KR20030033282A - 항산화 활성을 가지는 신남알데히드를 함유한 계피 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성 및 노화방지 효과가 우수한 활성성분을 함유하는 계피 추출물에 관한 것이다. 본 발명은 항산화 활성 및 노화방지 효과가 우수한 신남알데히드를 함유한 계피 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 계피 추출물은 간보호, 동맥경화, 항산화 및 노화방지 효과 등에 관련된 질환의 예방, 치료 및 치료보조제로서 사용할 수 있다.

Description

항산화 활성을 가지는 신남알데히드를 함유한 계피 추출물{Extract of Cinnamomi cortex containing Cinnamaldehyde }

본 발명은 항산화 활성 및 노화방지 효과가 우수한 활성성분을 함유하는 계피 추출물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 항산화 활성 및 노화방지 효과가 우수한 신남알데히드를 함유한 계피 추출물 및 그 용도에 관한 것이다.

계피(Cinnamomi cortex)는 녹나무과(Lauraceae)에 속하는 식물이다. 계피의 생리활성 성분으로는 정유성분(essentail oil)인 시나믹 알데히드(cinnamic aldehyde), 시나밀 아세트산(cinnamyl acetate), 페닐프로필 아세트산(phenylpro phyl acetate), 시나민산(cinnamic acid), 살리실알데히드(salicylaldehyde) 등이 알려져 있다. 계피는 중추 신경계 진정작용, 혈압 강하작용, 부신피질 기능 개선작용, 위와 장 기관 개선작용, 백혈구와 혈소판에 대한 영향과 항방사선 작용, 항체생산 촉진작용 등의 생리활성을 지니고 있다고 알려져 있다.

항산화제에 대한 연구는 식품분야의 자동산화에 관한 연구뿐만 아니라, 생체내의 DNA, 단백질 등의 고분자 물질에 대한 훼손과 관련하여 생리학, 생화학, 의학분야에서도 다양하게 진행되고 있다. 이러한 항산화제는 작용기작에 따라, 라디칼제거제, 산소 제거제, 금속 이온의 킬레이트 화합물 등으로 구분되어질 수 있는데, 활성 산소가 암, 당뇨, 치매 등의 질병과 관련된 산화적 스트레스(oxidative stress)에 있어서 결정적인 역할을 한다는 것이 밝혀짐에 따라, 이러한 활성 산소제거제에 관한 많은 연구가 진행되고 있다(Halliwell B., Aeschbach R., Loliger J., and Aruoma O. I., Fd.Chem, Toxic., 33, 601, (1995); Shahi F., Janitha P. K., and Wanasundara P. D., Critical reviews in food science andnutrition, 32, 67, (1992); Lester P., and Alexander N. G., Academic Press INC. (1993)).

천연 항산화제로 가장 많이 사용되고 있는 토코페롤은 식물성 유지에서는 그 첨가 효과가 뚜렷하게 나타나지 않으며 일정첨가 농도 이상에서는 오히려 산화촉진제로 작용하는 등 바람직하지 않은 효과를 나타내기도 한다.

본 발명자들은 천연 항산화제에 대한 연구를 수행하던 중 계피의 정유성분으로부터 분리한 페놀릭 화합물이 항산화활성 및 노화방지 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항산화 활성을 갖는 활성성분이 포함된 계피 추출물을 제공한다. 본 발명은 상기 계피 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 또는 노화방지를 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 항산화 활성을 가지는 활성성분이 포함된 계피 추출물을 제공한다. 상기 활성성분은 화학식 I 으로 표시되며 신남알데히드로 동정된 화합물이다.

<화학식 I >

계피는 심나모멈속 식물에 속하는 것으로 심나모멈속 식물로는 신나모멈 카시아(Cinnamomum cassia), 실론 계피(Cinnamomum zeylanicum), 자바 계피(Cinnamomum burmanii), 베트남 계피(Cinnamomum obtusifolium), 사이공 계피(Cinnamomum sieboldii) 등이 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 신나모미 코르텍스(Cinnamomi cortex)를 사용하여 계피 추출물을 제조하였다.

본 발명자들은 계피의 정유성분을 추출한 다음 용매 분획하여 불순물을 제거하고 흡착 크로마토그래피로 페놀릭 화합물을 분리정제하였다 (실시예 1, 실시예 2). 분리된 페놀릭화합물을 동정한 결과, 신남알데히드임을 규명하게 되었다.

신남알데히드는 상술한 계피의 정유성분, 이를 포함한 추출물 또는 계피로부터 직접 추출 및 정제하여 제조한다. 바람직한 양태로서, 신남알데히드는 정유추출단계, 용매분획단계 및 분리정제단계를 통해 제조될 수 있다. 계피의 정유성분을 수증기 증류장치를 이용하여 추출한 다음(정유추출단계) 증류추출물을 유기 용매로 분획하여 불순물을 제거한다(용매분획단계). 상기 유기 용매로는 헥산, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 사용할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

정유추출과 용매분획으로 얻어진 엑기스를 흡착 크로마토그래피를 반복 수행함으로써 정제된 신남알데히드를 획득할 수 있다(분리정제단계). 구체적으로 흡착크로마토그래피는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피, 역상 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 분취용 고속 액체 칼럼 크로마토그래피 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 용출 용매로 신남알데히드를 포함한 추출성분에 영향을 미치지 않는 어떤 용매라도 사용이 가능하며 통상의 천연물 추출분야에 사용하는 용매를 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, 헥산-에틸아세테이트, 헥산-아세톤, 헥산-클로로포름, 클로로포름-에틸아세테이트, 메탄올-물, 메탄올-아세토나이트릴-물 혼합용매중에서 선택하여 사용할 수 있다. 또한 상기의 화합물 및 계피의 정유성분은 통상의 유기합성 방법을 사용하여 합성될 수도 있다.

본 발명에 따른 신남알데히드를 포함하는 계피 추출물의 생리활성을 조사한 결과, 지질과산화로 생성되는 말론디알데히드를 감소시키고, 지질과산화물을 해독시키는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 활성 및 글루타치온 농도를 감소시키며 중간 산화물의 생성을 감소시킴을 알 수 있었다. 이로부터, 신남알데히드를 포함하는 추출물이 황산화효과 및 노화방지 효과가 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 신남알데히드를 투여하지 않고 브로모벤젠만을 투여한 흰쥐의 경우에 정상군에 비하여 약 2.6배의 말론디알데히드 수치를 나타냄을 확인하였고 이러한 사실은 브로모벤젠이 지질과산화를 일으켜 노화를 유발한 것으로 생각되었다. 이에 비하여 계피의 정유성분, 즉 신남알데히드를 투여한 처리군은 말론디알데히드를 현저히 감소시키므로 항산화 활성 즉, 노화를 차단하는 것을 알 수 있었다. 브로모벤젠의 생체내에서 독성발현의 첫 단계는 간 시토크롬 P450 효소의 활성을 증가시켜서 브로모벤젠을 에폭시화하는 것이다. 이 에폭시화물은 에폭시드히드롤라제에 의하여 해독되고 계속하여 글루타치온-S-트란스페라제에 의하여 글루타치온이 결합하는 해독과정을 거쳐 배설된다. 계피의 정유성분을 투여한 처리군에서는 지질과산화물을 해독시키는 글루타치온-S-트란스페라제나 글루타치온의 농도가 오히려 감소한 것을 알 수 있었는데 이는 계피 추출물이 과산화물의 생성을 차단한 결과 이를 해독시키는 효소도 활성이 감소한 것으로 생각된다. 또한 체내에서 독성을 유발하는 브로모벤젠의 중간체에 의하여 간 아닐린 히드록실라제나 아미노피린 디메칠라제와 같은 시토크롬 P450 효소의 활성이 나타날 수 있으나, 브로모벤젠 만을 투여한 비교군에 비하여 계피 추출물을 투여시 브로모벤젠의 독성 유발 중간체 즉 산화물의 생성이 차단되어 간 아닐린 히드록실라제나 아미노피린 디메칠라제가 현저히 낮은 활성을 나타내는 것을 재확인 할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 신남알데히드를 유효성분으로 함유한 계피 추출물은 항산화제 또는 노화방지제로 사용될 수 있다.

상기 과정을 통하여 제조된 본 발명의 추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체 (carrier), 부형제 (forming agent), 희석제 (diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있으며 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.

투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1

계피의 정유 추출물의 제조

신선한 계피를 잘게 부수고 수증기 증류 장치에 건조 중량 1.5 kg을 넣어 4시간 동안 수증기 증류 추출로 정유 성분을 추출하였다. 추출물을 물에 현탁하여 에테르를 첨가함으로써 용매 추출한 후 용매 분획물을 얻었다. 이 용매 분획물에는 무수망초를 넣어 여분의 수분을 흡수시킨 후 여액을 모았고, 이 여액은 40℃의 수조로 가온한 진공 농축기를 사용하여 감압 농축하였다. 그 결과 액상의 에테르 추출물 9 g을 얻을 수 있었고, 이 시료는 계피의 정유 성분으로 생리활성을 측정하거나 상기의 페놀릭 화합물을 정제하는 시료로 사용되어졌다.

실시예 2

페놀릭 화합물의 분리 정제

실시예 1에서 획득한 에테르 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 우선 내경 3 cm의 컬럼을 스텐드에 수직 고정하고 솜으로 컬럼의 아래 부분을 막았다. 미리 준비해 둔 전개 용매 (헥산-에틸아세테이트 (10:1)) 400 ㎖와 실리카겔 (Art No. 7734, Merk, Cermany) 60g을 삼각 플라스크에 넣어 현탁하여 공기를 제거한 후, 컬럼에 신속히 가하고 컬럼 하단의 마개를 열어 전개 용매를 빼내었다. 용출되는 전개 용매를 이용하여 삼각 플라스크의 남은 실리카겔을 모두 씻어컬럼에 충진하였다. 전개 용매가 실리카겔의 상단에 올 때까지 용출하고 컬럼의 마개를 잠갔다.

시료를 실리카겔에 흡착시키기 위하여 실시예 1에서 제조한 에테르 분획을 에틸아세테이트 50 ㎖와 잘 혼합하여 용해한 후, 실리카겔 5 g을 가한 후 진공 농축기에서 40 ℃로 가온 하면서 용매를 증발시켰다. 얻어진 분말상의 건조물을 유발에서 유봉으로 미세하게 분쇄하였다. 분쇄물을 미리 준비한 컬럼에 스푼을 사용하여 로딩 하였다. 전개 용매는 헥산-에틸아세테이트 (10:1) 400㎖를 먼저 사용한 후 헥산-에틸아세테이트 (10:2)를 사용하였고, 그 용출액 10 ㎖ 씩을 계속 분취 하여 모두 96개의 분획을 얻었다.

얻어진 모든 분획물에 대하여 박층 크로마토그래피 (TLC)로 용출 성분을 분석하였다 (TLC plate; Silica gel 60F₂₅₄(1.05715), Merck). TLC는 제조자의 매뉴얼에 기재된 방법에 의하여 실시하였으며, TLC로 나타나는 반점의 검출은 바닐린-황산 시약을 사용하였다. TLC의 패턴에 의하여 유사한 분획은 모아 혼합한 후 40℃로 가온한 수조에서 진공 농축하였다. 그 결과 5개의 분획을 얻을 수 있었다.

그 중 2번째 분획을 분취용 TLC를 이용하여 정제하였을 때 순수한 무색의 향기성분 1.2 g을 얻을 수 있었다.

실시예 3

페놀릭 화합물의 구조동정

상기 실시예 2에서 정제된 페놀릭 화합물의 구조를 동정하였다. 분리된 화합물의 융점은 융점 측정용 기구 (Yanagimoto micromelting point apparatus)를 사용하여 측정하였다. IR 스펙트럼은 하이터치 260-01 스펙트로미터(Hitachi 260-01 spectrometer)를 사용하여 KBr 디스크법으로 측정하였으며, 질량 스펙트럼은 핀니간 맷 TSG-700(Finnigan mat TSQ-700 (70 eV))으로 측정하였다.¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 내부표준물질 테트라메틸실란 (tetramethylsilane: TMS)을 첨가하여 브루커 AM-200 스펙트로미터(Bruker AM-200 Spectrometer)로 측정하였다.

실험 결과, 본 발명에 따른 페놀릭 화합물의 이화학적 특징은 다음과 같으며 신남알데히드(cinnamaldehyde)로 동정되었다.

[화학식 1]

colerless oil

UV λ_max(DMSO): 290 nm

IR (KBr, cm^-1) v_max: 1621 (aromatic C=C), 1684 (α,β -unsaturated aldehyde)

¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ : 6.72 (1H, dd, J=7.7 and 15.9 Hz, H-8), 7.44 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 7.45 (2H, d-like, H-2,6), 7.54 (3H, m, H-3,4,5), 9.70 (1H, d, J=7.7 Hz)

¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) δ : 193.5(C-9), 152.6 (C-8), 133.8 (C-1), 131.1 (C-3), 128.9 (C-2,6), 128.7 (C-3,5), 128.3 (C-7) MS (70 eV) m/z (%): 132.1 (M⁺, 69), 131.1 ( [M-H]⁺, 100), 103.1( [M-CO] +, 44), 77 ( [phenyl]⁺, 24),

실시예 4

신남알데히드의 노화방지 및 항산화활성 측정

실험동물인 흰쥐에 7 일간 매일 한 번씩 에틸아세테이트 분획을 경구로 투여하였고, 본 발명에 따라 제조한 신남알데히드를 복강투여하였다. 그 후 24 시간이지나 흰쥐의 노화를 촉진시키기 위해 브로모벤젠 480 mg/kg을 12 시간마다 4회 투여하였다. 브로모벤젠 마지막 투여 후 혈액을 채취하여 말론디알데히드 함량, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 활성, 글루타치온 함량, 간 아닐린 히드록실라제 활성 및 간 아미노피린 N-디메틸라제 활성을 측정하여 신남알데히드의 항산화활성을 측정하였다. 각각의 실험치는 6회 반복실험의 평균± 표준편차로 나타내었다.

(1) 말론디알데히드 함량의 측정

오카와 등의 방법 (Ohkawa, H., Ohishi, N. and Yaki, K. Anal. Biochem., 95, 351 (1979))을 사용하여 실험동물의 말론디알데히드 함량을 측정하였다. 쥐로부터 적출한 간 조직 1 g 당 9배량의 생리식염수를 가해 마쇄하고 이 마쇄액에 8.1% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)와 20% 아세트산 완충용액(acetate buffer; pH 3.5)을 첨가하였다. 상기 시료를 발색시키기 위해0.8% 티오바비투릭산(thiobarbituric acid)를 가한 후 95℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 실온에서 냉각시키고 η-부탄올:피리딘(η-BuOH:Pyridine)을 15:1의 부피비율로 첨가하여 15 분간 원심분리 시킨 후 홍색의 η-부탄올:피리딘층을 취하여 파장 532 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도를 표준곡선을 이용하여 간 조직 1 g당 말론디알데히드 nM로 전환하였다.

(2) 글루타치온-S-트랜스퍼라제 활성의 측정

하비그 등 (Habig, W. H., Pabist, M. J. and Jakoby, W. B. J. Biol. Chem., 249, 7130 (1974))의 방법으로 실험동물의 글루타치온-S-트랜스퍼라제 활성을 측정하였다. 0.1 M 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer; pH 6.5)이 첨가된 간조직 시료액 3.5 ㎖에 1 mM 글루타치온, 1 mM 1-클로로-2,4-디니트로벤젠 (1 mM 1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 및 0.1 ㎖ 효소액을 가하여 25 ℃에서 2 분간반응시켰다. 이때 생성되는 티오에테르(thioether)에 의한 340 nm에서 흡광도의 변화를 모니터링하고 흡광계수 9.6 mM^-1cm^-1을 이용하여 효소의 활성도를 산정하였다.

(3) 글루타치온의 함량 측정

글루타치온의 함량은 가이톤드(Gaitonde)의 방법을 변경하여 시스테인 (cystein)의 양을 측정하였으며, 비단백질 결합-SH(nonprotein bound-SH)의 양에서 시스테인-SH의 양을 빼주어 산정하였다. 호모게네이트(Homogenate)에 간조직 시료액과 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 동량을 가하여 원심분리한 후 상징액을 획득하였다. 상징액 0.5 ㎖를 취하여 여기에 빙초산 0.5 ㎖, 닌하이드린시약 (250 mg 닌하이드린/빙초산 6 ㎖ + 진한 염산 (conc. HCl) 4 ㎖)을 0.5 ㎖ 첨가하였다. 이를 10 분간 가열한 다음 냉수에 냉각한 후 에탄올 3 ㎖를 가한 즉시 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 글루타치온 함량은 측정한 흡광도를 표준곡선에의해 환산하여 나타내었다.

(4) 간 아닐린 히드록실라제 활성 측정

비드랙 등(Bidlack, W. R. and Lowry, G. L. Biochem. Pharmacol., 31, 311(1982))의 방법에 따라 실험동물의 간 아닐린 히드록실라제 활성을 측정하였다.

10 mM MgCl₂와 150 mM KCl이 함유된 50 mM 트리스. HCl 완충액 (pH 7.4)이 첨가된 간조직 시료액 2 ㎖에 기질로 1 mM 아닐린 HCl, 0.5 mM NADPH 및 효소액 (300-400㎍의 단백질)을 첨가하였다. 이 액을 37 ℃에서 20 분간 반응시킨 다음 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)를 가하여 반응을 종료하고 10 분간 원심분리하였다. 원심분리하여 획득한 상징액에 10% Na₂CO₃와 0.2N-NaOH (2% 페놀 함유)를 첨가하여 37 ℃에서 30분간 발색시켰다. 상기 반응물의 흡광도를 파장 640 nm에서 측정하고 표준곡선에서 활성도를 산정하였다.

(5) 간 아미노피린 N-디메틸라제 활성 측정

나쉬 등 (Nash, T. J. Biol. Chem., 55, 416 (1953))의 방법을 약간 변경하여 실험동물의 간 아미노피린 N-디메틸라제 활성을 측정하였다. 0.1 M Na⁺/K⁺인산 완충용액(pH 7.5)이 첨가된 간조직 시료액 2㎖에 2 mM 아미노피린(aminopyrine), HCl, 0.5 mM NADPH, 10 mM MgCl₂, 150 mM KCl, 1 mM 세미카비진(semicarbizine) 및 효소액 (30-400 ㎍의 단백질)을 첨가하였다. 이 반응액을 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 다음 15% ZnSO₄와 포화 Ba(OH)₂를 가하여 반응을 종료시키고 5 분간 방치 후 10 분간 원심분리 하였다. 획득한 상징액 5 ㎖에 나쉬시약(Nash reagent)를 첨가하여 60 ℃에서 30 분간 발색시키고 다시 원심분리 하여 상징액을 취하였다. 상징액의 흡광도를 파장 415 nm에서 측정하고 표준곡선에 준하여 활성도를 산정하였다.

실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 브로모벤젠을 투여한 흰쥐는 정상군에 비하여 약 2.6배가 증가된 말론디알데히드 수치를 나타내었다. 이는 브로모벤젠이 지질과산화를 일으켜 노화를 유발한 것으로 간주된다. 이에 비하여 계피의 정유성분, 즉 신남알데히드를 투여한 처리군은 말론디알데히드를 현저히 감소시키므로 항산화 활성 즉, 노화를 차단하는 것으로 나타났다. 또한, 계피의 정유성분을 투여한 처리군에서는 지질과산화물을 해독시키는 글루타치온-S-트란스페라제나 글루타치온의 농도가 오히려 감소하였다. 이것은 말론디알데히드의 생성이 현저히 감소한 것과 상응하는 결과로서 계피 추출물이 과산화물의 생성을 차단하여 이를 해독시키는 효소도 활성이 감소한 것으로 사료된다. 간 아닐린 히드록실라제 또는 아미노피리딘 디메질라제의 활성도 브로모벤젠 만을 투여한 비교군에 비하여 계피의 신남알데히드를 포함하는 정유성분을 투여하였을 때 그 활성히 현저히 낮게 나타났다.

[표 1]

계피의 정유성분에서 분리한 신남알데히드의 간 대사효소에 대한 효과

각 실험치는 6회 실험의 평균± 표준편차를 나타낸다.

동일한 문자를 가진 실험치는 유의적인 차이가 없음을 의미한다(p<0.05)

본 발명에 따라 제조된 신남알데히드(cinnamaldehyde)를 유효성분으로 함유한 계피 추출물은 우수한 항산화 효과 및 노화방지 효과가 있다. 따라서, 이를 간 보호, 동맥경화, 항산화 및 노화방지 효과 등에 관련된 질환의 예방 및 치료를 위해 사용할 수 있다.

Claims (3)

1. 하기 화학식으로 표시되는 신남알데히드를 유효성분으로 함유하는 항산화 활성을 가지는 계피 추출물.
2. 제 1항에 있어서, 계피 추출물은 계피의 정유성분을 수증기 증류장치를 이용하여 추출하고 추출된 정유성분을 유기 용매 분획한 다음 정유추출과 용매분획으로 얻어진 엑기스를 흡착 크로마토그래피를 반복수행하여 분리정제함으로써 제조한 추출물.
3. 제 1항 기재의 계피 추출물을 유효성분으로 하는 항산화제 및 노화방지제.