KR20020083370A - 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전장(full-length) 상보 디옥시리보핵산(이하, cDNA라고 약칭함)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 전령 리보핵산 (이하, mRNA라고 약칭함)에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고, 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA복합체를 선별하는 단계; 상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA를 주형으로하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 전장 cDNA의 선택적 증폭 방법에 대한 것이다.

Description

전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는 앵커와 프라이머 {Process for preparation of full-length cDNA, and anchor and primer used for the same}
본 발명은 목적은 전장(full-length) 상보 디옥시리보핵산(이하, cDNA라고 약칭함)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 전령 리보핵산(이하, mRNA라고 약칭함)에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트(dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고, 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA a복합체를 주형으로하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 전장 cDNA선택적 증폭 방법에 대한 것이다.
최근에, 새로운 유전자를 찾아내고 유전자의 염기 서열을 결정한 후 그들의 생물학적인 특성을 알아냄으로써, 단백질과 같은 다양한 유전 공학 산물을 대량 생산할 수 있는 기술이 개발되고 있다. 이와 같은 유전자의 염기 서열 분석을 통해, 발암 물질 (carcinogen) 또는 기형 발생 물질(teratogen)과 같이 외부 요인에 의해서 유전자가 부적절하게 발현되거나 억제됨으로써 발생하는 다양한 질병에 대한 치료방법을 모색할 수 있다.
이러한 목적을 위해서, 현재까지, 유전 공학의 기본적인 기술로서 전령 RNA를 역전사시켜 상보 DNA를 제조한 후 이를 클로닝 벡터에 삽입하고 대량 복제하여, 생물학적으로 중요한 단백질을 대량 생산하는 방법이 개발되었다.
따라서, 인간의 상보 DNA 라이브러리(cDNA library)를 대량으로 생산하고, DNA 칩을 이용하여 유전자 발현 양상을 연구하기 위해서는 기존의 방법보다 효율적이고 간편하게 전장의 상보 DNA를 대량으로 제조하는 방법의 개발이 요구되고 있다.
인간 유전자의 발현 양상 연구와 그로부터 생성되는 물질의 구조 규명을 위한 전제수단으로서, 전장의 상보 DNA의 양말단 증폭(5', 3' rapid amplification of cDNA ; 5', 3' RACE) 방법이 널리 사용되고 있으며, 상보 DNA를 부분적으로 증폭하여 각 부분의 염기 서열을 규명한 EST(expressed sequence tag)를 서로 조합하여 완전한 염기 서열을 규명하는 방법이 개발되었다.
그런데, 현재까지 개발된 전장 상보 DNA를 획득하기 위한 방법은, 전령 RNA의 캡구조를 인식 표지로 사용하는 방법이 대표적인데, 여기서 "캡구조"는 진핵 생물의 전령 RNA의 5'말단에 특이적으로 존재하는 구조로써 메틸기가 치환된 구아니딘뉴클레오티드를 가지고 있으며, 일반적으로 단백질 합성 과정에서 개시 인자 (Initiation Factor)가 인식하는 부위이다.
진핵 세포의 전령 RNA의 캡구조를 인식하기 위해, 캡 결합 단백질과 고형 지지대(solid support matrix)를 결합한 융합 단백질(fusion protein)을 이용하여 5'캡부위에 붙이는 방법, 캡구조의 디올기를 인식하는 바이오틴을 처리하는 방법, 전령 RNA의 5'말단 부위의 캡구조를 토바코산 피로포스파타아제(tobacco acid pyrophosphatase)를 사용하여 제거한 후 합성 올리고뉴클레오티드를 연결시키는 방법등이 현재까지 개발되어 이용되고 있다.
그러나, 이러한 방법들은 많은 비용이 소요되며 효소 처리 과정과 정제 과정이 복잡하여 처리 과정 중 시발물질이 분해 또는 분실되거나 분실되는 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다.
따라서, 현재 역전사 과정에서 역전사 효소가 전령 RNA의 5'말단 부위를 인식하게 하는 대표적인 방법으로서, 소위 "캡파인더(CapFinder)"법이나 "캡셀렉터 (CapSelector)"법이 이용되고 있다. 그러나 "캡파인더"법의 경우 전령 RNA의 캡구조 부위에서 역전사 효소에 의한 뉴클레오티드 첨가 과정이 지체되고, 또한 템플레이트 스위칭 올리고뉴클레오티드(template switching oligonucleotide)를 인식하여 증폭을 해야하므로 불완전한 증폭 양상을 보일 수 있는 문제점이 있다.
"캡셀렉터"법은 상기의 문제점을 일부 해결하였지만, 말단 디옥시리보뉴클레오티딜 전이효소(terminal deoxyribonucleotidyl transferase)에 의한 리보 테일링 (Ribo-tailing)과정에 의해 아데닌기를 연결하는 과정이 추가되어야 하고, 이후 두가닥(double strand)의 어뎁터(adapter)를 다시 결합시켜야하는 문제점이 있다. 두 가닥의 어댑터를 결합시키는 과정에서 소요되는 시간이 상당하고, 적어도 십수 시간이상 소요되므로써 "캡셀렉터"법은 전장 cDNA를 대량으로 제조하는 상업적 방법으로 사용하기에는 문제점이 있다.
따라서, 당업계에는 보다 간편하고 짧은 과정을 통하여 전장 cDNA를 효율적으로 획득하고 이를 완전하게 증폭하여 전장 cDNA를 대량으로 제조할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요청되고 있다.
따라서, 본 발명은 mRNA를 주형으로한 cDNA의 역전사 과정(reverse transcription)과 앵커와 핵산의 연결 과정 (ligation)인 두 단계의 과정만으로 전장 cDNA를 획득하고 이를 완전하게 증폭하여 전장 cDNA를 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 베타엑틴(β-actin) 유전자의 cDNA 양 말단 부위를 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 아가로스 젤 상에서 전기영동한 사진이다.
도 2는 100 ng의 전령 RNA를 사용하여 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH ; Lane 1), 베타엑틴 (β-actin ; Lane 2), RNA 중합효소 II (RNA pol II ; Lane 3)와 트렌스페린 수용체(TFR ; Lane 4)의 전장 5'말단을 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 아가로스 겔상에서 전기영동한 사진이다.
도 3은 2㎍의 비장의 전체 RNA를 사용하여 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 GAPDH (Lane 1), 감마엑틴 (Lane 2), RNA 중합효소 II (Lane 3)증폭한 후 아가로스 겔상에서 전기영동한 사진이다.
도 4는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH ; 그림 4-1), 트렌스페린 수용체(TFR ; 그림 4-2)와 RNA 중합효소 II (RNA pol II ; 그림 4-3)의 전장 5'말단을 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 해당 산물들을 클로닝한후 염기서열을 결정하고 이미 알려진 전장의 염기서열과 비교 분석한 결과도이다.
도 5는 본 발명의 방법에 의하여 전장 상보 DNA를 제조하는 방법을 간단하게 나타낸 그림이다.
본 발명의 목적은 전장(full-length) cDNA를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, mRNA에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트(dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고, 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA 복합체를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 전장 cDNA의 선택적 증폭 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, mRNA에 역전사효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일 가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 상기의 전장 cDNA/mRNA 복합체를 주형으로 하여 증폭하고자 하는 유전자 부위에 대한 유전자 특이 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 진행시키는 단계를 포함하는 cDNA 또는 mRNA 일부 부위의 선택적 증폭방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, mRNA에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트(dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA 복합체를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 전장 cDNA에 결합된 앵커의 특정 부위를 그 특정부위에 선택적인 DNA 제한효소로 절단하여, 특정 부위 말단부를 갖는 두가닥 cDNA를 제조하는 단계;상기의 특정 부위 말단부를 갖는 두가닥의 cDNA를 DNA 연결효소를 사용하여 벡터에 삽입하는 단계; 상기의 cDNA가 삽입된 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계; 상기 숙주 세포를 대량으로 배양하는 단계; 상기의 대량으로 배양된 숙주 세포로부터 상기 특정 부위 말단부를 절단하는 DNA 제한효소를 사용하여 전장의 cDNA를 절단하는 단계를 포함하는 전장 cDNA 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 역전사 효소(RTase)는 M-MLV 역전사효소로서 3mM MgCl2와 2mM MnCl2존재하에서, 전령 RNA의 5' 캡부위를 인식하여 상보 DNA의 3'말단에 3 내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트기(dCTP)를 연결해주는 말단 전이 효소의 기능을 갖고 있다. 이에 관한 것은 Schmidt와 Mueller 의 논문 (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No 21, e31)에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명에서 사용된 효소는 RNA 연결 효소는, T4 RNA 연결효소로서 NpNpNOH (trinucleoside-diphosphate)를 포스페이트 수용기(acceptor)의 최소 기질로 인식할 수 있고, pNp(nucleoside 3',5'-biphosphate)는 포스페이트 제공자(donor)의 최소기질로 인식한다. 이는 핵산이 3개 이상의 주형 비의존성 시토신기를 갖는 전장 1차 cDNA 만이 T4 RNA 연결 효소에 의해 다른 올리고머와 연결될 수 있다는 것을 의미하며, 3개 보다 적은 디옥시뉴클레오티딜트리포스페이트(dNTP)를 갖고 있는 cDNA의 경우는 T4 RNA 연결 효소가 인식하지 못하여 다른 올리고머와 연결될 수 없다. 즉 이는 역전사효소가 1 차 cDNA 합성중 mRNA의 cap 지역을 만나 3' 말단에 주형 비의존성 반응에 의하여 추가로 3개 이상의 dCTP가 추가된 전장 1 차 cDNA만을 T4 RNA 연결효소의 특성을 이용하여 선별할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 방법들은, 선택적으로는, 상보 DNA의 합성 과정에 관여하지 않고 잔류된 전령 RNA를 리보 핵산 분해 효소(RNase)(예를 들어 RNase A)를 사용하여 제거하는 단계를 추가하여 포함할 수 있다. 3' 말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5' 말단에 단일 가닥 연결반응이 가능하도록 인산기가 결합된 한 가닥 (single strand) 앵커를 제조한 후, 이러한 앵커를 RNA 연결 효소(예를 들어 T4 RNA 연결 효소)를 사용하여 3 내지 4개의 시토신기가 연결된 전장 상보 DNA의 3'말단에 연결시키고, 앵커와 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응법으로 상보 DNA를 증폭한다.
이 방법을 응용한 상보 DNA 라이브러리를 구축하기 위하여, 상기의 프라이머와 CapFish(dT) 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응법으로서 두가닥의 완전한 상보 DNA를 합성하고 이를 통하여 상보 DNA의 전장을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 말단 전이 효소를 따로 처리하는 과정이 추가되지 않았기 때문에 이전에 보고된 다른 방법들보다 반응 시간을 단축할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 최대한의 효율을 얻기 위해서는 앵커와 핵산의 연결 반응 과정시 반응 시간이 8시간 이상 소요되지만, 인산기가 연결된 앵커를 대량으로 미리 아데닐화 (pre-adenylation)시켜 제조하여 사용할 경우 연결 반응시간을 3 시간 이하로 단축할 수 있어 반복적으로 수행되는 전장 cDNA 선별시 반응 시간을 단축하여 전체 소요시간을 줄일 수 있다.
이렇게 제조되어진 아데닐화된 앵커는 매우 안정하기 때문에 상온에서 보관할 경우에도 수주간 사용할 수 있다. 즉, 아데닐화되지 않은 앵커로 중합효소 연쇄 반응법에 의한 증폭에 필요한 충분한 주형을 얻기 위해서는 8시간 이상의 연결 반응 시간이 필요하지만, 미리 아데닐화된 앵커를 사용하여 앵커와 핵산간의 연결 반응을 진행할 경우 3시간이면 반응 시간이 충분하고 또한 높은 효율의 앵커와 핵산간의 연결 반응이 가능하였다.
"켑셀렉터"에 비해, 본 발명의 방법은 말단 전이 효소의 처리 과정이 생략될 수 있기 때문에 보다 간단한 방법이다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
RNA로부터 전장의 상보 DNA의 선별과 전장 5' 부위의 증폭
전체 RNA 2㎍ 또는 전령 RNA 100 ng을 사용하여 다음 방법에 의하여 세포내 양이 적은 TFR 전령 RNA와 세포내 양이 풍부한 베타엑틴, GAPDH의 전령 RNA의 전장 상보 DNA를 선별한 후 전장 5'부위를 증폭하였다.
1-1 : 상보 DNA 가닥의 합성
사람의 태반, 비장, 간 조직으로부터 Blood RNA PrepMateTM(Bioneer, Korea)을 사용하여 총 RNA를 분리한 후 필요한 경우 전령 RNA를 dT cellusose column을 이용하여 추가로 분리하였다. 올리고(dT) 앵커 프라이머 [CapFish(dT)]를 사용하여 상보 DNA를 합성하기 위하여 전체 RNA 2㎍ 또는 전령 RNA 100ng이 사용되었다. 50mM Tris-Cl pH8.3, 75mM KCl, 6mM MgCl2, 2mM DTT 각각의 dNTPs 2mM 그리고 1㎕의 PowerScriptTMRT(Clontech, USA)가 포함된 역전사 반응물 20㎕를 42℃에서 1시간동안 반응시켰으며, 이 역전사 반응물은 미합중국 등록 특허 제 4,943,531호에 개시되어 있다. 필요한 경우 이 반응물에 100mM MnCl20.4㎕를 첨가한 후 42℃에서 30분간 추가 반응시켰다. 이것을 phenol:chroloform으로 정제하고 3M 아세테이트 나트륨/DEPC와 에탄올을 첨가하여 RNA와 상보DNA/mRNA 혼성체를 침전시켰다.
1-2 : 앵커 합성과 T4 RNA 연결 효소에 의한 앵커와 핵산의 결합 반응
전 처리 (pre-adenylation)된 앵커[CapFishLink] 300 pmoles을 실시예 1-1에서 생산한 핵산 혼합물(RNA 와 cDNA/mRNA 혼성체)없이 50mM Tris-Cl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP, 25% PEG 6000 10㎕, 0.005% BSA 와 30unit T4 RNA 연결 효소(Takara, Japan)와 함께 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 실시예 1-1에서 합성된 핵산 혼합물(RNA 와 cDNA/mRNA 혼성체)에 위에서 합성한 앵커 60pmoles과 10unit의 T4 RNA 연결 효소를 처리하고 37℃에서 3시간동안 반응시켰다. 합성에참여하지 않고 잔류된 RNA는 10mg/㎖ 리보 핵산 분해 효소 4㎕를 처리하고 37℃에서 30분간 반응시켜 제거하였다.
1-3 : 중합효소 연쇄 반응법에 의한 증폭
실시예 1-2의 반응물 1㎕가 베타엑틴 전령 RNA의 5'말단 부위와 3'부위를 증폭하기 위한 주형으로서 사용되었다. AccuPower PCR premix(Bioneer, Korea)를 사용하였고, 전령 RNA의 5'말단을 증폭하기 위해 앵커에 특이한 프라이머 (CapFishRaceN 1과 2)와 베타엑틴(Genebank accession No: NM_001101) 역방향 프라이머(β-ActinR)가 사용되었으며, 전령 RNA의 3'말단을 증폭시키기 위해 CapFish(dT)와 베타엑틴 정방향 프라이머(β-ActinF)가 사용되었다. 중합효소 연쇄 반응의 실험 조건은 다음과 같았다.
94℃에서 1분간 초기 반응을 시키고 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1 내지 3분간 5회 반복 실시한 후, 추가로 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1 내지 3분간 30회 반복 실시하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 M은 사이즈 마커(size marker)를 나타내고, Lane 1은 베타액틴 정방향 프라이머와 베타엑틴 역방향 프라이머를 사용하여 상보 DNA를 중합효소 연쇄 반응법으로 증폭한 뒤 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과이다. Lane 2는 CapFish(dT)프라이머와 베타엑틴 정방향 프라이머를 사용하여 상보 DNA의 3'말단 부위를 중합효소 연쇄 반응법으로 증폭하여 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과이다. Lane 3은 CapFishRace1 프라이머와 베타엑틴 역방향 프라이머를 사용하여 상보 DNA의 5' 말단 부위를 중합효소 연쇄 반응법으로 증폭하여 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과이다.
또한 GAPDH 유전자 프라이머(Genebank accession No: M33197) 와 RNA 중합효소 II 유전자 프라이머(Genebank accession No: X82385)와 TFR 유전자 프라이머 (Genebank accession No: X01060) 가 해당 유전자의 전령 RNA의 5' 말단 부위를 증폭하는데 CapFishRace1 프라이머와 같이 사용되었다.
도 3에서 보는 바와 같이 100 ng의 전령 RNA를 시발물질로 사용한 경우 세포내 다량 존재하는 GAPDH와 베타엑틴 그리고 세포내 소량 또는 중간정도의 양이 존재하는 RNA 중합효소와 TFR유전자의 5' 말단 지역을 1 차례의 증폭을 통해 얻을 수 있었으며, 전체 RNA를 시발 물질로 한 경우는 GAPDH, 베티엑틴 및 RNA 중합효소 II의 5' 말단 지역의 산물을 한 차례 중합반응에 의하여 얻을 수 있었다.
1-4 : 역전사 핵산 염기 서열 결정
AccuPrepTM겔 정제 키트(Bioneer, Korea)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 과정 후 생긴 최종산물인 증폭된 상보 DNA를 정제하고 클로닝하여, AccuPower DNA 염기 서열 결정 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 염기 서열 반응을 수행하고 4% 변성 겔(denaturing gel)에 전기영동하여 최종적으로 Silverstar 염색키트 (Bioneer, Korea)로 밴드를 확인하여 염기 서열을 결정하였다.
도 4에서 보는 바와 같이 염기서열 결정 결과를 기존에 보고된 해당 염기서열과 비교한 결과 GAPDH (Genebank accession no ; J04038), RNA 중합효소II (Genebank accession no ; X98433.1) 및 TFR 유전자 (Genebank accession no ; X04664)의 전장 5' 말단을 성공적으로 선별하였다. 본 예시에서 사용된 방법은 전령 RNA 100ng을 시발 물질로 사용한 경우에 세포내 양이 적은 TFR 전령 RNA의 전장 5' 말단 부위까지 선별적으로 증폭할 수 있는 특이성을 나타내었다.
사용된 앵커와 프라이머의 염기 서열
염기서열
CapFishLink 5' phosphate AAGDAGTGGTATCAACGAGTGCGGCCGCGGG biotin 3'
CapFish(dT) 5' ATTCTAGAGCGGCCGCGACATGT(30) VN 3'
CapFishRace1 5' CCCGCGGCCGCACTCGTTGATACCACTGCTTGGG 3'
CapFishRace2 5' CCCGCGGCCGCACTCGTTGATACCACTGCTTGGGG 3'
CapFishRaceN1 5' CGCACTCGTTGATACCACTGCTTGGG 3'
CapFishRaceN2 5' CGCACTCGTTGATACCACTGCTTGGGG 3'
β-actinF 5' GCCCTGAGGCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC 3'
β-actinR 5' GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG 3'
GAPDHF 5' GTGGCGTATAGTAAGGCTGCAACAGTTACT 3'
GAPDHR 5' AAGCAGTTGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTG 3'
RNApol IIR 5' CACTGATGAGGTCGGTGATGGCGTTGGTAA 3'
TFRR 5' TGCTGGTACCAAGAACCGCTTTATCCAGAT 3'
도 1은 베타엑틴(β-actin) 유전자의 상보 DNA 양 말단 부위를 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 아가로스 젤 상에서 전기영동한 사진이다. 여기서 Lane 2는 정방향과 역방향의 유전자 특이 프라이머를 이용하여 증폭한 경우이고, Lane 2는 3' 말단을 그리고 3은 5' 말단을 각각 역방향과 정방향의 유전자 특이 프라이머와 앵커특이 프라이머를 이용하여 증폭한 것으로써 모든 산물은 현재 전장으로 보고된 베타엑틴 유전자로부터 유추된 길이와 일치한다.
도 2는 100 ng의 전령 RNA를 사용하여 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH ; Lane 1), 베타엑틴 (β-actin ; Lane 2), RNA 중합효소 II (RNApol II ; Lane 3)와 트렌스페린 수용체(TFR ; Lane 4)의 전장 5'말단을 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 아가로스 겔상에서 전기영동한 사진이다. Lane 5는 GAPDH 유전자의 정방향과 역방향 프라이머를 이용하여 증폭한 유전자의 일부인 300 bp 산물이다.
도 3은 2㎍의 비장의 전체 RNA를 사용하여 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 GAPDH (Lane 1), 감마엑틴 (Lane 2), RNA 중합효소 II (Lane 3)증폭한 후 아가로스 겔상에서 전기영동한 사진이다.
도 4는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH ; 그림 4-1), 트렌스페린 수용체(TFR ; 그림 4-2)와 RNA 중합효소 II (RNA pol II ; 그림 4-3)의 전장 5'말단을 본 발명의 방법과 프라이머를 사용하여 증폭한 후 해당 산물들을 클로닝한후 염기서열을 결정하고 기 보고된 전장의 염기서열과 비교 분석한 결과도이다.
도 5는 본 발명의 방법에 의하여 전장의 상보 DNA를 제조하는 방법을 간단하게 나타낸 그림이다.
본 발명의 전장의 상보 DNA를 획득하는 방법은 기존의 방법보다 간단한 2단계의 과정, 즉 전령 RNA를 주형으로하여 상보 DNA를 합성하는 역전사 과정과 앵커와 핵산의 결합 과정으로만 이루어지기 때문에 전체 전장 상보 DNA 선별 공정을 크게 단축하여 간편화할 수 있다. 또한 본 발명의 캡휘시(CapFish) 프라이머에는NotI,SmaI,XbaI,BglII,XhoI,SalI과 같은 제한 효소에 대한 인식 부위가 존재함으로써 상보 DNA 라이브러리를 구축하는데 필요한 클로닝 과정을 보다 쉽게 수행할 수 있고, 앵커와 핵산의 결합 반응시 앵커를 아데닐화 시켜 상보 DNA와 보다 용이하게 효율적으로 결합할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 방법을 사용하여 유전자 구조의 판명에 긴요하게 사용되는 전장의 상보 DNA를 보다 간단하고 경제적으로 선별할 수 있으며 이를 응용하여 전장의 5′말단지역을 선별적으로 증폭하여 확인할 수 있고 또한 전장 상보 DNA 라이브러리를 보다 간단하고 경제적으로 구축하기 위한 방법으로 응용될 수 있다.

Claims (24)

1)mRNA에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고, 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 2)상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA복합체를 선별하는 단계; 3)상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA복합체를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 전장 cDNA의 선택적 증폭 방법.
1)mRNA에 역전사효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 2)상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 3)상기의 전장 cDNA/mRNA 복합체를 주형으로 하여 증폭하고자 하는 유전자 부위에 대한 유전자 특이 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 진행시키는 단계를 포함하는 cDNA 또는 mRNA 일부 부위의 선택적 증폭방법.
1)mRNA에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기갸 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 2)상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA 복합체를 선별하는 단계; 3)상기의 앵커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 상기의 전장 cDNA/mRNA 복합체를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 진행시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 전장 cDNA에 결합된 앵커의 특정 부위를 그 특정부위에 선택적인 DNA 제한효소로 절단하여, 특정 부위 말단부를 갖는 두가닥 cDNA를 제조하는 단계; 4)상기에서 제조된 특정 부위 말단부를 갖는 두가닥의 cDNA를 DNA 연결효소를 사용하여 벡터에 삽입하는 단계; 5)상기의 cDNA가 삽입된 벡터를 사용하여 숙주 세포에 도입시키는 단계; 6)상기 숙주 세포를 대량으로 배양하는 단계; 7)상기의 대량으로 배양된 숙주 세포로부터 상기 특정 부위 말단부를 절단하는 DNA 제한효소를 사용하여 전장의 cDNA를 절단하는 단계를 포함하는 전장 cDNA 제조 방법.
제 1항에 있어서, 역전사 효소가 M-MLV인 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 선택적 증폭 방법.
제 1항에 있어서, 상기 RNA 연결 효소가 T4 RNA 연결 효소인 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 선택적 증폭 방법.
제 1항에 있어서, 상기의 2)의 복합체 선별 단계 이후, 상기의 3)의 중합효소 연쇄반응을 진행(Polymerase Chain Reaction)시키는 단계이전에, RNA분해효소를 사용하여 잔류하는 단일 가닥 RNA를 제거하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 선택적 증폭 방법.
5'말단 부위에 하나 이상의 아데닌기를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 앵커.
제 7항에 있어서, 상기 앵커가 NotI, SmaI, XbaI 및 XhoI 제한 효소의 인식 부위를 포함하고 있는 것임을 특징으로 하는 앵커.
제 7항에 있어서, 상기 앵커가 상보 DNA를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머와 상보적인 결합을 할 수 있는 임의의 염기 서열을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 앵커.
제 7항에 있어서, 상기 앵커가 단일 가닥(single strand)인 것임을 특징으로 하는 앵커.
제 8항에 있어서, 상기 앵커가 단일 가닥(single strand)인 것임을 특징으로 하는 앵커.
제 9항에 있어서, 상기 앵커가 단일 가닥(single strand)인 것임을 특징으로 하는 앵커.
제 8항에 있어서, 상기 앵커가 상보 DNA를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머와 상보적인 결합을 할 수 있는 임의의 염기 서열을 하나 이상 포함하는 것임을 특징으로 하는 앵커
5'말단부위에 3 내지 4개의 구아닌기와 하나 이상의 티민기를 포함하는 하는 앵커에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제 2항에 있어서, 역전사 호소가 M-MLV인 것을 특징으로 하는 mRNA 일부 부위의 증폭 방법.
제 2항에 있어서, 상기 RNA 연결 효소가 T4 RNA 연결 효소인 것을 특징으로 하는 mRNA 일부 부위의 증폭 방법.
제 2항에 있어서, 상기의 2)의 복합체 선별 단계 이후, 상기의 3)의 중합효소 연쇄반응을 진행(Polymerase Chain Reaction)시키는 단계이전에, RNA분해효소를 사용하여 잔류하는 단일 가닥 RNA를 제거하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA 일부 부위의 증폭 방법.
제 2항에 있어서, 리보 핵산 분해 효소가 리보 핵산 분해 효소 A에 의해 수행되는 것임을 특징으로 하는 mRNA 일부 부위의 증폭 방법.
제 3항에 있어서, 역전사 호소가 M-MLV인 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 RNA 연결 효소가 T4 RNA 연결 효소인 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 앵커에 아데닌기를 연결하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기의 2)의 복합체 선별 단계 이후, 상기의 3)의 중합효소 연쇄반응을 진행(Polymerase Chain Reaction)시키는 단계이전에, RNA분해효소를 사용하여 잔류하는 단일 가닥 RNA를 제거하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전장 cDNA 제조 방법.
제 3항에 있어서, 리보 핵산 분해 효소가 리보 핵산 분해 효소 A에 의해 수행되는 것임을 특징으로 하는 전장 cDNA 제조 방법.
1)mRNA에 역전사 효소를 작용시켜 3내지 4개의 디옥시시티딘모노포스페이트 (dCMP)기가 3′말단에 결합된 cDNA가닥과 mRNA간의 복합체를 제조하고, 이와는 별도로 3′말단에 바이오틴 또는 인산기가 결합되고 5′말단에는 인산기가 결합된 단일가닥 앵커를 아데닐화시키는 단계; 2)상기의 cDNA/mRNA 복합체의 cDNA가닥의 3′말단에 상기 아데닐화 단일가닥 앵커를 선별적으로 결합시켜 전장 cDNA/mRNA복합체를 선별하는 단계를 포함하는 전장 cDNA의 선별 방법.
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