KR20020085326A - 신규 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한효소의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곤충세포를 숙주로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한 다양한 효소의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배큘로바이러스의 다각체 프로모터, 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열, 상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 제한효소 자리가 있는 클로닝 부위, 상기 클로닝 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결 서열, 상기 배큘로바이러스의 다각체 프로모터의 업스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 한 서열, 상기 전사 종결 서열의 다운스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 다른 서열 및 선택표지로서의 항생제 내성 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한 효소의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한 효소의 제조방법{Novel Recombinant Baculovirus Expression Vectors and Process for Preparing Enzymes with the Same}

본 발명은 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 효소의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 곤충세포를 숙주로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터 및 이를 이용한 다양한 효소의 제조방법에 관한 것이다.

유용 단백질을 대량 생산하기 위한 발현벡터 시스템은 대장균, 고초균 등 원핵세포, 효모와 같은 하등 진핵세포, 배큘로바이러스 (baculovirus)를 벡터로 사용하는 곤충세포, 또는 CHO와 같은 포유류 세포를 사용하여 왔다. 상기 대장균 발현 시스템은 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 발현벡터 구축이 용이하며 생산되는 단백질의 양이 비교적 많은 장점이 있는 반면, 번역후 수식 (post-translational modification)이 진핵세포의 패턴과 같지 않아 생물학적 활성도를 기대하지 못하고 봉입체 (inclusion body)로 발현될 때 리폴딩 (refolding)이 어려워 실용성이 없는 단점을 갖는다. 한편, 포유류 세포에서 발현된 단백질은 글리코실화 (glycosylation)를 포함하는 번역후 수식이 원활하게 이루어져, 활성도와 안정성이 높은 단백질의 생산이 가능하다는 장점이 있는 반면, 곤충세포 발현 시스템에 비해 발현 효율이 낮으며 생산비가 고가인 단점이 있다.

배큘로바이러스는 막대 모양의 뉴클레오캡시드 내에 130-200 kbp의 환형 이중나선 DNA 지놈을 갖고 있다. 배큘로바이러스는 매우 제한된 숙주 범위를 갖고 있으며, 주로 곤충 세포에 감염하여 치명적인 질병을 일으키는 특성이 있으며, 이러한 특성을 이용해 생물학적 살충제로 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다 (Summers 등, Genetic engineering of the genome of the AcNPV, 319(1985)). 배큘로바이러스는 복제과정에서 두 가지 형태의 바이러스를 생산하며, 그 중 하나는 곤충 애벌레의 먹이가 되는 식물 잎 등에 붙어 있는 배큘로바이러스로서, 이는 다각체 (porihedrin) 단백질로 둘러싸여 있어 외부에 노출된 상태로 존재할 때 유해 환경요소로부터 보호된다. 이러한 형태의 배큘로바이러스는 감염된 곤충 애벌레에서 비감염 애벌레로의 감염원이 된다. 다른 형태의 배큘로바이러스는 상기한 다각체가 없으며 조직배양세포 사이와 감염된 유충에서 세포간 감염을 일으킨다.

한편, 상기 다각체를 암호화하는 유전자는 배큘로바이러스 감염 후 20시간 이후에 발현되는 말기 발현 유전자 (very late gene)에 속하며, 감염 후기 세포에서 발현 단백질의 20-50% 정도를 차지할 정도로 발현양이 매우 크다 (Vialard 등,J. Viro., 64:37-50(1990)). 상기한 다각체의 과발현성에 착안하여 외래 유전자를 강력한 다각체 프로모터 (polyhedrin promoter) 뒤에 삽입함으로써, 재조합 단백질을 생산하는 배큘로바이러스 발현 시스템이 개발되었다.

1980년대 중반 오토그라파 칼리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus: AcNPV)를 발현벡터 시스템으로 사용하여 사람의 α또는 β-인터페론을 곤충세포에서 발현한 이래로, 현재까지 인터루킨-2, HTLV-I 단백질을 비롯한 수백 종 이상의 바이러스 및 동 식물의 다양한 유전자들이 곤충세포에서 발현되었다. 배큘로바이러스를 벡터로 사용하여 곤충세포에서 발현하는 시스템은 다른 벡터 시스템과 비교하여 유용 단백질이 과발현된다는 점 이외에 포유류 세포와 가장 유사한 번역후 수식이 일어난다는 장점이 있다. 곤충세포의 번역후 수식 (예: 단백질 절단 가공, N-말단 블록킹, 인산화, 지질 수식, 글리코실화 등)이 포유류 세포와 유사하게 일어나기 때문에 곤충세포에서 생성된 재조합 단백질은 구조가 정확하고 활성을 갖는 경우가 많다.

거염벌레 (fall army worm)에서 유래되는 곤충세포 스포도테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda(Sf9 또는 Sf21)) 또는 배추 자벌레 (cabbage looper)에서 유래되는 곤충세포 트리코플루시아 나이(Trichoplusia ni(BTI-TN-5B1-4)) 등의 세포주들은 배큘로바이러스가 감염할 수 있는 세포들로서 정체배양과 대량 배양의 필수 조건인 부유배양이 가능하여 일시에 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

현재까지 개발 및 이용되고 있는 배큘로바이러스 발현 시스템으로는 상기한 AcNPV 외에도 누에 (silk worm)에 감염하는 BmNPV (Bombyx morinuclear polyhedrosis virus)가 있으나, 다양한 이동 벡터 (transfer vector)와 숙주 세포주가 개발되어 있는 AcNPV 시스템이 일반적으로 이용되고 있다. 또한, 배큘로바이러스 프로모터들 중에 강력한 프로모터로 알려져 있는 다각체 프로모터에 외래 유전자를 융합하여 감염 후기에 다량의 재조합 단백질을 발현하도록 하는 방법이 주로 이용되고 있다 (O'Reilly, D. R. 등, Baculovirus expression vectors, (1992)).

세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질, 당지질의 당쇄는 박테리아 및 바이러스의 숙주세포에의 감염, 세균독소의 접착, 세포의 암화 및 암전이, 면역세포와 신경세포의 분화유도 등을 포함한 수정 및 발생, 분화과정에서 세포간의 인식, 접착 등의 상호작용에 의한 다세포 사회의 기간적인 생명 현상에 깊이 관여하고 있는 것이 알려져 있다 (Hakomori 등,J. Natl. Cancer Inst., 71:231(1983)). 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸 등에 존재하는 당쇄는 복합당질 (glycoconjugates)로 총칭되고, 각각의 당쇄는 그들 당쇄를 합성하는 당전이효소 (glycosyltransferase)와 분해하는 당쇄분해효소 (glycosidase)에 의하여 구축되어지는데, 일반적으로 이러한 2개의 효소군을 암호화하는 유전자를 당쇄유전자 (glycogene)라 부른다. 당쇄 합성은 단백질 합성과는 달리 유전자의 직접적인 지배를 받지 않고 당쇄유전자에 의해 암호화되는 당전이효소나 당쇄분해효소에 의한 조절적인 제어에 의해 2차적으로 구축되기 때문에, 당쇄유전자의 복잡한 발현기구나 생체 내에 존재하는 당쇄의 복잡한 다양성을 창출하는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 발생과 분화, 암화 등에 의한 당쇄 구조의 변화 기작을 이해하기 위해서는당쇄 유전자의 해석이 필요하고 생명 현상에 관여하는 당쇄의 생물학적 기능과 당쇄의 발현기구를 유전자 수준에서 해명하기 위해서도 당쇄 유전자의 연구는 필수적이다.

상기 당전이효소는 공여체인 당뉴클레오티드로부터 단당을 수용체에 전이하여 새로운 글리코시드 결합을 형성하는 일련의 효소를 총칭한다. 공여체의 경우, 당뉴클레오티드의 뉴클레오티드 부분에 의해 서로 다르게 존재하는데, 글루코스 (Glc), 갈락토스 (Gal), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), 글루쿠론산 또는 크실로오스에는 UDP가 결합하며, 퓨코스 (Fuc), 만노스 (Man)에는 GDP가 결합하고, 시알산 (NeuAc, NeuGc)에는 CMP가 결합한다. 한편, 수용체로는 단당, 올리고당, 다당, 펩티드, 단백질, 당단백질, 지질, 당지질, 프로테오글리칸 등이 있다. 당쇄 합성은 당의 아노머 구조 (α-, β-)와 글리코시드 결합부위 및 형성되는 당쇄에 대해 각각 특이적인 당전이효소에 의해 이루어지므로 (one enzyme one linkage), 생체 내에는 약 200-300 종의 서로 다른 당전이효소가 존재하고 특히 동물세포에 존재하는 복합당질의 당쇄의 합성에는 약 100-150 종류 이상의 당전이효소가 관여하고 있다 (Paulson, J. C. 등,J. Biol. Chem., 264: 17615(1989)).

당전이효소는 막결합단백질로서 생체 내에 미량으로 존재하고 열에 불안정하기 때문에 당전이효소의 분리 및 정제는 극히 어려운 것으로 알려져 있다. 1970 년대 Hill 등 (J. Biol. Chem., 247:7135-7147)은 상기한 공여체 또는 수용체와 유사한 물질을 이용하여 실시되는 친화력 크로마토그래피로 락토스 합성효소인 β1-4갈락토스전이효소 (GalT)를 최초로 우유에서 정제하였고, 1986년에는 상기 효소의 cDNA 클로닝이 당전이효소로서는 최초로 보고되었다.

그 후 분자생물학의 발달에 의해 지금까지 약 30종 이상의 서로 다른 당전이효소의 cDNA가 클로닝 되고 그들에 대한 아미노산 서열이 알려져 당전이효소들의 1 차 구조상에는 공통적인 도메인 구조가 존재한다는 사실이 밝혀졌다. 현재까지 규명된 바에 따르면, 클로닝된 당전이효소들은 모두 타입 Ⅱ 막관통 영역, 스템 영역 및 촉매활성 영역으로 이루어진 4개의 도메인 구조로 되어 있으며, 이 중에서 막관통 영역에는 골지체 표적 시그널이 존재하는 것으로 확인되었고, 스템 영역에는 단백질분해효소에 의한 절단 부위가 존재하여 절단에 의해 가용성의 활성형 효소가 우유나 혈청과 같은 가용성 부분에서 정제되는 것으로 추측되고 있다 (Kleene, R. 및 Berger, E. G.,Biochim. Biophys. Acta, 1154:283(1993)).

한편, 시알산 (sialic acid; Sia, NeuAc)은 뉴라민산 (neuraminic acid; Neu)의 아실 유도체의 총칭으로서, 1936년 Blix에 의해 우타액샘의 뮤신으로부터 최초로 분리되었고, 그 구조는 총 9개의 탄소로 구성되어 있으며 COOH기를 갖고 있는 산성당으로 알려져 있다. 고등동물에서 시알산은 당단백질, 당지질 및 올리고당쇄의 Gal, GlcNAc, GalNAc 및 시알산에 각각 특이적인 시알산전이효소의 작용에 의해 α-글리코시드 결합으로 연결되어 있다. 복합당질의 당쇄의 시알산은 세포막 표면에 존재하는 당쇄 구조에서 가장 말단에 위치하고 있기 때문에 세포와 세포외 환경과의 접촉에 직접적으로 관여하고 있을 것으로 예상되었고, 오래전부터 체액중의 혈구 세포나 당단백질의 수명이 시알산의 제거에 의해 단축되는 것이 알려져 있다 (Ashwell 등,Ann. Rev. Biochem., 51:531(1982)).

시알산전이효소는 당뉴클레오티드인 CMP-NeuAc 또는 CMP-NeuGc를 공여체로 하여 갈락토스 등의 수용체 기질 당쇄의 비환원성 말단 (HO-수용체)에 시알산을 전이하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 형성하는 결합위치 (2-3, 2-6, 2-8) 뿐만 아니라 수용체 당쇄의 배열이나 고차구조에도 특이성을 나타내기 때문에 포유동물에서 발견되는 복합당질의 시알산당쇄의 생합성에도 적어도 12 종류 이상의 시알산전이효소가 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(Beyer 등,Adv. Enzymol., 52:23(1981)).

최근에는 많은 종류의 당전이효소들의 cDNA 및 지놈 유전자가 분리되어 그들의 기능과 전사조절기구 해석 및 세포 내에서의 위치, 나아가 세포 표면에 발현하고 있는 당쇄의 기능 연구에 큰 진전을 보이고 있다. 현재까지 약 30 종류 이상의 당전이효소 유전자의 cDNA가 클로닝 되었지만 동물세포에 존재하는 복합당질의 당쇄의 합성에는 약 100-150 종류의 당전이효소가 관여하고 있는 것으로 추측되고 있기 때문에, 당전이효소 유전자의 클로닝은 현재까지 클로닝된 유전자의 정보와 클로닝 방법을 이용하여 이제부터 본격적으로 이루어질 전망이다.

또한, 다른 당전이효소에서와 마찬가지로 시알산전이효소에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있지만, 대량생산이 난이하여 연구에 많은 제약이 따르고 있다. 따라서, 현재 해결하여야 하는 과제는 기존의 클로닝된 유전자를 이용한 활성형 시알산전이효소의 대량생산과 효소 이용기술 개발이다.

현재까지 의약품으로 사용 되어온 당쇄 유도체는 화학적 합성에 의해 생산되어 왔으나, 단당과 단당을 연결하는 당쇄화 (glycosylation) 반응은 그 반응의 위치 선택성 및 입체 선택성 때문에 목적으로 하는 당쇄 유도체의 합성이 매우 어렵고 과다한 생산비용 때문에 당전이효소에 의한 합성 및 대량생산이 크게 기대되고 있다. 특히, 화학적 합성에 의한 시알산의 도입은 당쇄화 반응 중에서도 가장 어려운 단계이므로, 화학적 합성을 대체하여 시알산전이효소를 이용하게 된다면 시알산 함유 당쇄 유도체를 대량생산하게 되고, 이에 암세포 증식 억제제 및 염증질환 저해제와 같은 당쇄 유도체의 의약품 개발에 현실적으로 기여할 수 있게 된다. 한편, 활성형 당전이효소의 대량생산은 현재까지 갈락토스 전이효소에 대해서만 성공적인 예가 있을 뿐, 활성형 시알산전이효소의 대량생산에 대한 성공적인 예는 전무한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시하였다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 신규한 재조합 배큘로바이러스 발현벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 발현벡터를 이용한 곤충세포에서 외래 효소의발현방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 발현벡터를 이용한 외래 효소의 제조방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 플라스미드 pFastBacMG-ST6GalI의 제작 과정을 대 략적으로 나타낸 모식도;

도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pFastBacMG-ST6GalI의 유전자 지도;

도 3은 인간시알산 전이효소 유전자를 사람 태반세포에서 클로닝하고 pFastBacMG 벡터 내에 삽입하는 과정을 보여주는 아가로스 겔 사진;

도 4는 재조합 플라스미드 pFastBacMG-ST6GalI 및 곤충세포를 이용한 시알산전이효소의 발현과정을 대략적으로 나타낸 모식도;

도 5는 재조합 플라스미드 pFastBacMG-ST6GalI 및 곤충세포를 이용하여 발현된 시알산전이효소를 확인하기 위한 SDS-PAGE (A 패널)및 웨스턴 블롯팅 (B 패널)겔 사진;

도 6은 본 발명의 최종적인 정제 단계에서 수득한 시알산전이효소의 SDS-PAGE 겔 사진;

도 7은 상기 도 6에 해당하는 시료의 웨스턴 블롯팅 겔 사진;

도 8은 본 발명에 따라 정제된 시알산전이효소의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프; 및

도 9는 본 발명에 따라 정제된 시알산전이효소의 EPO에 대한 활성을 나타내는 등전집속 겔 사진.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 배큘로바이러스의 다각체 프로모터, 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열, 상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 제한효소 자리가 있는 클로닝 부위, 상기 클로닝 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결 서열, 상기 배큘로바이러스의 다각체 프로모터의 업스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 한 서열, 상기 전사 종결 서열의 다운스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 다른 서열 및 선택표지로서의 항생제 내성 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터를 제공한다.

상기한 본 발명의 발현벡터는 종래의 배큘로바이러스 벡터를 이용한 단백질의 대량발현 시스템을 개선하기 위하여 제작된 것으로서, 곤충세포에서 목적 단백질의 대량 발현 및 이의 효과적인 분리 및 정제를 개선하기 위하여 제작된 것이다.

본 발명의 발현벡터에 있어서, 배큘로바이러스의 다각체 프로모터는 배큘로바이러스의 말기 발현 유전자인 다각체 유전자의 발현을 조절하는 것으로서, 곤충세포 내에서 작동되는 강력한 프로모터 중 하나이다(참조: O'Reilly, D. R. 등,Baculovirus expression vectors, (1992)).

상기 프로모터의 다운스트림에 위치하는 시그널 펩타이드는 벡터에 추가적으로 삽입되는 외래 단백질의 DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질이 숙주세포의 외부로 다량 발현되도록 한다. 이와 같이, 단백질이 세포 외부로 다량 발현되는 경우에는 숙주세포의 배양액을 이용하여 단백질의 분리 및 정제를 고수율 및 고정제도로 실시할 수 있다. 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열은 IgM 시그널 펩타이드, GP64 시그널 펩타이드, 꿀벌 멜리틴 시그널 펩타이드 등을 포함하고, 가장 바람직하게는 IgM 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열이다. IgM 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열이 가장 바람직한 이유는 발현된 단백질을 숙주세포의 외부로 다량 분비하여 곤충세포에서 정확히 기능을 수행하기 때문이며 곤충세포는 물론 동물세포에서도 작동하기 때문이다.

한편, 본 발명의 벡터에 있어서 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열은 IgG 항체와의 결합능을 갖는 도메인을 암호화하는 것으로서, 바람직하게는 스태파이로코커스 오리우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 유래된 것을 이용하는 것이다. 단백질 A에서 유래된 IgG 결합 도메인은 모든 IgG에 대하여 비특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖는다. 이용된 IgG 결합 도메인은 상기 클로닝 부위에 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 삽입되면 상기 단백질과 함께 융합되어 발현되며, 정제 과정에서 친화성을 이용하여 간단한 방법 (예: 친화성 크로마토그라피)으로 고수율 및 고정제도로 목적의 단백질을 얻을 수 있다.

상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 제한효소자리가 있는 클로닝 부위는, 클로닝될 단백질의 다양성을 고려하여 다양한 제한효소 자리가 있는 멀티플 클로닝 부위가 바람직하다.

본 발명 벡터 내의 전사 종결 서열은 클로닝 부위에 삽입되는 단백질의 전사를 종결하기 위한 폴리 아데닐화 서열로서, 예를 들어 SV40 polA 서열을 이용할 수 있다.

본 발명의 발현벡터에서 이용되는 트랜스포존 (transposon)의 반복서열은 트랜스포존의 전위 (transposition)를 매개하는 능력을 갖는 서열로서 당업계에 공지되어 있는 서열이다 (참조: Calos, M. P. 등,Cell20:579(1980)). 상기 트랜스포존의 반복서열은 Tn1, Tn2, Tn3, Tn4, Tn5, Tn7, Tn9및 Tn10등의 트랜스포존으로부터 유래된 반복서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 Tn7의 양 말단에 있는 반복서열을 이용하는 것이다.

상기 선택표지로서의 항생제 내성 유전자는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 이용될 수 있고, 바람직하게는 비용의 측면을 고려하여 암피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자를 이용하는 것이다.

본 발명의 발현벡터에서 클로닝될 수 있는 것은 단백질을 암호화하는 다양한 DNA 서열을 포함하고, 바람직하게는 산업적으로 유용한 효소를 암호화하는 DAN 서열이며, 보다 바람직하게는 당전이효소, 당단백질, 각종 활성을 필요로 하는 효소 등을 암호화하는 DNA 서열이고, 가장 바람직하게는 시알산전이효소와 같은 당전이효소를 암호화하는 DNA 서열이다. 특히, 상기 시알산전이효소는 하기의 실시예에서 본 발명의 가장 바람직한 구현예로 예시되어 있고, 인간 에리스로포이에틴 (EPO)에 시알산을 부가하여 EPO의 활성 반감기를 증가시키는 데 이용될 수 있다.

시알산전이효소를 암호화하는 DNA 서열을 이용하는 경우, 전체 서열 중 시그널 펩타이드, 세포질 꼬리 부위 (cytoplasmic tail) 및 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 암호화하는 서열이 제거된 활성 도메인만을 코딩하는 서열을 이용하는 것이 바람직하다. 시그널 펩타이드를 제거하는 것이 바람직한 이유는 본 발명의 벡터 내에 이미 IgM 시그널 펩타이드가 있고, IgM 시그널 펩타이드 뒤에 놓이게 되는 시알산전이효소의 시그널 펩타이드는 시그널 펩타이드로서의 역할을 하지 못할 뿐만 아니라, 시그널 펩타이드의 소수성 때문에 시알산전이효소의 발현을 어렵게 하거나 단백질 분비를 저해하기 때문이다. 세포질 꼬리 부위는 특정 기능이 없기 때문에 제거되는 것이 바람직하고, 막통과 도메인은 시알산전이효소의 시그널 펩타이드와 동일하게 소수성을 가지므로 시알산전이효소의 발현 및 분비의 효율을 저해하기 때문에 제거되는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 발현벡터는 종래의 배큘로바이러스 벡터에서는 전혀 채택된 바가 없는 IgG 결합 도메인 및 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 있으며, 이와 같은 특징은 본 발명의 벡터에 의해 클로닝되는 단백질의 곤충세포 외부로의 다량발현 및 고효율의 정제를 가능하게 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 배큘로바이러스의 다각체 프로모터, 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열, 상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 특정 효소를 암호화하는 외래 유전자, 상기 외래 유전자의 다운스트림에 위치한 전사 종결 서열, 상기 배큘로바이러스의 다각체 프로모터의 업스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 한 서열, 상기 전사 종결 서열의 다운스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 다른 서열 및 선택표지로서의 항생제 내성 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터로 배큘로바이러스 지놈 DNA 및 상기 트랜스포존의 반복서열과 동종의 트랜스포존 활성서열을 갖는 백미드를 포함하고 있는 세포를 형질전환시켜 재조합 백미드를 형성시키는 단계; (ⅱ) 상기 재조합 백미드를 세포로부터 분리하는 단계; (ⅲ) 상기 분리된 재조합 백미드로 곤충세포를 형질감염시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 형질감염된 곤충세포를 배양하는 단계를 포함하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법을 제공한다.

본 발명의 효소의 발현방법에 따르면, 상기한 백미드 (bacmid)는 배큘로바이러스 지놈 DNA를 포함하고, 바람직하게는 배큘로바이러스 야생형 지놈 DNA 중 배큘로바이러스의 생존력에 영향을 미치지 않는 결손 (deletion)이 있는 DNA 서열이다. 또한, 상기 백미드는 상기한 발현벡터의 트랜스포존 반복서열 사이에 있는 DNA 서열이 삽입되는 자리로서 상기 트랜스포존의 반복서열과 동종의 트랜스포존 활성서열을 포함하고 있으며, 이 서열에 의해 전위가 동종 재조합 (homologous recombination) 타입으로 발생하게 된다.

한편, 백미드를 포함하는 세포는 일반적으로 박테리아 세포가 이용되며, 자신의 염색체 또는 별도의 플라스미드 형태로 트랜스포자아제 (transposase)를 포함하고, 가장 바람직하게는 DH10Bac 대장균이다. 상기 DH10Bac 대장균은 백미드 내에 전위가 동종 재조합 타입으로 발생되도록 하는 트랜스포존을 매개할 수 있는 트랜스포존 활성서열 그리고 AcNPV의 지놈 DNA를 갖고 있으며, 더불어 트랜스포자아제 (transposase)의 유전자를 갖는 헬퍼 플라스미드를 별도로 갖고 있다.

이와 같은 세포를 상기한 본 발명의 발현벡터로 형질전환하면, 발현벡터와 백미드 사이에 전위가 발생되고 결국 발현벡터의 반복서열 사이에 있는 DNA 서열 (발현 카세트)이 백미드내의 전위 부위에 삽입되어 재조합 백미드가 형성된다.

이렇게 형성된 세포 내의 재조합 백미드는 통상의 플라스미드 추출법 (Sambrook, J. 등,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989))을 이용하여 분리할 수 있다.

분리된 재조합 백미드는 이어, 곤충세포 내로 형질감염된다. 이 때 이용될 수 있는 형질감염 방법은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 칼슘 포스페이트 침전법, DEAE-덱스트란, 전기 천공법, 미세주입법, DNA가 로딩된 리포좀, 리포펙틴-DNA 복합체, 폴리양이온, 유전자 밤바드먼트 (bombardment) 등을 포함하나, 가장 바람직하게는 리포펙틴-DNA 복합체을 이용하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예는, 상기 단계 (ⅳ) 이후에 (ⅴ) 형질감염된 곤충세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하고 이를 곤충세포에 2차로 형질감염시키는 단계; 및 (ⅵ) 형질감염된 곤충세포를 배양하는 단계를 추가적으로 포함한다.

상기 단계 중 재조합 배큘로바이러스의 분리는 숙주세포인 곤충세포로부터 용혈되어 배지로 나온 바이러스를 PEG 등으로 침전시켜 실시하는 것이 가장 바람직하나, 다른 공지의 분리방법도 이용할 수 있다.

한편, 2차로 곤충세포를 형질감염하는 것은 1차 감염에 의해 충분한 재조합 배큘로바이러스를 수득할 수 없기 때문이다.

본 발명의 방법에 있어서, 이용될 수 있는 곤충세포는 SF-9, SF-21, 하이 파이브 세포 (BTI-TN-5B1-4), Tn-368 및 Tn-368A 등을 포함하고, 가장 바람직하게는 하이 파이브 세포를 이용하는 것이다. 상기 하이 파이브 세포는 세포 외부로 분비되는 단백질의 발현량이 우수하고, 우혈청이 없는 배지에서도 배양이 가능하여 발현된 단백질을 정제하는 데 유용하다.

상기한 본 발명의 방법에 의해서, 외래 단백질이 다량으로 발현될 뿐만 아니라, 곤충세포 외부로 발현되므로 향후의 정제 과정이 보다 용이하게 실시될 수 있다.

한편, 본 발명의 발현방법에 있어서, 상기한 본 발명의 발현벡터와 중복되는 사항은 편의적으로 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 곤충세포에서의 발현방법에 의해 발현된 외래 효소를 함유하는 배양물을 정제하는 단계를 포함하는 외래 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 곤충세포로부터 발현된 외래 효소가 세포 외부로 발현되기 때문에, 정제 단계에서 보다 용이하게 작업을 할 수 있다. 더불어, 발현되는 단백질의 N-말단 쪽에는 IgG 결합 도메인이 융합되어 있기 때문에, 상기의 정제 단계는 상기 도메인의 친화성을 이용하여 실시될 수 있고, 이는 최종적으로 정제되는 단백질의 고수율 및 고정제도를 가능하게 한다. 이러한 정제과정은 예컨대, 상기 IgG 결합 도메인에 대하여 친화성을 나타내는 IgG가 결합된 레진이 충진된 컬럼을 이용하여 크로마토그래피 방법으로 실시될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 정제과정은 친화성 크로마토그래피 방법을 이용하는 경우에는 1-단계만으로도 고정제도로 다량의 외래 단백질을 정제할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 의해 최종적으로 수득된 단백질은 그 N-말단에 IgG 결합 도메인이 융합되어 있으나, 하기 실시예 3에서 확인할 수 있듯이, 활성은 그대로 유지된다.

한편, 본 발명의 효소의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명의 발현벡터 및 발현방법과 중복되는 사항은 편의적으로 그 기재를 생략한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명의 재조합 발현벡터 pFastMG-ST6GalI의 구축

pcDSA 벡터 (Leeet al.,Mol. Cells, 6:552-556(1996)) 내에 존재하는 IgM 시그널 펩타이드와 IgG 결합 도메인 서열만을 PCR 증폭하기 위해 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 염기서열은 센스 프라이머의 경우, 5'-TAGGCGGTCCGATGAAATTCAGCTGGGTCA-3'이고, 안티센스 프라이머의 경우, 5'-CATGCCATGGCCTTTGGCGCCTGAGCGTC-3'이다. 상기 프라이머 중 센스 프라이머에는RsrⅡ, 안티센스 프라이머에는NcoI 제한효소 자리를 삽입하였다. 이어, 상기 pcDSA 벡터를 주형으로 하고 상기 2종의 프라이머를 이용하여 Takara사로부터 구입한 exTaq 중합효소를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 어닐링은 60℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 30초, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 30 사이클을 수행하였다. 그런 다음, PCR 생성물을 상기RsrⅡ 및NcoI 제한효소로 절단하고, 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동 및 분리하였다.

한편, pFastBac HT (Gibco BRL사, 미국) 벡터를RsrⅡ 및NcoI 제한효소로 절단하여 정제의 편이성 때문에 존재하는 6 x His 부위를 제거한 다음, 절단된 벡터를 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동 및 분리하였다. 이어, 상기 PCR 증폭 산물 및 상기 pFastBac HT 절단 산물을 T4 DNA 연결효소를 사용하여 연결하였다. 이렇게 제작된 pFastBacMG 벡터는 발현된 외래 단백질이 세포 밖으로 분비될 수 있도록 IgM 시그널 펩타이드 암호화 서열이 존재하고 정제 효율을 향상시키도록 IgG 결합 도메인 암호 서열을 갖게 되었다.

인간 시알산전이효소 유전자는 사람 태반세포 (BeWo, KCLB)에서 클로닝하였다. 우선, DMEM 배지 (10% 우태아혈청 포함)에서 배양 중인 사람 태반세포를 수확한 다음, RNeasy 키트 (Qiagen사, 미국)를 이용하여 세포 전체 RNA를 추출하였다. 이어, 추출된 RNA 및 랜덤 프라이머, RNA 분해효소 저해제, DTT를 넣고 10 분 동안 70℃의 열을 가한 다음 얼음에 2 분간 담가두어 RNA를 변성시켰다. 여기에 RT-PCR 반응버퍼, dNTP 및 역전사효소 (Takara사, 일본)를 넣고 42℃에서 2 시간 동안 반응시켜 외가닥 cDNA를 합성하였다. 이 반응물과 서열 3과 서열 4 프라이머 및 exTaq (Takara)을 반응시켜 시알산전이효소 cDNA를 합성하였다. 상기 RT-PCR 과정에서 이용된 프라이머 2종의 염기서열은 센스 프라이머의 경우 5'-AAGGATCCACAGGGGCCGCCAGACC-3'이고, 안티센스 프라이머의 경우 5'-AAAAAGCTTAGCAGTGAATGGTCCGGAA-3'이다. 상기 프라이머 중 센스 프라이머에는BamHI, 안티센스 프라이머에는HindⅢ 제한효소 자리를 집어넣었다. 이어, 생산된 RT-PCR 증폭체를 클로닝 벡터인 pGEMEasy (Promega사, 미국)를 통해 클로닝 한 후 자동 DNA 염기서열분석기 (ABI Prism사, 미국)를 이용하여 인간 시알산전이효소임을 확인하였다 (참조: 도 3). 합성된 cDNA의 길이는 1005 bp이며, 335개의 아미노산에 해당하는 것으로서, 전체 서열 중 시그널 펩타이드, 세포질 꼬리 (cytoplasmic tail) 및 막통과 도메인 (transmembrane domain)이 제거된 활성 도메인만을 코딩하는 cDNA이다.

pGEMEasy 벡터 내에 클로닝 된 시알산전이효소를BamHI과HindⅢ 제한효소로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음, 시알산전이효소 유전자 부분만을 분리하였다. pFastBacMG 벡터를 상기 시알산전이효소 유전자 분리에 사용한 제한효소와 동일한BamHI과HindⅢ로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동 후, 제한효소로 절단된 벡터만을 분리하였다. 이어, 분리한 시알산전이효소 유전자와 pFastBacMG 벡터를 T4 DNA 연결효소를 사용하여 연결하여 pFastBacMG-ST6GalI 벡터를 제작하였다.

첨부한 도 3에서 M 레인은 DNA 마커, 1번 레인은 RT-PCR을 통해 합성한 인간 시알산전이효소의 DNA 밴드이며 2번 레인은 pGEMEasy에 인간 시알산전이효소 유전자를 클로닝한 밴드이고, 3번 레인은 2번 레인의 벡터를BamHI과HindⅢ로 절단하여 삽입된 인간 시알산전이효소 유전자가 빠지는 그림이며, 4번 레인은 pFastBacMG 벡터에 인간 시알산전이효소를 삽입한 그림이며, 5번 레인은 4번 레인의 벡터를BamHI으로 자른 그림이며, 6번 레인은 4번 레인의 벡터를BamHI과HindⅢ로 잘라 삽입된 인간 시알산전이효소 유전자가 빠지는 그림이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 인간 시알산전이효소 유전자는 인간 태반세포에서 클로닝 되고 곤충세포 발현벡터인 pFastBacMG에 삽입되었음을 알 수 있다.

한편, 제작된 pFastBacMG-ST6GalI을 DH10Bac 세포에 형질전환시키고, 이렇게 형질전환된 세포를Escherichia coliDH10Bac-ST6GalI이라 명명하였으며, 이를 한국종균협회에 2001년 4 월 9 일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM-10258을 부여받았다.

첨부한 도 1은 본 발명의 pFastBacMG-ST6GalI의 제작 과정을 대략적으로 나타낸 도면이다. 또한, 도 2는 상기 pFastBacMG-ST6GalI의 유전자 지도이다.

실시예 2: 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 rvST6Gal의 제조 및

시알산전이효소의 발현

본 실시예를 위하여 배큘로바이러스의 일종인 AcNPV의 DNA (백미드, bMON14272)가 들어있는 대장균 DH10Bac (Gibco BRL사, 미국)을 이용하였다. 상기 백미드 (bacmid)는lacZ유전자를 가지고 있으며 그 유전자 내부에 전위 (transposition) 부위가 있다. 한편, 상기 실시예 1에서 사용된 이동 벡터 pFastBacMG에는 트랜스포존이 있고 그 사이에 발현하고자 하는 외래 유전자인 시알산전이효소 유전자가 삽입되어 있다.

실시예 1에서 제작한 pFastBacMG-ST6GalI을 상기 대장균 DH10Bac에 형질전환 시켜 대장균 내에서 백미드와 pFastBacMG-ST6GalI의 전위를 유도한 다음, 겐타마이신, 테트라사이클린 및 카나마이신의 항생제와 X-gal과 IPTG가 들어있는 LB 플레이트에서 배양한 다음 무색의 콜로니만을 선별하였다. 이어, 무색의 콜로니를 LB 배지가 들어있는 시험관에서 24시간 동안 배양한 다음, 플라스미드 추출법 (Maniatis 등, Molecular Cloning)을 이용하여 재조합 백미드를 분리하였다. 분리한 재조합 백미드 내의 시알산전이효소 유전자의 존재 유무는 PCR로 확인하였다.

한편, 곤충세포 Sf9 (Invitrogen사, 미국)를 26℃ 배양조건 하에서 60 mm 배양접시에 고착 배양시킨 후, 배지를 제거하고 상기 재조합 백미드와 리포펙틴 (Gibco BRL사, 미국)의 혼합물을 Grace's 배지와 함께 상기 배양접시에 넣어주었다. 5 시간 후에 배양접시 내의 배지를 제거하고 우태아혈청이 들어있는 배지를 넣고 72시간 동안 배양하였다. 이어, 곤충세포를 성장시킨 배지의 일부를 수확하고 PEG를 넣어 배지 내의 바이러스를 침전시킨 다음, PCR을 통해 재조합 배큘로바이러스의 생성을 확인하였다.

이렇게 제조된 재조합 바이러스의 농도는 낮기 때문에, 바이러스 농도를 높이기 위해 Sf9 세포가 자라고 있는 플라스크에 상기 재조합 배큘로바이러스를 재감염시켰다. 성장하고 있는 곤충세포의 약 90% 이상이 용혈될 때까지 배양한 다음, 배지를 수확하여 고농도의 재조합 배큘로바이러스 rvST6GalI를 확보하였다. 첨부한 도 4는 상기한 과정을 대략적으로 나타낸 도면이다.

한편, 세포 외로 분비되는 단백질의 경우, Sf9 세포보다 하이 파이브 (High Five) 세포에서 발현량이 많은 것으로 알려져 있다 (Biotech. Bioengin., 63:255-262(1999)). 또한, 하이 파이브 세포는 우혈청이 없는 배지에서도 배양이 가능하여 정제가 편리하기 때문에 본 발명자들은 시알산전이효소의 대량 발현을 파이브 세포를 이용하여 실시하였다. 우선, 우혈청이 없는 배지에서 배양 중인 하이 파이브 세포 (Invitrogen사, 미국)를 상기 과정에서 확보된 재조합 배큘로바이러스 rvST6GalI으로 형질감염시키고, 72시간 동안 배양한 다음, 배지와 세포를 각각 수확하였다.

수확한 상기 세포를 동량의 단백질 샘플 버퍼와 혼합한 후에 격렬하게 교반하고 10분 동안 끓인 다음, SDS-PAGE를 수행하였다. 이어, 필요에 의해 실험실에서 제작한 일반적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 웨스턴 블롯팅 시 인간 시알산전이효소에 특이적인 항체를 사용하지 않은 이유는 발현된 재조합 인간 시알산전이효소의 앞쪽에 IgG 결합 도메인 암호서열이 있기 때문에 일반적인 항체를 이용하여도 웨스턴 블롯팅에서 검출할 수 있기 때문이다. 첨부한 도 5에서 패널 A는 상기 SDS-PAGE의 결과, 그리고 패널 B는 상기 웨스턴 블롯팅의 결과를 나타내는 사진이다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 바이러스를 감염시키지 않은 곤충세포 (1번 레인) 및 야생형 배큘로바이러스로 감염시킨 곤충세포 (2번 레인)에서는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 모두에서 인간 시알산전이효소의 발현이 전혀 관찰되지 않는 반면, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 rvST6GalI으로 감염시킨 곤충세포 (5번 레인)에서는 시알산전이효소의 발현이 명백하게 관찰되었다. 도 5의 3번 레인은 웨스턴 블롯팅의 양성 대조군으로 사용한 것이며 4번 레인은 시알산전이효소의 전체 유전자를 발현시킨 것이고 5번 레인은 시알산전이효소 중에서 활성부위만을 발현시킨 것이다.

한편, 재조합 배큘로바이러스 rvST6GalI으로 감염시킨 하이 파이브 세포에서 인간 시알산전이효소가 세포 외로 분비되는지를 확인하기 위하여, 상기 수확한 배지를 동량의 단백질 샘플 버퍼와 혼합한 후에 격렬하게 교반하고 10분 동안 끓인 다음, SDS-PAGE를 수행하였다. 이어, 일반적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 실험 결과, 배지에서도 인간 시알산전이효소가 검출되었다. 이러한 결과는 발명자의 의도에 따라 재조합 플라스미드 내의 IgM 시그널 펩타이드를 암호화 하는 서열이 정상적으로 작동하여, 하이 파이브 세포 내에서 발현된 시알산전이효소가 세포 외로 원활히 분비됨을 나타내는 것이다.

실시예 3: 인간 시알산전이효소의 정제

본 발명의 재조합 배큘로바이러스가 감염된 상기 실시예 2의 하이 파이브 세포를 72시간 동안 배양하고 이어 세포 배양 배지를 수확한 다음, 세포 외로 분비된 인간 시알산전이효소를 다음과 같이 정제하였다: 우선, CNBr-활성화 세파로스 4B (Pharmacia사, 미국)을 1 mM HCl 용액에 30분 동안 함침시켜 레진을 활성화시켰다. 이렇게 활성화된 레진을 결합 완충액 (0.1 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH 8.3)으로 여러 번 세척한 다음, 캘리시바이러스의 단백질분해효소에 특이성을 갖고 있는 다세포군 항체(본 발명자들의 실험실에서 직접 제작된 것)와 활성형 레진을 혼합하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 레진에 결합되지 않은 항체는 상기 결합 완충액으로 세척하여 제거하고 항체가 붙지 않은 레진의 활성자리는 차단 버퍼 (0.2 M 글리신, pH 8.0)로 실온에서 2시간 동안 처리하여 차단하였다.

이어, 상기 항체-레진 결합체를 컬럼에 채우고 균일하게 채워질 때까지 결합버퍼로 계속 세척하였다. 수확한 세포 배양 배지를 고농도의 결합 완충액와 혼합하여 조성과 pH를 결합 완충액과 같게 조정한 다음, 1 ㎖/분의 속도로 상기 컬럼을 통과시켰다. 배지를 모두 컬럼에 통과시킨 후, 결합 완충액을 충분히 통과시켜 비특이성 단백질들을 제거하였다. 그런 다음, 항체-레진 복합체에 결합된 재조합 인간 시알산전이효소를 분리하기 위해 용출 완충액 (0.1 M 글리신, 0.5 M NaCl, pH3.0)을 컬럼에 넣으면서 용출물을 순서대로 수확하였다. 재조합 인간 시알산전이효소가 들어있는 정제물은 4℃에서 하룻밤 동안 투석하였다. 투석이 끝난 재조합 인간 시알산전이효소는 센트리콘 10 (Amicon사, 미국)을 사용하여 농축하였으며, 단백질의 농도는 BCA 키트 (Pierce사, 미국)를 이용하여 측정하였다.

첨부한 도 6은 상기 최종적인 컬럼에서 수확된 정제물을 순서대로 로딩하여 SDS-PAGE한 결과이고, 도 7은 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 6 및 도 7의 레인 5 내지 레인 11에서 확인할 수 있듯이, 약 40 kDa에 해당하는 재조합 인간 시알산전이효소가 본 실험에서 정제되었음을 알 수 있다. 더불어, 본 실험에서 정제된 재조합 인간 시알산전이효소는 IgG 결합 도메인이 결합된 것으로서, 간단한 정제 과정을 통해 정제될 수 있음을 확인할 수 있다.

한편, 재조합 인간 시알산전이효소의 활성은 Gross (Gross, H.J. 등,Anal. Biochem., 186:127(1990))의 실험방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다: 우선, 30 ㎎/㎖ 아시알로페투인 (asialofetuin), 0.3% 트리톤 X-100 및 65 mM NaCl를 포함하는 65 mM 소듐 카코딜레이트 (sodium carcodylate; pH 6.5) 10 ㎕에 60 μM CMP-9-플루오르세이닐(fluoresceinyl)-NeuAc (Calbiochem사, 미국) 10 ㎕를 넣고 적당히 희석된 정제한 재조합 인간 시알산전이효소를 넣은 다음, 30분 동안 37℃에서 반응시켰다. 30분 후 반응 정지액 0.1 M CTP 5 ㎕를 넣고 암소에서 보관하였다. 그런 다음, 반응물 20 ㎕를 50 mM 인산나트륨 및 0.1 M NaCl (pH 6.8)로 평형화된 세파크릴 S-200 (Pharmacia사, 미국)이 들어 있는 컬럼 (7 x 67 mm)에 0.2㎖/분의 속도로 통과시켰다. 이렇게 겔 여과한 경우에는 분자량이 큰 수용체인 아시알로페투인인 먼저 통과하고, 이어서 작은 분자량의 공여체인 CMP-9-플루오르세이닐-NeuAc이 통과된다. 그리고 나서, 컬럼을 통과한 시료를 방울로 받아 형광측정기 (Sequoia-Turner, 모델 No.450)로 형광도를 측정하였다 (참조: 도 8). 첨부 도 8에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 정제에 의해 수득한 인간 시알산전이효소의 양을 증가시킴에 따라 수용체인 아시알로페투인에 더 많은 형광물질이 결합되었고, 본 발명의 발현 시스템 및 정제방법에 의해 활성 상태의 인간 시알산전이효소가 생성됨을 알 수 있다.

실시예 4: 본 발명에 따라 제조된 재조합 인간 시알산전이효소의

용도 확인

상기 실시예 3에서 정제한 인간 시알산전이효소가 실제 의약품 개발에 응용될 수 있음을 다음과 같이 확인하였다. 인간 에리스로포이에틴 (EPO)이 생체 내에서 활성을 유지하는데 결정적인 역할을 하는 것은 EPO에 결합되어 있는 당쇄들이다 (Goto 등,Biotechnology, 6:67(1988)). 특히, 그 중에서도 당쇄 말단에 위치한 시알산은 EPO의 활성 반감기에 결정적이며 궁극적으로는 효능에 영향을 주느 것으로 알려져 있다 (Lowy 등,Nature, 185:102(1960)). 현재 의약품으로 제조·판매되는 EPO는 포유류 세포 배양을 통해 만들어지고 있으며 이 세포들은 사람에서 유래한 것이 아니고 햄스터에서 유래한 것들이다. 여기에서 만들어진 EPO의 당쇄 구조는 사람 세포에서 만들어진 EPO와 유사한 구조를 가지고 있다. 만일 이러한세포 배양을 통해 만들어진 재조합 EPO의 당쇄 말단에 더 많은 시알산을 첨가할 수 있다면, EPO의 활성 반감기를 증가시킬 수 있으며 이로써 이 약품을 필요로 하는 환자들에게 저비용, 고효율의 효과를 줄 수 있으리라 기대된다.

우선, 실험에서 사용될 EPO 시료는 햄스터 세포인 CHO에서 재조합 기술에 의해 생산된 것이다. CHO 세포에서 분비되어 배양 배지에 있는 EPO를 수집하고 농축한 다음, 시알산 첨가를 확인하였다. 상기 분리된 EPO 시료와 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 시알산전이효소를 37℃에서 12 시간 동안 반응시켰고, 양성대조군으로서 상기 분리된 EPO 시료와 소에서 정제된 시알산전이효소 (Sigma사, 미국)를 37℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 각각의 반응물을 등전집속 (isoelectrofocusing) 키트 (Novex 사)에 로딩하고 130 V의 전압을 걸어주었으며, 등전점에 따라 단백질을 분리한 후, 겔을 쿠마쉬 염색하였다 (참조: 도 9). 첨부 도 9에서, 1번 레인은 시알산전이효소와 반응시키지 않은 CHO 세포에서 생산된 인간 EPO을 등전집속한 것으로서 pH 구배가 형성되어 있는 전기장에서 분리된 인간 EPO가 pH 4.55-5.85에 걸쳐 5-6개의 동족체 밴드를 형성했으며 이들 동족체들은 인간 EPO가 시알산화된 정도 차이에 의한 것으로서 pH가 작은 쪽의 밴드일수록 시알산의 함량이 높고 생체 내 활성이 높게 나타났다. 2번 레인 및 3번 레인은 상기한 소에서 정제된 시알산전이효소로 처리한 CHO 세포 생산 EPO를 등전집속한 것으로서 1번 레인의 반응 전의 인간 EPO와 비교하여 시알산의 함량이 높아져 동족체들이 더 낮은 pH로 이동하였다. 4번 레인에서 6번 레인까지의 샘플은 상기 양성 대조군과 거의 동일하게 본 발명의 재조합 인간 시알산전이효소를 처리한 인간 EPO로서 처리한 효소의 양에 따라 낮은 pH 부위로 이동하였다. 4번 레인은 재조합 인간 시알산전이효소 15.5 ㎍을 반응에 첨가한 결과이며 5번 레인은 7.7 ㎍, 6번 레인은 0.155 ㎍의 재조합 인간 시알산전이효소를 반응에 첨가한 결과이다.

상기한 실험 결과는 본 발명의 재조합 인간 시알산전이효소가 활성을 위해 당 잔기를 요구하는 의약품 등의 개발에 직접적으로 이용될 수 있음을 보여준다.

본 발명은 신규한 재조합 배큘로바이러스 발현벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 재조합 발현벡터를 이용한 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법을 제공하며, 이를 이용한 외래 효소의 제조방법도 제공한다. 본 발명의 발현벡터는 곤충세포를 숙주로 이용하여 다량의 외래 단백질을 세포 외부로 효과적으로 발현할 뿐만 아니라, 목적의 외래 단백질에 IgG 결합 도메인이 융합되어 있어 매우 효과적인 외래 단백질의 정제를 가능하게 한다.

Claims (19)

1. 배큘로바이러스의 다각체 프로모터, 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 IgM 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열, 상기 IgM 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열, 상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 제한효소 자리가 있는 클로닝 부위, 상기 클로닝 부위의 다운스트림에 위치한 전사 종결 서열, 상기 배큘로바이러스의 다각체 프로모터의 업스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 한 서열, 상기 전사 종결 서열의 다운스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 다른 서열 및 선택표지로서의 항생제 내성 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열은 IgM 시그널 펩타이드, GP64 시그널 펩타이드 및 꿀벌의 멜리틴 시그널 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 스태파이로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 유래된 것임을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 트랜스포존의 반복서열은 Tn1, Tn2, Tn3, Tn4, Tn5, Tn7, Tn9및 Tn10으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 트랜스포존으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 클로닝 부위에 당전이효소, 사이토카인 및 바이러스 구조 당단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소를 암호화하는 외래 유전자가 추가적으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 당전이효소를 암호화 하는 외래 유전자는 시알산전이효소를 암호화 하는 외래 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 시알산전이효소를 암호화 하는 외래 유전자는 시그널 펩타이드, 세포질 꼬리 부위 및 막통과 도메인이 제거된 활성 도메인만을 암호하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터.
8. 다음과 같은 단계를 포함하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법:

   (ⅰ) 배큘로바이러스의 다각체 프로모터, 상기 프로모터의 다운스트림에 위치한 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열, 상기 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열의 다운스트림에 위치한 특정 효소를 암호화하는 외래 유전자, 상기 외래 유전자의 다운스트림에 위치한 전사 종결 서열, 상기 배큘로바이러스의 다각체 프로모터의 업스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 한 서열, 상기 전사 종결 서열의 다운스트림에 위치한 트랜스포존의 양 말단 반복서열 중 다른 서열 및 선택표지로서의 항생제 내성 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 발현벡터로 배큘로바이러스 지놈 DNA 및 상기 트랜스포존의 반복서열과 동종의 트랜스포존 활성서열을 갖는 백미드를 포함하고 있는 세포를 형질전환시켜 재조합 백미드를 형성시키는 단계;

   (ⅱ) 상기 재조합 백미드를 세포로부터 분리하는 단계;

   (ⅲ) 상기 분리된 재조합 백미드를 곤충세포에 형질감염시키는 단계; 및

   (ⅳ) 상기 형질감염된 곤충세포를 배양하는 단계.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 발현방법은 (ⅴ) 형질감염된 곤충세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하고 이를 곤충세포에 2차로 형질감염시키는 단계; 및 (ⅵ) 형질감염된 곤충세포를 배양하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
10. 제 7 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열은 IgM 시그널 펩타이드, GP64 시그널 펩타이드 및 꿀벌의 멜리틴 시그널 펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
11. 제 7 항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 스태파이로코커스 오리우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 유래된 것임을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
12. 제 7 항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스 발현벡터내에 삽입되어 있는외래 유전자는 당전이효소, 사이토카인 및 바이러스 구조 당단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 당전이효소를 암호화 하는 유전자는 시알산전이효소를 암호화 하는 유전자인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 시알산전이효소를 암호화 하는 외래 유전자는 시그널 펩타이드, 세포질 꼬리 부위 및 막통과 도메인이 제거된 활성 도메인만을 암호하는 유전자인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
15. 제 8 항에 있어서, 상기 트랜스포존의 반복서열은 Tn1, Tn2, Tn3, Tn4, Tn5, Tn7, Tn9및 Tn10으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 트랜스포존으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
16. 제 8 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곤충세포는 SF-9, SF-21, 하이 파이브 세포, Tn-368 및 Tn-368A로 구성된 그룹으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 발현방법.
17. 상기 제 8 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 곤충세포에서의 발현방법에 의해 발현된 외래 효소를 함유하는 배양물을 정제하는 단계를 포함하는 외래 효소의 제조방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 곤충세포는 SF-9, SF-21, 하이 파이브 세포, Tn-368 및 Tn-368A로 구성된 그룹으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 곤충세포에서 외래 효소의 외래 효소의 제조방법.
19. 제 17 항에 있어서, 상기 정제 단계는 상기 발현된 외래 효소에 결합되어 있는 IgG 결합 도메인에 대하여 친화성을 나타내는 IgG가 결합된 레진으로 충진된 컬럼을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 외래 효소의 제조방법.