KR20030064742A - 펩타이드성 약물의 경구용 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 의약품의 프로리포솜과 프로리포솜을 함유한 경구투여형 제제에 관한 것으로서, 상기 프로리포솜은 유기용매상에서 펩타이드 의약품과 인지질을 용해시키고, 전술한 용액을 수용성 키토산으로 코팅하여 제조하는 것이다.

본 발명에 의한 프로리포솜을 사용한 펩타이드성 약물의 경구 투여형 제제는 펩타이드성 약물의 안정성과 생체이용율을 현저히 증가시킨다.

Description

펩타이드성 약물의 경구용 제제{ORAL DELIVERY OF PEPTIDE}

펩타이드성 약물은 유전자 재조합기술 및 고체상 펩타이드 합성기술의 급속한 발전으로 인해 임상으로 이용될 수 있는 사용 가능 약물의 수가 90년대 들어 급격한 증가세로 확장되고 있으며 생명공학의 눈부신 발전이 이를 가속화시켜 현재 세계적으로 약 100 품목 이상이 개발되어 시판되고 있다.

그러나 현재 개발되어 시판되고 있는 펩타이드성 약물의 대부분의 제형은 주사제로서

1) 환자에게 투여시 환자에게 고통을 동반하고

2) 냉장보관 등의 보관상의 어려움이 있고

3) 환자에게 약물투여시 병원을 방문해야 하는 등의 주사제로서의 단점을 갖고 있어 펩타이드성 약물의 경구용 제제 개발은 절실히 요구되고 있는 실정이나 지금까지는 개발초기단계로서 미미한 상태이다.

그러나 펩타이드성 약물의 주사제로서의 상기한 어려움들을 경구형 제형으로 극복했을 때

1) 환자에게 투약이 가장 적합한 형태로 제형화될 수 있고,

2) 제제의 안정성이 증가되어 유통 및 유효기간설정 등 생산, 판매와 소비가 기존의 제형보다 편리하고 유리하게 변화될 것이며,

3) 환자가 선호하는 경구용 투여제제의 시장은 기존 약물제형시장을 빠르게 대체할 것으로 예상되기 때문에 경구형 제제개발에 대한 기술적인 연구가 활발히 진행되고 있다

일반적으로 펩타이드성 약물의 경구형 제제개발에 대한 기술적 어려움들은 저명한 논문에서 지적되어 왔다.( Raymond M. Reilly, Rommel Domingo and Jasbir Sandhu. Drug Delivery Systems , 32 , 4 , 313 - 323 , 1997 : Jeoseph A. Fix. Pharmaceutical Research. vol. 13. no. 12. 1996 : Amyn P. Sayani and Yie W. Chien. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 13, 1&2, 85 - 184, 1996 : Jane P. F. Bai, Li-Ling Chang and Jian-Hwa Guo, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 12, 4, 339 - 371, 1995 )

이같은 펩타이드성 약물의 경구형 제제개발에 있어 해결되어야 할 과제로서는

1) 장관내에서의 낮은 흡수율,

2) 소장내 단백분해효소에 의한 효능소실,

3) 흡수후 체내에서의 높은 반감기에 의한 효력유지어려움 등이 주요 해결되어야 할 문제들로 연구의 초점이 되고 있다.

이런 문제들을 해결하는 방법중 먼저 장관내에서의 낮은 흡수율을 해결하는방법으로서는

1) 생체막 통과를 증가시키기 위하여 극세 미립자(nano or microsphere particle) 속에 약물을 봉입하거나( Istvan Toth, International Journal of Pharmaceutical, 183, 1999, 51 - 55 : E . Bjork , U. lsaksson , P. Edman. J. Drug Targeting 2 , 501 - 507 , 1995 : Shinji Sakuma . Norio Suzuki. International Journal of Pharmaceutical. 149 . 1997 . 93 - 106 ),

2) 흡수촉진제를 함께 사용하는 방법( Patrick J. Shinko, Yong - Hee Lee, Pharmaceutical Research, vol, 16, No 4, 1999, 527 - 533 : J. C. Scott - Moncrieff, Z. Shao, J. Pharm. Sci. 83, 1465 - 1469, 1994 : E.A . Hosny , N. M Khan Drug Devel. Ind. Pharm. 21, 1583 - 1589, 1995 : Isao Sasaki, Hideyuki Tozaki, Biol. Pharm. Bull. 22, 6, 611 - 615, 1999 : Anthomy C. Chao, Joseph Vu Nguyen, International Journal of Pharmaceutical , 191, 1999, 15 - 24 ),

3) 펩타이드 구조를 수식하는 방법(Deven Shah, Wei Chiang, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 85, No 12, 1996, 1306-1309 : Kazunori Iwanaga, Satoshi Ono, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 88, No 2, 1999, 248 - 252 : Istvan , John P. Malkinson, J. Med. Chem. 1999, 42, 4010 - 4013 )

4) 약물의 구조를 변경시키거나 효소저해제를 함께 사용하는 방법( P. Buhlnayer, A. Caseli. W. Fuhrer. J. Med. Chem. 31, 1839, 1998 : A. Yamamato. T. Taniguchi, K. Rikyu, T. Tsuji, Pharm. Res. 11, 1496 - 1500, 1994 )

5) 흡수후 체내 안정성을 증가시키기 위해 미립자내 봉입, 약물의 수식 등(David F. Ranney, Biochemical Pharmacology, vol. 59, 105 - 114, 2000 : Ian M. Chapman, Ora H. Pescovitz, Gail Murphy, Journal of clinical Endocrinology & Metabolism. 1997. vol 82, No 10, 3455 - 3463 )이 주로 사용되어 왔고 이밖에도 펩타이드성 약물에 대한 제제 개발연구는 여러가지 방법을 통해 활발히 진행되고 있다.( Z. Aydin, J. Akbuga. International Journal of Pharmaceutics 131. 101 - 103, 1996 : K. Aledeh, E. Gianasi, I. Orienti and V. Zecchi. J. Microcapsulation, 1977, vol. 14, no. 5, 567 - 576 : A. Pork. B. Amsden. K. de yao Journal of Pharmaceutical Science vol. 83. No. 2, 1994. 178 - 185 ).

한편 이들 펩타이드성 약물의 경구형 제제개발의 한 방법으로 리포솜을 이용한 방법은

1) 비교적 극세 미립자(nano or microsphere particle) 속에 약물을 쉽게 봉입할 수 있는 장점과

2) 리포솜이 장점막에서 용이하게 흡수될 수 있다는 장점으로 근래 들어 많은 연구가 진행되어 왔고 이들에 대한 선행기술로는 리포텍 에스 에이( Lipotec, S.A.)사가 특허로 공개한 기술 등이 있다 ( EP - 0855179 A2 ).

그러나 이 방법은 리포솜의 제조시에

1) 물을 사용하고 있기 때문에 약물의 안정성에 문제가 있고,

2) 분말형태로 제조하기 위하여 동결건조나 건조과정을 거치는 공정을 사용하는 등의 문제점이 있고

3) 리포솜 자체의 응집성 (aggregation) 이나, 침강 (sedimentation),융합(fusion), 산화 (oxidation), 인지질의 가수분해( phospholipid hydrolysis) 등의 리포솜 자체 물성으로 인해 수용액에서의 안정성이 낮고

4) 생산과정에서 재현성 및 멸균 등의 어려움이 있어 의약품으로 사용하기에 단점들을 가지고 있었다.

본 발명은 펩타이드 및 프로테인 의약품 (이하 “펩타이드성 약물”이라 한다.)의 경구투여형 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다 .

도 1은 연어칼시토닌의 수용성 키토산과의 프로리포솜의 형성모양과 약물의 내부 봉입을 나타내는 사진이며,

도 2는 수용성 키토산을 이용한 프로리포솜의 수화과정을 현미경으로 관찰하여 수분에 용해되는 과정을 나타낸 사진으로, 도 2a는 프로리포솜 분말을 나타낸 사진이며, 도면 2b는 프로리포솜에서 리포솜이 생성된 것을 나타낸 사진이다.

도 3은 프로리포솜의 수화로 형성된 리포솜의 입자크기 및 분포를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 일실시예로서 연어칼시토닌(salmon calcitonin)의 프로리포솜 중의 연어칼시토닌의 경시 함량변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 일실시예로서 연어칼시토닌 함유 프로리포솜을 함유하는 여러 제형의 약물투과율을 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 이와 같은 종래기술의 문제점을 극복하기 위해 펩타이드성 약물의 화학적 수식보다는 물리적 수식을 중심으로 제제학적인 연구검토를 오랫동안 실행한 결과 본 발명을 완성했다.

본 발명은 이들 선행기술에 대한 문제점을 개선시킨 방법으로

1)수용성 키토산을 사용하여 리포솜(liposome)의 전구체인 프로리포솜(proliposome)을 제조해 장점막에서의 흡수를 증대시켰고,

2) 장내수용액 상태에서 펩타이드성 약물의 안정성을 증가시키기 위해 pH조절제를 사용하고,

3) 장점막에서 쉽게 펩타이드성 약물이 원활히 흡수되도록 흡수촉진제 등의 첨가물을 혼합한 후,

4) 이를 경구투여에 적당한 제형으로 제형화함과 동시에,

5) 제형을 장용성 코팅화해 위산에서 펩타이드성 약물이 파괴되지 않고 장내까지 용이하게 이동해 흡수될 수 있도록 제조하는 방법이다.

즉 본 발명은 리포솜을 이용한 기존의 경구제제 제조방법인 EP - 0855179 등에서 나타나는 문제점인 리포솜을 분말형태로 제조하기 위한 동결건조나 증발과 같은 과정을 거치지 않고 리포솜의 전단계인 프로리포솜을 단시간내에 고수율로 제조할 수 있어 생산과정이 단순하고, 펩타이드성 약물의 단점인 수분과 온도에 대한 안정성을 증가시키고 프로리포솜을 제조하는 담체로써 키토산을 사용함으로 생체이용률을 증가시킬 수 있는 등의 장점을 갖고 있다.

본 발명의 구체적인 내용은,

1) 수용성 키토산의 수용해성 성질을 이용해 유기용매를 이용 분말형태로 수용성 키토산에 코팅된 펩타이드성 약물을 분말형태로 제조하고,

2) 위산으로부터 펩타이드성 약물을 보호하기 위해 장용성 코팅을 한 후,

3) 장내에 제형이 도달했을 때 물에 녹는 수용성 키토산의 물리적 성질을 통해 분말형태의 프로리포솜이 장내에서 리포솜을 형성함으로써 경구투여시 장점막에서 원활히 흡수될 수 있도록 함과 동시에 유리 양전하를 갖는 키토산의 장점막 부착성의 성격과,

4) 대부분의 펩타이드성 약물이 수용액 상태에서 불안정해 경구투여후 장내에서 쉽게 분해되는 것을 방지하기 위해 펩타이드성 약물의 대부분이 pH 3-4에서 안정함에 착안해 장내에서의 안정성을 증가시키기 위해 pH조절제를 사용하고,

5) 장점막에서 펩타이드성 약물이 쉽게 세포와 세포 사이의 파라트랜스 패턴(paratrans patten)으로 흡수되도록 흡수촉진제 등의 첨가물을 혼합 배합함으로써 장점막에서 펩타이드성 약물이 용이하게 흡수될 수 있도록 하는 것이다.

다음에 본 발명의 내용을 상세히 설명한다.

키토산은 천연고분자 물질로 게, 새우 등의 갑각류의 껍질이나 곤충의 표피, 버섯, 균류의 세포벽 등에 널리 분포되어 있는 함유 생물체의 지지와 방호 역할을 하는 다당류 키친으로부터 만들어지는 물질이다.

즉 키친은 셀룰로즈와 유사한 구조를 가진 겹사슬이 없는 매우 긴 사슬구조의 고분자 물질로 2번탄소에 수산기 (- OH ) 대신에 아세틸아미노기 ( - NHCOCH₃)가 치환되어 있고 키토산은 키친에서 2번탄소 아미노기에 연결된 아세틸기를 탈아세틸화하여 얻어지는 물질로 많은 유리 양이온을 지닐 수 있기 때문에 여러 가지 생리활성을 가지고 있다.

이런 이유로 고품질의 키토산이 개발되어 식품, 화장품, 의약품 및 흡착제, 식물세포의 활성제, 페수처리응집제 등 여러 분야에서 다양하게 이용되고 있다.

특히 근래에 와서는 키토산의 지방결합능력이 식물성 섬유소보다 훨씬 효과가 뛰어나며 질병에 대한 면역성 및 저항성을 향상시켜 줄뿐 만 아니라 생체내에서 독성이 없어 무해한 것으로 나타나고 있다.

그러나 그동안 여러분야에 사용하던 키토산은 물이나 알콜에는 용해되지 않고 포름산, 젖산, 초산 등의 유기산수용액, 묽은염산과 같은 무기산에만 용해되어 의약품 제제에 사용하기에는 한정된 응용성을 가지고 있었다.

이에 본 발명에서는 물에 녹는 키토산( JK FM - 01 : 주식회사 자광 )을 이용해 펩타이드성 약물의 경구 투여제제에 대해 연구한 결과 본 발명을 완성했으며, 본 발명에서 사용한 수용성 키토산은

1) 탈아세틸화도가 85% - 99 %

2) 물에서의 용해도가 99.99% 이상

3) 분자량은 100,000 - 500,000 등으로 의약품에서 부형제로서 사용이 가능한

4) 식품첨가물 규격 적합 이라는 특징을 갖고 있다.

즉 본 발명에서 사용한 키토산은 물에 99.99% 이상이 녹는 것을 그 주요 특징으로 나타내고 있는 바 기존의 키토산에 비해 물에 대한 용해도가 높은 이유는

1) 키토산 제조방법인 키틴에 알카리수용액을 처리한 후 아세틸아미노(Acetylamino)기를 가수분해해 아미노(amino)기로 만드는 방법인 탈아세틸화 과정 후에 다단계 분리막 공정을 이용해 수용성이면서 탈아세틸화도를 85 % - 99 %로 증가시켰고,

2) 다단계 분리막 공정을 통해 키토산의 순도를 90% 이상으로 제조했고,

3) 키토산의 2번탄소의 탈아세틸화 과정에서 아미노기를 활성화 시켰기 때문에 물분자와 접촉시 키토산의 특징을 갖고 있으면서 물에 쉽게 녹는다.

또 이와 더불어 본 발명의 특징은 현재까지 의약품이나 화장품 등의 분야에서 사용되어온 리포솜의 문제점을 해결함과 동시에 키토산의 장점을 그대로 지니고 수용액에서 녹는 수용성 키토산의 장점을 이용해 펩타이드성 약물의 경구투여 제제를 제조하는 것이다.

즉 리포솜은 단층 또는 다층의 인지질 이중막 패쇄소포 (vesicle)로 1965년 방감 등(Bangham et al, Diffusion of Univalent Ions across the Lamellae of Swollen Phospholipids, J. Mol. Biol., 13, 238 - 252. 1965) 에 의해 알려진 이후로 제조하는 제조방법에 따라 리포솜 자체의

1) 표면전하(surface charge),

2) 크기(size),

3) 지질함유량 (lipid content) 등의 변형이 가능해 사용하려는 목적과 용도에 맞게 지난 수십년간 여러 가지 제조방법에 의해 생산되었고 이를 식품 및 화장품 의약 등에서 이용해 왔다.

특히 최근 들어 의약품에 있어서는

1) 약물의 지속화 또는 약물의 표적화

2) 급성독성 완화 및 면역반응의 완화 또는 증강

3) 약물의 안정화

4) 투여제형의 변경 등의 목적으로 의약품의 여러 제형개발에 이용되고 있다.

그러나 그동안 현재까지 의약품 제형개발에 이용되어온 리포솜은

1) 리포솜의 응집성이나,

2) 침강,

3) 융합,

4) 산화,

5) 인지질의 가수분해 등의 리포솜 자체 물성으로 인해 수용액에서의 안정성이 낮고,

6) 대량생산과정에서 멸균 및 재현성 효율이 낮아 의약품에서 효율적으로 사용하기에 불충분한 단점을 가지고 있었다.

이런 이유로, 본 발명자들은 이러한 종래의 리포솜 제제의 문제점을 해결하기 위하여 오랫동안 연구를 한 결과, 수용성 키토산을 담체로 한 리포솜의 전단계인 고체분말 형태인 프로리포솜을 제조하면, 종래의 리포솜 제제의 문제점이 모두 해결되는 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 수용성 키토산을 사용하여 제조한 펩타이드성 약물의 프로리포솜을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 펩타이드성 약물을 수용성 키토산을 사용하여 제조한 프로리포솜을 통상의 약제학적인 방법으로 통상의 방법으로 제제화한 경구용 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드성 약물을 수용성 키토산을 사용하여 제조한 프로리포솜을 통상의 약제학적인 방법으로 통상의 방법으로 제제화한 경구용 제제를 제조하는 제조방법을 제공하는 것이다.

일반적으로 프로리포솜을 제조하기 위한 담체의 특성은

1) 물에 넣으면 녹아서 프로리포솜이 리포솜으로 변형되어야 하므로 수용성이어야 하며

2) 제조과정상 사용되는 유기용매에 대한 용해도가 낮아야 하는 등의 특징을 지녀야하는데

본 발명에서 사용하는 수용성키토산은 이런 프로리포솜의 담체적 성질을지니고 있을 뿐만 아니라 장내에서 수분에 의해 용해되었을 경우 키토산 자체가 지닌 유리양이온의 지방결합능력으로 인한 증점효과로 펩타이드성 약물의 경구투여시 약물의 생체 흡수율을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 펩타이드성 약물로서는 아프로티닌(aprotinin), 부세렐린(buserelin), 칼시토닌(calcitonin), 데스모프레신(desmopressin), 엘카토닌(elcatonin),글루카곤(glucagon),고나도트로핀(gonadotropin), 고나도렐린(gonadorelin),고세렐린(goserelin),히루딘(hirudin),류프로렐린(leuprorelin), 리프레신(lypressin), 나파렐린(nafarelin), 옥트레오타이드(Octreotide), 옥시토신(oxytocin),프로티렐린(protirelin),살카토닌(salcatonin),세르모렐린(sermorelin),소마토스타틴(somatostatin),소마트로핀(somatropin),테릴프레신(terlipressin),테트라코사크린(tetracosacrin),타이모펜틴(thymopentin),트립토렐린(triptorelin),바소프레신(vasopressin),알부민(albumin),인슐린(insulin),인터페론(interferon),이뮤노글로부린(immunoglobulin),GM-CSF,G-CSF,글라이코프로테인(glycoprotein) 등을 예로 들 수 있다. 이외에 펩타이드나 단백질 약물도 물론 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 펩타이드성 약물 함유 프로리포솜 제조에 사용되는 인지질로서는, 리포솜 제조에 사용되는 약학적으로 허용되는 통상의 인지질을 포함하며, 예를 들면, 포스파티딜-디엘-글리세롤-디미리스토일(Phosphatidyl - DL - Glycerol - Dimyristoyl), 엘-알파 에그 포스파티딜 콜린(L-α Egg phosphatidyl choline), 소이빈 포스파티딜 콜린(레시틴)(Soybean phosphatidyl choline (lecithin)), 디팔미토일 포스파티딜 콜린(Diphalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC)), 디미리스토일 포스파티딜 콜린(Dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC)), 콜레스테롤(Cholesterol),스테아릴아민(Stearylamine),디아세틸포스페이트(Diacetylphosphate), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine), 메톡시 폴리에틸렌글리콜 디스테아로일 포스파티딜-에타놀아민(Methoxy polyethylene glycol distearoyl phosphatidyl - ethanolamine) 등을 사용할 수 있다.

또 다른 본 발명의 특징은 일반적으로 아미노산으로 구성된 펩타이드성 약물은 구조 성분중에 아스파라긴(asparagine) 이나 글루타민(glutamine) 잔기 등이 포함되어 있고 이들 잔기는 수용액 상태에서 탈아미도화(deamidation) , 베타-일리미네이션(beta-elimination), 디설파이드 교환(disulfide exchange), 라세미화(racemization), 산화 등의 반응을 일으키고 이로 인해 쉽게 구조적 변성을 나타내며 궁극적으로는 펩타이드 약물의 활성을 잃게 되는데 이점을 방지하기 위한 방법으로 본 발명에 따른 경구투여 제제가 장내에서 용해시 쉽게 아스파라긴이나 글루타민이 화학적 반응을 일으키지 않는 pH 3 - 4의 범위로 pH조절제를 사용해 조절함으로써 장내에서의 펩티이드성 약물을 안정하게 유지시켰다.

본 발명에서 사용한 pH조절제는 일반적으로 의약품에서 경구용으로 사용이가능한 것은 모두 사용이 가능한데 대표적으로 구연산, 구연산나트륨, 아디핀산, 인산일수소나트륨 등이 있고 사용량은 전체량대비 1.0 % - 50 %가 바람직하다

또 다른 본 발명의 특징은 장관흡수시 장관 상피세포를 손상시키지 않는 천연물 또는 식품에서 유래된 흡수촉진제를 사용해 펩타이드성 약물의 경구 투여시 소장에서 약물의 흡수를 촉진시키는 것이다. 본 발명에서 사용이 가능한 흡수촉진제는 지방산(fatty acid) 혹은 그 염으로써 카프린산(capric acid), 올레인산(oleic acid) 등이고 담즙산(bile acid) 계통의 염인 콜레이트(cholate), 데옥시콜린산(deoxycholic acid)과 살리실레이트(salicylate) 계통인 살리실레이트(salicylate) 등이나 모로글리세라이드(monoglyceride) 계통의 흡수촉진제 등이 사용이 가능한데 본 발명에서 실시예로 주로 사용된 흡수촉진제는 담즙산 계통의 염인 데옥시콜린산 염을 사용하는 것이 바람직하며, 사용량은 0.1% - 10%을 사용하는 것이 바람직하다.

다음에 본 발명을 실시예 및 실험예로 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 본 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

프로리포솜의 제조 ( 연어칼시토닌의 제조예 )

체로 친 수용성 키토산 분말( 106㎛ - 300㎛ ) 4g을 100㎖ 환저플라스크(round bottemed flask)에 넣고 회전 증발농축기에 장치한 후 상온에서 30분간 감압 건조시켰다. 인지질로는 에그 레시틴(egg lecithin) 267㎎을 클로로포름 30㎖에 녹인후, 미리 에탄올 10㎖에 녹인 연어 칼시토닌 27㎎의 용액과 혼합한다.

수용성 키토산이 들어있는 100㎖ 환저플라스크내의 온도를 20 - 30℃로 유지시켜주면서, 리포솜 구성성분을 녹인 유기용매 혼합액의 일정량 ( 약 1 ㎖ )을 넣고 회전 증발농축기의 회전수를 120 - 150 rpm으로 유지하면서 수용성 키토산이 완전히 건조되어 자유 유동(free-flow)상태가 되면 다시 유기용매 혼합액을 가하여반복하여 코팅하였다. 마지막 용액을 가하고 건조시킨 후 유기용매 제거를 위해 냉동건조기에서 24시간 재건조한다 ( Yield : 95 % 이상 ).

실시예 2

프로리포솜의 제조 ( 데스모프레신의 제조예 )

체로 친 수용성 키토산 분말(106㎛ - 300㎛) 3g을 100㎖ 환저플라스크에 넣고 회전 증발농축기에 장치한 후 상온에서 30분간 감압 건조시켰다. 인지질로는 포스파티딜-DL-글리세롤-디미리스토일 160㎎을 클로로포름 24㎖에 녹인후 미리 에탄올 12 ㎖에 녹인 데스모프레신 20㎎의 용액과 혼합한다.

수용성 키토산이 들어있는 100㎖ 환저플라스크내의 온도를 20 - 30℃로 유지시켜주면서 리포솜 구성성분을 녹인 유기용매 혼합액의 일정량 (약 1㎖ )을 넣고 회전 증발농축기의 회전수를 120 - 150 rpm으로 유지하면서 수용성키토산이 완전히 건조되어 자유유동 상태가 되면 다시 유기용매 혼합액을 가하여 반복하여 코팅하였다.

마지막 용액을 가하고 건조시킨 후 유기용매 제거를 위해 냉동건조기에서 24시간 재건조한다 ( Yield : 96 % 이상 )

실시예 3 - 33

아프로티닌, 부세렐린, 엘카토닌, 글루카곤, 고나도트로핀, 고나도렐린, 고세렐린, 히루딘, 류프로렐린, 리프레신, 나파렐린, 옥트레오타이드, 옥시토신, 프로티렐린, 살카토닌, 세르모렐린, 소마토스타틴, 소마트로핀, 테릴프레신, 테트라코사크린, 타이모펜틴, 트립토렐린, 바소프레신, 알부민, 인슐린, 인터페론, 이뮤노글로부린, GM-CSF, G-CSF, 글라이코프로테인의 약물을 각각 사용하고 실시예 1 또는 2와 유사한 방법으로 각각의 펩타이드성 약물 함유 프로리포솜을 제조하였다.

실험예 1

프로리포솜의 약물 봉입확인(Cryo -SEM 확인)

연어칼시토닌을 함유하고 있는 프로리포솜의 약물봉입확인을 위해 초저온전자현미경을 이용해 약물을 넣지 않은 프로리포솜과 약물을 넣은 프로리포솜을 비교 관찰함으로써 프로리포솜에 약물이 봉입된 것을 확인할수 있었으며 시료의 전처리는 먼저 액상시료(프로리포솜을 수화시킨 리포솜)를 직경이 1㎝의 원반시료대 위에 한방울 ( 약 3㎕ ) 떨어뜨리고 크라이오-트랜스퍼 시스템(Cryo-transfer system : CT 1500 Cryotrans, Oxford Instrument Ltd., UK)의 나이트로젼 슬러슁 체임버(nitrogen slushing chamber)에 액체질소를 채워 넣고 여기에 시료를 급속히 넣은 후 진공상태에서 1분간 고정한다.

다음 이 시료를 -170℃로 조절된 크라이오 체임버(cryo-chamber)에 옮기고 진공상태를 확인한 후 냉각된 시료를 임의 파쇄, 절단시키고 이 파쇄된 시료를 크라이오-트랜스퍼 시스템과 연결된 주사전자현미경 ( JSM-5410LV, JEOL LTD., Japan )의 시료대에 이동시켜 온도를 -70℃로 조절하여 5분간 유지시켜 표면의 수분을 승화시킨다.

승화과정이 끝난 후 연속하여 크라이오 체임버로 다시 이동시켜 금으로 피막을 입힌 뒤 ( gold-coating ), 20 kV의 가속전압 상태에서 주사전자 현미경(SEM)으로 시료의 파쇄, 절단된 면을 관찰하여 리포솜의 형성모양과 약물의 내부 봉입을 확인했으며 그 사진을 도 1에 나타냈다

실험예 2

프로리포솜의 용해관찰:

수용성 키토산을 이용한 프로리포솜의 수화과정을 광학현미경으로 관찰하기 위하여 프로리포솜 과립을 현미경 슬라이드 위에 놓고 초점을 맞춘 후 400배의 배율로 하여 한방울의 물을 과립 위에 떨어뜨려서 수화 과정을 1분후에 관찰하여 프로리포솜이 수분에서 용해되는 과정을 확인할 수 있었으며 이 사진을 도 2에 나타냈다.

실험예 3

제조 리포솜의 입자크기 분석:

실시예 1에서 제조한 수용성 키토산 프로리포솜 5㎎에 증류수 5㎖을 넣어주고 볼텍싱 하면서 흔들어 녹인 다음 30분동안 수화시켰다. 이렇게 형성된 리포솜의 입자크기 및 분포를 입자도분석기(particle size analyzer)을 사용해 측정했다. 그 결과는 도 3의 그래프로 나타내었다.

실험예 4

프로리포솜중의 연어칼시토닌의 정량 및 안정성:

안정성 확인 및 정량을 위해 연어칼시토닌 약 5㎍에 해당하는 양의 제조된 프로리포솜을 정밀히 취하여 메탄올 300㎕에 넣어 녹인 후 볼텍싱 하여 완전히 녹인다. 0.45㎛로 여과한 후 40㎕를 HPLC에 주입하여 프로리포솜중의 연어칼시토닌을 정량했고 상온 및 냉장에서의 안정성에 대한 결과는 도 4에 나타냈으며, 약물의 함량분석에 이용된 HPLC의 조건은 다음과 같다.

HPLC조건 : 칼럼 - C18 ( sucelpo사 )

유속 - 1 ㎖/분

용매(solvent) A - 아세토니트릴 ( 0.1 % TFA )

용매 B - 물 ( 0.1 % TFA )

실험예 5

경구투여용 제형제조 ( 정제의 예 ) 및 장용코팅:

정제는 일반적인 약전 제제총칙부분의 정제 제조방법에 따라 습식법이 아닌 건식방법을 이용해 직타방법으로 제조했으며 발명의 효과를 검증하기위해 제조한 각 시료의 처방은 표 1과 같고 직타방법으로 제조한 각 시료의 장용코팅(Enteric coating)은 CAP를 사용해 코팅했으며 코팅 결과에 대해 약전 일반시험법을 이용해 1액과 2액에서의 붕해시험을 실시해 확인했다. 이 결과는 표 2에 나타냈다

구분	제형1	제형2	제형3	제형4	제형5
1액	안 녹음	안 녹음	안 녹음	안 녹음	안 녹음
2액	녹음	녹음	녹음	녹음	녹음

발명의 효과를 검증하기 위해 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 실험을 함께 실행했다.

실험예 6

세포를 이용한 시험관내 실험:

(1) 완전배지(Complete Media) 제조

멸균해 식힌 증류수 2리터에 상온에서 DMEM ( dulbecco's mocifued eagle medium ) 1리터용 2개, 소디움 비카보네이트 7.4 g , HEPES 2.6 g을 넣고 플레이트스터러(plate stirrer)에서 약 1시간 - 1시간 30분동안 교반시킨다.

교반후 pH-메타를 이용해 1N 염산으로 pH 7.4로 맞추고 이 용액을 필터 ( corning filter 430015 )를 사용해 여과한 후 50ml 피펫을 사용해 450ml 씩500ml 병에 분주한다.

450ml씩 분주한 500ml 병에 FBS 50ml, 스트렙토마이신(streptomycin) 5ml, NEAA 5ml을 넣고 제조된 완전배지의 오염 여부를 확인하기 위해 25ml T-플라스크에 완전배지 6ml 정도를 넣고 현미경으로 관찰한 후 인큐베이터에서 1일 이상 배양후 오염여부를 확인한다.

(2) CaCo₂세포(cell)의 디프로스팅(defrosting)

제조해 냉장고에 보관했던 완전배지를 37℃ 수욕(water bath)에서 20분 정도 가온한 후 5ml 피펫을 사용해 내용물을 4 - 5회 섞어준 다음 15ml 코니칼 튜브(conical tube)에 5ml을 넣고 질소탱크(Nitro tank)에서 셀라인(cell line) ( ATCC HTB-37, LOT 944495 )을 꺼낸 후 병 뚜껑을 약간 연 후 37℃ 수욕에서 녹인 다음 완전히 녹은 것을 확인 후 셀라인 보관 병의 뚜껑을 열고 5ml 피펫으로 5 - 6회 섞어준 다음 전량을 15ml 코니칼 튜브에 넣는다.

15ml 코니칼 튜브를 원심분리기를 이용해 1000rpm에서 7분간 원심분리 후 상층액을 취해 버리고 배지(media) 1ml을 넣고 4 - 5회 피펫으로 혼합해 셀(cell)을 풀어준 후 15ml 코니칼 튜브의 용액 전량을 25ml T-플라스크에 넣고 이 25 ml T-플라스크를 인큐베이터에 보관한다.

(3) 영양 배지 교환(Feeding cell media change)

인큐베이터에 보관하던 25ml T-플라스크를 꺼내 플라스크 바닦 부분에 있던 배지를 제거하고 이미 제조해 냉장고에 보관했던 완전배지를 37℃ 수욕에서 20분 정도 가온한 후 5 ml을 취해 25 ml T-플라스크의 바닦에 피펫이 닿지 않도록 주의하면서 배지를 교체해 준다

(4) 계대배양(Subculture)

냉장고에 보관했던 트립신 EDTA 용기 및 프리미디아(free media), 완전배지를 37℃ 수욕에서 20분 정도 가온한 후 인큐베이터에 있던 25 ml T-플라스크의 배지를 제거하고 트립신 EDTA을 25 ml T-플라스크에 2ml 넣는다.

트립신 EDTA가 고루 퍼지게 한 후 37℃ 수욕에서 4분간 보관 후 25 ml T-플라스크에 완전배지 10ml을 넣고 플라스크를 흔들어 주면서 셀을 분리시키고 분리된 용액을 피펫을 사용해 15ml 코니칼 튜브에 옮기고 1000rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 완전배지 2ml을 취해 T-플라스크에 넣고 셀이 잘 풀어지도록 한 후 인큐베이터에서 다시 재배양시킨다 ( 본 실험에서는 40 passage 이상된 셀을 사용했음 ).

(5) 콜라겐으로 트랜스웰(Transwell) 막의 코팅

10ml의 멸균된 0.1% 초산을 25mg의 랫트테일 콜라겐(rat tail collagen)에가한 다음 막대자석를 넣고 3 - 5시간 교반하여 녹인 후 이용액을 60 % 에탄올 용액을 사용해 1 : 1.5로 희석하여 최종농도가 0.3mg/ml이 되도록한 후 트랜스웰 ( Costar 3401 )의 윗부분 막에 50㎕의 콜라겐 용액을 고루 퍼지도록 넣은 다음 뚜껑을 열고 라미나 플로우(laminar flow)에서 UV 광원을 켜고 4 - 5시간 방치하면서 건조시킨다.

(6) 트랜스웰 플레이트 상에 셀 접종(Seeding cells onto Transwell plate)

코팅한 트랜스웰의 윗부분에는 완전배지를 0.5ml 또 아랫부분에는 1.5ml을 넣고 15분동안 인큐베이터에서 배양한 후 배지를 제거하고 다시 코팅한 트랜스웰의 아래부분에 1.5ml의 완전배지를 다시 넣은 다음 계대배양(subculture)으로 40패시지(passage) 이상된 셀을 2.5 - 3 x 10⁵cells/ml 의 농도가 되도록 희석한 후 코팅한 트랜스웰의 윗부분에 1.5ml 넣고 셀투과 실험에 이용할 수 있게 2주 - 3주동안 배양한다.

(7) CaCo₂세포 단층막(cell monolayer)의 물성확인

트랜스웰에 접종후 2 - 3주일이 경과한 후 세포단층막 전기저항 측정 ( Measurement of Transepithelial Eledtrical Resistance : TEE )을 밀리셀-ERS 저항시스템(Millicell - ERS Resistance System)을 이용해 측정했을 때 250Ω㎠ 이상으로 셀의 단층막이 잘 형성된 것을 확인했고 C¹⁴-만니톨을 이용해 투과성 실험을했을 때 ( < receiver dpm> / <donor dpm> ) / hr/ ㎠의 값이 0.4 % 이하이므로 단층막이 잘 형성되었음을 알 수 있었고 실험의 구체적인 내용은 다음과 같다.

사용한 약물농도 : specific activity 50 mCi/mmol의 C¹⁴-Mannitol 2-10μM

C¹⁴-만니톨의 정량 : 100 ㎕씩 시료채취하여 LSC 바이알에 넣고 LSC cocktail 2ml을 가한 후 10초간 볼텍싱 하여 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintilation counter (LSC))로 dpm을 측정하였다.

(8) 약물 투과실험 ( 살카토닌의 예 )

검증이 완료된 트랜스웰의 윗부분 배지를 피펫을 사용해 제거하고 앞의 실시예 1에서 제조한 프로리포솜을 약물농도 ( 4.0 ㎍/ ml )의 농도로 트랜스바퍼에 녹여 농도를 맞춘 후 트랜스웰의 윗부분에 넣고 37℃의 진탕수욕(shaking water bath)을 이용하여 85rpm으로 천천히 흔들어 주면서 약물투여후 15분 간격으로 트랜스웰을 플랫쉬바퍼(flashbuffer)가 들어있는 새 웰로 옮겨준다.

트랜스웰의 도너(donor)부분의 웰에서 약물을 샘플링한 후 ELISA 와 RIA Kit (Pen. Lab)을 사용해 살카토닌을 정량했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

실험예 7

랫트(Rat)를 이용한 생체내(in vivo) 실험

250g - 300g 의 SD 랫트 숫컷 ( 개체수는 1군당 5마리 )을 실험시작 1일 전부터 음수만을 먹이고 실험환경에 적응시킨 후 카뉼라(cannula)를 대퇴정맥과 동맥에 삽입시키기 위해 마취제 케타민 : 럼푼을 1 : 4 의 비율로 혼합해 400㎕로 근육주사한 후 랫트를 수술대에 고정시키고 가위 와 핀셋을 이용해 다리부분의 대퇴정맥 과 동맥을 찾아 카뉼라를 삽입한다.

카뉼라를 삽입 후 정맥 과 동맥에서 혈액을 주사기로 흡입해 혈액 채취를 확인한 후 경구(oral) 캡슐 존데를 사용해 제형 1 , 제형 2, 제형 3, 제형 4 , 제형 5의 제제 시료를 랫트에 경구 투여하고 일정한 시간 간격으로 대퇴동맥에서 혈액을 500㎕씩 채취하고 이에 대응하는 양의 식염수를 대퇴정맥으로 주사해 주면서 혈액 시료를 채취한다.

채취한 혈액은 원심분리기에서 10,000rpm 10분동안 원심분리 한 후 상층액을 따로 채취해 이 상층액으로 Elisa 와 RIA Kit (Pen. Lab)을 이용해 약물을 정량한다.

따로 생체이용률의 증가를 비교하기 위해 경구투여했던 동량의 약물을 대퇴정맥에 주사하고 포뮬레이션(fomulation)에서의 혈액채취방법과 동일하게 전처리 한 후 약물을 정량해 생체이용률을 계산하여 표 3에 나타냈다.

본원 발명의 효과는,

1) 수용성 키토산을 사용하여 리포솜의 전구체인 프로리포솜을 제조해 장점막에서의 흡수를 증대시켰고,

2) 장내수용액 상태에서 펩타이드성 약물의 안정성을 증가시키기 위해 pH조절제를 사용하고,

3) 장점막에서 쉽게 펩타이드성 약물이 원활히 흡수되도록 흡수촉진제 등의 첨가물을 혼합한 후,

4) 이를 경구투여에 적당한 제형으로 제형화함과 동시에,

5) 제형을 장용성 코팅화해 위산에서 펩타이드성 약물이 파괴되지 않고 장내까지 용이하게 이동해 흡수될 수 있도록 제조하는 제조방법이다.

즉 본 발명은 리포솜을 이용한 기존의 경구제제 제조방법인 EP - 0855179 등에서 나타나는 문제점인 리포솜을 분말형태로 제조하기 위한 동결건조나 증발과 같은 과정을 거치지 않고 리포솜의 전단계인 프로리포솜을 단시간내에 고수율로 제조할 수 있어 생산과정이 단순하고, 펩타이드성 약물의 단점인 수분과 온도에 대한 안정성을 증가시키고 프로리포솜을 제조하는 담체로서 수용성 키토산을 사용함으로써 생체이용률을 증가시킬 수 있는 등의 장점을 갖고 있다.

Claims (8)

1. 펩타이드성 약물 및 인지질을 유기용제에 용해하고 이 용액을 수용성 키토산으로 코팅하여 제조된 프로리포솜.
2. 제 1항에 있어서, 펩타이드성 약물로 아프로티닌, 부세렐린, 칼시토닌, 데스모프레신, 엘카토닌, 글루카곤, 고나도트로핀, 고나도렐린, 고세렐린, 히루딘, 류프로렐린, 리프레신, 나파렐린, 옥트레오타이드, 옥시토신, 프로티렐린, 살카토닌, 세르모렐린, 소마토스타틴, 소마트로핀, 테릴프레신, 테트라코사크린, 타이모펜틴, 트립토렐린, 바소프레신, 알부민, 인슐린, 인터페론, 이뮤노글로부린, GM-CSF, G-CSF 및 글라이코프로테인에서 선택된 것을 특징으로 하는 프로리포솜.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수용성 키토산이 탈아세틸화도가 85% - 99 %이고, 분자량이 100,000 - 500,000인 것을 특징으로 하는 프로리포솜.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 엘-알파 에그 포스파티딜 콜린, 소이빈 포스파티딜 콜린, 디팔미토일 포스파티딜 콜린, 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤, 스테아릴아민, 디아세틸포스페이트, 포스파티딜 세린 및 메톡시 폴리에틸렌글리콜 디스테아로일 포스파티딜 에타놀아민에서 선택된 인지질을 사용함을 특징으로 하는 프로리포솜.
5. 펩타이드성 약물 및 인지질을 유기용제에 용해하고 이 용액을 수용성 키토산으로 코팅하여 제조된 프로리포솜을 통상의 약제학적으로 허용되는 방법으로 통상의 약제학적으로 허용되는 제제형태로 제제화하고 통상의 장용코팅의 방법으로 장용코팅하여 제조된 펩타이드성 약물의 프로리포솜의 장용성 제제.
6. 제 5항에 있어서, 펩타이드성 약물이 아프로티닌, 부세렐린, 칼시토닌, 데스모프레신, 엘카토닌, 글루카곤, 고나도트로핀, 고나도렐린, 고세렐린, 히루딘, 류프로렐린, 리프레신, 나파렐린, 옥트레오타이드, 옥시토신, 프로티렐린, 살카토닌, 세르모렐린, 소마토스타틴, 소마트로핀, 테릴프레신, 테트라코사크린, 타이모펜틴, 트립토렐린, 바소프레신, 알부민, 인슐린, 인터페론, 이뮤노글로부린, GM-CSF, G-CSF 및 글라이코프로테인에서 선택된 약물인 것을 특징으로 하는 제제.
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 프로리포솜에 pH조절제를 혼합하여 pH를 3 ～ 4의 범위로 조절함을 특징으로 하는 제제.
8. 제 5항, 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 펩타이드성 약물의 흡수촉진제로서 지방산, 지방산염, 담즙산, 담즙산염, 살리실산 또는 살리실산 염에서 선택된 흡수촉진제를 첨가하여 제조된 제제.