KR20030066601A

KR20030066601A - 친유성 또는 양친매성 섬광체 및 분석에서 이의 용도

Info

Publication number: KR20030066601A
Application number: KR10-2003-7002383A
Authority: KR
Inventors: 코즈로우스키롤랜드즈비그니어우; 블랙번조나단마이클; 서덜랜드존데이비드; 컬리포드스티븐존; 서덜랜드앤드류제임스
Original assignee: 센스 프로테오믹 리미티드
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2003-08-09
Also published as: GB0306216D0; AU2001278633A1; IL154485A0; GB2383329A; EP1315707A1; CN1458925A; WO2002014290A1; BR0113328A; JP2004506754A; CA2420006A1

Abstract

본 발명은 친유성기 또는 양친매성기인 1개 이상의 R¹기에 공유 결합된 인광 물질인 1개 이상의 X기로 이루어지고; 세포, 세포막, 생물학적 막, 인공 막 또는 전달 매개체 내로 통합될 수 있으며; 통합되었을 때 인광 물질로서 작용할 수 있는 섬광체 분자를 제공한다. 바람직한 섬광체 분자는 식의 것이다. 또한, 신규의 섬광체 화합물을 함유하는 리포솜 또는 미셀, 신규의 섬광체 화합물을 함유하는 리포솜 또는 미셀의 제조 방법, 및 섬광체 화합물을 세포의 세포막내로 삽입하기 위한 전달 매개체로서 리포솜 또는 미셀의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명은 신규의 섬광체 화합물을 함유하는 세포를 제공하고, 분석 시스템에서 세포의 용도를 제공한다.

Description

친유성 또는 양친매성 섬광체 및 분석에서 이의 용도{LIPO- OR AMPHIPHILIC SCINTILLATORS AND THEIR USE IN ASSAYS}

신약 및 신규 치료법의 개발은 생물학적 표적의 동정(同定)에 의존한다. 표적 수용체, 효소 또는 단백질이 동정되는 경우, 상기 표적 수용체, 효소 또는 단백질을 사용하여 신규 리간드를 동정하고, 이로써 궁극적으로 신약 개발을 할 수 있다. 화학적 또는 생물학적 시스템에 있어서의 분자간의 상호작용을 모니터링하는 한 방법은 섬광체의 사용을 포함한다.

섬광체는 인광 물질이거나 인광 물질을 포함하는 분자이다. 인광 물질은 다수의 상이한 종(예컨대, 광자, 전자 또는 화학 반응물)에 의해 발광 후 여기될 수있는 화학 구조물이다. 이온화 입자[예컨대, 베타 입자, 오제 전자 또는 광자]와 인광 물질의 상호 작용은 인광 물질의 여기를 초래한다. 짧은 지연(통상 10^-10내지 10^-4초의 범위) 후, 통상 가시광선의 형태이거나 또는 다른 검출가능한 방사선의 형태인 전자기파 에너지의 광자 방출과 함께, 인광 물질은 바닥 상태(여기되지 않은 상태)로 되돌아 간다. 섬광체의 이완(relaxation)에 의해 방출된 빛을 적당한 섬광 계수기로 검출하고 정량할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 섬광성 분자 또는 섬광체란 용어는 인광 물질이거나 인광 물질을 포함하는 분자를 정의하는 데 사용되고, 섬광이란 용어는 상기 섬광성 분자에 의해 생성된 전자기파 방사선(통상 빛의 형태임)을 정의하는 데 사용된다.

전술한 바와 같이, 섬광은 인광 물질과 이온화 입자 간의 상호 작용의 결과로서 발생한다. 이온화 입자는 이온화 방사선 공급원(예컨대, 방사능 화합물)에 의해 생성된다. 섬광체의 여기 및 섬광의 발생을 위하여는, 용매 분자에 의해 이온화 입자가 섬광체와 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용을 하여야 한다. 방사능 화합물의 예로는 방사능표지 화합물에 관례적으로 사용되는 삼중 수소 종(種)을 들 수 있다. 삼중 수소는 예컨대 수중에서 매우 짧은 경로 길이를 갖는 이온화 방사선을 방출시키는데, 삼중 수소의 평균 경로 길이는 1.5 마이크로미터이다. 연마된 분자와 섬광체 분자 간의 거리가 1.5 마이크로미터 미만인 경우, 섬광이 발생한다. 유의적으로 1.5 마이크로미터를 초과하는 거리에서, 수중의 섬광체 분자와 방사능표지된 화합물 사이에서 유의적인 섬광은 발생하지 않는다.

섬광체에 의해 방출되는 빛의 양이 이온화 입자의 공급원의 근접성(proximity)에 비례하기 때문에, 섬광 측정법을 사용하여, 이온화 입자의 근접성의 정량적 평가를 할 수 있으며, 2개의 종(種)의 결합 정도의 정량적 평가도 가능하다.

섬광성 분자의 종래의 용도는 고체 지지체(예컨대, 섬광체를 혼입하는 중합체성 수지 또는 비드)의 용도를 포함하였다. 섬광 근접성 분석법(Scintillation Proximity Assay; SPA)은 형광성 분자에 의해 함침된 비드[예컨대, 세파로스 비드]를 포함한다. 비특이성의 비공유 상호 작용 또는 공유 결합에 의해, 생물학적 수용체 분자로 비드를 코팅한다. 이어서, 방사능표지된 리간드와 함께 비드를 항온배양한다. 수중에서 짧은 파장을 갖는 방사능표지를 선택한다. 수용체가 리간드와 결합하는 경우, 활성화되어 빛을 방출하는 함침된 형광성 분자와 근접한 곳으로 방사능의 중요 부분을 보낸다.

이 방법과 관련된 한가지 문제점은, 유기 용매를 사용하면 형광성 분자가 유기 용매에 용해되어 형광성 분자가 비드로부터 제거되기 때문에, 수성 시스템에서만 비드를 사용할 수 있다는 것이다. WO 00/20475에서 이러한 문제점이 다루어지는데, 상기 WO 00/20475에는 중합 반응에 의해 고체 지지체 내에 직접 섬광체 분자를 혼입하는 것이 기재되어 있다.

또 다른 문제점은 섬광 근접성 분석법과 관련되어 있다. 고체 지지체에 표적 분자(예컨대, 수용체, 단백질 또는 효소)를 부착시키기 위하여는, 먼저 표적을 분리한 후 그것을 정제하는 것을 필요로 한다. 이러한 분리 공정으로 인하여, 일부표적 분자는 활성을 상실한다. 소수성 특성을 강하게 나타내는 단백질[예컨대, 내인성으로 또는 외인성으로 막이 결합된 단백질(효소, 수용체 또는 채널)]은 정제하기 어렵다는 것이 주지되어 있으며, 상기 단백질은 소수성 막으로부터 제거될 때 활성을 상실한다. 또한, 상기 단백질은 SPA에 필요한 수성 조건에 노출시 변성될 수 있다. 다중 서브유니트 복합체의 경우, 단백질의 분리는 하나 이상의 서브유니트의 손실을 초래함으로써 단백질을 불활성화시킬 수 있다.

또한, 고체 지지체에 단백질을 부착시키기 위해서는, 고체 지지체에 부착되는 단백질로부터 유래한 부착물을 형성시킬 필요가 있다. 상기 부착물은 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 부착물은 극성, 비극성, 소수성 또는 친수성 상호 작용에 의해 형성될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 부착물의 형성은 특정 리간드에 대한 결합 부위를 왜곡하거나 차단할 수 있다.

섬광성 분자의 다른 용도는 (WO94/26413에 기술되어 있는 바와 같이) 섬광 평판 기법에의 용도인데, 상기 섬광 평판 기법에 있어서, 섬광성 분자와 플라스틱의 혼합물로 구성된 평판을 제조하고, 코팅물로 밀봉한다. 평판 상에서 세포를 배양하고, 방사능 리간드와 함께 항온배양한다.

섬광 근접성 분석법 및 섬광 평판 기법의 주요 장점 중 하나는 일부 용도에 있어서 이온화 방사선의 공급원으로서¹²⁵요오드(¹²⁵I)를 사용할 필요가 있다는 것이다.¹²⁵요오드(¹²⁵I)는 주로 감마선 및 X-선 방출제인데, 그것을 사용함에 있어서는엄격한 안전성 측정을 필요로 한다.

본 발명은 신규 섬광체(scintillator) 화합물, 신규 섬광체 화합물의 제조 방법, 및 신규 섬광체 화합물의 분석 시스템에의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 섬광체 화합물을 함유하는 리포솜 또는 미셀, 신규 섬광체 화합물을 함유하는 리포솜, 또는 미셀의 제조 방법, 및 세포의 세포막 내에 섬광체 화합물을 삽입하는 전달 매개체로서의 리포솜 또는 미셀의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 섬광체 화합물을 함유하는 세포, 및 신규 섬광체 화합물을 함유하는 세포의 분석 시스템에의 용도에 관한 것이다.

도 1은 목적하는 수송 채널 및 삽입된 섬광체 분자를 함유하는 세포를 개략적으로 도시한다. 방사능표지된 기재는 이 채널을 통과하여, 이 기재를 섬광체 분자에 근접시켜 섬광을 일으킬 수 있다. 수송 저해제와의 항온배양은 채널을 통한 방사능 기재의 수송을 방해하고, 이로써 섬광을 방지한다.

도 2는 상업적으로 이용가능한 섬광제 "마이크로신트(Microscint)"에 대한 섬광체 분자 ST1-ST11의 섬광도 비교이다.

도 3은 0.5 ml 리포솜 용액에 0.1 μCi¹⁴C-타우린을 첨가한 후, 섬광체 분자-리포솜 제제의 섬광 활성을 도시한다.

도 4는 섬광체 분자 대 리포솜(DOTAP)의 비율을 증가시키는 것이 리포솜 형성에 미치는 효과를 도시한다.

도 5는 타우린의 활성이 0.1 μCi에서 1.0 μCi로 증가되었을 때 관찰되는 신틸란트 분자를 함유하는 리포솜의 선형 반응을 나타낸다.

도 6은 양이온성 리포솜 (a) 및 0.1% 미셀 제제 (b)로 항온배양한 후, HeLa 세포로의 형광 프로브 N-678의 흡수를 나타낸다.

도 7은 HeLa 세포에 의해 30분 및 120분 후 섬광체 분자 ST4, ST5 및 ST6의 흡수를 나타낸다.

도 8은 삽입된 섬광체 분자를 함유하는 HeLa 세포에 의한¹⁴C-메티오닌의 흡수를 나타낸다. 삽입체는 상업적으로 이용가능한 섬광 칵테일을 사용하여 측정된 HeLa 세포내 메티오닌 흡수를 도시한다.

도 9는 삽입된 ST4 섬광체 분자를 함유하는 래트 C6 신경교종에 의한¹⁴C-메티오닌의 흡수를 나타낸다. 삽입체는 상업적으로 이용가능한 섬광 칵테일을 사용하여 측정한 C6 신경교종 세포에서의 메티오닌 흡수를 나타낸다.

도 10은 HeLa 세포에 의한³⁵S-메티오닌의 흡수를 나타낸다. 삽입체는 상업적으로 이용가능한 섬광 칵테일을 사용하여 측정한 HeLa 세포에서의 메티오닌 흡수를 도시한다.

도 11은 ST4에 대한 결과를 도시한다. 초기에¹⁴C-메티오닌의 흡수는 없었지만, 약 72시간 후¹⁴C-메티오닌이 축적되기 시작한다. ST4/DOTAP 또는 ST4/DOTAP/DOPE로 예비-항온배양된 세포들 사이에 유의성있는 차이점은 없었다.

도 12는 삽입체를 가진 화합물 ST4에 대한 결과를 도시하는데, 이는 상업적으로 이용가능한 섬광 칵테일을 사용하여 측정한 HeLa 세포에서의 티미딘 흡수를 도시한다.

도 13은 HTC 세포에 대하여 수행된 글루코코르티코이드 수용체 결합 분석의 결과를 도시한다.

도 14는 HTC 세포에 대하여 수행된³H-덱사메타손의 엘리먼트쇼윙( elementashowing) 치환의 결과를 도시한다.

도 15는 신틸리피드(scintilipid)로 항온배양된 C6 신경교종 세포에 대하여 수행된 β-아드레날린성 수용체 결합 분석의 결과를 도시한다.

도 16은 방사능리간드로서³H-오우아바인을 사용하여 성장시킨 HeLa 세포에 대하여 수행된 Na⁺/K⁺ATPase 결합 분석의 결과를 도시한다.

본 발명은 인광 물질 머리부 및 친유성 또는 양친매성 꼬리부를 함유하는 섬광체 분자 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포솜의 지질 이중층 내에 삽입된 1개 이상의 섬광체 분자가 혼입되어 있는 리포솜 또는 미셀의 단층 내에 삽입된 1개 이상의 섬광체 분자가 혼입되어 있는 미셀에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포솜 또는 미셀 내에 섬광체 분자를 삽입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포의 세포막 내에 삽입된 1개 이상의 섬광체 분자가 혼입되어 있는 세포, 및 세포 내에 상기 섬광체 분자를 삽입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 섬광체 분자의 분석 시스템에의 용도에 관한 것이다. 상기 용도 중 하나는 표적을 정제 또는 분리할 필요없이 표적 분자의 세포 환경 내에서 표적 분자를 동정함으로써, 신약 및 신규 치료법을 개발하는 것이다. 이러한 분석은, 종래에는 표적의 불안정성 또는 고도의 소수성 때문에 분석될 수 없었던 표적에 대한 리간드가 생성될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 제1 실시양태는 친유성기 또는 양친매성기인 1개 이상의 R¹기에 공유 부착된 인광 물질인 1개 이상의 X기를 포함하는 섬광체 분자[상기 섬광체 분자는 세포, 세포막, 생물학적 막, 인공 막 또는 전달 매개체(delivery vehicle) 내에 통합될 수 있고, 통합될 때 인광 물질로서 작용할 수 있다]를 제공한다.

본 명세서에 있어서, "막"이란 세포막, 합성 또는 인공 막 제제(리포솜, 미셀 등을 포함함) 등을 포함한다. 본 발명의 목적을 위한 전달 매개체는 본 발명의섬광체 분자의 막 내에의 삽입을 가능하게 하는 임의의 제제 또는 담체(예컨대, 리포솜 또는 미셀)이다.

X기 및 R¹기의 수는 필요한 섬광체 분자의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 섬광체 분자가 X기 및 R¹기로 구성된 올리고머가 되도록 하는 수일 수 있다. 또한, 상이한 X기와 R¹기의 혼합물을 사용할 수도 있다. 올리고머는 동일한 수의 X 및 X' 기를 포함할 수 있다. 대안으로, 상이한 수의 X기 및 R¹기를 사용할 수 있다. 섬광체 분자의 크기는 섬광체 분자가 세포막 내에 혼입될 수 있는 요건 및 섬광체 분자의 존재가 세포에 의해 용인되는 요건에 의해 제한된다는 것을 당업자가 이해할 수 있을 것이다.

바람직한 구체예에 있어서, 섬광체 분자는 하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물 또는 이의 염이다:

(X)_m-(R¹)_n

상기 화학식 (I) 중, m은 1 내지 20이고, n은 1 내지 20이며; 바람직하게는 m 및 n은 독립적으로 1 내지 10이고; 보다 바람직하게는 m 및 n은 독립적으로 1 내지 4이며; 가장 바람직하게는 m 및 n은 모두 1이다.

본 발명의 목적을 위해, 친유성기는 친유성(또는 소수성) 성질을 나타내는 화학 작용기이다.

친유성은 친유성 환경에 대한 분자 또는 작용기의 친화성을 나타낸다. 통상, 2상 시스템, 즉 액체-액체 시스템(1-옥탄올/물 중의 분배 계수) 또는 고체-액체 시스템에서의 분자의 분포 거동[역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는 박층 크로마토그래피(TLC) 시스템 상에서의 체류]에 의해 친유성을 측정한다.

본 발명의 목적을 위해, 양친매성기는 친수성 성질과 친유성 성질을 모두 나타내는 화학 구조물이다. 따라서, 통상 상기 구조물은 수성 용매 또는 유기 용매 중에서 명확히 구별되는 방식으로 거동할 수 있는 상이한 영역을 포함한다.

R¹기가 1개 이상의 X기 부착 부위를 함유할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

바람직하게는, R¹은 비(非)분지쇄 또는 분지쇄 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐, 알키닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 아미드, 아민, 알킬아릴, 알킬옥시아릴, 환원 아릴알킬, 환원 알콕시아릴, 알케닐아릴, 알케닐옥시아릴, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알케닐옥시헤테로아릴, 환원 알킬헤테로아릴, 환원 알콕시헤테로아릴, 또는 독립적으로 할로겐, 알킬, 알콕시, 아릴알킬, 아릴알콕시, 시아노, 니트로, -OC(O)R², -CO₂R², -NR³R⁴, -OR², -SR², -C(O)NR³R⁴, 또는 지질(천연 또는 합성)로부터 선택되는 1개 이상의 기에 의해 치환된 전술한 작용기들 중 어느 하나의 치환 유도체이다[여기서, R²는 H, 알킬, 아릴,또는 R¹에서 정의된 바와 같은 작용기를 포함하는 군으로부터 선택되고, R³및 R⁴는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 R¹에서 정의된 바와 같은 작용기를 포함하는 군으로부터 선택된다].

바람직한 구체예에 있어서, R¹은 비(非)-분지쇄 또는 분지쇄 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알킬아릴, 또는 독립적으로 -CO₂R², -OR², 또는 -OC(O)R²로부터 선택되는 1개 이상의 기에 의해 치환된 전술한 작용기들 중 어느 하나의 치환 유도체이다[여기서, R²는 H, 알킬 또는 아릴로부터 선택된다].

섬광체 분자가 세포막에 혼입되거나 세포막과 회합되도록 하기 위하여는, R¹기가 충분한 친유성을 부여하여야 한다. 섬광체 분자가 1개의 X기 및 1개의 R¹기를 포함하는 경우, R¹이 메틸 또는 에틸이라면, 이들 작용기는 섬광체 분자 상에 충분한 친유성을 부여하지 못할 가능성이 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 섬광체 분자가 1개의 X기 및 다수개의 R¹기(즉, 1개 초과의 R¹기)를 함유하는 경우, R¹이 메틸 또는 에틸이라면, 다수개의 메틸기 또는 에틸기의 존재는 섬광체 분자가 세포막에 혼입되거나 세포막과 회합되도록 하기에 충분할 것이다.

알킬은 바람직하게는 1개 내지 30개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 6개 내지 30개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 8개 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 알콕시는 1개 이상의 산소 원자에 의해 임의로 단절된(interrupred) 탄화수소쇄로서, 1개 내지 30개의 탄소 원자, 바람직하게는 1개 내지 20개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소쇄이다. 바람직한 구체예에 있어서, 알콕시기 내의 산소 원자는 1개 이상의 탄소 원자(바람직하게는 포화된 탄소 원자)에 의해 인광 물질인 X기로부터 분리된다. 알케닐은 1개 이상의 이중 결합을 함유하는 탄화수소쇄로서, 2개 내지 30개의 탄소 원자, 바람직하게는 8개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소쇄이다. 알키닐은 1개 이상의 삼중 결합을 함유하는 탄화수소쇄로서, 2개 내지 30개의 탄소 원자, 바람직하게는 8개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소쇄이다. 아릴은 방향환(예컨대, 페닐 또는 6원의 방향환) 또는 융합 고리계(예컨대, 나프틸, 안트라실 등)이다. 헤테로아릴은 O, S 또는 N으로부터 선택되는 1개 이상의 헤테로 원자를 함유하는 5원 또는 6원의 방향환; 또는 2개 이상의 융합 고리를 함유하는 접합 고리계(여기서, 1개 이상의 접합 고리는 헤테로 원자를 함유함)이다. 상기 헤테로아릴기의 예로는 피리딜, 피리미딜, 피리다지닐, 피라지닐, 티오페닐, 옥사졸릴, 피라졸릴, 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐 및 인돌릴을 들 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 지질은 비극성 유기 용매를 사용한 추출에 의해 세포 및 조직으로부터 분리될 수 있는 유기 분자, 또는 상기 분자의 합성 균등물 또는 유도체이다.

본 발명의 목적을 위해, X기는 다수의 상이한 종(예컨대, 광자, 전자 또는 화학 반응물, 바람직하게는 이온화 방사선의 공급원)에 의해 발광 후 여기될 수 있는 임의의 화학 작용기를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, X기의 예는 벤조트리아졸류 및 그 유도체, 쿠마린류 및 그 유도체, 방향족 탄화수소류[예컨대, p-테르페닐, p-쿼터페닐 및 이들의 유도체; 옥사졸류의 유도체; 1,3,4-옥사디아졸류(예컨대, 2,4-(비페닐일-6-페닐벤족사졸), 2,5-비스-(5'-tert-부틸벤족사졸릴일-[2']티오펜, 2-(4-t-부틸페닐)-5-(4-비페닐일)-1,3,4-옥사디아졸, 2-(1-나프틸)-5-페닐-옥사졸, 2-페닐-5-(4-비페닐일)-1,3,4-옥사디아졸, 1,4-비스[5-페닐-2-옥사졸릴]-벤젠, 및 2,5-디페닐옥사졸)]을 포함한다. X기의 또 다른 예는 1,4-비스(5-페닐-2-옥사졸릴)벤젠, 9,10-디페닐안트라센, 1,6-디페닐-1,3,4-헥사트리엔, 트랜스-p,p'-디페닐스틸벤, 1,1,4,4-테트라페닐-1,3-부타디엔, 3-히드록시플라본, 및 1,4-비스(2-메틸스티릴)벤젠을 포함한다.

머리부 작용기는 1개 이상의 친유성 R¹기 부착 부위를 함유할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 제1 실시양태의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 섬광체 분자는 1개의 머리부 작용기를 함유한다(즉, m=1). 머리부 작용기는 2개 이상의 친유성 R¹기 부착 부위를 함유할 수 있다. 따라서, 섬광체 분자는 하기 화학식 (IIa)로 표시되는 화합물이다:

X-(R¹)_n

상기 화학식 (IIa) 중, n은 2 이상의 정수이다.

또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 섬광체 분자는 1개의 친유성 R¹기를 함유한다(즉, n=1). 친유성 R¹기는 2개 이상의 머리부 X기 부착 부위를 함유함으로써, 하기 화학식 (IIb)로 표시되는 화합물을 생성시킬 수 있다:

(X)_m-R¹

상기 화학식 (IIb) 중, m은 2 이상의 정수이다.

본 발명의 가장 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물을 제공한다:

X-R¹

상기 화학식 (III) 중, 1개의 X기는 1개의 친유성 R¹기에 부착된다(즉, m 및 n = 1).

본 발명의 제1 실시양태의 섬광체 분자는 결합제(linker) 기에 의해 1개 이상의 R¹기에 부착된 1개 이상의 X기를 포함하여, 하기 화학식 (V)로 표시되는 섬광체 분자를 생성시킨다:

(X)_m-(결합제)-(R¹)_n

본 발명의 목적을 위해, 결합제 작용기는 알콕시, 아미노알킬, 아릴옥시, 아릴아미노, 알킬산, 카르보닐 아미딜, 에스테르, 아민, 실릴, 이미딜, 우레아, 알킬티오 또는 아릴티오일 수 있다.

결합제는 1개 이상의 X기 및 1개 이상의 R¹기 부착 부위를 다수개 제공할 수 있다. 상기 결합제의 예는 아미노산(예컨대, 리신, 글루탐산, 아스파르트산 등), 폴리알코올(예컨대, 글리세롤 등), 폴리티올, 폴리산, 또는 폴리아민을 포함한다.

섬광체 분자는 결합제에 의해 2개 이상의 R¹기에 결합된 1개의 X기로 구성되는 것이 적당하다. 대안으로, 섬광체 분자는 결합제에 의해 2개 이상의 머리부 작용기에 결합된 1개의 친유성 R¹기로 구성된다. 상기 분자는 적당한 결합제 작용기에 의해 결합된 1개의 R¹기 및 1개의 X기로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 인광 물질 머리부는 2,5-디페닐옥사졸(PPO), 또는 2,5-디페닐옥사졸 유도체이다. 2,5-디페닐옥사졸은 결합제 작용기에 의해 꼬리부와 결합되어 있거나 또는 직접 친유성 꼬리부와 결합되어 있는 4번 탄소에서 유도체화되는 것이 보다 바람직하다.

화학식 (I) 내지 (VI)으로 표시되는 화합물의 염의 예는 각각 메탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 염산염 및 설페이트 등을 부여하는 유기산(예컨대, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 p-톨루엔 설폰산 등), 무기산(예컨대, 염산 및 황산 등) 등으로부터 유도되는 염; 또는 염기(예컨대, 유기 염기 및 무기 염기 등)로부터 유도되는 염을 포함한다. 본 발명의 화합물의 염의 제조에 적당한 무기 염기의 예는 암모니아, 리튬, 나트륨, 칼슘, 칼륨, 알루미늄, 철, 마그네슘, 아연 등의 히드록시드, 카르보네이트, 및 비카르보네이트 등을 포함한다. 또한, 적당한 유기 염기를 사용하여 염을 제조할 수 있다. 본 발명의 화합물을 보유하는 염기 부가 염의 제조에 적당한 상기 염기는 비독성이고, 염을 제조하기에 충분히 강한 유기 염기를 포함한다. 상기 유기 염기는 이미 당업계에 공지되어 있으며, 아미노산(예컨대, 아르기닌 및 리신 등), 모노-, 디- 또는 트리히드록시알킬아민(예컨대, 모노-, 디- 및 트리에탄올아민), 콜린, 모노-, 디- 또는 트리알킬아민(예컨대, 메틸아민, 디메틸아민 및 트리메틸아민), 구아니딘; N-메틸글루코사민; N-메틸피페라진; 모르폴린; 에틸렌디아민; N-벤질페닐에틸아민; 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 등을 포함할 수 있다.

당업계에 주지된 방법을 사용하는 종래의 방식으로 염을 제조할 수 있다. 필요한 산을 함유하는 적당한 용매 중에 본 발명의 제1 또는 제2 실시양태에 따른 유리 염기 화합물을 용해시킴으로써, 상기 염기성 화합물의 산 부가 염을 제조할 수 있다. 화학식 (I)로 표시되는 화합물이 산성 작용기를 함유하는 경우, 상기 화합물을 적당한 염기와 반응시킴으로써, 상기 화합물의 염기 부가 염을 제조할 수 있다. 산 또는 염기 부가 염은 직접 분리할 수 있거나, 또는 예컨대 증발에 의해 용액을 농축시킴으로써 수득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 화합물의 예는 다음과 같은 것들을 포함한다.

본 발명의 제2 실시양태는 본 발명의 제1 실시양태에 따른 화합물 또는 그 유도체의 제조 방법을 제공한다.

일반적으로, 1개 이상의 R¹기에 1개 이상의 X기를 커플링시킴으로써, 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다. 당업계에 공지된 커플링 기법을 사용하여, 상기 커플링 반응을 수행할 수 있다. 사용되는 특정 커플링 반응은 X기 및 R¹기 상에 존재하는 작용성 및 형성되는 결합 상에 존재하는 작용성에 의존할 수 있다.

하기 방법 1), 2) 또는 3)에 따라 본 발명의 제1 실시양태의 바람직한 화합물을 제조하는 것이 보다 바람직하다:

1) 염기의 존재 하에서 할로알킬기로 2,5-디페닐옥사졸의 4-알코올 유도체를 알킬화하는 방법. 할로알킬기는 알킬화 단계 이전에 보호 단계를 필요로 할 수 있는 추가의 작용기를 함유할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 보호 단계가 필요한 경우, 임의의 종래의 보호 시약에 의해 보호 단계를 수행할 수 있다. 알킬화 단계 후, 종래의 탈보호 기법을 사용하여 보호기를 제거할 수 있거나, 또는 섬광체 화합물 상에 1개 이상의 작용기를 잔류시킬 수 있다.

2) 염기의 존재 하에서 알코올로 2,5-디페닐옥사졸의 4-할로겐 유도체를 알킬화하는 방법. 또한, 알코올은 알킬화 단계 이전에 보호 단계를 필요로 할 수 있는 추가의 작용기를 함유할 수 있다. 종래의 보호 시약을 사용하여, 상기 보호 단계를 수행할 수 있다. 종래의 탈보호 기법을 사용하여 보호기의 제거를 수행할 수 있으나, 섬광체 화합물 상에 1개 이상의 작용기를 잔류시킬 수 있다.; 또는

3) 본 발명의 1개의 섬광체 분자를 본 발명의 다른 섬광성 분자로 전환시키는 방법. 이를 수행할 수 있는 방법의 예는 하기 단계들을 포함한다:

보호기의 제거 단계,

보호기의 첨가 단계,

산화 단계(예컨대, 알코올을 알데히드 또는 케톤으로 산화시키거나, 또는 알데히드기를 산기로 산화시키는 단계),

산 또는 알코올의 에스테르화 단계,

산 또는 아민의 아미드화 단계,

환원 단계(예컨대, 알켄을 알칸으로 환원시키거나, 또는 알데히드를 알코올로 환원시키는 단계),

특정 화합물의 염의 생산 단계, 및

다른 작용기의 상호 전환(예컨대, 알코올의 브롬화) 단계.

당업자에게 공지된 기법을 사용하여, 4번 위치에서의 2,5-디페닐옥사졸기의 관능화를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 먼저 2,5-디페닐옥사졸을 에틸 2,5-디페닐-4-옥사졸카르복실레이트로 전환시킨 후(Tanaka 등의 문헌[Chem Abs. (1963), 58, 3407f] 참조), 수소화붕소나트륨의 에탄올성 용액을 사용하여 환원시킨다(Clapham 등의 문헌[Tetrahedron Lett., (1997), 52, 9061] 참조). 당업계에 공지된 시약을 사용하여, 알코올의 할라이드로의 상호 전환을 수행할 수 있다.

본 발명의 제1 실시양태의 모든 바람직한 특징은 본 발명의 제2 실시양태에 적용된다.

본 발명의 제3 실시양태는 본 발명의 섬광체 분자가 혼입되어 있는 리포솜을 제공한다.

본 발명의 목적을 위해, 리포솜은 지질 분자의 이중층으로 구성된 구형 구조물이다. 섬광체 분자의 지질 꼬리부에 의해 섬광체 분자를 지질 이중층 내로 삽입할 것을 제안한다. 리포솜을 구성하는 지질 분자는 임의의 천연 또는 합성 지질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 지질 분자는 양으로 하전된 머리부 작용기 및 지질 꼬리부로 구성된다. 바람직하게는, 리포솜은 1개 이상의 포스파티딜 콜린(PC), 디올레오일트리메틸암모늄 프로판(DOTAP), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 또는 디올레오일옥시프로필-트리메틸아민 암모늄 클로라이드(DOTMA)로부터 선택되는 지질을 포함한다.

리포솜을 형성시키고, 본 발명의 섬광체 분자를 세포막 내에 전달하는데 적당할 수 있는 다른 지질은 매우 다양한데, 상기 지질은 단일 사슬 탄화수소, 이중 사슬 탄화수소 또는 콜레스테롤을 보유하는 양이온성 지질을 소수성 앵커로서 포함한다. 이러한 주제에 대한 개관은 Chesnoy S. 및 Huang L.의 문헌[유전자 전달용 지질-DNA 복합체의 구조 및 기능; Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29. 27-47, (2000)]에서 찾을 수 있다.

본 발명의 바람직한 특징에 있어서, 본 발명은 섬광체 분자가 세포막 내에 삽입되도록 하는 전달 시스템으로서 리포솜-섬광체 컨쥬게이트를 제공한다.

대안으로, 본 발명의 제3 실시양태는 본 발명의 섬광체 분자가 혼입되어 있는 미셀을 제공한다.

본 발명의 제1 및 제2 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제3 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제4 실시양태는 리포솜 내에 섬광체 분자를 삽입하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일례에 있어서, 유기 용매 중에서 지질 및 섬광체 분자를 함께 항온배양한 후 유기 용매를 제거하고, 생성된 혼합물을 수중에서 현탁시킴으로써, 리포솜을 형성시킨다. 이어서, 현탁된 리포솜-섬광체 분자 복합체를 동결 건조시켜, 동결 건조된 분말로서의 리포솜-섬광체 분자 복합체를 제공할 수 있다. 대안으로, 수성 매질[예컨대, 물, 수성 완충액 또는 세정제 용액] 중의 현탁액으로서의 지질-섬광체 분자 복합체를 제공한다.

대안의 방법에 있어서, 리포솜을 형성시키기 위하여 리포솜 현탁액을 데울필요가 있다. 바람직하게는 30 내지 80 ℃, 보다 바람직하게는 50 내지 70 ℃, 가장 바람직하게는 60 ℃ 이상으로 리포솜 현탁액을 데운다.

섬광체 분자 대 지질의 비를 1:1 내지 10:1, 바람직하게는 2:1 내지 8:1, 보다 바람직하게는 4:1로 하여, 지질 및 섬광체 분자를 항온배양하였다.

대안의 방법에 있어서, 미리 형성된 리포솜과 함께 섬광체 분자를 항온배양하였다.

리포솜의 형성이 당업자에게 주지되어 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 당업자는 섬광체 분자가 혼입된 상이한 크기, 조성 등의 리포솜을 생산할 수 있을 것이다.

섬광체 분자를 세포막에 전달하는데 있어서의 미셀의 용도는 리포솜에 대한 대안으로서 연구되어 왔다. 미셀은 친유성 분자(예컨대, 계면활성제)의 응집체이고, 이는 약물 전달에 광범위하게 사용되어 왔다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 0.1%, 0.5% 또는 1.0%가 용해된 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(DTAB)로서의 계면활성제를 사용하여, 미셀을 형성시킨다. 또 다른 구체예에 있어서, 0.1 mg 내지 25 mg의 섬광체 분자, 바람직하게는 0.5 mg 내지 15 mg의 섬광체 분자, 보다 바람직하게는 10 mg 이상의 섬광체 분자를 10 ml의 0.1% DTAB 용액 중에 분산시킨다.

따라서, 본 발명의 제4 실시양태도 또한 섬광체 분자를 미셀 내에 삽입하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제1, 제2 및 제3 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제4 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제5 실시양태는 섬광체 분자가 혼입된 세포(여기서, 상기 섬광체 분자는 정상적인 세포의 기능에 영향을 미치지 않으면서 세포막 내에 삽입됨)를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 막 내에 삽입된 섬광체 분자, 및 막이 결합된 중요 단백질 또는 수용체를 함유한다.

세포는 1개 이상의 원핵생물(예: 박테리아 등) 또는 진핵생물(예: 진균류, 포유류, 파충류, 곤충류, 어류 등) 세포이다. 바람직하게는, 세포는 포유류 세포이다.

본 발명의 제5 실시양태의 세포는 중요 단백질을 발현시키는 세포주로부터 취할 수 있다. 단백질은 천연 단백질 또는 세포 내에 도입된 단백질일 수 있고, 구조(즉, 항상 발현된) 단백질 또는 유도된(즉, 특정 자극에 대한 반응으로 생성된) 단백질일 수 있다. 단백질은 막이 결합된[통합성(integral) 또는 외인성(extrinsic)] 단백질일 수 있거나, 또는 세포질 내에 위치한 단백질일 수 있다. 대안으로, 세포질 단백질을 조작함으로써, 내부 또는 외부 세포 표면 상에 세포질 단백질을 발현시킬 수 있다. 세포를 변형시킴으로써, 세포에 의해 발현되는 단백질의 레벨을 정상 레벨 이상으로 증가시킬 수 있다.

세포는 생식세포계 세포(germ-line cell) 또는 간세포(stem cell)이다. 또한, 혼합된 세포 집단(즉, 1개 이상의 유형의 세포 또는 1개 이상의 공급원으로부터 유래한 세포)으로서 세포를 제공할 수 있다.

섬광체 분자가 적재된 세포는, 방사능표지된 분자의 사용에 의해 생물학적활성 또는 약물 활성을 모니터링하는 각종 세포에 기초한 분석(cell-based assay)에 사용될 수 있다. 상기 섬광체 분자가 혼입된 분석 시스템은 세포의 과정을 실시간으로 조사하는데 사용될 수 있다. 상기 섬광체 분자가 사용될 수 있는 분석 시스템은 (i) 혼입 분석, (ii) 막 수송 분석, (iii) 결합 분석 및 (iv) 신호 전달 분석를 포함한다.

(i) 혼입 분석은 세포내의 생화학적 과정[예컨대, 단백질 합성(¹⁴C/³H/³⁵S-메티오닌 혼입), 세포 증식 및 DNA 수복/손상(¹⁴C/³H-티미딘 흡수/혼입), 및 지질 대사(¹⁴C/³H 표지된 전구체의 혼입)]을 모니터링하는데 사용된다.

(ii) 방사능표지된(¹⁴C/³H/³⁵S/⁴⁵Ca/¹²⁵I) 각종 기질의 수송(유입 또는 유출)을 측정하는 막 수송 분석은 채널 또는 담체의 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 막 수송에 대한 동력학적 연구 이외에, 단백질 저해제/활성화제에 대한 연구를 수행하여, 잠재적인 치료제일 수 있는 수송 저해제의 동정을 가능하게 한다.

(iii) 수용체 결합 분석을 비롯한 결합 분석은 방사능표지된 (¹⁴C/³H/³⁵S/⁴⁵Ca/¹²⁵I) 리간드의 결합을 필요로 하는데, 상기 방사능표지된 리간드의 결합으로부터 수용체의 수 및 친화성을 계산할 수 있다. 또한, 경쟁(competition) 연구는 표적 수용체의 잠재적인 저해제/활성화제를 평가하는데 사용될 수 있다. 모든 유형의 수용체[많은 다른 수용체 중에서도 특히 퓨린성(purinergic), 아드레날린성 및 니코틴성 수용체를 포함함]를 망라하는 광범위한 리간드가 시판된다.

(iv) 또한, 방사능표지된 2차 전령 및 기질을 사용하여, 신호 전달 활성을 조사할 수 있다.³⁵S-GTP 감마-S를 사용하여, G-단백질 활성을 모니터링할 수 있다. [³³P]-ATP 결합을 사용하여, 단백질-인산화를 모니터링할 수 있다. 칼슘은 신호 전달에 주된 역할을 하며,⁴⁵Ca은 칼슘 흡수를 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 방사능표지된 IP3, IP4 및 c-AMP는 시판되며, 신호 전달을 조사하는데 사용될 수 있다.

일반적으로, 방사성 동위원소의 활성을 측정하는 것은 세포 파괴 또는 세포막의 분리를 필요로 하고; 실시간 측정도 또한 불가능하다. 세포막 내에 혼입된 본 발명의 제1 실시양태의 섬광체 분자를 사용함으로써, 이러한 문제점들을 극복할 수 있다.

본 발명의 제5 실시양태의 대안의 구체예는 제1 실시양태의 1개 이상의 섬광체 분자 및 1개 이상의 중요 단백질 또는 수용체가 혼입된 리포솜 또는 미셀을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 단백질 또는 수용체는 정제되거나 부분적으로 정제된 단백질 또는 수용체이거나 또는 재조합 단백질 또는 수용체이다. 전술한 바와 같이, 단백질은 세포질 단백질(예: 단백질 키나제) 또는 막이 결합된 단백질(예: 7개의 막 횡단 수용체 또는 이온 채널)일 수 있다. 상기 리포솜 또는 미셀은 전술한 바와 같은 결합 분석 시스템에 사용될 수 있다.

본 발명의 제1, 제2, 제3 및 제4 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제5 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제6 실시양태는 제1 실시양태의 섬광체 분자를 세포 내에 삽입하는 방법을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 먼저 섬광체 분자를 리포솜 또는 미셀 내에 삽입한다. 섬광체 분자-미셀 또는 섬광체 분자-리포솜을 20-40 ℃, 바람직하게는 37 ℃에서 30분 내지 120분 동안 세포와 함께 항온배양한다. 대안의 방법에 있어서, 섬광체 분자를 세포와 함께 직접 항온배양한다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제6 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제7 실시양태는 리포솜 또는 미셀 및 본 발명의 섬광체 분자를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 대안의 구체예에 있어서, 키트는 리포솜 또는 미셀의 형성을 위한 1개 이상의 시약(예컨대, 세정제 분자 또는 지질), 및 본 발명의 섬광체 분자를 포함한다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제7 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제8 실시양태는 세포, 1개 이상의 본 발명의 섬광체 분자, 및 중요 단백질 또는 수용체를 포함하는 분석 시스템을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 특정 수용체를 함유하는 세포의 세포막 내에 섬광체 분자를 삽입한다. 방사능표지된 약물 분자는 수용체와 결합하고, 막 고정 섬광체 분자와의 상호 작용의 결과로서 섬광을 유발시킨다. 이어서, 상기 기법을 사용하여, 방사능표지된 리간드와 치환될 수 있기 때문에 수용체와 결합하는 신약[경쟁 분자]을 동정할 수 있다. 방사능표지된 리간드가 치환되고 섬광이 관찰되지않을 때, 신약의 동정을 확인할 수 있을 것이다.

대안의 구체예에 있어서, 안티센스 분자와 함께 섬광체 분자를 사용하여, 특정 분자가 소정의 세포 단백질에 결합할 수 있는지를 확인할 수 있다. 안티센스 분자는 소정의 단백질의 발현을 방지한다. 따라서, 방사능표지된 분자의 적용 전에 섬광이 발생하지 않을 때, 약물의 진정한 표적이 동정되었다.

본 발명의 제8 실시양태의 일 구체예는 특정 종(種)이 세포에 의해 흡수되지는 여부를 측정하는데 있어서의 섬광체 분자의 용도를 제공한다. 상기 섬광체 분자의 용도로는 세포 내에의 방사능표지된 메티오닌의 혼입을 측정하여 단백질 합성 및 흡수를 모니터링하는 것, 및 세포 내에의 방사능표지된 티미딘의 혼입을 측정하여 세포 증식을 모니터링하는 것을 들 수 있다. 또한, 방사능표지된 기질의 유입 및 유출을 사용하여, 막 수송 시스템(예컨대, 채널)의 활성 및 잠재적인 치료 약물에 의한 이들 경로의 저해를 평가할 수 있다.

추가의 흡수 실험은 이온화 방사선이¹⁴탄소(¹⁴C),⁴⁵칼슘(⁴⁵Ca),³⁵황(³⁵S) 및³³인(³³P)로 표지된 화합물일 때 섬광 분자를 성공적으로 사용할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 섬광 분석법은 종전에 논의된 섬광 근접성 분석법보다 잇점이 있는데, 이는 상기 섬광 분석법은¹²⁵요오드(¹²⁵I) 이외의 방사성 동위원소의 사용을 허용하기 때문이다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제8 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제9 실시양태는 본 발명의 1개 이상의 섬광체 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 안정화제, 세정제 및/또는 염료를 비롯한 다른 추가 성분과 함께 본 발명의 제1 실시양태의 1개 이상의 섬광체 분자를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체, 용액, 고형물, 분말, 동결 건조 분말, 또는 1개 이상의 과립 또는 펠렛의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 제9 실시양태의 또 다른 특징에 있어서, 상기 조성물은 상보적인 특성 또는 상승적인 특성을 보유하는 2개 이상의 섬광체 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 각각의 섬광체 분자는 상이한 방사성 동위원소와 함께 섬광을 발생시키고, 이로써 보다 더 큰 감수성을 달성하도록 한다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제9 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제10 실시양태는 특정 세포주 내에의 삽입용 섬광체 분자, 및 방사능표지된 리간드를 포함하는 키트를 제공한다. 대안의 구체예에 있어서, 리포솜 또는 미셀 전달 매개체 내에 삽입된 섬광체 분자를 포함한다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제10 실시양태에도 적용된다.

본 발명의 제11 실시양태는 분석 시스템에서 본 발명 제1 실시양태의 섬광체 분자의 사용을 제공한다. 분석 시스템은 하나 이상의 원핵 또는 진핵 세포의 사용을 포함하는 것이 바람직하다. 세포가 포유동물의 것이라면 더욱 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 섬광체 분자를 세포의 세포막내로 삽입한다. 섬광체 분자는 리포솜 또는 미셀과 같은 전달 매개체를 통해 또는 직접 삽입된다.

섬광체 분자는 방사능표지된 부분과 함께 사용되는 것이 바람직하며, 이 부분은¹⁴C,³H,³⁵S,³³P,⁴⁵Ca,¹²⁵I로 방사능표지된다.

본 발명의 제11 실시양태에 기술된 분석 시스템은 세포내 세포성 표적을 동정하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 실시양태의 모든 바람직한 특징은 제11 실시양태에도 적용된다.

본 발명은 후술하는 비제한적인 실시예에 대하여 예시된다. 본 명세서에 포함된 이들 실시예는 이하에 제시된 도면에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1 : 상업적으로 이용가능한 섬광제와 섬광체 분자의 비교

합성 섬광체 분자의 섬광 활성은, 문헌[Clapham, et al. (1997)Tetrahedron Lett. 38, 52]에 기재된 바에 따른 방법을 사용하여, 상업적으로 이용가능한 섬광제인 마이크로신트 20(Packard)과 비교하였다. 신틸리피드(scintilipid)의 일련의희석액은 톨루엔 중에서 10 mM, 1 mM, 0.1 mM 및 0.01 mM의 최종 농도로 제조하였다. 톨루엔 100 ㎕당 0.1 μCi를 함유하는¹⁴C-헥사데칸 모액을 제조하고, 96 웰 플레이트 포맷내에 방사능표지 100 ㎕를 1웰 당 신틸리피드 100 ㎕에 첨가하여 혼합 및 계수하였다. 비교용으로, 방사능표지 100 ㎕를 마이크로신트 20 100 ㎕에 첨가하였다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있다.

10 mM에서 각각의 신틸리피드에 대하여, 마이크로신트 20에 대한 섬광 효율(백분율)을 계산하였고, 이를 표로 나타내었다(표 1).

신틸리피드	ST1	ST2	ST3	ST4	ST5	ST6	ST7	ST8	ST9	ST0	ST11
효율(%)	34	33	30	15	13	10	8	12	9	0.6	65

본 발명자에 의해 수행된 또다른 실험 결과, 상업적으로 이용가능한 섬광제 3-히드록시플라본, POPOP(1,4-비스[5-페닐-2-옥사조일]-벤젠) 또는 부틸-PBD(2-(4-t-부틸페닐)-5-(4-바이페닐일)-1,3,4-옥사디아졸)는 리포솜내에 봉입될 수 있음이 밝혀졌다.

실시예 2: 리포솜내로 섬광체 분자의 봉입

지질[a) 포스파티딜 콜린, b) 디올레오일트리메틸암모늄 프로판 및 c) 디올레오일트리메틸암모늄 프로판/디올레오일포스파티딜에탄올아민]을, 검토하고자 하는 신틸리피드와 함께(1:1; 지질:신틸리피드) 클로로포름/메탄올 중에 용해시킨 후, N₂스트림 하에서 건조될 때까지 증발시켰다. 지질이 완전히 탈수되었음을 확인하기 위해, 최종적으로 최소한 2시간동안 진공 건조시켰다. 이어서, H₂O에서 재현탁시켜 10 mg/ml의 최종 지질 함량을 가지도록, 리포솜을 형성하였다. 경우에 따라서는, 리포솜 현탁액을 60℃로 가온하는 것이 필요하였다. 현미경으로 리포솜을 검사하여 안정한 리포솜 구조를 확인하였고, 분취량의 리포솜 제제에¹⁴C-타우린을 첨가하여 섬광을 확인하였다(도 3).

섬광체 분자 ST3 내지 ST7 및 ST10은 유의성있는 정도의 섬광 활성을 보였다. 현미경 하에서의 리포솜 제제의 검사는, 리포솜 막으로의 신틸리피드 봉입에 대한 정성적인 측정치를 제공한다. 그 결과는 ST4, ST5 및 ST10이 보다 안정한 리포솜을 형성한다는 것과 ST3, ST6 및 ST7을 함유한 제제는 신틸리피드의 결정 침착물을 가진다는 것을 의미한다. 그러므로, 세포계 분석에서 차후의 용도 및 세포내로의 신틸리피드 흡수를 검사하는 추가의 실험은 ST4, ST5 및 ST10을 사용하여 수행되었다.

증가하는 신틸리피드 함량을 가지는 리포솜 제제는, 최적의 리포솜 제제는 리포솜 현탁액 1 ml 당 DOTAP 2 mg에 대하여 신틸리피드 8 mg이었고(도 4), 이것이 차후의 실험에서 사용된 리포솜 조성물임을 나타내었다.

¹⁴C-타우린 활성이 0.1 μCi로부터 1.0 μCi로 증가되었을 때 선형 반응이 관찰되었다(도 5).

실시예 3: 세포막내로 섬광체 분자의 봉입

2가지 접근법이 세포막내로 신틸리피드 화합물을 봉입하는 데 사용되었다.(A) DOTAP(전술한 바와 같음)를 함유하는 양이온성 리포솜 및 (B) 미셀. 미셀은 계면활성제와 같은 친지성 분자의 응집체이며, 약물 전달에 있어서 널리 사용되어 왔다. 이 연구에서, 우리들은 PBS 중에 0.1%, 0.5% 또는 1.0%로 용해된 계면활성제 DTAB(도데실트리메틸암모늄 브로마이드)를 사용하였다. 예비 연구 결과, 10 mg 이하의 신틸리피드는 1% DTAB 용액 10 ml내에 분산될 수 있음이 밝혀졌다.

신틸리피드 분자를 함유하는 방사능표지된 리포솜을 제조하였고, 광범위하게 이용가능한 내피 세포주(HeLa)에 의한 흡수를 검사하였다. 방사능표지된 리포솜은 1 ml H₂O중에 재현탁된 신틸리피드 8 mg, DOTAP 2 mg 및 0.5 μCi¹⁴C-DOPE로 구성되었다. 이어서, 이 리포솜을 HeLA 세포와 항온배양하기 전에, 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 50% 희석하였다. HeLa 세포를 75 m²플라스크내에서 DMEM 중에 융합(confulence)될 때까지 성장시키고, 세포를 트립신 분해하고, 96웰 플레이트상에 이식하여 37℃의 O₂/CO₂인큐베이터내에서 약 48시간동안 융합 상태로 항온배양하였다. 이어서, 세포를 PBS 중에서 세척하여 성장 배지를 제거하고(혈청의 존재는 리포솜 흡수를 방해함), 방사능표지된 리포솜 제제(100 ㎕/웰)를 37℃에서 30분 또는 120분동안 항온배양하였다. 이 96웰 플레이트를 항온배양한 다음, PBS 중에서 철저히 세척하여 미결합된 임의의 리포솜을 제거하고, 이 플레이트를 β-섬광에 대하여 계수하였다(도 7).

섬광 계수 결과는, HeLa 세포가 신틸리피드를 흡수한다는 것, 그리고 흡수된¹⁴C-DOPE의 근접부가 섬광을 생성한다는 것을 나타내었다.

실시예 4: ¹⁴ C-메티오닌 흡수 분석

HeLa 세포를 75 cm²플라스크내에서 DMEM 중에 융합될 때까지 성장시키고, 96웰 플레이트에 이식하여, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 다양한 시점에서, DMEM을 PBS 중에¹⁴C-메티오닌이 첨가된 DMEM으로 교체하고, 리포솜을 첨가하였다. 리포솜의 조성은, H₂O 1 ml 중에 재현탁시키고 최종적으로 PBS 1 ml 중에 희석시킨 신틸리피드 8 mg, DOTAP 2 mg이었음. 이 세포를 리포솜의 존재하에서 120분, 60분 및 30분간 항온배양하였다.

도 8은 ST4, ST5 및 ST10에 대한 결과를 도시한다. 삽입체는 상업적으로 이용가능한 섬광제 칵테일(마이크로신트 20)을 사용하여 측정한 HeLa 세포에서의 메티오닌 흡수를 나타내고, 이것은 ST4 및 ST5를 로딩한 세포에 대한 결과를 반영한다. ST4가 로딩된 세포의 섬광 활성은 ST4 및 ST10이 로딩된 세포에 비해 큰데, 이것은 도 4 및 도 7의 결과로부터 예측되는 바이다.

메티오닌 흡수 분석을 래트의 뉴런 세포주(C6 신경교종)에서 반복하였다. C6 신경교종 세포를 Hams F12 배지에서 성장시켰지만, 이를 제외한 실험 프로토콜은 동일하였다. 그 결과를 ST4에 대하여 도 9에서 도시한다.

실시예 5: ³⁵ S-메티오닌 흡수

³⁵S-메티오닌을 사용하여, HeLa로의 메티오닌 흡수를 반복하였다. 얻어진 결과는¹⁴C-메티오닌 흡수와 일치하였으며, 도 10에 도시되어 있다.

실시예 6: '실시간' ¹⁴ C-메티오닌 흡수 분석

¹⁴C-메티오닌 흡수를 또한 '실시간'으로 나타내었다. HeLa 세포를 75 cm²플라스크 내에서 DMEM 중에 융합될 때까지 성장시키고, 96웰 플레이트에 이식하여, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 이 HeLa 세포를 신틸리피드를 함유하는 리포솜과 항온배양하였다. 리포솜의 조성은, 1 ml H₂O에 재현탁시키고 최종적으로 1 ml PBS에 희석한, 8 mg 신틸리피드, 2 mg DOTAP 또는 8 mg 신틸리피드, 1 mg DOTAP, 1 mg DOPE이었음. 이 세포를 37℃에서 120분간 리포솜 존재하에서 항온배양하였다.¹⁴C-메티오닌을 함유한 DMEM을 첨가하고, 시간에 따른 흡수를 측정하였다. 도 11은 ST4에 대한 결과를 도시한다. 처음에는¹⁴C-메티오닌의 흡수가 없었지만, 약 72시간 후¹⁴C-메티오닌이 축적되기 시작하였다. ST4/DOTAP 또는 ST4/DOTAP/DOPE로 예비-항온배양된 세포들 사이에 유의성있는 차이는 없었다.

실시예 7: ¹⁴ C-티미딘 흡수 분석

HeLa 세포를 75 cm²플라스크에서 보충된 DMEM중에 융합될 때까지 성장시키고, 24웰 플레이트에 이식하여, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 배지를 무혈청 DMEM으로 교체하고, 37℃에서 24시간동안 항온배양하였다. 이어서, 무혈청 DMEM을¹⁴C-티미딘을 함유하는 DMEM(0.2 μCi/웰)으로 교체하고, 37℃에서 24시간까지 항온배양하였다. 흡수 분석을 종료시키기 위해, 세포를 PBS 중에서 세척하고 리포솜을 첨가하였다. 리포솜 조성은, 1 ml H₂O 중에 재현탁시키고, 최종적으로 1 ml PBS 중에 희석시킨 8 mg 신틸리피드, 2 mg DOTAP이었음. 이 세포를 리포솜의 존재하에 37℃에서 120분, 60분 및 30분동안 항온배양하였다. 도 12는 상업적으로 이용가능한 섬광제 칵테일을 사용하여 측정한 HeLa 세포에서의 티미딘 흡수를 도시하는, 삽입체를 가진 ST4에 대한 결과를 나타낸다.

실시예 8: 방사능리간드 결합 분석

신틸리피드 기법을 사용하여 3가지의 방사능리간드 결합 분석(HTC 세포에서 글루코코르티코이드 수용체에 대한³H-덱사메타손 결합, C6 신경교종 세포에서 베타-아드레날린성 수용체에 대한³H-디하이드로알프레놀롤 결합, 및 HeLa 세포에서 Na/K 펌프에 대한³H-오우아바인 결합)을 수행하였다.

실험의 세부사항 중 많은 부분이 실시된 3가지 분석 모두에 공통된다. 세포주 각각을 75 cm²플라스크 내에서 융합될 때까지 성장시킨 후, 96웰 플레이트 또는 24웰 플레이트에 이식하였다. HTC 세포를, 필수 아미노산을 보충한 최소 필수 배지중에서 성장시키고, C6 신경교종 세포는 Ham's F12 배지에서 성장시키고, HeLa 세포는 DMEM에서 성장시켰다. 세포가 융합되고 나면, 이들을 PBS 중에서 세척하고,37℃에서 2시간동안 신틸리피드를 로딩하였다. 신틸리피드의 조성은, 1 ml H₂O에 재현탁시키고 최종적으로 1 ml PBS에 희석시킨 8 mg 신틸리피드, 2 mg DOTAP이었음. 이어서, 이 세포를 PBS 중에서 다시 세척하고, 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 24시간 내지 48시간동안 항온배양하였다.

실시예 9: 글루코코르티코이드 수용체 분석

글루코코르티코이드 수용체 결합 분석은, 96웰에서 성장시키고 신틸리피드로 항온배양한 HTC 세포에 대하여 수행하였다. 이 세포를 HEPES-완충 염수(HBS)(155 mM NaCl, 5 mM HEPES, pH 7.4) 중에서 3회 세척한 후, 다양한 농도의³H-덱사메타손(5 x 10^-10M 내지 1 x 10^-8M)으로 37℃에서 30분간 항온배양하였다. 이어서, 이 세포를 빙냉 HBS로 3회 세척한 후, 플레이트를 계수하여 전체(총) 결합을 확인하였다. 비특이적 결합을 확인하기 위해, 동일한 농도의³H-덱사메타손을 사용하되, 20 x 10^-6M의 '냉' 덱사메타손을 첨가하였고, 특이적인 결합은 총 결합 및 비특이적인 결합간의 차이로서 계산하였다. 그 결과를 도 13에서 도시한다.

³H-덱사메타손의 치환을 나타내는 실험을 또한 수행하였다. 1 x 10^-9M의³H-덱사메타손을, 증가하는 농도의 '냉' 덱사메타손(5 x 10^-10M 내지 1 x 10^-8M)의 존재하에서 세포에 첨가하고, 이 세포를 37℃에서 30분간 항온배양한 후, 세척 및 계수하였다. 분석 결과는 도 14에 도시한다.

실시예 10: 베타-아드레날린성 수용체 분석

베타-아드레날린성 수용체 결합 분석은 96웰에서 성장시키고 신틸리피드로 항온배양한 C6 신경교종 세포에서 수행하였다. 이 세포를 MOPS 완충액(MBS)(125 mM NaCl, 25 mM MOPS, pH 8.2)에서 3회 세척하고, 다양한 농도의³H-디하이드로알프레놀롤(1 x 10^-8M 내지 1 x 10^-4M)을 사용하여 37℃에서 30분간 항온배양하였다. 이어서, 이 세포를 빙냉 MBS로 3회 세척한 후 플레이트를 계수하여 총 결합을 확인하였다. 비특이적인 결합을 확인하기 위해, 동일한 농도의³H-디하이드로알프레놀롤을 사용하되, 10 x 10^-3M '냉' 알프레놀롤을 첨가하였고, 특이적인 결합은 총 결합과 비특이적인 결합간의 차이로서 계산하였다. 그 결과는 도 15에서 도시한다.

실시예 11: Na ⁺ /K ⁺ ATPase 결합 분석

Na⁺/K⁺ATPase에 대한 결합은, 방사능리간드로서³H-오우아바인을 사용하여 24웰 플레이트에서 성장시킨 HeLa 세포에 대하여 수행하였다. 이 세포를 HEPES-완충 염수(HBS)(140 mM NaCl, 5 mM 글루코즈, 0.5 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.4)에서 3회 세척한 후, 다양한 농도의³H-오우아바인(5 x 10^-8M 내지 1 x 10^-5M)을 사용하여 37℃에서 40분간 항온배양하였다. 이어서, 이 세포를 빙냉 MBS로 3회 세척한 후, 플레이트를 계수하여 총 결합을 확인하였다. 비특이적인 결합을 확인하기 위하여, 동일한 농도의³H-오우아바인을 사용하되 15 mM KCl을 항온배양배지에 첨가하였고, 특이적인 결합은 총 결합과 비특이적인 결합과의 차이로서 계산하였다. 그 결과는 도 16에 도시한다.

실시예 12: 섬광체 분자의 제조

ST1

알코올=0.50 g =2 mmol

수소화나트륨(오일중 60%)=0.160 g(60%) =0.096 g=4 mmol =2 당량

DMF=10 cm³

브로모옥탄 =0.346 cm³=0.386g=2 mmol =1 당량

수소화나트륨 및 알코올을 50 cm³둥근 바닥 플라스크에 두었다. DMF를 첨가하고, 얻어진 회색/흑색 슬러리를 실온에서 15분간 교반하였다. 이어서, 브로모옥탄을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 물(40 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 50 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수(5 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 에테르체를 황색 오일로서 얻었다(1.058 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산 100 cm³, 이어서 헥산 중 5% 에틸 아세테이트 200 cm³)로 정제하여, 순수한 에테르체를 무색 오일로서 얻었다(0.5474 g, 83%). 대부분의 오일을 샘플 튜브상에 배치하고, 수시간에 걸쳐 오일을 고체화하여 왁스상의 백색 고체를 얻었다(0.5528 g, 76%).

ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3060(m, C-H), 2925(s, C-H), 2854(s, C-H);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.85(3H t J 6.9), 1.20-1.40(10H bs), 1.65(2H pentet J 7.5), 3.61(2H t J 6.7), 4.65(2H s), 7.34-7.50(6H m), 7.79(2H d J 7.3), 8.10(2H dd J 5.3, 1.8);^□C(CDCl₃, 75MHz, Pendant) 14(CH₃), 22.7(CH₂), 26.3(CH₂), 29.4(CH₂), 29.5(CH₂), 29.8(CH₂), 31.9(CH₂), 65.5(CH₂), 71.1(CH₂), 126.9(CH), 127.1(CH), 129.2(CH), 129.4(CH), 129.5(CH), 131.0(CH), 잔여 4차 탄소 시그날은 너무 작아서 해상되지 않음;^M/z(APCI) 364 M+H⁺(C₂₄H₂₉NO₂requires M⁺363), 234(100%).

ST2

알코올=0.50 g =2 mmol

수소화나트륨(오일중 60%)=0.160 g(60%) =0.096 g=4 mmol =2 당량

DMF=5 cm³

브로모데칸 =0.415 cm³=0.442g=2 mmol =1 당량

수소화나트륨 및 알코올을 50 cm³둥근 바닥 플라스크에 두었다. DMF를 첨가하고, 얻어진 회색/흑색 슬러리를 실온에서 15분간 교반하였다. 이어서, 브로모데칸을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 물(40 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 50 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수(5 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 에테르체를 황색 오일로서 얻었다(1.173 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산 300 cm³, 이어서 헥산 중 5% 에틸 아세테이트 200 cm³)로 정제하여, 순수한 에테르체를 백색 고체로서 얻었다(0.5619 g, 72%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3059(w, C-H), 2924(s, C-H), 2852(s, C-H);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.88(3H t J 6.9), 1.20-1.40(14H bs), 1.66(2H pentet J 7.1), 3.62(2H t J 6.5), 4.65(2H s), 7.33-7.50(6H m), 7.80(2H d J 7.7),8.11(2H dd J 5.0, 1.6);^□C(CDCl₃, 75MHz, Pendant) 14.1(CH₃), 22.7(CH₂), 26.3(CH₂), 29.4(CH₂), 29.6(CH₂), 29.70(CH₂), 29.72(CH₂), 29.9(CH₂), 32.0(CH₂), 65.6(CH₂), 71.1(CH₂), 126.9(CH), 127.1(CH), 128.1(quaternary C), 129.02(quaternary C), 129.04(CH), 129.46(CH), 129.54(CH), 131.0(CH), 135.1(quaternary C), 149.7(quaternary C), 160.5(quaternary C);^M/z(APCI) 392 M+H⁺(C₂₆H₃₃NO₂requires M⁺391), 234(100%).

ST3

알코올=0.40 g =1.6 mmol

수소화나트륨(오일중 60%)=0.128 g(60%) =0.077 g=3.2 mmol =2 당량

DMF=5 cm³

브로모옥타데칸 =0.531 g =1.6 mmol=1 당량

수소화나트륨 및 알코올을 50 cm³둥근 바닥 플라스크에 두었다. DMF를 첨가하고, 얻어진 회색/흑색 슬러리를 실온에서 15분간 교반하였다. 이어서, 브로모옥타데칸을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 물(40 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 50 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수(5 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 에테르체를 황색 오일로서 얻었다(1.0772 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산 400 cm³, 이어서 헥산 중 7% 에틸 아세테이트 200 cm³)로 정제하여, 순수한 에테르체를 백색 고체로서 얻었다(0.6146 g, 76%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3059(w, C-H), 2915(s, C-H), 2848(s, C-H);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.87(3H t J 6.9), 1.15-1.40(30H bs), 1.65(2H pentet J 7.3), 3.61(2H t J 6.5), 4.63(2H s), 7.32-7.50(6H m), 7.79(2H d J 7.3), 8.10(2H dd J 7.7, 1.8);^□C(CDCl₃, 75MHz, Pendant) 14.1(CH₃), 22.7(CH₂), 26.3(CH₂), 29.4(CH₂), 29.6(CH₂), 29.68(CH₂), 29.72(CH₂), 29.9(CH₂), 32.0(CH₂), 진행성 8 CH₂시그날 하에서 잔여 8 CH₂기,65.6(CH₂), 71.1(CH₂), 126.9(CH), 127.1(CH), 128.1(quaternary C), 129.04(quaternary C), 129.19(CH), 129.46(CH), 129.54(CH), 131.0(CH), 135.1(quaternary C), 149.7(quaternary C), 160.5(quaternary C);^M/z(APCI) 504 M+H⁺(C₃₄H₄₉NO₂requires M⁺503), 234(100%).

ST4-방법 'A'

8-브로모-1-옥탄올(1)=1.0 g =4.8 mmol.

TBDMS-Cl=0.993 g =6.6 mmol=1.4 당량

이미다졸=0.458 g =6.7 mmol=1.4 당량

DCM =30 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기 하의 실온에서 20시간동안 교반하였다. 이 혼합물을 물(100 cm³)에 부어넣고, DCM(2 x 50 cm³)으로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염수(2 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다(1.955 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(2% 트리에틸아민을 함유한 헥산 중 10% 에틸 아세테이트)로 정제하여, 순수한 실릴 에테르체(2)를 무색의 오일로서 얻었다(1.512 g, 98%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 2928(s, C-H), 2855(s, C-H);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.02(6H s), 0.87(9H s), 1.29(6H s), 1.40(2H t J 6.4), 1.48(2H t J 6.4),1.85(2H pentet J 7.1), 3.37(2H t J 6.93), 3.55(2H t J 7);^□C(CDCl₃, 75MHz, Pendant) -5.5(2x CH₃), 18(C), 25.5(CH₂), 26(3x CH₃), 28(CH₂), 29(CH₂), 29.5(CH₂), 32.8(CH₂), 34(CH₂), 63.2(CH₂), 71.5(CH₂).

실릴 에테르(2)=1.211 g =3.75 mmol

옥사졸(3)=0.988 g =3.94 mmol=1.05 당량

수소화나트륨=0.900 g =37.49 mmol=10 당량

DMF =30 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기 하의 실온에서 2시간동안 교반하였다. 물(50 cm³)을 사용하여 조심스럽게 반응을 급냉시키고, 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 30 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수(2 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 생성물(4)을 황색 오일로서 얻었다(2.997 g, 162%). 이 생성물(약간의 에틸 아세테이트를 함유함)은 추가의 정제 작업 없이 반응시켰다. ν_H(CDCl₃, 300 MHz) 0.00(6H s), 0.85(9H s), 1.21(8H m), 1.45(2H t J 6.6), 1.62(2H t J 6.8), 3.51-4.60(4H m), 4.59(2H s), 7.3-8.2(10H m).

옥사졸 실릴 에테르(4)=2.838 g =3.75 mmol(이론치 최대량)

TBAF=1.656 g =6.33 mmol=1.7 당량

THF =30 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기 하의 실온에서 16시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(50 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 40 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기상을 염화암모늄 포화 수용액(2 x 40 cm³), 염수(2 x 40 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축함으로써 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다(1.83 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산(150 cm³) 중 20% 에틸 아세테이트, 이어서 헥산(150 cm³) 중 40% 에틸 아세테이트, 분리된 생성물 R_f=헥산 중 20% 에틸 아세테이트에서 0.21)로 정제하여, 순수한 알코올체를 황색 오일로서 얻었다(0.737 g, 실릴 에테르(2)로부터 2 단계에 대해 52%). 황색 오일을 헥산(20 cm³) 중 40% 아세테이트에 용해시키고, 활성탄(탈색제로서 1 g)과 함께 10분간 완만하게 가열하였다. 이 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 감압하에서 농축하여 순수한 생성물(5)을 연황색 오일로서 얻었다(0.397 g, 실릴 에테르(2)로부터 2단계에 대해 28%). ν_max/cm^-1(KBr disk) 3425(m, O-H), 3057(w, C-H), 2928(s, C-H), 2850(s, C-H), 1549(m, C=C);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 1.30(8H br s), 1.53-1.67(4H m), 3.60(4H t J 6.5), 4.63(2H s), 7.30-7.60(6H m), 7.78(2H d J 8), 8.09(2H dd J 4, 7.9);^m/z (APCI) 380(M+H⁺) (C₂₄H₂₉NO₃requires M+ 379), 234(100%).

ST4-방법 'B'

개략적인 정리

a. i. s-BuLi, THF, -78℃. ii. CO₂(s), 73% 수율

b. MeOH, H₂SO4, 환류, 42% 수율

c. TBDMS-Cl, 이미다졸, DCM, 98% 수율

d. NaBH₄, EtOH, 93% 수율

e. NaH, DMF

f. THF, TBAF, (6)으로부터 28%

실험치

2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실산(2)

2,5-디페닐옥사졸(1)=94.0 g=0.425 mol

s-부틸리튬=360 ml@1.3 M(헥산중)=1.1 당량

이산화탄소(고체)≒ 50 g

무수 테트라히드로푸란= 130 ml

디페닐옥사졸을 테트라히드로푸란 중에 용해시키고, -75℃로 냉각시켰다. 이 혼합물에 s-부틸리튬을 적가하고, 질소하에서 이 혼합물을 기계적으로 교반하여 무색의 용액이 짙은 적색을 띄도록 하였다. 30분 후, 분쇄된 고체 이산화탄소를 조심스럽게 일부씩 첨가하여 격렬한 발열 반응을 일어나게 하였다. 이 첨가는, 반응 온도가 -60℃를 넘지 않도록 조절되었다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 밤새 교반하고 실온으로 가온하였다. 3M 염산 수용액을 사용하여 pH 1로 산성화시키자, 백색 고체가 침전되었다. 이것을 여과하고, 물(3 x 30 ml)로 세척하고, 진공 건조하여 2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실산(2)을 회색빛을 띈 백색 고체로서 얻었다(82.7 g, 73%)._H(CDCl₃, 300 MHz) 7.47-7.56(6H, m), 8.12-8.17(2H, m), 8.28-8.33(2H, m);_C(CDCl₃, 75 MHz) 125.80, 126.81, 128.30, 128.67, 129.03, 130.84, 131.52, 171.58; MS(EI) m/z = 265 (M⁺) (C₁₆H₁₁NO₃requires M⁺265), 105(100%).

메틸 2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실레이트(3)

2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실산(2)=50.0 g=0.189 mol

메탄올=300 ml

농황산=2 ml

상기 시약들을 합치고, 대기중 수분을 제거한 환류하에서 밤새 가열하였다. 이어서, 용매를 감압하에서 증발시키고, 오일을 에틸 아세테이트(200 ml) 중에 재용해시켰다. 이어서, 이것을 10% 수성 나트륨 카보네이트, 염수 및 물(각각 3 x 100 ml)로 세척하였다. 유기 용매를 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에서 증발시켜 메틸 2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실레이트(3)를 황색 오일로서 얻었다(22.0 g, 42%)._H(CDCl₃, 300 MHz) 3.98(3H, s), 7.47-7.54(6H, m), 8.12-8.18(4H, m);_C(CDCl₃, 75 MHz) 52.43, 126.28, 126.85, 126.95, 128.46, 128.48, 128.85, 130.13, 130.40, 131.15, 155.32, 159.81, 162.70; MS(EI) m/z = 279 (M⁺) (C₁₇H₁₃NO₃requires M⁺279), 105(100%).

3-히드록시메틸-2,5-디페닐옥사졸(6)

메틸 2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실레이트(3)=15.1 g=0.054 mol

나트륨 보로하이드라이드 분말 =10.3 g=0.27 mol=5 당량

무수 에탄올=200 ml

메틸 2,5-디페닐옥사졸-4-카르복실레이트(3)를 에탄올 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 여기에 나트륨 보로하이드라이드를 일부씩 첨가하고, 혼합물을 1.5시간동안 교반하여, 실온으로 가온하였다. 이어서, 이것을 수성 3M 염산을 사용하여 pH 1로 산성화하고, 디클로로메탄(3 x 100 ml)으로 추출하였다. 이어서, 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에서 증발시켜 황색 고체를 얻었는데, 이것은 클로로포름으로부터 결정화된다. 얻어진 침전물을 여과하고, 에테르로 세척하여, 진공하에서 건조하여 3-히드록시메틸-2,5-디페닐옥사졸(6)을 미황색 결정으로서 얻었다(12.6 g, 93%)._H(CDCl₃, 300 MHz) 4.40(1H, bs), 4.86(2H, s), 7.34-7.49(6H, m), 7.70-7.75(2H, m), 8.01-8.07(2H, m);_C(CDCl₃, 75 MHz) 56.85, 126.10, 126.35, 126.85, 128.00, 128.56, 128.78, 128.89, 130.48, 136.17, 147.39, 159.88; MS(EI) m/z = 251 (M⁺)(100%)(C₁₆H₁₃NO₂requires M⁺251).

ST5

트랜스-4-데세날=1.0 cm³=5.5 mmol

나트륨 보로하이드라이드=1.033 g=27.3 mmol=5 당량

메탄올=10 cm³

메탄올을 질소 분위기 하에서 나트륨 보로하이드라이드에 첨가하였다. 이 교반 혼합물에,트랜스-4-데세날을 첨가하고, 실온에서 16시간동안 계속해서 교반하였다. 이 혼합물을 물(30 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 25 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수(2 x 50 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제트랜스-4-데센-1-올을 황색 오일로서 얻었다(0.947 g, 110%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3332(m, O-H), 2925(s, C-H), 2855(s, C-H),^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.9(3H t J 7), 1.20-1.40(6H m), 1.61(2H pentet J 9.1), 1.90-2.10(4H m0, 3.65(2H t J 7), 5.44(2H m).

트랜스-4-데센-1-올=0.947g=6.07 mmol

4-브로모메틸-2,5-디페닐옥사졸=1.906 g=6.07 mmol=1 당량

수소화나트륨=1.457 g=60.7 mmol=10 당량

DMF=20 cm³

수소화나트륨 및트랜스-4-데센-1-올을 DMF 중에서 질소 분위기하의 실온에서 10분간 교반하였다. 얻어진 회색의 슬러리에, DMF 중 4-브로모메틸-2,5-디페닐옥사졸 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 물(50 cm³)로 조심스럽게 반응을 급냉시키고, 디에틸 에테르(3 x 30 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수(20 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고,여과하고, 감압하에서 농축하여 황색 고체를 얻었다. 디에틸 에테르를 사용한 연마에 의해 미반응의 옥사졸이 침전되었고, 이것은 셀라이트 패드를 통한 여과에 의해 제거되었다. 여과액을 감압하에서 농축하여 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산(100 cm³), 헥산(200 cm³) 중 20% 에틸 아세테이트)로 정제하여, 순수한 생성물을 무색의 고체로서 얻었다(0.284 g, 12%). ν_max/cm^-1(KBr disk) 2916(s, C-H), 2852(s, C-H), 1545(m, C=C);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.86(3H t J 7.1), 1.20-1.40(6H m), 1.71(2H pentet J 6.9), 1.93(2H q J 5.1), 2.08(2H q J 5.6), 3.63(2H t J 6.5), 4.64(2H s), 5.39(2H m), 7.30-7.50(6H m), 7.79(2H d J 8), 8.10(2H dd J 4, 7.7);

^m/z (APCI) 390 (M+H⁺) (C₂₆H₃₁NO₂requires M+ 389), 234(100%).

ST6

4-브로모메틸 옥사졸=0.492 g=1.57 mmol.

3-(4-히드록시페닐)-프로판-1-올=0.248 g=1.63 mmol=1.04 당량

탄산칼륨=1.273 g=16.3 mmol=10.4 당량

18-크라운-6=촉매량

아세토니트릴=25 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기하에서 16시간동안 환류하였다. 혼합물을 물(30 cm³)에 부어넣고, 디에틸 에테르(3 x 30 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 묽은 염산 수용액(20%, 2 x 30 cm³)으로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물을 회색빛을 띈 백색의 고체로서 얻었다(0.651 g). 디에틸 에테르로 연마시켜, 생성물을 백색 고체로서 얻었다(0.330 g, 55%). ν_max/cm^-1(KBr disk) 3444(m, O-H), 3055(w, C-H), 2927(s, C=H);_H(CDCl₃, 300 MHz) 1.87(2H pentet J 6.5), 2.66(2H t J 7.5), 3.67(2H t J 6.2), 5.15(2H s), 7.00(2H d J 8.5), 7.13(2H d J 8.7), 7.30-7.60(6H m), 7.77(2H d J 7), 8.10(2H dd J 4, 7.7);^m/z (APCI) 386 (M+H⁺) (C₂₅H₂₃NO₃requires M⁺385), 234(100%).

ST7

ST6=0.40g=1.04 mmol

벤조일 클로라이드=0.13 cm³=0.153 g1.09 mmol=1.05 당량

트리에틸아민=0.29 cm³=0.210 g=2.08 mmol=2.0 당량

DCM=10 cm³

ST6을 DCM 중에 용해시키고, 질소 분위기 하에 두었다. 벤조일 클로라이드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 이어서, 트리에틸아민을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 혼합물을 물(20 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(3 x 20 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다. 이 오일을 16시간동안 방치했더니, 황색 고체가 생성되었다(0.511 g). 이 고체를 헥산으로 연마하여 황색 용액과 백색 고체를 얻었는데, 이 고체를 여과에 의해 수집하고, 건조시켜 순수한 생성물(ST7)을 백색 고체로서 얻었다(0.330 g, 65%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3051(w, C-H), 2927(s, C-H), 1716(s, C=O);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 2.07(2H pentet J 6.9), 2.73(2H t J 7.9), 4.33(2H t J 6.2), 5.14(2H s), 7.00(2H d J 8.5), 7.14(2H d J 8.5), 7.30-7.60(9H m), 7.76(2H d J 7), 8.03(2H d J 7), 8.10(2H m);^m/z (APCI) 490 (M+H⁺)(100%)(C₃₂H₂₇NO₄requires M⁺489), 234.

ST8

6-브로모-1-헥산올(1)=1.486 g=8.21 mmol

TBDMS-Cl=1.361 g=9.03 mmol=1.1 당량

이미다졸=0.615 g=9.03 mmol=1.1 당량

DCM=20 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기하의 실온에서 48시간동안 교반하였다. 이미다졸 하이드로클로라이드의 백색 침전물을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 에틸 아세테이트(2 x 50 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물(2)을 오렌지색 오일로서 얻었다(2.361 g, 98%). 이 생성물은 추가의 어떠한 정제 작업 없이 직접 사용하였다.

실릴 에테르(2)=2.361 g=8.03 mmol

옥사졸(3)=1.818 g=7.24 mmol=0.905 당량

수소화나트륨=1.921 g=80.3 mmol=10 당량

DMF=30 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기하의 실온에서 3시간동안 교반하였다. 물(50 cm³)로 조심스럽게 이 반응을 급냉시키고, 수성상을 에틸 아세테이트(3 x 30 cm³)로 추출하였고, 이 추출 과정에서 형성된 에멀젼을 파괴하기 위해 염수의 첨가가 요구되었다. 이 합쳐진 유기 추출물을 염수(2 x 20 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물(4)을 황색 오일로서 얻었다(3.88 g, 104%). 이 생성물(약간의 에틸 아세테이트를 함유함)은 추가의 정제 작업 없이 반응시켰다.

옥사졸 실릴 에테르(4) =3.88 g=8.03 mmol(이론치 최대량)

TBAF=4.63 g=17.7 mmol=2.2 당량

THF=30 cm³

상기 시약들을 합치고, 질소 분위기하의 실온에서 16시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(50 cm³)에 부어넣고, 에틸 아세테이트(2 x 30 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염화암모늄 포화 수용액(2 x 20 cm³), 염수(2 x 20 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다(3.209 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리: 헥산(400 cm³) 중 20% 에틸 아세테이트, 이어서 헥산(500 cm³) 중 40% 에틸 아세테이트)로 정제하여, 순수한 알코올체(ST10)를 미황색 왁스상 고체로서얻었다(1.127 g, 실릴 에테르(2)로부터 2 단계에 대하여 40%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3386(s, O-H), 3059(w, C-H 방향족), 2930(s, C-H), 2857(s, C-H), 1594(w, C=C 방향족), 1551(m, C=C 방향족), 1485, 1447, 1377, 1346, 1279, 1090, 1070, 1026, 920, 775, 764, 706, 690; δ_H(CDCl₃, 300 MHz) 1.35-1.45(4H m), 1.54(2H pentet J 6.7), 1.66(2H pentet J 6.7), 3.61(4H hexet J 3.2), 4.63(2H s), 7.36-7.48(6H m), 7.79(2H d J 7.3), 8.10(2H dd J 5.3, 7.9); δc(CDCl₃, 75MHz, Pendant) 25.3(CH₂), 25.8(CH₂), 29.4(CH₂), 32.4(CH₂), 62.4(CH₂), 64.9(CH₂), 7.03(CH₂), 126.0(CH), 126.2(CH), 128.6(CH), 128.7(CH), 129.3(CH), 130.2(CH);^M/z(APCI) 352 M+H⁺(C₂₂H₂₅O₃N requires M⁺351), 234(100%).

알코올(ST10)=0.580 g1.65 mmol

부티릴 클로라이드=0.176 g1.65 mmol=1 당량

트리에틸아민=0.334 g3.30 mmol=2 당량

DCM=20 cm³

알코올(ST10)을 DCM 중에 용해시키고, 생성된 황색 용액을 질소 분위기하에 두었다. 이 교반된 용액에, 부티릴 클로라이드, 트리에틸아민의 순서로 첨가하고, 실온에서 16시간동안 계속해서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(20 cm³)에 부어넣고,에틸 아세테이트(3 x 20 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수(20 cm³)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 감압하에서 농축하여 미정제 에스테르체(ST8)를 황색 오일로서 얻었다(0.747 g, 107%). 활성탄 및 디에틸 에테르(30 cm³)를 이 생성물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 완만하게 가온하였다. 이 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 감압하에서 농축하여 순수한 에테르체(ST8)를 미황색 오일로서 얻었다(0.312 g, 45%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3059(w, C-H), 2934(s, C-H), 2859(s, C-H), 1732(s, C=O), 1549(m, C=C);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 0.92(3H t J 7.3), 1.35(4H br s), 1.61(6H m), 2.25(2H t J 7.5), 3.60(2H t J 6.5), 4.03(2H t J 6.7), 4.63(2H s), 7.30-7.60(6H m), 7.78(2H d J 7.2), 8.10(2H dd J 3, 8);^M/z(APCI) 422 M+H⁺(C₂₆H₃₁NO₄requires M⁺421), 234(100%).

ST9

알코올(1) =0.501 g=1.43 mmol

벤조일 클로라이드=0.17 cm³=0.201 g=1.43 mmol=1 당량

트리에틸아민=0.3 cm³=0.217 g=2.15 mmol=1.5 당량

DCM=10 cm³

알코올(1)을 DCM 중에 용해시키고, 질소 분위기하에 두었다. 벤조일 클로라이드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 트리에틸아민을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물(20 cm³)에 부어넣고, 디에틸 에테르(2 x 20 cm³)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다. 이 오일을 16시간동안 방치하였더니, 황색 고체가 생성되었다(0.599 g). 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(헥산(200 cm³) 중 20% 에틸 아세테이트)로 정제하여, 순수한 에스테르체(ST9)를 무색의 오일로서 얻었다(0.340 g, 52%). ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3059(w, C-H), 2934(m, C-H), 2858(m, C-H), 1716(s, C=O);^□H(CDCl₃, 300 MHz) 1.46(4H pentet J 3.5), 1.71(4H m), 3.62(2H t J 6.5), 4.28(2H t J 6.7), 4.64(2H s), 7.30-7.60(9H m), 7.80(2H m), 8.02(2H d J 7.3), 8.09(2H dd J 4.2, 7.7);^M/z(APCI) 456 M+H⁺(100%)(C₂₉H₂₉NO₄requires M⁺455), 234.

ST11

ST10=2.5 g=7.12 mmol=1 당량

피리디늄 클로로크로메이트/실리카 겔(1:1)=4.6 g=10.67 mmol=1.5 당량

디클로로메탄=30 cm³

PCC/실리카를 디클로로메탄(30 cm³) 중 ST10의 용액에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 이 반응 혼합물을 에테르로 희석하고, 셀라이트 및 실리카를 통해 여과한 후, 감압하에서 농축하여 옥사졸 알데히드를 미정제 황색 오일로서 얻었다(2.087 g, 84%). 이 생성물은 추가의 정제 작업 없이 직접 사용하였다.

실리카 컬럼(헥산 중 20% 에틸 아세테이트) 및 합친 분획(R_f=0.47)(헥산 중 40% 에틸 아세테이트)을 통한 용리에 의해 정제한 샘플을 미황색 오일로서 분리하였다. 이 오일에 대한 분광 분석 결과 다음의 데이타를 얻었다. ν_max/cm^-1(박막, NaCl 플레이트) 3059(m, C-H 방향족), 2933(s, C-H), 2860(s, C-H), 1722(s, C=O), 1594(w, C=C 방향족), 1551(m, C=C 방향족), 1486, 1447, 1377, 1346, 1319, 1279, 1214, 1177, 1133, 1091, 1069, 1025, 1011, 950, 921, 776, 765, 707, 691, 675,660; δ_H(CDCl₃, 300 MHz) 1.40-1.66(6H m), 2.31-2.41(2H m), 3.61(2H t J 6.15), 4.63(2H s), 7.35-7.49(6H m), 7.77(2H d J 7.44), 8.10(2H d J 3.75), 9.72(1H s);

알데히드(1)=1.580 g=4.527 mmol=1 당량

산화은(I)=1.574 g=6.791 mmol=1.5 당량

NaOH_(aq)(2M)=30 cm³

메탄올=30cm³

산화은(I)을 메탄올 중 알데히드(1)의 용액에 첨가한 후, NaOH_(aq)(2M)를 적가하였다. 이 반응 혼합물을 질소 분위기하에 두어 용액의 증발을 방지하였고, 실온에서 6시간동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 산성화시켰더니(20% HCl_(aq)) 황색 용액이 흐려졌다. 용액을 디에틸 에테르(3 x 50 cm³)로 추출하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축하여 황색 오일(대기중에 개방된 상태로 방치했을 때 고체화됨)을 얻었다. 황색 고체를 고온의 디에틸 에테르(50 cm³)로 연마하여 황색 용액과 백색 고체를 얻었다. 백색 고체를 여과에 의해 분리하고, 냉 디에틸 에테르(30 cm³)로 세척하였다. 여과액을 염기성화(2M NaOH_(aq))한 후, 수성상을 산성화(20% HCl_(aq))하고, 디에틸 에테르(2 x 30cm³)로 추출하였다. 목탄을 디에틸 에테르 추출물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 완만하게 가온한 다음, 셀라이트를 통해 여과하고, 감압하에서 농축하여 불투명한 오일(대기에 개방된 상태로 밤새 방치하였을 때 백색 고체로 고체화됨)을 얻었다. 이 2종의 고체는 동일하였으므로, 합쳐서 단일 순수 생성물을 얻었다(1.27 g, 77%). ν_max/cm^-1(KBr disc) 3060(w, C-H 방향족), 2930(s, C-H), 2856(s, C-H), 2581(br, O-H), 1716(s, C=0), 1596(w, C=C 방향족), 1546(m, C=C 방향족), 1488, 1450, 1420, 1350, 1326, 1307, 1217, 1183, 1090, 1014, 911, 780, 761, 707, 688; δ_H(CDCl₃, 300MHz) 1.41-1.49(2H m), 1.65(4H pp J 6.7, 7.5), 2.33(2H t J 7.3), 3.61(2H t J 6.5), 4.64(2H s), 7.34-7.51(6H m), 7.77(2H d J 7.5), 8.1(2H dd); δc(CDCl₃, 75MHz, Pendant) 24.5(CH₂), 25.7(CH₂), 29.3(CH₂), 33.9(CH₂), 65.1(CH₂), 70.2(CH₂), 126.2(CH), 126.5(CH), 128.4(CH), 128.6(CH), 128.8(CH), 128.8(CH), 잔여 4차 탄소 시그날은 너무 작아서 해상되지 않음;^M/z(APCI) 366 M+H⁺(C₂₂H₂₃O₄requires M⁺365), 234(100%).

Claims

친유성기 또는 양친매성기인 1개 이상의 R¹기에 공유 결합된 인광 물질인 1개 이상의 X기를 포함하고; 세포, 세포막, 생물학적 막, 인공 막 또는 전달 매개체 내로 통합될 수 있으며; 통합되었을 때 인광 물질로서 작용할 수 있는 섬광체(scintillator) 분자.
제1항에 있어서, 하기 화학식 (I) 또는 이의 염인 섬광체 분자:

(X)_m-(R¹)_n(I)

식중, m과 n은 각각 1 내지 20이다.
제2항에 있어서, 상기 m과 n이 각각 1 내지 4인 섬광체 분자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m과 n이 동일한 값을 가지는 것인 섬광체 분자.
제4항에 있어서, 상기 m과 n이 모두 1인 섬광체 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1개의 X기 및 2개 이상의 R¹기로 이루어진 것인 섬광체 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1개의 R¹기 및 2개 이상의 X기로 이루어진 것인 섬광체 분자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X 및 R¹기는 링커기에 의해 연결되어 있는 것인 섬광체 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R¹은 독립적으로 비(非)분지쇄 또는 분지쇄 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐, 알키닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 아미드, 아민, 알킬아릴, 알킬옥시아릴, 환원 아릴알킬, 환원 알콕시아릴, 알케닐아릴, 알케닐옥시아릴, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알케닐옥시헤테로아릴, 환원 알킬헤테로아릴, 환원 알콕시헤테로아릴, 또는 독립적으로 할로겐, 알킬, 알콕시, 아릴알킬, 아릴알콕시, 시아노, 니트로, -OC(O)R², -CO₂R², -NR³R⁴, -OR², -SR², -C(O)NR³R⁴, 또는 지질(천연 또는 합성)로부터 선택되는 1개 이상의 기에 의해 치환된 전술한 작용기들 중 어느 하나의 치환 유도체 중 1개 이상이고;

R²는 H, 알킬, 아릴, 또는 R¹에 대하여 정의된 기이며; 그리고

R³및 R⁴는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 또는 R¹에 대하여 정의된 기인 섬광체 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 독립적으로 벤조트리아졸, 쿠마린, 방향족 탄화수소, 옥사졸, 1,3,4-옥사디아졸 또는 이들의 유도체 중 1개 이상인 섬광체 분자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 독립적으로 p-테르페닐, p-쿼테르페닐, 2,4-(비페닐일-6-페닐벤즈옥사졸), 2,5-비스-(5'-tert-부틸벤즈옥사졸릴-[2']티오펜, 2-(4-t-부틸페닐)-5-(4-비페닐일)-1,3,4-옥사디아졸, 2-(1-나프틸)-5-페닐-옥사졸, 2-페닐-5-(4-비페닐일)-1,3,4-옥사디아졸, 1,4-비스[5-페닐-2-옥사졸릴]-벤젠, 2,5-디페닐옥사졸, 1,4-비스(5-페닐-2-옥사졸릴)벤젠, 9,10-디페닐안트라센, 1,6-디페닐-1,3,4-헥사트리엔, 트랜스-p,p'-디페닐스틸벤, 1,1,4,4-테트라페닐-1,3-부타디엔, 3-히드록시플라본, 1,4-비스(2-메틸스티릴)벤젠 또는 이들의 유도체 중 1개 이상인 섬광체 분자.
하기 ST1 내지 ST11 또는 이들의 염으로부터 선택되는 섬광체 분자.
제8항에 있어서, 상기 링커는 알콕시, 아미노알킬, 아릴옥시, 아릴아미노, 알킬아미노, 카르보닐, 아미딜, 에스테르, 아미닐 실릴, 이미딜, 우레아, 알킬티오 또는 아릴티오인 섬광체 분자.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자의 제조 공정으로서, 1개 이상의 X기를 1개 이상의 R¹기에 커플링시키는 공정.
제8항의 섬광체 분자의 제조 공정으로서, 링커 분자를 통해 1개 이상의 X기를 1개 이상의 R¹기에 커플링시키는 공정.
다음을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물의 제조 공정:

(i) 염기의 존재 하에서 할로알킬기로 2,5-디페닐옥사졸의 4-알코올 유도체를 알킬화시키는 것, 또는

(ii) 염기의 존재 하에서 알코올로 2,5-디페닐옥사졸의 4-할로겐 유도체를 알킬화시키는 것, 또는

(iii) 화학식 (I)의 화합물을, 예를 들어

보호기의 제거,

보호기의 첨가,

산화(예컨대, 알코올을 알데히드 또는 케톤으로 산화시키거나, 알데히드를 산기로 산화시킴),

산 또는 알코올의 에스테르화,

산 또는 아민의 아미드화,

환원(예컨대, 알켄을 알칸으로 환원시키거나, 알데히드를 알코올로 환원시킴),

특정 화합물의 염의 생산, 또는

다른 작용기의 상호전환(예컨대, 알코올의 브롬화)에 의해, 화학식 (I)의 다른 화합물로 전환시키는 것.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상을 포함하는 리포솜.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상을 포함하는 미셀.
다음을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상을 리포솜에 삽입하기 위한 방법:

유기 용매 중에서 지질 및 섬광체 분자(들)를 항온배양하는 단계,

유기 용매를 제거하는 단계,

지질 및 섬광체 분자(들)를 수용액 중에 재현탁시키는 단계.
제19항에 있어서, 상기 지질 섬광체 현탁액을 80℃ 내지 30℃의 온도로 가온하는 것인 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 지질 섬광체 현탁액을 60℃ 이상의 온도로 가온하는 것인 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및 섬광체 분자를 1:1 내지 10:1의 비율로 항온배양하는 것인 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및 섬광체 분자를 2:1 내지 8:1의 비율로 항온배양하는 것인 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및 섬광체 분자를약 4:1의 비율로 항온배양하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자를 포함하는 세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상을 세포에 삽입하는 방법으로서, 세포를 제17항의 리포솜 또는 제18항의 미셀과 함께 항온배양하는 것을 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 세포를 20℃ 내지 40℃에서 항온배양하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 세포를 37℃에서 항온배양하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상 및 지질 분자를 포함하는 키트.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상, 및 목적하는 단백질 또는 수용체를 함유하는 세포를 포함하는 분석 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자 1개 이상 및 방사선원을 포함하는 키트.
제32항에 있어서, 상기 방사선원은 방사능표지된 리간드인 키트.
분석에 있어서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 섬광체 분자의 용도.
제34항에 있어서, 상기 분석은 혼입 분석, 수송 분석, 수용체 결합 분석 또는 신호 전달 분석인 용도.
제17항 또는 제18항에 있어서, 목적하는 단백질 또는 수용체를 더 포함하는 리포솜 또는 미셀.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 섬광체 분자.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 공정.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 리포솜.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 미셀.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 방법.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 키트.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 세포.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 분석 시스템.
실시예 또는 도면에 도시된 바와 같거나, 또는 이들에 관하여 전술한 바와 실질적으로 같은 조성물.