KR20020093155A

KR20020093155A - 내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이를 함유하는 음식품

Info

Publication number: KR20020093155A
Application number: KR1020027015327A
Authority: KR
Inventors: 오히시켄지; 사와다하루지; 요코이와카에; 요시다야스토; 와타나베츠네카즈
Original assignee: 가부시키가이샤 야쿠루트 혼샤
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2002-12-13
Also published as: EP1304114A1; AU5671701A; CA2408968A1; EP1304114A4; EP1304114A9; WO2001087317A1; US20060068047A1; US20030133921A1; CN1259923C; TWI249405B; CN1429115A; AU2001256717B2

Abstract

장내 미생물의 생균체 또는 사균체 또는 그의 구성물을 유효성분으로 함유하는 내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이 내분비 교란 화학물질 흡착제를 배합한 음식물이다.

본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이 내분비 교란 화학물질 흡착제를 배합한 음식물은 비스페놀류, 알킬페놀류, 트리아진류 등을 비롯한 내분비 교란 화학물질이나 이것에 오염된 음식품을 섭취할 때, 동시적으로 또는 일상적으로 경구 섭취함으로써, 체내로 흡수를 억제함과 동시에 일단 체내에 흡수된 내분비 교란 화학불질의 체외로 배출을 촉진할 수 있는 약제이다.

Description

내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이를 함유하는 음식품{ADSORBENT FOR ENDOCRINE DISRUPTORS AND FOODS AND DRINKS CONTAINING THE SAME}

배 밑바닥의 패각 부착 방지를 위해서 오랫동안 도포되어 온 유기 주석 화합물이 조개류의 생식기에 이상을 가져오는 원인물질이라는 보고(Gibbs 등, J. Mar. Biol. Assoc. UK, 66, 767, 1986)를 계기로 하여 내분비 교란 화학물질(소위, 환경호르몬)은 커다란 사회 문제가 대두되고 있다. 생체의 내분비계는 각종 호르몬의 작용에 의해, 개체의 발생이나 생식기의 발달 및 생체의 항상성의 유지 등을 제어하는 중요시스템이다. 내분비 교란 화학물질은 이들 내분비계의 밸런스에 장해를미치는 물질이고, 생활하수에 노출된 호수와 늪에 서식하는 야생 동물의 번식이나 형태에 이상을 초래한다.

사람이나 동물은 내분비 교란 화학물질을 소화관이나 폐 및 피부로부터 흡수 한다고 하나, 통상 생활 환경에 있어서는 사람에서는 공기나 물, 토양을 경유한 흡수는 비교적 적고, 주로 일상적으로 섭취하는 식품(고기나 어류)으로부터 오염된다고 생각되고 있다. 그 중에서도, 하기 식(I)으로 표시되는 "아트라진"이나 "시마진" 등의 트리아진계의 제초제 및 마라치온 등과 같이 현재라도 사용되고 있는 농약에 의한 생체 오염의 위험성이 지적되고 있다. 이와 같이 경구적으로 섭취된 내분비 교란 화학물질은 장관으로부터 흡수되어 간장이나 지방조직에 축적된다.

한편, 각종 식품 용기에 사용되고 있는 폴리카르보네이트 수지 등으로부터 용출하는 비스페놀 A(Krishnan 등, Endocrinology, 132, 2279(1993), Olea 등, Environ. Health Perspect. 104, 298 (1996) 및 4-노닐페놀(Soto 등, Environ. Health Perspect., 92, 167 (1991) , Nimrod 등, Crit. Rev. Toxicol., 26, 335 (1996))은 여성 호르몬인 에스트로겐에 대한 세포의 수용체에 결합하여 이들 내분비계의 밸런스에 장해를 미치는 물질이며, 사람에 미치는 영향이 매우 큰 것이므로 커다란 사회 문제가 되고 있다.

비스페놀 A는 하기 식(II)으로 표시되는 화합물이고, 주로 폴리카보네이트수지 및 에폭시 수지의 원료에 사용되는 이외에 페놀 수지, 가소성 폴리에스테르, 폴리술폰, 폴리아크릴레이트 등의 수지원료, 폴리염화비닐의 안정제 및 산화 방지제로서도 사용되고 있다. 일본에서 비스페놀 A의 생산량은 1996년에 약 25만톤이고, 그 중, 식품 용도는 4만톤에 이르고 있다.

비스페놀 A를 원료로 하는 폴리카르보네이트 수지는 내열성 및 내충격성이 우수하기 때문에, 커피 드리퍼 등의 고온에서 사용되는 기구, 유아용이나 급식용의 식기 및 젖병 등에 사용되고 있다. 폴리카르보네이트 제품에는 미반응의 비스페놀 A가 잔존하고 있을 뿐만 아니라, 고온조건하에서는 중합체로부터도 용이하게 용출하는 성질을 가지고 있다.

또한, 스틸 및 알루미늄제 식용 캔의 상당수는 내면을 에폭시 수지 또는 염화비닐 수지로 도장되어 있다. 에폭시 수지는 원료로서, 또한 염화비닐 수지는 안정제로서 비스페놀 A를 사용하고 있기 때문에, 가열살균이나 보존 시에 도막에 잔존하는 비스페놀 A가 식품으로 이행될 가능성이 지적되고 있다(Brotons 등, Environ. Health Perspect., 103, 608 (1995)).

더욱이, 비스페놀 A는 폴리카르보네이트 플라스틱의 형태로, 치과용 재료로서 충치 치료시의 실란트나 아이의 치아의 코팅제로도 사용되고 있다(Keith 등, "Environmental Endocrine Disruptors" Willey-Interscience, New York, p1232(1997). 이 치과용 재료에 대해서도, 폴리머의 중합이 불완전하거나, 고압증기멸균 등으로 열을 거치면 비스페놀 A가 용출할 가능성이 지적되고 있다(Krishnan 등, Endocrinology, 132, 2279 (1993).

한편, 하기 식 (III)으로 표시되는 4-노닐페놀은 노닐페놀에톡실레이트의 형태로 비이온성 계면활성제로서 사용되고 있으며, 그의 연간 생산량은 약 2만톤이다. 노닐페놀에톡실레이트는 기포성이 낮기 때문에 일본에서는 주로 공업용의 세정제, 분산제로서 섬유공업, 제지공업, 금속공업, 농약공업 등에 사용되고 있다. 이 때문에, 4-노닐페놀을 포함한 하수처리 방류수나 하천이나 해양으로 흘러 들어가 어류 등이 오염되고 있다.

이상과 같이 현대인은 일상적으로 비스페놀 A, 4-노닐페놀 및 아트라진을 비롯한 각종 내분비 교란 화학물질의 위험성에 노출되고 있는 것으로부터 인체에의 오염을 방어하는 소재나 제거방법 등이 조급히 요구되고 있다.

그런데, 경구적으로 섭취된 내분비 교란 화학물질은 장관으로부터 흡수되고 혈류를 통해 전신의 기관에 도달하여 내분비계의 밸런스를 무너뜨리는 등 각종 악영향을 일으킨다고 생각된다. 그리고, 당해 내분비 교란 화학물질을 장관 내에서 흡착하는 물질을 발견할 수 있으면, 이 물질의 이용에 의해 당해 내분비 교란 화학물질의 체내에의 흡수를 억제하여 체외로 배출하는 것을 촉진함으로써, 상기 기구에 의한 내분비계의 교란으로부터 생체를 방어할 수가 있다고 생각된다.

이와 같은 용도에 관련하여 지금까지 미강 섬유, 시금치 섬유, 클로렐라 및 스피루리나(spirulina)가 내분비 교란 화학물질인 다이옥신 및 일부의 폴리염화비닐(PCB) 화합물을 체외로 배출을 촉진한다고 보고되어 있다(Morita 등, Jpn. J. Toxicol. Environ. Health, 43, 42-47 (1997).

그러나, 내분비 교란 화학물질이 주로 흡수되는 부위인 장관 내에 존재하는 장내 미생물이 당해 물질을 흡착하는 것이나, 사람이나 동물체내에의 흡수 억제 작용을 가지는 것에 대하여는 지금까지 보고된 바 없다.

본 발명은 이러한 상황을 감안하여 식품 용기 등으로부터 용출하는 비스페놀 A, 4-노닐페놀, 아트라진을 비롯한 내분비 교란 화학물질이나, 이에 오염된 음식품을 섭취할 때, 동시적으로 또는 일상적으로 경구 섭취함으로써, 체내에의 흡수를 억제함과 동시에, 일단 체내에 흡수된 내분비 교란 화학물질의 체외로의 배출을 촉진 할 수 있는 약제의 제공을 그 과제로 하는 것이다.

본 발명은 경구적으로 섭취되는 내분비 교란 화학물질을 흡착 제거할 수 있는 내분비 교란 화학물질 흡착제에 관한 것으로, 더 상세하게는 사람 및 동물의 장관 내에서 내분비 교란화학 물질을 흡착하여 이 물질의 체내에의 흡수를 억제함과 동시에 일단 흡수된 이 물질의 체외로 배출을 촉진하는 효과를 가지는 내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이를 함유하는 음식품에 관한 것이다.

도 1은 장내 미생물만의 경우의, 장내 미생물 농도와 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 2는 장내 미생물 농도와 잔존 비스페놀 A의 양 및 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 3은 장내 미생물이 사료 중에 존재하는 경우의, 장내 미생물 농도와 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 4는 사료 농도와 장내 미생물에 의한 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 5는 반응계의 pH와 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 6은 반응시간과 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 7은 각종 장내 미생물의 종류와 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 8은 셀루로오즈의 종류와 비스페놀 A의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 9는 각종장내 미생물의 종류와 4-노닐페놀의 흡착량의 관계를 나타내는 도면이다.

도 10은 각종 장내 미생물의 종류와 아트라진의 흡착량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 11은 장내 미생물의 종류와 이들의 투여량과 비스페놀 A의 분변 총배출량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 12는 장내 미생물의 종류와 이들의 투여량과 분변 건조 중량과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 13은 장내 미생물의 종류와 이들의 투여량과 맹장 내용물중의 투여균체의 생균수와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 14는 장내 미생물의 투여량과 분변 건조 중량당의 비스페놀 A의 농도와의 관계를 나타내는 도면이다.

[발명의 실시형태]

본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제에서 사용되는 장내 미생물은 예부터 식품(유산균 음료, 요구르트 등)의 제조에 사용되는 균주로서 알려져 있으며, 인체에 대해서 극히 안전한 미생물이다. 본 발명의 장내 미생물에서 상주하는 세균이외에, 음식물로부터 섭취되어 장내에 어느 정도의 기간 체재하는 세균도 포함된다.

이 장내 미생물의 예로서는 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 락토코카스속, 스트렙토콕카스속, 엔테로코카스속, 와이셀라속, 로이코노스톡속, 테트라제노콕카스속, 프로피오니박테리움속, 박테로이데스속, 클로스트리디움속, 유우박테리움속, 프레보텔라속, 페디오콕카스속 또는 메가스페라속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

상기의 각 속에 속하는 미생물은 모두 용이하게 입수할 수 있는 것이지만, 특히 바람직한 예로서 다음의 미생물을 들 수 있다.

·락토바실러스·카제이 (Lactobacillus casei) YIT 9029

FERM BP-1366호 (1981년 5월 1일 수탁)

·락토바실러스·액시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YIT 0168

FERM BP-7536호 (1981년 12월 16일 수탁)

·비피도박테리움·브레베 (Bifidobacterium breve) YIT 4065

FERM BP-6223호 (1996년 2월 29일 수탁)

·비피도박테리움·비피담 (Bifidobacterium bifidum) YIT 4007

FERM BP-791호 (1981년 5월 1일 수탁)

·락토코카스·락티스(Lactococcus lactis) YIT 2027

FERM BP-6224호 (1997년 2월 10일 수탁)

·스트렙토코카스·서모필루스 (Streptococcus thermophilus) YIT 2001

FERM BP-7538호 (2001년 1월 31일 수탁)

·스트렙토콕카스·서모필루스 (Streptococcus thermophilus) YIT 2021

FERM BP-7537호 (1996년 11월 1일 수탁)

이상의 미생물은 현재의 독립 행정법인 산업기술 총합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1조메 1반지 1 주오 다이 6(우편번호 305-85, 66))에 기탁되고 있다.

·엔테로콕카스·페시움 (Enterococcus faecium) YIT 2039

·와이셀라·콘퓨자 (Weissella confusa) YIT 0233

·로이코노스톡·락티스 (Leuconostoc lactis) YIT 3001

·페디오콕카스·액시디락티시(Pediococcus acidilactici) YIT 3025

·프로피오니박테리움·액시디프로피오니(Propionibacterium acidipropionici) YIT 3501

·메가스페라·엘스데니 (Megasphaera elsdenii) YIT 6063

본 발명에서 이용되는 장내 미생물은 통상의 방법에 따라 효모 엑기스나 폴리펩톤을 함유하는 복합 배지에서 이들의 미생물을 배양함으로써 그의 생균체를 얻을 있으나, 예를 들면 하기 조성의 복합 배지를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서, 장내 미생물은 상기한 미생물의 일종을 단독으로 이용하여도 좋고, 또, 다른 속 또는 다른 종에 속하는 미생물을 2 종이상 조합하여 이용해도 좋다.

<복합 배지 조성>

변법 GAM 부이용(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)41.7g

D-(+)-글루코오즈(Wako Pure Chemicals Industry) 10.0g

폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트

(Wako Pure Chemicals Industry)1.0g

탈이온수1.0ℓ

(pH 7.3)

또, 장내 미생물의 가열균체(사균체)는 상기 생균체를 예를 들면, 80 내지 120℃ 정도의 온도에서 15∼30분간 정도 처리함으로써 얻어진다. 한편, 장내 미생물의 구성물은 일반적으로 이용되는 방법으로 얻을 수 있으며, 예를 들면, 균체를 세포벽 용해효소로 처리하여 세포벽 부분을 제거한 프로토플라스트 분획, 균체의 세포벽 용해효소 가용 분획, 이 프로토플라스트를 유기용제로 처리하여 얻어지는 세포질막 분획, 균체의 파쇄물, 또는 균체를 파쇄하고, 핵산 분해효소·단백 분해효소로 처리하여 얻어지는 세포벽 분획 등, 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 처리 가공한 것도 이용될 수 있다.

이와 같이하여 얻어진 장내 미생물의 생균체, 가열균체(사균체) 또는 그의 구성성분(이하, "장내 미생물 균체 등"이라 한다)은 그대로 또는 공지의 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제로 할 수 있다.

장관 내에 있어서 내분비 교란 화학물질 흡착작용을 발휘하기 위한 장내 미생물균체 등의 소요량은 균주에 따라 다르지만, 일반적으로는 하루 l0mg∼30g의 섭취량이고, 바람직하기로는 1∼5g 정도로 효과가 발휘되므로, 본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제는 이 투여량에 적절한 배합량, 제형으로 하면 좋다.

또한, 본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제는 각종의 음식품에 배합할 수 있다. 배합할 수 있는 음식물의 예로서는 발효유, 과즙 음료, 수프, 전병, 쿠키 등을 들 수 있다. 이들의 음식품에 대한 내분비 교란 화학물질 흡착제의 배합량도 특히 제약은 없지만, 최종적으로 상기한 정도의 양의 장내 미생물 균체 등을 섭취할 수 있는 정도로 하면 좋다.

이상과 같이하여 얻어지는 본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제 및 이를 함유하는 음식물은 각종 내분비 교란 화학물질, 예를 들면 비스페놀 A 등의 비스페놀류, 4-노닐페놀 등의 알킬페놀류, 아트라진 등의 트리아진류 등을 흡착하여 장관으로부터 체내로 흡수되는 것을 막아 체외로 배설할 수 있기 때문에, 이들 물질의 작용에 의한 내분비계의 교란으로부터 생체를 방어할 수 있는 것이다.

본 발명자는 내분비 교란 화학물질, 특히 비스페놀류, 알킬페놀류, 트리아진류 등을 흡착하는 물질에 대해서 예의 검색하던 중, 각종 장내 미생물의 균체 또는 그 구성물이 이들 물질을 유효하게 흡착하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 장내 미생물의 생균체 또는 사균체 또는 그의 구성물을 유효성분으로서 함유하는 내분비 교란 화학물질 흡착제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 내분비 교란 화학물질 흡착제를 함유하는 음식물을 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 인체에 내분비 교란 화학물질 흡착제를 수여하는 것으로부터 되는 내분비 교란 화학물질의 인체에의 흡수 억제 방법 및 인체로부터의 배출을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 하등 제약되는 것은 아니다. 또, 이하의 실시예에 있어서 내분비 교란 화학물질의 미생물에의 흡착량 및 동물의 체외에의 배출량은 이하의 방법에 의해 측정하였다.

(1) 미생물의 비스페놀 A흡착작용:

(a) 공시 시료의 조제

분산매에 보존하고 있는 미생물의 1 백금고리를 전술한 복합 배지 10㎖를 함유하는 시험관(15㎖)에 식균하고, 37℃에서 정치 배양했다. 24시간 후에, 동일 배지240㎖를 함유하는 삼각 플라스크(500㎖)에 시험관 1개분을 접종하고, 37℃에서 16 시간 정치 배양했다. 배양 종료후, 하기 조건으로 냉각 원심분리기를 사용하여 균체와 상청을 분리한 후, 균체를 인산 완충액(20mM의 인산2수소칼륨 수용액과 20mM 의 인산수소2칼륨 수용액을 혼합하여 pH를 7.0으로 조정한 용액)으로 2번 세정했다. 이 세정 균체 또는 80℃에서 30분간 가열 처리한 가열균체를 인산 완충액에 현탁하여, 흡착시험에 제공했다.

(냉각 원심분리의 조건)

냉각 원심분리기: RS-18III(Tomy Seiko Co., Ltd.)

로터: TA-18BH(Tomy Seiko Co., Ltd.)

회전수 (중력가속도): 8,000rpm (12,000 × g)

원심시간: 20분간

온도: 4℃

(b) 비스페놀 A 시료의 조제

한편, 비스페놀 A(Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) 100㎎을 전자 저울에서 메스 플라스크(10㎖)에 칭량하여, 에탄올(Wako Pure Chemicals Industry, 특급)로 정확하게 10㎖로 조제했다. 이 용액 l㎖를 트랜스퍼 피펫트로 다른 메스 플라스크(50㎖)에 분취하고, 에탄올로 정확하게 50㎖로 조제하여, 이 용액을 흡착시험에 제공했다.

또한, 내부 표준물질로서 하기 식(IV)으로 표시되는 비스페놀 B를 이용했다.

(c) 미생물과 비스페놀 A와의 흡착 반응 및 잔존 비스페놀 A양의 측정

상기 (a)에 기재된 생균체 또는 가열 균체의 현탁액 3.8㎖를 함유하는 유리 시험관에, (b)에 기재된 비스페놀 A의 에탄올 용액 0.2㎖를 첨가하고, 충분히 교반한 후, 37℃의 수욕중에 정치했다. 60분 후에 미생물을 원심분리하여 침전시키고, 상청 0.95㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 여기에, 내부 표준물질(비스페놀 B)의 에탄올 용액 0.05㎖ 및 디클로로메탄 1㎖를 첨가하고, 진탕기에서 격렬하게 진탕시켰다. 20분 후에 디클로로메탄층과 수층을 원심으로 분리하여, 디클로로메탄층(하층) 0.2㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 디클로로메탄을 증발 건고한 후, 데시케이타 내에서 밤새 방치했다. 또한, 이상의 조작을 미생물의 비존재하에서 행한 것을 음성 대조로 하였다.

이어서, 잔사에 디클로로메탄 0.16㎖를 첨가하여, 비스페놀 A를 재용해한 후, 페놀성 히드록시기를 트리메틸실릴(TMS)화하기 위하여 N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA)를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. TMS화의 반응 종료후, 후기 조건에 의하여, 가스 크로마토그래피(GC)를 사용하여 잔존 비스페놀 A를 정량적으로 분석했다.

(가스 크로마토그래피 측정 조건)

가스 크로마토그래피 장치: GC-14A (Shimadsu Corp.)

캐피러리 컬럼: NEUTRABOND-l (GL Science Inc., 25m ×0.25㎜;

df= 0.4㎛)

컬럼 온도: 100℃ → 300℃, 10℃/분

캐리어 가스: 헬륨

인젝터: Split, T= 310℃

검출기: FID, T= 310℃

샘플 주입량 : 1㎕

분석 시간: 20분

(d) 잔존 비스페놀 A량에 의한 미생물에 흡착한 비스페놀 A량의 산출

미생물에게 흡착된 비스페놀 A의 양은 상기 (c)에 의하여 측정된 미생물에 의하여 흡착되지 않았던 잔존 비스페놀 A의 양으로부터 다음 식을 사용하여 산출된다.

Y= X- (SA × CB/SB × CA) × X

Y: 미생물에 흡착한 비스페놀 A의 양

X: 반응액에 첨가한 비스페놀 A의 양

CA: 미생물 비존재하의 반응액에 함유된 비스페놀 A의 피크 면적

CB: 피크 면적 CA에 대응하는 비스페놀 B의 피크 면적

SA: 미생물에 흡착하지 않았던 비스페놀 A의 피크 면적

SB: SA에 대응하는 비스페놀 B의 피크 면적

(e) 미생물과 비스페놀 A와의 흡착 반응 및 미생물이 흡착한 비스페놀 A량의 측정

상기 (a)에 기재된 생균체 또는 가열 균체의 현탁액 3.8㎖를 함유하는 유리 시험관에 (b)에 기재된 비스페놀 A의 에탄올 용액 0.2㎖를 첨가하고, 충분히 교반한 후, 37℃의 수욕중에 정치했다. 60분 후에 미생물을 원심분리하여 침전시키고, 상청을 다른 유리 시험관에 분취한 후, 미생물을 인산 완충액(20mM의 인산2수소칼륨 수용액과 20mM 인산수소2칼륨 수용액을 혼합하여 pH를 7.0으로 조정한 용액)으로 2번 세정했다. 이 미생물의 펠렛 및 앞에서 분취한 상청에 비스페놀 A-d16(서로게이트 물질) 20㎍과 디클로로메탄 2㎖를 첨가하고, 격렬하게 진탕했다(200 스트로크/분). 20분 후에 원심분리하여 얻은 상청 0.2㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 디클로로메탄을 증발 건고한 후, 데시케이타 내에서 밤새 방치했다.

이어서, 잔사에 디클로로메탄 0.26㎖를 첨가하고, 비스페놀 A를 재용해한 후, 페놀성 히드록시기를 TMS화하기 위하여 BSTFA를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. TMS화의 반응 종료후, 페난트렌-d10(내부 표준물질)의 디클로로메탄 용액 (10㎍/㎖) 0.1㎖를 첨가하고, 후기 조건에 따라 가스 크로마토그래피/질량분석계 (GC/MS)를 사용하여 비스페놀 A를 정량적으로 분석했다.

(가스 크로마토그래피 측정 조건)

가스 크로마토그래피 장치: GC17A(Shimadzu Corp.)

캐피러리 컬럼: HP-5 (Agilent, 30m × 0.25㎜; df= 0.25㎜)

액상: 5% 페닐메틸실리콘

컬럼 온도: 60℃(1분) → 280℃(5분), 10℃/분

주입구 온도: 280℃

주입량: 스프리트레스법 (1분후 퍼지)

주입량: 1㎖

캐리어 가스: 고순도 헬륨 가스, 선속도= 44cm/초

인터페이스 온도: 280℃

샘플링 시간: 1분

분석 시간: 28분

(질량 분석 측정 조건)

질량분석장치: QP5000(Shimadzu Corp.)

이온화법: EI (70eV)

검출기 전압: 1.5kV

검출 모드: SIM

샘플링 레이트: 0.2초

(측정 이온)

대상 물질, 서로게이트, 내부 표준물질의 측정이온을 표 1에 나타낸다.

측정 대상물질	측정 이온수
비스페놀 A^*	357, 372
비스페놀 A-d16^*	368, 371, 386
페난트렌-d10	188

*TMS체: 트리메틸실릴 유도체

(f) 미생물에 흡착한 비스페놀 A량의 산출

GC/MS의 측정으로 얻어진 비스페놀 A의 TMS체와 서로게이트 물질의 TMS체와의 피크 면적값의 비로부터 검량선에 의하여 비스페놀 A의 검출량을 구했다. 이어서, 검출량 GC/MS에의 시료 주입량 및 농축 배율 등으로부터 다음 식을 사용하여 비스페놀 A의 양이 산출된다.

Y= D × (L × 1000/I)

Y: 미생물에 흡착한 비스페놀 A의 양(㎍)

D: GC/MS에 의한 검출량(㎍)

L: 시료의 최종 액량(㎖)

I: GC/MS에의 시료 주입량(㎕)

(2) 각종 미생물의 4-노닐페놀 흡착작용:

(a) 공시 시료의 조제

상기 (1)(a)와 동일하게 하여 공시 시료를 조제했다.

(b) 4-노닐페놀 시료의 조제

4-노닐페놀(GL Science Inc.) 100㎎를 전자 저울에서 메스 플라스크(10㎖)로 칭량하고, 에탄올로 정확하게 10㎖로 조제했다. 이 용액 3㎖를 트랜스퍼 피펫트로다른 메스 플라스크(50㎖)에 분취하고, 에탄올로 정확하게 50㎖로 조제하고, 이 용액을 흡착시험에 제공했다. 또, 내부 표준 물질로서 전술한 비스페놀 B를 이용했다.

(c) 미생물과 4-노닐페놀과의 흡착반응 및 잔존 4-노닐페놀 량의 측정

상기 (a)에 기재된 생균체 또는 가열 균체의 현탁액 3.8㎖를 함유하는 유리시험관에 (b)에 기재된 4-노닐페놀의 에탄올 용액 0.2㎖를 첨가하고, 충분히 교반한 후, 37℃의 수욕중에 정치했다. 60분 후에 미생물을 원심분리하여 침전시키고, 상청 0.95㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 여기에, 내부 표준물질(비스페놀 B)의 에탄올 용액 0.05㎖ 및 디클로로메탄 l㎖를 첨가하고, 진탕기에서 격렬하고 진탕했다. 20분 후에 디클로로메탄층과 수층을 원심에 의하여 분리하고, 디클로로메탄층(하층) 0.2㎖를 다른 유리시험관에 분취했다. 디클로로메탄을 증발 건고한 후, 데시케이타 내에서 하룻밤 방치했다. 또, 이상의 조작을 미생물의 비존재하에서 행한 것을 음성 대조로 했다.

이어서, 잔사에 디클로로메탄 0.16㎖를 첨가하고, 4-노닐페놀을 재용해한 후, 페놀성 히드록시기를 TMS화하기 위하여 BSTFA를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. TMS화 반응 종료후, 비스페놀 A 측정의 경우와 동일한 조건으로, 가스 크로마토그래피(GC)를 사용하여 4-노닐페놀을 정량적으로 분석했다.

(d)미생물에 흡착한 4-노닐페놀 량의 산출

미생물에 흡착된 4-노닐페놀의 양은 상기 (c)에 의하여 측정된 미생물에 의하여 흡착되지 않은 4-노닐페놀의 양으로부터 다음 식을 사용하여 산출된다.

Y= X- (SA × CB/SB × CA) × X

Y: 미생물에 흡착된 4-노닐페놀의 양

X: 반응액에 첨가된 4-노닐페놀의 양

CA: 미생물 비존재하의 반응액에 함유되는 4-노닐페놀의 피크 면적

CB: CA에 대응하는 비스페놀 B의 피크 면적

SA: 미생물에게 흡착되지 않은 4-노닐페놀의 피크 면적

SB: SA에 대응하는 비스페놀 B의 피크 면적

(3) 각종 미생물의 아트라진 흡착작용:

(a) 공시시료의 조제

상기 (1)(a)와 동일하게 하여 공시시료를 조제했다.

(b) 아트라진 시료의 조제

아트라진(GL Science Inc.) 100mg를 전자 저울에서 메스 플라스크(10㎖)에 칭량하고, 에탄올(Wako Pure Chemicals Industry, 특급)로 정확히 10㎖로 조제했다. 이 용액 3㎖를 트랜스퍼 피펫트로 다른 메스 플라스크(50㎖)에 분취하고, 에탄올로 정확하게 50㎖로 조제하고, 이 용액을 흡착시험에 제공했다.

(c) 미생물과 아트라진의 흡착반응 및 잔존 아트라진 량의 측정

상기 (a)에 기재된 생균체 또는 가열 균체의 현탁액 3.8㎖를 함유하는 유리시험관에 (b)에 기재된 아트라진의 에탄올 용액 0.2㎖를 첨가하여, 충분히 교반한 후, 37℃의 수욕중에 정치했다. 60분 후에 미생물을 원심분리하여 침전시키고, 상청 l㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 여기에, 디클로로메탄 1㎖를 첨가하고, 진탕기에서 격렬하고 진탕했다. 20분 후에 디클로로메탄층과 수층을 원심에 의하여 분리하고, 디클로로메탄층(하층) 0.2㎖를 다른 유리 시험관에 분취했다. 디클로로메탄을 증발 건고한 후, 데시케이타 내에서 밤새 정치했다. 또한, 이상의 조작을 미생물의 비존재하에서 행한 것을 음성 대조로 했다.

이어서, 잔사에 아세토니트릴과 50mM NH₄H₂PO₄수용액의 혼액(55: 45) 0.2㎖를 첨가하고, 아트라진을 재용해한 후, 후기 조건에 따라 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 아트라진을 정량적으로 분석했다.

(HPLC 측정조건)

HPLC 장치: Waters 2690 (Waters Corp.)

컬럼: Symmetry C₁₈5㎜(Waters Corp., 4.6 × 150㎜)

컬럼 온도: 37℃

유속: 1㎖/분

이동상: 아세토니트릴(Wako Pure Chemicals Industry, HPLC 용)과

50mM NH₄H₂PO₄수용액의 55: 45 혼액

검출기: Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Corp.)

검출 파장: 230nm

분석 시간: 10 분

(d) 미생물에게 흡착한 아트라진 량의 산출

미생물에 흡착된 아트라진의 양은 상기 (c)에 의하여 측정된 미생물에 의해 흡착되지 않았던 아트라진의 양으로부터 다음 식을 사용하여 산출된다.

Y= X- (S/C) × X

Y: 미생물에 흡착한 아트라진의 양

X: 반응액에 첨가한 아트라진의 양

S: 미생물에 흡착되지 않았던 아트라진의 피크 면적

C: 미생물 비존재하의 반응액에 함유된 아트라진의 피크 면적

(4) 미생물의 랫트 분변 중에의 비스페놀 A의 배출 촉진작용:

(a) 시험사료 및 군 설정

시험사료는 AIN-76 조성(Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Committee on Standards for Nutritional Studies; J. Nutr., 107, 1340, 1977)의 사료에 준하여 표 2의 조성에 따라서 조제했다. 시험 군으로서는 동결 건조 생균체를 2.5%, 5% 또는 10% 첨가한 균체 투여군과 균체를 첨가하지 않은 대조군을 이용하여 각 군 8마리로 했다. 또, 각 사료에는 균체의 동결 건조시에 보호제로 이용한 탈지분유가 사료 중량의 15%씩 함유되어 있다. 사료조성을 표 2에 나타낸다.

성분	대조군	균체 투여군
성분	대조군	2.5%	5%	10%
카제인	12.5	12.1	11.8	11.0
DL-메티오닌	0.3	0.3	0.3	0.3
α-콘스타치	15.0	14.6	14.1	13.2
슈크로오즈	42.5	41.3	40.0	37.5
셀루로오즈 화이버	5.0	4.9	4.7	4.4
콘 오일	5.0	4.9	4.7	4.4
AIN-76 미네랄 혼합	3.5	3.4	3.3	3.1
AIN-76 비타민 혼합	1.0	1.0	0.9	0.9
중주석산 콜린	0.2	0.2	0.2	0.2
탈지분유	15.0	15.0	15.0	15.0
동결 건조 생균체	0.0	2.5	5.0	10.0

표중의 숫자는 질량%

(b) 동물 및 시험사료의 투여 방법

10주령의 피셔 344계 암컷 랫트(일본 Clea)를 1주간 순화 사육(Oriental Yeast Co., Ltd.의 MF 사료 자유섭취)한 후, 체중 기준으로 7군으로 분류했다. 시험사료는 12일간 투여하고, 사료, 음료수도 자유 섭취시켰다. 사육환경은 명암 12시간 사이클, 실온 25℃, 습도 55%로 했다.

(c) 비스페놀 A의 투여방법 및 분변의 채취

시험사료의 투여 개시 5일째에 밤새 절식시키고, 다음 날 100㎍의 비스페놀 A를 함유하는 10g의 시험사료를 투여했다. 비스페놀 A 투여일부터 7일간의 분변을 전량 채취하여, 동결 건조했다.

(d) 분변중의 비스페놀 A의 추출

분변중의 비스페놀 A는 "하수도에 있어서의 내분비 교란 화학물질 조사 매뉴얼"(일본 財團法人下水道新技術推進機構) 및 "내분비 교란 화학물질 (환경호르몬)의 분석 III" (GL Science Inc.)에 준하여 추출했다. 또한, 비스페놀 A의 추출에는 잔류농약 시험용의 유기용매를 사용했다. 즉, 동결 건조한 분변 0.5g를 유리 시험관에 칭량하여, 비스페놀 A-d16(서로게이트 물질) 1㎍과 메탄올 10㎖를 첨가한 후, 격렬하게 진탕하였다(200 스트로크/분). 10분 후에 원심분리(2,000 rpm, 20분간)하여 얻은 상청을 다른 유리 시험관에 분취했다. 원심분리후의 잔사에 메탄올 10㎖를 첨가하여 격렬하고 진탕한 후, 원심분리후 상청을 앞에서 얻은 상청과 합하였다. 이 상청 (약 20㎖)을 약 5㎖까지 농축한 후, 정제수 0.125㎖ 와 n-헥산 2.5㎖를 첨가하고 격렬하게 진탕했다(200 스트로크/분). 메탄올 층에 신선한 n-헥산 2.5㎖를 첨가하고 격렬하게 진탕했다(200 스트로크/분). 10분 후에 메탄올 층을 약 1㎖까지 농축한 후, 0.125N의 HCl 수용액으로 pH를 3으로 조정했다.

이 용액에 3.75% NaCl 수용액 4㎖와 디클로로메탄 5㎖를 첨가하고, 격렬하게 진탕했다(200 스트로크/분). 10분 후에 하층의 디클로로메탄층을 다른 유리 시험관에 분취한 후, 상층에 새로운 디클로로메탄 5㎖를 첨가하고, 격렬하고 진탕했다(200 스트로크/분). 10분 후, 디클로로메탄층을 앞의 디클로로메탄층과 합하고, 약 5㎖로 농축한 후, 무수 황산나트륨 1.5g를 첨가하여 탈수했다. 이 용액을 실리카겔 컬럼 (40㎜ × 12㎜)에 걸은 후, n-헥산 10㎖를 흘려, 용출액은 버렸다. 다음에 아세톤 10㎖를 흘려 용출액을 분취했다. 얻어진 용출액을 증발 건고한 후, 잔사에 디클로로메탄 0.26㎖를 첨가하여, 비스페놀 A를 재용해했다.

그런 다음, 페놀성 히드록시기를 TMS화하기 위하여, BSTFA를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치했다. TMS화 반응 종료후, 페난트렌-d10(내부 표준물질)의 디클로로메탄 용액 (10㎍/㎖) 0.1㎖를 첨가하고, 후기 조건에 따라 가스 크로마토그래피/질량분석계(GC/MS)를 사용하여 비스페놀 A를 정량적으로 분석했다.

(e) GC/MS 측정 조건

상기 (2)(d)와 동일하게 하여 측정했다.

(f) 비스페놀 A의 정량

GC/MS의 측정에서 얻어진 비스페놀 A의 TMS체와 비스페놀 A-d16의 TMS체와의 피크 면적 값의 비로부터 검량선에 의하여 비스페놀 A의 검출량을 구했다. 다음에, 검출량, GC/MS에의 시료 주입량, 시험에 제공한 분변량 및 농축배율 등으로부터 다음 식을 사용하여 분변중의 비스페놀 A 농도가 산출된다.

Y= D × (L × 1000/I)/F

Y: 미생물에 흡착한 비스페놀 A의 양(㎍/g)

D: GC/MS에 의한 검출량(㎍)

L: 시료의 최종 액량(㎖)

I: GC/MS에의 시료 주입량(㎕)

F : 시험에 제공한 분변량(g)

(g) 맹장 내용물중의 생균수의 측정

상기 (a)에 기재된 생균을 12일간 투여한 랫트로부터 펜토바르비탈 마취하에서 맹장을 채취한 후, 얼음 중에 보관했다. 맹장 내용물중의 생균수는 유키 등의 방법(Norikatsu YUKI, Yukiko SAKAITANI, Yoko Tagami 및 Masami MOROTOMI, "발효유중의 Lactobaillus casei strain Shirota의 소화관내 잔류 특성", 건강·영양 식품 연구: 2, 1-6, 1999) 또는 아사바라 등의 방법(Takashi ASAHARA, Kensuke SHIMIZU, Yuji OHASHI, Takahiro MATSUKI, Kazumasa MATSUMOTO, Toshihoko TAKADA, Norikatsu YUKI, Hiroo TAKAYAMA 및 Ryuichiro TANAKA, "가열 처리한 기계로 간 고기 섭취에 의해 상승하는 사람 뇨중 변이원 활성에 대한 비피더스균 발효유의 억제효과", 장내 세균학 잡지: 12, 89-96, 1999.)에 따라서 측정했다.

(h) 통계 해석

얻어진 데이터의 통계해석은 다넷트(Dunnett)의 다중 비교 검정으로 행했다.

실시예 1

락토바실러스·카제이 YIT 9029에 의한 비스페놀 A의 흡착시험(1):

상기 (1)(a)의 공시시료의 조제법에 따라, 락토바실러스·카제이 YIT 9029 의 생균체 및 가열 균체를 얻었다. 이들을 이용하여 미생물 농도와 비스페놀 A의 흡착량의 관계를 조사했다. 시험샘플로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체 및 가열균체를 각각 그의 최종 농도가 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10g/ℓ가 되도록 조제한 것을 사용했다. 이것들의 시험 샘플에 비스페놀 A를 40㎍ 첨가하여, 반응시킨 후에, 원심후 상청에 잔존하는 비스페놀 A의 양을 가스 크로마토그래피로 정량하고, 그 값으로부터 흡착량을 구했다. 이 결과를 도 1에 나타낸다.

(결과)

도 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스·카제이 YIT 9029에 흡착한 비스페놀 A의 양은 반응액중의 당해 미생물의 농도에 의존하여 상승했다. 이 흡착작용은 생균체 및 가열균체의 어느 쪽에서도 확인되며, 생균체에 비하여 가열 균체의 쪽이 더 많이 비스페놀 A를 흡착하는 것을 알았다. 이것은 본 발명과 관한 미생물은 생균에서도, 사균에서도 그 효과를 발휘하는 것을 나타내는 것이다.

따라서, 이들의 미생물을 사용하여 음식품을 제조했을 경우, 반드시 균체를 생존하게 하여 두지 않으면 안 되는 것은 아니고, 보다 폭넓은 가공수단(온도나 pH등)을 이용하여 음식품을 제조할 수가 있다.

실시예 2

락토바실러스·카제이 YIT 9029 에 의한 비스페놀 A의 흡착시험(2)

미생물로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체를 이용하여 미생물 농도와 비스페놀 A의 흡착량 및 잔존한 비스페놀 A와의 관계를 조사했다. 시료 샘플로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체를, 각각 그의 최종농도가 0, 0.625, 1.25, 2.5 및 10g/ℓ이 되도록 조정한 것을 사용했다. 이것들의 샘플에 비스페놀 A를 20㎍ 첨가하고, 반응시킨 후에, 균체가 흡착한 비스페놀 A의 양 및 원심후의 상청에 잔존한 비스페놀 A의 양을, 각각 상기 (1)(c) 및 (e)의 측정방법으로 따라서 GC/MS, 가스 크로마토그래피로 정량하여, 상기 (1)(d) 및 (f)의 산출법에 따라 구했다. 이 결과를 도 2에 나타낸다.

(결과)

도 2에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스·카제이 YIT 9029에 흡착한 비스페놀 A의 양은 반응액중의 당해 미생물 농도에 의존하여 상승했다. 이에 대하여, 반응액의 원심후 상청에 잔존한 비스페놀 A의 양은 당해 미생물 농도에 의해 저하했다. 이 때, 당해 미생물에 의한 흡착량과 원심후 상청중의 잔존량의 합은 반응액에 첨가한 비스페놀 A의 양(20㎍)에 같았다.

이것은 균체가 흡착하고 있지 않은 비스페놀 A가 원심후 상청에 모두 존재하고 있는 것을 나타내며, 원심후 상청에 잔존하는 비스페놀 A의 양으로부터 산출한 균체에 흡착한 비스페놀 A의 양은 실제로 균체가 흡착한 비스페놀 A의 양과 같은 값이 되는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3

락토바실러스·카제이 YIT 9029에 의한 비스페놀 A의 흡착시험(3):

미생물로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체 및 가열 균체를 이용하여 동물시험에서 사용되는 사료(상품명: F-2, Funabashi Farm Company)의 공존하에서, 미생물 또는 사료 농도와 비스페놀 A의 흡착량의 관계를 조사했다. 시료 샘플로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체, 가열 균체 또는 사료의 최종농도가 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 g/ℓ로 되도록 조제한 것을 사용하였다. 이들 샘플에 비스페놀 A를 40㎍ 첨가하고, 반응시킨 후에, 원심후 상청에 잔존한 비스페놀 A의 양을 가스 크로마토그래피로 정량하여, 그 값으로부터 흡착량을 구했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

(결과)

락토바실러스·카제이 YIT 9029는 일정 농도의 사료 공존하에서도 균체의 농도 의존적으로 비스페놀 A를 흡착했다.

한편, 도 4에 나타난 바와 같이, 락토바실러스·카제이 YIT 9029가 흡착한 비스페놀 A량은 반응액중의 사료 농도에 영향을 받지 않았다.

이것은 락토바실러스·카제이 YIT 9029가 사람이나 동물의 소화관내에서 식이 성분의 존재에 영향을 받지 않고, 비스페놀 A를 선택적으로 흡착함을 나타내는 것이다.

실시예 4

락토바실러스·카제이 YIT 9029에 의한 비스페놀 A의 흡착시험(4):

미생물로서 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체 및 가열 균체를 이용하여 반응계의 pH와 미생물 농도와 비스페놀 A의 흡착량의 관계를 조사했다. 시험은 20mg의 락토바실러스·카제이 YIT9029와 40㎍의 비스페놀 A를 4㎖의 완충액 중에서 37℃로 가온하고, 60분 후, 흡착량을 측정했다. 시험 샘플의 pH는 2∼9로 하고, pH가 2∼4의 완충액은 20mM의 KH₂PO₄수용액에 염산을 첨가하여 조제했다. 또한, pH가 5∼8의 완충액은 20mM의 KH₂PO₄수용액과 20mM의 K₂HPO₄수용액을 혼합함으로서, pH가 9인 완충액에는 20mM의 K₂HPO₄수용액을 사용하여 조제했다. 이 결과를 도 5에 나타낸다.

(결과)

도 5에 나타낸 바와 같이, 가열한 락토바실러스·카제이 YIT 9029는 어떠한 수소이온농도(pH)에서도 거의 동량의 비스페놀 A를 흡착했다. 이에 반해, 생균체는 강산성 영역(pH 2)에서 보다 많은 비스페놀 A를 흡착했다. 또한, 어느 pH에서도 가열균체의 쪽이 생균체보다도 많은 비스페놀 A를 흡착했다.

이 결과는 식도로부터 항문까지의 소화관내의 어떠한 수소이온농도 부위에 서도, 당해 미생물이 한결같이 비스페놀 A를 흡착할 수 있는 능력을 가지는 것을 나타낸다. 또한, 그의 작용은 생균 또는 사균의 것을 묻지 않음을 나타내고 있다.

실시례 5

락토바실러스·카제이 YIT 9029에 의한 비스페놀 A의 흡착시험(5):

미생물로서 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체 및 가열 균체를 이용하여 반응시간과 비스페놀 A의 흡착량의 관계를 조사했다. 시험은 20mg의 락토바실러스·카제이 YIT 9029와 40㎍의 비스페놀 A를 4㎖의 완충액중에서 37℃로 가온하고, 1, 2, 5, 10, 30, 60 및 1440분(24 시간) 후에 흡착량을 측정했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.

(결과)

도 6 에 나타난 바와 같이, 생균체 및 가열 균체 모두 반응 개시 직후에 비스페놀 A의 흡착량이 최대에 도달하며, 24시간(1440분)까지 그의 흡착작용이 지속함을 알았다.

이 결과는 당해 미생물이 일단 비스페놀 A를 흡착하면, 균체로부터 유리하지 않고, 소화관내를 항문까지 수송되어 분변으로 체외에 배출되는 것을 시사하는 것이다.

실시예 6

각종 미생물에 의한 비스페놀 A의 흡착시험:

20mg 의 생균체 또는 가열 균체와 40㎍의 비스페놀 A를 4㎖의 완충액중에서 37℃에서 정치했다. 60분 후에 원심후 상청에 잔존한 비스페놀 A량을 측정하고, 균체에 흡착한 비스페놀 A의 양을 산출했다. 균체에 흡착한 비스페놀 A의 양은 1㎎의 균체가 흡착한 비스페놀 A의 양을 마이크로그램 단위로 나타냈다. 이 결과를 도 7에 나타낸다.

또, 비교로서 내분비 교란 화학물질 흡착 효과가 있다고 여겨지고 있는 셀 로로오즈류에 대하여, 비스페놀 A에 대한 흡착력을 조사했다. 셀룰로오즈류로서는 동물 시험에서 음식물 섬유로서 사용되는 식물 셀루로오즈(Toyo Roshi Co., Ltd.) 및 식물 셀루로오즈보다도 미세한 섬유구조를 가지는 미생물 셀루로오즈(아세토박터·패스튜리아 YIT 6109가 생산하는 셀루로오즈)를 이용했다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.

(결과)

도 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 미생물 사이에 차이가 있지만, 본 발명에 관한 미생물은 모두 비스페놀 A를 흡착했다. 또한, 어느 미생물에 대하여서도, 생균체뿐만 아니라 가열 균체에서도 많은 비스페놀 A를 흡착하는 것을 알았다.

한편, 도 8에 나타난 바와 같이, 식물 셀루로오즈는 비스페놀 A를 거의 흡착하지 않았다. 또한, 식물 셀루로오즈보다 미세한 섬유구조를 가지는 미생물 셀루로오즈는 비스페놀 A를 흡착했지만, 그 흡착작용은 본 발명에 관한 미생물의 작용에 비교하여 현저하게 낮은 것을 알았다.

이상의 결과는 비스페놀 A에 대한 흡착작용이 식물섬유 및 미생물 전반에 인정되는 작용은 아니고, 본 발명과 관한 장내 미생물에 특유의 작용인 것을 시사하는 것이다.

실시예 7

각종 미생물에 의한 4-노닐페놀의 흡착시험:

2.5mg의 생균체 또는 가열 균체와 40㎍의 4-노닐페놀을 4㎖의 완충액 중에서 37℃에서 정치하고, 60분 후에 균체에 흡착한 4-노닐페놀의 양을 산출했다. 균체에 흡착한 4-노닐페놀의 양은 1mg의 균체가 흡착한 4-노닐페놀의 양을 마이크로그램 단위로 나타냈다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.

(결과)

도 9에 나타난 바와 같이, 각각의 미생물 사이에 차이가 있지만, 본원 출원에 관한 미생물은 모두 4-노닐페놀을 흡착했다. 또한, 어느 미생물에 대하여서도, 생균체뿐만이 아니라 가열균체에서도 많은 4-노닐페놀을 흡착하는 것을 알 수 있다.

실시예 8

각종 미생물에 의한 아트라진의 흡착시험:

20mg의 생균체 또는 가열균체와 40㎍의 아트라진을 4㎖의 완충액 중에서 37℃에서 정치하고, 60분 후에 균체에 흡착한 아트라진의 양을 산출했다. 균체에 흡착한 아트라진의 양은 1mg의 균체가 흡착한 아트라진의 양을 마이크로그램 단위로 나타냈다. 결과를 도 10에 나타낸다.

(결과)

도 10에 나타난 바와 같이, 각각의 미생물 사이에 차이가 있지만, 본원 출원에 관한 미생물은 모두 아트라진을 흡착했다. 또, 어느 미생물에 대하여서도, 생균체만이 아니라, 가열 균체에서도 많은 아트라진을 흡착하는 것을 확인했다.

실시예 9

랫트장관내에 있어서의 락토바실러스·카제이 YIT 9029 또는 비피도박테리움·브레베 YIT 4065에 의한 비스페놀A의 흡착시험:

미생물로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029 또는 비피도박테리움·브레베 YIT 4065의 생균체를 이용하여 미생물의 투여량과 비스페놀 A의 배출량의 관계를 조사했다. 시험 샘플로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029 및 비피도박테리움·브레베 YIT 4065의 동결건조 생균체를, 각각 그의 최종 농도가 0, 2.5, 5 및 10%로 되도록 조제한 사료를 사용했다. 또, 비교로서 식물 셀루로오즈(Toyo Roshi Co., Ltd.)를 최종 농도가 10%가 되도록 조제한 사료를 사용했다. 상기 (4)(c)방법에 따라, 시험사료의 투여개시 5일째에 밤새 절식 후, 100㎍의 비스페놀 A를 함유하는 시험사료(10g)를 랫트에게 투여했다.

시험사료의 투여개시 후 7일간의 분변을 전량 회수하여, 분변 중량, 분변중의 비스페놀 A량, 평균 섭이량 및 체중의 총증가량을 측정했다. 또한, 시험사료 투여 후 7일째에 랫트의 맹장 내용물중의 투여균체의 생균수를 측정했다.

(결과)

도 11에 나타난 바와 같이, 대조군의 랫트의 분변에 배출된 비스페놀 A의 양은 7일간에서 17㎍이고, 이것은 투여량(100㎍)의 불과 17%에 지나지 않았다. 이것에 대하여, 락토바실러스·카제이 YIT 9029 또는 비피도박테리움·브레베 YIT 4065를 투여한 랫트에서는 분변에 배출된 비스페놀 A의 양이 균체의 투여량에 의존하여 증대했다. 이 때, 이들 균체를 10%로 섭이 투여함으로써 투여한 비스페놀 A의 45%∼48% 가 분변으로 배출되었다. 또, 시험 기간중, 군간의 체중과 섭이량에 유의인 차이는 인정되지 않았다.

한편, 도 12에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A의 투여후 7일간의 분변량은 균체의 투여량에 의존하여 상승했다. 또, 도 13에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A의 투여후 7일째의 랫트의 맹장 내용물중의 투여균체의 생균수도, 균체의 투여량에 의존하여 상승했다. 이것은 균체의 투여에 의하여 장내에 있어서의 생균수가 증가하고, 그 결과 분변의 배출이 촉진된 것을 나타내고 있다.

더욱이, 도 14에 나타난 바와 같이, 랫트 분변중의 비스페놀 A의 농도는 군간 그리고 일정하지는 않으나, 어느 균체의 투여에 의하여도 대조군 및 식물 셀루로오즈와 비교하여 유의하게 상승했다.

이들의 결과는 락토바실러스·카제이 YIT 9029 및 비피도박테리움·브레베 YIT 4065가 식이와 함께 섭취한 비스페놀 A의 장관으로부터의 흡수를 억제하여, 분변으로 배출하는 것을 촉진하는 작용을 가지는 것을 나타내고 있다. 또한, 균체의 투여에 의한 비스페놀 A의 분변 배출량의 증대가, 균체의 투여에 의한 분변량의 증가를 일으킬 뿐만 아니라, 당해 물질에 대한 균체 자신의 흡착량이 증가한 결과에 의한 것을 나타내고 있다.

실시예 10

각종 음식용 조성물의 제조 :

본 발명에 관한 미생물을 사용하여, 각종 음식용 조성물을 제조했다. 이하에 그 처방 예를 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

(1) 건강 식품(정제)

다음 처방의 조성물을 타정하여, 정제로 했다.

(처방) 질량 %

장내 미생물 균체 건조물¹⁾10

식물 추출 분말 30

로얄 젤리 분말 5

콜라겐 분말 5

락토오즈 25

옥수수 전분20

히드록시프로필셀루로오즈 4

스테아린산마그네슘 1

1) 실시예 1에서 얻은 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균체 또는 가열 균체를 동결 건조하여 제조했다.

(2) 건강 음료

다음 처방에 의하여 건강 음료를 제조했다.

(처방)질량 %

장내 미생물균체의 건조물¹⁾5

벌꿀 15

시트르산 0.1

dl-말산 0.1

식물 추출액 (신나몬) 20

D-소르비톨액 (70%) 10

나트륨 벤조에이트 0.05

향료 적량

정제수 잔부

합계 100

1) 실시예 1에서 얻은 락토바실러스·카제이 YIT 9029의 생균 또는 가열 균체를 동결 건조하여 제조했다.

(3) 과즙 음료

다음 처방에 의하여 과즙 음료를 제조했다.

(처방) 질량 %

장내 미생물균체의 건조물¹⁾5

포도당 액당 33

그레이프 푸르츠 과즙 60

향료 적량

산미료 적량

1) 실시예 1에서 얻은 락토바실러스·카제이 YIT 9029 의 생균체 또는 가열 균체를 동결 건조하여 제조했다.

(4) 발효유

다음 방법에 의하여 발효유를 제조했다.

(A) 1종의 균주에 의한 발효유

10%의 탈지분유와 5%의 글루코오스를 멸균하고, 장내 미생물을 식균하여 발효유를 제조했다. 식균하는 장내 미생물로서는 락토바실러스·카제이 YIT 9029, 락토바실러스·액시도필루스 YIT 0168, 비피도박테리움·브레베 YIT 4065, 비피도박테리움·비피담 YIT 4007, 락토코카스·락티스 YIT 2027, 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT 2001, 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT 2021 및 엔테로콕카스·페시움 YIT 2039로부터 각각 1주를 선택하여, 합계 8종의 발효유를 제조했다. 얻어진 발효유중의 균체량은 0.1∼10g/ℓ(생균수는 약 4×10⁸∼4×10¹⁰cells/㎖)이었다. 이들 발효유는 모두 풍미가 좋고, 기호성의 높은 것이었다.

(B) 복수의 균주에 의한 발효유

10%의 탈지분유와 5%의 글루코오스를 멸균하여, 이하의 조합으로 장내 미생물을 식균하여, 합계 10종의 발효유를 제조했다.

조합 1. 락토바실러스·액시도필루스 YIT 0168 및 락토바실러스·카제 이 YIT 9029

조합 2. 비피도박테리움·브레베 YIT 4065 및 락토바실러스·카제이 YIT

9029

조합 3. 비피도박테리움·비피담 YIT 4007 및 락토바실러스·카제이 YIT9029

조합 4. 락토코카스·락티스 YIT 2027 및 락토바실러스·카제이 YIT 9029

조합 5. 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT 2001 및 락토바실러스·카제이 YIT 9029

조합 6. 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT 2021및 락토바실러스·카제이 YIT 9029

조합 7. 엔테로콕카스·페시움 YIT 2039 및 락토바실러스·카제이 YIT 9029

조합 8. 비피도박테리움·브레베 YIT 4065, 비피도박테리움·비피담 YIT

4007 및 락토바실러스·액시도필루스 YIT 0168

조합 9. 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT2021, 비피도박테리움·브레베

YIT 4065 및 락토바실러스·액시도필루스 YIT 0168

조합 10. 스트렙토콕카스·서모필루스 YIT 2001, 비피도박테리움·브레베

YIT 4065 및 락토바실러스·락티스YIT 2027

얻어진 발효유중의 총균체량은 0.1∼10g/ℓ(생균수는 약 4×10⁸∼4×10¹⁰cells/㎖)이었다. 이들 발효유는 풍미가 좋고, 기호성이 높은 것이었다.

전술한 바와 같이 장내 미생물의 생균체 또는 사균체 또는 그의 구성물은 사람 및 동물의 장관 내에서 비스페놀 A, 4-노닐페놀, 아트라진 등의 내분비 교란 화학물질을 흡착하여, 당해 물질의 생체내에의 흡수를 억제함과 동시에, 일단 흡수된 당해 물질의 체외로의 배출을 촉진하는 것이기 때문에, 내분비 교란 화학물질에 의한 인체 오염의 방어에 극히 유효한 것이다.

더욱이, 장내 미생물은 예로부터 유산균 음료나 요구르트 등의 식품의 제조에 사용되고 있는 것으로부터 밝혀진 바와 같이, 병원성이 없는 안전한 미생물이다.

따라서, 상기 장내 미생물의 균체 등을 함유하는 본 발명의 내분비 교란 화학물질 흡착제는 경구 투여하는 의약으로서 이용할 수 있는 것 외에, 식품에 혼합하여 일상적으로 섭취하여, 내분비 교란 화학물질에 의한 인체 오염의 방어를 도모할 수가 있기 때문에, 건강 유지를 위하여 매우 유효한 것이다.

Claims

장내 미생물의 생균체 또는 사균체 또는 그의 구성물을 유효성분으로 함유하는 내분비 교란 화학물질 흡착제.
제 1항에 있어서, 내분비 교란 화학물질이 비스페놀류, 알킬페놀류 또는 트리아진류인 내분비 교란 화학물질 흡착제.
제 1항에 있어서, 장내 미생물이 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 락토바실러스속, 스트렙토콕카스속, 엔테로콕카스속, 와이셀라속, 로이코노스톡속, 테트라제노콕카스속, 프로피오니박테리움속, 박테로이데스속, 클로스트리디움속, 프레보텔라속 및 유우박테리움속의 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종이상인 내분비 교란 화학물질 흡착제.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 장내 미생물이 내분비 교란 화학물질의 사람 및 동물의 장관으로부터 체내에의 흡수를 억제하는 작용을 가지는 것인 내분비 교란 화학물질 흡착제.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 장내 미생물이 내분비 교란 화학물질의 체외로 배출을 촉진하게 하는 것인 내분비 교란 화학물질 흡착제.
제 1항 내지 제 5항의 어느 1항에 있어서, 장내 미생물의 가열균체를 이용하는 것인 내분비 교란 화학물질흡착제.
제 1항 내지 제 6항의 어느 1항 기재의 내분비 교란 화학물질 흡착제를 함유하여 되는 음식품.
사람 및 동물에 내분비 교란 화학물질 흡착제를 투여함을 특징으로 하는 내분비 교란 화학물질의 체내에의 급수억제 방법.
사람 및 동물에 내분비 교란 화학물질 흡착제를 투여함을 특징으로 하는 내분비 교란 화학물질의 체외로의 배출 촉진방법.