KR20020085167A - 헤모글로빈으로부터 헴철의 간편한 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤모글로빈으로부터 헴철의 제조방법에 관한 것으로, 헤모글로빈에 단백질 분해기작이 상이한 두 종류의 엔도형과 엑소형 단백질 분해 효소를 동시에 처리하여 가수분해도가 향상된 효소 분해물을 얻은 후, 효소 분해물을 특정 pH로 조절하여 헴철 부분을 선택적으로 침전시켜 분리한 후 건조하여 헴철을 제조하는 방법으로서, 기존의 헴철제조방법에 비해 공정이 간편하고 헴철 수율이 높은 효과가 있다.

Description

헤모글로빈으로부터 헴철의 간편한 제조방법{The Simple manufacturing process for the heme-iron from hemoglobin}

본 발명은 철의 공급원 중의 하나인 헴철의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 동물의 혈액에 존재하는 단백질 중 헴철을 함유하고 있는 헤모글로빈을 효소로 분해한 후 헴철과 펩타이드의 용해도 차이를 이용하여 헴철을 분리하는 간편한 헴철의 제조방법에 관한 것이다.

생체에서 철분은 미량 무기질의 일종으로 필요량은 적으나 주로 산소운반에 관여하는 중요한 역할을 한다. 우리나라에서 철분의 1일 권장량은 소아가 10∼12 mg, 청소년이 12∼18 mg, 성인남자 12 mg, 성인여자 18 mg, 임산부 26∼30 mg, 수유부는 20 mg이다. 식품 중의 철분은 헴철(heme iron)과 비헴철(non-heme iron)의2가지 형태로 존재하며 동물성 식품 중의 철 함량의 평균 40%가 헴형이고 나머지 60%가 비헴형이며 식물성 식품 중의 철은 모두 비헴형으로 존재한다.

헴철은 대부분 헤모글로빈과 미오글로빈의 형태로 섭취되며 흡수율이 매우 높고 다른 식사 요인에 의하여 영향을 받지 않으나, 비헴철의 흡수는 식품의 종류, 개인의 철 영양상태 등의 영향을 받으며 통상 건강인은 섭취한 철분의 5∼10% 정도만을 흡수하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 철의 결핍은 전세계적으로 가장 흔한 영양문제로 그 원인은 부적절한 섭취, 철 흡수의 불량, 빠른 성장과 혈액손실, 반복되는 임신에 의한 저장 철의 고갈 등이다. 철 결핍의 위험이 높은 시기는 급격한 신체성장이 이루어지는 6개월∼4세의 영유아기, 사춘기, 월경혈의 손실이 있는 가임기 여성, 철의 요구가 증가하는 임신기이며 특히 영유아와 임산부는 철 결핍이 되기 쉬운 것으로 알려져 있다.

철 결핍을 예방, 치료하기 위하여 염화 제2철(ferric chloride), 구연산 철(ferric citrate), 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate), 호박산 구연산 철 나트륨(iron and sodium succinate citrate), 젖산 철(ferrous lactate), 피로인산 제2철(ferric pyrophosphate), 헴철(heme iron) 등의 철 화합물이 식품의 철 강화제 및 제약 원료로 사용되고 있다.

철 화합물 중 헴철을 제외한 나머지는 무기철 성분으로 철 함량이 높고 경제적으로 저렴한 장점이 있으나 생체에서 흡수율이 낮고 과잉 섭취시 철 중독을 유발할 수 있는 단점이 있어 점차 흡수율이 높고 부작용이 없는 유기철 성분인 헴철의 사용량이 증가하고 있다.

헴철은 헤모글로빈에 함유되어 있는 성분으로 동물의 혈액으로부터 분리, 정제하여 제조한다. 헤모글로빈(분자량 65,000 달톤)은 헴기를 포함하고 있는 4개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 단백질로 1몰의 헤모글로빈에는 4몰의 철이 함유되어 있다. 헤모글로빈 중 철의 함량을 분자량에 따라 계산하면 0.34%(=223.2/65,000 ×100), 헴철의 함량은 3.8%(=2,464/65,000 ×100)이므로 고농도 헴철을 얻기 위하여는 단백질 부분의 함량을 낮추어야 한다.

헴철을 얻기 위한 방법으로는 먼저 혈액 중의 적혈구에서 헤모글로빈을 분리하고, 카르복시메칠 셀룰로스(carboxymethy cellulose; CMC)를 첨가하여 CMC 복합체로 헴을 침전시키는 방법(Autio, et. al., US Patent 4,518,525), 저급 알코올과 같은 탈수제를 사용하거나 이미다졸(imidazol) 유도체를 사용하는 방법(Lindroos, US Patent 4,431,581), 라이신, 아르기닌의 아미노산을 첨가하는 방법(Ingberg, et. al., US Patent 5,008,388) 등이 알려져 있다.

그러나 이상의 방법들은 헤모글로빈으로부터 글로빈 단백질을 분리하기 위하여 고안된 것으로 적혈구 용액 혹은 헤모글로빈 용액에 별도의 화합물을 첨가하여 글로빈 단백질을 분리하고 부산물로 헴철을 얻을 수 있도록 구성되어 있으나 첨가물을 회수하거나 제거하는 별도의 공정이 필요하여 대량제조가 곤란한 단점이 있다.

또 다른 제법으로는 고농도의 유기산을 이용하여 고온에서 분해하는 방법(Liu, et. al., J. Agric. Food Chem., 44, 2957, 1996)과 단백질 분해효소를 처리하여 헤모글로빈 중 글로빈을 분해하여 펩티드를 함유하는 헴철을 제조하는 방법(Eriksson, US Patent 4,411,915, Piot, et. al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 42, 147, 1988)이 있다. 유기산을 사용하는 방법은 다량의 유기산이 최종 제품에 함유되어 품질에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다.

단백질 분해 효소를 사용하는 기존의 방법들은 엔도형 단백질 분해 효소 한 종류만을 사용하여 헤모글로빈의 단백질을 분해하였기 때문에 단백질 가수분해도가 낮고, 헤모글로빈의 분해로 생성되는 펩티드와 펩티드, 펩티드와 헴기 사이의 소수성 결합으로 응집체(aggregate)가 생성되어(Lebrun, et. al., J. Agric. Food Chem., 46, 5017, 1998) 헴철을 함유한 응집체의 분자량이 크게 증가하여(Liu, et. al., J. Agric. Food Chem., 44, 2957, 1996) 효율적으로 펩티드를 제거하여 고농도로 헴철을 함유한 제품을 제조하기 곤란하다.

헴철을 함유한 응집체에서 펩티드 제거를 용이하게 하기 위하여 요소를 고농도(35~50%)로 첨가하는 방법이 있으나 요소의 첨가량이 많아서 경제적이지 못하며, 추가로 요소를 제거하는 공정이 필요한 단점이 있다.

또한 본 출원의 발명자들이 2000년 9월 9일 출원한 헤모글로빈으로부터 헴철의 제조방법(출원번호 10-2000-053778)에, 헤모글로빈에 단백질 분해기작이 상이한 엔도형과 엑소형 단백질 분해 효소를 순차적으로 2회 이상 반복하여 처리하여 분해한 다음 한외여과하여 건조시키는 방법이 있으나, 공정이 복잡하고 비용이 많이 드는 단점이 있었다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 헴철을 제조하는 방법들의 단점을 극복하고자 연구한 결과, 작용 기작이 상이한 두 종류의 단백질 분해효소 즉, 단백질의특정 펩티드 결합만을 가수분해하여 폴리펩티드를 올리고펩티드로 분해하는 엔도형의 효소(endopeptidase)와 폴리펩티드 말단을 아미노산 단위로 비선택적으로 가수분해하는 엑소형의 효소(exopeptidase)를 헤모글로빈에 동시에 처리하여 헤모글로빈의 가수분해도가 향상된 효소 분해물에서 헴철부분과 펩티드 부분의 용해도가 pH에 따라 서로 상이함을 확인하고 효소 분해물의 pH를 조절하여 철의 함량이 높은 헴철을 간편하게 회수함으로서 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 헤모글로빈에 단백질 분해 기작이 상이한 두 종류 이상의 단백질 분해효소를 동시에 처리하여 분해하고 분해액의 pH를 조절함으로서 철의 함량이 높은 헴철의 간편한 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 목적은 염기성 용액에서 변성시킨 헤모글로빈에 2종 이상의 단백질 분해효소인 엔도형 효소와 엑소형 효소를 동시에 처리하여 가수분해도가 높은 헤모글로빈의 가수분해물을 얻고 이 효소 분해물의 pH를 조절하여 헴철부분을 침전시켜 분리한 후 건조하여 암갈색 분말을 얻은 다음 이 암갈색 분말의 pH에 따른 수율과 분말내의 헴철의 함량을 측정하고, 동일한 방법으로 제조하되 헤모글로빈의 가수분해도에 따른 암갈색 분말의 수율과 분말내의 헴철의 함량을 비교함으로서 최적인 헴철 획득방법을 달성하였다.

이하 본 발명의 구성을 설명한다.

도1은 헤모글로빈의 가수분해도의 변화를 경시적으로 나타낸 그림이다.

도2는 헤모글로빈의 효소분해물에서 pH에 따른 헴철과 펩타이드의 용해도를 나타낸 그림이다.

본 발명은 헤모글로빈의 가수분해에 적합한 엔도형 및 엑소형 단백질 가수분해 효소를 이용하여 가열하여 변성시킨 헤모글로빈 용액에 상기의 단백질 가수분해 효소를 동시에 처리하여 분해시킨 후 헤모글로빈 가수분해물의 pH를 조절하여 헴철을 다량 함유한 부분을 침전시켜 분리한 후 건조하여 헴철을 함유한 암갈색 분말을 제조하는데 소요되는 공정으로 구성된다.

단계별 공정을 보면 헤모글로빈 용액에 효소를 처리하여 헴철의 획득을 간편하고 용이하게 수행되도록 효율적으로 가수분해를 수행하는 공정; 동일한 방법으로 엔도형 및 엑소형 단백질 가수분해 효소를 동시에 처리하여 분해시킨 헤모글로빈 가수분해물을 등전점을 이용한 침전법 또는 한외여과하여 분리, 농축한 후 열풍이나 분무건조로 헴철이 함유된 암갈색 분말을 제조공정으로 구성된다.

본 발명의 상기 구성에 의하면 헴철의 함량을 높이기 위하여 엔도형 효소와 엑소형 효소를 동시에 사용하였으며, 그 결과 가수분해도를 향상시킬 수 있었으며 헤모글로빈 분해물로부터 헴철을 분리하는 과정에서 펩티드 부분을 제거하는 것도 매우 용이하였다.

엔도형의 효소와 엑소형의 효소를 동시에 처리하면 엔도형 효소에 의하여 생성된 폴리펩티드 사슬의 말단을 아미노산 단위로 분해하므로 헴철을 회수하는 과정에서 손쉽게 단백질의 함량을 낮추어 헴철의 함량을 높일 수 있는 장점이 있다. 또한 엔도형 효소의 작용으로 생성되는 펩티드가 생성과 동시에 엑소형 효소의 작용으로 아미노산 단위로 분해되므로 순수한 펩티드 부분에서는 아미노기와 카르복실기의 증가로 펩티드의 소수성이 약해지고 친수성이 강해지므로 펩티드의 용해도가 증가하게 되며, 헴철을 함유한 펩티드 부분도 엑소형 효소에 의하여 펩티드에서 아미노산이 유리되므로 상대적으로 소수성이 강한 철 함유 포피린 환(porphyrin ring)의 분율이 증가하게 되어 헴철의 용해도는 감소하게 된다.

따라서 펩티드와 펩티드, 펩티드와 헴기 사이의 소수성 결합에 의하여 생성되는 응집체의 생성이 크게 감소하게 되므로 헴철의 분리가 용이해 진다. 이러한 용해도의 차이는 헤모글로빈의 가수분해도와 비례하여, 가수분해도가 증가하면 헴철과 펩티드의 용해도 차이는 더욱 증가한다. 단백질과 펩티드의 용해도는 각각의 등전점에 해당하는 pH에서 최소가 되므로 헴철을 함유한 펩티드 부분의 용해도가 최소인 pH조건이 존재하며 특정 pH조건에서는 헴철의 분리가 용이하게 된다.

본 발명에서 가수분해도와 헴철의 용해도에 대한 영향인자인 pH의 관계를 조사한 결과, 헤모글로빈의 가수분해도 10~20%에서는 pH 5~6, 가수분해도 20~40%에서는 pH4~5, 가수분해도가 40% 이상되면 pH 4이하에서 헴철 부분의 용해도가 최소로 되었으며, 가수분해도가 증가함에 따라 헴철을 포함한 펩티드 부분의 평균 등전점이 산성쪽으로 이동하였다. 그러므로 헤모글로빈의 가수분해도에 따라 헴철을 효율적으로 분리할 수 있는 pH조건을 선택할 수 있으며, 가수분해도가 높아지면 가수분해물의 pH를 3~4로 조정하여 헴철 부분의 용해도를 최소화하여 고농도 헴철을 간편하게 제조할 수 있게 되었다.

엔도형 및 엑소형 단백질 분해효소에 의하여 분해된 헤모글로빈 분해물에서 헴철 부분을 분리하는 또다른 방법으로는 크로마토그라피, 한외여과, 전기영동 등의 방법이 있다. 그러나 전기영동법은 다량의 시료를 처리하기 곤란한 단점이 있으며, 크로마토그라피법과 막을 이용하는 한외여과법은 다량으로 헴철을 회수할 수 있는 장점이 있으나 설비비가 많이 드는 단점이 있다. 따라서 본 발명과 같이 효소분해액의 pH를 조절하는 방법은 분리공정이 대단히 간편하여 설비비가 절약되며 분리효율도 우수한 장점이 있다.

본 발명에서 사용하는 엔도형의 단백질 분해 효소로는 동물, 식물, 미생물 기원의 효소를 모두 사용할 수 있고 기질인 헤모글로빈을 염기성 조건에서 변성시킨 후 사용하기 때문에 효소반응의 최적 pH가 중성 알칼리성인 것이 효과적이며 상업화된 것으로는 알칼라제(Alcalase), 에스페라제(Esperase), 페스칼라제(Pescalase) 등이 헤모글로빈의 분해에 적합하다.

엑소형의 분해효소는 미생물 기원의 효소로 플라보자임(Flavourzyme), 펩티다제(Peptidase) FP 등을 사용하는 것이 경제적이다.

각각의 단백질 분해 효소 사용량은 통상 기질 단백질의 0.1∼10%(w/w) 범위로 효소 반응시간과 효소의 활성에 기준한 경제성을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한 사용하는 효소들의 반응조건이 상이하므로 온도와 pH 조건을 엔도형 효소와 엑소형 효소의 반응조건을 고려하여 사용하는 효소의 활성이 최대로 유지될 수 있는 조건으로 조절하는 것이 필요하다.

본 발명에서 반응액의 가수분해도를 경시적으로 측정하여 가수분해도 35 ~ 70% 정도까지 헤모글로빈을 가수분해한다. 이때 가수분해도는 하기와 같은 식에의해 정의된다.

본 발명에서 펩티드와 아미노산 부분을 제거한 분획은 열풍건조, 분무건조, 진공동결건조, 진공건조 등의 방법으로 건조할 수 있다. 최종 건조물은 암갈색의 분말로 철의 함량은 1 ~ 3.2%(w/w), 헴철의 함량으로는 11.1 ~ 35.5%(w/w)이며, 수율은 헤모글로빈 대비 34 ~ 10%(w/w)이다.

본 발명은 헤모글로빈에서 단백질을 분해하여 제거하는 것이므로 단백질의 가수분해도가 높아져서 단백질을 많이 제거할수록 헴철의 함량이 높아진다.

이하 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하나 본 발명의 권리범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 2종의 단백질 분해효소로 동시에 처리한 헤모글로빈으로부터 헴철 제조

제 1 공정 : 헤모글로빈의 가수분해

헤모글로빈(시그마사 제품) 100 g을 증류수 1.5ℓ에 현탁하고 90℃로 30분간 가열하여 변성시킨 후 온도는 50℃, pH는 0.1 M NaOH 용액을 가하여 7.5로 조정하고 전체부피를 2 L로 하였다. 동일하게 3개의 기질용액을 준비하여 첫번째는 엔도형 분해효소인 에스페라제(Esperase) 1 g을, 두번째는 엑소형 분해효소인 플라보자임(Flavourzyme) 1 g을, 세번째는 엔도형 분해효소인 에스페라제(Esperase) 1 g과 엑소형 분해효소인 플라보자임(Flavourzyme) 1 g을 동시에 가하고 각각 5시간 동안분해하였다. 이때 각각의 기질 pH는NaOH 용액을 이용하여 pH 7.5으로 일정하게 유지하였다. 가수분해 과정에서 경시적으로 시료를 취하여 가수분해도를 측정하여 도1에 나타내었다. 엔도형 분해효소와 엑소형 분해효소를 동시에 사용한 결과, 가수분해도가 엔도형 분해효소 혹은 엑소형 분해효소만을 사용한 가수분해반응에 비하여 약 2배 이상 향상되었다.

제 2 공정 : 헤모글로빈 가수분해물로부터 헴철의 분리조건 조사

헤모글로빈 가수분해물에서 헴철의 분리조건을 조사하기 위하여 pH에 따른 헴철 부분과 펩티드 부분의 용해도를 조사하였다. 엔도형 분해효소와 엑소형 분해효소를 동시에 사용한 헤모글로빈 분해물(가수분해도 45.6%)을 200 ml씩 취하여 진한 HCl과 NaOH를 이용하여 pH를 2~9로 조정하고 3,000 g로 15분간 원심분리한 후 상등액의 단백질의 함량은 마이크로 킬달법으로 총질소를 정량하였으며 헴철의 함량은 피리딘-가성소다법으로 프로토포피린의 함량으로 측정하여 도2에 나타냈다. 가수분해도 45.6%인 분해물에서 상등액의 헴철 함량은 pH 3~4 범위에서 최소로 측정되었다.

제 3 공정 : 헤모글로빈 가수분해물로부터 헴철의 분리 및 건조

엔도형 분해효소와 엑소형 분해효소를 동시에 사용하여 미리 제조한 헤모글로빈 분해물(가수분해도 45%) 2ℓ의 pH를 3.5로 조정한 후 3,000 g로 15분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 침전물을 회수하여 통상의 방법으로 열풍건조하였다. 건조물의 성분을 분석한 결과 단백질 73%, 헴철23 %, 수분 4 %로 수율은 16%였다.

<실시예 2>∼<실시예 6> 2종의 단백질 분해효소로 동시에 처리한 헤모글로빈가수분해물의 가수분해도에 따른 헴철 제조

실시예 1 과 동일하게 헤모글로빈 용액을 준비하고 엔도형 분해효소인 에스페라제 1 g과 엑소형 분해효소인 플라보자임 1 g을 동시에 가하고 pH 7.5으로 일정하게 유지하면서 5시간 동안 분해하였다. 이때 가수분해 과정에서 가수분해도가 다르게 적절한 시간에 시료를 100 ml씩 취하여 가수분해도에 따라 pH를 다양하게 조절하고 3,000 g로 15분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 침전물을 회수하여 통상의 방법으로 열풍건조하였다.

가수분해물의 pH조건과 건조물의 성분을 분석한 결과는 표1과 같다.

[표1] 헤모글로빈의 가수분해도에 따른 헴철의 수율

가수분해도(%)	pH	단백질함량(%)	헴철 함량(%)	수율(%)
7.9	6.0	93	7	54.3
14.8	5.5	91	9	42.2
19.8	5.0	89	11	34.5
29.5	4.5	85	15	25.3
42.5	3.5	78	22	17.3

<비교예 1> 2종의 단백질 분해효소로 동시에 처리한 헤모글로빈으로부터 한외여과법을 이용한 헴철 제조

실시예 1 과 동일하게 헤모글로빈 용액을 준비하고 엔도형 분해효소인 에스페라제 1 g과 엑소형 분해효소인 플라보자임 1 g을 동시에 가하고 pH 7.5으로 일정하게 유지하면서 5시간 동안 분해하였다. 최종 가수분해물(가수분해도 43.3%) 2ℓ에 함유된 저분자량 성분을 막 공극(pore size)의 크기가 5,000 달톤이며 재생 셀룰로스 재질의 한외여과막(밀리포어사 제품)을 이용하여 제거하여 0.5ℓ로 4배 농축하고, 추가로 2ℓ의 증류수를 가하면서 다이어필터레이션(diafiltration)하여 저분자량 성분을 더 제거하고 최종 부피를 0.5ℓ로 하였다. 최종 농축액을 통상의 분무 건조방법으로 건조하여 암갈색의 분말 21 g을 얻었다. 건조물의 성분을 분석한 결과 단백질 78%, 헴철 18%, 수분 4 %로 수율은 21% 이였다. 본 발명의 제조방법보다 한외여과장치가 필요하며 분리시간이 많이 소요된다.

<비교예 2~3> 1종의 단백질 분해효소로 분해한 헤모글로빈으로부터 헴철의 제조

실시예 1 과 동일하게 헤모글로빈 용액을 준비하고 동일하게 2개의 기질용액을 준비하여 첫번째는 엔도형 분해효소인 에스페라제 1 g을, 두번째는 엑소형 분해효소인 플라보자임 1 g을 가하고 pH 7.5으로 일정하게 유지하면서 5시간 동안 분해하였다. 가수분해물의 가수분해도를 측정하고 그에 따라 pH를 조절한 후 3,000 g로 15분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 침전물을 회수하여 통상의 방법으로 열풍건조하였다.

건조물의 성분을 분석한 결과는 표2와 같다. 본 발명의 결과보다 가수분해도가 낮기 때문에 헴철의 함량이 낮다.

[표2] 1종 단백질 분해효소에 의한 헴철의 수율

	사용효소	가수분해도(%)	pH	단백질 함량(%)	헴철 함량(%)	수율(%)
비교예 2	Esperase	25.2	4.5	91	9	42.2
비교예 3	Flavourzyme	22.8	4.5	93	7	54.3

이상, 상기의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 헤모글로빈을 단백질 분해기작이 상이한 엔도형 및 엑소형 단백질 분해효소로 동시에 분해하여 가수분해도가 향상된 효소 분해물을 얻고 효소 분해물의 pH를 3~4로 조절하여 헴철 부분을 선택적으로 침전시킨 후 분리, 건조하여 헴철의 함량이 높은 암갈색의 분말을 제조하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업과 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

1. 헤모글로빈으로부터 헴철의 제조방법에 있어서, 헤모글로빈에 단백질 분해 기작이 상이한 엔도형과 엑소형 단백질 분해 효소를 동시에 처리하여 효소분해물을 얻은 후, 효소분해물의 pH를 조절하여 헴철을 선택적으로 침전시킨 후 분리 건조시킴을 특징으로 하는 헴철의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 효소분해물의 가수분해도가 20∼45%이고, pH는 3∼5임을 특징으로 하는 헴철의 제조방법.