KR20020082890A - Ｌｐａ 수용체 아고니스트 및 안타고니스트, 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 명세서에 공개된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 및 그러한 화합물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, LPA 수용체의 아고니스트로서 또는 안타고니스트로서의 활성을 갖는 그러한 화합물을 사용하는 방법, 예컨데, LPA 수용체에 대한 LPA 활성을 저해하는 방법, LPA 수용체 활성을 조절하는 방법, 암을 치료하는 방법, 세포 증식을 촉진시키는 방법, 및 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＬＰＡ 수용체 아고니스트 및 안타고니스트, 및 사용 방법{LPA RECEPTOR AGONISTS AND ANTAGONISTS AND METHODS OF USE}

모든 비-형질전환 세포는 그들의 생존과 증식을 위해 성장 인자를 필요로 한다. 폴리펩티드 성장 인자에 더하여, 성장 인자와 유사한 특성을 가진 새로운 지질 부류가 발견되었으며, 인지질 성장 인자(PLGFs)로 알려져 있다. 대부분의 정지 세포의 증식을 유도함(Jalink et al., 1994a; Tokumura, 1995; Moolenaar et al., 1997)에 있어 그들의 유사한 약리학적 특성에도 불구하고, PLGFs는 구조적으로 두 개의 넓은 부류로 하위 분류될 수 있다. 첫 번째 부류는 글리세롤 주쇄를 보유하는글리세로인지질 매개자(GPMs)를 포함한다. GPMs의 예로는 LPA, 포스파티드산(PA), 사이클릭 포스파티드산(사이클릭-PA), 알케닐 글리세롤 포스페이트(알케닐-GP), 및 리소포스파티딜 세린(LPS)를 포함한다. 두 번째 부류는 스핑고이드 염기 모티프를 보유하는 스핑고지질 매개자(SPMs)를 포함한다. SPMs의 예로는 스핑고신-1-포스페이트(SPP), 디히드로스핑고신-1-포스페이트, 스핑고실포스포릴콜린(SPC), 및 스핑고신(SPH)를 포함한다.

LPA(Tigyi et al., 1991; Tigyi and Miledi, 1992), PA(Myher et al., 1989), 알케닐-GP(Liliom et al., 1998), 사이클릭-PA(Kobayashi et al.,1999), SPP(Yatomi et al., 1995), 및 SPC(Tigyi et al.,2000)가 혈청에서 검출되었다. 이들 지질 매개자들은 동정되고 특성이 규명되었다. 성장 인자와 유사한 특성들을 나타내는, 혈청 및 혈장에 존재하는 알려지지 않은 PLGF가 여전히 존재한다(Tigyi and Miledi, 1992). 약 20㎛ 농도의 LPA가 혈청에 존재하는 가장 풍부한 PLGF이다(Tigyi and Miledi, 1992;Jalink et al.,1993).

진핵 세포에서, LPA는 소포체 막에서 주로 일어나는 인지질 생합성의 초기 단계에서 핵심 중간체이다(Bosch, 1974;Bishop and Bell, 1988). 소포체에서, LPA는 글리세롤-3-포스페이트에의 아실-CoA의 작용으로부터 유래되며, 추가로 아실화되어 PA를 생성한다. LPA의 PA로의 아실화 속도가 매우 높으므로, 극소량의 LPA가 생합성 부위에 축적된다(Bosch, 1974). LPA는 소포체에 한정되기 때문에, 대사 중간체로서의 그 역할은 아마도 시그날링 분자로서의 그 역할과는 무관한 것으로 보인다.

LPA는 혈청의 구성 성분이며 그 농도는 낮은 마이크로몰(㎛) 범위이다(Eicholtz et al.,1993). 응고 과정동안 활성화된 혈소판에 의해 LPA가 방출되기 때문에 이 농도가 예상된다. 혈청과는 달리, 새 혈액 또는 혈장에서는 검출되지 않는다(Tigyi and Miledi, 1992;Eicholtz et al.,1993). 혈청에 존재하는 LPA는 알부민에 결합되며, 전 혈청의 열에 안정하고 및 비투석성인 생물학적 활성의 대부분의 원인이다(Moolenaar,1994).제노푸스난모세포에서 내향성 클로라이드 전류(chloride current)를 유발하는 활성 혈청 성분이 LPA인 것으로 확인되었다(18:0)(Tigyi and Miledi,1992). 알부민-결합된 LPA(18:0) 다량이 리소-PC에 대한 리소포스포리파제 D(PLD)의 작용에 의해서라기 보다는 응고 과정동안 생산된다. 리소포스포리파제 D에 의한 경로는 헤파린 또는 시트레이트와 덱스트로스의 작용에 의해 비응고된 '성숙' 혈장내의 LPA의 존재에 대해 책임이 있다(Tokumura et al.,1986). 주목할 다른 점은 EDTA로 처리된 혈장에는 LPA가 존재하지 않는다는 것이다. 이 사실은 혈장 리소포스포리파제가 Ca²⁺-의존성(Tokumura et al.,1986)일 수도 있음을 의미한다.

알부민의 역할은 혈청에 존재하는 포스포리파제의 작용으로부터 LPA를 보호하는 것이다(Tigyi and Miledi,1992). Tigyi와 Miledi는 알부민이 혈류에서 LPA의 운반체로 작용할 뿐만 아니라, 그 생리학적 반감기를 증가시킴을 제안했다.제노푸스난모세포에서 클로라이드 전류를 유도함에 있어 LPA 작용을 모방하는, 혈청 알부민에 존재하는 아직 확인되지 않은 지질 매개자가 있다.

LPA-반응성 세포 유형은 점균류 아메바와제노푸스난모세포에서 포유류 체세포에까지 이른다. 따라서, LPA의 공급원과 그 방출은 활성화된 혈소판에만 한정되지 않을 수도 있다. 최근의 실험은 펩티드 성장 인자들에 의해 자극될 경우, 포유류 섬유아세포가 신속히 LPA를 생산하고, 이는 이어서 세포외 매질로 방출됨을 보여주었다(Fukami and Takenawa,1992).

미지의 세포 기원의 비교적 다량의 생활성 LPA가 난소 암 환자의 복수액에 존재하며(Xu et al.,1995a), 그러한 환자로부터의 복수액이 난소 암 세포에 대한 강력한 분열 촉진 활성을 보유한다(Mills et al.,1988;Mills et al.,1990)는 증거가 있다. 종양 세포에 의해 세포외 액으로 분비되는지, 백혈구에 의해 분비되는지, 또는 다양한 포스포리파제의 작용을 통해 더욱 복잡한 지질로부터 생성되는지 여부는 확인되어야 한다.

GPMs와 SPMs는 계통발생도에 널리 걸친 다양한 세포 반응을 유발한다(Jalink et al.,1993a). LPA는 신경(Jalink et al.,1993;Durieux et al.,1992), 혈소판, 정상 및 형질전환된 섬유아세포(Jalink et al.,1990), 상피 세포(van Corven et al.,1989;Moolenaar,1991), 및제노푸스난모 세포(Tigyi and Miledi, 1992;Durieux et al.,1992;Fernhout et al.,1992)와 같은 다양한 세포에서 세포내 저장물로부터 유래하는 일시적인 Ca²⁺시그날을 유도한다. LPA는 혈소판 응집(Schumacher et al.,1979;Tokumura et al.,1981;Gerrard et al.,1979;Simon et al.,1982)과 평활근 수축(Tokumura et al.,1980; Tokumura et al.,1994)을 유도하며, 정맥내 투여시 혈압에서 종의존적 변화를 유도한다(Schumacher et al.,1979;Tokumura et al.,1978).

정지 섬유아세포에 첨가될 때, LPA는 DNA 합성과 세포 분열을 자극한다(van Corven et al.,1989;van Corven et al.,1992). LPA의 성장 유사 효과는 펩티드 성장 인자의 존재를 필요로 하지 않는다. 이 관찰은 세포 증식을 지탱하기 위해 인슐린 또는 상피 성장 인자(Moolenaar,1991)의 존재를 필요로 하는 엔도테린 또는 바소프레신과 LPA가 구별되게 한다. 주목할 점은 Sp²골수종 세포에서 LPA는 cAMP 농도 증가에 의해 매개되는 항분열촉진 반응에 관여한다는 것이다(Tigyi et al.,1994; Fischer et al.,1998). 분열 촉진 경로와는 달리, 항분열촉진 경로는 페르투시스 독소(PTX)에 의해 영향받지 않았다. 또한, 폴스콜린과 이소부틸 메틸 잔티스 첨가시, Sp²골수종 세포에서 LPA의 항분열촉진 작용은 첨가성이었다(Tigyi et al.,1994). 다양한 세포 유형에서, LPA는 섬유아세포에서 병소 접착 형성과 스트레스 섬유 형성을 포함하는 세포 골격 변화를 야기한다(Ridley and Hall, 1992). LPA는 또한 발생중인 축삭의 수축을 야기하여 신경 모세포종 분화의 역전과 억제를 촉진한다(Jalink et al.,1994a; Jalink et al.,1994b). 혈청 결핍된 N1E-115 신경 모세포종 세포에 나노몰(nmol)양의 LPA를 첨가할 경우(Jalink and Moolenaar, 1992), 즉각적인 축삭 수축을 야기하였으며, 이와 함께 신속하지만 일시적으로 세포 몸체가 둥글어졌다(Jalink et al.,1993b). LPA가 연속적으로 존재하는 경우, neuroblastoma 세포는 그들의 미분화된 표현형을 유지하며, 유사 분열을 진행하지못한다. 인슐린 유사 성장 인자들과 같은 부가적인 인자들이 세포 주기의 진행에 필요했다. 일단 세포가 형태적인 분화를 거치면, LPA의 첨가는 이 형태적인 변화를 역전시킨다. 따라서, LPA-유도된 축삭 수축은 기층에 대한 부착 손실에서가 아니라 액틴-세포 골격의 수축에 기인한다(Jalink et al.,1993b;Jalink et al.,1994b).

다른 생리학적 화학적 유인제(예, 인터루킨 8)와 유사하게, LPA는 사람 단핵구에서 주촉성 기작에 의해 세포 이동을 유도한다(Zhou et al.,1995). 세포 이동을 유도하는 것에 더하여, LPA는 간암 및 암 세포가 중피 세포의 단층에 침입하는 것을 촉진한다(Imamura et al.,1993). 이 침입의 기작은 아직 불명확하나, 증가된 세포 이동성 및 증가된 세포 부착에 기인할 수도 있다. 마지막으로, LPA는 또한 신생 심장근세포 어팝토시스를 차단하는 것으로 알려져 있다(Umansky et al.,1997).

독특한 천연 인지질인 사이클릭-PA는 세포 유형에 따라, 다른 GPMs와 유사하거나 반대되는 세포 작용을 일으키는 것으로 알려졌다.제노푸스난모세포에서 실험할 경우, 이것은 다른 GPMs와 같은 클로라이드 전류를 유발시켰으나, 그 반응은 LPA에 의해 탈감작되지 않았다(Fischer et al.,1998). Murakami-Murofushi et al.(1993)은 사이클릭-PA가, 증식을 유도하는 LPA와 달리, 항증식 작용을 나타냄을 보여주었다.

PLGF 수용체(PLGFRs)는 7-경막(7TM) 구아닌 뉴클레오티드-결합 조절 단백질(G 단백질)-결합된 수용체(GPCR) 상과에 속한다. 7-TM GPCRs는 이종삼량체 G-단백질과 상호작용하여 세포 반응을 매개하는 세포-표면 수용체 과이다. EDG-2, EDG-4, EDG-7, 및 PSP-24를 포함하는 많은 LPA 수용체가 확인되었다. 이들 LPA 수용체와 다른 것들의 상관성을 보여주는 계통발생도가 도1에 나타난다.

1996년에, Hecht et al.은 마우스 신피질 세포주로부터의 추정상의 사문석 수용체를 암호하는 cDNA를 클론하기 위해 차등 하이브리드화를 이용하였다(Hecht et al.,1996). 이 유전자는 심실 영역 유전자-1(Vzg-1)로 불렸다. 이 유전자는 피층 신경원성 영역에서 발현되며 41kDa(364 아미노산)의 분자량을 갖는 단백질을 암호하였다. Vzg-1은 내피 분화 유전자-2(EDG-2)로 불리는 공개되지 않은 양 서열에 매우 유사하였다. 동일한 cDNA가 또한 마우스와 소 라이브러리로부터 올펀(orphan) 수용체로서 분리되었으며, rec1.3으로 알려졌다(Macrae et al.,1996). 이는 마우스 조직에서 널리 분포되며 뇌와 심장에서 가장 많이 발현되었다.

1996년에, Guo et al.,은 PCR계 프로토콜을 이용하여제노푸스난모 세포로부터 또 다른 추정 LPA 수용체 PSP-24(372 아미노산)를 분리하였다(Guo et al.,1996). 이 수용체는 Vzg-1/EDG-2/rec1.3과 거의 유사성을 보이지 않았다(Guo et al.,1996). EDG-2 사람 LPA 수용체의 cDNA 서열을 이용한, 스핑고리피드 수용체를 찾기 위한 서열 기초 조사 결과, 두 가지의 밀접하게 관련된 GPCRs, 즉 래트 H218(EDG-5, 354 아미노산)과 EDG-3(378 아미노산)을 발견하였다(An et al.,1997a). 노던 분석은 심장 조직에서 EDG-3과 EGD-5를 암호하는 mRNA가 다량 발현됨을 보여주었다.

EDG-2가 LPA를 위한 작용성 수용체임이 최근 확인되자, An et al.은 신규한 LPA 아형을 위한, 서열에 기초한 연구를 수행하였다(An et al.,1998a). GPCR을 암호하는 사람 cDNA가 발견되어 EDG-4로 명명되었다(An et al.,1998a). 노던 블롯 분석은 EDG-2와 EDG-4가 둘다 GPM 수용체로 작용함에도 불구하고, 그들의 조직 분포는 매우 상이함을 보여주었다. EDG-2와 달리, EDG-4는 일차적으로 말초 혈액 백혈구와 정소에서 발현되었다(An et al.,1998a).

사람 Jurkat T 세포로부터의 PCR 증폭 cDNA는 EDG 과에 속하는 이전에 알려지지 않았던 GPCR을 확인하였다. 확인된 GPCR은 EDG-7으로 명명되었다. 분자 질량은 40kDa(353 아미노산)이었다. 사람 조직에서 EDG-7 발현의 노던 블롯 분석은 심장, 췌장, 전립선, 및 정소에서 발현됨을 보여주었다(Bandoh et al.,1999). 따라서, 두 가지 다른 과의 PLGFs 수용체, PSP24와 EDG가 있으며, 총 10개의 PLGFRs(도 1)가 있다. 리스트는 계속 증가한다.

이들 다양한 수용체는 GPMs 또는 SPMs 에 대한 그들의 리간드 특이성에 기초하여 분류될 수 있으며, 하기 표 1과 같다.

인지질 성장 인자 수용체, 길이 및 주 리간드

PLGFR	아미노산 수	주 리간드
EDG-1	381	SPP
EDG-2	364	LPA
EDG-3	378	SPP
EDG-4	382	LPA
EDG-5	354	SPP
EDG-6	385	SPP
EDG-7	353	LPA
EDG-8	400	SPP
제노푸스 PSP24	372	LPA
쥐과 PSP24	373	LPA

제노푸스PSP24와 쥐과 발현된 PSP24는 GPM(LPA, Fischer et al.,1998) 야기 진동성 클로라이드-전류를 특이적으로 변환한다. 이들은 구조적으로는 EDG 과에 상동성이 아니다(Tigyi and Miledi,1992;Fernhout et al.,1992). EDG 과는 두 개의 다른 하위그룹으로 분류될 수 있다. 첫 번째 그룹은 EDG-2, EDG-4, 및 EDG-7을 포함하며, 이들은 단지 GPM만을 위한 수용체로 작용하며(Hecht et al.,1996;An et al.,1998a;Bandoh et al.,1999;An et al.,1998b) 리간드 결합에 대한 반응으로 많은 시그날을 전달한다. 두 번째 그룹은 EDG-1, EDG-3, EDG-5, EDG-6 및 EDG-8에 관련되며, SPMs에 대해 특이적이다(An et al.,1997a;Im et al.,2000;van Brocklyn et al.,1998;van Brocklyn et al.,2000;Spiegel and Milstein,2000). 다양한 PLGFR's의 주요 조직 발현이 하기 표2에 나타난다.

인지질 성장 인자 수용체의 사람 조직 발현

PLGFR	가장 많이 발현되는 사람 조직
EDG-1	도처
EDG-2	심혈관, CNS, 생식소 조직, GI
EDG-3	심혈관, 백혈구
EDG-4	백혈구, 정소
EDG-5	심혈관, CNS, 생식소 조직, 태반
EDG-6	림프계, 조혈 조직
EDG-7	심장, 췌장, 전립선, 정소
EDG-8	뇌
PSP24	CNS

PLGFs는 다수의 G-단백질-매개 시그날 전달 사건을 활성화한다. 이들 과정은 이종삼량체 G-단백질 과 G_q/11, G_i/0, 및 G_12/13을 통해 매개된다(Moolenaar,1997;Spiegel and Milstein, 1995;Gohla, et al.,1998).

G_q/11경로는 포스포리파제 C(PLC) 활성화를 일으키며, 이는 이노시톨 트리포스페이트(IP₃) 생산을 야기하며 다양한 세포에서 Ca²⁺의 이동을 일으킨다(Tokumura,1995). 일부 세포에서, 이 반응은 PTX-민감성이며, 이는 다수의 PTX-민감성 및 비민감성 경로가 관여함을 의미한다(Tigyi et al.,1996). 이 경로는 단백질 키나아제 C(PKC)의 디아실 글리세롤(DAG)-매개 활성화에도 책임이 있다. PKC는 세포 포스포리파제 D(PLD)를 활성화하며, 이는 포스파티딜 콜린이 유리 콜린과 PA로 가수분해 되도록 한다(van der Bend et al.,1992a). 또한, PLC는 MAP 키나제를 직접 또는 일부 세포 유형에서는 PKC의 DAG 활성화를 통해 활성화할 수 있다(Ghosh et al.,1997).

분열 촉진성-시그날링 경로는 G-단백질 이종삼량체 G_i/0서브유닛을 통해 매개된다. 형질감염 연구는 αi 서브유닛이 아닌 G_iβγ이량체가 Ras-MAP 키나제 활성화에 작용함을 나타낸다.

Ras의 활성화는 EGF(Cunnick et al.,1998) 또는 PDGF 수용체(Herrlich et al.,1998)와 같은 수용체 티로신 키나제(RTKs)의 트랜스활성화에 의해 선행된다. 트랜스활성화된 RTKS는 Ras를 활성화시키며, 이는 Raf를 통해 MAP 키나제(ERK 1,2)의 활성화로 이끈다. PTX-민감성인 G_iα서브유닛은 아데니릴 사이클라제(AC)를 저해하여, 수용체를 인산화시키고 탈감작시키는 G-단백질-결합된 수용체 키나제(GRKs)에 βγ이량체가 결합하도록 한다. 인산화된 수용체는 β-아레스틴에 의해 발견되어, src 키나제를 발견하며, 이는 EGF-수용체를 인산화하여, 그 활성 형태를 생성한다(Lin et al.,1997;Ahn et al., 1999;Luttrell et al.,1999). 트랜스활성화된 RTKs는 Ras를 활성화시키며, 이는 Raf를 통해 MAP 키나제(ERK 1,2)를 활성화시킨다. PTX-민감성인 G_iα서브유닛은 AC를 저해하여 사이클릭-AMP(cAMP) 농도를 감소시킨다. LPA에 의한 반대의 세포 효과, 즉, 유사 분열과 항유사분열은 cAMP 두 번째 메신저 시스템에 대한 반대 효과에 의해 수반된다. 유사 분열은 G_iα경로를 통해 매개되며, 그 결과 cAMP 농도가 감소되는 반면(van Corven et al.,1989;van Corven et al.,1992), 항유사분열은 cAMP의 비-PTX 민감성 Ca²⁺-의존성 증가에 의해 수반된다(Tigyi et al.,1994;Fischer et al.,1998).

대조적으로, 액틴-세포 골격의 재배열로 이끄는 PTX-비민감성 G_12/13시그날링 경로에 대해서는 별로 알려진 것이 없다. 이 경로는 또한 RTKs의 트랜스활성화에 관여하며(Lin et al.,1997;Ahn et al.,1999;Luttrell et al.,1999;Gohla et al.,1998) 작은 GTPase, Rho에 집결할 수도 있다(Moolenaar, 1997). 다양한 단백질 파트너들이 분리되고 확인되어, Rho의 다운 스트림 시그날링에 대해 더 많이 알려져 있다. Rho는 Ser/Thr 키나제를 활성화시키며, 이는 미오신 경쇄 포스파타제(MLC-포스파타제)를 인산화하고, 저해한다(Kimura et al.,1996). 이 경로는 MLC의 인산화 형태의 축적을 일으키며, 세포 골격 반응으로 이끌어 축삭의 수축(Tigyi and Miledi,1992;Tigyi et al.,1996;Dyer et al.,1992;Postma et al.,1996;Sato et al.,1997), 스트레스 섬유의 유도(Ridley and Hall, 1992;Gonda et al.,1999), 주화성의 자극(Jalink et al.,1993a), 세포 이동(Zhou etal.,1995;Kimura et al.,1992), 및 종양 세포 침입(Imamura et al.,1993;Imamura et al.,1996)과 같은 세포 효과로 이끈다. PLGF-유도된, Rho-매개된, 종양 세포 침입은 씨.보툴리늄 C3-톡신에 의해 차단되며, 이는 ADP-의존 기작에서 Rho를 특이적으로 리보실화한다(Imamura et al.,1996).

또한 Rho는 정지 섬유아세포에서 DNA 합성을 자극하는 능력을 갖는다(Machesky and Hall, 1996;Ridley,1996). Rho과(family) GTPase의 발현은 혈청-반응 인자(SRF)를 활성화시키며, 이는 초기 유전자 전사를 매개한다(Hill et al.,1995). 또한, PLGF(LPA)는 종양 세포 침입을 유도한다(Imamura et al.,1996). 하지만, 그것이 세포 골격 변화 또는 유전자 전사, 또는 둘다에 관여하는 지는 불명확하다.

증식 및/또는 이들의 이동과 같은 다수의 세포 활성 및 세포 경로에서의 LPA/LPA 수용체 관여 및 상처 치료와 암에서의 관여에 의해, 전술한 LPA 수용체에서의 안타고니스트 또는 아고니스트로서 작용, 바람직하게는 선택적으로 작용할 수 있는 신규 화합물을 동정하는 것이 필요하다.

현재 극소수의 합성 또는 내인성 LPA 수용체 저해제가 공지되어 있다. 현재까지 보고된 안타고니스트중, 대부분의 작업은 SPH, SPP, N-팔미토일-1-세린(Bittman et al.,1996), 및 N-팔미토일-1-티로신(Bittman et al., 1996)에 대한 것이었다. 전술한 화합물들은제노푸스난모 세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류를 저해함이 알려졌다(Bittman et al.,1996;Zsiros et al.,1998). 하지만, 이들 화합물들은 모든 세포 시스템에서 연구되지는 않았다.SPP는 종양 세포 침입을 저해하는 것으로 알려져 있으나, SPP가 LPA의 저해제가 됨으로써인지 또는 그 자신의 수용체의 작용을 통해서인지는 확실하지 않다. N-팔미토일-1-세린과 N-팔미토일-1-티로신은 또한 LPA-유도된 혈소판 응집을 저해하지만(Sugiura et al.,1994), 이들 화합물들이 LPA 수용체에서 작용하는 지 여부는 밝혀져야 한다. 리소포스파티딜 글리세롤(LPG)는 LPA 작용의 저해를 어느 정도 보여준 첫 번째 지질이다(van der Bend et al.,1992b). 하지만, 몇몇 LPA-반응성 세포 유형에서는 검출할 수 없었다(Liliom et al.,1996). 이들 저해제 중 어느 것도 특정 LPA 수용체에서 선택적으로 작용하는 것으로 나타나지는 않았다.

폴리설폰화된 화합물인 수라민(Suramin)은 가역적이고 용량 의존적인 방식으로 LPA-유도된 DNA 합성을 저해하는 것으로 나타났다. 하지만, 수라민은 LPA 수용체에 대해 어떤 특이성도 갖지 않으며 매우 높은 밀리몰(mM) 농도에서만 LPA의 작용을 차단했다(van Corven et al.,1992).

본 발명은 현재의 LPA 아고니스트와 LPA 안타고니스트와 관련된 문제를 극복하는 것에 관한 것이다.

본 출원은 그 전체가 참고로 본원에 통합되며 2000년 3월 17일에 출원된 미국 가출원 제 60/190,370호의 이익을 누린다.

본 발명은 부분적으로, 국립 보건원 Grant Nos.HL 07641-12와 GM43880 및 국립 과학 재단 Grant No.IBN-9728147에 의해 기금을 지원 받았다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수도 있다.

본 발명은 리소포스파티드산("LPA") 수용체에 대해 아고니스트 또는 안타고니스트 활성을 갖는 LPA 유도체 및 이들의 전립선 암 치료, 난소 암 치료, 및 상처 치료를 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 치료 용도에 관한 것이다.

도 1은 LPA 수용체 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24(α,β)를 비롯한 10개의 인지질 성장 인자 수용체의 부류 및 관련성을 설명하는 계통발생도이다.

도 2는 세린 아미드 화합물35-43의 제조에 이용되는 합성 개요를 나타낸다.

도 3은 세린 아미드 포스페이트 화합물55-59의 제조에 이용되는 합성 개요를 나타낸다.

도 4는 바이포스페이트 화합물66-68의 제조에 이용되는 합성 개요를 나타낸다.

도 5a 및 5b는 바이포스페이트 화합물의 합성법을 나타낸다. 도 5a는 1,2-바이포스페이트 화합물85-92의 제조에 이용되는 합성 개요를 나타낸다. 도 5b는 1,3-바이포스페이트 화합물을 제조하기 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 6a 및 6b는 피로포스페이트 화합물의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 7a 내지 7c는 토실레이트-보호된 디-에테르 중간체로부터 치환된 모노-포스페이트 및 모노-포스포네이트의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 8은 직쇄 지방산 포스페이트 화합물106-110의 제조에 이용되는 합성 개요를 나타낸다.

도 9는 직쇄 티오인산 모노알킬 에스테르의 합성법을 나타낸다.

도 10은 직쇄 알킬아미노-인산의 합성법을 나타낸다.

도 11은 배좌 구속된(conformationally restrained) 사이클릭 포스페이트 화합물의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 12는 배좌 구속된 사이클릭 포스페이트 화합물의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 13은 배좌 구속된 사이클릭 포스페이트 화합물의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 14는 유리 포스페이트 부분을 갖는 배좌 구속된 화합물의 제조를 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 15는 2-모노포스페이트를 제조하기 위한 대안적 합성 개요를 나타낸다.

도 16은 1,3-바이포스페이트 화합물을 제조하기 위한 대안적 합성 개요를 나타낸다.

도 17은 X³으로서 -N(H)-아실기를 갖는 화합물을 제조하기 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 18은 X³으로서 -N(H)-이미다졸기를 갖는 화합물을 제조하기 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 19는 X³으로서 -N(H)-C(O)-O-R⁷을 갖는 화합물을 제조하기 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 20은 X³으로서 -N(H)-C(S)-O-R⁷을 갖는 화합물을 제조하기 위한 합성 개요를 나타낸다.

도 21은56(SAP, 14:0)의 세포외 적용에 의한제노푸스(Xenopus)난모세포에서의 LPA-유도 클로라이드 전류의 용량-의존적 저해를 나타내는 그래프이다.

도 22은57(SAP, 18:0)의 세포외 적용에 의한제노푸스난모세포에서의 LPA-유도 클로라이드 전류의 용량-의존적 저해를 나타내는 그래프이다.

도 23a 및 23b는66(MAGDP, 18:0)의 세포외 적용에 의한제노푸스난모세포에서의 LPA-유도 클로라이드 전류의 용량-의존적 저해를 나타내는 그래프이다. 화살표는 5 μM66의 세포내 주사 시간을 나타내며, 이어서 LPA의 세포외 적용이 이루어진다.

도 24는66(MAGDP, 18:0)의 용량-저해 효과를 나타내는 그래프이다. LPA 일정량(5 nM)을66증가량과 함께 난모세포에 적용하였다. 데이터 포인트들은 측정된 클로라이드 전류의 피크 크기를 나타낸다.

도 25는92(MAGDP, 22:0)의 세포외 적용에 의한제노푸스난모세포에서의 LPA-유도 클로라이드 전류의 용량-의존적 저해를 나타내는 그래프이다.

도 26은제노푸스난모세포에 대한56a(SDAP, 14:0/2:0)의 용량-의존적 효과를 나타내는 그래프이다.

도 27은 LPA-유도 HEY 세포 이동에 대한 화합물56(SAP, 14:0),56a(SDAP, 14:0/2:0) 및66(MAGDP, 18:0)의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 시험 화합물 농도는 1 μM 이었고; LPA 농도는 0.1 μM 이었다.

도 28a 내지 28c는 Edg-2(28a), Edg-4(28b) 또는 Edg-7(28c)을 이종성으로 발현시키는 RH7777 세포에서의 Ca²⁺응답에 대한 용량 응답 관계를 나타내는 그래프이다. 각각의 데이터 포인트는 3번 이상의 측정값의 평균 ±S.D.를 나타낸다.

도 29a 내지 29d는 Edg-2 및 Edg-7은 발현시키나 Edg-4는 발현시키지 않는 RH7777 세포에 있어서 LPA에 의하여 유발된 Ca²⁺응답의 DGPP 8:0 저해를 나타내는 그래프이다. Edg-2, -4 또는 -7을 발현시키는 RH7777을 100 nM LPA 18:1 및 1 μM DGPP 8:0의 혼합물에 노출시켰다. 대조군 세포들을 100 nM LPA 18:1에 노출시켰다. 안정한 Edg-2(29a), Edg-4(29b) 및 Edg-7(29c) 발현 세포들, 또는 Edg-4(29d)를 일시적으로 발현시키는 세포들에 대한 대표적인 Ca²⁺응답을 나타낸다.

도 30a 내지 30c는 Edg-7을 발현시키는 RH7777 세포들(Edg-7 세포들)에 있어서 DGPP 8:0에 의한 LPA 응답의 저해의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. 증가 농도의 DGPP 8:0와 혼합된 250 nM 농도의 LPA 18:1에 세포들을 노출시켰고, 생성된 Ca²⁺응답의 피크 면적을 측정하였다(30a). 또한, 500 nM 농도의 DGPP 8:0과 혼합된 증가 농도의 LPA 18:1에 세포들을 노출시켰다(30b). 500 nM 농도의 지시된 지질과 혼합된 250 nM 농도의 LPA 18:1에 Edg-7 세포들을 노출시켰다(30c). Ca²⁺응답의 피크 면적은 최소 세 번의 측정값의 평균 ±S.D.로 나타낸다.

도 31a 내지 31c는 Edg-2를 발현시키는 RH7777 세포들(Edg-2 세포들)에 있어서 DGPP 8:0에 의한 LPA 응답의 저해의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. 증가 농도의 DGPP 8:0와 혼합된 250 nM 농도의 LPA 18:1에 안정한 Edg-2 세포들을 노출시켰고, Ca²⁺응답의 피크 면적을 측정하였다(31a). 10 μM 농도의 DGPP 8:0과 혼합된 증가 농도의 LPA 18:1에 Edg-2 세포들을 노출시켰다(31b). 10 μM 농도의 지시된 지질과 혼합된 250 nM 농도의 LPA 18:1에 Edg-2 세포들을 노출시켰다(31c). 응답은 최소 세 번의 측정값의 평균 ±S.D.로 나타낸다.

도 32a 및 32b는 Edg-4 발현 RH7777 세포들에서 DGPP에 대한 구조-활성 관계를 나타내는 그래프이다. 5 μM 농도의 지시된 지질과 혼합된 500 nM 농도의 LPA 18:1에 안정한 Edg-4 세포들을 노출시켰다(32a). 1 μM 농도의 지시된 지질과 혼합된 100 nM 농도의 LPA 18:1에 Edg-4 세포들을 일시적으로 발현시키는 세포들을 노출시켰다(32b). Ca²⁺응답의 피크 면적을 측정하였고, 최소 세 번의 측정값의 평균 ±S.D.로 나타낸다.

도 33a 내지 33c는제노푸스난모세포에서 LPA-유발 Cl^-1전류에서의 DGPP 8:0의 약리학적 특성을 설명하는 그래프이다. 증가 농도의 DGPP 8:0와 혼합된 5 nM 농도의 LPA 18:1에 난모세포들을 노출시켰고, 생성된 진동 Cl^-1전류의 피크 크기를 측정하였다(33a). 200 nM 농도의 DGPP 8:0과 혼합된 증가 농도의 LPA 18:1에 난모세포들을 노출시켰다(33b). 데이터 포인트들은 최소 세 번의 측정값의 평균 ±S.D.를 나타낸다. 지시된 바와 같이, 5 nM LPA 18:1, 또는 5 nM LPA 18:1 및 1 μM DGPP 8:0의 혼합물로 난모세포들을 처리하였다. 1 μM DGPP 8:0의 세포내 주사를 화살표로 나타낸다.

도 34a 내지 34d는 NIH3T3 섬유아세포 및 HEY 난소 암세포에 있어서 LPA-유발 Ca²⁺응답을 저해하는 DGPP 8:0을 나타내는 그래프이다. Edg 및 PSP24 수용체 전사체에 대한 NIH3T3의 RT-PCR 분석(34a). 10 μM 농도의 DGPP 8:0과 혼합된, 100 nM 농도의 LPA 18:1, 또는 S1P에 NIH3T3을 노출시켰다(34b). Edg 및 PSP24 전사체의 존재에 대한 HEY 세포들의 RT-PCR 분석(34c). 1 μM 농도의 DGPP 8:0과 혼합된, 100 nM 농도의 LPA 18:1, 또는 S1P에 HEY 세포들을 노출시켰다(34d). 생성된 Ca²⁺응답의 피크 면적을 측정하였고, 최소 세 번의 측정값의 평균 ±S.D.로 나타낸다.

도 35는 NIH3T3 세포들의 LPA-유발 증식의 DGPP 8:0 저해를 나타내는 그래프이다. NIH3T3 세포들을 6 시간 동안 혈청 결핍된 상태(serum-starvation)에서 배양하고, 10 μM 농도의 지시된 지질과 혼합된 5 μM 농도의 LPA 18:1에 노출시켰다. LPA 18:1 대신에 용매(BSA)에 대조군 세포들을 위치시켰다. 상기 세포들을 24 시간 동안 지질로 항온처리하고 계수하였다. 데이터는 세 번의 실험으로 나타낸다.

도 36은제노푸스난모세포에서의 직쇄 지방산 포스페이트 화합물106-110에 의한 LPA 응답의 저해의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다.

도 37은제노푸스난모세포에서의 직쇄 지방산 포스페이트 화합물108에 의한 LPA 응답의 저해의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다.

도 38은 Edg-2, Edg-4 또는 Edg-7 수용체를 각각 발현시키는 RH7777 세포들을 직쇄 지방산 포스페이트 화합물108에 노출 시킨 후의, 상기 세포들의 안타고니스트 또는 아고니트스 유도 응답의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. Ca²⁺응답의 피크 면적을 측정하였다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 한 실시 양태는 하기 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다:

(I)

상기 식에서,

X¹, X²및 X³중 하나 이상은 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-이고, X¹및 X²가 -O-PO(OH)-O-로 함께 연결되거나, X¹및 X³이 -O-PO(OH)-NH-로 함께 연결되며;

X¹, X²및 X³중 하나 이상은 R¹-Y¹-A-이고, X¹, X²및 X³중의 둘이 R¹-Y¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X²및 X³이 -N(H)-C(O)-N(R¹)-로 함께 연결되고;

임의로, X¹, X²및 X³중 하나는 H 이며;

A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이고;

Y¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR²-이며;

Z¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;

Z²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며;

Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR⁴, =O, 또는 H 및 -NR⁵R⁶의 조합이고;

X¹, X²또는 X³각각에 있어서의 R¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이며;

R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷및 R⁸은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.

전술한 R 기(예, R¹-R⁸) 각각에 있어서, 직쇄 알킬은 화학식 -(CH₂) _x CH₃(여기에서,x는 0 내지 29임)을 갖는 것이고; 분지쇄 알킬은 상기 직쇄 알킬에 대하여 정의된 바와 같은 화학식을 갖는 것이나, 단, 하나 이상의 CH₂기는 CHW 기(여기에서, W는 알킬 측쇄임)로 대체된 것이며; 직쇄 알케닐은 화학식 -(CH₂) _xa CH=CH(CH₂) _xb CH₃(여기에서,xa및xb각각은 0 내지 27이고, (xa+xb)는 27 이하임)을 갖는 것이고; 분지쇄 알케닐은 상기 직쇄 알케닐에 대하여 정의된 바와 같은 화학식을 갖는 것이나, 단, 하나 이상의 CH₂기가 CHW 기(여기에서, W는 알킬 측쇄임)로 대체된 것이거나, 하나의 CH 기가 CW 기(여기에서, W는 알킬 측쇄임)로 대체된 것이다.

방향족 또는 헤테로방향족 고리로는 페닐, 인덴, 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피롤리딘, 피페리딘, 티오펜, 퓨란, 나프탈, 바이-페닐 및 인돌 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방향족 또는 헤테로방향족 고리는 그 고리가 R¹-Y¹-A 쇄의 Y¹기에 결합하는 경우에 비례하여 그 고리 상의오르토,메타또는파라위치에 위치한 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체를 포함할 수 있다. 상기 고리 상의 치환체들로는 알킬, 알콕시, 아민(예, 2차 또는 3차 아민), 알킬아민, 아미드, 알킬아미드, 산, 알콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아실기는 전술한 바와 같은 알킬, 알케닐, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함할 수 있다.

아릴알킬 및 아릴옥시알킬기로는 전술한 바와 같은 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬기(이 알킬기는 R¹-Y¹-A 쇄의 Y¹기에 결합됨)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

하기와 같은 이미 공지된 내인성 화합물 또는 합성 화합물은 화학식(I)의 화합물의 전술한 정의에서 특히 배제된다: 리소포스파티드산, 포스파티드산, 사이클릭 포스파티드산, 알케닐 글리세롤포스페이트, 디옥틸 글리세롤 피로포스페이트 또는 N-팔미토일-L-세린.

화합식(I) 화합물의 예로는 하기 화학식(II)-(V)의 서브클래스 화합물이 있다.

화학식(II)A 및 (II)B의 구조에 있어서, Q¹및 Q²는 모두 H₂이고; X¹, X²및 X³중 하나는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-(여기에서, Z¹및 Z²는 O임)이며; X¹, X²및 X³중 둘은 R¹-Y¹-A(여기에서, 각각에 대하여 Y¹은 O이고, A는 직접 결합임)이다. 각각의R¹은 화학식(I)에 대하여 전술한 바와 같이 독립적으로 정의된다.

(II)A

(II)B

화학식(III)의 구조에 있어서, Q¹은 H₂이고; Q²는 O이며; X¹은 (HO)₂PO-Z¹-(여기에서, Z¹은 O임)이고; X²및 X³은 R¹-Y¹-A(여기에서, 각각에 대하여 Y¹은 -NH-이고, A는 직접 결합임)이다. 각각의 R¹은 화학식(I)에 대하여 전술한 바와 같이 독립적으로 정의된다. 화학식(III)의 범위 내에 있는 바람직은 화합물은 X³이 NH₂이고, X²가 -NHR¹(여기에서, R¹은 C14 내지 C18 알킬이거나, 더욱 바람직하게는 C14 알킬또는 C18 알킬임)인 것이거나; 또는 X³이 -NHR¹(여기에서 R¹은 아세틸기임)이고, X²가 -NHR¹(여기에서, R¹은 C14 알킬임)인 것이다.

(III)

화학식(IV)의 구조에 있어서, Q¹은 =NR⁴이고; Q²는 H₂이며; X¹및 X²는 -O-PO(OH)-O-로 함께 연결되고; X³은 R¹-Y¹-A-(여기에서, A는 직접 결합이며, Y¹은 -NH-임)이다. R¹및 R⁴는 화학식(I)에 대하여 전술한 바와 같이 정의된다.

(IV)

화학식(V)A 및 (V)B의 구조에 있어서, Q¹및 Q²는 모두 H₂이고; X¹, X²및 X³중 둘은 (HO)₂PO-Z¹-(여기에서, 각각에 대하여 Z¹은 O임)이며; X¹, X²및 X³중 하나는 R¹-Y¹-A(여기에서, A는 직접 결합이고, Y¹은 -O-임)이다. R¹은 화학식(I)에 대하여 전술한 바와 같이 정의된다. 화학식(V)A 및 (V)B의 범위 내에 있는 바람직은 화합물은 R¹이 C21 알킬을 포함하는 아실인 화합물이거나, R¹이 C18 알킬인 화합물이다.

(V)A

(V)B

화합식(I)의 화합물 및 그 하위 부류의 화학식(II)A, (II)B, (III), (IV), (V)A 및 (V)B의 화합물은 하기 합성 개요를 이용하여 제조할 수 있다.

세린 아미드(SA) 및 세린 아미드 포스페이트(SAP) 시리즈(화학식(III))를 합성하기 위하여, 우선 전구체t-Boc 보호된 β-락톤(25)을 합성하였다. 시판t-Boc-L-세린(도 2,24)을 출발 물질로 하여, 미추노보(Mitsunobo) 조건 하에서 트리페닐 포스핀(PPh₃) 및 디에틸아지도디카복실레이트(DEAD)를 도입하여, 약 50 %의 수율로 화합물25를 수득하였다(Sun 등, 1996). 다양한 1차 아민을 사용하여 매우 불안정한 β-락톤25를 개방시켜 하이드록시 아민26-36을 얻으려는 Sun 등이 개발한 방법을 이용한 시도들은, 다양한 시약들(트리에틸 아민 등)의 사용에도 불구하고, 실패하였다. 그 대신에, THF 중의 β-락톤으로 1차 아민을 환류시킴으로써,t-Boc 보호된 하이드록시 아미드26-34를 수득하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 화합물26-34를 정제하였다.t-Boc 보호기의 트리플루오로아세트산 (TFA)-매개 제거는 TFA 염으로서 화합물35-43을 제공하였다.

화합물55-59의 합성을 위하여,t-Boc 보호된 하이드록시 아미드26-30을 포스포릴화시켰다. 최종 화합물의 주의 깊은 연구는 최종 화합물이 매우 소수성인 영역과 매우 친수성인 영역을 포함할 것임을 암시하였다. 상기 두 영역 모두는 추출 과정 중에 문제를 야기하고/하거나 정제 단계 중에 컬럼에 부착될 수 있다. 이러한 잠재적인 문제들을 회피하기 위하여, 포스포아미데이트 화학을 이용하였다. 포스포아미데이트 화학을 이용함에 의해서, 포스페이트 하이드록실기를 보호하여 완전하게 소수성인 분자를 제공함으로써 좀 더 용이하게 정제할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다.

본질적으로, 과정들을 조합하여 이용함으로써 소정 생성물(55-59)을 수득하였다(Lynch 등, 1997; Bittman 등, 1996; Liu 등, 1999). 출발 하이드록시아미드(26-30)를 무수 피리딘으로 반복하여 세척하고, 고진공 중에서 48시간 동안 건조시켰다. 피리딘-세척된 하이드록시아미드를 아르곤 대기 하에서 유지시켰다. 그 다음, 1H-테트라졸 및 새로 증류한 THF/CH₂Cl₂1:1 혼합물을 첨가하였다. 포스포릴화제인 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트를 첨가하였다. TLC에 의하여 상기 반응을 모니터링한 후, 과아세트산으로 상기 포스포네이트를 계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 컬럼 크로마토그래피를 통하여 상기 반응 혼합물을 정제하여 벤질-보호된 포스페이트로서 화합물50-54를 제공하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 화합물50-54를 접촉 환원시킴으로써 에탄올 내에서 상기 보호 벤질기의 제거 과정을 수행하여 화합물55-59를 수득하였다(도 3).56을 아세트산 무수물과 반응시켜 화합물56a를 제공하였다(도 3).

일단 SAP 시리즈(화합물 55-59)의 합성에 대한 포스포릴화 기술이 밝혀졌을 때, 유사한 과정을 이용하여 비스포스페이트(화학식(V)A 및 (V)B)를 합성하였다(도 4, 5a 및 5b). 시판 디올60-62를 무수 피리딘으로 세척하고, 고진공 하에서 48 시간 동안 건조시켰다. 이들 건조 디올(60-62)을 새로 증류한 1:1 THF/CH₂Cl₂에 용해시킨 후, 1H-테트라졸을 첨가하였다. 이 교반 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트를 첨가하였다. TLC를 통하여 상기 반응 혼합물을 모니터하고, 적절한 시간에 과아세트산으로 상기 포스포네이트를 계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 상기 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 벤질-보호된 비스포스페이트로서 화합물63-65를 제공하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 화합물63-65를 접촉 환원시킴으로써 에탄올 내에서 상기 보호 벤질기의 제거 과정을 수행하여 비스포스페이트로서 화합물66-68을 수득하였다.66-68의 합성에 대한 전술한 과정과 유사한 과정으로 화합물85-92를 수득하였다.

화합물85-92는 1,2-바이포스페이트이지만, 도 5b는 1,3-바이포스페이트의 합성을 도시한다. 시판 2-페톡시-1,3-프로판-디올을 출발 물질로 사용하였다. 우선, 상기 출발물질을 메틸 요오다이드의 존재하에서t-BuOK로 보호한 후, 접촉 수소화를 수행함으로써, 추후 할라이드(RX, 여기에서 R은 R¹에 대하여 전술한 바와 같이 정의됨)와 반응하는 중간체를 수득하였다. 상기 수득된 중간체는 이어서 에틸-SH의 존재하에 AlCl₃으로 처리하여, 주쇄의 C2에 결합된 RO 기를 갖는 1,3 디올을 수득하였다. 상기 회수된 1,3 디올을 새로 증류한 1:1 THF/CH₂Cl₂에 용해시킨 후, 1H-테트라졸을 첨가하였다. 이 교반 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트를 첨가하였다. TLC를 통하여 상기 반응 혼합물을 모니터하고, 적절한 시간에 과아세트산으로 상기 포스포네이트를 계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 상기 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 벤질-보호된 비스포스페이트 화합물을 수득하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 상기 화합물을 접촉 환원시킴으로써 에탄올 내에서 상기 보호 벤질기의 제거 과정을 수행하여 1,3-비스포스페이트 화합물을 수득하였다.

화학식(II)A 및 (II)B의 피로포스페이트를 합성하기 위하여, 출발물질로서글리시달 토실레이트((2R)(-) 또는 (2R)(+))를 사용하였다(도 6a 및 6b). 알콜의 존재하에 BF₃과 같은 루이스산으로 상기 고리의 개방을 촉매화하여, C1 위치에 토실레이트-보호된 중간체를 제공하였다. 다음 단계에서, 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘을 사용하여 상기 알콜의 C2 위치를 R 기(예, 전술한 바와 같은 R¹)로 치환함으로써 디-에테르 중간체를 수득하였다. 트리스(테트라-n-부틸암모늄) 하이드로젼 피로포스페이트로 상기 디-에테르 중간체를 처리함으로써 상기 토실레이트의 친핵성 공격을 야기시켜 상기 토실레이트를 C1 위치에서 피로포스페이트 치환체로 치환시켰다.

화학식(II)B의 피로포스페이트를 제조하기 위하여, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘 및 트리플릭 무수물의 존재하에서 상기 토실레이트 보호된 중간체를 벤질 알콜로 처리하여, 중간체를 C2 위치에서 벤질화시킨다. 우선, 18-크라운-6의 존재 하에 포타슘 수퍼옥사이드를 작용시켜 상기 벤질레이트 중간체 상의 토실레이트 보호기를 제거함으로써 C1 위치에 하이드록실기를 제공하였고, 이를 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘을 사용하여 R 기(예, 전술한 바와 같은 R¹)로 치환시켰다. 생성된 디-에테르 중간체는 여전히 C2 위치에 벤질 보호기를 가지고 있었다. 수소화에 의하여 상기 벤질 보호기를 제거하고, 이어서 피리딘 및p-톨루엔설포닐 클로라이드를 작용시켜 하이드록실기를 토실레이트화함으로써 C2 위치에 토실기를 보유한 디-에테르를 생성시켰다. 트리스(테트라-n-부틸암모늄) 하이드로젼 피로포스페이트로 처리하여 친핵성 공격을 수행시킴에 의하여 상기 토실레이트기를 제거하고, C2 위치에서 피로포스페이트 치환체로 치환시켰다.

포스페이트 및 바이포스페이트( 및 피로포스페이트, 포스포네이트, 등)를 제조하기 위한 대안적 개요는 도 15 및 16에 도시한다.

도 15에 있어서, 알콜(ROH)과 함께 출발물질로 글리시달 브로마이드를 사용하였다. 반응 조건으로서는 K₂CO₃로 처리한 후, 암모늄 염 C₆H₆CH₂N⁺(C₂H₅)₃Cl^-로 처리함으로써, 상기 브로마이드를 R 기로 치환시켰다. 그 다음, 알콜(R¹OH) 및 에테르 중의 1M HCl로 처리한 후, 상기 글리시달 중간체의 고리를 개방시켜, C2 위치에 하이드록시 기를 갖는 디-에테르 중간체를 제공하였다. 상기 디-에테르를 1H-테트라졸과 혼합하고, 이 교반 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트를 첨가하였다. TLC를 통하여 상기 반응 혼합물을 모니터하고, 적절한 시간에 과아세트산으로 상기 포스포네이트를 계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 상기 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 벤질-보호된 포스페이트를 제공하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 상기 벤질-보호된 포스페이트를 접촉 환원시킴으로써 에탄올 내에서 상기 보호 벤질기의 제거 과정을 수행하여 모노포스페이트 화합물을 수득하였다.

도 16에 있어서, 유사한 반응 개요를 이용하였다. 단, 글리시달 브로마이드를 알콜(ROH)과 반응시키는 대신에, BnOH를 사용하여 C3 부위를 보호하였다. 반응 조건으로서는 K₂CO₃로 처리한 후, 암모늄 염 C₆H₆CH₂N⁺(C₂H₅)₃Cl^-로 처리함으로써, 상기 브로마이드를 Bn 기로 치환시켰다. 그 다음, 무수 BnOH 및 에테르 중의 1M HCl로 처리한 후, 상기 글리시달 중간체의 고리를 개방시켜, C1 위치를 보호하였다. 생성된 디-에테르 중간체는 C2 위치에 하이드록시기를 갖는다. 상기 디-에테르를 수성 K₂CO₃중의 할라이드 염(RX)과 혼합하여, C2 위치에 에테르 결합을 통하여 부착된 R 기를 갖는 보호된 중간체를 수득하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 접촉 환원시킴으로써 상기 중간체를 탈보호시켜 1,3 디올을 수득하였다. 상기 디올을 1H-테트라졸과 배합한 후, 이 교반 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트를 첨가하였다. TLC를 통하여 상기 반응 혼합물을 모니터하고, 적절한 시간에 과아세트산으로 상기 포스포네이트를 계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 상기 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 벤질-보호된 포스페이트 화합물을 수득하였다. 60 psi에서 H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 상기 벤질-보호된 포스페이트를 접촉 환원시킴으로써 에탄올 내에서 상기 보호 벤질기의 제거 과정을 수행하여 1,3-비스포스페이트 화합물을 수득하였다.

도 6a에 나타낸 바와 같이 제조한 디-에테르 중간체(예, R 및 R¹치환체 포함)를 사용하여, 토실기의 제거시 C1 부위에 다수의 개질 포스페이트 및 포스포네이트를 부착시킬 수 있다. 도 7a에 도시한 바와 같이, 염기 조건하에서 중간체를 X⁴-Z¹-PO(O-보호기)₂(여기에서, Z¹은 -(R³)CH-이고, X⁴는 H임)와 반응시킨다. 상기염기 조건은 토실레이트 보호기를 제거하여, 개질된 포스페이트-Z¹-PO(O-보호기)₂가 C1 부위에 단일 결합을 형성하도록 한다. TMSBr로 처리한 후, 상기 보호기를 제거함으로써 C1 부위에 -(R³)CH-PO(OH)₂기를 제공한다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, X⁴-Z¹-PO(OH)-Z²-PO(OH)₂(여기에서, Z¹은 -O-이고, Z²는 -CH₂-이며, X⁴는 H임)를 갖는 트리스(테트라-n-부틸암모늄)과 상기 중간체를 염기 조건 하에서 반응시킨다. 상기 염기 조건은 토실레이트 보호기를 제거하여, 개질된 포스포네이트 -Z¹-PO(OH)-Z²-PO(OH)₂가 C1 부위에 단일 결합을 형성하도록 한다. 산성 조건 및 CH₃CN으로의 처리에 의해서, -O-PO(OH)-CH₂-PO(OH)₂기가 C1 부위에 부착된다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, 상기 중간체를 X⁴-Z¹-PO(O-보호기)₂(여기에서, Z¹은 -OCH₂CH₂-이고, X⁴는 H임)와 염기 조건 하에서 반응시킨다. 상기 염기 조건은 토실레이트 보호기를 제거하여, 개질된 포스페이트 -Z¹-PO(O-보호기)₂가 C1 부위에 단일 결합을 형성하도록 한다. 콜리딘 중의 TMSBr 및 물 세척액으로 처리한 후, 상기 보호기를 제거함으로써 C1 부위에 -OCH₂CH₂-PO(OH)₂기를 제공하였다.

화학식(III)의 배좌 제한된 사이클릭-포스페이트 화합물을 제조하기 위하여, 도 11에 도시된 합성 개요에서 출발물질로 화합물26-30을 사용하였다. 화합물26-30을 1H-테트라졸과 반응시키고, 그 생성물을 디-tert-부틸 디이소프로필포스포아미데이트로 처리하여 분자내 고리화 반응을 유발시켰다. 계내에서 상기 포스포네이트를 과아세트산으로 산화시켜 사이클릭 포스페이트 중간체를 수득하였다. TFA로 환원시켜 화학식(III)의 화합물을 수득하였다.

기타 배좌 제한된 화합물도 제조할 수 있다.

도 12에 도시한 바와 같이, X¹과 X²가 함께 -O-PO(OH)-O-인 사이클릭 포스페이트를 제조하기 위한 대안적 개요를 나타낸다. 벤질-보호된 1,3 디올 중간체를 POCl₃과 반응시켜 분자내 고리화 반응을 초래한다. (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 C2 탄소에 결합된 하이드록실기를 포함하는 사이클릭 포스페이트를 제공한다. 그 다음, 상기 사이클릭 중간체를 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘으로 처리하여 최종 화합물을 수득한다.

도 13에 도시한 바와 같이, X¹과 X³이 함께 -O-PO(OH)-NH-인 사이클릭 포스페이트를 제조하기 위한 개요를 나타낸다. 출발물질로서 전술한 바와 같이 제조한 중간체35-43을 사용하여, 그들을 트리스(1,2,4-트리아졸)포스페이트로 처리한 후, 2 % HCl 세척액으로 처리하여 분자내 고리화 반응을 초래한다.

도 14에 도시한 바와 같이, 포스페이트기가 고리의 일부가 아닌, 구체적으로, X²와 X³이 함께 -N(H)-C(O)-N(R¹)-인 사이클릭 화합물을 제조하기 위한 개요를나타낸다. 출발물질로서 전술한 바와 같이 제조한 중간체50-54를 사용하고, 그들을 무수 COCl₂로 처리하여, 고리화 반응 중에 C2 및 C3 탄소에 결합된 아민들 사이에 카보닐을 삽입시킨다. (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 상기 포스페이트로부터 벤질 보호기를 제거한다.

LPA 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트로서 사용할 수 있는 기타 화합물 부류는 지방산 포스페이트 또는 직쇄 포스페이트이다. 도 8에 도시한 바와 같이, 무수 n-알칸올 및 1H-테트라졸을 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시킬 수 있다. 무수 메틸렌 클로라이드 중의 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포아미다이트의 용액을 첨가할 수 있다. 이어서, 무수 메틸렌 클로라이드 중의 과아세트산을 적가하여 벤질-보호된 지방산 포스페이트101-105를 얻을 수 있다. (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 무수 메탄올 중에서 처리한 후, 상기 벤질-보호기를 제거하여 지방산 포스페이트106-110을 제공한다.

지방산 포스페이트를 제조하기 위한 대안적 방법으로서, 티오포스페이트 및 아미도포스페이트를 또한 제조할 수 있다. 도 9에 도시한 바와 같이, 예를 들어, n-머캅토알칸 및 1H-테트라졸을 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시킬 수 있다. 무수 메틸렌 클로라이드 중의 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포아미다이트의 용액을 첨가할 수 있다. 이어서, 무수 메틸렌 클로라이드 중의 과아세트산을 적가하여 벤질-보호된 지방산 티오포스페이트를 얻을 수 있다. (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 무수 메탄올 중에서 처리한 후, 상기 벤질-보호기를 제거하여 지방산 티오포스페이트를 제공한다. 도 10에 도시한 바와 같이, 예를 들어, n-알킬아민 및 1H-테트라졸을 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시킬 수 있다. 무수 메틸렌 클로라이드 중의 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포아미다이트의 용액을 첨가할 수 있다. 이어서, 무수 메틸렌 클로라이드 중의 과아세트산을 적가하여 벤질-보호된 지방산 아미도포스페이트를 얻을 수 있다. (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 무수 메탄올 중에서 처리한 후, 상기 벤질-보호기를 제거하여 지방산 아미도포스페이트를 제공한다.

도 17 내지 20에 도시한 바와 같이 1차 아민기를 공격함에 의해서 전술한 반응 개요 각각을 추가로 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 화합물50-54로부터 중간체를 제조하는데, 화합물50-54를 TFA로 처리함으로써 t-Boc 보호기를 제거하여, 보호된 포스페이트를 이탈시키면서 C2 부위에 1차 아민을 제공한다.

도 17에 있어서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 산 할라이드(예, R¹COCl)로 공격하여, 상기 1차 아민을 아미드(-N(H)-C(O)-R¹)로 전환시킨다. 그 다음, (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 벤질-보호된 포스페이트를 탈보호시킬 수 있다.

도 18에 있어서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 POCl₃중의 N-아세틸 이미다졸린으로 공격하여, 상기 1차 아민을 2차 아민(-N(H)-이미다졸)으로 전환시킨다. 치환된 이미다졸린을 사용할 수도 있다. 그 다음, (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 벤질-보호된 포스페이트를 탈보호시킬 수 있다.

도 19에 있어서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 R¹OC(O)Cl로 공격하여, 상기 1차 아민을 카바메이트(-N(H)-C(O)-O-R¹)로 전환시킨다. 그 다음, (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 벤질-보호된 포스페이트를 탈보호시킬 수 있다.

도 20에 있어서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 R¹NCO 또는 R¹NCS로 공격하여, 상기 1차 아민을 우라미드(-N(H)-C(O)-N(H)-R¹) 또는 티오우라미드(-N(H)-C(S)-N(H)-R¹)로 전환시킨다. 그 다음, (전술한 바와 같이) H₂대기 하에서 활성탄 상의 10 % 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 벤질-보호된 포스페이트를 탈보호시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 비-사이클릭 화합물은 (Y²O)₂PO-Z¹¹-Z¹³또는 (Y²O)₂PO-Z¹²-P(OH)O-Z¹¹-Z¹³[여기에서, Z¹¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H- 또는 -O- 이고; Z¹²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며; Z¹³은 H 또는 제1 이탈기이거나, -Z¹¹-Z¹³이 함께제1 이탈기를 형성하고; Y²는 H 또는 보호기임]을 화학식(VI)의 중간체 화합물과 반응시키고, 경우에 따라, 탈보호함으로써 제조할 수 있는데, 여기에서, 상기 반응 단계 및 탈보호 단계는 X¹, X²및 X³중 하나 또는 둘이 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-(여기에서, Z¹및 Z²는 전술한 바와 같이 정의됨)인 화학식(I)의 화합물을 제공하기에 효과적인 조건 하에서 수행한다.

화학식(VI)의 중간체 화합물은 다음과 같은 구조를 갖는다.

(VI)

상기 식에서,

X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 R¹¹-Y¹¹-A-이고, X¹¹, X¹²및 X¹³중의 둘이 R¹¹-Y¹¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X¹²및 X¹³이 -N(H)-C(O)-N(R¹¹)-로 함께 연결되고;

X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 OH, NH₂, SH 또는 제2 이탈기이며;

임의로, X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나는 H 이고;

A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이며;

Y¹¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR¹²-이고;

Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR¹³, =O, 또는 H 및 -NR¹⁴R¹⁵의 조합이며;

X¹¹, X¹²또는 X¹³각각에 있어서의 R¹¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이고;

R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.

본 발명의 LPA 수용체 아고니스트와 안타고니스트를 제조하면, 그러한 화합물들은 후술하는 환자들의 치료에 적합한 약학 조성물의 제조에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 약학적 허용 담체와 본 발명 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이 약학 조성물은 또한 적절한 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼과 같은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 일반적으로, 이 조성물은 약 0.01 내지 99%, 바람직하게는 약 20 내지 75%의 활성 화합물과 함께 담체, 부형제, 안정화제 등을 포함할 것이다.

고체 단위 투여 형태는 통상적인 형태일 수 있다. 고체 형태는 본 발명의 화합물과 담체, 예를 들어 윤활제 및 락토스, 슈크로스, 또는 옥수수 전분과 같은 불활성 충전제를 함유하는 통상의 젤라틴 타입과 같은 캡슐일 수 있다. 다른 구체예에서, 이들 화합물들은, 아카시아, 옥수수전분, 또는 젤라틴과 같은 결합제, 옥수수전분, 감자 전분, 또는 알긴산과 같은 붕해제, 및 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 함께 락토스, 슈크로스, 또는 옥수수전분과 같은 통상의 정제 기제를 이용하여 정제화된다.

본 발명 화합물은 또한 약학적 담체와 함께 생리학적 허용 부형제 중의 이들 물질의 용액 또는 현탁액에 의해 주사형 또는 국소-적용형 투여형태로 투여될 수 있다. 그러한 담체는 계면 활성제를 첨가하거나 첨가하지 않은 물과 오일같은 멸균액체 및 아쥬반트, 부형제 또는 안정화제를 포함한 약학적 및 생리학적 허용 담체를 포함한다. 오일의 예로는 페트롤륨유, 동물유, 식물유, 또는 합성유, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 또는 광유를 들 수 있다. 일반적으로, 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당용액, 및 글리콜(예, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜)이 바람직한 액체 담체이며, 특히 주사용 용액에 적합하다.

에어로졸로 사용하는 경우, 용액 또는 현탁액중의 본 발명 화합물은 적절한 추진제(예, 프로판, 부탄 또는 이소부탄과 같은 탄화수소 추진제)와 통상의 아쥬반트와 함께 가압된 에어로졸 용기내에 팩킹될 수 있다. 또한 본 발명의 물질은 분무기 또는 분사기와 같은 비가압 형태로 투여될 수 있다.

원하는 치료에 따라, 본 발명 화합물은 경구, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내 점적, 동내, 또는 방광내 점적, 안구내, 동맥내, 병변내, 또는 점막(예, 코 점막, 목 점막 및 기관지 관 점막)에의 도포로 투여될 수 있다.

본 발명 범위내의 조성물은 본 발명 화합물이 그 의도하는 목적을 이루는데 효과적인 양으로 함유된 모든 조성물을 포함한다. 각자의 필요에 따라, 각 성분의 유효량의 적정 범위의 결정은 당업계의 기술 범위내이다. 일반적인 투여량은 약 0.01∼약 100mg/kg체중을 포함한다. 바람직한 투여량은 약 0.1∼약 100mg/kg체중을 포함한다. 가장 바람직한 투여량은 약 1-약 100mg/kg체중을 포함한다. 본 발명 화합물의 투여를 위한 치료 섭생법은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 일부 화합물은 LPA 수용체의 아고니스트로 유용한 것으로 밝혀진한편, 본 발명의 다른 화합물은 LPA 수용체의 안타고니스트로 유용한 것으로 밝혀졌다. 그들의 활성 차이때문에, 다양한 화합물들이 다른 용도를 갖는다. 본 발명의 바람직한 동물 환자는 포유류, 즉, 포유류강에 속하는 개체이다. 본 발명은 특히 사람 환자의 치료에 유용하다.

본 발명의 한 가지 양상은 LPA 수용체 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로서, LPA 수용체 아고니스트 또는 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명 화합물을 제공하는 단계 및 LPA 수용체를 LPA 수용체 활성을 조절하기에 효과적인 조건하에서 본 발명 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

LPA 수용체는 정상적으로 LPA 수용체를 발현하거나 또는 특정 LPA 수용체를 발현하도록 형질전환된 세포상에 존재한다. 적절한 LPA 수용체는 제한없이 EDG-2, EDG-4, EDG-7, 및 PSP-24 수용체를 포함한다. 정상적으로 이들 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 조직은 상기 표 1에 나타난다. 세포를 본 발명의 LPA 수용체 아고니스트 또는 LPA 수용체 안타고니스트와 접촉시킬 때, 접촉은 세포가 생체외 또는 생체내에 있는 동안 수행될 수 있다.

정상적으로는 이들 수용체를 발현하지 않는 숙주 세포에서 이들 수용체를 이종성으로 발현시키기 위해, 그러한 수용체 하나 이상을 암호하는 핵산 분자를, 적절한 전사 및 번역 조절 영역(즉, 프로모터 및 전사 종결 시그날)을 포함하는 발현 벡터내로 센스 방향으로 삽입하고, 이어서 숙주 세포를 이 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 발현 벡터는 세포 게놈내로 통합될 수도 있고, 또는 염색체외 핵 물질로 존재할 수도 있다. 발현은 구성형이거나 유도성일 수 있으며, 구성형 발현이 대부분의 목적에 부합된다.

EDG-2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 공지이며 An et al.(1997b)에서 보고되었으며, Genbank 기탁 번호 제U80811호이며, 본원에 참고로 통합된다. EDG-2 암호 핵산 분자는 하기하는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

atggctgcca tctctacttc catccctgta atttcacagc cccagttcac agccatgaat 60

gaaccacagt gcttctacaa cgagtccatt gccttctttt ataaccgaag tggaaagcat 120

cttgccacag aatggaacac agtcagcaag ctggtgatgg gacttggaat cactgtttgt 180

atcttcatca tgttggccaa cctattggtc atggtggcaa tctatgtcaa ccgccgcttc 240

cattttccta tttattacct aatggctaat ctggctgctg cagacttctt tgctgggttg 300

gcctacttct atctcatgtt caacacagga cccaatactc ggagactgac tgttagcaca 360

tggctcctgc gtcagggcct cattgacacc agcctgacgg catctgtggc caacttactg 420

gctattgcaa tcgagaggca cattacggtt ttccgcatgc agctccacac acggatgagc 480

aaccggoggg tagtggtggt cattgtggtc atctggacta tggccatcgt tatgggtgct 540

atacccagtg tgggctggaa ctgtatctgt gatattgaaa attgttccaa catggcaccc 600

ctctacagtg actcttactt agtcttctgg gccattttca acttggtgac ctttgtggta 660

atggtggttc tctatgctca catctttggc tatgttcgcc agaggactat gagaatgtct 720

cggcatagtt ctggaccccg gcggaatcgg gataccatga tgagtcttct gaagactgtg 780

gtcattgtgc ttggggcctt tatcatctgc tggactcctg gattggtttt gttacttcta 840

gacgtgtgct gtccacagtg cgacgtgctg gcctgtgaga aattcttcct tctccttgct 900

gaattcaact ctgccatgaa ccccatcatt tactcctacc gcgacaaaga aatgagcgcc 960

acctttaggc agatcctctg ctgccagcgc agtgagaacc ccaccggccc cacagaaagc 1020

tcagaccgct cggcttcctc cctcaaccac accatcttgg ctggagttca cagcaatgac 1080

cactctgtgg tttag 1095

암호된 EDG-2 수용체는 하기하는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는다:

MAAISTSIPV ISQPQFTAMN EPQCFYNESI AFFYNRSGKH LATEWNTVSK LVMGLGITVC 60

IFIMLANLLV MVAIYVNRRF HEPIYYLMAN LAAADFFAGL AYFYLMFNTG PNTRRLTVSY 120

WLLRQGLIDT SLTASVANLL AIAIERHITV FRMQLHTRMS NRRVVVVIVV IWTMAIVMGA 180

IPSVGWNCIC DIENCSNMAP LYSDSYLVFW AIFNLVTFVV MVVLYAHIFG YVRQRTMRMS 240

RHSSGPRRNR DTMMSLLKTV VIVLGAFIIC WTPGLVLLLL DVCCPQCDVL AYEKFFLLLA 300

EFNSAMNPII YSYRDKEMSA TERQILCCQR SENPTGPTES SDRSASSLNH TILAGVHSND 360

HSVV 364

EDG-4를 위한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지이며 An et al.(1998b)에서 보고되었으며, Genbank 기탁 번호 제NM_004720호이며, 본원에 참고로 통합된다. EDG-4 암호 핵산 분자는 하기와 같은 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

atggtcatca tgggccagtg ctactacaac gagaccatcg gcttcttcta taacaacagt 60

ggcaaagagc tcagctccca ctggcggccc aaggatgtgg tcgtggtggc actggggctg 120

accgtcagcg tgctggtgct gctgaccaat ctgctggtca tagcagccat cgcctccaac 180

cgccgcttcc accagcccat ctactacctg ctcggcaatc tggccgcggc tgacctcttc 240

gcgggcgtgg cctacctctt cctcatgttc cacactggtc cccgcacagc ccgactttca 300

cttgagggct ggttcctgcg gcagggcttg ctggacacaa gcctcactgc gtcggtggcc 360

acactgctgg ccatcgccgt ggagcggcac cgcagtgtga tggccgtgca gctgcacage 420

cgcctgcccc gtggccgcgt ggtcatgctc attgtgggcg tgtgggtggc tgccctgggc 480

ctggggctgc tgcctgccca ctcctggcac tgcctctgtg ccctggaccg ctgctcacgc 540

atggcacccc tgctcagccg ctcctgtttg gccgtctggg ctctgtcgcg cctgcttgtc 600

ttcctgctca tggtggctgt gtacacccgc attttcttct acgtgcggcg gcgagtgcag 660

cgcatggcag agcatgtcag ctgccacccc cgctaccgag agaccacgct cagcctggtc 720

aagactgttg tcatcatcct gggggcgttc gtggtctgct ggacaccagg ccaggtggta 780

ctgctcctgg atggtttagg ctgtgagtcc tgcaatgtcc tggctgtaga aaagtacttc 840

ctactgttgg ccgaggccaa ctcactggtc aatgctgctg tgtactcttg ccgagatgct 900

gagatgcgcc gcaccttccg ccgcottctc tgctgcgcgt gcctccgcca gtccacccgc 960

gagtctgtcc actatacatc ctctgcccag ggaggtgcca gcactcgcat catgcttccc 1020

gagaacggcc acccactgat ggactccacc ctttag 1056

암호된 EDG-4 수용체는 하기하는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는다:

MVIMGQCYYN ETIGFFYNNS GKELSSHWRP KDVVVVALGL TVSVLVLLTN LLVIAAIASN 60

RRFHQPIYYL LGNLAAADLF AGVAYLFLMF HTGPRTARLS LEGWFLRQGL LDTSLTASVA 120

TLLATAVERH RSVMAVQLHS RLPRGRVVML IVGVWVAALG LGLLPAHSWH CLCALDRCSR 180

MAPLLSRSYL AVMALSSLLV FLLMVAVYTR IFFYVRRRVQ RMAEHVSCHP RYRETTLSLV 240

KTVVIIIGAF VVCWTQGQVV LLLDGLGCES CNVLAVEKYF LLLAEANSLV NAAVYSCRDA 300

EMRRTERRLL CCACLRQSTR ESVHYTSSAQ GGASTRIMLP ENGHPLMDST L 351

EDG-7을 위한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지이며 Bandoh et al.(1999)에서 보고되었으며, Genbank 기탁 번호 제NM_012152호이며, 본원에 참고로 통합된다. EDG-7 암호 핵산 분자는 하기와 같은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

atgaatgagt gtcactatag caagcacatg gacttttttt ataataggag caacactgat 60

actgtcgatg actggacagg aacaaagctt gtgattgttt tgtgtgttgg gacgtttttc 120

tgcctgttta tttttttttc taattctctg gtcatcgcgg cagtgatcaa aaacagaaaa 180

tttcatttcc ccttctacta cctgttggct aatttagctg ctgccgattt cttcgctgga 240

attgcctatg tattcctgat gtttaacaca ggcccagttt caaaaacttt gactgtcaac 300

cgctggtttc tccgtcaggg gcttctggac agtagcttga ctgcttccct caccaacttg 360

ctggttatcg ccgtggagag gcacatgtca atcatgagga tgcgggtcca tagcaacctg 420

accaaaaaga gggtgacact gctcgttttg cttgtctggg ccatcgccat ttttatgggg 480

gcggtcccca cactgggctg gaattgcctc tgcaacatct ctgcctgctc ttccctggcc 540

cccatttaca gcaggagtta ccttgttttc tggacagtgt ccaacctcat ggccttcctc 600

atcatggttg tggtgtacct gcggatctac gtgtacgtca agaggaaaac caacgtcttg 660

tctccgcata caagtgggtc catcagccgc cggaggacac ccatgaagct aatgaagacg 720

gtgatgactg tcttaggggc gtttgtggta tgctggaccc cgggcctggt ggttctgctc 780

ctcgacggcc tgaactgcag gcagtgtggc gtgcagcatg tgaaaaggtg gttcctgctg 840

ctggcgctgc tcaactccgt cgtgaacccc atcatctact cctacaagga cgaggacatg 900

tatggcacca tgaagaagat gatctgctgc ttctctcagg agaacccaga gaggcgtccc 960

tctcgcatcc cctccacagt cctcagcagg agtgacacag gcagccagta catagaggat 1020

agtattagcc aaggtgcagt ctgcaataaa agcacttcct aa 1062

암호된 EDG-7 수용체는 하기하는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는다:

MNECHYDKHM DFFYNRSNTD TVDDWTGTKL VIVLCVGTFF CLFIFFSNSL VIAAVIKNRK 60

FHFPFYYLLA NLAAADFFAG IAYVFLMFNT GPVSKTLTVN RWFLRQGLLD SSLTASLTNL 120

LVIAVERHMS IMRMRVHSNL TKKRVTLLIL LVWAIAIFMG AVPTLGWNCL CNISACSSLA 180

PIYSRSYLVF WTVSNLMAFL IMVVVYLRIY VYVKRKTNVL SPHTSGSISR RRTPMKlMKT 240

VMTVLGAFVV CWTPGLVVLL LDGLNCRQCG VQHVKRWFLL LALLNSVVNP IIYSYKDEDM 300

YGTMKKMICC FSQENPERRP SRIPSTVLSR SDTGSQYIED SISQGAVCNK STS 353

PSP-24를 위한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지이며 Kawasawa et al.(2000)에서 보고되었으며, Genbank 기탁 번호 제AB030566호이며, 본원에 참고로 통합된다. PSP-24 암호 핵산 분자는 하기와 같은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:

atggtcttct cggcagtgtt gactgcgttc cataccggga catccaacac aacatttgtc 60

gtgtatgaaa acacctacat gaatattaca ctccctccac cattccagca tcctgacctc 120

agtccattgc ttagatatag ttttgaaacc atggctccca ctggtttgag ttccttgacc 180

gtgaatagta cagctgtgcc cacaacacca gcagcattta agagcctaaa cttgcctctt 240

cagatcaccc tttctgctat aatgatattc attctgtttg tgtcttttct tgggaacttg 300

gttgtttgcc tcatggttta ccaaaaagct gccatgaggt ctgcaattaa catcctcctt 360

gccagcctag cttttgcaga catgttgctt gcagtgctga acatgccctt tgccctggta 420

actattctta ctacccgatg gatttttggg aaattcttct gtagggtatc tgctatgttt 480

ttctggttat ttgtgataga aggagtagcc atcctgctca tcattagcat agataggttc 540

cttattatag tccagaggca ggataagcta aacccatata gagctaaggt tctgattgca 600

gtttcttggg caacttcctt ttgtgtagct tttcctttag ccgtaggaaa ccccgacctg 660

cagatacctt cccgagctcc ccagtgtgtg tttgggtaca caaccaatcc aggctaccag 720

acttatgtga ttttgatttc tctcatttct ttcttcatac ccttcctggt aatactgtac 780

tcatttatgg gcatactcaa cacccttcgg cacaatgcct tgaggatcca tagctaccct 840

gaaggtatat gcctcagcca ggccagcaaa ctgggtctca tgagtctgca gagacctttc 900

cagatgagca ttgacatggg ctttaaaaca cgtgccttca ccactatttt gattctcttt 960

gctgtcttca ttgtctgctg ggccccattc accacttaca gccttgtggc aacattcagt 1020

aagcactttt actatcagca caactttttt gagattagca cctggctact gtggctctgc 1080

tacctcaagt ctgcattgaa tccgctgatc tactactgga ggattaagaa attccatgat 1140

gcttgcctgg acatgatgcc taagtccttc aagtttttgc cgcagctccc tggtcacaca 1200

aagcgacgga tacgtcctag tgctgtctat gtgtgtgggg aacatcggac ggtggtgtga 1260

암호된 PSP-24 수용체는 하기하는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는다:

MVFSAVLTAF HTGTSNTTFV VYENTYMNIT LPPPFQHPDL SPLLRYSFET MAPTGLSSLT 60

VNSTAVPTTP AAFKSLNLPL QITLSAIMIF ILFVSFLGNL VVCLMVYQKA AMRSAINILL 120

ASLAFADMLL AVLNMPFALV TILTTRWIFG KFFCRVSAMF FWLFVIEGVA ILLIISIDRF 180

LIIVQRQDKL NPYRAKVLIA VSWATSFCVA FPLAVGNPDL QIPSRAPQCV FGYTTNPGAQ 240

AYVILISLIS FFIPFLVILY SFMGILNTLR HNALRIHSYP EGICLSQASK LGLMSLQRPF 300

QMSIDMGFKT RAFTTILILF AVFIVCWAPF TTYSLVATFS KHFYYQHNFF EISTWLLWIC 360

YLKSALNPLI YYWRIKKFHD ACLDMMPKSF KFLPQLPGHT KRRIRPSAVY VCGEHRTVV 419

LPA 수용체 아고니스트는 LPA 수용체로부터 LPA-유사 활성을 유도할 것이며, 이는 화학적으로, 예를 들어 난모 세포에서의 Ca²⁺또는 Cl^-전류, 또는 세포 형태, 이동성, 증식 등의 변화 관찰에 의해 측정될 수 있다. 대조적으로, LPA 수용체 안타고니스트는 LPA 수용체로부터 LPA-유사 활성을 차단할 것이다. 이 또한 화학적으로 예를 들어 난모 세포에서의 Ca²⁺또는 Cl^-전류, 또는 세포 형태, 이동성, 증식 등의 변화 관찰에 의해 측정될 수 있다.

LPA 수용체 안타고니스트로 작용하는 본 발명 화합물에 의해, 본 발명은 또한 LPA 수용체에 대한 LPA 유도된 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명 화합물을 제공하고, LPA 수용체의 LPA-유도된 활성을 저해하기에 효과적인 조건하에서 이 화합물을 LPA 수용체와 접촉시키는 것을 포함한다. LPA 수용체는 상기에서 정의한 대로일 수 있다. LPA 수용체는 수용체를 정상적으로 발현하거나 수용체를 이종성으로 발현하는 세포상에존재한다. LPA 수용체를 본 발명 화합물과 접촉시키는 것은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.

전술한 대로, LPA는 전술한 LPA 수용체를 포함한 LPA 수용체를 통한 시그날링에 관련된 많은 다른 세포 경로에 관련된 시그날링 분자이다. 따라서, 본 발명 화합물은 LPA 수용체 안타고니스트 또는 LPA 수용체 아고니스트로 작용함으로써 세포 행동에 대한 LPA 의 효과를 조절할 것이다.

본 발명의 한 가지 양상은 암 치료 방법에 관한 것으로서, 본 발명 화합물을 제공하고 이 화합물의 유효량을 암 치료에 효과적인 방식으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명 화합물로 치료될 수 있는 암의 유형은 그 행동이 적어도 부분적으로 LPA-매개 활성에 기인하는 암 세포에 의해 특징지어지는 암을 포함한다. 일반적으로, 이러한 유형의 암은 LPA 수용체의 하나 이상의 유형을 발현하는 암세포에 의해 특징지어진다. 암의 예시적인 형태는 제한 없이 전립선 암과 난소 암을 포함한다.

암 치료에 특히 유용한 본 발명 화합물은 LPA 수용체 안타고니스트이다.

본 발명 화합물을 투여할 때, 이들은 전신성으로 투여될 수 있고, 또는 다르게는 암 세포가 존재하는 특정 부위에 직접 투여될 수 있다. 따라서, 투여는 화합물을 암세포에 전달하는 데 효과적인 임의 방식으로 이루어질 수 있다. 이론에 얽매임 없이, LPA 수용체 안타고니트스는 LPA 수용체에 결합시 암세포의 증식 또는 전이를 저해할 것이며, 그렇지 않으면 이들 암세포를 파괴할 것이다. 실시예 12에서 나타난 것처럼, 본 발명의 몇몇 LPA 안타고니스트 화합물들은 전술한 유형의 하나 이상의 LPA 수용체를 발현하는 전립선 암 세포주에 대해 세포독성이었다.

본 발명의 LPA 안타고니스트 화합물 또는 약학 조성물이 암 치료를 위해 투여될 때, 이 약학 조성물은 또한 다양한 유형의 암 치료를 위해 현재 알려지거나 이후에 개발될 치료제 또는 치료 섭생법을 포함하거나 병행하여 투여될 수 있다.

암 침입은 개별적인 세포 또는 세포 집단이 일차 종양으로부터 떨어지고 전신성 순환계 또는 림프계에 도달하여 다른 기관으로 번지는 복잡한 다단계 과정이다(Liotta et al.,1987). 이 과정동안, 종양 세포는 모세 혈관에서 멈추고, 혈관외 유출되고, 조직의 기질내로 이동하여 이차 병소를 만든다. 먼저, 종양 세포는 순환계로부터 그들을 정지시키는 내피 세포상의 시그날을 인식해야 한다. 두 번째, 종 양 세포는 세포 표면 라미닌 수용체를 통해 기저막 글리코단백질 라미닌에 부착해야 한다. 기저막에의 부착에 이어, 종양 세포는 프로테아제를 분비하여 기저막을 분해한다. 부착 및 국소적 단백질 분해에 이어, 침입의 세 번째 단계는 종양 세포 이동이다. 세포 이동성은 종양 세포 침입 및 전이에서 중심적인 역할을 한다. 동물 실험에서 생체외에서의 종양 세포의 이동성과 전이적 행동 사이의 관계는 강한 직접적 관련성을 나타낸다(Hoffman-Wellenhof et al.,1995). PLGFs가 증식을 촉진하고 생체외에서 암세포의 침입을 증가시킴은 잘 알려진 사실이다. Imamura와 그 동료들은 암 세포가 그들의 침입을 위해 혈청 인자를 필요로 함을 확립하였다(Imamura et al.,1991). 그리고 그 후 무혈청 시스템에서 종양 세포 침입을 완전히 회복할 수 있는 가장 중요한 혈청 성분으로 LPA를 확인하였다(Xu et al.,1995a;Imamura et al.,1993;Mukai et al.,1993).

PLGFR이 난소 암 세포주, 즉, OCC1과 HEY 세포에서 발현됨이 밝혀졌다. 구체적으로, RT-PCR 분석은 이들 세포주에서 EDG-2와 EDG-7 수용체의 존재를 보여준다. 최근에, Im et al.(2000)은 EDG-7이 전립선 암 세포주, 즉, PC-3와 LNCaP 세포에서 발현됨을 보여주었다. 전립선 암 세포주 DU-145, PC-3 및 LNCaP 주에 대한 RT-PCR 분석은 EDG-2,4,5 및 EDG-7이 모든 세 전립선 암 세포주에 존재하는 반면, EDG-3은 LNCaP와 DU-145 전립선 암 세포주에 존재함을 보여주었다.

실시예에 나타난 것처럼, 본 발명의 몇몇 LPA 수용체 안타고니스트는 특정 전립선 암 세포주와 특정 난소 암 세포주를 표적화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 LPA 안타고니스트는 전립선 암과 난소 암을 포함한 LPA-매개 암의 치료를 위한 대체 접근법을 제공한다.

본 발명의 다른 양상은 세포 증식을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 세포 증식을 증진하는 이 방법은 LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명 화합물을 제공하고, 세포의 LPA 수용체-유도된 증식을 증진하기에 효과적인 방식으로 화합물을 세포 상의 LPA 수용체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

LPA가 암 세포 활성을 조절하는 데서 하는 역할에 더하여, LPA가 또한 자연 상처 치료에서 생리학적 역할을 가짐을 제안하는 강한 증거가 있다. 상처 부위에서, 활성화 혈소판에서 유래된 LPA는 다른 혈소판-유래 인자들과 함께 적어도 부분적으로, 상처 부위에서의 세포 증식과 염증을 자극하는 것으로 생각된다(Balaz et al.,2000). 더욱이, LPA 스스로 혈소판 응집을 자극하며, 이는 다시 초기 응집성 반응으로의 양성 피드백 인자를 개시하는 인자일 수 있다(Schumacher etal.,1979;Tokumura et al.,1981;Gerrard et al.,1979;Simon et al.,1982).

세포 증식에서의 LPA 의 역할에 의해, LPA 수용체 아고니스트 활성을 갖는 화합물은 상처 치유를 촉진하기에 효과적인 방식으로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양상은 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명 화합물을 제공하고 유효량의 화합물을 상처 부위에 전달하며, 여기서 화합물은 상처 치유를 촉진하는 세포상의 LPA 수용체에 결합하고, 따라서 LPA 수용체 아고니스트-유도된 세포 증식을 자극하여 상처 치료를 촉진함으로써 이루어진다.

상처 치료에서 일차 목표는 상처 봉합을 이루는 것이다. 개방된 피부 상처는 하나의 주요 부류의 상처를 나타내며, 화상 상처, 신경성 궤양, 욕창, 정맥 울혈 궤양, 및 당뇨성 궤양을 포함한다. 개방된 피부 상처는 일상적으로 6 가지의 주요 성분을 포함하는 과정에 의해 치유된다:i)염증, ii)섬유아세포 증식, iii)혈관 증식, iv)연결 조직 합성, v)상피 세포화, 및 vi)상처 수축. 상처 치료는 이들 성분이 개별적으로 또는 전체적으로 적절히 기능하지 못할 때 손상된다. 영양 부족, 감염, 약학 제제(예, 액티노마이신과 스테로이드), 당뇨병, 및 노령을 포함한 많은 인자들이 상처 치료에 영향을 줄 수 있다.

인지질은 세포 분열(Xu et al.,1995b), 어팝토시스, 세포 부착 및 유전자 발현 조절을 포함한 세포 활성의 중요한 조절 인자인 것으로 입증되었다. 구체적으로, 예를 들어 LPA는 세포 증식(Moolenaar,1996)과 세포 이동(Imamura et al.,1993)에 대해 성장 인자와 유사한 효과를 유발한다. 또한 LPA가 상처 치료와재생에서 역할을 함이 제안되었다(Tigyi and Miledi,1992).

일반적으로, 섬유아세포, 내피 및 상피 세포가 상처내로 더 빨리 유입되도록 하는 제제는 상처가 치료되는 속도를 증가시킨다. 상처 치료에 유용한 본 발명 화합물은 많은 생체외 및 생체내 모델에서 확인되고 시험될 수 있다.

생체외 시스템은 상처 치료 과정의 다른 성분들, 예를 들어 조직 배양 세포(예, 섬유아세포(Verrier et al.,1986)), 내피 세포(Miyata et al.,1990) 또는 상피 세포(Kartha et al.,1992))의 "상처난" 융합성 단층으로의 세포의 복귀를 보여준다. 다른 시스템은 내피 세포 이동 및/또는 증식의 측정을 허용한다(Muller et al.,1987;Sato et al.,1988).

상처 치료를 위한 생체내 모델은 또한 당업계에 공지이며, 상처난 돼지 표피(Ohkawara et al.,1977) 또는 햄스터 뺨 낭에서의 약제-유발 구강 점막 병변(Cherrick et al.,1974)을 포함한다.

상처 치료에 효과적인 본 발명 화합물은 또한 본 발명 조성물로 배합하거나 또는 다른 경로를 통하여 동시에, 항균제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제, 항염증제, 진통제, 항소양제, 또는 이들의 배합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 약제와 함께 투여될 수 있다.

상처 치료를 위해, 바람직한 투여 방식은 국소 경로에 의한 것이다. 하지만, 별법으로, 또는 병행하여, 제제를 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 경피 경로로 투여할 수 있다. 별법으로, 또는 병행하여, 경구 경로로 투여할 수도 있다. 투여되는 투여량은 연령, 건강, 및 수용체의 체중, 만일 있다면 병행되는 치료종류, 치료 빈도, 및 원하는 효과의 특성에 의존할 것이다.

바람직한 국소 적용을 위해, 상처를 가진 사람과 동물의 치료의 경우 특히, 본 발명의 화합물을 상처 영역, 예를 들어 피부 표면에 유효량 투여하는 것이 바람직하다. 이 양은 일반적으로 한번 도포시 약 0.001mg 내지 약 1g이며, 치료할 영역, 증상의 심각성, 및 이용되는 국소 부형제의 특성에 의존한다. 바람직한 국소 제제는 연고 기제(예, PEG-1000) ml당 약 0.01 내지 약 50mg의 활성 성분이 이용되는 연고이다.

발명의 요약

본 발명은 하기 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다:

(I)

상기 식에서,

X¹, X²및 X³중 하나 이상은 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-이고, X¹및 X²가 -O-PO(OH)-O-로 함께 연결되거나, X¹및 X³이 -O-PO(OH)-NH-로 함께 연결되며;

X¹, X²및 X³중 하나 이상은 R¹-Y¹-A-이고, X¹, X²및 X³중의 둘이 R¹-Y¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X²및 X³이 -N(H)-C(O)-N(R¹)-로 함께 연결되고;

임의로, X¹, X²및 X³중 하나는 H 이며;

A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이고;

Y¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR²-이며;

Z¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;

Z²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며;

Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR⁴, =O, 또는 H 및 -NR⁵R⁶의 조합이고;

X¹, X²또는 X³각각에 있어서의 R¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이며;

R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷및 R⁸은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이고;

화학식(I)의 화합물은 리소포스파티드산, 포스파티드산, 사이클릭 포스파티드산, 알케닐 글리세롤포스페이트, 디옥틸 글리세롤 피로포스페이트 또는 N-팔미토일-L-세린이 아니다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 실시 양태는 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체의 LPA-유도 활성을 저해하기에 효과적인 조건 하에서 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 LPA 수용체에 대한 LPA 활성 저해 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 LPA 수용체 아고니스트 또는 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체의 활성을 조절하기에 효과적인 조건 하에서 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 LPA 수용체의 활성 조절 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 암을 치료하기에 효과적인 방식으로 상기 화합물 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체-유도 세포 증식을 촉진시키기에 효과적인 방식으로 세포 상의 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식 촉진 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 상처 부위에 상기 화합물 유효량을 송달하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법으로서, 상기 화합물이 상처 치료를 촉진하는 세포 상의 LPA 수용체에 결합하여 LPA 수용체 아고니스트-유도 세포 증식을 자극함에 의하여 상처 치료를 촉진하는 것인 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 양태는 본 발명의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 화합물을 제조하기 위한 한 접근법은 (Y²O)₂PO-Z¹¹-Z¹³또는 (Y²O)₂PO-Z¹²-P(OH)O-Z¹¹-Z¹³[여기에서, Z¹¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H- 또는 -O- 이고; Z¹²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며; Z¹³은 H 또는 제1 이탈기이거나, -Z¹¹-Z¹³이 함께 제1 이탈기를 형성하고; Y²는 H 또는 보호기임]을 화학식(VI)의 중간체 화합물과 반응시키는 단계, 및 경우에 따라 탈보호하는 단계를 포함하며, 여기에서, 상기 반응 단계 및 탈보호 단계는 X¹, X²및 X³중 하나 또는 둘이 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-인 화학식(I)의 화합물을 제공하기에 효과적인 조건 하에서 수행한다:

(I)

상기 식에서,

X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 R¹¹-Y¹¹-A-이고, X¹¹, X¹²및 X¹³중의 둘이 R¹¹-Y¹¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X¹²및 X¹³이 -N(H)-C(O)-N(R¹¹)-로 함께 연결되고;

X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 OH, NH₂, SH 또는 제2 이탈기이며;

임의로, X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나는 H 이고;

A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이며;

Y¹¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR¹²-이고;

Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR¹³, =O, 또는 H 및 -NR¹⁴R¹⁵의 조합이며;

X¹¹, X¹²또는 X¹³각각에 있어서의 R¹¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이고;

R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.

본 명세서에서 1 이상의 LPA 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트로서 확인된 본 발명의 화합물들은 LPA 수용체 시그날링에 의하여 매개되는 생화학적 경로를 각각 저해하거나 촉진하는 용도를 갖는다. LPA 수용체 시그날링를 조절함에 의하여, 상기 안타고니스트 및 아고니스트는 암 치료 및 상치 치료 촉진에 있어서의 특이적이고 실질적인 용도를 갖는다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의하여 정하여진다.

재료 및 방법

토마스-후버(Thomas-Hoover) 모세관 융점 장치를 사용하여, 모든 융점(mps)(수정된 값이 아님)을 측정하였다.

Bruker AX 300 분광계(300, 75.5 MHz) 상에서¹H 및¹³C 핵자기 공명(NMR) 스펨트럼을 기록하였다. 화학적 이동 값(δ)은 테트라메틸실란(TMS)에 대한 상대적인 값을 백만분의 일(ppm) 단위로 나타내었다. 피크는 다음과 같이 약칭하였다: s-단일항(singlet); d-이중항(doublet); t-삼중항(triplet); q-사중항(quartet); bs-광역 단일항(broad singlet); m-다중항(multiplet).

Bruker AX 300 분광계 상에서 양성자, 13번 탄소(¹³C) 및 31번 인(³¹P) 자기 공명 스펙트럼을 수득하였다. 양성자 및 1번 탄소에 대한 화학적 이동 값은 테트라메틸실란(TMS)에 대한 상대적인 값을 백만분의 일(ppm) 단위로 나타내었다. 31번 인에 대하 스펙트럼은 d₆=0 ppm에서 아세톤 중의 0.0485 M 트리페닐포스페이트에 대한 상태적인 값을 백만분의 일(ppm) 단위로 나타내었다.

Perkin Elmer System 200-FTIR 상에서 적외선(IR) 스펙트럼을 기록하였다.

포지티브 모드(positive mode) 또는 네가티브 모드(negative mode)로 전자분사 인터페이스(Electrospray Interface; ESI)를 사용하는 직접 주입에 의해 Bruker Esquire AG 또는 Bruker Esquire LC/MC 분광계 상에서 질량 스펙트럼(MS)를 기록하였다. 스펙트럼 데이터는 지정된(assigned) 구조와 일치하였다.

Atlantic Microlabs, Inc(미국 조지아주 노르크로스 소재)에서 원소 분석을 수행하였고, 측정값은 이론값의 ±0.4% 이내이었다.

실리카 겔(merck, 230-400 메쉬 또는 200-425 메쉬, 60 Å)은 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다.

알루미늄 배킹(backing)(두께 200 미크론 또는 250 미크론)을 갖는 sigma Aldrich 실리카 겔 60 F 254 TLC 시트 상에서 분석용 TLC를 수행하였다.

특별한 언급이 없는 한, 모든 시약, 용매 및 트로마토그래피 매질은 추가 정제없이 Aldrich Chemical Company(미국 위스콘신주 밀워키 소재), Fisher Scientific(미국 펜실베니아주 피츠버그 소재) 또는 Sigma chemical Co.(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 시판하는 것을 사용하였다. 지시약으로 벤조페논을 사용하여, 금속 나트륨으로부터 증류함으로써 테트라히드로푸란(THF)을 건조시켰다. 수소화칼슘(CaH₂)으로부터 무수 염화메틸렌(CH₂Cl₂)을 증류하였다. 모든 모노 글리세리드는 Nu-Check-Prep(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에서 시판하는 제품을 구입하였다. t-Boc-L-세린은 Fluka에서 시판하는 제품을 구입하였다.

모든 지질은 Avanti Polar Lipids(미국 알라바마주 알라바스터 소재)에서 시판하는 제품을 구입하였다. 지방산이 없는 소 혈청 알부민(BSA)도 상기 회사 제품을 구입하였다. LPA는 사용 하기 전에 1 ml의 EGTA를 함유하지만 Ca²⁺이 없는 행크스 평형 염 용액 중에 용해되어 있는 1 mM의 BSA와 복합체화되었다. 특별한 어느급이 없는 한, 분취량의 모든 다른 지질은 MeOH 중에 용해시키고, 사용하기 전에 LPA와 혼합한다.

사이토펙텐(cytofectene) 형질전환 시약은 Bio-Rad(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)에서 시판하는 제품을 구입하였다. Fura-2 AM은 Molecular Probes(미국 오리건주 유겐 소재)에서 시판되는 제품을 구입하였다.

배양 배지, 우태아 혈청(FBS) 및 G418은 Cellgro(미국 버지니아주 헤른돈 소재)에서 시판하는 제품을 구입하였다.

사람 Edg-4를 안정적으로 발현시키는 RH7777 세포는 이해심 많은 Kevin Lynch 박사(미국 버지니아주 찰스로테스빌레 소재 버지니아 대학)가 제공한 것이다. pCDNA3 발현 플라스미드(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재 Invitrogen사) 내에삽입된, 표시 문자가 표지된(flag-tagged) cDNA의 암호화 사람 Edg-4 및 Edg-7은 Junken Aoki 박사(일본 도쿄 소재 도쿄 대학)로부터 선물받은 것이다. RH7777 및 NIH3T3 세포는 ATCC(AMerican Type Culture Collection)(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 구입한 것이다. HEY 세포는 Lisa Jennings(멤피스 소재 테네시 대학)박사가 제공한 것이다. 모든 세포주는 10% FBS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 둘베코 개량 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) 중에 유지시켰다. 난모 세포는 전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조),제노푸스라에비스(Xenopuslaevis) 개구리로부터 수득하였다.

안정적인 형질전환

사람 Edg-2, Edg-4 또는 Edg-7을 암호화하는 cDNA 구조물로 RH7777 세포를 형질전환한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 사이토펙텐 형질전환 시약을 사용하여 pCDNA3 발현 벡터 내에 서브클로닝하였다. 형질전환된 세포는 10% FBS 및 1 mg/ml의 게네티신(geneticine)을 함유하는 DMEM 내에서 선별하였다. 내성 세포를 수집하고, 제한 희석(limiting dilution)에 의해 서브클로닝하였다. 이어서, 생성되는 클론은 기능 분석 및 RT-PCR 분석을 사용하여 스크리닝하였다. 데이터는 개별 클론의 대표적인 데이터이다.

일시적인 형질전환

RH7777 세포는 형질전환 전에 1일 동안 폴리리신이 코팅된 유리 커버글라스(미국 뉴저지주 바인랜드 소재 Bellco) 상에 도말하였다. 다음날, 6 ㎕의 사이토펙텐과 혼합된 1 ㎍의 의 플라스미드 DNA로 밤새도록(16-18 시간) 세포를 형질전환하였다. 이어서, DMEM으로 세포를 2회 헹구고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 중에서 배양하였다. 다음날, DMEM으로 세포를 헹구고, 세포내 Ca²⁺를 모니터링하기 전에 최소 2시가 동안 혈청을 회수하였다.

세포내 Ca ²⁺ 의 측정 및 데이터 분석

전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조), 형광 Ca²⁺지시약 Fura-2 AM을 사용하여, 세포내 Ca²⁺에 있어서의 변화를 모니터링하였다. FL WinLab software(미국 웨레스레이 소재 Perkin-Elmer)에 의해 측정시, 세포내 Ca²⁺측정으로부터 수득한 데이터 포인트는 유도된 Ca²⁺의 일시적 산물(transient)의 총 피크 면적을 나타내었다. 데이터 포인트는 평균 3회 이상의 측정 ±표준 편차를 나타낸다. 데이터 포인트의 중요성은 학생 t-테스트를 사용하여 측정하고, p<0.05에서 유의적인 의미를 갖는다고 간주하였다.

제노푸스 난모 세포에 있어서의 전자물리적 기록

전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조), 2개의 전극 전압 클램프 시스템을 사용하여, LPA에 의해 유도된 오실레이터 Cl^-전류를 기록하였다.

Edg 및 PSP24 mRNA의 RT-PCR 분석

하기 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여, 전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조), RT-PCR에 의한 Edg 및 PSP24 수용체 mRNA의 동정을 수행하였다.

EDG-1

정방향 프라이머(forward primer) 5'-₈₁TCATCGTCCGGCATTACAACTA-3'(서열 번호 9);

역방향 프라이머(reverse primer) 5'-GAGTGAGCTTGTAGGTGGTG₃₅₁-3'(서열 번호 10);

EDG-2

정방향 프라이머 5'-₆₅AGATCTGACCAGCCGACTCAC-3'(서열 번호 11);

역방향 프라이머 5'-GTTGGCCATCAAGTAATAAATA₄₂₂-3'(서열 번호 12);

EDG-3

정방향 프라이머 5'-₁₃₇CTTGGTCATCTGCAGCTTCATC-3'(서열 번호 13);

역방향 프라이머 5'-TGCTGATGCAGAAGGCAATGTA₅₉₇-3'(서열 번호 14);

EDG-4

정방향 프라이머 5'-₆₃₄CTGCTCAGCCGCTCCTATTTG-3'(서열 번호 15);

역방향 프라이머 5'-AGGAGCACCCACAAGTCATCAG₁₁₉₅-3'(서열 번호 16);

EDG-5

정방향 프라이머 5'-₁₁ATGGGCAGCTTGTACTCGGAG-3'(서열 번호 17);

역방향 프라이머 5'-CAGCCAGCAGACGATAAAGAC₇₂₀-3'(서열 번호 18);

EDG-6

정방향 프라이머 5'-₂₈₀TGAACATCACGCTGAGTGACCT-3'(서열 번호 19);

역방향 프라이머 5'-GATCATCAGCACCGTCTTCAGC₇₉₀-3'(서열 번호 20);

EDG-7

정방향 프라이머 5'-₉₁AGCAACACTGATACTGTCGATG-3'(서열 번호 21);

역방향 프라이머 5'-GCATCCTCATGA'rrGACATGTG₄₄₆-3'(서열 번호 22);

EDG-8

정방향 프라이머 5'-₈₈ATCTGTGCGCTCTATGCAAGGA-3'(서열 번호 23);

역방향 프라이머 5'-GGTGTAGATGATAGGATTCAGCA₁₁₆₁-3'(서열 번호 24);

PSP24

정방향 프라이머 5'-₃₂₀CTGCATCATCGTGTACCAGAG-3'(서열 번호 25); 및

역방향 프라이머 5'-ACGAACTCTATGCAGGCCTCGC₁₁₈₄-3'(서열 번호 26).

세포 증식 분석

전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조), 직접 세포 계수에 의해 NIH3T3 세포의 증식을 평가하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM 내에서 밀도가 10,000개의 세포/웰인 24-웰 평판 내에 NIH3T3 세포를 도말하였다. 다음날, 세포를 헹구고, DMEM 내에서 6시간 동안 혈청이 결핍된 상태로 하였다. 이어서, 24시간 동안 지질을 첨가하였다. 쿨터 계수기(Coulter counter)(미국 플로리다주 히알레아 소재 Coulter Electronics) 내에서 계수함으로써, 세포수를 측정하였다.

³ H-티미딘의 혼입

전술한 바와 같이(1999년도에 발행된 Tigyi 등의 문헌 참조), RH7777 세포 내로의³H-티미딘의 혼입을 측정하였다.

실시예 1 - N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β락톤(중간체 화합물 25)의 합성

500 ml 삼구 플라스크에 저온 온도계 및 100 ml 적하 깔때기(dropping funnel)을 장착하였다. 모든 유리 기구는 사용하기 이전에 불꽃 건조하고, 아르곤(Ar) 하에서 실온으로 냉각시켰다. 플라스크에 트리페닐포스핀(Ph₃P)(10 g, 38 mmol, 진공 하에서 72시간 동안 P₂O₅위에서 건조됨)을 첨가하고, THF(190 ml)를 새로 증류시켰다. 용액을 냉각시키고, 아르곤 대기 하의 -78 ℃(건조 냉 아세톤 배쓰(bath))에서 교반하였다. 격렬히 교반하면서, 새로 증류된 디에틸아조디카르복실레이트(DEAD)(6.2 ml, 39.9 mmol)를 30분 이상 시린지(syringe)를 사용하여 첨가하였다. 첨가 완료 후, 우유빛 백색 페이스트를 수득할 때까지(약 30분-40분) 혼합물을 교반하였다. 새로 증류된 THF(75 ml) 중의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린(24)(7.79 g, 38 mmol, 진공 하에서 72시간 동안 P₂O₅위에서 건조됨) 용액을 반응 혼합물에 45분 이상 적가하였다. 아르곤 하에서 -78 ℃에서 밤새도록 혼합물을 교반하고, 0 ℃로 데웠다(온도가 -10 ℃에 이를 때까지 빙조 내에 플라스크를 배치시켰다). 약 30분 후, 빙조를 수조로 대체하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 회전 증발기 상에서 농축시켜, 30 ℃에서 담황색 오일을 수득하였다. 이어서, 상기 오일을 25% EtOAc/헥산(100 ml)로 처리하고, 생성되는 백색 고체를 여과에 의해 제거하고, 실리카 겔 상에서 25% EtOAc/헥산(2 ×70 ml)로 세척하고, 25%(500 ml) 및 300%(1500 ml) EtOAc/헥산을 연속적으로 사용하여 잔류 오일의 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 배합하여 백색 고체로서의 3.4 g(47%)의 화합물(25)을 수득하였다: mp 119-121 ℃ dec (Lit. 119.5-120.5 ℃ dec); lH NMR (CD₂Cl₂) δ 1.44 (s, 9H), 4.38-4.42 (m, 2H), 4.96-5.03 (q, J1= 6.l Hz, J2=12.5 Hz, lH), 5.39 (s, br, 1H);¹³C NMR (CD₂Cl₂) d 28.31, 60.01, 66.63, 81.50, 155.0l, l69.94; IR (KBr) 3361, 2978, 1843, 1680, 1533, 1370, 1292 cm^-1; C₈H₁₃NO₄에 대한 원소 분석 이론치: C, 51.33; H, 6.94; N, 7.50. C₈H₁₃NO₄에 대한 원소 분석 실측치: C, 51.41; H, 7.01; N, 7.51.

실시예 2 - 화합물 26-34의 합성

사용되는 유리 기구를 불꽃 건조시키고, 아르곤 대기 하에서 실온으로 냉각시켰다. 아르곤 대기 내에서 반응을 수행하였다. THF는 사용 전에 새로 증류하였다.

화합물 26: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(노닐아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트

THF(60 ml) 중의 데실 아민(490 mg, 3.20 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(300 mg, 1.60 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 왁스형 분말로서의 290 mg(52%)의 화합물(26)을 수득하였다: mp 50-52℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 0.88 (t, J=6.4 Hz, 3H) 1.26 (s, 14H), 1.46 (s, 9H), 3.04 (bs, lH), 3.16-3.34 (m, 2H), 3.63 (m, 1H), 4.06-4.15 (m, 2H), 5.53 (bs, lH), 6.63 (bs, lH);¹³C NMR (CDCl₃) δ 1409, 22.65, 26.80, 28.27, 29.24, 29.27, 29.37, 29.50, 29.51, 31.86, 39.43, 54.34, 62.87, 77.20, 80.34, 171.52; IR (KBr) 3282, 3098, 2929, 2856, 1666, 1547, 1467, 1369, 1300, 1248, 1179 cm^-1; C₁₆H₃₂N₂O₄에 대한 원소 분속 이론치: C, 62.76; H, 10.53; N, 8.13. C₁₆H₃₂N₂O₄에 대한 원소 분석 실측치: C, 63.00; H, 10.46; N, 7.98.

화합물 27: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-(테트라데실아미노)에틸]카르바메이트

THF(40 ml) 중의 테트라데실 아민(273 mg, 1.28 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 분말로서의 245 mg(57%)의 화합물(27)을 수득하였다: mp 59-62℃;¹H NMR (CDC1₃) δ 0.88 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.25 (s, 24H), 1.45 (s, 9H), 3.15-3.36 (m, 3H), 3.63-3.65 (m, lH), 4.07-4.13 (m, 2H), 5.60-5.63 (m, 1H), 6.72 (bs, 1H);¹³C NMR (CDCl3) δ 14.10, 22.66, 26.81, 27.99, 28.27, 29.25, 29.33, 29.37, 29.50, 29.57, 29.62, 29.66, 31.90, 39.47, 54.58, 62.87, 77.20, 80.52, 156.34, 171.37; IR (KBr) 3345, 2920, 2852, 1708, 1688, 1655, 1637, 1572, 1529, 1472, 1248, 1173 cm^-1; C₂₂H₄₄N₂O₄에 대한 원소 분석 이론치: C, 65.96; H, 11.07; N, 6.99. C₂₂H₄₄N₂O₄에 대한 원소 분석 실측치: C, 66.04; H, 11.17; N, 6.96.

화합물 28: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(옥타데실아미노)-2-옥소에틸에틸]카르바메이트

THF(60 ml) 중의 옥타데실 아민(516 mg, 2.08 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(300 mg, 1.60 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 분말로서의 300 mg(41%)의 화합물(28)을 수득하였다: mp 69-71℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 0.88 (t, J=6.3 Hz, 3H), l.25 (s, 30H), 1.46 (s, 9H), 3.03 (bs, lH), 3.16-3.34 (m, 2H), 3.63 (m, 1H), 4.05-4.21 (m, 2H), 5.64 (bs, lH), 6.62 (bs, 1H);¹³C NMR (CDCl₃) δ 14.10, 22.68, 26.81, 28.28, 29.25, 29.35, 29.51, 29.58, 29.69, 31.91, 39.43, 54.29, 62.87, 77.20, 171.53; IR (KBr) 3345, 2919, 2852, 1687, 1636, 1570, 1528, 1473, 1305, 1173 cm^-1; C₂₆H₅₂N₂O₄·0.2C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 이론치: C, 67.86; H, 11.39; N, 5.91. C₂₆H₅₂N₂O₄·0.2C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 실측치: C, 67.59; H, 11.46; N, 6.1.

화합물 29: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[4-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트

THF(40 ml) 중의 4-(테트라데실옥시)아닐린(150 mg, 0.490 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(91 mg, 0.490 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(2회)를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 분말로서의 110 mg(45%)의 화합물(29)을 수득하였다: mp 92-94 ℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.6 Hz, 3H), 1.25 (s, 22H), 1.48 (s, 9H), 1.76 (m, 2H), 3.67-3.72 (dd, J1=4.9 Hz, J2= 7.2 Hz, IH), 3.92 (t, J=6.5 Hz, 2H), 4.23-4.26 (m, 2H), 5.65 (bs, lH), 6.83-6.87 (m, Jo=8.9 Hz, 2H), 7.36-7.40 (m, Jo=8.9 Hz), 8.6 (bs, lH);¹³C NMR (CDCl₃) δ 14.10, 22.69, 26.01, 28.28, 29.25, 29.34, 29.39; 29.56, 29.58, 29.64, 31.91, 62.53, 68.30, 77.20, 111.17, 114.81, 121.70, 130.25, 156.22, 169.78; IR (KBr) 3304, 2920, 2852, 1658, 1514, 1472, 1238, 1174 cm^-1; C₂₈H₄₈N₂O₅·0.05CHC1₃에 대한 원소 분석 이론치: C, 67.56; H, 9.71; N, 5.62. C₂₈H₄₈N₂O₅·0.05CHC1₃에 대한 원소 분석 실측치: C, 67.80; H, 9.67; N, 5.60.

화합물 30: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(4-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트

THF(20 ml) 중의 p-아니시딘(100 mg, 0.8 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(151 mg, 0.8 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 분말로서의 135 mg(54%)의 화합물(30)을 수득하였다: mp 109-111℃;¹H NMR (CDCl₃), δ 1.48 (s, 9H), 3.68-3.73 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 4.24-4.27 (m,2H), 5.68 (bs, 1H), 6.83-6.88 (m,Jo=9 Hz, 2H), 7.37-7.42 (m, Jo=9 Hz, 2H), 8.61 (bs, lH);¹³C NMR (CDC1₃) δ 28.29, 54.96, 55.47, 62.54, 81.00, 114.18, 121.78, 130.45, 156.64, 156.98, 169.59; IR (KBr) 3340, 2978, 1673, 1603, 1516, 1298; 1238,cm^-1; C₁₅H₂₂N₂O₅에 대한 원소 분석 이론치: C, 58.05; H, 7.15; N, 9.03. C₁₅H₂₂N₂O₅에 대한 원소 분석 실측치: C, 58.04; H, 7.17; N, 9.06.

화합물 31: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[3-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트

THF(25 ml) 중의 3-(테트라데실옥시)아닐린(179 mg, 0.588 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(91 mg, 0.490 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 48시간 동안 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 분말로서의 105 mg(43%)의 화합물(31)을 수득하였다: mp 70-72℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 0.88(t, J=6.6 Hz, 3H), 1.26 (s, 22H), 1.48 (s, 9H), 1.76 (m, 2H), 3.67-3.73 (dd, J1=5.l Hz, J2= 6.9 Hz, 1H), 3.93 (t, J=6.5 Hz, 2H), 4.23-4.26 (m, 2H), 5.66 (bs, lH), 6.64-6.68 (m, 1H), 6.93-6.96 (m, 1H), 7.19 (t, Jo=8.l Hz, lH), 7.23 (t, Jm=2 Hz, lH), 8.75 (bs, lH);¹³C NMR (CDCl₃) δ 14.11, 22.68, 26.02, 28.28, 29.23, 29.35, 29.39, 29.60, 29.66, 31.92, 62.38, 68.07, 77.20, 106.22, 111.10, 111.92, 129.67, 138.54, 159.75; IR (KBr) 3368, 2918, 2851, 1679, 1618, 1498, 1472, 1286 cm^-1; C₂₈H₄₈N₂O₅·0.05CHCl₃에 대한 원소 분석 이론치: C, 67.56; H, 9.71; N, 5.62. C₂₈H₄₈N₂O₅·0.05CHCl₃에 대한 원소 분석 실측치: C, 67.44; H, 9.79; N, 5.57.

화합물 32: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(3-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트

THF(30 ml) 중의 m-아니시딘(171 mg, 1.38 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 밤새도록 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 황색 오일로서의 154 mg(46%)의 화합물(32)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃), δ 1.48 (s, 9H), 3.68-3.73 (dd, J1=4.8 Hz, J2=6.9 Hz, lH), 3.75 (s, 3H), 4.22-4.25 (d, J=10.23Hz, 2H), 5.66 (bs, IH), 6.66-6.69 (m, lH), 6.96-6.99 (m, lH), 7.21 (m, Jo=8.l Hz, 1H), 7.24 (m, 1H), 8.79 (bs,lH);¹³C NMR (CDC1₃) δ 28.28, 29.68, 55.30, 62.39, 77.20, 81.11, 105.67, 110.55, 112.15, 129.73, 138.63, 160.19, 169.89.

화합물 33: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[2-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트

THF(25 ml) 중의 2-(테트라데실옥시)아닐린(200 mg, 0.654 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(102 mg, 0.545 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 48시간 동안 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모아 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 황색 오일로서의 33 mg(<10%)의 화합물(33)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.88 (t, J=6.6 Hz, 3H), 1.26 (s, 22H), 1.48 (s, 9H), 1.76 (m, 2H), 3.67-3.73 (dd, J1=5.1 Hz, J2=6.9 Hz, lH), 3.93 (t, J=6.5 Hz, 2H), 4.23-4.26 (m, 2H), 5.66 (bs, lH), 6.64-6.68 (m,1 H), 6.93-6.96 (m, lH), 7.19 (t, Jo=8.l Hz, 1H), 7.23 (t, Jm=2 Hz, lH), 8.75 (bs, lH);¹³C NMR (CDC1₃) δ 14.10, 22.68, 25.88, 28.30, 29.17, 29.35, 29.58, 29.64, 29.68, 31.91, 55.73, 63.03, 68.7I, 77.20, 111.06, 119.86, 119.86, 120.78, 124.21, 127.27, 147.75, 157.22, 169.25.

화합물 34: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(2-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트

THF(30 ml) 중의 o-아니시딘(238 mg, 1.93 mmol) 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 아르곤 하에서 48시간 동안 혼합물을 환류시켰다. 회전 증발기 상에서 반응 혼합물을 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, CHCl₃/헥산으로부터 결정화함으로써, 황색 분말로서의 150 mg(45%)의 화합물(34)을 수득하였다: mp 92-94℃;¹H NMR (CDCl₃), δ 1.49 (s, 9H), 3.87 (s, 3H), 3.73-3.83 (m, lH), 4.21-4.34 (m, 2H), 5.64 (bs, lH), 6.86-6.97 (m, 2H), 7.03-7.09 (m, Jo=7.80 Hz, Jm=1.8 Hz, lH), 8.28-8.31 (dd, Jo=8.9 Hz, Jm=I.5 Hz, 1H) 8.9 (bs, 1H);¹³C NMR (CDCl₃) δ 28.28, 55.73, 62.87, 80.65, 110.14, 120.03, 120.97, 124.30, 127.13, 148.33, 169.43; IR (KBr) 3525, 33I9, 2982, 1672, 1653, 1548, 1528, 1465, 1256, 1160, 1006 cm^-1; C₁₅H₂₂N₂O₅에 대한 원소 분석 이론치: C, 58.05; H, 7.15; N, 9.03. C₁₅H₂₂N₂O₅에 대한 원소 분석 실측치: C, 58.04; H, 7.07; N, 8.85.

실시예 3 -화합물 35-43의 합성

화합물 35: N-1-노닐-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1 ml) 중의 화합물(26) (20 mg, 0.0580 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 19 mg(95%)의 화합물(35)을 수득하였다: mp 168-170℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 0.88 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.27 (s, 14H), 1.50 (m, 2H), 3.20 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.70-3.78 (m, lH), 3.81-3.88 (m, 2H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.44, 23.74, 27.96, 30.30, 30.42, 30.47, 30.70, 30.73, 30.78, 30.80, 33.10, 40.71, 56.30, 61.77, 167.97; IR (KBr) 3280, 2919, 2850, 1654, 1573, 1464, 1231, 1141, 1089, 1059,cm^-1. Cl₃H₂₈N₂O₂·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 50.27; H, 8.16; N, 7.82. Cl₃H₂₈N₂O₂·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 50.15; H, 8.30; N,7.95.

화합물 36: N-1-테트라데실-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1.5 ml) 중의 화합물(27) (50 mg, 0.124 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1.5 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 48 mg(94%)의 화합물(36)을 수득하였다: mp 168-171℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 0.89 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.28 (s, 22H), 3.22 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.73-3.80 (m, lH), 3.84-3.91 (m,2H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.43, 23.73, 27.95, 30.29, 30.41, 30.47, 30.69, 30.73, 30.78, 30.80, 33.08, 40.71, 56.29, 61.77, 167.99; IR (KBr) 3277, 2919, 2850, 1656, 1573, 1464, 1231, 1141, 1089, 1059 cm^-1; C₁₇H₃₆N₂O₂·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 55.06; H, 9.00; N, 6.76. C₁₇H₃₆N₂O₂·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 54.94; H, 8.99; N,6.58.

화합물 37: N-1-옥타데실-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1 ml) 중의 화합물(28) (25 mg, 0.0547 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 23 mg(92%)의 화합물(37)을 수득하였다: mp 170-172℃;¹H NMR (CD₃OD) 80.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.27 (s, 30H), 1.49-1.54 (m, 2H), 3.22 (t, J=7.0 Hz, 2H), 3.74-3.81 (m, lH), 3.83-3.91 (m, 2H);¹³C NMR (CD₃OD)δ 14.43, 23.74, 27.95, 30.30, 30.41, 30.47, 30.69, 30.78, 33.07, 40.71, 56.30, 61.77, 167.97; IR (KBr) 3276, 2919, 2850, 1657, 1468, 1207, 1181, 1138, 1059 cm^-1; C₂₁H₄₄N₂O₂·CF₃COOH 0.15CH₂Cl₂에 대한 원소 분석 이론치: C, 57.53; H, 9.45; N, 5.80. C₂₁H₄₄N₂O₂·CF₃COOH 0.15CH₂Cl₂에 대한 원소 분석 실측치: C, 57.45; H, 9.55; N, 5.81.

화합물 38: N-1-[4-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(0.050 ml) 중의 화합물(29) (54 mg, 0.110 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(0.050 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 55 mg(99%)의 화합물(38)을 수득하였다: mp 135-139℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 0.89 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.28 (s, 21H), 1.43 (m, 2H), 1.74 (m, J=6.5 Hz, 2H), 3.86-4.03 (m, 5H), 6.84-6.88 (m, Jo=9.0 Hz, 2H), 7.41-7.47 (m, Jo=9.0 Hz, 2H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.42, 23.72, 30.41, 30.46, 30.50, 30.67, 30.74, 33.06, 56.81, 61.72, 69.26, 115.71, 122.96, 131.84, 157.80, 166.06; IR (KBr) 3281, 2920, 2852, 1672, 1604, 1559, 1515, 1240, 1210, 1132 cm^-1; C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 59.27; H,8.16; N, 5.53. C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 59.48; H, 8.09; N, 5.49.

화합물 39: N-1-(4-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(0.049 ml) 중의 화합물(30) (50 mg, 0.161 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(0.049 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시킨 후, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 50 mg(96%)의 화합물(39)을 수득하였다: mp 182-183℃ dec;¹H NMR (CD₃OD), δ 3.76 (s, 3H), 3.87-3.94 (m, 1H), 3.97-4.04 (m, 2H), 6.85-6.91 (m,Jo=9.1 Hz, 2H), 7.44-7.49 (m, Jo=9.0 Hz, 2H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 55.86, 56.80 , 61.73, 115.07, 122.95, 131.99, 158.31, 166.10; IR (KBr) 3278, 3099, 2964, 1673, 1562, 1517, 1196, 1131,cm^-1; C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 44.31; H, 4.67; N, 8.58.

화합물 40: N-1-[3-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(0.062 ml) 중의 화합물(31) (45 mg, 0.091 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(0.062 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 45 mg(99%)의 화합물(40)을 수득하였다: mp 115-119 ℃;¹H NMR (CD₃OD),δ 0.89 (s, J=6.5Hz, 3H), 1.28 (s, 21H), 1.43 (m, 2H), 1.75 (m, J=6.5 Hz, 2H), 3.8-3.93 (m, 4H), 4.01-4.05 (m, lH), 6.67-6.71 (m, lH), 7.04-7.07 (m, lH), 7.20 (t, Jo=8.1 Hz, lH), 7.28 (t, Jm=2.l Hz, 1H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.44, 23.75, 27.18, 30.38, 30.49, 30.52, 30.73, 30.78, 33.09, 56.96, 61.66, 69.05, l07.71, 111.75, 113.16, 130.72, 140.16, 161.07, 166.36; IR (KBr) 3266, 2920, 2852, 1676, 1608, 1566, 1496, 1438, 1211, 1130, 1045 cm^-1; C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 59.27; H, 8.16; N, 5.53. C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 59.49; H, 8.13; N, 5.41.

화합물 41: N-1-(3-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1 ml) 중의 화합물(32) (120 mg, 0.386 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 회색 고체로서의 123 mg(98%)의 화합물(41)을 수득하였다: mp 137-140℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 3.77 (s, 3H), 3.88-3.99 (m, 2H), 4.01-4.06 (m, 1H), 6.68-6.71 (m, 1H), 7.02-7.10 (m, 1H), 7.22 (t, Jo=8.l Hz, lH), 7.29 (t, Jm=2.l Hz, lH);¹³C NMR (CD₃OD) δ55.70, 56.94; 61.67, 107.14, 111.11, 113.28, 130.73, 140.22, 161.61, 166.43; IR(KBr) 3265, 1675, 1609, 1566, 1496, 1433, 1268, 1196, 1044, cm^-1; C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C, 44.52; H, 4.59; N, 8.66.

화합물 42: N-1-[2-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1 ml) 중의 화합물(33) (21 mg, 0.386 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 회색 고체로서의 21 mg(95%)의 화합물(42)을 수득하였다: mp 63-66 ℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 0.88 (t, J=6.5 Hz, 3H), 1.27 (s, 21H), 1.146 (m, 2H), 1.83 (m, J=7.8 Hz, 2H), 3.90-4.07 (m, 4H), 4.18 (t, J=5.8 Hz, 1H), 6.87-6.93(m, 1H), 6.99-7.02 (m, lH), 7.08-7.14 (m, lH), 7.96-7.99 (m, 1H);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.43; 23.73, 27.07, 30.27, 30.48, 30.57, 30.79, 33.07, 56.198, 61.67, 69.84, 112.93, 121.40, 123.38, 126.80, 127.53, 150.93, 166.74; IR (KBr) 3282, 2925, 2851, 1679, 1556, 1496, 1458, 1213, 750,cm^-1; C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH 0.5H₂O에 대한 원소 분석 이론치: C, 58.24; H, 8.21; N,5.43. C₂₃H₄₀N₂O₃·CF₃COOH 0.5H₂O에 대한 원소 분석 실측치: C; 58.59; H, 8.09;N, 5.24.

화합물 43: N-1-(2-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트

아르곤 대기 하에서, CH₂Cl₂(1 ml) 중의 화합물(34) (80 mg, 0.257 mmol)의 냉각(0 ℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 적가하였다. 첨가 완료 후, 실온에서 3시간 동안 반응물을 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축시키고, 진공 펌프 상에서 건조시킴으로써, 회색 고체로서의 81 mg(97%)의 화합물(43)을 수득하였다: mp 131-133 ℃;¹H NMR (CD₃OD), δ 3.88 (s, 3H), 3.91-4.02 (m, 2H), 4.18-4.22 (m, lH), 6.89-6.94 (m, lH), 7.01-7.04 (m, 1H), 7.10-7.16 (t, Jo=8.1 Hz, lH), 8.00-8.03 (t, Jm=2.l Hz, IH);¹³C NMR (CD₃OD) δ 56.27, 56.34, 56.47, 61.81, 111.94, 121.52, 123.21, 126.71, 127.54, 151.43, 166.80; IR (KBr) 3271, 1675, 1546,1499, I465, 1439, 1268, 1207, 1130,cm^-1; C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. C₁₀H₁₄N₂O₃·CF₃COOH에 대한 원소 분석 실측치: C,44.18; H, 4.57; N, 8.59.

실시예 4 - 중간체 화합물 50-54의 합성

사용되는 유리 기구를 불꽃 건조시키고, 아르곤 대기 하에서 실온으로 냉각시켰다. 무수 피리딘으로 출발 물질인 알콜을 세척하고(3회), 건조시켰다(48시간 동안 고진공 하에서). 아르곤 대기 내에서 반응을 수행하였다. THF 및 CH₂Cl₂는 사용하기 전에 새로 증류하였다.

화합물 50: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(노닐아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트

피리딘으로 세척된 출발 물질 화합물 (28)(252 mg, 0.551 mmol)에 1H-테트라졸(231 mg, 3.31 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(50 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (1.14 mg, 3.31 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트(Na-metabisulfite)를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서, THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×25 ml), NaHCO₃(2 ×30 ml), 물(2 ×30 ml) 및 염수(2 ×30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 무색 오일로서의 195 mg(49%)의 화합물(50)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.25 (bm, 29H), 1.34 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 3.I7-3.23 (m, 2H), 4.01-4.09 (m, lH), 4.31-4.43 (m, 2H), 4.96-5.09 (m, 4H), 5.55 (bs, lH), 6.33 (bs, lH) 7.31-7.39 (m, 10H);¹³C (CDC1₃) δ 14.09, 22.66, 26.79, 28.25, 29.24, 29.27, 29.42, 29.50, 29.53, 31.86, 39.68, 66.98, 69.66, 69.73, 77.20, 128.06, I28.10, l28.64, 128.70, 128.72, 135.02, 168.50; MS m/z 603 (M-H); IR (KBr) 3349, 2919, 2852, 1717, 1685, 1654, 1516, 1470, 1457, 1242, 1163, 1037, 1025,999 cm^-1.

화합물 51: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-옥소-2-(테트라데실아미노)에틸]카르바메이트

피리딘으로 세척된 출발 물질 화합물 (27)(305 mg, 0.761 mmol)에 1H-테트라졸(319 mg, 4.56 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(40 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (1.57 mg, 4.56 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트(Na-metabisulfite)를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서, THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×30 ml), NaHCO₃(2 ×40 ml), 물(2 ×35 ml) 및 염수(2 ×35 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 왁스형 고체로서의 451 mg(89%)의 화합물(51)을 수득하였다: mp 33-35℃;¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 22H), 1.44 (s, 9H), 1.52-1.55 (m, 2H), 3.16-3.23 (m, 2H), 4.02-4.09 (m, 1H), 4.31-4.43 (m, 2H), 5.00-5.I5 (m, 4H), 5.57 (bs, lH), 6.34 (t, J=5.0 Hz, IH) 7.31-7.40 (m, 10H);¹³C (CDCl₃) δ 14.08, 19.03, 22.67, 26.81, 28.27, 29.25, 29.33, 29.44, 29.51, 29.59, 29.62, 29.65, 31.91, 39.69, 46.49, 54.47, 67. 00, 67.07, 67.24, 67.32, 69.66, 69.68, 69.74, 76.12, 77.20, 77.84, 80.57, 128.0, 128.05, 128.09,128.58, 128.64, 128.68, 135.45, 135.54, 135.59, 168.51; C₃₆H₅₇N₂O₇P·1H₂O·0.5C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 이론치: C, 63.14; H, 8.78; N, 3.88. C₃₆H₅₇N₂O₇P·1H₂O·0.5C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 실측치: C, 62.80; H, 8.38; N, 4.21.

화합물 52: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(옥타데실아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트

피리딘으로 세척된 출발 물질 화합물 (26)(270 mg, 0.783 mmol)에 1H-테트라졸(329 mg, 4.70 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(50 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (1.62 mg, 4.70 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트(Na-metabisulfite)를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서, THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(50 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×25 ml), NaHCO₃(2 ×25 ml), 물(2 ×25 ml) 및 염수(2 ×25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 138 mg(28%)의 화합물(52)을 수득하였다: mp 52-54℃;¹H NMR (CDC1₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23 (bm, 14H), 1.44 (s, 9H), 1.63 (m, 2H), 3.17-3.24 (m, 2H), 4.01-4.09 (m, lH), 4.30-4.44 (m, 2H), 5.00-5.05 (m, 4H), 5.56 (bs, lH), 6.32 (bs, 1H) 7.29-7.39 (m, 10H);¹³C (CDC1₃) δ 14.11, 22.68, 26.80, 28.25, 29.26, 29.35, 29.42, 29.52, 29.60, 29.64, 29.69, 31.91, 39.68, 67.00, 67.07, 69.69, 69.74, 77.20, 127.93, 128.06, 128.10, 128.65, 128.70, 128.73, 135.43, 168.51, 170.07; IR (KBr) 3349, 2919, 2852, 1717, 1685, 1654, 1516, 1242, 1163, 1037, 1025,999 cm^-1; C₄₀H₆₅N₂O₇P·0.75H₂O·1C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 이론치: C, 64.56; H, 9.17; N, 3.42. C₄₀H₆₅N₂O₇P·0.75H₂O·1C₄H₈O₂에 대한 원소 분석 실측치: C, 64.23; H, 9.05; N, 3.78.

화합물 53: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-옥소-2-[4-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트

피리딘으로 세척된 출발 물질 화합물 (29)(310 mg, 0.647 mmol)에 1H-테트라졸(450 mg, 6.42 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(40 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (2.21 mg, 6.42 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트(Na-metabisulfite)를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서, THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×25 ml), NaHCO₃(2 ×35 ml), 물(2 ×35 ml) 및 염수(2 ×35 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 81 mg(17%)의 화합물(53)을 수득하였다: mp 74-76℃;¹H NMR (CDC1₃) δ 0.87 (t J=6.5 Hz, 3H), 1.30 (s, 22H), 1.46 (s, 9H), 1.71-1.80 (m,2H), 3.91 (t, J=6.5Hz, 3H), 4.01-4.16 (m, 1H), 4.42-4.49 (m, 2H), 4.96-5.09 (m, 4H), 5.65 (bs, 1H), 6.80-6.86 (m, Jo=9.0 Hz, 2H) 7.31-7.39 (m, 12H), 8.82 (bs, 1H);¹³C (CDC1₃) δ 14.10, 22.67; 26.02, 28.26, 29.26, 29.34, 29.40, 29.57, 29.64, 31.91, 68.31, 69.84, 77.20, 114.79, 121.72, 128.07, 128.13, 128.65, 128.74, 130.03, 166.71; IR (KBr) 3340, 2920, 2852, 1717, 1677, 1513, 1457, 1237, 1059, 998 cm^-1; C₄₂H₆₁N₂O₈P·1H₂O·0.45C₆H₁₄에 대한 원소 분석 이론치: C, 66.31; H, 8.63; N,3.46. C₄₂H₆₁N₂O₈P·1H₂O·0.45C₆H₁₄에 대한 원소 분석 실측치: C,65.92; H, 9.02; N, 3.84.

화합물 54: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(4-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트

피리딘으로 세척된 출발 물질 화합물 (30)(225 mg, 0.725 mmol)에 1H-테트라졸(254 mg, 3.625 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(20 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (1.25 mg, 3.625 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트(Na-metabisulfite)를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 회전 증발기 상에서 THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(50 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×15 ml), NaHCO₃(2 ×25 ml), 물(2 ×25 ml) 및 염수(2 ×25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 백색 고체로서의 195 mg(47%)의 화합물(54)을 수득하였다: mp 82-84℃;¹H NMR (CDC1₃) δ 1.44 (s, 9H), 4.11 (s, 3H), 4.09-4.18 (m, lH), 4.43-4.51 (m, 2H), 4.98-5.05(m, 4H), 5.72 (bs, 1H), 6.78-6.82 (m, Jo=9.0 Hz, 2H) 7.26-7.33 (m, 10H), 7.36-7.41 (m, Jo=9.0 Hz, 2H), 8.41 (bs, lH);¹³C (CDCl₃) δ 28.26, 55.45, 66.93, 67.00, 69.76, 69.83, 69.90, 77.20, 80.91, 114.11, 121.75, 128.06, 128.12, 128.64, 128.72, 128.73, 130.38, 135.28, 135.42, 156.62, 166.75;³¹P NMR (CDCl₃) δ 16.72 (1P); IR (KBr) 3337, 2969, 1716, 1689, 1665, 1514, 1457, 1304, 1245, 999 cm^-1; C₁₉H₃₅N₂O₈P에 대한 원소 분석 이론치: C, 61.05; H, 6.18; N, 4.91. C₁₉H₃₅N₂O₈P에 대한 원소 분석 실측치: C, 60.80; H, 6.20; N, 4.88.

실시예 5 - 화합물 55-59의 합성

화합물 55: 2-아미노-3-(노닐아미노)-3-옥소프로필 2수소 포스페이트

EtOH(15 ml) 중의 화합물(50)(100 mg, 0.165 mmol) 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 50 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 백색 분말로서의 48 mg(90%)의 화합물(55)을 수득하였다: mp 196-198 ℃;¹H NMR (CF₃COOD) δ 0.81-0.82 (m, 3H), 1.26-1.30 (m, 14H), 1.59 (m, 2H), 3.37-3.38 (m, 2H), 4.54-4.59 (m, lH), 4.72-4.81 (m, 2H);¹³C NMR (CF₃COOD) δ l4.66, 24.39, 28.60, 28.60, 30.46, 30.94, 31.16, 31.30,31.39, 33.81, 43.53, 57.21, 66.42, 167.86; MS m/z 323 (M-H); IR (KBr) 3314, 2920, 2853, 1670, 1575, 1477, 1246, 1063, 1043 cm^-1; C1₃H₂₉N₂O₅P·0.5CH₃OH에 대한 원소 분석 이론치: C, 47.64; H, 9.18; N, 8.23. C1₃H₂₉N₂O₅P·0.5CH₃OH에 대한 원소 분석 실측치: C, 47.24; H,8.84; N, 8.02.

화합물 56: 2-아미노-3-(노닐아미노)-3-옥소프로필 2수소 포스페이트

EtOH(15 ml) 중의 화합물(51)(145 mg, 0.219 mmol) 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 45 psi에서 3시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 3시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 백색 분말로서의 75 mg(90%)의 화합물(56)을 수득하였다: mp 189-190 ℃;¹H NMR (CF₃COOD) δ 0.81 (bs, 3H), 1.24 (s, 23H), 1.57 (m, 2H), 3.37 (m, 2H),4.54-4.58 (m, 1H), 4.73-4.78 (m, 2H);¹³C NMR (CF₃COOD) δ 14.43, 24.16, 28.34, 30.21, 30.69, 31.01, 31.17, 31.22, 31.27, 33.62, 43.27, 56.96, 66.16, 167.60;³¹P NMR (CF₃COOD) δ 17.93 (1P); MS m/z 379 (M-H); IR (KBr) 3318, 2923, 2852, 1671, 1657, 1563, 1475, 1242, 1055 cm^-1; C₁₇H₃₇N₂O₅P에 대한 원소 분석 이론치: C, 53.67; H, 9.80; N, 7.36. C₁₇H₃₇N₂O₅P에 대한 원소 분석 실측치: C, 53.40; H, 9.73; N, 7.31.

화합물 56a: 2-(아세틸아미노)-3-옥소-3-(테트라데실아미노)프로필 2수소 포스페이트

0.5 ml의 피리딘 중의 화합물(56)(20 mg, 0.052 mmol) 샘플에 과량의 무수 아세트산을 첨가하였다. 실온에서 밤새도록 혼합물을 교반하였다. 회전 증발기 상에서 과량의 피리딘 및 무수 아세트산을 배치시켰다. 생성되는 혼합물을 20 ml의 수성 HCl로 교반하였다. EtOAc(2 ×25 ml)로 산성 혼합물을 추출하였다. EtOAc층을 물(2 ×25 ml)과 EtOAc(2 ×25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 여과하였다. 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 점착성(gummy) 고체로서의 15 mg(71%)의 화합물(56a)을 수득하였다:¹HNMR (CD₃OD), δ0.89 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.27 (s, 22H), 1.99-2.02(m, 3H), 3.15-3.20 (m, 2H), 4.104.28 (m, 2H), 4.54-4.62 (m, lH);¹³C NMR (CDCl₃/CD₃OD) 13.48, 16.19, 22.23, 26.50, 28.91, 29.21, 31.48; 30.21, 31.01, 31.17, 31.22, 31.27, 33.62, 43.27, 56.96, 66.16, 163.02, 174.96; IR (KBr) 3316, 2923, 2853, 1671, 1657, 1560, 1467, 1247, 1059 cm^-1.

화합물 57: 2-아미노-3-(옥타데실아미노)-3-옥소프로필 2수소 포스페이트

EtOH(15 ml) 중의 화합물(52)(117 mg, 0.164 mmol) 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 50 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 백색 분말로서의 70 mg(98%)의 화합물(57)을 수득하였다: mp 190-192 ℃;¹H NMR (CF₃COOD) δ 0.81 (t, J=6.9 Hz, 3H), 1.25 (s, 31H), 1.58 (m, 2H),3.34-3.44 (m, 2H), 4.49-4.59 (m, 1H), 4.71-4.81 (m, 2H);¹³C NMR (CF₃COOD) δ 14.70, 24.43, 28.60, 30.46, 30.95, 31.28, 31.31, 31.44, 31.48, 31.55, 33.89, 43.53, 57.12, 57.21, 66.35, 167.85; MS m/z 435 (M-H); IR (KBr) 3325, 2922, 2852; 1674, 1655, 1560, 1472, 1045 cm^-1; C₂₁H₄₅N₂O₅P에 대한 원소 분석 이론치: C, 57.77; H, 10.39; N, 6.42. C₂₁H₄₅N₂O₅P에 대한 원소 분석 실측치: C, 57.61; H, 10.22; N, 6.25.

화합물 58: 2-아미노-3-옥소-3-[4-(테트라데실옥시)아닐리노]프로필 2수소 포스페이트

EtOH(15 ml) 중의 화합물(53)(40 mg, 0.054 mmol) 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 50 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 백색 분말로서의 22 mg(88%)의 화합물(58)을 수득하였다: mp 187-190 ℃;¹H NMR (CF₃COOD) δ 0.80-0.82 (m, 3H), 1.25 (m, 20H), 1.77-1.84 (m, 2H), 4.20 (t, J=6.0 Hz, 2H), 4.64-4.74 (m, IH), 4.90-4.91 (m, 2H), 7.04-7.0.7 (d, Jo=9.0 Hz, 2H), 7.32-7.35 (d, Jo=9.0 Hz, 2H);¹³C NMR(CF₃COOD) δ 14.81, 24.54, 27.57, 30.62, 31.19, 31.38, 31.46, 31.52, 31.60, 31.65, 33.99, 57.70, 66.53, 73.66, 119.32, 126.55, 131.25, 158.87, 167.06; MS m/z 471 (M-H);IR (KBr) 3325, 2923, 2852, 1665, 1553, 1515, 1469, 1240, 1046 cm^-1; C₂₃H₄₁N₂O₆P·0.5CH₃OH·0.5CHCl₃에 대한 원소 분석 이론치: C, 52.58; H, 8.00; N, 5.11. C₂₃H₄₁N₂O₆P·0.5CH₃OH·0.5CHCl₃에 대한 원소 분석 실측치: C, 52.89; H, 7.83; N, 5.29.

화합물 59: 2-아미노-3-(4-메톡시아닐리노)-3-옥소프로필 2수소 포스페이트

EtOH(15 ml) 중의 화합물(54)(125 mg, 0.219 mmol) 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 45 psi에서 2시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 2시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 백색 분말로서의 82 mg(96%)의 화합물(59)을 수득하였다: mp 199-202 ℃;¹H NMR (CF₃COOD) δ 3.93 (s, 3H), 4.65-4.75 (m, lH), 4.88-4.94 (m, 2H), 7.01-7.04 (d, Jo=9.0 Hz, 2H), 7.31-7.34 (d, Jo=9.0 Hz, 2H);¹³C NMR (CDC1₃) δ 57.60, 58.00, 66.54, 117.69, 126.64, 131.07, 159.62, 167.07; MS m/z 289 (M-H); IR (KBr) 3317, 2961, 1680, 1565, 1515, 1478, 1236, 1045 cm^-1; C₁₀H₁₅N₂O₆P에 대한 원소 분석 이론치: C, 41.39; H, 5.21; N, 9.65.C₁₀H₁₅N₂O₆P에 대한 원소 분석 실측치: C, 41.25; H, 5.35; N, 9.73.

실시예 6 -화합물 63-65의 합성

사용되는 유리 기구를 불꽃 건조시키고, 아르곤 대기 하에서 실온으로 냉각시켰다. 출발 물질인 알콜을 무수 피리딘으로 세척하고(3회), 고진공 상에사 48시간 동안 건조시켰다. 아르곤 대기 내에서 반응을 수행하였다. THF 및 CH₂Cl₂는 사용하기 이전에 새로 증류하였다.

화합물 63: 1,2-(3-옥타데실옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 dl-바틸 알콜(화합물 60, 225 mg, 0.652 mmol)에 1H-테트라졸(229 mg, 3.26 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(50 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(1.12 mg, 3.26 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×25 ml), NaHCO₃(2 ×30 ml), 물(2 ×30 ml) 및 염수(2 ×30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 303 mg(53%)의 화합물(63)을 수득하였다:¹H NMR (CDC1₃) δ 0.86 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.24 (bm, 28H), 1.33-1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 3.29-3.36 (m, 2H), 3.48-3.50 (d, J=5.2 Hz, 2H), 4.04-4.22 (m, 2H), 4.60 (m, lH), 5.00 (m, 8H), 7.27-7.33 (m, 20H);¹³C (CDCl₃) δ 14.05, 18.96, 22.62, 25.95, 29.29, 29.41, 29.49, 29.53, 29.59, 29.63, 31.85, 46.48, 66.58, 69.20, 69.23, 69.28, 69.36, 71.75, 75.37, 127.76, 127.82, 127.86, 127.88, 127.94, 128.36, 128.45, 128.49, 128.61, 128.62, 135.46, 135.54, 135.59, 135.65, 135.68, 135.75, 135.79; MS m/z 866 (M+H)⁺.

화합물 64: 1,2-(3-도데실옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 dl-3-O-n-도데실-1,2-프로판디올(화합물 61, 400 mg, 1.5 mmol)에 1H-테트라졸(645 mg, 9.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(40 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(3.18 mg, 9.2 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을급랭시켰다. 감압 하에서 THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(80 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×35 ml), NaHCO₃(2 ×40 ml), 물(2 ×30 ml) 및 염수(2 ×30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 100 mg(<10%)의 화합물(64)을 수득하였다:¹H NMR (CDC1₃) δ 0.86 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.23 (bm, 18H), 1.46 (m, 2H), 3.13-3.36 (m, 2H), 3.49-3.51 (d, J=5.2 Hz, 2H), 4.03-4.23 (m, 2H), 4.59 (m, 1H), 5.01 (m, 8H), 7.26-7.34 (m, 20H);¹³C (CDC1₃) δ 14.11, 22.68, 26.01, 29.35, 29.47, 29.54, 29.59, 29.63, 29.66, 31.91, 69.01, 69.06, 69.26, 69.30, 69.34, 69.42, 69.62, 71.83, 77.21, 127.83, 127.89, 127.94, 127.95, 128.44, 128.52, 128.56, 135.64, 135.74, 135.85; IR(NaC1, neat) 3427, 1276, 1000,885, 499 cm-1; MS m/z 781 (M+H)⁺, m/z 803 (M+Na)⁺.

화합물 65: 1,2-(3-헥사데실옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 dl-3-O-n-헥사데실-1,2-프로판디올(화합물 62, 500 mg, 1.57 mmol)에 1H-테트라졸(664 mg, 9.47 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF/CH₂Cl₂(50 ml)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(3.27 mg, 9.47 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 및 CH₂Cl₂를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(80 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×35 ml), NaHCO₃(2 ×40 ml), 물(2 ×30 ml) 및 염수(2 ×30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 205 mg(15%)의 화합물(65)을 수득하였다:¹H NMR (CDC1₃) δ 0.87 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.25 (bm, 26H), 1.46 (m, 2H), 3.30-3.42 (m, 2H), 3.49-3.51 (d, J=5.2 Hz, 2H), 3.97-4.23 (m, 2H), 4.60 (m, lH), 5.01 (m, 8H), 7.26-7.35 (m, 20H);¹³C NMR(CDCl₃)δ 14.11, 22.68, 26.00, 29.35, 29.47, 29.54, 29.59: 29.64, 29.68, 3l.91, 69.00, 69.06, 69.26, 69.29, 69.34, 69.41, 71.82, 71.74, 75.52, 75.60, 77.20, 126.97, 127.82, 127.88, 127.93, 127.95, 127.99,128.43, 128.51, 128.55, 128.60, 135.63, 135.73, 135.79, 135.83; IR(NaCl, neat) 3423, 1269, 1016, 736, cm^-1; MS m/z 837 (M+H)⁺, m/z 859 (M+Na)⁺.

실시예 7 -화합물 66-68의 합성

화합물 66: 1,2-(3-옥타데실옥시프로판)-비스(2수소 포스페이트)

EtOH(15 ml) 중의 화합물(63)(135 mg, 0.156 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)를 첨가하였다. 60 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 투명한 왁스로서의 70 mg(89%)의 화합물(66)을 수득하였다:¹H NMR (CD₃OD) δ 0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 30H), 1.55 (m, 2H), 3.45-3.50 (m, 2H), 3.62-3.64 (m, 2H), 4.00-4.16 (m, 2H), 4.47 (m, lH);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.43, 19.30, 23.73, 27.20, 30.47, 30.64, 30.78, 33.07, 72.80; MS m/z 503 (M-H); IR(NaCl Neat) 1011 cm^-1.

화합물 67: 1,2-(3-도데실옥시프로판)-비스(2수소 포스페이트)

EtOH(15 ml) 중의 화합물(64)(70 mg, 0.089 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)를 첨가하였다. 60 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 투명한 왁스로서의 35 mg(94%)의 화합물(67)을 수득하였다:¹H NMR (CD₃OD) δ 0.79 (t, J=6.7 Hz, 3H), 1.90 (s, 18H), 1.46 (m, 2H), 3.34-3.41 (m, 2H), 3.49-3.73 (m, 2H), 3.78-4.05 (m, 2H), 4.47 (m, lH);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.43, 23.71, 23.74, 27.20, 30.49, 30.64, 30.76, 30.81, 33.08, 66.80, 72.79; MS m/z 4l9 (M-H); IR(NaCl Neat) 1008 cm^-1.

화합물 68: 1,2-(3-헥사데실옥시프로판)-비스(2수소 포스페이트)

EtOH(15 ml) 중의 화합물(65)(138 mg, 0.164 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)를 첨가하였다. 60 psi에서 4시간 동안 수소화 반응을 수행하였다. 4시간 후, TLC로 반응의 완결을 검측하고, 셀라이트를 통해 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 용출액을 농축시킴으로써, 투명한 왁스로서의 75 mg(96%)의 화합물(68)을 수득하였다:¹H NMR (CD₃OD) δ 0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 23H), 1.56 (m, 2H), 3.43-3.50 (m, 2H), 3.58-3.65 (m, 2H), 3.89-4.16 (m, 2H), 4.47 (m, lH);¹³C NMR (CD₃OD) δ 14.44, 23.74, 27.20, 30.48, 30.64, 30.80, 33.08, 72.80; MS m/z 475 (M-H); IR(NaCl, Neat) 1011 cm^-1.

실시예 8 -중간체 화합물 77-84의 합성

사용되는 유리 기구를 불꽃 건조시키고, 아르곤 대기 하에서 실온으로 냉각시켰다. 출발 물질인 알콜을 무수 피리딘으로 세척하고(3회), 고진공 상에서 48시간 동안 건조시켰다. 아르곤 대기 내에서 반응을 수행하였다. THF 및 CH₂Cl₂는 사용하기 이전에 새로 증류하였다.

화합물 77: 1,2-(3-테트라데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노미리스틴(화합물 69, 800 mg, 2.6 mmol)에 1H-테트라졸(1.01 g, 14.5 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(45 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(5.02 mg, 14.5 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×75 ml), 물(2 ×50 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 600 mg(28%)의 화합물(77)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.25 (bm, 20H), 1.53 (m, 2H), 2.17-2.32 (m, 2H), 3.96 -4.24 (m, 4H), 4.61-4.70 (m, 1H), 4.99-5.08 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);¹³C (CDCl₃)δ 14.10, 22.67, 24.70, 29.08, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.62, 29.66, 31.90, 33.86, 64.24, 65.82, 69.41, 69.46, 69.48, 69.53, 69.57, 77.20, 127.85, l27.91, 127.98, 127.99, 128.04, 128.57, 128.59, 128.70, 128.71 135.50, 135.59, 173.09; IR(NaC1, Neat) 3422, 1742, 1457, 1274, 1035, 1001 cm-1; MS m/z 8823 (M+H)⁺, m/z 845 (M+Na)⁺.

화합물 78: 1,2-(3-펜타데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노펜타데카노인(화합물 70, 800 mg, 2.5 mmol)에 1H-테트라졸(970 mg, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(45 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (4.80 mg, 13.9 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×100 ml), 물(2 ×50 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 741 mg(35%)의 화합물(78)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.25 (bm, 22H), 1.53 (m, 2H), 2.17-2.32 (m, 2H), 3.95-4.24 (m, 4H), 4.61 -4.70 (m, lH), 4.99-5.07 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);¹³C NMR(CDCl₃) δ 14.09, 22.66, 24.69, 29.08, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.62, 29.65, 31.89, 33.85, 64.23, 65.86, 69.40, 69.46, 69.48, 69.53, 69.56, 77.20, 127.84, 127.90, 127.97, 127.98, 128.03, 128.56, 128.59, 128.69, 128.71 135.50, 135.59, 173.09; IR(NaC1, Neat) 3421, 1742, 1457, 1275, 1035, 1014, 1001 cm^-1; MS m/z 837 (M+H)⁺, m/z 859 (M+Na)⁺.

화합물 79: 1,2-(3-헥사데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노팔미틴(화합물 71, 800 mg, 2.4 mmol)에 1H-테트라졸(1.00 g, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(45 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(4.90 mg, 14.2 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml),NaHCO₃(2 ×100 ml), 물(2 ×50 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 786 mg(38%)의 화합물(79)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.25 (bm, 24H), 1.53 (m, 2H), 2.17-2.32 (m, 2H), 3.96-4.24 (m, 4H), 4.61-4.70 (m, lH), 4.99-5.08 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);¹³C NMR(CDCl₃) δ 14.09, 22.66, 24.71, 29.09, 29.23, 29.33, 29.45, 29.60, 29.63, 29.67, 31.90, 33.87, 62.23, 62.30, 65.89, 69.43, 69.48, 69.50, 69.55, 69.58, 77.20, 126.96, 127.85, 127.91, 127.98, 128.04, 128.56, 128.59, 128.64, 128.71 135.52, 135.61, 173.07; IR(NaC1, Neat) 3421, 1742, 1457, 1273, 1035, 1016, 1001 cm^-1; MS m/z 851 (M+H)⁺, m/z 873 (M+Na)⁺.

화합물 80: 1,2-(3-헵타데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노헵타데카노인(화합물 72, 800 mg, 2.32 mmol)에 1H-테트라졸(980 mg, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(40 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (4.81 mg, 13.9 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×100 ml), 물(2 ×50 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 1.48 g(74%)의 화합물(80)을 수득하였다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.87 (t J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 26H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.05 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);¹³C NMR(CDC1₃) δ 14.10, 22.66, 24.69, 29.07, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.63, 29.66, 31.89, 33.84, 62.21, 62.27, 65.85, 69.40, 69.45, 69.47, 69.52, 69.56, 74.04, 74.23, 77.20, l27.83, 127.87, 127.96, 127.97, 128.53, 128.55, l28.57, 128.59, 135.47, 135.56, 173.07; IR(NaC1, Neat) 3483, 1743, 1457, 1281, 1035, 1013, 1000 cm^-1; MS m/z 865 (M+H)⁺, m/z 887(M+Na)⁺.

화합물 81: 1,2-(3-옥타데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노스테아린(화합물 73, 800 mg, 2.2 mmol)에 1H-테트라졸(1.00 g, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된THF(40 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (4.92 mg, 14.2 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×100 ml), 물(2 ×50 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 870 mg(45%)의 화합물(81)을 수득하였다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 28H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 3.97-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, lH), 4.99-5.07 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);¹³C NMR(CDCl₃) δ 14.09, 22.66, 24.69, 29.08, 29.23, 29.33, 29.45, 29.59, 29.63, 29.67, 31.89, 33.85, 62.22, 62.28, 64.23, 65.87, 68.69, 69.23, 69.42, 69.50, 69.54, 69.58, 74.07, 74.25, 127.60, 127.84, 127.90, 127.98, 128.03, 128.54, 128.56, 128.58, 128.60, 128.71, 135.47, 135.57, 173.08; IR (NaCl, Neat) 3421, 1742, 1457, 1273, 1251, 1216, 1035, 1016, 1000 cm^-1; MS m/z879 (M+H)⁺, m/z 901 (M+Na)⁺.

화합물 82: 1,2-(3-노나데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노노나데카노인(화합물 74, 800 mg, 2.1 mmol)에 1H-테트라졸(977 mg, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(40 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (4.81 mg, 13.9 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×125 ml), 물(2 ×75 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 1.47 g(78%)의 화합물(82)을 수득하였다:¹H NMR(CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 30H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, lH), 4.99-5.03 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);¹³C (CDCl₃) δ 14.08, 22.65, 24.67, 29.06, 29.22, 29.32, 29.43, 29.58,29.61, 29.66, 31.88, 33.83, 62.25, 65.84, 69.38, 69.46, 69.51, 69.54, 74.03, 74.10, 74.15, 74.22, 77.20, 127.82, 127.88, 127.96, 128.53, 128.56, 135.45, 135.55, 173.06; IR(NaC1, Neat) 3483, 1743, I457,1273, 1282, 1216, 1035, 1013 cm^-1; MS m/z 893 (M+H)⁺,m/z 915 (M+Na)⁺.

화합물 83: 1,2-(3-이코사노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노아라키딘(화합물 75, 800 mg, 2.06 mmol)에 1H-테트라졸(1.00 g, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(40 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트 (4.81 mg, 13.9 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×125 ml), 물(2 ×75 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 1.39 g(74%)의 화합물(83)을 수득하였다:¹H NMR(CDCl₃)δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 32H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.05 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);¹³C NMR(CDCl₃) δ 14.09, 22.65, 24.69, 29.07, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.63, 29.67, 31.89, 33.84, 62.21, 62.27; 65.86, 69.40, 69.45, 69.48, 69.52, 69.56, 74.05, 74.12, 74.16, 74.24, 77.20, 127.83, 127.89, 127.97, 128.53, 128.55, 128.57, 128.59, 135.47, l35.56, 173.07; IR(NaCl, Neat) 3483, 1743, 1457, 1273, 1282, 12I6, 1035, 1012, 1000 cm^-1; MS m/z 907 (M+H)⁺, m/z 929 (M+Na)⁺.

화합물 84: 1,2-(3-도코사노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)

피리딘으로 세척된 출발 물질인 모노베헤닌(화합물 76, 800 mg, 1.92 mmol)에 1H-테트라졸(1.00 g, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF(40 ml)를 첨가하였다. 10분 후, 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트(5.14 mg, 14.8 mmol)를 첨가하고, 아르곤 대기 하에서 90분 동안 반응물을 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0 ℃(빙조)로 냉각시키고, 과량의 과아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 동안 추가로 교반한 후, Na-메타비설피트를 첨가하여, 과량의 과아세트산을 급랭시켰다. 감압 하에서 THF 를 제거하였다. 농축물을 EtOAc(100 ml)로 처리하고, Na-메타비설피트(2 ×50 ml), NaHCO₃(2 ×125 ml), 물(2 ×75 ml) 및 염수(2 ×50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을Na₂SO₄위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용리하면서, 잔류물의 플래쉬 컬럼 크로맡토그래피를 수행하였다.

적당한 분획물을 모으고, 농축시켜 진공 내에서 건조시킴으로써, 투명한(clear) 오일로서의 1.27 g(71%)의 화합물(84)을 수득하였다:¹H NMR (CDCl₃) δ 0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 36H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, lH), 4.99-5.03 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);¹³C NMR(CDC1₃) δ 14.08, 22.65, 24.68, 29.07, 29.22, 29.32, 29.44, 29.59, 29.62, 29.66, 31.88, 33.84, 62.20, 62.26, 65.85, 69.40, 69.45, 69.48, 69.53, 69.57, 74.05, 74.16, m 74.24, 77.20, 127.83, 127.88, 127.96, 127.97, 128.30, 128.52, 128.54, 128.57, 128.58, 135.46, 135.55, 173.07; MS m/z 935 (M+H)⁺, m/z 957 (M+Na)⁺.

실시예 9 - 화합물 85-92의 합성

화합물 85: 1,2-(3-테트라데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(15 ml) 중77의 용액(385 mg, 0.468 mmol)에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물85를 210 mg(98%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.4Hz, 3H), 1.28(s, 20H), 1.56-1.63(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 3.93-4.42(m, 4H), 4-59(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.44, 23.73, 26.09, 30.71, 30.23, 30.43, 30.47, 30.61, 30.75, 33.07, 34.80, 34.94, 61.90, 61.96, 63.96, 63.70, 66.24, 74.33, 77.51, 175.02; MS m/z 461(M-H)^-;IR(NaCl Neat) 3386, 1702, 1216, 1019 cm^-1.

화합물 86: 1,2-(3-펜타데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(15 ml) 중78의 용액(451 mg, 0.538 mmol)에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물86을 250 mg(97%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.4Hz, 3H), 1.28(s, 22H), 1.58(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 3.97-4.21(m, 4H), 4.38(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.44, 23.74, 26.05, 30.16, 30.36, 30.48, 30.57, 30.76, 33.08, 35.11, 61.36, 63.70, 63.90, 66.24, 67.77, 70.22, 77.33, 77.40, 77.51, 175.63; MS m/z 475(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3380, 1728, 1216, 1031 cm^-1.

화합물 87: 1,2-(3-헥사데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(15 ml) 중79의 용액(561 mg, 0.659 mmol)에 10% Pd/C(610 mg)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물87을 300 mg(92%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.4Hz, 3H), 1.28(s, 24H), 1.56-1.63(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 3.95-4.40(m, 4H), 4.39(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.43, 23.73, 25.89, 26.05, 26.09, 30.15, 30.23, 30.36, 30.44, 30.47, 30.56, 30.61, 30.67, 30.75, 33.07, 34.08, 34.94, 35.11, 61.36, 64.00, 66.22, 67.74, 70.22, 77.33, 77.40, 77.51, 175.03; MS m/z 489(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3357, 1729, 1216, 1029 cm^-1.

화합물 88: 1,2-(3-헵타데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(15 ml) 중80의 용액(636 mg, 0.736 mmol)에 10% Pd/C(724 mg)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물88을 365 mg(98%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.6Hz, 3H), 1.28(s, 26H), 1.56-1.63(m, 2H), 3.96-4.17(m, 4H), 4.22-4.42(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.54, 23.73, 25.90, 26.10, 30.16, 30.24,30.36, 30.43, 30.47, 30.56, 30.61, 30.76, 33.07, 34.81, 34.95, 61.37, 61.92, 63.97, 66.26, 67.70, 67.78, 70.06, 74.42, 77.46, 175.04; MS m/z 503(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3357, 1710, 1216, 1032 cm^-1; 분석·계산치(C₂₀H₄₂O₁₀P₂·1H₂O): C, 45.97; H, 8.49. 실측치: C, 46.32; H, 8.73.

화합물 89: 1,2-(3-옥타데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(15 ml) 중81의 용액(530 mg, 0.603 mmol)에 10% Pd/C(617 mg)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물89를 305 mg(97%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, j=6.3Hz, 3H), 1.28(s, 28H), 1.56-1.61(m, 2H), 2.42-2.38(m, 2H), 3.91-4.17(m, 4H), 4.24-4.42(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.43, 23.74, 25.90, 26.06, 26.10, 30.16, 30.24, 30.36, 30.47, 30.57, 30.61, 30.67, 30.76, 33.08, 34.81, 34.95, 35.11, 61.37, 63.72, 66.26, 67.68, 67.75, 70.25, 77.48, 175.04; MS m/z 517(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3388, 1731, 1216, 1020 cm^-1.

화합물 90: 1,2-(3-노나데카노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(25 ml) 중82의 용액(952 mg, 1.06 mmol)에 10% Pd/C(1.00 g)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물90을 555 mg(98%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6,4 Hz, 3H), 1.27(s, 29H), 1.56-1.63(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 4.06-4.17(m, 2H), 4.22-4.42(m, 2H), 4.59(m, 1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.44, 23.74, 25.90, 26.06, 30.16, 30.24, 30.36, 30.48, 30.57, 30.63, 30.76, 30.79, 33.08, 34.81, 35.12, 63.94, 66.25, 175.03; MS m/z 531(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 1735, 1216, 1012 cm^-1.

화합물 91: 1,2-(3-이코사노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(25 ml) 중83의 용액(711 mg, 0.784 mmol)에 10% Pd/C(813 mg)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물91을 419 mg(91%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.4Hz 3H), 1.28(s, 32H), 1.58(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 3.95-4.42(m, 4H), 4.58(m,1H);¹³C NMR(CD₃OD) δ14.44, 23.74, 25.90, 26.06, 30.16, 30.24, 30.36, 30.48, 30.57, 30.63, 30.67, 30.76, 33.08, 34.81, 35.11, 61.37, 61.98, 66.26, 67.69, 67.77, 77.42, 175.03; MS m/z 545(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3418, 1735, 1261,1019 cm^-1.

화합물 92: 1,2-(3-도코사노일옥시프로판)-비스(디하이드로젼포스페이트)

EtOH(25 ml) 중84의 용액(451 mg, 0.538 mmol)에 10% Pd/C(710 mg)을 첨가하였다. 수소첨가 반응은 60 psi에서 4시간 동안 수행되었다. 4시간 후, TLC에 의해 반응 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과한 후, 용출액을 감압하에 농축시켜 백색 왁스로서 화합물92를 400 mg(98%) 얻었다:¹H NMR(CD₃OD) δ0.89(t, J=6.3Hz, 3H), 1.27(s, 36H), 1.58(m, 2H), 2.24-2.38(m, 2H), 3.98-4.42(m, 4H), 4.59(m, 1H);¹³C NMR(CDCl₃/CD₃OD) δ13.72, 22.40, 24.71, 28.84, 28.97, 29.08, 29.18, 29.41, 31.65, 34.1660.15, 60.99, 62.42, 63.17, 65.16, 65.30, 65.98, 73.24, 173,79; MS m/z 573(M-H)^-; IR(NaCl Neat) 3431, 1739, 1254, 1177 cm^-1.

실시예 10 - 제노푸스 난모세포 분석

내인적으로 PSP24 PLGFR을 발현하는제노푸스난모세포를 사용하여, 새로이 설계되고 합성된 화합물들을 LPA 저해 활성에 대하여 선별하였다.

난모세포는 무균 조건하에서 크실라진으로 마취시킨 성체제노푸스(Xenopus laevis)로부터 얻어, 실험용으로 제조하였다. V-VI 단계의 난모세포를 Ca²⁺가 없는 난소 링거-2 용액((OR-2) 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH7.5, NaOH 함유함) 중에서 1.4 mg/ml로 콜라게나아제 A형 처리(Boehringer, IN)하여 여포 세포층을 박리시켰다. 난모세포를 17-20℃의 인큐베이터 내에서 바스액(Barth's solution) 중에 유지시켰고, 분리 후 2-7일동안 사용하였다.

전기생리학적 기록은 -60 mV의 막 전위를 유지하는 표준 2 전극-전압-클램프 증폭기(GeneClamp 500, Axon Instruments, Ca)를 사용하여 수행하였다. 시험 화합물을 MeOH 중에 용해시키고, 지방산이 없는 BSA로 복합체화한 후, 개구리 Na⁺-링거액(120 nM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES; pH 7)으로 희석하였고, 이것을 난모세포에 5 ml/분의 유속으로 수퍼퓨전(superfusion)에 의해 제공하였다. 막 전류는 NIC-310 디지탈 오실로스코프(Nicolet, Madison, WI)를 사용하여 기록하였다. 15분(최소)의 간격으로 적용하여, 적절한 세출(washout) 및 탈감작으로부터 복구(회복)가 이루어지도록 하였다.

도 21-27은 화합물56,57,66및92이 LPA에 의해 유도된 클로라이드 전류를 용량-의존적으로 저해함을 나타낸다.

화합물36은 비-인산화 유도체 가운데 가장 우수한 저해제였다. 화합물36을 세포내 주사하여 이것의 저해 효과가 세포 표면에 대한 작용의 결과인지 또는 저해가 세포내 작용의 결과인지 여부를 알고자 할 때,36의 세포내 적용은 작용 부위에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않았다. 따라서, 유리 하이드록시 화합물(35-43)과는 별도로, 세포 표면상에서 상호작용하고 세포내로 침투하지 않는 인산화 화합물(55-59)을 합성하였다.

화합물56, 57, 66및92는제노푸스난모세포 내에서 LPA에 의해 유도된 클로라이드 전류에 대한 저해제이다. 화합물56, 57, 66및92는 용량 의존적인 방식으로 LPA의 작용을 차단할 수 있었다. 더욱이,제노푸스난모세포를 세척하면 LPA 반응이 완벽히 복구되었는데, 이 실험은 화합물56, 57, 66, 92가 LPA에 의해 유도된 클로라이드 전류를 가역적으로 저해할 수 있었다는 것을 의미한다. 5 μ M의 화합물66은제노푸스난모세포에서의 LPA 효과를 완전히 제거하였고, 약 1.2 μ M의 IC₅₀을 가졌다(도 23 및 24). 또한,66을 세포내로 미세주입한 후(화살표, 도 23B), LPA(10 nM)를 세포외 적용시켰을 때, 이것은 LPA 반응을 저해하지 못했는데, 이 실험은 화합물66의 저해 작용이 세포외적 특성이라는 것을 암시한다.

화합물35, 및37-43을제노푸스난모세포에 대하여 시험하였으나, 그 결과는 결정적이지 못했다. 1 μ M의 화합물55는 약한 저해를 나타내었다(2 nM LPA에 대하여 38%). SAP 시리즈에 있어서, 화합물58및59는제노푸스난모세포 분석에서 시험되어야 한다. 비스포스페이트 시리즈에 있어서, 화합물89는 LPA에 의해 유도된 반응을 저해하였다(2 nM LPA에 대하여 59%). 그러나, 화합물67(역치 ∼1 μ M),68(역치 ∼10 nM) 및85(역치 ∼ 100 nM)는 단독으로 반응을 일으킬 수 있었고, 화합물86,87, 88, 90및91은 평가되어야 한다. 화합물56a를 설계하고 합성하여 유리 아미노기의 중요성을 시험하였다.56a를제노푸스난모세포 분석에서 평가할 때, `LPA와 함께 사용되는 경우 LPA의 반응을 증강시켰다. 화합물56a는 2 μ M에서는 반응을 일으키지 않았지만(도시하지 않음), 10 μ M에서56a는 반응을 일으킬 수 있었는데, 이 실험은 유리 아미노기가 저해 활성에 필수적이라는 것을 암시한다.

실시예 11 - HEY 난소 세포 이동

두개의 LPA 수용체인 EDG-2 및 EDG-7은 HEY 난소 암 세포 중에서 발현되는 것으로 알려져 있어서, LPA에 의해 유도된 세포 이동성을 저해하는 능력에 대하여 화합물56,56a, 및66을 평가하였다(화합물 농도: 0.1 μ M의 LPA 농도에 대하여 1 μ M).

HEY 난소 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FBS, Hyclone)으로 보충한 2 mM L-글루타민(GIBCO BRL)을 함유한 RPMI 1640 배지에 유지시켰다. 모든 세포를 이틀간 융합물(confluency)으로 성장시킴으로써, 동시에 G_0`/G₁단계로 이르게 하였다. 세포를 재플레이트하고, 세포가 플라스크상에서 약 50 내지 60% 융합되었을 때 실험용으로 수집하였다. 세포를 플라스크로부터 제거한 후, 이들을 37℃의 PBS 내에서 0.53 mM EDTA에 5분간 노출시켰다. EDTA를 동용적의 RPMI 1640 + 2 mM L-글루타민 및 10% FBS로 중화하였다. 세포를 실온에서 800 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 수집된 세포를 2 mM L-글루타민 배지를 함유한 RPMI 1640로 2회 세척하고, 1 x 10⁶세포수/ml의 농도로 재현탁시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 두었다.

개질된 정량적 세포 이동 분석(Cat. #ECM500, Chemicon, Temecula, Ca)을 사용하여 세포 이동성을 시험하였다. 케미콘 챔버 멤브레인은 피브로넥톤을 함유한 직경 8 마이크론의 세공으로 피복되어 있었다. 저해제(1 μM)를 포함하거나 포함하지 않는 400 ㎕ RPMI/2 mM L-글루타민을 하부 챔버내로 피펫팅하였다. RPMI 1640/2 mM L-글루타민 중 약 5 x 10⁴세포를 상부 챔버에 첨가하였다. 삽입물을 가진 24-웰 플레이트를 5% CO₂인큐베이터 내에서 37℃로 4시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 말기에, 챔버를 새로운 24-웰 플레이트로 이동시키고, 내부 챔버상의 세포를 탈지면으로 수차례 제거하고, 제조된 셀 스테인 솔루션 내에 실온에서 30분간 두었다. 항온처리의 말기에, 셀 스테인 솔루션을 웰로부터 제거하였다. 챔버를 웰당 1 ml PBS로 3회 세척하였다. 최종 PBS 세척 후, 적절한 세포 형태를 확인하기 위하여 챔버를 검사하였고, 역상 현미경을 사용하여 부착 세포를 계수하였다.

새로이 합성된 화합물이 LPA에 의해 유도된 HEY 난소 암 세포의 이동에 미치는 효과는 도 27에 제시되어 있다. 화합물66은 LPA에 의해 유도된 세포 이동성을 약 70% 저해하였지만, 화합물55(경계면) 및56a는 LPA에 의해 유도된 세포 이동성을 증강시켰다.

실시예 12 - 화합물 세포독성

임 등(2000) 및 RT-PCR 데이타는 전립선 암 세포주 DU-145, PC-3 및 LNCaP에서 PLGFR의 존재를 보여주었다.제노푸스난모세포에서 기대되는 저해 활성 및 세포 이동성 분석에 기인하여, DU-145, PC-3 및 LNCaP 전립선 암 세포주에 대하여 다수의 화합물이 미치는 성장 저해 효과를 검사하였다.

DU-145, PC-3 및 LNCaP 세포를 150 cm²플라스크(10% 태아 송아지 혈청(FBS)으로 보충한 둘베코의 개질 이글 배지 또는 RPMI-1640을 함유함)에서 증식시켰다.트립신을 사용하여 모액 플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하여, 새로운 배지 중에 재현탁시키고, 96-웰 배양 플레이트 중에 약 2,000 세포수/웰의 밀도로 플레이트하였다. 최종 약물 농도는 0.05 내지 10 또는 50 μ M이었다. 약물이 첨가되지 않은(음성 대조군), 그리고 5-플루오로우라실이 첨가된(양성 대조군) 대조군 실험을 병렬적으로 수행하였다. 48시간에서 배지를 제거하고, 교체하여 실험 과정에서 약물 열화(劣化)에 의한 영향을 최소화하였다. 96 시간의 약물 노출 후, 저온의 50% 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리함으로써 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 설포로다민 B(SRB)로 염색하고, 세포수 대 흡광도의 표준 곡선과 비교하는 등의 방식으로 540 nm에서의 흡광도를 비교함으로써 세포수를 측정하였다. 실험은 2회 수행되었다. 대조군(미처리 웰)의 백분율로서의 세포수를 약물 농도에 대하여 플롯하고, 세포의 성장을 50%로 저해하는 농도(IC₅₀)를 비선형 회귀법에 의해 결정하였다(WinNonlin, Pharsight Corporation).

전립선 암 세포주 DU-145, PC-3, 및 LNCaP 상에서, 기준 화합물 5F-우라실, LPA(18:1), SPH(13:0), SPP(13:0) 및 N-팔미토일 L-세린 인산(15:0)과 함께 수행된 세포독성 연구를 하기 표 3에서 제시한다.

[표 3]

합성된 화합물이 전립선 암 세포주에 대하여 미치는 세포독성

^x대조군(미처리 웰)의 백분율로서의 세포수를 약물 농도에 대하여 플롯하고, 세포의 성장을 50%로 저해하는 농도(IC₅₀)를 비선형 회귀법에 의해 결정하였다(WinNonlin, Pharsight Corporation).

WA = 약한 활성; NA = 활성 없음; ? = 최대 저해는 50%임.

화합물55,56,56a,66및85는 일정 범위의 성장 저해 활성을 나타내었다.화합물56은 5-플루오로우라실에 비해 더욱 강력한 DU-145 및 PC-3 세포 성장 저해제였다. 흥미롭게도,56a는 DU-145 세포의 성장을 선택적으로 저해하였지만, PC-3 세포에 대해서는 그다지 효능을 가지지 못했고; 화합물55는 DU-145 및 PC-3 세포에 비해 LNCaP 세포 성장의 보다 강력한 저해제였다. 화합물66은 LNCaP 세포 성장을 선택적으로 저해하였지만, PC-3 및 LNCaP 세포에 대해서는 활성을 보이지 않았다. 화합물85는 비스포스페이트(sn-1-아실) 가운데 가장 활성이 큰 것이었다.

실시예 1-12에 대한 논의

3개 세트의 화합물을 특이적으로 합성하고, 분석하였다(35-43, 55-59, 66-68및85-92). 제1 및 제2 세트는 합성 저해제인 N-팔미토일 L-세린 인산을 가진 내인성 저해제인 SPH 및 SPP의 아말감화를 포함한 반면, 제3 시리즈는 비스포스페이트를 포함하였다. 화합물56,57,66및92는제노푸스난모세포 내에서 LPA에 의해 유도된 클로라이드 전류에 대한 저해제였다. 또한, (sn-1) 위치에 더 짧은 길이의 쇄를 가진 비스포스페이트는제노푸스난모세포에서 클로라이드의 전류를 유도할 수 있었다[67(역치 ∼ 1 μ M),68(역치 ∼ 10 nM) 및85(역치 ∼ 100 nM)]. 화합물66은 HEY 난소 암 세포주에서 LPA에 의해 유도된 세포 이동성을 저해하는 것으로 나타났다. DU-145, PC-3 및 LNCaP 전립선 암 세포주에 대한 상기 합성 화합물의 성장 저해 효과를 평가한 결과, 3가지의 매우 강력하고 선택적인 화합물(56, 56a, 66)이 발견되었다.

상기 데이타(표 3)는 첫째, 포스페이트가 없고 알코올을 포함하는 화합물이 활성이 더 작고(27vs.56), 둘째 보호된 포스페이트 부분을 가진 화합물이 활성이더 작으며(51vs.56), 셋째 아민의 알킬화는 활성을 감소시키지 아니하고(56a), 넷째 가장 강력한 비스포스페이트는sn-1 위치에 에테르 결합을 가지며, 다섯째 SAP 시리즈에서 쇄의 길이가 짧아지면(55대56), DU-145 및 PC-3에 대한 효능이 감소되고(그러나, 이것은 LNCaP 세포에 대해서는 더욱 강력하였음), 여섯째 비스포스페이트(sn-1 알킬) 화합물에 있어서 쇄의 길이가 짧아지면 효능이 감소되었지만, LNCaP 세포에 대한 선택성은 그대로였고, 일곱째sn-1 위치에서의 치환(아실 vs. 알킬)은 효능을 증가시키지 않았다는 것을 나타낸다. 이들 분자에 대한 표적 부위는 세포막(예를 들어, 세포막 신장 수용체)상일 것 같은데, 그 이유는 (활성 수송 시스템이 존재할 가능성이 있기는 하지만) 극성 포스페이트 유도체가 세포막을 쉽게 가로지를 것 같지 않기 때문이다. 이들 결과는 PLGFR의, 또는 다운스트림 신호 전달 과정에서의 차이가 전립선 암 세포에서 이들 화합물의 성장 저해 특성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있음을 암시한다.

실시예 13 - Edg-2, Edg-4 및 Edg-7을 발현하는 안정한 세포주의 제조 및 특성 규명

Edg-2, -4 및 -7 수용체에 대한 선택적인 안타고니스트를 개발하기 위하여, 가능성 있는 화합물을 선별하기 위한 시스템을 먼저 확립하였다. RH7777 세포는 다양한 세포 분석에서 LPA에 비반응성인 것으로 보고되었고, 임의의 공지된 Edg 수용체에 대한 mRNA가 결손된 것으로 알려져 있었기 때문에, 이를 모델 시스템으로서 선택하였다(Fukushima et al., 1998). EDG 수용체로 세포감염시킨 안정한 세포주 및 비어있는 벡터로 세포감염시킨 대조군 세포주를 RH7777 세포내에 확립시켰다.

세포내 Ca²⁺과도 상태(transient)를 모니터링함으로써, 그리고 RT-PCR에 의해, 생성된 클론을 선별하였다. 이 선별 방법을 사용하여 Edg-2 및 -7을 발현하는 3개 이상의 양성 세포주를 동정하였으나, Edg-4를 발현하는 양성 세포주는 동정할 수 없었다. 벡터로 세포감염된 세포는 또한 LPA에 비반응성인 것으로 나타났다. Edg-4를 발현하는 안정한 클론이 분리되었지만, Edg-4의 일시적인 발현 결과, LPA가 매개하는, 세포내 Ca²⁺과도 상태의 활성화가 일어났는데, 이것은 구조체가 이들 세포내에서 기능적으로 활성임을 증명하였다. 이 실험에 사용된 안정한 Edg-4 세포주가 임 등(친절하게 우리에게 그 클론을 제공하였음)에 의해 분리되고, 특성 규명되었다(Im et al., 2000).

가능성있는 안타고니스트를 선별하기 위한 적합한 분석법을 동정하기 위하여, 세포주를 추가로 규명하였다. LPA에 의해 유도된 ERK 1/2의 활성화는 Edg-2 및 Edg-4 발현 세포에서 나타났지만, ERK 1/2는 Edg-7 발현 세포에서는 활성화되지 않았다. LPA는 Edg-2, -4, 및 -7을 발현하는 안정한 세포주에서 Ca²⁺과도 상태를 일으켰다. 용량 응답 곡선은 Edg-2, -4 및 -7 발현 세포에 대하여 각각 378±53, 998±67 및 214±26 nM의 EC₅₀수치를 나타내었다(도 28A-C). 안정한 Edg-4 클론내에서 측정된 EC₅₀수치가 이전에 보고된 것과 상이하였기 때문에, 또한 Edg-4를 일시적으로 발현하는 세포에 대하여 용량 응답 곡선을 확립하였고(도 28B, 안 등, 1998a; 안 등, 1998b), 이것은 186±39의 EC₅₀수치를 산출하였다.

안정한 세포주에서 DNA 합성을 자극하는 LPA의 능력은³H-티미딘 혼입을 측정함으로써 검사하였다. 야생형, 그리고 벡터로 세포감염된 RH7777 둘다는 10 μ M LPA로 24시간 항온처리한 후에³H-티미딘 혼입을 증가시키는 것으로 나타나지 않았고, 이것은 이들 세포에서 LPA가 유사분열원성이라는 이전의 보고와 상반된다. Edg-2 발현 세포는³H-티미딘 혼입에서 1.8배 증가를 나타낸 반면에, Edg-4 및 -7 발현 세포는 대조 세포에 비해³H-티미딘 혼입의 증가를 나타내지 않았다.

실시예 14 - Edg-2 및 Edg-7 수용체에 대한 단쇄 포스파티데이트 활성

Ca²⁺과도 상태가 Edg-2, -4 및 -7을 발현하는 3가지 모든 안정한 세포주에서 유도되었기 때문에, 이 분석을 사용하여 가능성있는 안타고니스트를 선별하였다. LPA에 의해 활성화된 Edg 수용체류, 즉 Edg-2, Edg-4, 및 Edg-7에 대한 선택적인 안타고니스트를 동정하기 위하여, LPA 파마코포아의 구조적인 특징을 출발점으로 하였다. 단쇄(8:0) LPA 또는 LPA(8:0) 및 LPA(18:1)의 혼합물을 Edg-2, -4 또는 -7의 저해제로서 시험하였다. LPA 8:0 및 LPA 18:1의 혼합물을 사용하여 세포를 챌린지할 때, Ca²⁺반응은 임의의 3가지 안정한 세포주에서 영향을 받지 않았다(도 30A-C, 31A-C 및 32A-B). LPA 8:0(10 μ M의 농도)은 단독으로 임의의 세포에서 Ca²⁺반응을 유도할 수 없었다

이들 결과에 기초하여, 출원인은 LPA 파마코포아의 개질(지방산 쇄의 이동성을 입체적으로 제한함)이 그 리간드 특성에 영향을 줄 수 있음을 가정하였다. 이러한 이유로, 우리들은sn-2 위치에 제2 단쇄 지방산을 가진 화합물을 시험하였다. 이러한 단쇄 포스파티데이트는 상응하는 단쇄 LPA에 비하여 소수성이 증가되었고, 이것은 수용체의 결합 포켓-리간드와의 상호작용을 억제할 수 있다.

포스파티딘산(PA) 및 디아실글리세롤 피로포스페이트(DGPP)는 LPA 파마코포아와 일부 중요한 화학적 특성을 공유하는 천연 지질으로서, 이온성 포스페이트기(들) 및 지방산 쇄를 가진다. 역시 Edg 수용체의 아고니스트는 아니다(하기 참조). 이러한 유사점에 주목하여, 단쇄 DGPP를 제조하고, Edg-2, -4 또는 -7의 저해제로서 시험하였다. 도 29A-D는 10배 과량의 DGPP(8:0)이, 안정한 세포주내에서 LPA에 의해 유도된 Ca²⁺반응에 대하여 미치는 효과를 보여주고 있다. Edg-2 발현 세포에서의 Ca²⁺반응은 약 50%로 저해된 반면(도 29A), Edg-7 발현 세포에서의 반응은 완전히 제거되었다(도 29C). 대조적으로, Edg-4 발현 세포에서의 Ca²⁺반응은 DGPP 8:0에 의해 영향을 받지 않았다(도 29B). Edg-4의 안정하고 일시적인 발현에 대한 EC₅₀수치에서의 차이에 기인하여(도 29B), DGPP 8:0을 Edg-4에 의해 일시적으로 세포감염된 세포 상에서 유사한 방식으로 시험하였다. 안정한 세포에서의 실험 결과와 동일하게, Ca²⁺반응은 Edg-4를 일시적으로 발현하는 세포에서 DGPP 8:0에 의해 영향을 받지 않았다(도 29D). DGPP 8:0에 대하여 전술한 분석 각각에 있어서, PA 8:0으로 유사한 관찰 결과가 얻어졌다(하기 참조).

증가된 농도의 DGPP 8:0을 사용하여 Edg-2 및 -7 발현 세포에서 저해 곡선을 결정한 반면, LPA의 농도는 연구된 수용체에 대한 EC₅₀으로 일정하게 유지하였다. Edg-7에 대한 285±28 nM(도 30A) 및 Edg-2에 대한 11.0 ±0.68 μ M(도 31A)의 IC₅₀수치를 곡선으로부터 결정하였다. IC₅₀수치에 근접한 DGPP 8:0의 일정량을 사용하는 경우(Edg-7에 대하여 250 nM, Edg-2에 대하여 3 μ M), Edg-7(도 30B) 및 Edg-2(도 31B)에 대한 용량 응답 곡선은 오른쪽으로 이동하였는데, 이것은 경쟁적 저해 메커니즘을 나타낸다.

DGPP에 대한 구조 활성 상관관계를 더욱 잘 정의하기 위하여, LPA, DGPP, PA 및 DAG의 단쇄-(8:0) 및 장쇄(18:1) 종을 Edg-2 및 -7 발현 세포주에 대하여 시험하였다. 도 30C는 LPA 18:1의 조합물 및 이들 각각의 지질에 노출되었을 때, Edg-7 발현 세포내에서 Ca²⁺반응에 대한 이들 지질의 효과를 나타낸다. 이들 실험에 있어서, LPA의 농도는 EC₅₀부근에서 선택된 반면, 시험 지질은 DGPP 8:0의 IC₅₀과 동일한 농도로 사용되었다. LPA 8:0은 Edg-7에 대한 어떠한 효과도 가지지 않았지만, DGPP 8:0 및 PA 8:0 양자는 Ca²⁺반응을 각각 50% 및 56% 유의성있게 저해하였다. 대조적으로, DAG 8:0는 Ca²⁺반응을 유의성있게 증가시켰다. DDPGG 및 PA의 쇄 길이가 18:1로 증가되면, 이들 유사체는 더 이상 Edg-7의 저해제가 아니었다(도 30C). 또한, DPG 18:1은 Edg-7에 대한 저해 효과를 가지지 않았다.

동일한 세트의 지질을 Edg-2 발현 세포에 대하여 시험하였다(도 31C). DPGG,PA, 및 DAG의 옥틸 쇄 길이 유사체를 10 μ M로 사용하는 경우, 모두 각각 대조군의 50, 19 및 64%로 반응을 감소시켰다. 쇄 길이가 18:1로 증가되면, DGPP 및 DAG는 더 이상 저해 효과를 가지지 않았지만, PA 18:1은 적당한 저해 효과를 유지하여, Ca²⁺반응을 18% 저하시켰다. 지질 판넬을 또한 Edg-4 발현 세포에 대하여 시험하였다(도 32A-B). 이들 지질을 Edg-4를 발현하는 안정한 세포주에서 분석하였을 때, 단쇄 또는 장쇄 지질의 어느 것도 저해 효과를 가지지 않았으나, PA 8:0 및 18:1은 Ca²⁺반응을 대조군의 각각 162 및 137%로 유의성있게 증가시켰다. 안정한 클론으로부터 얻어진 결과를 확인하기 위하여, 지질 판넬을 일시적으로 Edg-4를 발현하는 세포에 대하여 시험하였다(도 32B). 다시, 안정한 세포주에서의 결과와 일치하여, 단쇄 그리고 장쇄 종의 DGPP 또는 PA 어느 것도 Ca²⁺반응에 대하여 저해 효과를 가지지 않았다. 안정한 Edg-4 클론과 대조적으로, PA 유사체는 Edg-4을 일시적으로 발현하면서, 세포내에서 Ca²⁺의 반응을 증강시켰다. 단독으로 적용되었을 때, 10 μ M 이하의 농도에서는 PA의 어떤 종도 안정하게 또는 일시적으로 Edg-4를 발현하는 세포에서 반응을 일으키지 않았다.

DGPP 8:0가 내인적으로 LPA 수용체를 발현하는 세포에 대하여 미치는 효과를 또한 검토하였다. DGPP 8:0은제노푸스난모세포에서 LPA에 의해 유도되고 Ca²⁺이 매개하는 내부로의 Cl^-전류를 저해하며, 96±21 nM의 IC₅₀를 가지는 것으로 나타났다(도 33A). DGPP 8:0 200 nM 농도 존재하에서, LPA 18:1에 대한 용량 응답 곡선이 오른쪽으로 이동하였는데, 이것은 Edg-2 및 -7 클론에서 발견되는 것과 같은 경쟁적인 작용 메커니즘을 의미한다(도 33B). DGPP 8:0이 세포내 또는 세포외 메커니즘을 통해 작용하는 가의 여부를 알아보기 위하여, DGPP 8:0을 세포내로 주사하고, 난모세포를 LPA 18:1에 노출시켰다. 도 32C는 DGPP 8:0을 세포내로 주사하여 농도를 300 nM 높게 한 다음, 5 nM LPA 18:1를 세포외 적용하면 대조군과 동일한 크기의 반응이 유도되었다는 것을 도시한다. 비교용으로, DGPP 8:0을 세포외에 적용하였을 때, LPA 18:1에 의해 정상적으로 유도된 반응은 완전히 저해되었다(도 33C). DGPP 8:0의 저해 효과는, 10분간 세척 후 반응이 대조군 레벨로 회복되는 것과 같이 가역적이다.

난모세포에서 발현되는 LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성을 나타내기 위하여, 폴리 A + 래트 뇌의 mRNA를 주사함으로써 신경전달물질 수용체의 발현을 유도하였다. 그 결과, 아세틸콜린 및 세로토닌에 대한 G-단백질 결합된 수용체가 발현되었는데, 이것은 주사되지 않은 난모세포에서는 발현되지 않았다. 이들 신경전달물질은 LPA에 의해 활성화되는, 동일한 이노시톨 트리포스페이트-Ca²⁺신호전달경로는 활성화시킨다(Tigyi et al., 1990). 이들 난모세포에서, DGPP 8:0은 세로토닌 또는 카바콜에 의해 유도된 반응을 저해하지 않았는데, 이것은 LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성을 입증하는 것이었다. 유사한 농도로 사용되는 경우, PA 8:0은 또한 난모세포에서 LPA에 의해 유도된 반응을 저해하는 데 유효하였다.

LPA에 의해 유도된 반응에 대한 DGPP 8:0의 효과를, LPA 수용체를 내인적으로 발현하는 포유동물 시스템에서 검사하였다. Edg 및 PSP24 수용체에 대한 mRNA의 존재에 대한 RT-PCR에 의해 NIH3T3 세포를 선별하였다. 도 34A는 NIH3T3 세포에서 Edg-2, -5 및 PSP24에 대한 mRNA 전사물이 검출되었음을 나타낸다. DGPP 8:0이 LPA에 의해 유도되지만 S1P에 의해 유도되지 않는 Ca²⁺반응을 저해하는 데 특이적이라는 것을 보여주기 위하여, NIH3T3 세포를 10 μ M DGPP 8:0의 존재하에서 100 nM LPA 또는 S1P에 노출시켰다. 도 34B에서 보는 바와 같이, DGPP 8:0은 LPA에 의해 유도된 Ca²⁺반응을 유의성있게 저해한 반면, S1P에 의해 유도된 반응은 영향을 받지 않았다.

LPA는 난소 암에서 생성되고, 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Xu et al., 1995a). 그러므로, DGPP 8:0을 또한 HEY 난소 암 세포에 대하여 시험하여 이것이 치료적으로 관련된 표적에 대하여 영향을 미치는지의 여부를 결정하였다. 도 34D는 DGPP 8:0이 LPA에 의해 유도된 Ca²⁺의 반응을 대조군의 12%로 저해하였지만, DGPP 18:1은 아무런 효과도 없었음을 보여준다. 또한, PA 8:0은 Ca²⁺반응을 대조군의 6%로 저해한 반면, PA 18:1은 아무런 효과도 가지지 않았다. HEY는 Edg-1, -2, -5, -7 수용체에 대한 mRNA 전사물을 발현한다(도 34C).

실시예 15 - NIH3T3 세포 증식의 저해

성장 인자의 대표적인 효과는 이의 세포 증식 유도 능력이다. LPA는 다양한다른 유형의 세포 증식을 자극하는 것으로 나타났으므로(Goetzl et al., 2000), DGPP 8:0의 세포 증식 저해능을 NIH3T3 세포에서 검사하였다. 도 35는 DGPP 8:0이 NIH3T3 세포에서 LPA에 의해 유도된 증식을 유의성있게 저해하여 세포의 수를 대조군 수준으로 감소시킨다는 것을 보여주는 반면에, 용매 처리된 대조군 세포에 대해서는 아무런 효과를 가지지 않았다. DGPP 8:0의 저해 효과에 대한 구조-활성 상관관계를 정의하기 위하여, 단쇄 및 장쇄 종의 DGPP, PA 및 DAG를 분석에 포함시켰다. 도 35에 제시된 바와 같이, 시험 판넬에 함유된 어떤 지질도 용매 처리된 대조군 세포에 대하여 유의성 있는 저해 또는 자극 효과를 가지지 않았다. 단지 DGPP 8:0은 LPA에 의해 유도된 증식을 저해하였다. DGPP 18:1, 및 장쇄 그리고 단쇄 PA 및 DAG는 LPA에 의해 유도된 증식에 대하여 역시 영향을 주지 않았다. 흥미롭게도, PA 8:0은 이 분석에서 유의성있는 저해능을 가지지 않았다.

실시예 13-15의 논의

Edg-2, -4 및 -7 수용체의 이종 발현을 위해 RH7777 세포를 사용하여 가능성있는 안타고니스트를 선별하였다. 우리의 이전 Edg 수용체 계산 모델링(Parrill et al, 2000) 및 이용가능한 구조-활성 데이타(Jalink et al., 1995)를 토대로 할 때, 상기 실험 결과는 단쇄 포스파티데이트 DGPP 8:0이 Edg-7의 선택적이고 경쟁적인 안타고니스트이며, 285±28 nM의 IC₅₀을 갖는다는 것을 증명하고 있다. 이 분자는 11.0±0.68 μ M의 IC₅₀을 가지는, Edg-2에 대한 불량한 저해제인 것으로 나타났으나, Edg-4를 저해하지 않았다. DGPP 8:0은제노푸스난모세포에서 내인성 LPA 반응을 저해하였고, 이것의 IC₅₀은 96±21 nM이었다. PA 8:0은 유사한 저해 특성을 보여주었다. 그러므로, 이들 단쇄 포스파티데이트는 Edg-2에 비해 Edg-7에 대하여 40-100배의 선택성을 나타낸다.

단쇄 포스파티데이트에 대한 상기 결과는 반도(Bandoh) 등의 결과(2000)를 확인시켜 주는데, 이들은 탄소수 12 이하의 아실쇄를 가진 LPA는 Edg-2, -4, 또는 -7를 발현하는 곤충 세포에서 반응을 일으키지 않는다는 것을 증명하였다. 앞서 증명된 바와 같이, LPA 8:0은 포유동물 발현 시스템에서 Edg-2, -4, 또는 -7의 아고니스트도 안타고니스트도 아니었다. Edg-7은sn-2 대sn-1에 에스테르화된 지방산 쇄를 가진 LPA에 대하여 10배의 선택성을 가진다(Bandoh et al., 2000). 그러므로, 포스페이트기에 대한 탄화수소 쇄의 거리는 수용체와의 결합 및 수용체의 활성화를 무효화하지 않는다. Edg-7은 또한 장쇄 포화 지방산에 비해 장쇄 불포화 지방산에 대하여 선택적이다. 에테르 결합 또는 비닐-에테르 측쇄가 존재하는 경우, EC₅₀이 2배 감소되었다(Bandoh et al., 2000). 더욱이, 탄소수 18의 탄화수소쇄가 최적인 반면, 탄소수 20의 유사체는 보다 약한 아고니스트이었다. Edg-7의 이러한 약리학적 특성은 수용체 활성화가 쇄의 길이 및 측쇄의 유연성(에스테르 대 에테르 결합)에 따라 좌우되는 것임을 암시한다.

Edg-1 수용체의 계산 모델링으로 리간드 결합에 필요한 3개의 전하띈 잔기를 확인하게 되었다. 이들 잔기중 하나인 아르기닌 120(포스페이트기와 상호작용하는 것으로 예상됨)은 모든 Edg류에서 보존된다. 제2 잔기인 아르기닌 292는, Edg-8을제외한 모든 Edg류가 양이온성에 가까운 잔기를 가지는 위치에 존재한다. 제3 잔기인 글루타메이트 121은 Edg-2, -4 및 -7에서 상응하는 자리에 글루타민을 가지며, LPA-특이적인 Edg 수용체 가운데 보존되지 않는다. 이 글루타민 잔기는 LPA의 하이드록실기와 상호작용할 것으로 예상된다. 이 잔기를 알라닌 치환하면, 수용체의 리간드 결합 및 활성화가 상실되는데, 이것은 PLGF 파마코포아의 전하띈 부분과 이들 3개의 잔기의 이온성 상호작용이 Edg-1에 있어서 리간드 결합에 필수적이라는 사실을 암시한다(Parrill et al., 2000). 더욱이, 수용체와 탄화수소 쇄의 상호작용 그자체는 리간드 결합 및 활성화에 충분지 않았다(Parrill et al., 2000). 그러므로, 이온성 앵커 및 소수성 꼬리 양자를 포함하는 상호작용의 조합이 아고니스트 활성화에 필요하다고 가정하였다. 상기 결과는 소수성 꼬리와 리간드 결합 포켓 사이의 상호작용의 중요성에 근거하여, 단쇄 LPA 8:0이 Edg-2, -4, 또는 -7을 활성화할 수 없다는 것을 증명함으로써 상기 가정을 뒷받침하고 있다. 그 결과로서, 출원인은 소수성 꼬리를 PLGF 파마코포아의 "역전" 부위로 명명하였다. 이들 수용체에 의한 지방산의sn-1 및sn-2 치환의 상대적인 허용성(tolerance) 때문에, 출원인은 이들의 절단된 탄화수소쇄에 의해 수용체를 활성화할 수 없다고 여겨졌던 단쇄 포스파티데이트에 주목하였다. 포스파티데이트 중의 아실쇄의 구조적 이동성은 또한 인접한 지방산 부분에 의해 제한된다. 출원인은 또한 피로포스페이트 부분의 효과를 연구하였는데, 이것은 부위를 고정시키는 음전하 특성을 변화시키는 것이 아니라, 전하를 증가시킨다.

이러한 개념의 약물 설계를 Edg-2, -4 및 -7 수용체를 발현하는 클론 세포주에 대하여 시험하였다. DGPP 8:0 및 PA 8:0의 약리학적 특성은 3가지 수용체 사이에 매우 상이한 것으로 나타났다. 상기 분자 둘다는 Edg-7을 저해하는 데 유효하였던 반면에, 이들은 Edg-2에 대해서는 그다지 유효하지 않았다. 역시 Edg-4에 대하여 유효하지 않았다. DGPP 8:0은 또한 Edg-2 및 -7 둘다에 대한 경쟁적인 저해제로서 밝혀졌고, 용량 응답 곡선을 오른쪽으로 이동시켜, 순차적으로 두가지 수용체에 대한 LPA의 EC₅₀을 증가시켰다. 상응하는 장쇄 종의 PA 및 DGPP의 아고니스트 활성 결핍은 결합 포켓에서의 일반적인 제한 사항으로 주의를 집중시킨다. 결합 포켓에서 리간드를 결합시키는 데 있어서 이온성 앵커의 중요성은, 비록 이것의 세포내 효과가 기타 분자 표적(예를 들어, PKC)에 대한 세포내 작용과 혼동될 수 있지만, DAG 8:0에 의한 저해 결핍에 의해 뒤받침된다.

PA 및 DGPP는 천연 인지질이다. DGPP (8:0)는 식물에서 신규한 지질로서 1993년에 발견되었고, 포스파티데이트 키나아제에 의한 PA의 인산화 생성물이다(Wissing and Behrbohm, 1993; Munnik et al., 1996). DGPP는 세균, 효모 및 식물에서 동정되었지만, 포유동물에서는 동정되지 않았다. 최근의 연구로부터, DGPP가 세포질 포스포릴라아제 A₂를 활성화시킴으로써 프로스타글란딘의 생산을 자극하고 대식 세포를 활성화한다는 것이 밝혀졌는데, 이것은 면역 반응에 있어서 DGPP의 역할을 암시한다(Balboa et al., 999; Balsinde et al., 2000). 이들 앵커는 이러한 효과들이 LPA 수용체에 의해 매개되는 가능성을 배제하였다. 장쇄 DGPP 및 PA 유사체를 사용한 상기 결과는 이 개념을 확인시켜 주었는데, 그 이유는 이들화합물이 10 μM 이하의 농도에서는 Edg 수용체 발현 세포주에서 아고니스트 특성을 가지지 않았기 때문이었다.

단쇄 포스파티데이트의 효과를, 또한 3가지 상이한 세포 유형에서 내인적으로 발현되는 LPA 수용체에 대하여 검사하였다. DGPP 8:0 및 PA 8:0은제노푸스에서 LPA에 의해 유도된 Cl^-전류의 유효한 저해제인 것으로 밝혀졌다. 작용 부위를 알아보기 위하여, DGPP 8:0을 난모세포에 주사한 후, LPA를 세포외 적용하였다. DGPP 8:0은 세포외로 적용되었을 때 LPA에 의해 유도된 Cl^-전류를 저해하는 데에만 단지 유효했는데, 이것은 DGPP가 세포 표면에 대하여 안타고니스트 효과를 가진다는 것을 증명하였다. LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성은 난모세포 및 NIH3T3 세포에서 증명되었다. 이들 세포에서, DGPP 8:0은 LPA에 의해 유도된 Ca²⁺반응을 저해하는 데에만 단지 유효할 뿐, S1P, 아세틸콜린 또는 세로토닌에 의해 유도된 반응에는 유효하지 않았다.

RT-PCR 분석 결과, Edg-4, 또는 -7이 아닌 단지 Edg-2가 NIH3T3 세포에서 발현되었음이 확인되었다. NIH3T3 세포에서, 100배 과량의 DGPP 8:0은 단지 Ca²⁺반응을 40% 저해하였다. Edg-2를 발현하는 안정한 세포주에서 보여지는 저해 정도는 유사하였고, 즉 이것은 약한 저해제였다. 단쇄 DGPP 및 PA를, HEY 난소 암 세포상에서 LPA에 비해 10배 과량으로 평가하였을 때, 양자는 유효한 저해제였으나, 장쇄 분자는 역시 아무런 효과도 나타내지 않았다. RT-PCR 결과는 대부분의 mRNA가 HEY세포에서 Edg-7에 관한 것인 반면, 단지 미량의 Edg-2 mRNA가 검출되었을 뿐이었다. Edg-7을 발현하는 안정한 세포주에서 보여지는 저해 정도는 유사하였으며, 여기서 DGPP 8:0 및 PA 8:0 둘다는 유효한 저해제였다.

단쇄 포스파티데이트 둘다를, LPA에 의해 유도된 NIH3T3의 세포 증식을 차단하는 능력에 대하여 평가하였다. DGPP 8:0은 LPA에 의해 유도된 증식을 유효하게 저해하였으나, 장쇄 DGPP는 그렇지 않았다. PA 8:0은 Ca²⁺반응을 저해하는 데 유효하였으나, 세포 증식을 저해하는 데에는 유효하지 않았다. 이들 결과는, PA(12:0)이 PA 18:1의 유사분열원성 효과를 저해하지 않았다는 이전의 보고와 일치하는 것이다.(van Corven et al., 1992). 장기간 분석에서는 분자의 안정성이 관심의 대상이 되는데, 그 이유는 지질 포스파타아제가 안타고니스트를 불활성화할 수 있기 때문이다. PA 및 DAG 양자가 증식을 저해하는 데 실패하였다는 사실은, DGPP 8:0이 이 분석을 실시하는 동안 더욱 안정할 것임을 암시한다. DGPP의 안정성은, 실험 도중 DGPP가 대사되지 아니하였음을 보고한 발보아(Balboa) 등의 문헌(1999)에 의해 입증되었다.

DGPP 8:0은 Edg 수용체 및 PLGF 수용체 연구 분야에 있어서 중요한 새로운 수단을 제공한다. Edg류의 계산 모델링으로부터 얻어진 PLGF 파마코포아의 소수성 반전 및 이온성 앵커의 개념은 새로운 저해제의 설계와 합성에 도움이 될 것이다.

실시예 16

직쇄 포스페이트 중간체 101-105의 합성

화합물 101 : 인산 디벤질 에스테르 부틸 에스테르

소수성 n-부탄올 74 mg(1.00 mmol) 및 1H-테트라졸 365 mg(5.17 mmol)을 100 ml의 둥근 바닥 플라스크내에서 무수 염화메틸렌 34 ml중에 용해시켰다. 무수 염화메틸렌 5 ml 중 디벤질-N,N-디이소프로필 포르포라미다이트 0.895 g(2.58 mmol)의 용액을 아르곤 대기 하에서 시린지를 통해 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 ∼38℃의 이소프로필 알코올/드라이 아이스조에서 냉각시켰다. 무수 염화메틸렌 28 ml 중 32% 퍼아세트산 0.815 g(3.43 mmol)을 첨가 깔때기를 통해 적가하였다. 첨가가 끝난 후, 반응 혼합물의 온도를 얼음조를 사용하여 0℃로 상승시켰다. 반응 혼합물을 얼음조에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮겨 염화메틸렌 200 ml로 희석하였다. 유기 층을 10% 나트륨 메타바이설파이트(2 x 40 ml), 포화 중탄산나트륨(2 x 40 ml), 물(30 ml), 및 염수(40 ml)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여, 진공하에서 농축시켜 건조하였다. 이어서, 용리제로서 1:1 헥산/에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여 투명한 오일로서 화합물101(과량의 인산화제로부터 소량의 불순물을 함유한 309 mg)을 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) 0.88(t, J=7.2Hz, 3H, CH ₃ ), 1.34(sextet, J=7.2Hz, 2H, OCH₂CH₂CH ₂ CH₃, 1.59(quintet, J=6.6Hz, 2H, OCH₂CH ₂ CH₂CH₃), 3.99(dt, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂CH₂CH₃), 5.02(d, J=1.8Hz,2H, OCH ₂ Ar), 5.05(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂ Ar), 7.35(br s, 10H, 2 x ArH);¹³C NMR(CDCl₃) 13.55, 18.60, 32.16(d, Jc,p=6.8 Hz), 67.72(d, Jc,p=6.1Hz), 69.13(d, Jc,p=5.5Hz), 127.90, 128.47, 128.55, 136.00(d, Jc,p=6.8Hz);³¹P NMR(CDCl₃) 16.84; MS(포지티브 모드):m/z357.3에서 [M+²³Na].

화합물 102: 인산 디벤질 에스테르 옥틸 에스테르

무수 n-옥탄올 130 mg(1.00 mmol)을 사용하였고, 화합물101에서와 유사한 방법을 수행하였다. 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여. 화합물102(351 mg, 90%)를 투명한 오일로서 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) 0.88(t, J=6.9Hz, 3H, CH ₃ ), 1.24(br s, 10H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₅CH₃), 1.60(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₅CH₃), 3.98(dt, J=6.6Hz, 6.9Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₅CH₃), 5.02(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂ Ar), 5.05(d, J=2.4Hz, 2H OCH2Ar), 7.34(br s, 10H, 2 x ArH);¹³C NMR(CDCl₃) 14.19, 22.62, 25.38, 29.06, 29.14, 30.17(d, Jc,p=6.9Hz), 31.75, 68.05(d, Jc,p=6.2Hz), 69.12(d, Jc,p=5.5Hz), 127.90, 128.47, 128.56, 135.97(d, Jc,p=6.9Hz);³¹P NMR(CDCl₃) 16,83; MS(포지티브 모드):m/z413.4에서 [M+²³Na]⁺.

화합물 103: 인산 디벤질 에스테르 도데실 에스테르

무수 n-부탄올을 186 mg(1.00 mmol)을 사용하였고, 화합물101에서와 유사한 방법을 이용하였다. 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여. 화합물103(361 mg, 81%)을 투명한 오일로서 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) 0.88(t, J=7.2Hz, 3H, CH ₃ ), 1.24(br s, 18H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₉CH₃), 1.60(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₉CH₃), 3.98(td, J=6.9Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₉CH₃), 5.02(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂Ar), 5.05(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂Ar), 7.34(br s, 10H, 2 x ArH);¹³C NMR(CDCl₃) 14.13, 22.69, 25.38, 29.12, 29.35, 29.49, 29.56, 29.63, 30.18(d, Jc,p=7.0Hz), 31.92, 68.05(d, Jc,p=6.1Hz), 69.12(d, Jc,p=5.4Hz), 127.89, 128.46, 128.55, 135.97(d, Jc,p=6.8 Hz);³¹P NMR(CDCl₃) 16.84; MS(포지티브 모드):m/z469.1에서 [M+²³Na]⁺.

화합물 104: 인산 디벤질 에스테르 옥타데실 에스테르

옥타데칸올 270 mg(1.00 mmol)을 사용하였고, 화합물101에서와 유사한 방법을 사용하였다. 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여. 화합물104(474 mg, 89%)를 투명한 오일로서 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) 0.88(t, J=6.9Hz, 3H, CH ₃ ), 1.25(br s, 30H,OCH₂CH₂(CH ₂ )₁₅CH₃), 1.60(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₁₅CH₃), 3,98(td, J=6.6Hz, 6.9Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₁₅CH₃), 5.02(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂ Ar), 5.05(d, J=2.1Hz, 2H, OCH ₂ Ar), 7.34(br s, 10H, 2 x ArH);¹³C NMR(CDCl₃) 14.12, 22.70, 25.40, 29.13, 29.38, 29.51, 29.58, 29.68, 29.72, 30.20(d, Jc,p=6.9Hz), 31.94, 68.06(d, Jc,p=6.1Hz), 69.14(d, Jc,p=5.4Hz), 127.90, 128.47, 128.55, 136.00(d, Jc,p=6.8Hz),;³¹P NMR(CDCl₃) 16.83; MS(포지티브 모드):m/z553.3에서 [M+²³Na]⁺.

화합물 105: 인산 디벤질 에스테르 도코사닐 에스테르

도코사놀 327 mg(1.00 mmol)을 사용하였고, 화합물101에서와 유사한 방법을 사용하였다. 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 미정제 생성물을 정제하여. 화합물105(516 mg, 88%)을 흡습성 백색 고체로서 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) 0.88(t, J=6.9Hz, 3H, CH ₃), 1.25(br s, 38H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₁₉CH₃), 1.60(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₁₉CH₃), 3.98(td, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₁₉CH₃), 5.02(d, J=2.4Hz, 2H, OCH ₂Ar), 5.05(d, J=2.4Hz, 2H, OCH ₂Ar), 7.35(br s, 10H, 2 x ArH);¹³C NMR(CDCl₃) 14.13, 22.70, 25.39, 29.12, 29.37, 29.50, 29.57, 29.66, 29.71, 30.18(d, Jc,p=6.9Hz), 31.93, 68.06(d, Jc,p=6.0Hz), 69.13(d, Jc,p=5.6Hz), 127.89, 128.47, 128.55, 135.98(d,Jc,p=6.9Hz);³¹P NMR(CDCl₃) 16.83; MS(포지티브 모드): m/z 609.3에서 [M+²³Na]⁺.

실시예 17 - 직쇄 포스페이트 화합물 106-110의 합성

화합물 106: 인산 모노부틸 에스테르

화합물101200 mg(0.60 mmol)을 두꺼운 벽을 가진 압력 용기내에서 30 ml의 무수 메탄올 중에 용해시켰다. 이 용기를 아르곤으로 세정하고, 10%, Pd/C 200 mg을 첨가하였다. 용기를 수소첨가 반응 장치내에 연결시키고, 실온에서 반응 용기내부에 50 psi 이하의 수소 대기를 8시간 동안 유지시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 메탄올로 세척한 셀라이트 패드를 통해 진공 여과시켰다. 용매를 진공하에서 증발시켜, 황색 오일10670 mg(86%)을 남겼다.¹H NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 0.95(t, J=7.2Hz, 3H, CH ₃ ), 1.43(sextet, J=7.5Hz, 2H, OCH₂CH₂CH ₂ CH₃), 1.66(quintet, J=6.9, 2H, OCH₂CH ₂ CH₂CH₃), 3.99(td, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂CH₂CH₃);¹³C NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 13.71, 19.02, 32.72(d, Jc,p=7.2Hz), 66.86(d, Jc,p=5.5Hz);³¹P NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 18.84; MS(네가티브 모드):m/z 153.0에서 [M-1]^-.

화합물 107: 인산 모노옥틸 에스테르

화합물102200 mg(0.51 mmol)을 사용하였고, 화합물106에서와 유사한 방법을 이용하여, 백색/황색의 점성 고체107100 mg(93%)을 분리하였다.¹HNMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 0.89(t, J=6.9Hz, 3H, CH ₃ ), 1.29(br s, 10H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₅CH₃), 1.67(quintet J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₅CH₃), 3.97(dt, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₅CH₃),¹³C NMR(CDCl₃/MeoH-d₄) 14.18, 22.98, 25.89, 29.57, 29.58, 30.76(d, Jc,p=7.3Hz), 32.18, 67.16(d, Jc,p=5.2Hz);³¹P NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 20.55; MS(네가티브 모드):m/z 209.1에서 [M-1]^-.

화합물 108: 인산 모노도데실 에스테르

화합물103200 mg(0.45 mmol)을 사용하였고, 화합물106에서와 유사한 방법을 이용하여 백색 고체108112 mg(94%)을 얻었다.¹H NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 0.88(t, J=6.6Hz, 3H, CH ₃ ), 1.27(br s, 18H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₉CH₃), 1.67(quintet, J=6.6Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₉CH₃), 3.97(dt, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₉CH₃);¹³C NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 14.21, 22.98, 25.84, 29.57, 29.67, 29.89, 29.92, 29.96, 29.98, 30.69(d, Jc,p=7.4Hz), 32.25, 67.22(d, Jc,p=5.7Hz);³¹P NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 21.22; MS(네가티브 모드):m/z 265.0에서 [M-1]^-.

화합물 109: 인산 모노옥타데실 에스테르

화합물104200 mg(0.38 mmol)을 사용하였고, 화합물106에서와 유사한 방법을 사용하여 백색 고체109104 mg(79%)을 얻었다.¹H NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 0.89(t, J=6.9Hz, 3H, CH ₃ ), 1.27(br s, 30H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₁₅CH₃), 1.68(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₁₅CH₃); 3.98(dt, J=6.6Hz, 6.9Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₁₅CH₃));¹³C NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 14.26, 23.14, 26.01, 29.74, 29.84, 30.06, 30.09. 30,16, 30.87(d, Jc,p=7.2Hz), 32.42, 67.32(d, Jc,p=5.8Hz);³¹P NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 21.69; MS(네가티브 모드):m/z349.1에서 [M-1]^-.

화합물 110: 인산 모노도코실 에스테르

화합물105200 mg(0.34 mmol)을 사용하고, 화합물106에서와 유사한 방법을 사용하여 백색 고체11098 mg(71%)을 얻었다.¹H NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 0.88(t, J=6.9Hz, 3H), 1.26(br s, 38H, OCH₂CH₂(CH ₂ )₁₉CH₃), 1.66(quintet, J=6.9Hz, 2H, OCH₂CH ₂ (CH₂)₁₉CH₃), 3.97(td, J=6.6Hz, 6.6Hz, 2H, OCH ₂ CH₂(CH₂)₁₉CH₃);¹³C NMR(CDCl₃/MeOH-d₄) 14.22, 23.01, 25.87, 29.61, 29.71, 29.93, 29.97, 30.04, 30.73(d, Jc,p=7.4Hz), 32.29, 67.27(d, Jc,p=5.6Hz);³¹P NMR(CDCl₃/MeOH-d₄)20.66; MS(네가티브 모드):m/z405.1에서 [M-1]^-.

실시예 18 - 직쇄 포스페이트 화합물 106-110

내인적으로 PSP24 PLGFR을 발현하는제노푸스난모세포를 사용하여, 화합물106-110을 LPA 저해 활성에 대하여 선별하였다. 난모세포는 무균 조건하에서 크실라진으로 마취시킨 성체제노푸스로부터 얻어, 실험용으로 제조하였다. V-VI 단계의 난모세포는 Ca²⁺가 없는 난소 링거-2 액((OR-2) 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.5, NaOH 함유함) 중에서 1.4 mg/ml로 콜라게나아제 A형 처리(Boehringer, IN)하여 여포 세포층을 박리시켰다. 난모세포를 17-20℃의 인큐베이터 내에서 바스액(Barth's solution) 중에 유지시켰고, 분리 후 2-7일동안 사용하였다.

전기생리학적 기록은 -60 mV의 막 전위를 유지하는 표준 2 전극-전압-클램프 증폭기(GeneClamp 500, Axon Instruments, CA)를 사용하여 수행하였다. 시험 화합물을 MeOH 중에 용해시키고, 지방산이 없는 BSA로 복합체화한 후, 개구리 Na⁺-링거액(120 nM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES; pH 7)으로 희석하였고, 이것을 난모세포에 5 ml/분의 유속으로 수퍼퓨전에 의해 제공하였다. 막 전류는 NIC-310 디지탈 오실로스코프(Nicolet, Madison, WI)를 사용하여 기록하였다. 15분(최소)의 간격으로 적용하여, 적절한 세출 및 탈감작으로부터 복구(회복)가 이루어지도록 하였다.

도 36은, 화합물106-110이 LPA에 의해 유도된 클로라이드 전류를 용량 의존적으로 저해함을 보여준다. 화합물108은 가장 좋은 저해제이며, 약 8.1 nM의 IC₅₀을 가진다. 화합물107이 약 10.2 nM의 IC₅₀수치를 가지면서 유사한 정도의 유효성을 나타내었지만, 보다 길거나 짧은 직쇄 알킬기를 가진 화합물은 LPA에 의해 유도된 클로라이드의 전류를 저해하는 데 있어서 유효성이 감소되는 것으로 나타났다. 도 37은 양성 대조 용액(LPA 단독)에 대한 EC₅₀, 25 nM와, LPA 및 화합물108100 nM을 함유하는 용액에 대한 EC₅₀, 343 nM를 비교하고 있다. 그러므로, 화합물108은제노푸스난모세포에서 PSP24 수용체의 LPA 신호전달을 유효하게 저해한다.

상기 결과에 기초하여, 개개의 수용체를 이종적으로 발현하는 RH7777 세포에서 Edg-2, -4 및 -7의 안타고니스트로서의 유용성에 대하여 화합물108을 시험하였다.

도 38은 LPA 18:1 및 화합물108의 조합물에 노출시켰을 때 Edg-2, -4 및 -7을 발현하는 세포에서 Ca²⁺반응에 대한 화합물108의 효과를 도시하고 있다. 이 실험에서, LPA의 농도는 ED₅₀부근에서 선택되었다. 화합물108은 Edg-2 및 Edg-7 발현 세포주에서 Ca²⁺반응을 각각 대조군의 약 63% 및 56%로 유의성있게 저해하였다. 대조적으로, 화합물108은 Edg-4 발현 세포주에서 Ca²⁺반응을 대조군의 약 148%로 유의성있게 증가시켰다.

따라서, 직쇄 포스페이트는 생체내에서 Edg-2 및 Edg-7 활성을 선택적으로 저해하고, 생체내에서 Edg-4 활성을 선택적으로 증강시킬 것으로 예상된다.

참고 문헌 목록

다음의 참고 문헌 각각은 본 출원의 명세서에 그 자체로서 참고로 포함된다.

본 명세서에서는 바람직한 구체예를 구체적으로 기술하고 있지만, 관련 기술의 당업자는 본 발명의 본질을 벗어나지 않는 다양한 개질, 부가, 치환 등이 가능함을 명확히 숙지하고 있을 것이므로, 이러한 것들은 다음의 특허청구범위에서 정해지는 발명의 범위에 속하는 것으로 해석된다.

Claims (34)

1. 화학식(I)의 화합물:

   (I)

   상기 식에서,

   X¹, X²및 X³중 하나 이상은 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-이고, X¹및 X²가 -O-PO(OH)-O-로 함께 연결되거나, X¹및 X³이 -O-PO(OH)-NH-로 함께 연결되며;

   X¹, X²및 X³중 하나 이상은 R¹-Y¹-A-이고, X¹, X²및 X³중의 둘이 R¹-Y¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X²및 X³이 -N(H)-C(O)-N(R¹)-로 함께 연결되고;

   임의로, X¹, X²및 X³중 하나는 H 이며;

   A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이고;

   Y¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR²-이며;

   Z¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;

   Z²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며;

   Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR⁴, =O, 또는 H 및 -NR⁵R⁶의 조합이고;

   X¹, X²또는 X³각각에 있어서의 R¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이며;

   R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷및 R⁸은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이고;

   화학식(I)의 화합물은 리소포스파티드산, 포스파티드산, 사이클릭 포스파티드산, 알케닐 글리세롤포스페이트, 디옥틸 글리세롤 피로포스페이트 또는 N-팔미토일-L-세린이 아니다.
2. 제1항에 있어서,

   Q¹및 Q²가 모두 H₂이고;

   X¹, X²및 X³중 하나는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z²-(여기에서, Z¹및 Z²는 O임)이며;

   X¹, X²및 X³중 둘은 R¹-Y¹-A-(여기에서, 각각에 대하여 Y¹은 O이고, A는 직접 결합임)인 화합물.
3. 제1항에 있어서,

   Q¹은 H₂이고;

   Q²는 =O이며;

   X¹은 (HO)₂PO-Z¹-(Z¹은 O임)이고;

   X²및 X³은 R¹-Y¹-A-(여기에서, 각각에 대하여 Y¹은 -NH-이고, A는 직접 결합임)인 화합물.
4. 제3항에 있어서, X³은 -NH₂이고, X²는 -NHR¹(여기에서, R¹은 C14 내지 C18 알킬임)인 화합물.
5. 제4항에 있어서, R¹은 C14 알킬인 화합물.
6. 제4항에 있어서, R¹은 C18 알킬인 화합물.
7. 제3항에 있어서,

   X³은 -NHR¹(여기에서, R¹은 아세틸기임)이고,

   X²는 -NHR¹(여기에서, R¹은 C14 알킬임)인 화합물.
8. 제1항에 있어서,

   Q¹은 =NR⁴이고;

   Q²는 H₂이며;

   X¹및 X²는 -O-PO(OH)-O-로 함께 연결되고;

   X³은 R¹-Y¹-A-(여기에서, A는 직접 결합이며, Y¹은 -NH-임)인 화합물.
9. 제1항에 있어서,

   Q¹및 Q²는 모두 H₂이고;

   X¹, X²및 X³중 둘은 (HO)₂PO-Z¹-(여기에서, Z¹은 O임)이며;

   X¹, X²및 X³중 하나는 R¹-Y¹-A(여기에서, A는 직접 결합이고, Y¹은 -O-임)인 화합물.
10. 제9항에 있어서,

    R¹은 C21 알킬을 포함하는 아실인 화합물.
11. 제9항에 있어서,

    R¹은 C18 알킬인 화합물.
12. 제1항에 따른 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
13. LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 제1항에 따른 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체의 LPA-유도 활성을 저해하기에 효과적인 조건 하에서 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 LPA 수용체에 대한 LPA 활성 저해 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 LPA 수용체는 세포 상에 존재하고, 상기 접촉은 생체외에서 수행하는 것인 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 LPA 수용체는 세포 상에 존재하고, 상기 접촉은 생체내에서 수행하는 것인 방법.
16. 제13항에 있어서, 상기 LPA 수용체가 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
17. LPA 수용체 아고니스트 또는 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 갖는 제1항에 따른 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체의 활성을 조절하기에 효과적인 조건 하에서 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 LPA 수용체의 활성 조절 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 LPA 수용체는 세포 상에 존재하고, 상기 접촉은 생체외에서 수행하는 것인 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 LPA 수용체는 세포 상에 존재하고, 상기 접촉은 생체내에서 수행하는 것인 방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 LPA 수용체가 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
21. 제17항에 있어서, 상기 화합물은 LPA 수용체 아고니스트로서의 활성을 가지며, 상기 접촉은 LPA 수용체 활성을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 수행하는 것인 방법.
22. 제17항에 있어서, 상기 화합물은 LPA 수용체 안타고니스트로서의 활성을 가지며, 상기 접촉은 LPA 수용체 활성을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 수행하는것인 방법.
23. 제1항에 따른 화합물을 제공하는 단계, 및 암을 치료하기에 효과적인 방식으로 상기 화합물 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 암이 전립선 암 또는 난소 암인 것인 방법.
25. 제23항에 있어서,

    상기 화합물은 LPA 수용체 안타고니스트이고,

    상기 투여 단계는 상기 화합물을 암 세포에 송달하는 것을 포함하며,

    여기에서, 상기 화합물은 LPA 수용체에 결합하여 상기 암 세포의 증식 또는 전이를 저해하는 것인 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 화합물이 암 세포에 송달되었을 때, 그 암 세포가 파괴되는 것인 방법.
27. LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 제1항에 따른 화합물을 제공하는 단계, 및 LPA 수용체-유도 세포 증식을 촉진시키기에 효과적인 방식으로 세포 상의 상기 LPA 수용체를 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식 촉진 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 LPA 수용체가 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, 상기 세포가 생체외에 있는 것인 방법.
30. 제27항에 있어서, 상기 세포가 생체내에 있는 것인 방법.
31. LPA 수용체의 아고니스트로서의 활성을 갖는 제1항에 따른 화합물을 제공하는 단계, 및 상처 부위에 상기 화합물 유효량을 송달하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법으로서, 상기 화합물이 상처 치료를 촉진하는 세포 상의 LPA 수용체에 결합하여 LPA 수용체 아고니스트-유도 세포 증식을 자극함에 의하여 상처 치료를 촉진하는 것인 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 송달 단계가 상기 화합물 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 상기 상처 부위에 도입하는 것을 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서,

    상기 상처 부위는 외부에 있는 것이고,

    상기 도입은 상기 상처 부위에 상기 조성물을 국소적으로 적용하는 것을 포함하는 방법.
34. (Y²O)₂PO-Z¹¹-Z¹³또는 (Y²O)₂PO-Z¹²-P(OH)O-Z¹¹-Z¹³[여기에서, Z¹¹은 -(CH₂) _m - 또는 -O(CH₂) _m -(여기에서,m은 1 내지 50의 정수임), -C(R³)H- 또는 -O- 이고; Z¹²는 -(CH₂) _n - 또는 -O(CH₂) _n -(여기에서,n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이며; Z¹³은 H 또는 제1 이탈기이거나, -Z¹¹-Z¹³이 함께 제1 이탈기를 형성하고; Y²는 H 또는 보호기임]을 화학식(VI)의 중간체 화합물과 반응시키는 단계, 및 경우에 따라 탈보호하는 단계를 포함(여기에서, 상기 반응 단계 및 탈보호 단계는 X¹, X²및 X³중 하나 또는 둘이 (HO)₂PO-Z¹- 또는 (HO)₂PO-Z²-P(OH)O-Z¹-인 화학식(I)의 화합물을 제공하기에 효과적인 조건 하에서 수행함)하는 제1항에 따른 화합물의 제조 방법:

    (VI)

    상기 식에서,

    X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 R¹¹-Y¹¹-A-이고, X¹¹, X¹²및 X¹³중의 둘이 R¹¹-Y¹¹-A-인 경우에 각각은 동일하거나 상이하며, 또는 X¹²및 X¹³이 -N(H)-C(O)-N(R¹¹)-로 함께 연결되고;

    X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나 이상은 OH, NH₂, SH 또는 제2 이탈기이며;

    임의로, X¹¹, X¹²및 X¹³중 하나는 H 이고;

    A는 직접 결합, (CH₂) _k (여기에서,k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O 이며;

    Y¹¹은 -(CH₂) _l -(여기에서,l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR¹²-이고;

    Q¹및 Q²는 독립적으로 H₂, =NR¹³, =O, 또는 H 및 -NR¹⁴R¹⁵의 조합이며;

    X¹¹, X¹²또는 X¹³각각에 있어서의 R¹¹은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,이고;

    R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R¹⁶및 R¹⁷은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2 내지 C30 알케닐, 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 있거나 없는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1 내지 C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1 내지 C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.