다음과 같이 생성되었다: 13 mL MeOH 내의 5-아세틸레이티드-4,5,6-피리미딘 500 mg(1.5 mmol)에 MeOH 내의 25% NaOMe 13 mL 용액이 부가되었고 결과 용액은 5시간 동안 환류되었다. 냉각 후, 5 mL의 물이 부가되었고 상기 용액은 5 mL로 농축되었다. 결과 수성 용액은 4x10 mL THF 및 2x10 mL EtOAc로 추출되었다. 결합된 유기층들은 MgSO4로 건조되었고, 80-90% 수율인 미황색 고체를 산출하는 건조상태로 농축되었다. 원하는 순도가 더 높으면 결과 생성물은 실리카 젤 칼럼(silica gel column))에 부가되고 CH2Cl2:EtOAc:MeOH=4:4:1로 용리(elution)될 수 있다.
치환기들은 다음과 같이 Mitsunobu 알킬화를 사용하여 9-N 위치에 부가되었다: 5 mL 톨루엔(toluene) 및 1 mL CH2Cl2내의 퓨린 유도체 0.16 mmol에 2.2 당량 PPh3및 1.3 당량 ROH에 이어 5 당량의 DEAD가 부가되었다. 상기 반응은 TLC로 모니터되었고 15분에서 1시간 계속되었다. 상기 혼합물은 ISCO CombiFlash 시스템(실리카 젤 칼럼)에 적용되었고 30-75% 분리 생성물을 산출하기 위해 CH2Cl2/아세톤의 구배(gradient)로 용리되었다. 이 절차는 도6에서 보는 바와 같이 40 비분지(unbranched) 및 분지, 선형 및 고리, 포화 및 불포화 1차 및 2차 알콜들(alcohols)을 사용하여 수행되었다. 이들 합성에서, 네오페틸(meopentyl) 알콜과 시클로헥사놀(cyclohexanol)인 단지 2개의 알콜만이 이 반응에서 생성물을 산출하지 않는 것으로 발견되었다.
4개의 화합물들(PU-A-4, PU-B-4, PU-C-4 및 PU-C-15)은 처음 시험에 사용되었다. 편의상 이들 4개의 구조는 표13에서와 같이 각각 PU1, PU2, PU3 및 PU4로서 나타낸다.
실시예 2
인간 암세포주 MCF-7, SKBr3 및 MDA-MB-468은 ATCC(Manassas, VA)로부터 입수되었고 2 mM 글루타민, 50 units/mL 페니실린, 50 units/mL 스트렙도마이신 및 (MCF-7 및 MDA-MB-468에 대하여) 5% 또는 (SKBr3에 대하여) 10% 열 비활성된 소태아 혈청이 첨가된 DME:F12의 1:1 혼합물로 유지되었고 5% CO237℃에서 배양되었다.
단백질 수준 분석에 대하여, 세포들은 약제 또는 DMSO 비클에 지시된 시간 주기 동안 노출된 50-70% 집합(conflunece)으로 성장하였다. 용해질들은 50 mM Tris pH=7.4, 2% SDS 및 10% 글리세롤 용해 버퍼를 사용하여 조제되었다. 단백질 농도는 BCA 키트(Pierce Chemical Co.)를 사용하여 제품 지시에 따라 결정되었다. 정화된 단백질 용해질들(20-50 mg)은 변성 SDS-PAGE 상에 전기연동적으로 분해되었고, 니트로셀룰로스(nitrocellulose)로 이동되고 다음 1차 항체들로 탐식되었다: 항-Her2(C-18), -Her3(C-17), -Raf-1, -사이클린(cyclin) D1, -Rb(c-15)(Santa Cruz), 항-hsp90, -hsp70, -ER(Stressgen), 항-Trap-1(MSK81), 항-b-악틴(actin), -투불린(tubulin) (Sigma), 항-PI3K(p85)(Upstate Biotechnologies).
항증식 지수를 결정하기 위해, 약제 처리 전에 6-웰 디쉬(6-well dishes)에서 웰 당 10,000개의 세포를 씨드(seed)하고 24시간 동안 배양하여 성장 분석이 수행되었다. 약제 또는 비클은 각각의 실험에 대하여 아웃라인된(outlined) 대로 투여되었고, 세포들은 설명된 시간 주기 동안 배양된 후 세포 계수기(coulter counter)로 계산되었다. 셀 주기 분포는 Becton Dickinson 형광 활성화된 세포 분류기로 Nusse 등에 따라 분석되었고 Cell Cycle Multi-cycle 시스템(Phoenix Flow System, San Diego, CA)에 의해 분석되었다.
실험 1:
MCF-7 세포들은 조절 퓨린 Ad-But 또는 PU3 농도를 변화시켜(0, 10, 50, 100 또는 250 μM) 24시간 동안 처리된 후 용해되었다(lysed). Hsp90, Trap1 및 Hsp70의 수준은 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해 평가되었다 결과는 GM 같은 PU3이 Hsp90 및 Hsp70의 세포 수준을 증가시킨다는 것을 나타냈다. 세포들을 PU3로 처리하는 것은 또한 Trap-1 보다 빠르게 이동하고 항-Trap-1 항체에 의해 인지되는 단백질 띠(band)를 유도한다. 이 단백질 띠의 정체(identity)는 알려지지 않았을 지라도, 그것의 외관은 Hsp90 저해제들에 세포 노출의 표지자인 것으로 보인다. Ad-But은 동일한 농도에서 연구된 단백질 수준에 영향을 미치지 못했다.
실험 2:
MCF-7, SKBr3 및 MDA-MB-468 세포들의 세포 배양들은 항증식 효과의 발생을 시험하기 위해 몇몇 농도 중 하나로 또는 DMSO 대조구(control)에서 PU3으로 처리되었다. 도14A-C는 시간 상관관계로서 세포 수의 결과를 나타낸다. 나타난 바와 같이, PU3은 이들 유방암 세포주들의 성장을 분명히 저해한다.
실험 3:
SKBr3 세포들의 세포 배양들은 0, 10, 50, 100 및 250 μM 농도의 PU1, PU2,PU3 또는 PU4로 처리되었다. 24시간 후, 상기 세포들은 용해되었고(lysed) 세포 내의 Her2와 Raf-1의 양이 평가되었다. 상기 화합물들은 구조적으로 매우 유사할지라도, 그것들은 2개의 단백질의 분해를 촉진하는데 서로 다른 효능을 가지는 것으로 밝혀졌다. PU1은 시험된 어떤 농도에서도 양 단백질을 적게 분해하는 것으로 나타났고, 반면 PU2는 250 μM에서 Her2를 분해하였지만 Raf-1을 분해하지 못했다. PU3은 100 μM 이상의 농도에서 Her2를 분해하였지만 250 μM에서는 Raf-1의 단지 부분적인 감소를 가져왔다. PU4는 50 μM 이상의 농도에서 Her2를 250 μM의 농도에서 Raf-1을 분해하였다.
실험 4:
분해의 시간 추이를 시험하기 위하여, MCF-7 세포들은 100 μM PU3로 처리되었다. 세포들의 할수(aliqouts)는 1.5, 3, 6, 12 및 24 시간에서 회수되었고, Her2, Raf-1, Hsp90 및 Trap-1의 양이 평가되었다. 상기 화합물은 Her2의 빠른 분해(투여 3시간 내에 50% 이상 감소됨)와 24시간 주기 내에서 Hsp90과 Hsp70의 상당한 합성을 유도하는 것으로 나타났다. Raf-1의 양은 이 시간 동안 두드러지게 변하지 않았다.
실험 5:
MCF-7의 세포 배양들은 0, 10, 50, 100 및 250 μM의 PU1, PU2, PU3 또는 PU4로 처리되었다. 24시간 후, 상기 세포들은 용해되었고(lysed) 세포 내의 Her2의 양이 평가되었다. 비록 상기 화합물들이 구조적으로 매우 유사할지라도, 그것들은 Her2의 분해를 촉진하는데 별개의 효능을 가지는 것으로 밝혀졌다. PU1은 50μM를 넘는 농도에서 단지 부분적인 분해를 나타냈고, 반면 PU2는 250 μM에서 완전히 Her2를 분해하였다. PU3는 10 μM 이상의 농도에서 Her2를 실질상 분해하였다. PU4는 100 μM 보다 큰 농도에서 Her2를 실질상 분해하였다.
실험 6:
MCF-7 세포들의 세포 배양들은 PU1, PU2, PU3 또는 PU4로 0, 10, 50, 100 및 250 μM에서 처리되었다. 24시간 후, 상기 세포들은 용해되었고(lysed) 세포 내 에스트로젠 수용체들의 양이 평가되었다. 상기 화합물들은 구조적으로 매우 유사하지만, 에스트로젠 수용체들의 분해를 촉진하는데 서로 다른 효능을 가지는 것으로 발견되었다. PU1은 시험된 농도에서 어떤 분해도 본질상 나타내지 못한 반면, PU2는 250 μM에서 에스트로젠 수용체를 완전히 분해하였다. PU3는 50 μM 이상의 농도에서 에스트로젠 수용체를 부분적으로 분해하였다. PU4는 100 μM 보다 큰 농도에서 Her2를 실질상 분해하였다.
실험 7 :
SKBr3 및 MCF-7 세포들의 배양들은 24시간 동안 PU3의 농도를 변화시켜(0, 10, 50, 100 또는 250 μM) 시험되었다. 상기 세포들은 용해되었고(lysed) Her2, Raf1, Her3, 에스트로젠 수용체(ER), p85(PI3K), 튜뷸린 및 액틴의 수준은 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. 작용(Her2, Raf1, Her3 및 ER)을 위해 hsp90에 의존하는 그것들의 신호전달 단백질들의 양에 있어서의 감소가 관찰되었다. PI3K, 튜뷸린 또는 액틴, 다른 신호전달 경로에 포함되는 단백질들에 대한 효과는 관찰되지 않았다.
실시예 3
실시예 2의 실험들은 (분해되어서는 안되고 분해되지 않은 기준 단백질로서) 카이네이스들 HER3, 에스트로전 수용체(ER), Her2, Raf, Rb 및 p85의 분별 분해를 제공하는 본 발명에 따른 합성 화합물들 PU1, PU2, PU3 및 PU4의 능력을 증명한다. 몇몇 중요한 관찰 결과가 이 데이터로부터 만들어질 수 있다.
PU3는 에스트로전 수용체 복합체를 불안정하게 하고 단백질의 용량-의존성 분해를 유도한다. PU3는 또한 Her2 수준에 있어 빠른 감소를 초래하고, 내형질 세망에서in vivo격절되는 불완전하게 글리코실화된 Her2인 것으로 생각되고 또한 GM에 대하여 보이는 저분자량(170 kDa 대 180 kDa 성숙 단백질) HER-2 띠의 축적을 초래한다. Raf와 Her3의 수준은 PU3에 덜 민감하지만, 보다 높은 농도에서 분해된다. PU2는 또한 하이퍼포스포릴화된(hyperphosphroylated) Rb인 것으로 생각되는 저분자량 Rb 띠를 유도한다.
대조적으로, PU2는 저분자량 띠의 축적 없이 Her2의 상당한 감소를 나타냈고 Raf 카이네이스 분해에 덜 효과적이었다. 상기 저분자량 띠는 또한 PU1이 결합 모이어티로 사용될 때는 부재한다. PU2는 ER을 분해하는데 덜 효과적이고, 반면 PU1은 ER에 실질상 영향이 없었다. 이들 차이는 PU3이 PU1과 PU2로부터 HSP90 패밀리의 서로 다른 멤버에 결합한다는 것을 시사하고, 따라서 별개의 특이성을 설명하는 증거를 제공한다. PU4는 또한 ER이나 Raf보다 Her2를 감소시키는데 보다 큰 능력을 나타낸다.
실시예 4
PU-C 패밀리의 6개의 화합물들이(도15에 나타난 바와 같이 가변 X1 그룹들과 함께 X4=H, X2=1, 2, 3 OMe, X3=H) 조제되었고 MCF-7 세포들 내의 Her2, Her3 및 TRAP-1에 대한 그것들의 효과가 시험되었다. 상기 세포들은 24시간 동안 각각 화합물들의 10, 50, 100 및 250 μM로 처리되었다. X1 그룹의 성질 및 크기는 화합물의 활성에 상당한 영향을 갖는다. N-말단 포켓을 보다 잘 채울 대형, 소수성 그룹들은 Her2를 분해하지만 Her3을 분해하지 못하는 능력을 나타낸다. 또한, 이들 화합물들에 관하여 Her2를 분해하는 능력과 Trap-1 합성의 유도 사이에 상관관계가 있다.
한편, 크고 단단하며 다소 극성인 X1 그룹들을 가진 화합물들은 덜 순조롭게 상호 작용하고, 시험된 농도에서 Her2를 두드러지게 분해하지 않는다.
실시예 5
PU3는 도16A 및 B에 나타난 합성도식에 따라서 중위(middle) OH를 통하여 바이오틴(Biotin)에 연결되었다. PU3-바이오틴은 세파로스-스트렙타비딘 비드(Sepharose-Streptavidin beads) 상에서 고정되었다. 이들 비드는 Trap-1 및 Hsp90알파와 PU3의 상호 작용을 나타내기 위해 사용되었다.
실시예 6
PU3는 MCF-7 이종이식편(xenografts)에서 그것의 안정성과 효능에 대하여 시험되었다. 상기 화합물은 IP에서 500 mg/kg 까지 상당한 징후의 독성을 나타내지 않으면서 투여되었다. 수립 종양(established tumors)을 가진 생쥐들은 50, 100 및 500 mg/kg i.p. 분량의 PU3로 단회 투여 처리되었다. 대조구 생쥐들은 DMSO만으로 처리되었다. 생쥐들은 12 시간 후처리 희생되었다. 면역블롯을 위해, 종약 조직은 2% SDS 용해 버퍼에서(pH 7.4) 균질화되었다. 모든 경우에 면역블롯 결과에서 Her2 수준의 감소가 관찰되었다. PI3 카이네이스(p85)의 수준에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 7
몇몇 9-알킬-8-벤질-9H-퓨린-6-일아민들(ylamines)(4-46)이 PU-C의 9-N-알킬화에 의해 생성되었다(도6B). 또한3의 2-아미노 그룹은(도7B) HF/피리딘에서tert-부틸 나이트라이트(nitrite)(TBN)을 사용하여 비수성 배지(non-aqueous media)에서 디아조화 반응(diazotization reaction)을 통하여 플로린으로 전환되었다. 결과 퓨린은 2-플로로-9-알킬-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민들47-59를 산출하기 위해 알킬화되었다. 상기 알킬화는 대열의 1차 및 2차 알콜을 수용할 수 있는 방법인 Mitsunobu 반응을 사용하여 수행되었다. 2-플로로 유도체들은 상응하는 알콜 및 NaOMe에서 환류하여 2-알콕시(alcoxy) 퓨린60및61로 전환되었다. 퓨린 모이어티의 위치 2에서 대다수의 수식은 (3)으로 시작되었다. 요오드(iodine)는62를 산출하기 위해 디아이오도메탄(diiodomethane)에서 아이소아밀 나이트라이트(isoamyl nitrite)을 사용하는 위치에 도입되었다. 2-아이오도(iodo) 유도체는 DMF에서 트리-n-부틸시아노스타네인(butylcyanostannane) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 가진 시아노-유도체63그리고 비닐트리부틸틴(vinyltributyltin) 및(MeCN)2PdCl2를 가진 비닐-유도체64로 전환되었다.
벤질 모이어티는 포켓 라이신과 상호 작용을 증가시키기 위하여 전자공여 그룹들에 있어서 보강되었다. 염소(chlorine)와 브롬(bromine)이t-부틸 과산화수소 및 상응하는 산 할라이드를 사용하여 라디칼 반응을 통하여 부가되었다. 염소의 경우 단일치환만이 관찰되었으나(65), 브롬은 단일치환체(66) 및 소량의 디-브롬치환된(di-bromosubstituted) 생성물(67)을 산출하였다. (도8B)
퓨린과 페닐 고리 사이 교량의 성질 및 길이는 부가적으로 수식되었다. 시발 재료로서 8-Br-아데닌(adenine)을 사용하였다. 이것은 상응하는 생성물들60-70을 산출하기 위해 아닐린-(aniline-), 페놀- 또는 벤질-유도체와 고온에서 반응했다. (도10)
완전히 치환된 유도체71과72의 어셈블리는3으로 시작되었다. 염소는73을 산출하기 위해 전술한 라디칼 반응을 통하여 처음에 부가되었다. 다음에, 2-아미노 그룹은 플로린으로 변환되었고 결과 퓨린(74)은 Mitsunobu 반응을 통하여 알킬화되었다.
다양한 화합물들에 대한 특이 반응은 아래 설명된다:
3(DAAC):8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-2,6-디아민: DCM(20 mL)내의 트리메톡시페닐 아세트산(1.0 g, 4.4 mmol)(비활성 분위기 하에서)에 시아누릭 플로라이드(371 mL, 4.4 mmol) 및 피리딘(356 mL, 4.4 mmol)이 부가되었다. 상기 혼합물은 실온에서 1시간 동안 휘젓긴 후, DCM 추가 30 mL가 부가되었다. 결과 용액은 물(5 mL)로 한 차례 세척되었고, 용매를 제거하여 생성된 산 플로라이드는 DMF(10 mL)에서 녹여 다음 단계에 사용되었다. 개별적으로, 2,4,5,6-테트라아미노피리미딘 설페이트(sulfate)(0.9 g, 3.8 mmol)은 NaOH(456 mg, 11.4 mmol)을 포함한 물(40 mL)에 용해되었다. 결과 용액은 70℃로 가열되었고 산 플로라이드는 20분 주기에 걸쳐 드롭와이즈(dropwise) 부가되었다. 반응 혼합물은 1.5시간 동안 70℃에서 휘젓긴 후 건조상태로 농축되었다. 상기 미정제 물질에 MeOH(16 mL) 및 MeOH(16 mL) 내의 NaOMe 25% 용액이 부가되었고 결과 용액은 90℃에서 18시간 동안 가열되었다. 냉각에 이어, 용액의 pH는 농축된 HCl을 부가하여 7로 조정되었다. 상기 수용액은 제거되었고 상기 미정제물은 DCM(100 mL) 및 MeOH(50 mL)에 용해되었다. 용해되지 않은 고형체들은 여과하여 제거되었고 생성물(470 mg, 37%)은 실리카 젤 칼럼에서 4:4:2 EtOAc:DCM:MeOH로 정제되었다.
FAC:2-플로로-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-푸린-6-일아민:3(500 mg, 1.5 mmol)에 피리딘(2 mL) 내의 HF 70% 용액, 피리딘(8 mL),t-부틸 나이트라이트(200 mL, 2.0 mmol)이 서서히 부가되었다. 상기 혼합물은 2시간 동안 휘젓긴 후 물(15 mL)과 MeOH(10 mL) 내의 8 g CaCO3으로 밤새 소광되었다(quenched). 상기 용액은 건조상태로 농축되었고 결과 미정제물은 MeOH(30 mL) 및 DCM(10 mL)에 용해되었다. 불용성 고형체들은 여과하여 제거되었고 용매는 미정제 생성물을 산출하기 위해 제거되었다. 이것은 10:5:5:0.75의 헥산(hexane):DCM:EtOAc:MeOH로 용리하는(eluting) 실리카 젤 칼럼에서 정제되었다(240 mg, 50%).
알킬화는 전술한 바와 같이 Mitsunobu 반응을 통하여 수행되었다. 본질상, 5:1의 톨루엔:DCM 내의 FAC에 상응하는 알콜의 1.3 eq., 2 eq. PPh3, 3 eq. 디-tert-부틸 아조디카르복실레이트(azodicarboxylate)가 부가되었고 결과 용액은 다음을 산출하기 위해 실온에서 10분에서 1시간 동안 휘젓겼다(전환은 TLC에 의해 모니터되었다).
48 (PU3F):2-플로로-9-부틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 60% 수율.
52 (PU29F):2-플로로-9-(2-아이소프로폭시-에틸)-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 86% 수율.
54 (PU47F):2-플로로-9-펜트-4-에닐(enyl)-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 86% 수율.
59 (PU20F):2-플로로-9-(테트라하이드로퓨란-2-일메틸)-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 53% 수율.
50 (PU44F):2-플로로-9-(2-메톡시-에틸)-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 28% 수율.
47 (PU43F):2-플로로-9-프로필-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 66% 수율.
57 (PU24F):2-플로로-9-펜트-4-이닐(ynyl)-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 76% 수율.
53 (PU8F):2-플로로-9-부트(but)-3-에닐-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 42% 수율.
55 (PU48F):2-플로로-9-부트-3-이닐-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 36% 수율.
56 (PU49F):2-플로로-9-펜트-3-이닐--8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 25% 수율.
58 (PU16F):2-플로로-9-사이클로부틸메틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 33% 수율.
51 (PU26F):2-플로로-9-[(S)-2-메틸-부틸]-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 68% 수율.
49 (PU21F):2-플로로-9-펜틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 65% 수율.
PU24DA:9-펜트-4-이닐-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-2,6-디아민: 톨루엔(20 mL)과 DCM(4 mL) 내의 DAAC(200 mg, 0.61 mmol)에 PPh3(330 mg, 1.3 mmol), 4-펜틴(pentyne)-1-올(ol)(75 mL, 0.8 mmol) 및 디-t-부틸 아조디카르복실레이트(600 mg, 2.5 mmol)가 부가되었다. 상기 혼합물은 실온에서 2시간 동안 휘젓겼다. 생성물은 10:8:4:4의 헥산:CHCl3:EtOAc:EtOH로 용리하는 실리카 젤 칼럼 상에서 원통 크로마토그래피에 의해 분리되었다(120 mg 고형체, 49%).
62 (PU24I):2-아이오도-9-펜트-4-이닐-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: PU24DA(50 mg, 0.13 mmol)에 Ch2I2(2.5 mL) 및 아이소아밀 나이트라이트(100 mL, 0.78 mmol)이 부가되었고 결과 용액은 80℃에서 1시간 동안 가열되었다. 냉각 후, 상기 용액은 농축된 후 실리카 젤 칼럼에 부가되었다. 생성물은 10:4:4:0.75의 용리액 핵산:CHCl3:EtOAc:EtOH를 사용하여 분리되었다(40 mg, 61%).
63 (PU24CN):2-시아노-9-펜트-4-이닐-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: 건조 DMF(2.5 mL) 내의 PU24I(20 mg, 0.04 mmol), Pd(PPh3)4(7 mg, 6.3x10-3mmol)및 트리부틸틴 시안화물(cyanide)(14 mg, 0.043 mmol)의 용액은 180℃에서 6시간 동안 가열되었다. 냉각과 용매 제거에 이어, 생성물(13 mg, 81%)은 원통 크로마토그래피로 분리되었다(10:8:4:0.75의 헥산:CHCl3:EtOAc:EtOH).
64 (PU24V):9-펜트-4-이닐-8-(3,4,5-트리메틸-벤질)-2-비닐-9H-퓨린-6-일아민: 건조 DMF(3 mL) 내의 PU24I(20 mg, 0.04 mmol), (MeCN)2PdCl2(2x10-3mmol) 및 트리부틸비닐틴(12.5 mg, 0.041 mmol)의 용액은 100℃에서 1시간 동안 가열되었다. 냉각과 용매 제거에 이어, 생성물(15 mg, 92%)은 원통 크로마토그래피로 분리되었다(10:8:4:1의 헥산:CHCl3:EtOAc:EtOH).
60 (PU3OMe):2-메톡시-9-부틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: MeOH(1 mL) 내의 PU3F(20 mg, 0.051 mmol) 용액에 MeOH(1.5 mL) 내의 NaOMe 25% 용액이 부가되었다. 결과 혼합물은 85℃에서 2시간 동안 가열되었다. 냉각에 이어, 상기 혼합물은 4 N HCl로 중화된 후 건조상태로 농축되었다. 미정제물은 고형체(11 mg, 51%)를 산출하기 위해 10:5:5:1의 헥산:EtOAc:DCM:MeOH로 실리카 젤 칼럼에서 정제되었다.
61 (PU3OEt):2-에톡시-9-부틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: EtOH(2 mL) 내의 PU3F(20 mg, 0.051 mmol) 용액에 NaOMe(15 mg, 0.28 mmol)가 부가되었고 상기 혼합물은 2시간 동안 환류되었다. 냉각 및 HCl로 중화 후, 상기 용액은 건조상태로 농축되었다. 생성물(12 mg, 56%)은 전술한 바와 같이 정제되었다.
65 (PU3Cl):9-부틸-8-(2-클로로-3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: MeOH(3 mL) 내의 PU3(37 mg, 0.1 mmol)에 농축된 HCl(33 mL, 0.4 mmol)이 부가되었다. 상기 용액은 0℃로 냉각되었고t-부틸 하이드로페록사이드(44 mL, 0.4 mmol)의 90% 수용액이 부가되었다. 결과 용액은 밤새 환류되었다. 냉각과 용매 제거에 이어, 생성물(31 mg 고형체, 72%)은 원통 크로마토그래피에 의해 분리되었다(10:5:5:1.5의 헥산:EtOAC:DCM:MeOH로 용리).
66 및 67 (PU3PhBr 및 PU3PhBr2):MeOH(3 mL) 내의 PU3(37 mg, 0.1 mmol)에 HBr(45 mL, 0.4 mmol)의 48% 수용액이 부가되었다. 상기 혼합물은 0℃로 냉각되었고,t-부틸 하이드로페록사이드(44 mL, 0.4 mmol)가 드롭와이즈로 부가되었다. 결과 용액은 0℃에서 30분 동안 휘젓긴 후 추가로 1시간 동안 환류되었다. 냉각과용매 제거에 이어, 상기 혼합물은 현저하게 모노브롬화된(monobrominated) 생성물(31 mg, 69%)과 미량의 디브롬화된(dibrominated) 생성물(2.3 mg, 4.4%)을 산출하기 위해 원통 크로마토그래프에 의해 분리되었다(10:5:5:1.5의 헥산:EtOAC:DCM:MeOH로 용리).66 (PU3Br):9-부틸-8-(2-브로모-3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민;67 (PU3Br2):9-부틸-8-(2,6-디브로모-3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민.
73 (DAACPhCl):MeOH(50 mL) 내의 DAAC(1 g, 3.0 mmol)의 슬러리(sluury)에 농축된 HCl(1.5 mL, 18 mmol)이 부가되었다. 결과 용액은 0℃로 냉각되었고t-부틸 하이드로페록사이드(2.5 mL, 8 mmol)의 70% 수용액이 서서히 부가되었다. 상기 혼합물은 30분 동안 0℃에서 휘젓긴 후 20시간 동안 환류되었다. 깨끗한 생성물(1.09 g, 90%)을 산출하기 위해 용매는 고 진공 하에서 제거되었다.
74 (FDAACPhCl):피리딘(6.5 mL) 내의 HF의 20% 용액에 피리딘(13.5 mL)이 부가되었고(비활성 분위기 하), DAACPhCl(1 g, 2.7 mmol)이 뒤따랐다. 상기 혼합물은 5분 동안 휘젓긴 후t-부틸 나이트라이트(450 mL, 3.5 mmol)이 서서히 부가되었다. 휘젓기는 추가 30분 동안 계속되었다. 상기 반응은 물(10 mL):MeOH(10 mL) 내의 CaCO3(16.5 g)을 부가하여 소광되었고 2시간 동안 휘저었다. 상기 용액은 농축되었고 결과 슬러리는 DCM(50 mL):MeOH(50 mL)에서 용해되었다. 불용성 고형체들은 여과되었고 1:1(2x25 mL)의 DCM:MeOH로 세척되었다. 용매 제거에 이어, 생성물은 10:5:5:1의 헥산:EtOAc:DCM:MeOH로 용리하는 실리카 젤 칼럼에서정제되었다(370 mg 고형체, 37%).
71 (PU24FCl):2-플로로-9-펜트-4-이닐-8-(2-클로로-3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민: (308 mg, 76%).
72 (PU29FCl):2-플로로-9-(2-아이소프로폭시-에틸)-8-(2-클로로-3,4,5-트리메톡시-벤질)-9H-퓨린-6-일아민:
68 (PAM3):9-부틸-N*8*-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-9H-퓨린-6,8-디아민: BrAd3(50 mg, 0.186 mmol)과 트리메톡시아닐린(120 mg, 0.65 mmol)의 혼합물은 160℃에서 30분 동안 가열되었다. 냉각에 이어, 고형체는 DCM(20 mL)과 MeOH(5 mL)에서 용해되었고 불용성 고형체들은 여과되었다. 생성물(57 mg 고형체, 83%)은 7:4:1의 DCM:EtOAc:MeOH로 용리하는 실리카 젤 칼럼에서 정제되었다.
70 (PU3OBu):9-부틸-8-(3,4,5-트리메톡시-벤질옥시)-9H-퓨린-6-일아민: MeOH(50 mL) 내의 25% NaOMe 내의 벤질 알콜(250 mL, 2.5 mmol)의 용액은 5분 동안 휘젓겼다. 메탄올의 제거에 이어, BrAd3(26 mg, 0.096 mmol)과 Cu 분말(10 mg, 0.16 mmol)이 부가되었고, 상기 혼합물은 2분 동안 180℃에서 가열되었다. 생성물은 10:5:5:1의 헥산:DCM:EtOAc:MeOH로 실리카 젤 칼럼에서 정제되었다(5.5 mg, 14%).
69 (PU3OPh):9-부틸-8-(3,4,5-트리메톡시-페녹시)-9H-퓨린-6-일아민: 트리메톡시페놀(75 mg, 0.4 mmol),t-BuOK(34 mg, 0.3 mmol), Cu 분말(10 mg, 0.64 mmol) 및 BrAd3(26 mg, 0.1 mmol)의 혼합물은 1시간 동안 140℃에서 가열되었다. 생성물(13 mg 고형체, 35%)은 원통 크로마토그래피에 의해 분리되었다(10:5:5:1로헥산:DCM:EtOAc:MeOH).
실시예 8
인간 암세포주 MCF-7, SKBr3 및 MDA-MB-468은 ATCC(Manassas, VA)로부터 입수되었고 2 mM 글루타민, 50 units/mL 페니실린, 50 units/mL 스트렙토마이신 및 (MCF-7 및 MDA-MB-468에 대하여) 5% 또는 (SKBr3에 대하여) 10% 열 비활성된 소태아 혈청이 첨가된 DME:F12의 1:1 혼합물로 유지되었고 5% CO237℃에서 배양되었다.
단백질 분석.세포들은 60-70% 집합으로 성장하였고 약제나 DMSO 비클에 지시된 시간 주기 동안 노출되었다. 용해질들은 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS 및 10% 글리세롤 용해 버퍼를 사용하여 조제되었다. 단백질 농도는 BCA 키트(Pierce Chemical Co.)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 결정되었다. 정화된 단백질 용해질들(20-50 mg)은 변성 SDS-PAGE 상에 전기연동적으로 분해되었고, 니트로셀룰로스로 이동되고 다음 1차 항체들로 탐식되었다: 항-Her2(C-18), -Her3(C-17), -Raf-1, -사이클린 D1, -Rb(c-15) (Santa Cruz Biotechnology), 항-hsp90, -hsp70 (Stressgen), 항-Trap-1 (MSK81), 항-b-악틴(actin), -투불린(tubulin) (Sigma), ER, 항-PI3K(p85) (Upstate Biotechnologies).
항증식 지수.성장 분석은 6-웰 디쉬에서 웰 당 10,000개의 세포들(MCF-7 및 MDA-MB-468)과 20,000개의 세포들(SKBr3)을 씨드하고 약제 처리 전 24시간 동안 배양하여 수행되었다. 약제 또는 비클은 각각의 실험에 대하여 아웃라인된 대로 투여되었고, 세포들은 설명된 시간 주기 동안 배양되었고 그 다음에 숫자는 세포계수기로 계산되었다.
조직 배양 IC 50 연구.성장 저해 연구는 전술한 설포로다민(sulforhodamine) B 분석을 사용하여 수행되었다. 실험은 BT-474, MDA-MB-468, MCF-7 및 TSU-Pr1으로 수행되었다. 보존 배양(stock cultures)은 글루타민, 10% FBS와 함께 30 mL의 DME(HG, F-12, 비-필수 아미노산, 그리고 페니실린 및 스트렙토마이신)를 포함하는 T-175 플라스크에서 성장하였다. TSU-Pr1은 글루타민과 10% FBS를 가진 RPMI 1640에서 성장하였다. 세포들은 칼슘과 마그네슘 없이 PBS에서 0.05% 트립신(trypsin)과 0.02% EDTA로 분리되었다.
웰 당 3,000개의 세포 밀도로 평판배양된 BT-474를 제외하고는, 실험 배양들은 웰 당 1,000개의 세포 밀도로 100 uL 성장 배지에서 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 평판배양되었다. 웰의 한 칼럼은 공백 대조구(blank control)로서 소용되도록 세포들이 없는 상태로 두었다. 세포들은 밤새 부착되도록 하였다(BT-474는 48시간 동안 부착되도록 하였다). 다음날, 추가 100 uL의 성장 배지가 각각의 웰에 부가되었다. 스톡 약제(stock drug) 또는 DMSO는 희망했던 처음 농도 2배로 성장 배지에 용해되었다. 약제 또는 DMSO는 마이크로타이터 플레이트에 1:1 비율로 연속적으로 희석되었고 복제 웰(duplicate wells)에 부가되었다. 72시간 성장 후에, 대조구 웰과 비교하여 처리되는 세포 숫자는 10% 트리클로로아세트산으로 처리하고 1% 아세트산 내의 0.4% 설포로다민 B로 착색시킨 후 평가되었다. IC50은 대조구 성장과 비교하여 50%으로 세포 성장을 저해하는 약제 농도로서계산되었다.
Her2 분해. 전단백질 분석.세포들은 60-70% 집합으로 성장하였고 지시된 시간 주기 동안 약제나 DMSO에 노출되었다. 용해질은 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS 및 10% 글리세롤 용해 버퍼를 사용하여 조제되었다. 단백질 농도는 BCA 키트(Pierce Chemical Co.)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 결정되었다. 정화된 단백질 용해질들(20-50 μg)은 변성 SDS-PAGE 상에 전기연동적으로 분해되었고, 니트로셀룰로스로 이동되고 항-Her2 1차 항체(C-18)(Santa Cruz Biotechnology)로 탐식되었다.
결합 연구. 고체상(solid phase) 경쟁 분석.GM은 전술한 바와 같이 Affigel 10 수지(BioRad) 상에 고정되었다. GM-비드는 프로티에이스(protease) 저해제들을 포함하는 TEN 버퍼(50 mM, Tris HCL pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% NP-40)로 세척된 후 45분 동안 4℃에서 TEN 버퍼 내의 0.5 BSA로 차단되었다. Stressgen(SPP-770)으로부터의 Hsp90 단백질은 얼음 위에서 17분 동안 약제와 함께 또는 없이 배양되었다. 각각의 샘플에 20 μL GM-비드가 부가되었고 혼합물들은 4℃에서 1시간 동안 회전된 후 각각 500 μL 빙냉 TEN으로 3회 세척되었다. GM-비드 결합 단백질은 65 μL 1xSDS에서 가열하여 고체상으로부터 용리되었다. 샘플들은 Hsp90 알파 분석에 대하여 20 μL 할수로 그리고 Hsp90 베타 분석에 대하여 40 μL 할수로 분할되었고, SDS/PAGE 젤에 적용되었으며 각각 Hsp90 알파(Stressgen#SPA-840) 및 Hsp90 베타(NeoMarkers#RB-118)로 면역블롯팅에 의해 시각화되었다.
화합물 PU4-72는 Hsp90에 결합, Her2 전단백질의 분해 및 그것들의 항증식효과에 대하여 시험되었다. 결과는 표1, 2, 3 및 4에 요약된다.
표1. 활성에 미치는 9-N 사슬 성질의 영향
EC50 EC50 IC50 IC50 IC50 IC50
Hsp90 α Hsp90 β MCF-7 Her2/MCF-7 BT-474 MDA-468
PU13 4 70 75
PU22 5 80 118
PU43 6 6.6 10.8 47 50 54
PU3 7 15 13 50 55 61
PU21 8 22.5 11.8 62 50 73
PU41 9 16.6 20.4 98 100 70
PU9 10 28 114 69 85
PU14 11 62.3 52.1 160 >100 130
PU26 13 25.3 15.7 62 70 71
PU15 15 12 16.2 75 70 70
PU30 16 111.3 47.8 111 120
PU16 17 17 32 46 60 68
PU4 18 120 >100 70 50
PU23 22 13.3 9.5 47 50 55
PU7 23 17.6 7.5 64 70 80
PU8 24 4 10.6 41 30 73
PU11 25 51 66
PU24 26 2.6 1.5 24 20 41
PU25 36 82
PU44 37 4.1 12.4 65 85 79
PU29 38 1.4 1.7 39 45 72
PU20 41 4.4 3.4 92 70 80
* 도6B로부터의 다른 모든 화합물들은 비활성이거나 불용성이었다.
표2. 활성에 미치는 C-2 플루오르화(fluorination)의 영향
EC50 EC50 IC50 IC50 IC50 IC50
Hsp90 α Hsp90 β MCF-7 Her2/MCF-7 BT-474 MDA-468
PU43F 47 4.1 5.3 25 30 30 25
PU3F 48 6 3.5 24 25 29 30
PU21F 49 22 8.9 36 35 43 19
PU44F 50 7.9 13.8 64 65 60 35
PU2F 51 22 15 44 40 45 28
PU29F 52 2 1.3 16 15 16
PU8F 53 5 9.8 33 30 35 25
PU47F 54 10.7 9.9 45 50 46 33
PU48F 55 10 3.5 25 20 28 16
PU49F 56 15 10.4 37 45 33 45
PU24F 57 6.2 0.7 11 5 14 15
PU16F 58 30.7 9.2 41 40 31 21
PU20F 59 2.3 6.8 23 20 25 21
퓨린 모이어티의 위치 2에서 CN, 비닐, 아이오딘, 메톡시, 에톡시, NH2 의 중 어느하나의 부가는 활성을 감소시켰거나 소멸시켰다.
표3. 페닐 모이어티에 미치는 전자-공여 그룹 도입의 영향
EC50 EC50 IC50 IC50 IC50 IC50
Hsp90 α Hsp90 β MCF-7 Her2/MCF-7 BT-474 MDA-468
PU3 7 15 13 50 55 61
PU3PhCl 65 18.6 4.6 19 25 30 36
PU3PhBr 66 35.3 11.7 25 50 60 INSOL
PU3PhBr2 67 >100 >100 30 >100 21
최량의 치환기들의 동화 결과 유도체 71 및 72가 된다(표4).
표4.
EC50 EC50 IC50 IC50 IC50 IC50
Hsp90 α Hsp90 β MCF-7 Her2/MCF-7 BT-474 MDA-468
PU24FCl 71 0.55 0.45 2 2 4.5 3
PU29FCl 72 0.65 0.52 5.4 5 4.5 4.5
실시예 9
Akt 단백질의 분해를 유도하는 PU3 및 PU24FCl의 능력. 도17A 및 B에 나타난 것처럼, Her2 분해 대하여 관측된 활성에 있어서 30곱의 차이는 Akt의 분해에 또한 반영되었다. 대략 30곱의 차이는 또한 Hsp90 결합 친화력에서도 또한 나타났다.
실시예 10
Her2 분해를 유도하는 데 효과적인 PU-시리즈 화합물들의 농도와 MCF-7 세포주에 있어서 성장 저해에 요구되는 농도 사이, 그리고 Hsp90 결합 상수와 성장 저해에 요구되는 농도 사이의 상관관계가 있었는지를 나타내도록 데이터는 분석되었다. 도18A 및 B에서 나타난 바와 같이, 실험 결과는 성장 저지, Her2 전단백질 분해 및 Hsp90 결합 효능 사이에 좋은 상관관계를 시사하였다.
실시예 11
세포 배양.인간 암세포주 MCF-7, SKBr3 및 BT-474는 ATCC(Manassas, VA)로부터 입수되었고 2 mM 글루타민, 50 units/mL 페니실린, 50 units/mL 스트렙토마이신 및 (MCF-7에 대하여) 5% 또는 (SKBr3 및 BT-474에 대하여) 10% 열 비활성된 소태아 혈청이 첨가된 DME:F12의 1:1 혼합물에서 유지되었고 5% CO237℃에서 배양되었다.
Her2 분해. 전단백질 분석.세포들은 60-70% 집합으로 성장하였고 지시된 시간 주기 동안 약제나 DMSO에 노출되었다. 용해질은 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS 및 10% 글리세롤 용해 버퍼를 사용하여 조제되었다. 단백질 농도는 BCA 키트(Pierce Chemical Co.)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 결정되었다. 정화된 단백질 용해질들(20-50 μg)은 변성 SDS-PAGE 상에 전기연동적으로 분해되었고, 니트로셀룰로스로 이동되고 항-Her2 1차 항체(C-18)(Santa Cruz Biotechnology)로 탐식되었다. 도19에 나타난 바와 같이, PU24FCl은 낮은 농도(SKBr3, MCF-7 및 BT-474에 대하여 각각 1.7, 2, 4,5 μM의 IC50)에서 종양 유전자 단백질 Her2의 효율적인 분해를 유도한다.

Claims (26)

  1. 단백질들의 HSP90 패밀리의 멤버의 N-말단 포켓에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 화합물에 있어서, 상기 화합물은 합성 분자이고 상기 결합 모이어티는 안사마이신 항생제 또는 라디시콜 또는 그것들의 유도체가 아닌 것을 특징으로 하는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에 가용성인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 치환된 퓨린인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 단백질 수용체 또는 표지자에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티에 연결되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하기 식으로 이루어진 그룹에서 선택되고:
    여기서 X는 O, S, NH, CH2또는 CO이며; X1은 소수성 사슬 또는 COR이고, 여기서 R은 소수성 체인이며; X2는 1에서 5 수소 수용체/공여자 작용기들이고, 그것들은 같거나 별개일 수 있으며; X3은 (포화, 불포화, 고리 또는 선형) 알킬 그룹들, 알콕시 그룹들, 할로겐, SMe 및 SEt 중에서 선택된 소형 그룹이고; X4는 H 또는 X3과 같고, X5는 H 또는 X1과 같으며; X6은 -NH2, -OH, -OAlkyl, -CONH2또는 유사한 수소 공여체 작용기이고 R1은 H이거나 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하기 식을 가지고:
    여기서 Y는 C, O, N 또는 O-C이며; X1은 소수성 사슬 또는 COR이고, 여기서 R은 소수성 체인이며; X2는 1에서 5 수소 수용체/공여자 작용기들이고, 그것들은 같거나 별개일 수 있으며; X3은 (포화, 불포화, 고리 또는 선형) 알킬 그룹들, 알콕시 그룹들, 할로겐, SMe 및 SEt 중에서 선택된 소형 그룹이고; X4는 없거나, H 또는 X3과 같고, X5는 H 또는 X1과 같으며; X6은 -NH2, -OH, -OAlkyl, -CONH2또는 유사한 수소 공여체 작용기이고 R1은 H이거나 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하기 구조를 가지고:
    여기서 X7은 수소 또는 할로겐이고 X3은 할로겐인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하기 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 하기 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모이어티는 이합체를형성하기 위하여 제2 결합 모이어티에 연결되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 조제적으로 수용 가능한 운반체 및 단백질들의 HSP90 패밀리의 멤버의 N-말단 포켓에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 합성물을 포함하는 조제 조성물에 있어서, 상기 결합 모이어티는 단백질들의 HSP90 패밀리의 멤버의 포켓의 N-말단 포켓 내에 배치될 때 접힌 C-입체형상을 이룰 수 있는 백본, 및 상기 결합 모이어티가 단백질들의 HSP90 패밀리의 적어도 하나의 멤버에 대하여 ADP 보다 크고 갈다나마이신과 다른 N-말단 포켓에 대한 결합 친화력을 가지는 정도까지 N-말단 포켓 내의 다수의 포텐셜 결합 자리들과 상호 작용하는 방향으로 향한 백본 상의 치환기들을 가지고, HSP90 패밀리의 샤프롱들을 필요로 하는 단백질들의 차별 분해를 제공하는 것을 특징으로 하는 조제 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 부분이거나 전부인 것을 특징으로 하는 조제 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 제9항에 따른 화합물의 부분이거나 전부인 것을 특징으로 하는 조제 조성물.
  14. 작용을 위해 HSP90 패밀리의 멤버를 필요로 하는 단백질 또는 수용체에 의존하는 세포들의 성장을 저해하기 위한 방법은 상기 세포들을 제1항 내지 제8항 중어느 한 항에 따른 화합물로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 작용을 위해 HSP90 패밀리의 멤버를 필요로 하는 단백질 또는 수용체에 의존하는 세포들의 성장을 저해하기 위한 방법은 상기 세포들을 제9항에 따른 화합물로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 하기 식을 가지는 화합물:
    여기서 X는 O, S, NH, CH2또는 CO이며; X1은 소수성 사슬 또는 COR이고, 여기서 R은 소수성 체인이며; X2는 1에서 5 수소 수용체/공여자 작용기들이고, 그것들은 같거나 별개일 수 있으며; X3은 (포화, 불포화, 고리 또는 선형) 알킬 그룹들, 알콕시 그룹들, 할로겐, SMe 및 SEt 중에서 선택된 소형 그룹이고; X4는 H 또는 X3과 같고, X5는 H 또는 X1과 같으며; X6은 -NH2, -OH, -OAlkyl, -CONH2또는 유사한 수소 공여체 작용기이고 R1은 H이거나 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 하기 식을 가지는 화합물:
    여기서 Y는 C, O, N 또는 O-C이며; X1은 소수성 사슬 또는 COR이고, 여기서 R은 소수성 체인이며; X2는 1에서 5 수소 수용체/공여자 작용기들이고, 그것들은 같거나 별개일 수 있으며; X3은 (포화, 불포화, 고리 또는 선형) 알킬 그룹들, 알콕시 그룹들, 할로겐, SMe 및 SEt 중에서 선택된 소형 그룹이고; X4는 없거나, H 또는 X3과 같고, X5는 H 또는 X1과 같으며; X6은 -NH2, -OH, -OAlkyl, -CONH2또는 유사한 수소 공여체 작용기이고 R1은 H이거나 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 8-벤질 퓨린 조성물을 만들기 위한 방법은
    (a) 카르복실산 시발 재료를 산 할라이드로 변환하는 단계; 및
    (b) 8-벤질 퓨린 고리 닫힘 되는 중간 생성물을 생성하기 위하여 상기 산 할라이드를 아미노-치환된 피리미딘과 반응시키는 단계;를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 9-위치에 질소에서 상기 8-벤질 퓨린을 알킬화하는 단계를 더 포함하는 8-벤질 퓨린 조성물을 만들기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 알킬화는 Mitsonobu 알킬화 반응을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 8-벤질 퓨린 화합물을 만들기 위한 방법.
  21. 시험 화합물을 HSP90 패밀리의 멤버의 N-말단 포켓에 대한 결합 친화력에 대하여 스크린하기 위한 방법은
    (a) 상기 시험 화합물 및 상기 HSP90 패밀리의 멤버를 위에 고정되는 hsp 결합 모이어티를 가진 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 고정된 안사마이신 항생제에 의하여 결합된 상기 HSP90 패밀리의 멤버의 양을 관측하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 시험 화합물 없이 결합된 양과 비교해서 상기 결합된 HSP90의 멤버의 양에 있어서의 감소는 상기 시험 화합물이 상기 HSP90 패밀리의 멤버에 결합하는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 hsp 결합 모이어티는 안사마이신 항생제 또는 라디시콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 hsp 결합 모이어티는 겔다나마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 hsp 결합 모이어티는 제1항 내지 제9항, 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 따른 합성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 화합물을 Hsp90-알파 또는 베타에 대한 선택적 결합에 대하여 스크린하기 위한 방법은
    (a) 비특이성 HSP90-결합 모이어티를 가진 지지물을 스크린될 화합물의 존재 하에 Hsp90-알파 및 베타 모두를 포함하는 Hsp90 조제를 함유하는 용액과 화합시키는 단계; 및
    (b) 상기 지지물에 결합하는 Hsp90-알파 및 베타의 양을 검출하는 단계;를 포함하고, 여기서 별개의 결합 선택성을 가진 화합물은 Hsp90-알파 및 베타가 상기 지지물에 결합하는 것을 별개의 정도로 저해할 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 비특이성 HSP90 결합 모이어티는 겔다나마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7235649B2 (en) * 2000-03-24 2007-06-26 Duke University Isolated GRP94 ligand binding domain polypeptide and nucleic acid encoding same, and screening methods employing same
EP1423080A4 (en) * 2001-03-01 2009-06-03 Conforma Therapeutics Corp PROCESS FOR TREATING PROLIFERATIVE GENETIC DISORDERS WITH HSP90 INHIBITORS
WO2003029419A2 (en) * 2001-10-01 2003-04-10 Duke University Three dimensional structure of crystalline grp94 binding domain, and its methods of use
CA2464031A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-08 Conforma Therapeutics Corporation Purine analogs having hsp90-inhibiting activity
EP1472230B1 (en) 2002-02-08 2009-06-17 Conforma Therapeutic Corporation Ansamycins having improved pharmacological and biological properties
US20030216315A1 (en) * 2002-02-13 2003-11-20 Duke University Modulation of immune response by non-peptide binding stress response polypeptides
GB0228417D0 (en) * 2002-12-05 2003-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Pyrazole compounds
WO2004069999A2 (ja) * 2003-02-04 2004-08-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited スクリーニング方法
GB0309637D0 (en) * 2003-04-28 2003-06-04 Cancer Rec Tech Ltd Pyrazole compounds
CN100567242C (zh) 2003-06-27 2009-12-09 协和发酵麒麟株式会社 Hsp90家族蛋白质阻断剂
WO2005028434A2 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Conforma Therapeutics Corporation Novel heterocyclic compounds as hsp90-inhibitors
DE102004039280A1 (de) 2004-08-13 2006-02-23 Merck Patent Gmbh 1,5-Diphenyl-pyrazole
DE102004049078A1 (de) 2004-10-08 2006-04-13 Merck Patent Gmbh Phenylpyrazole
WO2006052795A2 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 University Of Rochester Methods of inhibiting the activity of hsp90 and/or aryl hydrocarbon receptor
GB0501535D0 (en) * 2005-01-25 2005-03-02 Vernalis R&D Ltd Pyrimidothiophene compounds
US7834181B2 (en) * 2005-02-01 2010-11-16 Slaon-Kettering Institute For Cancer Research Small-molecule Hsp90 inhibitors
US9403828B2 (en) 2005-02-01 2016-08-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Small-molecule Hsp90 inhibitors
DE102005009440A1 (de) 2005-03-02 2006-09-07 Merck Patent Gmbh Thienopyridinderivate
RU2007137133A (ru) 2005-03-09 2009-04-20 Ниппон Каяку Кабусики Кайся (Jp) Новый ингибитор hsp90
US8399464B2 (en) 2005-03-09 2013-03-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha HSP90 inhibitor
KR20080004550A (ko) * 2005-03-30 2008-01-09 콘포마 세러퓨틱스 코포레이션 Ｈｓｐ９０-억제제로서 알키닐 피롤로피리미딘 및 관련유사체
AU2006242920A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Pfizer Limited 2-amido-6-amino-8-oxopurine derivatives as Toll-Like receptor modulators for the treatment of cancer and viral infections, such as hepatitis C
EP2049497A2 (en) * 2005-05-19 2009-04-22 Astex Therapeutics Limited Pyrimidine derivatives as hsp90 inhibitors
WO2006130469A1 (en) * 2005-05-27 2006-12-07 Oregon Health & Science University Stimulation of neurite outgrowth by small molecules
AU2006270322A1 (en) 2005-07-14 2007-01-25 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
EP1937258A2 (en) * 2005-09-23 2008-07-02 Conforma Therapeutics Corporation Anti-tumor methods using multi drug resistance independent synthetic hsp90 inhibitors
EP1962863A4 (en) * 2005-12-22 2010-11-24 Conforma Therapeutics Corp ORALLY ACTIVE PURINE INHIBITORS OF THERMAL SHOCK PROTEIN 90
EP2038041A4 (en) 2006-05-12 2010-02-17 Myriad Genetics Inc THERAPEUTIC COMPOUNDS AND THEIR USE AGAINST CANCER
AR061185A1 (es) 2006-05-26 2008-08-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Compuestos heterociclicos como inhibidores de hsp90. composiciones farmaceuticas.
EP2034839B1 (en) * 2006-06-30 2017-08-23 Sloan-Kettering Institute for Cancer Research Treatment of neurodegenerative diseases through inhibition of hsp90
CN103539769B (zh) 2006-08-11 2016-03-16 斯特拉斯堡大学 用作激酶抑制剂和hsp90抑制剂的大环化合物
CL2007002994A1 (es) * 2006-10-19 2008-02-08 Wyeth Corp Compuestos derivados heterociclicos que contienen sulfamoilo, inhibidores de hsp90; composicion farmaceutica; y uso para el tratamiento del cancer, tal como cancer de mama, de colon y prostata, entre otros.
FR2907453B1 (fr) 2006-10-24 2008-12-26 Sanofi Aventis Sa Nouveaux derives du fluorene,compositions les contenant et utilisation
GB0622084D0 (en) 2006-11-06 2006-12-13 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of HSP90
DE102007002715A1 (de) 2007-01-18 2008-07-24 Merck Patent Gmbh Triazolderivat
MX2009008084A (es) 2007-02-01 2009-10-12 Astrazeneca Ab Derivados de 5,6,7,8-tetrahidropteridina como inhibidores de hsp90.
RU2009136343A (ru) 2007-03-01 2011-04-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся (Jp) Макроциклическое соединение
EP2133094A4 (en) 2007-03-05 2010-10-13 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION
NZ579635A (en) 2007-03-20 2011-07-29 Curis Inc Fused amino pyridine as hsp90 inhibitors
BRPI0810178A2 (pt) 2007-04-12 2014-09-23 Joyant Pharmaceuticals Inc Dímeros e trímeros miméticos de smac úteis como agentes anticâncer
GB0718255D0 (en) * 2007-09-19 2007-10-31 Univ Edinburgh Nucleobase characterisation
WO2009065035A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Myriad Genetics, Inc. Therapeutic compounds and their use in treating diseases and disorders
US7960420B2 (en) 2007-12-21 2011-06-14 Joyant Pharmaceuticals, Inc Diazonamide analogs with improved solubility
US8895701B2 (en) 2008-01-05 2014-11-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Peptide-conjugated oligonucleotide therapeutic and method of making and using same
US20110190237A1 (en) * 2008-01-15 2011-08-04 Nexgenix Pharmaceuticals Macrocyclic Prodrug Compounds Useful as Therapeutics
BRPI0906598A2 (pt) 2008-02-01 2015-07-07 Takeda Pharmaceutical Oxim derivattivos como inibidores hsp90
JP5123429B2 (ja) 2008-04-29 2013-01-23 ジョイアント ファーマスーティカルズ、インク． インドリン抗癌剤
LT5623B (lt) 2008-04-30 2010-01-25 Biotechnologijos Institutas, , 5-aril-4-(5-pakeistieji 2,4-dihidroksifenil)-1,2,3-tiadiazolai kaip hsp90 šaperono slopikliai ir tarpiniai junginiai jiems gauti
US8153619B2 (en) 2008-05-22 2012-04-10 Joyant Pharmaceuticals, Inc. Diazonamide analogs
WO2010001989A1 (ja) * 2008-07-03 2010-01-07 協和発酵キリン株式会社 癌幹細胞及び／または癌前駆細胞の減少剤並びに癌の再発及び／または転移の予防剤
EP2387316A4 (en) * 2009-01-16 2012-06-13 Curis Inc CONDENSED AMINOPYRIDINE FOR THE TREATMENT OF BRAIN TUMORS
AR077405A1 (es) 2009-07-10 2011-08-24 Sanofi Aventis Derivados del indol inhibidores de hsp90, composiciones que los contienen y utilizacion de los mismos para el tratamiento del cancer
FR2949467B1 (fr) 2009-09-03 2011-11-25 Sanofi Aventis Nouveaux derives de 5,6,7,8-tetrahydroindolizine inhibiteurs d'hsp90, compositions les contenant et utilisation
WO2011040421A1 (ja) 2009-09-29 2011-04-07 武田薬品工業株式会社 スクリーニング方法
NZ625593A (en) 2009-10-07 2016-03-31 Sloan Kettering Inst Cancer Purine derivatives useful as hsp90 inhibitors
EP2588129A4 (en) * 2010-06-30 2014-07-09 Univ Brandeis ON SMALL MOLECULES TARGETED PROTEIN REMOVAL
EP2677869B1 (en) * 2011-02-25 2017-11-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cyclic azabenzimidazole derivatives useful as anti-diabetic agents
BR112013025634A2 (pt) 2011-04-05 2016-07-19 Sloan Kettering Inst Cancer inibidores de hsp90
BR112013025761A2 (pt) 2011-04-05 2018-05-29 Sloan Kettering Inst Cancer Res inibidores de hsp90
SG194223A1 (en) 2011-04-22 2013-11-29 Joyant Pharmaceuticals Inc Diazonamide analogs
EP2904119B1 (en) 2012-10-02 2020-06-17 The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital Methods relating to dna-sensing pathway related conditions
RU2670768C9 (ru) * 2013-06-27 2018-12-17 Цзинхуа Юниверсити Биологический маркер опухоли
CA2921571C (en) 2013-08-16 2022-04-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Selective grp94 inhibitors and uses thereof
CN105147693B (zh) * 2015-09-23 2018-01-12 昆明理工大学 一种小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用
SI3483164T1 (sl) 2017-03-20 2020-08-31 Forma Therapeutics, Inc. Sestavki pirolopirola kot aktivatorji piruvat kinaze (PKR)
US20230055923A1 (en) 2018-09-19 2023-02-23 Forma Therapeutics, Inc. Activating pyruvate kinase r
MA53668A (fr) 2018-09-19 2021-09-15 Forma Therapeutics Inc Traitement de la drépanocytose avec un composé activant la pyruvate kinase r

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2729642A (en) * 1954-08-13 1956-01-03 Chattanooga Medicine Co Water soluble salts of 8-(para-aminobenzyl) caffeine and method for their preparation
US3930005A (en) * 1973-06-15 1975-12-30 Squibb & Sons Inc Antiinflammatory agents and their use
US4172829A (en) * 1978-05-09 1979-10-30 Bristol-Myers Company 2,9-Disubstituted adenine derivatives and their use as non-adrenergic bronchodilators
EP0193454A1 (en) * 1985-02-25 1986-09-03 Merck & Co. Inc. 8-Substituted-9-hydroxyalkyl and hydroxyalkoxymethyl-guanines and pharmaceutical compositions containing them
US5565566A (en) * 1987-04-24 1996-10-15 Discovery Therapeutics, Inc. N6 -substituted 9-methyladenines: a new class of adenosine receptor antagonists
EP0363320A3 (de) * 1988-10-06 1991-11-21 Ciba-Geigy Ag Substituierte 9H-Purine
DE4216846A1 (de) * 1992-05-21 1993-11-25 Basf Ag Verfahren zur Fixierung großer zeolithischer und zeolithanaloger Molekularsieb-Kristalle auf Formkörper
US5387584A (en) 1993-04-07 1995-02-07 Pfizer Inc. Bicyclic ansamycins
US5932566A (en) 1994-06-16 1999-08-03 Pfizer Inc. Ansamycin derivatives as antioncogene and anticancer agents
US5736549A (en) * 1994-10-05 1998-04-07 Chiroscience Limited Hypoxanthine and guanine compounds
US5783404A (en) 1995-04-13 1998-07-21 Amgen Inc. Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
DK1516628T3 (da) 1995-07-27 2013-09-08 Genentech Inc Stabil, isotonisk lyofiliseret proteinformulering
DE19535504A1 (de) * 1995-09-25 1997-03-27 Bayer Ag Substituierte Xanthine
US6294541B1 (en) * 1996-06-06 2001-09-25 Euro-Celtique S.A. Purine derivatives having phosphodiesterase IV inhibition activity
EP1023315B1 (en) 1997-05-14 2010-03-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods and compositions for destruction of selected proteins
US5968921A (en) 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
AR029347A1 (es) 1999-04-02 2003-06-25 Euro Celtique Sa Compuesto de adenina, compuesto de isognanina y 2,6-ditioxantina como precursor del mismo, uso de dichos compuestos para preparar una composicion farmaceutica y dicha composicion farmaceutica
EP1169319A4 (en) 1999-04-09 2005-02-09 Sloan Kettering Institutefor C METHODS AND COMPOSITIONS FOR DEGRADING AND / OR INHIBITING TYROSINE KINASES BELONGING TO THE HER FAMILY
US6335157B1 (en) 1999-05-07 2002-01-01 The European Molecular Biology Laboratory Method based on localization of Hsp90 to the centrosome
GB9924020D0 (en) * 1999-10-11 1999-12-15 Pfizer Ltd Pharmaceutically active compounds
WO2002009696A1 (en) * 2000-07-28 2002-02-07 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods for treating cell proliferative disorders and viral infections
CA2464031A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-08 Conforma Therapeutics Corporation Purine analogs having hsp90-inhibiting activity
US20070129334A1 (en) * 2001-10-30 2007-06-07 Conforma Therapeutics Corporation Orally Active Purine-Based Inhibitors of Heat Shock Protein 90
WO2005028434A2 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Conforma Therapeutics Corporation Novel heterocyclic compounds as hsp90-inhibitors

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