KR20030029530A - 산화질소 흡입의 치료 효능 향상 - Google Patents

산화질소 흡입의 치료 효능 향상 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유류내에서의 산화질소(NO) 흡입 관련 HPV의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 산화질소의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 항반응성 산소종(안티 ROS제), 예를 들어, N-아세틸시스테인 또는 류코트리엔 블록커의 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다. 또한, 본 발명은 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 NO의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 안티 ROS제의 유효량 또는 류코트리엔 블록커의 치료 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다.

Description

산화질소 흡입의 치료 효능 향상{ENHANCING THERAPEUTIC EFFECTIVENESS OF NITRIC OXIDE INHALATION}
산화질소(NO)는 신체의 많은 세포에 의하여 생성되는 고반응성의 자유 래디칼 화합물이다. 이것은 세포질 구아닐 고리화효소의 헴부위에 결합하여, 구아닐 고리화효소를 활성화하여 세포내에서 환상 구아노신 3',5'-모노포스페이트(cGMP)의 레벨을 증가시켜서, 혈관 민무늬근을 이완하여 혈관을 확장시킨다.
NO 가스는 흡입되었을 때, 인간과 동물의 폐혈관의 선택적 확장제로서 작용한다. 결과적으로, NO 흡입은 폐의 통풍이 양호한 지역에서의 혈관 확장에 사용된다. 급성 호흡 질환 증후군(ARDS)에서는, 약화된 폐조직의 통풍은 동맥혈의 산화를 감소시킨다. 산화질소 흡입은 종종 ARDS 환자에게 산화를 향상시킨다. 이것은 폐의 통풍이 양호한 부위의 혈관을 확장시켜서, NO를 거의 수용하지 않는, 통풍이 불량한 지역으로부터 멀리, 혈류을 재분배함으로써, 그렇게 기능하기 때문이다. 그러나, ARDS 환자의 30~40%가 NO 흡입이 있어도 동맥 산화의 향상을 보지 못했다(Bigatello 들, 1994, anesthesilogy 80:761-770; Dellinger 들., 1998, Crit. Care Med. 26:15-23). 이것이 ARDS 환자는 NO 흡입에 응답하지 못할 것이다또는 환자들이 단지 일시적으로만 응답할 것이라는 예측은 곤란하다. 그러나, 폐혈증과 관련된 ARDS 환자들의 60% 미만이 흡입된 NO에 반응하지 않음이 알려져 있다(Krafft 들., 1996, Chest 109:486-493).
정상의 폐맥 관계는 폐포의 저산소증 반응을 억제한다. ARDS와 같은 폐 질환이 있는 환자에게, 저산소증 폐혈관 수축(HPV)은 통풍이 불량한(저산소의) 폐 지역으로부터 멀리 또는 통풍이 양호한(정상 산소의) 폐 지역으로 혈류을 재분배함으로써 전신의 동맥 산화의 레벨을 올린다. 폐혈증과 내독혈증은 HPV를 약화시켜 동맥 산소 농도를 심각하게 감소시킨다(Hutchinson 들., 1985, J.Appl. Physiol. 58:1463-1468). 이러한 전신 산화의 감소는 생명을 위협할 수 있다. 산화질소 흡입은 폐의 통풍이 양호한 지역으로 혈류을 증가시킴으로써, 폐혈증 동안에 산화 또는 동맥혈을 향상시킬 것으로 예측할 수 있다. 그러나, 실제로, 폐혈증 동안, NO 흡입은 종종 비효능적이고, 때때로, NO 흡입과 관련된 HPV의 감소 때문에 해롭다. (1996년 Gerlach 들의 Nitric Oxide and the Lung,(Zapol and Bloch 출판), Marcel Dekker Inc., New York의 페이지 271-283에서의 "급성 폐질환에서 흡입된 산화질소의 낮은 레벌"를 참조).
내인성의 NO는 산화질소 합성효소에 의해, 산소의 존재하에 L-아르기닌으로부터 L-시트룰린으로의 전환을 통하여 생성된다(Knowles 들., 1994, Biochemistry 298: 249-258). 3개의 다른 형태의 산화질소 합성효소(NOS)가 특징지워진다. 신경 NOS(NOS1)과 내피 NOS(NOS3)는 구성 효소이다. 상당양의 NO를 제조할 수 있는 NOS2로 알려진 유도 NOS는 엔도톡신(리포 다당류 또는 LPS라도도 함)과시토킨(Knowles 들., supra)에 의하여 유도된다. 다양한 NO 흡입 치료의 값이 표시되어 있어도, NO 흡입 및 NO 관련 HPV 손실에 대한 폐혈관 확장 응답의 약화는 급성 호흡 질환에 중요한 문제를 남긴다.
개요
본 발명자들은 폐 NO 레벨의 증가가 폐혈증 동안 HPV를 약화시킴에 필요하고, 이러한 HPV 약화는 반응성 산소 스캐빈저 또는 류코트리엔 블록커에 의해 개선할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 폐질환을 가진 환자에게 동맥혈 산화를 향상시키기 위하여 NO 흡입의 혈관 확장 효과를 유지하면서, NO 흡입의 HPV 감소 효과를 개선할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 HPV의 약화는 단순히 NO 매개의 혈관 확장만은 아님을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 폐 NO 레벨의 상승 뿐만 아니라 다른 리포 다당류 유도제가 엔도톡신에 감연된 마우스에서 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답을 약화시킴에 필요함을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답을 유지하는 방법을 개발하였다.
본 발명의 하나의 측면으로, 본 발명은 포유류에서 NO 흡입 관련 HPV의 약화를 감소, 또는 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법으로 특징지워진다. 하나의 태양으로, 이 방법은 포유류에게 NO의 치료 유효량을 흡입에 의하여 투여하고, 항반응성 산소종(안티 ROS)제의 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다. 이 안티 ROS제는 예를 들어, N-아세틸시스테인, 알로푸리놀, 아스코브산(비타민 C), 빌리루빈, 카페인산, 카탈라제, PEG-카탈라제, 세루로플라슴, 구리 디이소프로필살리실레이트, 데퍼로사민 메실레이트, 디메틸우레아, 에브셀렌(2-페닐-1,2-벤즈이소셀레나졸-3(2H)-온;Pz51), EUK-8, FeTMTPyP(5,10,15,20-테트라키스(N-메틸-4'-피리딜)포르피나토 철(III) 클로라이드), FETPPS(5,10,15,20-테트라키스(4-설포나토페닐)포르피리나토 철(III) 클로라이드), 글루코코르티코이드, 글루타치온, MnTBAP(Mn(III)테트라키스(4-벤조산)포르피린 클로라이드), MnTMPyP(Mn(III)테트라키스(1-메틸-4-피리딜)포르피린 펜타클로라이드), 셀레노메티오닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제(SOD), 폴리에틸렌글리콜-공역-SOD(PEG-SOD), 탁시포린(디하이드로퀴에르세틴; 3,3',4',5,7-펜타하이드록시플라본), 및 비타민 E를 들 수 있다. N-아세틸시스테인이 안티 ROS제로 바람직하다. 또하나의 태양으로, 이 방법은 흡입에 의하여 NO의 치료 유효량을 투여하고, 류코트리엔 블록커의 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다. 다른 태양으로, 2개 이상의 안티 ROS제, 또는 안티 ROS와 류코트리엔 블록커를 NO 흡입과 함께 보조 투여하는 것이다.
본 발명의 다른 측면으로, 본 발명은 포유류에서 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장의 손실을 감소, 또는 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법으로 특징지워진다. 하나의 태양으로, 이 방법은 포유류에게 NO의 치료 유효량을 흡입에 의하여 투여하고, 안티 ROS제의 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다. 또하나의 태양으로, 이 방법은 흡입에 의하여 NO의 치료 유효량을 투여하고, 류코트리엔 블록커의 유효량을 보조 투여하는 것으로 되어 있다. 다른 태양으로, 2개 이상의 안티 ROS제, 또는 안티 ROS와 류코트리엔 블록커를 NO 흡입과 함께 보조 투여하는 것이다.
다른 언급이 없으면, 여기서 사용하는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술에서의 당업자가 일반적으로 이해는 의미와 같다. 다툼이 있는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서에서 조정할 것이다. 여기서 언급된 모든 공보, 특허, 다른 서류는 참고 문헌에 포함된다.
여기서 기술한 방법 및 물질과 동급 또는 등가의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 하기에 기술한다. 이 물질, 방법 및 실시예는 단지 예에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 특징과 장점은 발명의 상세한 설명과 청구의 범위로부터 명백하게 알 수 있을 것이다.
본 발명은 폐 생리학 및 심장학에 관한 것이다.
도 1은 미처리된 야생형 마우스의 단리된 관류 폐내에서 폐동맥 압력(PAP; 관류압과 등가)과 좌심방압(LAP)을 측정한 대표 실험예의 기록이다. 안정된 트롬보산 A2유사체 U46619를 주입하여 PAP를 5 또는 6mmHg까지 증가시켰다. 0.4, 4.0, 40ppm 의 NO 가스를 각각 5분 동안 투여하였다. 각각 투여후, PAP를 이전 NO 레벨로 복귀하였다.
도 2a는 리포 다량류 예비처리 야생형 마우스(폐쇄 원)와 미처리 야생형 마우스(개방 원)의 NO 흡입에 대한 투여 응답 커브를 나타낸다. NO 흡입에 대한 응답은 미처리된 야생형 마우스(*P<0.001)에 비하여, 리포 다량류 예비 처리된 야생형 마우스에서 약화되었다. 데이터는 평균 ±SE로 나타냈다. △PAP는 폐동맥압의 변화이며, U46619로 유도된 증가분의 백분율이다.
도 2b는 리포 다량류 예비처리 NOS2 결핍 마우스(폐쇄 사각)와 미처리 NOS2 결핍 마우스(개방 사각)의 NO 흡입에 대한 투여 응답 커브를 나타낸다. 미처리된 NOS2 결핍 마우스(†P<0.05)와 리포 다당류 예비처리 야생형 마우스(‡P<0.001)에 비하여, 리포 다량류 처리된 NOS2 결핍 마우스가 NO 흡입에 대한 응답이 크게 나타났다. 데이터는 평균 ±SE로 나타냈다. △PAP는 폐동맥압의 변화이며, U46619로 유도된 증가분의 백분율이다.
도 3은 리포 다당류 예비처리 야생형 마우스(야생형/LPS)와 미처리 야생형 마우스(야생형/대조구)로부터 단리된 관류 폐 내에, 그리고 순환 공기내에 16시간 동안 20ppm NO에 미리 노출된 리포 다당류 예비처리 NOS2 결핍 마우스(ko/LPS)와 미처리 NOS2 결핍 마우스(ko/대조구)로부터 단리된 관류 폐 내에, 단기간 NO 흡입에 의한 혈관 확장의 데이터를 종합한 그래프이다. NO 노출 후, 리포 다당류 예비처리 NOS2 결핍 마우스가 리포 다당류를 수용하지 않은 NOS2 결핍 마우스(*P<0.05)보다 단기간 NO 흡입에 대해 응답적이지 못하였다. 이와 마찬가지로, NO 노출 후, 리포 다당류 예비처리 야생형 마우스가 리포 다당류를 수용하지 않은 야생형 마우스(*P<0.05)보다 단기간 NO 흡입에 대해 응답적이지 못하였다. 데이터는 평균 ±SE로 나타냈다.
도 4는 NOS2 결핍 마우스로부터 얻은 단리된 관류 폐에서, 0.4ppm NO 가스의 단기 흡입에 의한 혈관 확장에 대하여, 리포 다당류 감염후 0, 0.2, 2.0 및 20ppmNO를 16시간 호흡한 효과의 실험 데이터를 종합한 히스토그램이다. 2ppm 과 20ppm NO 가스 노출은 NO에 대한 폐혈관 확장을 감소시켰다. 데이터는 평균 ±SE로 나타냈다. 0ppm NO 16시간 노출에 대하여 *P<0.05; **P<0.001이다.
도 5는 리포 다당류 감염 마우스(폐쇄 원)와 대조구 마우스, 및 N-아세틸시스테인(150mg/kg i.p)를 리포 다당류와 동시에 처리하고 3.5시간 후에 이를 반복한 리포 다당류 감염 마우스(폐쇄 삼각)에서의 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 실험 데이터를 종합한 그래프이다. NO 흡입에 대한 응답은 대조구 마우스(*P<0.001)에 비하여 리포 다당류 처리 마우스에서 감소하였다. N-아세틸시스테인(150mg/kg)의 2번 투여로 NO 흡입에 대한 다당류 유도 혈관 반응성의 감소를 완전히 보호하였다. % 혈관 확장은 폐동맥압의 변화이며, U46619로 유도된 증가분의 백분율이다. 데이터는 평균 ±SE로 나타냈다.
도 6은 복강내 N-아세틸시스테인 또는 사린을 주입하고, 실내 공기 또는 실내 공기 + 20ppm NO 가스에서 16기산 호흡한 리포 다당류(LPS) 감염 마우스에서의 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 실험 데이터를 종합한 그래프이다. 리포 다당류 감염 마우스에서 NO에 대한 폐혈관 확장 응답에 대해 N-아세틸시스테인 150mg/kg의 보호 효과는 NO 흡입 동안 유지되었다(양 그룹의 LPS+사린에 대해 *P<0.05이다).
도 7은 사린으로 처리(대조구, 개방 바; n=7)한, 엔도톡신으로 처리(엔도톡신, 폐쇄 바 n=6)한, 또는 엔도톡신 감염후 복강내 5mg/kg L-NIL을 투여(L-NIL(선택적 NOS2 억제제)+ 엔도톡신, 스트리프 바;n=5)한 야생형 마우스(+/+)와 NOS2 결핍 마우스(-/-)에서, 좌 주 기관지 폐색(LMBO)후 좌폐로 5분 분획 혈류(QLPA/QPA)의 변화에 대한 실험을 종합한 히스토그램이다. (*P<0.05, 대조구에 대하여 엔도톡신; P<0.01, NOS2 결핍에 대하여 야생형; #P<0.01, 엔도톡신에 대하여 엔도톡신 + L-NIL). 공기 또는 40ppm NO에서 22시간 호흡하고, 호흡 중단 후 1시간 동안 측정하였다. 엔도톡신 감염 야생형 마우스에서는 LMBO 후에 폐혈류 재분배의 현저한 감소를 일으켰으나, NOS2 결핍 마우스에서는 그렇지 않았다. 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마우스는 40ppm NO 흡입 후, NO 흡입을 중단하고 1시간 측정한 결과, 엔도톡신 처리 야생형 마우스와 같이 HPV의 동일한 감소를 나타냈다. 40ppm NO를 22시간 호흡한 사린 처리 NOS2 결핍 마우스와 야생형 마우스는, NO 흡입 중단 후 1시간 측정하였을 때, LMBO 후 폐혈류을 재분배하는 능력을 유지하였다.
도 8은 LMBO(저산소 폐혈관 축소(HPV)의 척도)에 대응하여, 좌폐혈관 저항의 증가분(△iLPV)의 변화를 측정한 실험의 결과를 종합한 히스토그램이다. HPV는 엔도톡신 감염 야생형 마우스에서 약화되었다(ETX; 사린 감염 마우스에 대해 #P<0.05). HPV는 N-아세틸시스테인(NAC; 복강내에 엔도톡신과 함께 투여) 500mg/kg으로 처리된 엔도톡신 감염 마우스에서는 유지되었고, N-아세틸시스테인 (NAC; 복강내에 에도톡신과 함께 투여) 150mg/kg으로 처리된 엔도톡신 감염 마우스에서는 유지되지 않았다(사린 감염 마우스에 대해 *P<0.05). HPV는 EUK-8, 슈퍼옥사이드의 스캔빈저, 하이드로겐퍼옥사이드 및 퍼옥시나트라이트로 처리된 엔도톡신 감염 마우스내에서 완전히 유지되었다(미처리된 엔도톡신 감염 마우스에 대해 ‡P<0.05).
도 9a~9c는 일시적인 좌폐동맥(LPA) 폐색과 함께 및 좌폐동맥 폐색 없이, LMBO 이전과 LMBO 동안, 폐 및 전신의 혈류 역학을 측정한 대표치이다. LMBO 이전(a) 및 LMBO 동안(b,c) 주혈류 역학에서 LMBO에 의하여 유도된 한쪽 폐포 저산소증의 효과를 도시하였다. 전체 폐포 붕괴가 LMBO후 약 1분 발생하였다. 사린 처리 야생형 마우스에서, 우 폐동맥(QRPA)을 통과하는 평균 유속, 평균 폐동맥압(PPA), 평균 전신 동맥압(PSA), 및 평균 공기압(PALV)을 베이스라인으로 하여 연속적으로 기록하고, 그리고 LMBO 후에 이를 연속적으로 기록하였다. 우 및 좌폐동맥 사이에 혈류 분배를 분석하기 위하여, QRPA=QPA 지점에서 폐동맥을 일시적으로 폐색하였다(도 9a와 도 9c 참조). QPA- QRPA의 차이가 QLPA이다. 베이스라인, LMBO 이후 5분 측정하였다. 화살표는 좌폐동맥의 폐색(90초)과 이완을 나타낸다.
도 10a는 형광 마이크로스피어(직경 15㎛)의 정맥 주사와 초음파 유속 프로브로 QRPA의 측정에 의하여 분석된 좌 또는 우 폐로 %폐혈류의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. 값은 LMBO 이전 및 LMBO 이후의 좌 또는 우 폐로 분획 흐름으로서 표시된다(사린 처리 야생형 마우스; n=4). 이 2 방법 사이에는 밀접한 상관 관계가 있다(r2=0.967).
도 10b는 사린 처리 야생형 마우스(n=6)에서 LMBO 이전(베이스라인) 및 LMBO 5분 후 좌폐 흐름 압력 관계에 대한 실험 결과를 나타내는 그래프이다. 좌폐동맥 흐름(QLPA)은 초음파 유속 프로브에 의하여 측정하였고, 경사는 하대정맥의 일시적인 폐색으로 인한 QPA의 감소에 의하여 발생하였다(P<0.05, 경사가 베이스라인에대하여 다르다).
도 10c는 사린 처리 야생형 마우스(n=3)내의 붕괴된 좌폐의 재팽창 동안 전체 좌폐혈관 저항(TLPVR)의 변화를 나타내는 그래프이다. 값은 각각 95% 신뢰 간격으로 모든 데이터 점은 선형 회귀로써 표시하였다.
도 11은 엔도톡신 처리 야생형 마우스(굵은 라인)와 엔도톡신 처리 NOS2-결핍 마우스(가는 라인)에서 산소의 전신 동맥 부분압(PaO2)에 대하여 LMBO에 의하여 유도된 지역적 저산소증의 효과를 나타내는 그래프이다. 엔도톡신은 연구에 앞서 10mg/kg E.coli 엔도톡신의 복강내 주사에 의하여 22시간 투여되었다. PaO2의 연속적인 기록이 대동맥궁에 위치한 클라크형 산소 전극으로 얻어졌다. 데이터는 야생형 마우스(n=5) 및 NOS2-결핍 마우스(n=3)에 대한 독립적인 실험의 평균값이다.
도 12는 혈액 역학 측정으로부터 데이터의 표이다. 혈액 역학 측정은, 혈액 역학 측정전에 사린(대조구) 또는 엔도톡신(엔도톡신)으로 22시간 감염된 야생형 마우스(NOS2+/+)와 NOS2 결핍 마우스(NOS2-/-)에 대해, 공기내에서의 40ppm NO의 22시간 흡입을 시행하고 또는 시행없이(NO 흡입의 중단후 1시간 동안 측정) , LMBO(베이스라인) 이전 및 좌폐 저산소증 이후 5분에서 실시하였다. HR= 심장 속도(min-1), PSA= 평균 전신 동맥압(mmHg), PPA=평균 폐동맥압(mmHg), QPA=좌폐동맥 폐색 동안 우 폐동맥을 통한 흐름(㎕×min-1×g-1bw), QRPA= 우 폐동맥을 통한 흐름(㎕×min-1×g-1bw), QLPA= 좌폐동맥을 통한 흐름(㎕×min-1×g-1bw), QLPA/QPA= 일시적인 좌폐동맥 폐색 동안 우 폐동맥을 통한 흐름에 대한 좌폐동맥을 통한 흐름의 비율. LMBO 이전 베이스라인에서의 모든 값은 ANOVA에 의하여 그룹사이에서 비교된다. 각 파라미터 상의 LMBO의 효과를 각 그룹에서 ANOVA에 의하여 포스트 혹 비교로 분석하였다(베이스라인에 대해AP<0.05,BP<0.01,CP<0.001).
도 13은 사린 감염 야생형 마우스(n=7), 사린 감염 5-LO 결핍 마우스(n=7), 엔도톡신 감염 야생형 마우스(n=8), 엔도톡신 감염 5-LO 결핍 마우스(n=9), 5-LO 활성 단백질 억제제(MK886)으로 처리된 엔도톡신 감염 야생형 마우스(n=8) 및 Cys T1-수용체 길항제(MK571)로 처리된 엔도톡신 감염 야생형 마우스(n=7)에서의 좌폐혈관 저항(좌 PVR)의 LMBO 유도 증가에 대한 실험으로부터 데이터를 종합한 히스토그램이다. 사린 감염 야생형 마우스 대하여 *P<0.01이고; 엔도톡신 감염 야생형 마우스에 대하여 #P<0.01이다.
NO 흡입
흡입에 의한 NO의 안정하고 효과적인 투여 방법은 예를 들어, Zapol,미국특허번호 5,570,683; Zapol 들., 미국특허번호 5,904,938; Frostell 들., 1991, Circulation 83:2038-2074에 기재되어 있다. 흡입용 NO는 상업적으로 입수 가능하다(INOmaxTM, INO Therapeutics, Inc., Clinton, NJ). 본 발명에서, NO 흡입은 의료 관행에 따르는 것이 바람직하다.
흡입에 의한 NO의 적합한 초기 투여량은 20ppm이다. INOmaxTM포장 삽입물을 참조하시오(www.inotherapeutics.com). 그러나, 투여량은 환자의 연령과 상태, 치료되는 질병, 그외 내과 의사가 생각하는 다른 요인에 따라 다르지만, 0.1~100ppm이다. 효능 투여량을 가장 낮게 하는 것이 바람직하다. 경험적으로 가장 낮은 투여량에 도달하기 위하여는, 투여를 20ppm에서 시작한 후, 혈관 확장 효과가 소실될 때까지 서서히 투여량을 감소시킨다. 20ppm이 흡입 투여량으로 부족하다고 생각되는 경우에는, 혈관확장 효과가 관찰될 때 까지, NO 투여량을 서서히 증가시킨다. 상기와 같은 투여량의 조정은 본 기술의 당업자에게 자명한 통상의 방법이다. 본 발명의 장점은, 여러 경우에서, NO가 단독으로 투여된 경우에 요구 NO 투여량보다 낮은 NO 투여량으로 요구 치료 결과를 달성할 수 있다는 것이다. 또한, 다른 현상(예: 폐혈증 폐질환)이 발생하지 않은 것에서 흡입 NO 응답이 가능하고, 또는 급성 폐질환의 진행에도 불구하고 응답을 보존할 수 있다.
안티 ROS제
반응성 산소종(ROS)은 슈퍼옥사이드 래디컬(O2●), 하이드로겐퍼옥사이드 (H2O2), 및 하이드록실 래디컬(OH●)을 들 수 있다. 여기서 사용되는 "안티 ROS제"란, (1) 활성 산소종의 생성을 억제하는 화합물; 또는 (2) 일단 생성된 활성 산소종과 신속하게 반응하여 제거하는 화합물을 말한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 많은 안티 ROS제는 공지되어 있다. 안티 ROS제의 예는 N-아세틸시스테인(MucosilTM), 알로푸리놀, 아스코브산(비타민 C), 빌리루빈, 카페인산, 카탈라제, PEG-카탈라제, 카테친, 세루로플라슴, 구리 디이소프로필살리실레이트, 데퍼로사민 메실레이트, 디메틸우레아, 에브셀렌, EUK-8, FeTMTPyP, FETPPS, 글루코코르티코이드, 글루타치온, MnTBAP, MnTMPyP, 셀레노메티오닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, PEG-슈퍼옥사이드 디스무타제, 탁시포린, 및 비타민 E를 들 수 있다. 본 발명의 몇개의 다른 구체예서는, 2종 이상의 안티 ROS제를 조합하여 사용된다. 바람직한 안티 ROS제는 N-아세틸시스테인(MUCOSILTM, Dey, Napa, CA)이며, 이것은 종래의 분무기를 사용하여 에로로졸 미스트로서 흡입하기에 적합한 멸균 용액(10% 또는 20%)으로 입수 가능하다.
또한 약간의 안티 ROS제는 퍼옥시니트라이트(NO와 슈퍼옥사이드의 반응에 의하여 제조되는 독성 반응성 질소종)를 제거한다. 반응성 질소종을 제거하면, NO 흡입 관련 HPV의 약화 및 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지할 있다.
안티 ROS제의 투여량과 투여 방법은 사용하는 안티 ROS제에 따라 다르다. 다양한 안티 ROS제의 안정하고 효과적인 투여량과 투여 방법은 공지되어 있다. Physician's Desk Reference(PDR), Clinical Pharmacology 2000, Gold Standard Multimedia(http://cp.gsm.com/fromcpo.asp), 또는 공급자의 포장 삽입물을 참조하시오.
바람직한 안티 ROS제는 N-아세틸시스테인이며, MUCOMYSTTM, MUCOSIL-10TM,및MUCOSIL-20TM으로 구입 가능하다. N-아세틸시스테인의 적합한 투여 방법은 구강, 직장, 분무 에어로졸, 및 정맥 주사를 들 수 있다. 초음파 또는 종래의 분무기가 N-아세틸시스테인을 투여하는데 사용할 수 있다. (N-아세틸시스테인은 철, 구리, 및 고무와 같은 물질과 반응하기 때문에, N-아세틸시스테인과 접촉하는 분무 장치의 부품은 플라스틱 또는 유리로 만들어 져야 한다.). N-아세틸시스테인(MUCOSILTM)을 위한 전형적 투여 섭생(regimens)은 다음을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다:
20시간 IV 섭생: 15분에 걸쳐 150mg/kg IV(D5W 200ml에 희석), 이어서 4시간에 걸쳐 50mg/kg IV(D5W 500ml에 희석), 그 후 16시간에 걸쳐 100mg/kg IV(D5W 1000ml에 희석).
48시간 IV 섭생: 1시간에 걸쳐 140mg/kg IV(D5W내 1:5로 희석), 이어서 4시간당 70mg/kg IV(D5W내 1:5로 희석)의 12 투여(전체 투여량 980 mg/kg)를 처음으로 개시한 후 4시간에 걸쳐 140mg/kg IV(D5W내 1:5로 희석). 이 48시간 섭생의 각각 투여는 1시간에 걸쳐 IV.
안면 마스크, 마우스피스 또는 기관을 사용한 분무: 성인 및 청소년: 6-8시간당 20% 용액 5~10ml, 또는 10% 용액 10~20ml. 어린이: 6-8시간당 20% 용액 3~5ml, 또는 10% 용액 6~10ml. 영아: 6-8시간당 20% 용액 1~2ml, 또는 10% 용액 2~4ml.
텐드 또는 croupette를 사용하는 분무: 성인 및 어린이: 짙은 미스트가 구비되기까지의 10%~20%의 충분한 용액 체적, 300ml 미만이 요구됨.
어린이를 위한 구강 또는 직장 투여: 10% 용액 5~30ml를 매일 3~6번(예: 10ml를 매일 4번).
안티 ROS제의 투여는 NO 흡입 개시와 함께 동시에 시작하는 것이 바람직하다.
류코트리엔 블록커
류코트리엔은 백혈구내에서 자연적으로 발생하는 생물학적 활성 화합물의 집합이다. 류코트리엔은 히스타민과 마찬가지로 알레르기 및 염증 반응을 일으킨다. 아라키돈산은 5-리프옥시게나제(5LO) 및 이 5LO 활성 단백질(FLAP)의 작용에 의하여, 류코트리엔 A4로 변환된다. 류코트리엔 A4는 신속하게 류코트리엔 B4(LTB4)와 류코트리엔 C4(LTC4)로 변환된다. 다음에, LTC4는 류코트리엔 D4(LTD4)와 류코트리엔 E4(LTE4)로 변환된다. 시스테인 류코트리엔이라고도 하는 LTC4,LTD4 및 LTE4는 CysLT1 및 CysLT2 수용체와 반응한다. 여기서 사용되는 "류코트리엔 블록커"란 (1) 류코트리엔 합성 경로에서 단계를 억제하는 화합물, 또는 (2) 류코트리엔 수용체 활성을 억제하는 화합물을 의미한다. 류코트리엔 블록커의 예로는 몬테루카스트(montelukast)(SINGULAIR(상품명); Merck; 선택적 구강 활성 류코트리엔 수용체 길항제), 자피루카스트(zafirukast)(ACCOLATE(상품명); AastraZeneca; 선택적 펩티드 류코트리엔 수용체 길항제), 질로이톤(zileuton) (ZYFLO(상품명);Abbott; 5LO의 구강 활성 억제제), 프란쿠라스트(prankulast), Mk-571, MK-591, MK-886, BAYx 1005, 신나루카스트(cinalukast), 포비루카스트에다민(pobilukast edamine), MK-679 및 ZD 2138을 들 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 2종 이상의 류코트리엔 블록커를 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 류코트리엔 블록커로는 선택적 구강 활성 류코트리엔 수용체 길항제인 몬테루카스트(montelukast)(SINGULAIR(상품명)); 류코트리엔 D4(LTD4) 및 류코트리엔 E4(LTE4)의 선택적 경쟁적 수용체 길항제인 자피루카스트(zafirukast) (ACCOLATE(상품명)); 5LO의 구강 활성 억제제인 질로이톤(zileuton) (ZYFLO(상품명))을 들 수 있다.
류코트리엔 블록커의 투여량과 투여 방법은 사용하는 류코트리엔 블록커에 따라 다르다. 다양한 류코트리엔 블록커의 안정하고 효과적인 투여량과 투여 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, Physician's Desk reference(PDR(상품명)) 또는 공급자의 포장 삽입물을 참조하라. 예를 들어, 성인의 바람직한 자피루카스트 (zafirukast)(ACCOLATE(상품명))의 투여량은, 타블렛 형태로 구강 섭취하여, 20mg씩 하루에 2번이다. 다른 예로, 성인의 바람직한 몬테루카스트(montelukast) (SINGULAIR(상품명))의 투여량은 타블렛 형태로 구강 섭취하여, 하루에 1번 10mg이다.
류코트리엔 블록커의 투여는 NO 흡입의 개시와 동시에 시작하는 것이 바람직하다. 류코트리엔 블록커 투여의 지속 기간은 사용한 류코트리엔 블록커 및 NO 흡입의 지속 기간에 따라 다르다.
폐질환
본 발명은 통상 NO 흡입 치료 동안에 효과적으로 이용할 수 있지만, 특히 급성 호흡 질환 증후군(ASDR)을 포함한 급성 폐질환이 있는 환자에게 산화를 향상시키는데 이용할 수 있다. 급성 폐질환의 예로는 폐감염(바이러스, 박테리아, 곰팡이) 확산; 흡출(예:위 내용물, 익사 직전의 물, 신생아의 대변); 독소 및 자극제(예: 염소 가스, NO2, 담배, 오존, 고농도 산소)의 흡입; 마약(예: 헤로인, 메타돈, 모르핀, 덱스트로프로폭시펜) 과복용 폐부종; 비마약 약물(예: 나이트로퓨란토인) 효과; 숙주 항원에 대한 면역 반응(예: Goodpaststure's 증후군, 전신 홍반성 낭창 ); 폐의 외부에서 개시된 과정에서의 전신 반응과 연관된 고혈압을 갖는 비흉부 충격("폐 충격)의 효과(그람 음성 폐혈증, 출혈성 췌장염, 양수 색전증, 지방 색전증); 및 폐 타박상, 폐 이식, 심장과 폐의 바이패스 폐질환, 및 폐절제 폐부종을 포함하는 충격후 폐질환을 들 수 있다.
약화 HPV
본 발명의 방법은 NO 흡입 관련 HPV의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는데 유용하다. HPV의 약화가 존재한다는 표시의 예로는 환자의 창백기에 의하여 나타날 수 있는 저(low) 혈액산화(저산소혈증), 산소 포화의 레벨 감소, 정신상태의 변화, 신경성 기능 장애, 호흡 곤란, 심박 급속증 및 고혈압을 들 수 있다. HPV의 약화가 존재하는 증상의 예로는 단호흡과 가슴통을 들 수 있다. HPV의 약화 또는 감소의 진단은 당업자에게 자명하다.
HPV의 약화 또는 감소의 위험에 있는 환자는 폐혈증을 가진 환자와 잠재적폐염증을 가진 환자를 들 수 있다. 폐염증은 폐렴 또는 급성 호흡 질환 증후군과 같은 상태에서 일어날 수 있다
NO 흡입에 대한 응답의 약화
본 발명의 방법은 NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는데 유용하다. NO에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실은 산화를 증가시키거나 또는 폐동맥압(PAP)을 감소시키는 NO의 무능력을 의미한다. PAP를 감소시키는 능력이 없다는 표시의 예로는 심장 출력 저감 및 우 가슴통을 들 수 있으며, 쇼크, 부종 및 전신 부종으로 나타난다.
NO 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실 위험이 있는 환자로는 폐혈증을 가진 환자와 잠재적 폐염증을 가진 환자를 들 수 있다. 폐염증은 폐렴 또는 급성 호흡 질환 증후군과 같은 상태에서 일어날 수 있다.
실시예 1: 안티 ROS제와 NO에 대한 폐혈관 응답의 약화
엔도톡신 감염 마우스에 의하여, 반응성 산소종과 반응성 질소종의 스캐빈저가 NO 흡입에 대한 폐혈관 응답의 약화를 방지함을 나타내는 실험적 증거를 얻었다. 이들 실험은 NOS2 결핍 마우스를 이용하여 실시하였는데, 여기서 NO 이외의 엔도톡신 유도 인자와 함께 NO 흡입이 NO 흡입에 대응하여 혈관 확장하는 폐혈관 구조의 능력을 약화시킨다. NO 흡입에 대한 응답을 U46619로 예비 수축된 단리 관류 마우스 폐에서 평가하였다. 폐의 단리전에 엔도톡신으로 16시간 처리한 야생형 마우스는 NO 흡입에 대한 응답을 약화시켰다(도 2a). 엔도톡신으로 처리된NOS2 결핍 마우스는 NO 흡입에 대한 응답을 약화시키지 않았다(도 2b). 폐 단리전에 20ppm NO에 16시간 노출된 양생형 마우스는 NO 흡입에 대한 응답을 약화시키지 않았다. 엔도톡신으로 처리되고 또한 20ppm NO에 16시간 노출된 NOS2 결핍 마우스는 NO 흡입에 대한 응답을 약화시켰다(도 3). 엔도톡신 대신에 사린을 수용하고 또한 20ppm NO에 16시간 노출된 NOS2 결핍 대조구 마우스는 NO 흡입에 대한 응답을 약화시키지 않았다. 엔도톡신으로 처리된 야생형 마우스에서, N-아세틸시스테인(도 5), 디메틸우레아, EUK8 및 카탈라제 등의 반응성 산소종 및 질소종의 스캐빈저는 NO 흡입에 대한 응답의 약화를 방지하였다. 에도톡신 감염 야생형 마우스에서, N-아세틸시스테인은 NO 흡입을 연장함에도 불구하고 NO 흡입에 대한 폐혈관 응답의 약화를 방지하였다(도 6).
도 5에 나타낸 실험 결과는, N-아세틸시스테인으로 처리한 엔도톡신 감염 야생형 마우스에서는 NO 흡입에 대한 응답이 유지됨을 나타내고 있다. 도 6에 나타낸 실험 결과는, N-아세틸시스테인의 보호 효과를 일으키는 메커니즘은 단순히 엔도톡신 유도 폐 NOS2 발현의 억제에 기인하는 것은 아니다.
방법과 물질
이들 연구는 Subcommittee for Research Animal Care of the Massachusetts General hospital에 의하여 승인되었다. 표 1에 열거한 바와 같이, 20-30g의 성숙한 수컷 마우스 78마리를 연구하고, 여기에 그 결과를 요약하였다. NOS2 결핍 마우스(MacMicking 들., 1995, cell 81:641-650)를 Dr.Carl Nathan에 의하여 준비하였다. 동일한 배경(F1 generation of the parental strains SV 129 and C57Black/6)의 마우스를 야생형 마우스(Hickey 들., 1997, FASWR J. 11:955-964)로써 이용하였다.
단리된, 관류하며, 통풍시킨 마우스의 폐 모델. 마우스를 펜토바비탈 소듐의 정맥 주사(체중당 200mg/kg)하여 죽이고 37℃ 물재킷 챔버(단리된 관류 폐 사이즈 1형 839; Hugo-sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germany)에 넣었다. 기관(trachea)을 단리하고 관을 삽입하고, 21% O2, 6% CO2, 73% N2로 체적 조정 통풍기(모델 687; Havard Appratus, south Natick, MA)를 사용하여 85breath/분의 통풍 속도, 2cm H2O 말단 호기압으로 폐를 통기하였다. 일호흡량은 각 연구를 통해 10cm H2O의 피크 흡기압을 제공하도록 조정하였다. 이 폐를 중앙 폐골절개(sternotomy)를 통하여 노출시키고, 결찰을 폐대동맥 흐름 트랙 둘레에 위치시켰다. 10IU 헤파린을 우심실에 의 주사한 후, 폐도맥을 우심실을 거쳐서 스테인레스스틸 투관(1mm ID)으로 투관시켰다. 폐정맥 유출액을 승모판을 가로질러 좌심실의 정단을 통하여 놓여진 스테인레스스틸 투관을 거쳐서 좌심방으로 배수하였다. 좌심방압을 2mmHg로 유지하였다. 폐를 37℃ 비순환 시스템에서 일정한 유속(50ml.kg body weight-1.min-1; Ismatec Reglo-Analogue roller pump; Laboratoriumstechnik GmbH, Wertheim-mondfeld, Germany)으로 관류하였다. 사용한 관류액은 1.26 mM CaCl2, 5.33 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.50 mM MgCl2, 0.41 mM MgSO4, 138.0 mM NaCl, 4.0 mM NaHCO3, 0.3 mM Na2HPO4, 및 5.6 mM 글루코스를 함유하는 Hank's Balanced Salt Solution(GibcoBRL, Grand Island, NY)이다. Holzmann 들., 1996, Am.J.Physiol.271:L981-L986에 기재되어 있는 바와 같이, 단리된, 관류한, 통기한 마우스 폐에, 폐부종을 방지하기 위하여, 보바인 혈청 알루민 5% 및 데스트란 5%(모두 Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo)를 상기 관류액에 첨가하였다. 프로스타글란딘과 NO 합성을 억제하기 위하여, 내인성 인도메타신 30mM(Sigma chemical Co.) 및 1mM L-NAME(Sigma chemical Co.)를 상기 관류액에 각각 첨가하였다. 소듐 바이카보네이트를 첨가하여 상기 관류액의 pH를 7.34-7.43으로 조정하였다.
폐가 지혈 또는 폐확장부전의 표시가 없이 균질한 백색 외관을 갖고, 또한 초기 10분 베이스라인 관류 기간의 두번째 5분 동안 10mmHg 미만의 안정된 관류압을 보인다면, 이 연구에 포함시켰다. 이들 2개의 기준을 이용하여, 연구 전에 각 그룹으로부터 폐 표본의 약 15%을 버렸다.
안흐름 투관과 바깥 흐름 투관의 측부에 각각 연결된 사린 충전 멤브레인압 트랜듀서(Argon, Athens, TX)를 거쳐서 폐동맥압(PAP)과 좌심방압을 측정하였다. Y 피이스(piece) 직전에 흡기 림(limb)에 연결된 시차 압력 트랜듀서(model MP-45-32-871; Validyne Engineering Corp., Northridge,CA)를 사용하여 통풍압(Paw)을 측정하였다. 압력 트랜듀서는 의료용 증폭기(Hewlett Packard 7754B, Andover, MA)에 연결되어 있고, 데이터는, 데이터 취득 시스템(DI-220; Dataq Instruments, Akron, OH)를 갖는 아날로그 디지털 인터페이스를 사용한 퍼스널 컴퓨터 상에 150Hz에서 기록되었다. 이 시스템은 각각의 실험전에 캘리브레이션 하였다.
NO 흡입을 위하여, NO 가스(질소내 800 또는 80ppm NO, Airco, Murray Hill, Nj)를 산소, 이산화탄소, 및 질소와 혼합(산소 블렌더: bird Corporation, Palm Springs, CA)하여, 최종 농도 즉 요구하는 NO농도인 21% O2, 6% CO2로 하였다. NO 및 NO의 높은 산화 상태(NOx; CLD 700AL; Eco Physics, Durnten, Switzerland), 산소(Hudson Ventronics Ddivision, Temecula, CA), 및 이산화탄소(Datex CO2모니터; Puritan-Bennett Corporation, Los Angeles, CA)농도를 연속적으로 모니터링 하였다.
리포 다당류 감염 후 NO 흡입에 대한 폐혈관 응답. 야생형 마우스와 NOS2 결핍 마우스에게, 단리 폐 관류전에 사린에 16시간 용해한 Escherichia coil 0111:B4 리포 다량류(LPS; Difco Laboratories, Detroit, Mi) 50mg/kg를 복강내 주사하였다. 이 시간 포인트는 마우스의 예비 연구에 의하여 선택하였다(Holzmann 들; 1996,Am.J.Physiol. 271: L981-L986). 미처리된 야생형 NOS2 결핍 마우스를 대조구로 사용하였다.
초기 10분 베이스라인 관류 기간 후, 폐활관 수축을 트롬보산A2 유사체 U-46619(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)의 연속 주입에 의하여 유도하였다. 상기 주입 속도는 5 또는 6 mmHg의 PAP에서 안정된 증가를 제공하기 위하여 조정되었다. 그 후, 폐에 0.4, 4 및 40ppm NO를 각각 5분 동안 연속적으로 통기하여, 흡입 NO에 대한 투여 응답 커브를 얻었다. 각각의 NO 통기 기간 후, 이 PAP를 예비 NO 상승 베이스라인까지 회복하였다. PAP가 NO 흡입의 중단후 5분에서 예비 NO값 ±10% 범위가 아니라면, U-46619 주입을 재조정하였다. 흡입 NO(△PAP)에 대한 혈관 확장 응답은 흡입된 NO(NO 흡입 5분 후의 PAP - PAP 예비 NO)에 의하여 생성된 PAP의 변화로서 U-46619에 의하여 유도된 PAP 증가(PAP 예비 NO-초기 베이스라인에서의 PAP)의 백분율로써 측정하였다.
흡입 NO에 대한 폐혈관 응답에서의 NO 노출의 효과. 마우스 4개 그룹에 20ppm NO로 16시간 호흡시켰다. NO 노출 전에, 야생형 마우스의 하나의 그룹과 NOS2 결핍 마우스의 하나의 그룹에 50mg/kg 리포 다당류를 복강내 주사하였다. 또한 리포 다당류의 수용 없이, 야생형 마우스 그룹과 NOS2 결핍 마우스 그룹을 NO 흡입에 노출시켰다. NO 노출 16시간 후, 폐를 단리하고 상기한 방법과 같이 관류하였다. 폐혈관 수축이 U-46619의 주입에 의하여 유도되었고, 0.4ppm, 4ppm, 40ppm NO에 대한 혈관 확장 응답을 측정하였다.
순환압 NO 노출 동안, 동물을 40-1 아크릴 챔버에 유지시켰다. 앞서 기술한 바와 같이(Steudel 들, 1998, 101:2468-2477), NO(질소내 10,000ppm NO; Airco, Murry Hill, NJ), 공기 및 산소의 매우 신선한 가스 유속에서, NO 및 NOx의 농도를 소다 석회를 사용하여 신중하게 조정하였다.
NOS2 결핍 마우스의 또 다른 2개의 그룹을 리포 다당류로 처리하고(50mg/kg 복강), 이어서 각각 0.2 ppm, 2ppm NO에 노출시켰다. 16시간 후, 0.4ppm, 4ppm, 및 40ppm 흡입 NO에 의하여 생성된 폐혈관 확장의 정도를 측정하여, 단리된 폐관류 연구를 실시하였다.
습윤 폐 대 건조 폐의 중량비. 각 실험의 말기에, 폐문(hilar) 구조를 제외하고, 양쪽 폐를 절개하고 칭량하고(습윤 중량), 그 후, 폐를 앞서 기술한 바와 같이(Holzmann 들., supra), 마이크로웨이브 오븐에서 60분간 건조하고, 다시 칭량하였다(건조 중량). 습윤 폐 대 건조 폐의 중량비는 습윤 중량을 건조 중량으로 나누어 계산하였다.
통계적 분석. 모든 데이터를 평균 ±표준 에러(SE)로서 표시하였다. 그룹을 비교하기 위하여, 분산의 2방향 분석을 실시하였다. 유의차가 분산 분석에 의하여 검출되었을 때, 계획된 비교를 위하여, 포스트 혹(post hoc) 최소 유의차 시험을 실시하였다(Statistica for Window; StatSoft, Inc., Tulsa, OK). 통계적 유의는 P값<0.05로 가정하였다.
결과
U46619의 주입에 의해 일정한 관류 흐름에서 PAP를 안정하게 증가시켰으며, 실험의 후반부에 U46619 주입을 중단한 후에는 복귀시킬 수 있었다. PAP를 5 또는 6mmHg 까지 증가시키는데 필요한 U46619의 투여량은 리포 다당류를 전처리 및 미처리한 야생형 마우스와 NOS2-결핍 마우스에서 차이가 나지 않는다.
리포 다당류를 복강내 주입한 마우스는 야생형 마우스 및 NOS2-결핍 마우스에서 유사한 정도의 입모(piloerection), 설사, 기면(lethargy)을 나타냈다. 리포 다당류 주입 16시간 후의 치사율은 약 15%였으며, 두 마우스 종간에 차이는 없었다.
NO 흡입에 대한 폐혈관 응답
NO의 흡입은 모든 군에서 투여량에 의존적인 방식으로 PAP를 감소시켰다.도 1은 미처리 야생형 마우스의 분리 관류시킨 폐에서, 폐동맥압(PAP; 관류압과 동일함)과 좌심방압(LAP)을 측정하는 통상의 실험 장치를 이용하여 PAP와 LAP를 측정한 추적도이다. 안정한 트롬복산 A2아날로그 U46619를 주입하여 PAP를 5 또는 6mmHg 까지 증가시켰다. 폐는 NO 가스 농도(0.4, 4.0 및 40ppm)를 변화시키면서 각각 5분간 통기시켰다. NO의 통기를 중단한 후, PAP가 이전 NO 농도로 되돌려지게 하였다. 이러한 결과는, 마우스의 분리 관류시킨 폐에서, 저농도의 NO 가스를 통기함에 의해 폐동맥압을 측정할 수 있고, 안정한 폐 혈관수축을 유발할 수 있으며, 폐 혈관수축을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
리포 다당류를 처리한 야생형 마우스의 분리 관류시킨 폐에서의 PAP는 미처리 동물에 비해, 0.4 및 4ppm 흡입된 NO에 응답하여 각각 79% 및 45% 이하로 감소하였다(P < 0.001; 도 2a). 40ppm에 대한 폐 혈관확장 응답은 이들 군간에 차이가 없었다. 미처리 NOS2-결핍 마우스에서의 흡입된 NO에 대한 응답은 미처리 야생형 마우스의 응답과 차이가 없었다. 이와 대조적으로, 리포 다당류를 처리한 NOS2-결핍 마우스에서 분리한 폐는 리포 다당류를 처리한 야생형 마우스의 폐보다 흡입된 NO에 대해 더 높은 혈관확장을 나타내었다(각각의 NO 투여량에서 P < 0.001; 도 2b). 또한, NO에 의해 유도되는 혈관확장은, 리포 다당류 미처리 NOS2-결핍 마우스 또는 야생형 마우스에 비해, 처리한 NOS2-결핍 마우스에서 증가되었다(각각의 NO 투여량에서 P < 0.05; 도2b).
도2a에 나타낸 데이터는, 엔도톡신 투여에 의해 야생마우스의 0.4 및 40ppm의 NO 통기에 응답한 폐맥관계 팽창 능력이 손상됨을 보여준다(*P< 0.001). 도2b에 나타낸 데이터는 엔도톡신 투여에 의해 흡입된 NO에 대한 폐혈관확장 응답이 손상되지않음을 보여준다. 오히려, 엔도톡신은 NOS2-결핍 마우스의 0.4, 4, 및 40ppm의 NO 통기에 응답한 폐맥관계 팽창 능력을 증대시켰다(†P<0.05). 흡입된 NO에 대한 폐혈관확장 응답은 엔도톡신 투여 야생형 마우스보다 엔도톡신 투여 NOS2-결핍 마우스에서 더 컸다(‡P<0.001).
NO 흡입 노출 후의 NO에 대한 폐혈관 응답
NO 흡입에 대한 응답저하 현상에서 분자 NO의 역할을 조사하기 위해서, 리포 다당류 처리 및 미처리한 NOS2-결핍 마우스와 야생형 마우스에게 16시간 동안 20ppm의 NO를 공기중에 공급하여 호흡시켰다. 사전 NO 흡입 노출은 미처리 야생형 마우스 혹은 NOS2-결핍 마우스로부터 분리한 관류된 폐에서 또는 리포 다당류 전처리 야생형 마우스에서 뒤이어서 흡입되는 NO에 대한 응답을 변경시키지 않았다. 이와 대조적으로, 16시간 동안 순환(ambient) NO에 노출시킨 리포 다당류 전처리 NOS2-결핍 마우스에서는 NO에 노출시키지 않은 리포 다당류 전처리 NOS2-결핍 마우스에 비해서 NO 흡입에 대한 폐혈관확장 응답이 감소하였다. 16시간 동안 20ppm의 순환 NO에 노출시킨 NOS2-결핍 마우스로부터 분리 관류시킨 폐에서, NO 흡입에 대한 뒤이은 혈관확장 응답은 0.4(ΔPAP-24±4% 대 -42±4%; P<0.05) 및 4ppm(ΔPAP-39±5% 대 -58±4%; P<0.01)의 NO에서는 리포 다당류를 전처리한 후에 손상되었으나(미처리 대조군과 비교), 40ppm(ΔPAP-55±3% 대 -62±5%; P=중요하지 않음;도3)의 NO에서는 손상되지 않았다. 사전에 NO 흡입 노출시키지 않은 동물과 유사하게, 리포 다당류 전처리 야생형 마우스에서는 폐관류 실험전에 16시간 동안 20ppm의 NO를 호흡시킨 미처리 야생형마우스에 비해, NO에 의해 유도되는 혈관확장이 감소되었다(도3).
지연된 NO 노출 후, 엔도톡신 투여 NOS2-결핍 마우스는 리포 다당류 미처리 NOS2-결핍 마우스보다 단기 흡입에 대해 더 낮게 응답하였다(*P < 0.05). 마찬가지로, 지연된 NO 노출 후, 리포 다당류 전처리 야생형 마우스는 리포 다당류 미처리 야생형 마우스에서 보다 단기 NO 흡입에 대해 더 낮게 응답하였다(*P < 0.05). 이러한 결과는 20ppm NO의 지연 호흡에 의해 미처리 야생형 또는 NOS2-결핍 마우스에서의 뒤이은 NO 통기에 대한 폐 혈관확장 응답이 손상되지 않음을 나타낸다. 이와 대조적으로, 20ppm NO의 지연 호흡에 의해, 엔도톡신 투여 NOS2-결핍 마우스에서는 뒤이은 NO 통기에 대한 폐 혈관확장 응답이 현저하게 손상되었다(도2b에 나타낸 데이터와 비교).
16시간 동안 NO를 저농도로 흡입시키는 것이 폐 관류동안 단기 NO 흡입에 대한 혈관반응성(vasoreactivity)을 손상시키는지 여부를 조사하기 위해, 리포 다당류 처리 NOS2-결핍 마우스를 0.2 및 2ppm NO 흡입에 노출시켰다. 리포 다당류 투여 후 16시간 동안 0.2ppm의 NO를 호흡하는 것은 NOS2-결핍 마우스에서의 단기 흡입 NO에 의한 뒤이은 반응성 저하를 일으키지 않았다. 그러나, 16시간 동안 2ppm을 호흡하는 것은, 대조구에서의 응답에 비해, 0.4ppm NO 흡입에 대한 혈관확장 응답을 감소시켰다(P < 0.05; 도4).
습윤폐와 건조폐의 중량비
폐부종의 부재는 관류후의 습윤폐와 건조폐의 중량비가 변하지 않음에 의해 확인되었다. 리포 다당류 전처리 야생형(습윤중량-건조중량:4.3±0.2)과 NOS2-결핍(4.8±0.1) 마우스, 또는 미처리 야생형(4.6±0.1)과 미처리 NOS2-결핍(4.6±0.1)마우스간에 차이는 없었다. 16시간 동안 NO 흡입 노출에 의해, 리포 다당류 전처리 야생형(4.9±0.1)과 NOS2-결핍(5.1±0.2) 마우스에서 또는 미처리 야생형(4.5±0.3)과 미처리 NOS2-결핍(4.8±0.1) 마우스에서의 습윤폐와 건조폐 중량비는 노출되지 않은 마우스와 비교하여, 변화가 없었다. 습윤폐와 건조폐의 중량비는 흡입된 NO에 대한 혈관확장 반응과 상관관계가 없었다.
N-아세틸시스테인의 효과
N-아세틸시스테인(NAC)을 사용하여 반응성 산소종을 제거함으로써 엔도톡신 투여 마우스에서의 NO 흡입에 대한 폐혈관확장 응답의 손상을 막을 수 있는지 여부를 조사하였다. 야생형 마우스에 표준 사린(saline) 또는 NAC(150mg/kg i.p.)를 투여한 직후, 및 3.5시간 후에 엔도톡신(E.coli 011: B4-LPS, 50mg/kg i.p.)을 처리하였다(n=5). NAC를 처리한 부가 엔도톡신 투여 마우스는 16시간 동안 20ppm의 NO를 호흡시켰다.
엔도톡신 투여 후 마우스 폐를 분리, 관류, 및 16시간 통기시켰다. 마우스 유래의 폐에는 사린(saline)만 처리하고 호흡 실내 공기를 대조구(n=10)로서 이용하였다. U46619로 폐 혈관수축을 유도한 다음, 흡입에 의한 0.4, 4.0 및 40ppmNO에 대한 혈관확장 응답을 측정하였다. 엔도톡신 투여 마우스에서, 0.4, 4.0 및 40ppm NO에 대해 응답한 혈관확장은 대조구 마우스에 비해, 각각 32±13%, 43±10%, 및 53±8%였다(P < 0.001 대 대조구)(도6). 이와 대조적으로, NAC 처리한 엔도톡신 투여 마우스에서의 NO 흡입에 대한 혈관확장 응답은 각각 75±14%, 103±15%, 및 91±7%로 대조구 마우스와 차이가 없었다(P < 0.001 대 LPS)(도6). 또한 20ppm의 NO에 노출시킨 엔도톡신을 처리한 NAC처리 마우스에서, NO 흡입에 대한 응답은 보존되었다. 이것은 NAC가 엔도톡신에 의해 유도되는 폐의 NO 농도 증가를 방지함으로써 급성 NO 흡입에 대한 응답을 보존하지 않음을 의미한다. 이러한 결과는 엔도톡신에 의해 유도되는 NO 흡입에 대한 응답의 손상을 방지에 대한 NAC의 유효성을 나타낸다.
실시예 2: HPV 및 활성 산소종의 스캐빈저
반응성 산소종의 스캐빈저가 엔도톡신이 투여된 마이스에서 HPV의 약화를 방지한다는 것을 입증하는 실험적 증거를 얻었다. HPV의 엔도톡신 유도 약화에서 NOS2 역할을 조사하기 위하여, 야생형 마이스 및 선천성 NOS2 결핍 마이스에서 좌측 주류 기관지 폐색(LMBO) 이후 폐혈류 (pulmonary blood flow)를 재분배할 수 있는 능력을 비교하였다. 이 실험에서 쥐과의 LMBO 모델을 개발하였다. 이는 약화되지 않은 마이스에서 HPV에 대한 엔도톡신의 역할을 평가할 수 있게 한다.
도 7에서 나타낸 결과는 총 폐혈류에 대한 좌폐혈류 비율(QLPA/QPA 비율)의 음의 변화에 반영된 바와 같이 LMBO가 저산소 좌폐로부터 멀어지는 폐혈류의 재분배를 가져온다는 것을 나타낸다. 엔도톡신 투여는 야생형 마이스에서 LMBO 이후 폐혈류 재분배의 뚜렷한 감소를 가져오지만 (*P<0.05, 대조에 대한 엔도톡신) NOS2 결핍 마이스에서는 그렇지 않다 (P<0.01, 야생형 마이스에 대하여). L-NIL의 초기 투여는 LMBO 유도 폐혈류 재분배의 감소를 방지하였다 (#P<0.01 엔도톡신을 투여하고 L-NIL을 처리하지 않은 마이스에 대하여). 40 ppm NO의 지속 흡입 후, 엔도톡신을 처리한 NOS2 결핍 마이스는 엔도톡신을 투여한 야생형 마이스에서와 같은 동일한 HPV의 손실을 나타내었다 (§P<0.05 NO 미흡입에 대한 NO 흡입). 22시간 동안 40 ppm NO을 호흡한 사린을 투여한 NOS2 결핍 마이스 및 야생형 마이스는 NO 흡입을 중지하고 1시간 후 측정했을 때, LMBO 후 폐혈류를 재분배할 능력을 보유하였다. 이 결과는 엔도톡신 투여 후 HPV 약화에는 엔도톡신 유도 NOS2 발현으로 인하여 또는 NO 흡입으로 인하여 증가된 폐의 NO 레벨이 요구된다는 점을 보여준다. 그러나, 증가된 폐의 NO 레벨에 지속적인 노출만으로는 (NO 흡입을 중지하고 1시간 후 측정했을 때) HPV를 약화하기에 불충분하다.
LMBO에 대한 응답으로 좌폐혈관 저항, HPV의 측정치 증가량의 변화(△iLPV)에 대한 실험을 수행하였다. 엔도톡신이 투여된 야생형 마이스에서 HPV는 약화되었다 (도 8). 500 mg/kg의 N-아세틸시스테인이 처리된 엔도톡신 투여 마이스에서 HPV는 보존되었으나, 150 mg/kg이 처리된 마이스에서는 그렇지 않았다 (엔도톡신과 복강내 동시투여). 슈퍼옥사이드, 하이드로겐퍼옥사이드 및 퍼옥시니트라이트 양쪽의 스캐빈저인 EUK-8이 처리된 엔도톡신 투여 마이스에서 완전히 보존되었다.
위의 실험으로부터 NOS2 결핍은 엔도톡신 유도 HPV의 약화으로부터 마이스를 보호한다는 것을 발견하였다. 또한 활성 산소종의 스캐빈저는 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 HPV의 약화를 방지한다는 것을 발견하였다 (도 8). 6행의 증거는 이와 같은 결론을 지지한다. (1) 야생형 마이스에서 LMBO는 좌폐에서 폐혈관 저항(PVR)을 증가시켰으나, 엔도톡신 투여 22시간 후 LMBO 유도 좌폐혈관수축은 약화되었다; (2) NO에 노출되지 않은 엔도톡신 투여 NOS2 결핍 마이스에서, LMBO 유도 좌폐혈관수축은 약화되지 않았다(도 7); (3) 22시간 동안 40 ppm NO에 노출된 엔도톡신 투여 NOS2 결핍 마이스에서, LMBO 유도 좌폐혈관수축은 약화되었다 (도 7); (4) 지속적인 NO 흡입만으로는 마이스에서 HPV를 약화하지 않았다; (5) N-아세틸시스테인 또는 EUK-8은 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 HPV의 약화를 방지하였다; 그리고 (6) N-아세틸시스테인으로 처리되고 22시간 동안 20 ppm NO에 노출된 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 HPV는 약화되지 않았다.
방법 및 물질
연구 동물 보호에 대한 매사추세츠 종합병원 소위원회의 협회 승인 후에, SV129와 C57BL/6의 잡종 배경을 가진 NOS2 결핍 마이스 (MacMicking 들, 1995,세포81:641-650)(뉴욕주 뉴욕 소재 코넬대의 C. Nathan에 의해 제공된) 외에, SV129/B6F1 야생형 마이스 (SV129 및 C57BL/6 마이스의 F1-세대손) 및 SV129 야생형 마이스 (Jackson 연구소, 미국 메인주 Bar Harbor 소재)를 조사하였다. 보조 연구에서, NOS2 결핍 마이스(18), C57BL/6 배경으로 10세대 역교배(C57BL/6-Nos2tmlLau, N10-역교배 세대; Jackson 연구소) 및 야생형 C57BL/6을 조사하였다.
동물의 나이, 몸무게 및 성별이 대등한 실험 그룹들이 사용되었다. 나이가 2-5개월이고, 무게가 18-30g인 수컷 및 암컷 마이스를 조사하였다.
그룹 1:대조. SV129/B6F1 야생형 마이스(n=5), SV129 야생형 마이스(n=7) 및 NOS2 결핍 마이스(n=7)가 0.2 mL 사린의 복강내 주사를 받았으며 22시간 후에 조사하였다.
그룹 2:엔도톡신 처리. SV129/B6F1 야생형 마이스(n=5), SV129 야생형 마이스(n=6) 및 NOS2 결핍 마이스(n=6)에 0.2 mL 사린에 용해된 10 mg/kg 대장균 011B4 엔도톡신의 복강내 주사하고 22시간 후에 조사하였다. 또한, C57BL/6 야생형 마이스(n=7) 및 C57BL/6-Nos2tmlLau(n=5)에 0.2 mL 사린에 용해된 10 mg/kg 엔도톡신의 복강내 주사하고 22시간 후에 조사하였다.
그룹 3:엔도톡신 처리된 +L-NIL. SV129/B6F1 야생형 마이스(n=5)에 0.2 mL 사린에 용해된 10 mg/kg 대장균 011B4 엔도톡신을 복강내 주사하였다. 상기 엔도톡신 투여 3시간 후에, 마이스를 L-NIL 5 mg/kg으로 복강내 처리하였다. 조사는 엔도톡신 투여 22시간 후에 수행하였다. 이전에 엔도톡신을 투여(n=5) 및 투여하지 않은(n=4) (22시간 전에) 추가 SV129/B6F1 마이스에서, LMBO 동안 5 mg/kg L-NIL의 정맥내 볼루스 투여에 대한 급성 반응을 조사하였다.
그룹 4:4 또는 40 ppm NO에 지속적인 노출. 사린이 처리된 SV129 야생형 마이스(n=5) 및 22시간 동안 공기중의 40 ppm NO를 호흡한 NOS2 결핍 마이스(n=5) 를 NO 흡입 중지 1시간 후 조사하였다. SV129 야생형 마이스(n=5) 및 10 mg/kg 엔도톡신을 복강내 투여후 22시간 동안 공기중의 40 ppm NO를 호흡한 NOS2 결핍 마이스(n=5)를 NO 흡입 중지 1시간 후 조사하였다. 10 mg/kg 엔도톡신을 복강내 투여후 22시간 동안 공기중의 4 ppm NO를 호흡한 NOS2 결핍 마이스(n=4)를 NO 흡입 중지 1시간 후 조사하였다.
그룹 5:연속 PaO₂ 및 PvO₂측정. SV129/B6F1 야생형 마이스(n=3) 및 10 mg/kg 엔도톡신을 복강내 투여후 22시간 NOS2 결핍 마이스(n=3)에서 LMBO 이전 및 기간에 PaO₂를 연속 평가하였다. SV129/B6F1 야생형 마이스(n=4) 및 10 mg/kg 엔도톡신을 복강내 투여후 22시간 NOS2 결핍 마이스(n=4)에서 LMBO 이전 및 기간에 PaO₂를 연속 평가하였다. 사린이 처리된 SV129 야생형 마이스에서, 이전의 엔도톡신 투여 없이, 제어 상태 하에서 LMBO 이전 및 기간에 PaO₂(n=4) 및 PvO₂(n=4)를 조사하였다.
그룹 6:정맥내 안지오텐신 II의 증가 복용에 대한 폐혈관 반응. 엔도톡신(n=5) 또는 사린(n=3)이 처리된 SV129/B6F1 야생형 마이스를 투여 22시간 후 조사하였다.
실험 준비. 케타민(ketamine)(0.1 mg/g 체중[bw])의 복강내 주사로 마이스를 마취하였다. 기관 절개 및 동맥 카테테르법이 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Steudel 들, 1997,Circ. Res.81:34-41). 2 French Fogarty 동맥 색전 카테테르(Baxter Healthcare Corp., Irvine, California, USA)와 결합된 주문품인 기관내 튜브(22G Angiocath; Becton Dickinson Healthcare Systems, Sandy, Utah, USA)를 기관 내에 최초에 남아있는 Fogarty 카테테르의 풍선 팁과 함께, 기관 내로 삽입하였다. 체적 제어 통풍이 분당 110-120 호흡의 호흡률로, FiO₂1.0, 13 cm H2O의 첨두 흡기압, 및 2-3 cm H2O의 양의 종단-흡기압 레벨에서 개시되었다. 우측복늑골의 개흉술을 수행하였고, 소혈관 초음파 유속 프로브(1RB; Transonic Instruments, Ithaca, NY)가 우폐동맥 주위에 위치하고 현미해부기(X-tra Hand; TechniTool, Plymouth, PA)를 이용하여 위치가 고정되었다. 4-0 견사제가 잠정적 혈관 폐색을 위하여 좌측 주폐동맥 주위에 위치하게 하였다. 폐동맥 카테테르(PE10)가 직접 천공에 의하여 주폐동맥 내로 삽입되었다. 다른 실험에서, 하부 가슴대동맥 유속 프로브를 상기 보고한 바와 같이 위치하게 하였다 (Steudel 외, 상동).
일부 연구에서, 우측 중간엽 유출 폐정맥이 30G 니들로 천공되고, PE10 튜빙에 연결되고, 좌심방 압력 (PLA)을 평가하기 위하여 마이크로클립으로 고정되었다. 대동맥에서의 부분 산소압 (PaO₂)을 측정하기 위해, 유연성 폴라로그래피 Clark형 PO₂전극 (LOCOX A3-Revoxode, 1.5 Fr.; GMS-Gesellschaft fuer medizinische Sondentechnik, Kiel, Germany)이 목동맥을 통해 대동맥궁 내로 삽입되었다. 폐동맥에서의 부분 산소압 (PvO₂)을 측정하기 위해, 우심실 유출로가 천공되었으며, 산소 전극이 상기 폐동맥 내로 삽입되었다. 전극들은 테스트 프로브 배럴을 이용하여 주위압력의 공기 중에서 각각의 실험 전후에 교정하였다. 마취는 복강내 케타민(ketamine) (0.1 mg/g bw)으로 유지되었으며 근육이완을 만들기 위해 복강내 판크로늄(pancuronium) (0.002 mg/g bw)의 크라진(xylazine) (0.01 mg/g bw) 주사가 추가되었다.
혈류 및 혈압 측정. 일부 연구에서, 평균 전신 동맥압 (PSA), 평균 폐동맥압 (PPA)을 생체용 증폭기 (Hewlett Packard 8805C, Palo Alto; Siemens Sirecust960, Danvers, MA)를 이용해 연속적으로 측정하였다. 평균 하단 가슴 대동맥 흐름 (QLTAF) 및 우 폐동맥 흐름 (QRPA)을 유량계 (T106; Transonic Instruments)에 연결된 소형 혈관 유속 프로브로 측정하였다. 일부 실험에서는, 좌심실의 종단-확장압(end-diastolic pressure)을 1.4 Fr. Millar 카테테르로 측정하였다. 상기 카테테르는 좌심실 내로 우측 목동맥을 통해 삽입되었다. 모든 측정 신호는 아날로그-디지털 변환기로 전달되어 컴퓨터 화면에 표시되고, 데이터 수집 시스템 (DI 220; Dataq Instruments, Akron, OH)을 이용해 개인용 컴퓨터에 640 Hz로 기록되었다. 모든 모니터링 장비는 매 실험 전에 교정되었다.
좌폐동맥 및 우폐동맥 흐름의 차동 측정. 총 폐동맥 흐름 (QPA)에 대한 QRPA 및 좌폐동맥 흐름(QLPA)의 기여도를 평가하기 위해, 좌폐동맥의 잠정적 폐색 (90초)을 수행하였다. 급성 좌폐동맥 폐색 기간의 QRPA는 QPA (즉, 심박출량)로 간주되었으며 QLTAF와 근사한 (r2 = 0.88; y = 0.95x + 0.38; n = 9) 상관관계를 보였다. QLPA는 좌폐동맥 폐색 (QPA) 기간의 QRPA와 열린 좌폐동맥의 QRPA 간의 차이로 계산되었다 (QLPA = QPA - QRPA). 개별 흐름의 절대값이 기록되었으며, 좌측 및 우측 폐에 대한 흐름의 분별분포 (QRPA/QPA 및 QLPA/QPA)가 계산되었다.
하부 가슴대동맥에서 측정할 때 혈류 (blood flow)는 상부 말단 및 머리 부위에서 상실됨으로 QPA는 좌폐동맥 (QLPA)의 잠정적 폐색 기간에 QRPA의 측정으로 평가된다. 또한, 두 번째 유속 프로브의 추가는 오차의 가능성을 증가시키고, 마우스의 작은 크기로 인하여 동물에 대한 외과적 외상 및 스트레스를 증가시킨다.
단방향 폐포 저산소증. 국부적 (즉, 좌폐) 폐포 저산소증을 유도하기 위하여, 좌측 주류 기관지는 상기 좌측 주류 기관지 내로 Fogarty 카테테르를 삽입하고 시각적인 제어 하에서 풍선 팁을 부풀려서 가역으로 폐색되었다. 좌폐의 완전한 허탈이 약 1분 내로 시각적으로 관찰되었으며 우폐의 잠정적 과도주입에 의해 확인되었다. 일부 실험에서, 허탈한 좌폐는 30 cm H2O의 첨두 기도압(peak airway pressure)에 대하여 N2내의 5% CO₂로 재주입되었다. QLPA를 LMBO 이전 및 5분 후에 측정하였다.
안지오텐신 II의 주입. 무균 정상 사린에 용해된 안지오텐신 II 복용의 증가(분당 0.05, 0.5 및 5.0 ng/g bw)가 주입 펌프 (Pump 11; Harvard Apparatus Co., South Natick, MA)를 사용해 중앙 정맥 카테테르를 통해 주입되었다. PLA, PPA, PSA 및 QLTAF는 연속적으로 측정되었다.
보조 NO로 호흡. 마이스를 특별한 구조의 챔버 (Steudel 외, 상동)에 가두고 흡기 혼합물에 추가된 40 ppm NO로 0.21의 흡입 산소 분획 (FiO₂)에서 22시간 동안 무의식적으로 호흡하게 하였다. 노출 후, 마이스는 챔버에서 나오고 마취를 유도하는 동안 공기를 호흡하게 하였다. 상기 챔버에서 나온지 60분 후에 혈류 역학 측정값을 얻었다. 측정하는 동안, 동물들은 보조 NO 없이 FiO₂1.0에서 기계적으로 환기하였다.
폐혈류 측정의 확인. 사린이 처리된 야생형 마이스 (n=5)에서 형광 라벨의 마이크로스피어 (Glenny 외, 1993,Appl. Physiol.74:2585-2597)의 정맥내 주사를 이용한 부분적인 폐혈류 분포의 동시 측정값을 이미 여기 기술한 바와 같이 초음파 프로브를 이용한 측정값과 비교하였다. LMBO 이전, 응집을 방지하기 위하여0.05% Tween-80 계면활성제를 포함한 0.2mL 사린 내에 일시 정지된, 50,000 색의 마이크로스피어 (15-㎛ NuFlow Spheres; Interactive Medical Technologies Ltd., West Los Angeles, CA)는 와류되고, 그 다음 즉시 목정맥 배관을 통해 (30초 이상) 주입된다. 주입 완료 후, 상기 카테테르는 0.1 mL 사린으로 플러시된다. LMBO 5분 후에, 마이크로스피어 주입은 다른 색의 마이크로스피어를 이용하여 반복된다. 동물들이 희생되고, 그 폐들을 거두어 각각 무게를 잰다. 조직 샘플은 흐름 세포계수 분석을 이용한 마이크로스피어 총수를 위하여 분석된다. 좌측 또는 우측 폐에 대하여 폐혈류의 분획은 양쪽 폐의 총 구면에 대한 좌측 또는 우측 폐에 대한 총 구면으로 계산되었다.
추가로 사린이 처리된 야생형 마이스 (n=6)에서, 폐혈류의 LMBO 유도 재분배가 좌폐혈관 저항의 증가에 의하여 반영되었음을 확인하기 위하여, 하대정맥의 잠정적 폐색 기간 동안 직접 QLPA를 측정하였으며 좌폐동맥압-흐름 관계의 기울기 및 절편를 계산하였다.
폐 습윤/건조 비율. 펜토바비탈 (0.1mg/g 복강내)로 안락사 후에, hilar 구조를 제외한 양쪽 폐는 잘라내어 없애고 즉시 무게를 측정하였다. 이후로, 상기 조직은 60분 동안 마이크로오븐에서 건조되고, 위에 기술한 바와 같이 (20), 무게를 재측정하였다. 폐 습윤/건조 비율을 계산하였다.
통계 분석. 폐혈류의 변화는 기준 혈류의 퍼센트 감소로 표현된다. 그룹간의 차이는 2-way ANOVA를 이용해 결정된다. ANOVA에 의하여 큰 차이점이 발견되면, 그 이후에 Fisher 테스트를 사용한다 (Statistica for Windows; StatSoftInc., Tulsa, OK). 0.05 보다 작은 P값은 큰 차이를 나타낸 것이다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로 표현된다.
실험결과
폐혈류에 대한 단방향 폐포 저산소증의 효과.생체에서의 HPV를 평가하기 위하여, 쥐과의 모델을 개발하여 차등 폐혈류 측정값을 좌폐 단방향 폐포 저산소증 이전 및 그 기간에 얻었다 (도 9A-9C). 우측 주류 기관지의 폐색이 심각한 저산소혈증 및 혈류 역학 불안정을 초래하므로, 좌측 주류 기관지 (LMBO)의 폐색을 선택하여 단방향 폐허탈의 안정 모델을 만들었다. 차등 폐혈류를 우폐동맥 주위에 위치한 초음파 유속 프로브를 이용해 개흉술에서 측정하였으며, 좌측 및 우측 폐간의 흐름 분포는 좌폐동맥을 잠정적으로 폐색하여 평가하였다 (도 9a-9c).
도 9a-9c는 잠정적인 좌폐동맥 폐색인 상태 및 아닌 상태에서 LMBO 이전 (도 9a), LMBO 개시 (도 9b) 및 LMBO 5분 후에 (도 9c) 폐 및 전신 혈류 역학 측정값의 대표적 트레이싱을 나타낸 것이다. 좌폐동맥 흐름의 잠정적 폐색은 아무런 전신 혈류 역학 효과를 만들지 않았다 (도 9a). 총 폐 허탈이 LMBO 약 1분 후에 발생하였다. LMBO 기준선 및 이후의 사린 처리된 야생형 마우스에서 우폐동맥을 통한 평균 흐름 (PRPA), 평균 폐동맥압 (PPA), 평균 전신 동맥압 (PSA), 및 평균 기도압 (PALV)의 온라인 기록을 나타낸다. 우측 및 좌측 폐동맥간 혈류 분포를 평가하기 위하여, 좌폐동맥을 QRPA=QPA 지점에서 잠정적으로 폐색하였다 (도 9a 및 도 9c 참조). QPA와 QRPA의 차이는 QLPA와 같다. 측정값은 기준선에서 그리고 LMBO 5분 후에 취하였다. 화살표는 좌폐동맥의 폐색 (90초) 및 해제를 나타낸다. 이 대표적인 트레이싱은 마우스의 생체에서 폐혈류 분포를 측정할 능력을 강조한다.
도 10a-10c는 마우스에서 폐혈류 측정 방법을 확인하기 위해 사용되는 실험적 근사값을 나타낸 것이다. 도 10a는 형광 마이크로스피어 (지름 15㎛)의 정맥내 주입 및 초음파 유속 프로브로 QRPA의 동시 측정에 의하여 평가된 좌측 또는 우측 폐에 대한 퍼센트 폐혈류의 상관관계를 나타낸 것이다. 후자의 방법에서, 좌측 및 우측 폐동맥간의 차등 혈류 분포는 좌폐동맥의 잠정적 폐색에 의해 평가되었다. 값은 LMBO 이전 및 이후 (사린이 처리된 야생형 마이스; n=4) 우측 또는 좌측 폐에 대한 분할 흐름으로 나타난다. 상기 두 방법이 거의 일치하고 있음에 유의하라
(r²=0.967). 도 10b는 사린이 처리된 야생형 마이스(n=6)에서 LMBO 이전 (기준선) 및 5분 후의 좌폐 흐름-압에 대한 실험결과를 나타낸 것이다. LMBO에 의해 유도되는 좌폐혈관 저항의 증가분을 나타내는 기울기의 상당한 증가에 유의하라. 이 연구에서, 좌폐동맥 흐름 (QLPA)는 초음파 유속 프로브를 이용해 직접 측정되었으며, 그 기울기는 하대정맥의 잠정적인 폐색으로 QPA를 감소시킴으로 생성되었다 (P<0.05, 기울기는 베이스라인에 대하여 다름). 도 10C는 사린이 처리된 야생형 마이스(n=3)에서 허탈한 좌폐의 재확장 기간 동안 총 좌폐혈관 저항 (TLPVR)에서의 변화를 예시한 것이다. 좌폐는 30cm H2O의 첨두 흡기압까지 N₂에서의 5% CO₂를 연속 주입하여 팽창하였다. 값은 각각 95% 신뢰구간으로 모든 데이터 포인트를 선형회귀하여 나타낸다. 이 결과는 LMBO 후 폐혈류의 재배치는 저산소증에 기여하고 좌폐 허탈에는 기여하지 않음을 예시하였다.
LMBO 이전, 혈류 역학 파라미터는 야생형 마이스와 NOS2 결핍 마이스간에 차이가 없었다. LMBO 5분 후, QLPA/QPA는 사린이 처리된 야생형 마이스에서 46 ±5% 그리고 사린이 처리된 NOS2 결핍 마이스에서 50 ±7% 만큼 감소하였다 (도 7). 좌폐동맥 부근에 유속 프로브를 이용하여 직접 QLPA를 측정하는 보조 연구에서, LMBO 유도 폐혈류 재배치는 좌폐혈관 저항을 102 ±18 mmHgㆍminㆍgㆍmL에서 210±18 mmHgㆍminㆍgㆍmL으로 증가함으로 반영된다는 점을 발견하였다 (도 10B). LMBO 유도 폐혈류 재배치는 허탈된 폐가 N2에서의 5% CO₂로 직시 (direct vision)하에서 정상 폐체적으로 재팽창되었을 때 좌폐혈관 저항 (LPVR)이 변화하지 않았기 때문에, 좌폐 허탈과 연관된 기계적 요인에 기여할 수 없었다 (n=3; 도 10C).
단방향 폐포 저산소증 기간의 폐 및 전신 혈류 역학에 대한 내독혈증의 효과. 10 mg/kg 대장균 엔도톡신의 복강내 주입으로 투여 후, 마이스는 필로이렉션 및 설사로 혼수상태가 되었다. 대략 50%의 마이스가 엔도톡신 투여 1주일 후 죽었으며, 야생형 및 NOS2 결핍 마이스 간의 치사율에는 차이가 없었다 (데이터를 나타내지 않음). LMBO 이전, 혈류 역학 파라미터는 사린이 처리된 마이스 및 엔도톡신이 처리된 마이스 간에 차이가 없었으나 (도 12), QPA는 그 차이가 통계상 중요하지는 않았지만, NOS2 결핍 마이스에서 보다 엔도톡신 처리된 마이스에서 더 높은 경향이 있었다 (230 ±35 vs. 120 ±32 uLㆍminㆍgㆍbw). 모든 연구에서 엔도톡신 투여 야생형 및 NOS2 결핍 마이스에 대한 QPA의 비교는 상기 두 유전자형간에 차이가 없음을 확증한다 (야생형 마이스 180 ±20uL/min per gram; NOS2 결핍 마이스 140 ±15ul/min per gram; n=21 및 15, 각각). QPA의 차이는 잠재적으로 폐혈류 재배치에 영향을 미칠 수 있으므로, QLPA/QPA의 변화가 QPA의 변화에 의존하는지의 여부를 실험하였다. 선형회귀 분석은 LMBO 동안 QPA와 QLPA/QPA간에 아무런 상관관계가 없음을 나타낸다 (r2=0.03, 모든 마이스에 대하여 및 모든 엔도톡신 처리 마이스에 대하여 양쪽 다 (P<0.001; 도 7). LMBO 이후, QLPA/QPA는 사린 처리된 야생형 마이스에서 46 ±5%, 그리고 엔도톡신 처리 야생형 마이스에서 18 ±5% 감소하였다. 대조적으로, LMBO는 사린 처리 NOS2 결핍 마이스에서 QLPA/QPA를 50 ±5%, 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스에서 51 ±6% 감소하였다 (도 7). SV129, SV129B6F1, 또는 C57BL/6 야생형 계통간에, 또는 SV129/B6F1 혼혈 배경의 NOS2 결핍 마이스 및 C57BL/6 배경에 대하여 10대를 역교배한 NOS2 결핍 마이스간에 엔도톡신에 대한 반응에서 차이는 없었다 (데이터를 나타내지 않음).
단방향 폐포 저산소증 기간의 PaO₂및 PvO₂에 대한 내독혈증의 효과. 엔도톡신 투여후 야생형 및 NOS2 결핍 마이스에서 주목되는 LMBO 유도 폐혈류 재배치의 차이가 동맥 산소첨가에서의 LMBO 유도 변화의 차이에 의해 반영되는지의 여부를 결정하기 위하여, PaO₂를 LMBO 이전 및 그 기간에 연속적으로 측정하였다. 각각의 엔도톡신 처리 야생형 및 NOS2 결핍 마이스에서, PvO₂에 대한 LMBO 의 효과가 또한 평가되었다. FiO₂ 1.0에서 호흡하는 사린 처리 야생형 마이스 (n=4)에서, 5분 동안의 LMBO는 PaO₂를 432 ±7 mmHg에서 225 ±13 mmHg로 감소하였다. PaO₂는 엔도톡신 처리 야생형 마이스에서 342 342 ±13 mmHg이고 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스에서 342 ±33 mmHg이었다. LMBO 5분 후, 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스 (230 ±18 mmHg; P<0.05; 도 11)에서 보다 엔도톡신 처리 야생형 마이스 (145 ±9 mmHg)에서 더 감소하였다.
PvO₂는 엔도톡신 처리 야생형 마이스 및 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스에서 차이가 없었다 (LMBO 이전: 각각 39 ± 5 및 44 ± 8 mmHg; LMBO 이후: 각각 34 ± 4 및 43 ± 7 mmHg; 양쪽 그룹에 대하여 n=3).
NOS2 활동의 지속적인 약리학적 억제. NOS2의 지속적인 약리학적 억제가 HPV를 보존하는지의 여부를 결정하기 위해, 야생형 마이스 (n=5)에 10 mg/kg 엔도톡신을 복강내 주입하였으며, 3시간 후에 NOS2 활동의 선택적 억제제인 L-NIL (5 mg/kg 복강내)으로 처리하였다. L-NIL의 복용은 엔도톡신 투여 7시간 후 야생형 마이스에서 cGMP 레벨의 증가를 방지하기에 충분하였다 (데이터를 나타내지 않았음). 폐혈류 연구는 엔도톡신 투여 22시간 후 수행되었다. L-NIL 처리된 엔도톡신 노출 마이스에서, 사린 처리 또는 엔도톡신 처리 야생형 마이스와 비교하여, LMBO 이전의 전신 및 폐 혈류 역학의 변화는 측정되지 않았다. QLPA/QPA의 감소는 엔도톡신만을 주입받은 야생형 마이스에서 보다 L-NIL 처리된 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 더 컸다 (53 ±10% vs. 18 ±5%; P<0.01; 도 7).
L-NIL로 NOS2의 급성 약리학적 억제. NOS2 효소 활동의 급성 억제가 LMBO 기간에 HPV를 증가하는지의 여부를 결정하기 위해, LMBO 이후 L-NIL (5 mg/kg 복강내)이 투여되는 동안 사린 처리 및 엔도톡신 처리 야생형 마이스에서 폐혈류 연구를 수행하였다. 사린 처리 야생형 마이스 (n=5)에서, 급성 L-NIL 투여는 LMBO 기간 동안 QLPA/QPA를 더 감소하지 않았다 (L-NIL 이전 49 ±3%; L-NIL 이후 56 ±3%). 모든 다른 혈류 역학 파라미터는 L-NIL 주입 후 변하지 않았다. 22시간 전에 엔도톡신이 처리된 야생형 마이스에서 (n=4), 급성 L-NIL 투여는 LMBO 기간동안 QLPA/QPA를 더 감소하지 않았다 (L-NIL 이전 22 ±11% 감소; L-NIL 이후 24 ±18% 감소).
4 또는 40 ppm NO의 지속 흡입. 다른 NOS2 제품이 아니라 NO의 증가된 폐 레벨이 HPV의 엔도톡신 유도 약화에 기여하는지를 알아보기 위하여, 사린 처리 및 엔도톡신 투여 야생형 및 NOS2 결핍 마이스가 공기 중에서 22시간 동안 40 ppm NO를 호흡하였다. 1시간 후에 혈류 역학 연구를 수행하여, 잠재적인 혈관확장 활동이 흡입한 NO를 발산하기 위한 충분한 시간을 허용하였다. 22시간 동안 40 ppm NO의 흡입은 사린 처리 야생형 마이스 및 NOS2 결핍 마이스에서 HPV를 약화하지 않았다. LMBO 이후 QLPA/QPA의 감소는 사린 처리 야생형 마이스에서 51 ±10%, 그리고 22시간 동안 40 ppm NO를 호흡한 후 사린이 처리된 NOS2 결핍 마이스에서 50 ±11%이었다 (도 7). 심장 박동수에서 약간의 변화 이외에, 22시간 동안 40 ppm NO의 지속적인 흡입에 노출된 엔도톡신 처리 및 사린 처리 마이스 간에 LMBO 이전 혈류 역학에는 아무런 다른 차이점를 발견할 수 없었다 (도 12). 40 ppm NO의 지속적인 흡입 후, 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스는 보조 NO를 호흡하지 않은 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스와 비교하여 HPV의 뚜렷한 저하를 나타내었다 (QLPA/QPAdml 감소: 각각 20 ±7% vs. 50 ±11%; P<0.05; 도 7). 대조적으로, 연장된 NO 흡입은 야생형 마이스에서 HPV의 엔도톡신 유도 약화에 영향을 주지 않았다 (QLPA/QPA의 감소: 22시간 동안 40 ppm NO를 호흡한 엔도톡신 처리 야생형 마이스에서 19 ±10%; NO에 노출되지 않은 엔도톡신 처리 야생형 마이스에서 18 ±5%; 도 7). 대조적으로, 22시간 동안 40 ppm NO의 호흡은 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스에서HPV를 약화하지 않았다 (QLPA/QPAdml 감소: 62 ±2%; n=4).
안지오텐신 II에 대한 폐의 혈관반응. HPV에 대한 엔도톡신의 영향이 폐혈관 수축 기능에 대한 엔도톡신의 비특이성 효과에 기여할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 사린 처리 야생형 마이스 및 엔도톡신 투여후 22시간 야생형 마이스에서 안지오텐신 II의 내정맥 복용 증가에 대한 폐의 혈관수축 반응을 측정하였다. PVR은 사린 처리 야생형 마이스에서 (P<0.01) 분당 5.0 ㎍/kg 안지오텐신 II에서 베이스라인의 74 ±24로부터 184 ±25 mmHgㆍminㆍgㆍmL로 그리고 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 (P<0.001) 55 ±11로부터 174 ±40 mmHgㆍminㆍgㆍmL로 증가하였다. 어떤 안지오텐신 II 복용 레벨에서도, 엔도톡신 처리 및 사린 처리 마이스의 PVR에는 차이가 없었다. 베이스라인에서의 PLA는 사린 처리 야생형 마이스 (6 ±1 mmHg)와 엔도톡신 처리 야생형 마이스 (5 ±1 mmHg)간에 차이가 없었으며, PLA는 양쪽 그룹에서 안지오텐신 II에 대한 반응으로 변하지 않았다.
폐 습윤/건조 중량비. 습윤/건조 중량비는 엔도톡신 투여 야생형 (습윤/건조 중량비: 5.0 ±0.5) 및 NOS2 결핍 마이스 (4.6 ± 0.2), 또는 사린 처리 야생형 (4.6 ± 0.1) 및 사린 처리 NOS2 결핍 마이스 (4.5 ±0.1) 간에 차이가 없었다. 22시간 동안 4 또는 40 ppm NO 호흡은 습윤/건조 중량비를 변화시키지 않았다.
요약 및 실험의 해석. 패혈증에서 HPV의 약화에 NO 및 NOS2의 역할을 조사하기 위하여, LMBO로 만들어진 단방향 폐포 저산소증에 대한 응답으로 폐혈류의 재배치를 평가하기 위한 생체내 마우스 모델을 개발하였다. 엔도톡신에 노출되지 않은 마이스에서, LMBO는 좌폐 PVR을 두배로 하여, 좌폐혈류 흐름의 50%를 우측 폐로전환하여 PaO₂의 약간의 감소를 일으켰다. 개흉술에서 초음파 유속 프로브를 이용하여 측정한 쥐과의 폐혈류 분포의 변화는 형광 마이크로스피어의 정맥내 주입을 이용하여 얻은 측정값과 근사한 상관관계를 가지며 (도 10A 참도) 큰 동물 (large animal) 모델을 연구한 연구자의 보고 내용과 유사하였다 (Domino 외, 1984,Anesthesiology60:562-566; Sprague 외, 1992,Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:8711-8715).
엔도톡신 투여 22시간 후 야생형 마이스에서, 국부적인 폐 저산소증에 대한 응답으로 폐혈류를 재배치하는 능력이 심각하게 약화되었으며, 전신 동맥 산소공급의 뚜렷한 저하를 가져왔다. 상기 마우스에서 이 엔도톡신으로 유도되는 폐혈류 재배치의 약화는 생 박테리아 (Fischer 외, 1997,Am. J. Respir. Crit. Care Med.156:833-839) 또는 엔도톡신(Hutchison 외, 1985, J. Appl. Physiol. 58:1463-1468)을 정맥내 투여 후 깨어있는 양에서 관찰한 것과 유사하다.
폐 맥관구조 혈관수축을 위한 안지오텐신 II의 능력이 엔도톡신 투여 및 사린 처리 마이스에서 차이가 없음을 발견했으므로 HPV의 엔도톡신 유도 약화가 혈관운동신경 수축 장치의 비특이성 기능장애에 기인한 것으로 나타나지는 않았다. 또한 쥐과의 폐 맥관구조에 대한 엔도톡신의 유해 효과는 엔도톡신 투여 14일 후의 HPV의 회복과 가역관계에 있었다 (데이터를 나타내지 않음).
22시간 이전 엔도톡신을 투여한 NOS2 결핍 마이스에서, HPV는 약화되지 않았으며 LMBO 기간 동안 전신 동맥 산소공급의 유지가 있었다. 마찬가지로, HPV는 엔도톡신 투여 3시간 후 NOS2 효소 활동의 특정한 억제제인 L-NIL을 처리한 야생형마이스에서 보존되었다. 이 결과는 NOS2 효소 활동이 HPV의 엔도톡신 유도 약화를 가져오는데 결정적임을 보여주는 것이다.
엔도톡신 투여 22시간 후 야생형 마이스에서의 HPV 약화는, LMBO 이후 즉시L-NIL의 급성 투여가 HPV를 회복시키지 않기 때문에, 과잉 폐 NO 레벨에 기여할 수 있다. 이 결과는 엔도톡신 유도 폐 NOS2 발현이 HPV을 약화하는데 필요하지만 계속되는 NOS2 활동이 엔도톡신 투여 22시간 후 측정하는 HPV의 약화에는 불필요하다는 것을 알려준다.
어떤 상태에서, NOS2는 NO (28)뿐만 아니라 슈퍼옥사이드를 만들 수 있다. 엔도톡신 투여 NOS2 결핍 마이스에서 NOS2에 의해 생산되는 NO가 흡입을 통해 NO 레벨을 보충함으로 엔도톡신 유도 HPV의 약화에 기여하였음을 시험하였다. NOS2 결핍 마이스에 엔도톡신을 투여하고 22시간 동안 변하는 농축 NO를 포함하는 노출 챔버에 놓는다. 챔버로부터 꺼내고 1시간 후 LMBO에 대한 응답으로 폐혈류 재배치를 측정하였으며, 이 때까지 폐의 NO 레벨이 높아질 것으로 기대되지 않았다. HPV는 40 ppm NO를 호흡한 엔도톡신 투여 NOS2 결핍 마이스에서 약화되었다 (도 7 참조). 대조적으로, 엔도톡신 처리 NOS2 결핍 마이스에서 22시간 동안 4 ppm NO의 호흡은 HPV를 약화시키지 않았다. 이 데이터는 현저히 높아진 폐의 NO 레벨 (NOS에 의해 내생적으로 생산된 또는 흡입된)이 HPV 약화에 필요하다는 점을 알려준다. 마이스에서의 관측결과를 인간으로 추정하는 경우, 본 연구의 중요한 임상적 의미는 폐 염증을 가진 환자에 고 농축 NO의 흡입 투여는 HPV를 저하시켜, 동맥 산소공급의 감소를 초래할 수 있다는 점이다. 또한, 본 연구의 발견은 급성 호흡질환을가진 환자를 처리하는 경우 최저 유효 농도의 NO을 흡입하게 하는 현 임상 관습을 지지한다 (Zapol, 1993, Intensive Care Med. 19:433-434).
사린 처리 야생형 및 NOS2 결핍 마이스에서, 22시간 동안 40 ppm NO의 흡입은 그 동물이 상기 노출 챔버에서 나온지 1시간 후에 조사하였을 때 HPV를 약화시키지 않았다 (도 7 참조). 이 결과는 폐의 NO 레벨만의 지속적인 증가는 HPV의 영구적인 약화를 일으키기에는 불충분하다는 것을 말해준다. 또한, 22시간 동안 40 ppm NO의 호흡은 엔도톡신 투여 야생형 마이스에서 HPV를 더 약화시키지 않았다. 따라서, 그 결과는 흡입한 NO 및 엔도톡신이 유도하는 폐의 NO 생산은 HPV 약화와 관련하여 추가적이 아님을 나타낸다. 본 연구는 엔도톡신 투여후 HPV의 지속적인 약화는 증가된 폐의 NO 레벨 및 부가적인 엔도톡신 유도 염증의 산물 모두를 필요로 한다는 점을 알려준다.
실시예 3: 류코트리엔 블록커 및 HPV의 약화
엔도톡신 투여 마이스에서 류코트리엔 합성 및 류코트리엔 수용체 활성화의 억제제는 HPV의 약화를 방지한다는 것을 나타내는 실험적 증거를 얻었다. 5LO-활성 단백질 (FLAP)이 존재하는 경우, 아라키돈산에서 류코트리엔 A4로의 변환을 촉매작용하는, 5-리폭시게나아제(5LO) 결핍의 엔도톡신 투여 마이스에서 HPV가 보존된다는 것을 발견하였다. 야생형 마이스에서, HPV는 FLAP 억제제 MK886 또는 CysT1 수용체 블록커 MK571로 처리된 엔도톡신 투여 마이스에서 보존된다는 것을 발견하였다. 이 실험을 위하여, 한쪽 폐 (one-lung) 저산소증의 생체 마우스 모델을 사용하였다.
야생형 (SV129B6/F1) 마이스 및 5LO 결핍 마이스를 마취하고 개흉술에서 조사하였다. 좌폐동맥 흐름 (QLPA), 및 폐 (PPA)와 전신 (PSA) 동맥압을 연속하여 측정하였다. 좌폐순환을 위한 압력 흐름 관계를 하대정맥의 잠정적 폐색에 의하여 얻었다.
좌측 주 기관지 폐색 (LMBO) 이후 좌폐혈관 저항의 퍼센트 증가 (P/Q 관계의 기울기, LPVR)로 HPV를 평가하였다. LMBO는 5LO 결핍 마이스에서 LPVR을 99 ±13% 증가하였으며, 야생형 마이스에서 100 ±11% 증가하였다. 데이터를 도 13에 요약하였다. 이 결과는 시스테이닐-류코트리엔 합성 또는 수용체 활성이 HPV의 엔도톡신 유도 약화를 방지하였음을 보여준다.
다른 실시예들
본 발명의 여러 실시예들이 기술되었다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 여러 수정이 가능하다는 점을 이해할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 여기에 기술되어 있는 것들 외에 안티 ROS 작용물질 및 류코트리엔 블록커를 이용하여 실시 가능하다. 따라서, 다른 실시예들은 다음의 청구범위 내에 속한다.

Claims (14)

  1. 포유류에게 산화질소의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 안티 ROS제의 유효량을 보조 투여함으로써, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 안티 ROS제는 N-아세틸시스테인, 알로푸리놀, 아스코브산(비타민 C), 빌리루빈, 카페인산, 카탈라제, PEG-카탈라제, 세루로플라슴, 구리 디이소프로필살리실레이트, 데퍼로사민 메실레이트, 디메틸우레아, 에브셀렌, EUK-8, FeTMTPyP, FETPPS, 글루코코르티코이드, 글루타치온, MnTBAP, MnTMPyP, 셀레노메티오닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, PEG-SOD, 탁시포린, 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 안티 ROS제가 N-아세틸시스테인 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    류코트리엔 블록커의 유효량을 더 보조 투여하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  5. 포유류에게 산화질소의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 류코트리엔 블록커의 유효량을 보조 투여함으로써, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 류코트리엔 블록커가 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트 (zafirlukast), 질로이톤(zileuton), 프란쿠라스트(prankulast), Mk-571, MK-591, MK-886, BAYx 1005, 신나루카스트(cinalukast), 포비루카스트 에다민(pobilukast edamine), MK-679 및 ZD 2138으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 류코트리엔 블록커가 몬테루카스트, 자피루카스트, 및 질로이톤으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입과 관련된 저산소 폐혈관 수축의 약화를 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  8. 포유류에게 산화질소의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 안티 ROS제의 유효량을 보조 투여함으로써, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 안티 ROS제는 N-아세틸시스테인, 알로푸리놀, 아스코브산(비타민 C), 빌리루빈, 카페인산, 카탈라제, PEG-카탈라제, 세루로플라슴, 구리 디이소프로필살리실레이트, 데퍼로사민 메실레이트, 디메틸우레아, 에브셀렌, EUK-8, FeTMTPyP, FETPPS, 글루코코르티코이드, 글루타치온, MnTBAP, MnTMPyP, 셀레노메티오닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, PEG-SOD, 탁시포린, 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 안티 ROS제가 N-아세틸시스테인 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    류코트리엔 블록커의 유효량을 더 보조 투여하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  12. 포유류에게 산화질소의 치료 유효량을 흡입에 의해 투여하고, 류코트리엔 블록커의 유효량을 보조 투여함으로써, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 류코트리엔 블록커가 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트 (zafirlukast), 질로이톤(zileuton), 프란쿠라스트(prankulast), mk-571, MK-591, MK-886, BAYx 1005, 신나루카스트(cinalukast), 포비루카스트 에다민(pobilukast edamine), MK-679 및 ZD 2138으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 류코트리엔 블록커가 몬테루카스트, 자피루카스트, 및 질로이톤으로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 포유류내의 산화질소 흡입에 대한 폐혈관 확장 응답의 손실을 감소, 부분적으로 방지 또는 완전히 방지하는 방법.
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