KR20030008805A - 라세미체의 케토로락을 단일이성체로 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라세미체의 형태로 존재하는 케토로락(Ketorolac)에서 인체에 약리학적으로 유효한 것으로 알려져 있는 (-)-이성체의 케토로락을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 기존에 알려진 기술에 비해 특히 높은 순도로 라세미체의 케토로락의 단일 이성체 분리를 행할 수 있는 신규의 분리방법을 제공하는 데 그 목적이 있는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하는 일 방법으로, 케토로락을 알콜류 화합물과 특정의 효소촉매 존재하에 반응시킨 후 반응 혼합물 중에서 (-)-이성체의 케토로락을 분리해내거나, 또는 케토로락을 알콜류 화합물과 반응시켜 얻어진 케토로락 에스터 화합물을 특정의 효소촉매 존재하에 가수분해시켜 얻어진 혼합물 중에서 (-)-이성체의 케토로락을 분리해내는 것을 특징으로 한 새로운 분리방법을 개시한다.

Description

라세미체의 케토로락을 단일이성체로 분리하는 방법{Separating method of single isomer from the ketorolac of the racemic body}

본 발명은 라세미체의 케토로락(Ketorolac)을 단일 이성체로 순수하게 분리하는 방법에 관한 것으로서, 특히 갠디다 엔타티카 리파제비와 같은 효소를 촉매로 사용하여 (-)-이성체의 케토로락을 분리하는 방법에 관한 것이다.

최근 들어 정밀화학 분야에서 특정 화합물의 제조에 효소를 촉매로 이용하는 기술이 많이 사용되고 있는데, 이는 효소 특유의 반응 특이성과 제조공정의 환경친화적 반응조건에 기인한다. 효소 촉매 중에서도 리파제(lipase)의 경우는 조효소의 도움없이도 단독으로 반응을 진행시키고 효소의 제조공정이 단순하여 가격이 저렴한 장점을 지니고 있어 다방면에 사용되고 있다. 그중에서도 리파제는 식품산업 등에서 지질(lipid)의 생산에 많이 사용되는데, 연간 6000만톤 가량의 지질 생산에 이용되는 것으로 알려져 있다.

또한, 리파제는 비대칭 탄소를 포함하고 있는 화합물과 특이적으로 반응하여 유효성분만 선택적으로 얻게 하는 특성을 지니고 있으며, 이러한 특성은 지질을 지방과 글리세롤로 부분적으로 또는 전체적으로 가수분해하는 반응, 분자간 에스터화

(interesterification)반응 혹은 전달에스터화(transesterification)반응, 또는 에스터 화합물의 합성반응 등에 주로 응용되고 있다.

본 발명의 대상 화합물인 케토로락(5-벤조일-1,2-디하이드로-3H-피롤로 [1,2-a]피롤-1-카르복실산)은 하기 일반식 1의 분자구조식을 지니며 비대칭 탄소를 1개 포함하고 있는 화합물이다.

상기 화학식 1의 구조를 지닌 케토로락은 광학 이성체인 (+)-이성체 및 (-)-이성체의 혼합되어 있는 라세미체의 형태로 존재하며, 그 중에서 (-)-이성체가 약리학적으로 인체에 유효하고 (+)-이성체는 일정 투여량에서 전혀 약리학적 효능을 나타내지 못하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 이성체에 대한 생물학적 차이점은 응고저해분석(platelet aggregation inhibition), 프로스타그란딘합성 (prostaglandin synthesis), 소염진통분석(analgesic and antiinflammatory analysis)등 여러가지 약리학적 효능 검사에 의해 확인된 것이다.

케토로락은 특히 비스테로이드성 소염진통제와 같은 약제로 많이 사용 되는데, 최근에는 이 약제를 사용한 환자들에서 소화기적 장애, 혈액학적 장애, 과민반응적 장애, 신장장애를 비롯한 여러가지 장애가 밝혀졌으며, 이러한 장애를 극복하기 위한 방법으로 투여량을 최소화하고 복용시간을 단축시키는 등의 처방이 사용되고 있다.

케토로락의 투여량을 최소화하는 방법중의 하나로 (-)-이성체의 단일 이성체를 사용하면 기존의 투여량에 비해 50% 감소효과를 얻을 수 있으며, 약리학적 규명이 되어 있지 않은 (+)-이성체를 사전에 제거할 수 있는 장점을 얻을 수 있다.

케토로락의 단일 이성체 분리에 대한 연구는 현재까지 거의 알려져 있지 않으며, 단지 훌링(Gerd Fulling)과 시(Charles J.Sih)가 1987년 J.Am. Chem. Soc. (1987, 109, 2845)발표한 것이 유일한데, 이와 같이 케토로락의 이성질체 분리에 관한 연구가 적은 것은 화합물 자체의 라세미화 경향이 높기 때문인 것으로 추정된다.

훌링과 시는 상기 논문에서 케토로락 에스터를 기질화합물로 하여 다양한 가수분해 효소를 이용한 이성질체 분리방법에 대한 연구결과를 발표하였다. 여기에서는 가수분해 효소로서 무코미하이, 수도모나스, 캔디다 루고사, 포신판크레아즈와 같은 리파제 계열의 효소들과 스트렙토마이세스 그리세우스, 아스페지러스 사이토이, 박시러스 서티리스, 아스페지러스 오리자와 같은 프로테아제 계열의 효소들을 촉매로 사용하여 분리과정을 수행하였는데, 이때 프로테아제 계열의 효소를 촉매로 이용한 경우 (-)-이성체의 순도가 95% 이상으로 되는 우수한 결과가 얻어진 반면에, 리파제 계열의 효소를 촉매로 이용한 경우는 (-)-이성체를 높은 순도로 얻는 것이 어려운 것으로 나타났다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 단일 이성체 분리에 효소촉매로서 그다지 효과를 나타내지 못하는 것으로 알려진 리파제 계열의 효소 들 중에서 특히 캔디다 엔타티카로부터 얻어지는 캔디다 엔타티카 리파제비(Candida antartica lipase B)를 케토로락의 단일 이성체 분리를 위한 효소 촉매로서 선택적으로 사용하여 높은 순도의 (-)-이성체를 분리해 내는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기질 화합물로 산화합물인 케토로락 외에도 케토로락의 에스터 유도체를 사용하여 (-)-이성체의 단일 이성체인 케토로락을 높은 순도로 분리해 내는 것이다.

본 발명은 케토로락을 알콜류 화합물과 특정조건하에서 캔디다 앤타티가 리파제비를 효소 촉매로 하여 반응시킴에 의해 하기 화학 반응식 2와 같이 케토로락 에스터 화합물과 (-)-이성체인 케토로락의 혼합 생성물을 제조한 후 분리공정을 거쳐 (-)-이성체의 케토로락을 분리해 내는 것을 특징으로 한 것이다.

본 발명은 또한 라세미체의 케토로락과 알콜류 화합물을 반응시켜 얻어진 라세미체의 케토로락 에스터 화합물을 기질화합물로 하고 캔디다 엔타티카 리파제비를 효소촉매로 사용하여 가수분해 반응을 시킴에 의해 하기 화학 반응식 3과 같이 (-)-이성체의 케토로락과 케토로락 에스터 화합물의 혼합생성물을 제조한 후 분리공정을 거쳐 (-)-이성체의 케토로락을 분리해 내는 것을 또 다른 특징으로 한 것이다.

[화학반응식 2]

상기식에서 R은 탄소수 3∼20의 알킬기 또는 아릴기임

[화학반응식 3]

상기식에서 R은 탄소수 3∼20의 알킬기 또는 아릴기임

이하에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 촉매로 사용되는 캔디다 엔타티카 리바제비는 리파제 계열의 캔디다 엔타티카로부터 노보디스크 등을 사용해 얻어지는 효소 촉매로서, 본 발명에서의 바람직한 사용량은 기질화합물로 케토로락을 사용하는 경우는 케토로락 사용량에 대하여 대략 10∼150중량% 범위로서, 10질량% 미만 사용시는 거울상 선택성이저하되는 문제가 있으며, 150질량% 초과 사용시는 촉매 향상 효과는 거의 없고 비용만 상승시키는 문제가 있다. 또한 기질 화합물로 케토로락 에스터 화합물을 사용하는 경우는 케토로락 에스터 화합물의 총 사용량에 대하여 리바제 비는 대략 10∼100질량% 범위에서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 케토로락을 기질화합물로 하는 경우 상기 케토로락을 알콜류 화합물과 캔디다 엔타티카 리파제비 촉매 및 특정조건하에서 반응시켜 케토로락 에스터 화합물과 (-)-이성체 형태의 케토로락 혼합물을 생성하는데, 이때 사용되는 알콜류 화합물로는, 예를 들어 에탄올, n-부탄올, n-헥산올, n-옥탄올, n-데칸올, n-테트라 데칸올, 2-클로로 에탄올, 벤질알콜, 이소프로필 알콜, 이소부틸 알콜과 같이 탄소수 3∼20의 알콜류 화합물이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 탄소수 4∼10의 알콜류 화합물이며, 특히 바람직하기로는 탄소수 8의 n-옥탄올이다.

반응용매로는 구체적으로 아세토 니트릴, 디이소프로필 에테르, 디 클로로 메탄, 1,2-디 클로로 에탄, 테트라 히드로 퓨란, 디메틸포름아마이드, 디이소프로필 에테르, 디 클로로 메탄, 1,2-디클로로 에탄이 더욱 좋은 성능을 나타내었으며, 특히 1,2-디클로로 에탄의 경우는 반응시간 단축의 효과를 얻을 수 있는 등의 장점을 지니고 있어 권장된다.

그리고, 상기 반응에 적합한 온도는 대략 20∼70℃ 범위이며, 더욱 바람직하게는 30∼60℃ 범위이다.

한편, 본 발명은 기질 화합물로 케토로락에스터 화합물을 사용하고 효소 촉매로 리파제비를 사용하여 가수분해반응에 의해 상기 화학 반응식 3과 같이 (-)-이성체의 케토로락과 미반응 케토로락 에스터 화합물의 혼합물을 제조후 상기 물질들을 분리시켜 (-)-이성체의 케토로락을 얻는 것을 또 다른 특징으로 하는데, 가수분해 반응시 사용되는 반응용액으로는 대략 pH6∼9(더욱 좋게는 pH7)범위의 완충용액을 사용하는 것이 좋으며, 완충용액의 구체적인 예로서는 인산염 완충액 등이 있다. 또한 상기 가수분해 반응시 바람직한 반응 온도는 대략 10∼40℃(더욱 바람직하게는 20∼30℃) 범위이다.

그리고 가수분해 반응시 유리되어 나오는 산은 묽은 알카리 용액으로 자동적으로 중화시키는 방법을 사용하는 것이 좋다.

상기와 같이 반응의 기질화합물로 케토로락과 케토로락 에스터 화합물을 사용해 케토로락 에스터 화합물과 (-)-이성체인 케토로락의 혼합물을 제조한 후 이를 분리하는 방법은 본 발명에서 별도로 특정되지는 않으나, HPLC 나 LC 등을 이용한 흡착분리 방법이 선호된다.

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

<1> 케토로락 부틸에스터 합성

케토로락 100mg (0.39m mol)을 부탄올 2㎖ 및 진한황산 0.1㎖의 혼합물에 넣은 후 3시간동안 환류 교반시키며 반응시켰다. 반응용액을 상온으로 냉각시킨 후 얼음물에 희석하여 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기층을 탄산수소나트륨의 수용액으로 중화시킨 후 유기층을 분리, 탈수, 여과하여 농축시킨 후 액체크로마토그래피(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10:1)를 이용해 케토로락 부틸에스터를 정량적으로얻었다.

<2> 리파제비를 이용한 케토로락 부틸에스터의 가수분해

상기<1>에서 얻은 케토로락 부틸에스터 40mg (0.16m mol)을 7㎖의 완충용액 (pH7)에 넣은 후 캔디다 엔타티카 리파제비 20mg을 가하여 대략 25℃ 온도하에서 반응을 시켰다. 이 때 반응 중 유리되어 나오는 산은 0.02N 가성소다용액으로 자동적으로 중화시켰으며, 또 반응용액으로부터 일정한 시간대별로 시료를 채취하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC, 이동상 : n-헥산/이소프로판올/트리플루오아세틱산 = 90/10/0.1)와 고정상(키랄팩AD)을 통하여 산 거울상 선택성을 측정하였으며 그 결과를 총 반응시간 및 얻어진 케토로락의 절대구조와 함께 하기 표 1에 나타내었다.

[비교예 1-5]

상기 실시예 1에서 효소 촉매로 하기 표 1에 나타낸 것을 각각 등몰량 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였으며 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

구분	효소 촉매	반응시간(hr)	산 거울상 선택성(%)	절대구조
실시예 1비교예 1비교예 2비교예 3비교예 4비교예 5	캔디다 엔타티카 리파제비캔디다 루고사 리파제벌콜데리아 세파시아스트렙토마이세스 그리세우스아스페르지러스 사이토이무코 미하이	0.56.857.31.3522.30.5	10091831006471	RRRSRR

* 상기에서 R은 (+)-이성체, S는 (-)-이성체

[실시예 2]

케토로락 10mg (0.039m mol) 및 부탄올 0.039m mol을 아세토니트릴 5㎖에 용해시키고 분자체(4Å) 30mg을 넣었다.

여기에 캔디다 엔타티카 리파제비 10mg을 넣고 34℃에서 교반하며 유지 반응시켰다. 반응 용액으로부터 일정한 시간별대로 시료를 채취하여 고성능 액체크로마토그래프(HPLC, 이동상 : n-헥산/이소프로판올/트리플루오아세틱산 = 90/10/0.1)과 고정상(키랄팩 AD)을 통하여 반응전환율 및 에스터 거울상 선택성 등의 물성을 측정하여 하기 표 2에 나타내었으며, 아울러 상기 공정에서 부탄올을 사용하는 대신에 표 2에 나타낸 다른 알콜류 화합물들을 등몰량 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

알콜류 화합물	반응시간(h)	반응전환율(%)	에스터 거울상 선택성(%)	절대구조
에탄올부탄올헥산올옥탄올데칸올테트라데칸올2-클로로에탄올페닐메탄올이소프로판올이소부탄올	434248525249254811649	435359585958213056	52908693878647802576	SSSSSSSSSS

[실시예 3]

케토로락 10mg (0.039m mol) 및 옥탄올 0.39m mol을 아세토니트릴 5㎖에 용해시키고 분자체(4Å) 30mg을 넣었다. 상기 반응용매에 캔디다 엔타티카 리파제비10mg을 넣고 34℃에서 교반하며 유지반응시켰다. 반응용액으로부터 일정한 시간별대로 시료를 채취하여 고성능 액체크로마토그래프(HPLC, 이동상 : n-헥산/이소프로판올/트리플루오아세틱산 = 90/10/0.1)과 고정상(키랄팩 AD)을 통하여 반응전환율 및 에스터 거울상 선택성 등을 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었으며, 아울러 상기 공정에서 반응 용매로 사용된 아세토니트릴 대신에 표 3에 나타낸 바와 같은 용매들을 각각 사용한 것 외에는 동일하게 실시하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

용 매	반응시간(h)	반응전환율(%)	에스터 거울상 선택성(%)	절대구조
아세토니트릴디이소프로필에테르디클로로메탄테트라히드로퓨란n-헥산디메틸포름아마이드1,2-디클로로에탄	52204869696969	5852541488051	9388100131006100	SSSSSSS

상기 실시예 및 비교예에서도 확인되듯이 본 발명에 의해 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 경우 기존의 방법에 비해 높은 순도의 (-)-이성체를 분리해 낼 수 있을 뿐만 아니라 분리에 소요되는 반응시간을 단축할 수 있는 등의 유용성을 얻을 수 있다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 나타내는 라세미체의 케토로락을 알콜류 화합물과 캔디다 엔타티카 리파제비 존재하에 반응시켜 얻어진 혼합물중에서 (-)-이성체의 케토로락을 분리해 내는 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.

   [화학식 1]
2. 라세미체의 케토로락을 알콜류 화합물과 반응시켜 얻어진 라세미체의 케토로락 에스터 화합물을 캔디다 엔타티카 리파제비 존재하에 가수분해시킴에 의해 얻어진 혼합물중에서 (-)-이성체의 케토로락을 분리해 내는 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
3. 제 1 항 및 제 2 항의 어느 한항에 있어서, 알콜류 화합물은 탄소수 3∼20의 알콜류 화합물임을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 캔디다 엔타티카 리파제비의 사용량은 케토로락의 총사용량에 대하여 10∼150중량% 범위에 있는 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 캔디다 엔타티카 리파제비의 사용량은 케토로락 에스터 화합물의 총 사용량에 대하여 10∼100질량% 범위에 있는 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 케토로락과 알콜류 화합물의 반응시 반응온도는 20∼70℃범위인 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
7. 제 2 항에 있어서, 가수분해시 사용되는 완충용액은 pH6∼9 범위의 완충용액임을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.
8. 제 1 항 및 제 2 항의 어느 한 항에 있어서, 케토로락과 케토로락 에스터 화합물의 혼합물 중에서 (-)-이성체의 케토로락 분리시 흡착분리방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 라세미체의 케토로락을 단일 이성체로 분리하는 방법.