KR20020082462A

KR20020082462A - 흡입요법에서의 이산화탄소 함량 증가

Info

Publication number: KR20020082462A
Application number: KR1020027007137A
Authority: KR
Inventors: 왈드렙제이.클리포드; 나이트제이.버논; 코쉬키나나데주다
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 1999-12-04
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2002-10-31
Also published as: EP1242106A1; JP2003515568A; KR100799089B1; AU1936901A; EP1242106A4; RU2002117912A; CA2393233A1; IL150027A; USRE40300E1; CN1167461C; WO2001039789A1; US20020106330A1; RU2270683C2; US6440393B1; CN1424914A; IL150027A0; ZA200204416B; AU777338B2

Abstract

본 발명은 에어로졸화된 약물을 약 10% 이하의 이산화탄소 가스를 함유하는 공기 혼합물을 통해 투여하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물의 호흡관에서 에어로졸화된 약물의 침착을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

흡입요법에서의 이산화탄소 함량 증가{Carbon dioxide enhancement of inhalation therapy}

발명의 배경

발명 분야

본 발명은 일반적으로 약물학 및 약물 전달 분야에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 이산화탄소 가스를 사용하여 흡입요법 동안에 분무된 약물의 폐 침착을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

관련 기술의 설명

소립자 리포좀 에어로졸 처치는 제트 분무기를 통해 수성 분산액으로부터 투여되는 리포좀내로 혼입된 지용성 또는 수용성 항암 약물로 구성된다(참조: 미국 특허 제5,049,388호). 분무시 발생되는 1 내지 3㎛ 공기 동력학적 질량 중위 직경(mass median aerodynamic diameter: MMAD)의 에어로졸은 호흡 기관의 표면을 표적으로 한 전달을 가능하게 한다. 이어서, 침착된 리포좀은 약물을 국소적으로 폐내로 방출하거나 혈액을 통해 순환하면서 폐외 조직으로 전달한다.

약물이 지용성인 경우, 약물은 사용된 지질 분자, 즉 사용된 항암 약물에 특이적인 방식으로 지질 분자와 결합할 것이고 현탁화 수성 매질중에 포함될 수 있는 다양한 용해성 성분에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 용해성 성분으로는 완충 염 및 가능하게는 폐 조직에 계면활성 인지질의 합성 및 분비를 증가시키고 이미 존재하는 호흡 장애 또는 에어로졸 처치에 의해 유발될 수 있는 장애를 최소화하는 이노시톨을 포함할 수 있다(7).

약물이 수용성인 경우, 약물은 다중라멜라 리포좀의 지질 이중층(라멜라)사이의 중심 공간에 존재하는 수성 소포에 적절한 절차에 의해 혼입될 수 있다. 단일라멜라 리포좀은 제조될 수 있다. 그러나, 지용성 또는 수용성 약물을 포획하는 그들의 능력은 포획이 하나의 중심 소포로 제한되기 때문에 감소된다. 에어로졸 물방물은 하나 이상의 약물-리포좀을 함유할 수 있다. 게다가, 상이한 약물-함유 리포좀을 혼합하거나 약물이 혼합되어 내재되어 있는 리포좀을 사용함으로써 에어로졸 리포좀 처치에 의해 하나 이상의 약물을 혼입시키는 것이 가능하다.

분무는 분무기의 노즐로부터 쉽게 방출되는 크기로 리포좀을 절단시킨다. 직경이 수 미크론이하의 리포좀은 전형적으로 500nm보다 적은 직경으로 절단되며 분무기의 작동 특징 및 기타 변수에 따라 500nm보다 상당히 작을 수 있다. 리포좀내에 함유된 수용성 약물의 절단은 감지할 수 있는 양, 아마 50%의 수용성 화합물을 방출할 것이다. 이것은 리포좀 사용에 대한 금기가 아니라 약물 제제의 두 가지 형태가 투여되고 효과가 어느 한 형태가 단독으로 주어졌을 지라도 양 형태에 의해 생성되는 치료 효과를 포함함을 의미한다. 리포좀 에어로졸 처치에 대한 기타 많은 세부사항은 미국특허 제5,049,388호에 기술되어 있다.

일반적으로, 흡입요법의 주된 목적은 중추 기도 및 호흡관의 주변 부위로 약물의 에어로졸 입자의 국소 전달에 있다. 그러나, 1 내지 2㎛ 공기 동력학적 질량중위 직경의 최적 크기 범위에서 조차 흡입된 입자의 침착 비율은 약 20%에 불과하다(1, 2). 흡입된 에어로졸의 폐 침착은 입자 크기, 흡습성 및 기도 구조에 의해 유의적으로 영향을 받는다(1,2).

특정적으로, 숨을 멈추는 것은 폐내에 입자의 증가된 잔류 시간으로 인해 폐 침착을 현저히 증가시킨다. 이것은 특히 작은 주변 기도에서 중력 침적이 좀더 장기간 일어날 수 있도록 하고 확실하게 수성 입자가 거의 100% 습도에서 완전히 평형을 이루고 최대 크기에 도달할 수 있도록 하며 추가로 침적을 증가시킨다(1,2). 컴퓨터 시뮬레이션은 사람이 30초간 호흡을 멈추는 행위가 침착율을 3.2배 증대시킬 수 있음을 증명한다. 이 효과의 생리학적 원리는 흡입 용량이 기본 호흡시 흡입되는 양에 비해 8배 많을 수 있는 깊은 호흡시 증가된 입자 흡수에 기인한다. 이렇게 큰 호흡량은 기도 직경이 가장 작은 폐의 가장 먼 지점에 입자의 침투를 유도하며 이에 따라 중력 및 최대 입자 크기로 인한 침착이 최고의 효율로 일어난다.

이러한 생리학적 특성의 신장에 의해, 호흡된 공기(에어로졸 입자를 함유)의 용량은 후속적으로 중추 기도 및 훨씬 더 높은 정도로 주변 폐에 침착 비율을 현저히 증가시킨다. 이산화탄소(CO₂)는 호흡의 가장 중요한 천연 조절인자이다. 이산화탄소는 현재의 압력 구배에 따라 조직으로부터 혈액내로 자유롭게 확산한다. 혈액내에 이산화탄소의 증가된 수준은 뇌척수액내로 쉽게 확산하며 여기서 HCO₃ ^-및 H⁺로의 전환이 발생한다. 척수의 복면 표면상의 중추 화학수용체는 CSF에 증가된 H⁺에반응하고 환기(호흡 속도 및 호흡량)에서의 보상적인 증가를 일으킨다.

연구원들은 실험 동물 및 사람에게서 이산화탄소 흡입을 이용하여 환기를 조절하였다. 5% 이산화탄소의 흡입은 호흡량의 192% 증가를 일으킨다(3). 이러한 증가는 신속하게 일어나며 노출되는 내내 지속적인 고평부에 도달한다(4). 일단 이산화탄소 노출이 정지되면, 환기의 변화는 수분내에 기본 수준으로 환원한다(4). 유사하게, 사람에 의한 5% 이산화탄소의 흡입은 분당 호흡량으로 3배 증가를 유도한다(5). 2분 동안에 정상인에 의한 5% 또는 7.5% 이산화탄소의 흡입은 각각 6.7% 및 19%의 호흡 빈도 증가를 유발하고 각각 31% 및 52%의 호흡량 증가를 유발하여 결과적으로 분당 호흡량이 각각 34% 및 75%로 증가하였다(6). 이들 농도에 대한 좀더 긴 노출은 훨씬 더 큰 반응을 낳았다(5).

캠프토테신 유사체 및 텍산은 현재 화학치료제로서 개발되어온 화학 물질이다(21,26). 항암제 파클리탁셀(PTX) 및 다른 캠프토테신(CPT) 유도체는 폐암을 포함한 여러 사람 종양의 치료에서 임상적으로 활성적이다. 이들 약물은 단독 물질로 사용되거나 다른 약물과 배합하여 사용될 때 임상 시험에서 유익할 결과를 보여준다(21). 이들 약물은 경구 또는 정맥내 투여 경로에 의해 전신적으로 투여된다. 파클리탁셀의 가장 효과적인 경로는 연속적인 정맥내 주입(22,24)인 반면, 캠프토테신은 호지성 동질물을 경구 투여할 때 가장 효과적으로 것으로 증명되었다.

독성 부작용의 발생은 흔히 이러한 치료 섭생에서의 주요한 제약이 된다. 누드 마우스(23) 및 실험 쥐 폐 전이(6)에서 수개의 피하 사람 암 이종이식편은 치료 대체 방법으로서 에어로졸 경로에 의해 투여된 캠프토테신 및9-니트로캠프토테신(9NC)의 리포좀 제제를 사용하여 성공적으로 치료되었다. 캠프토테신을 이용한 마우스에서의 약동학적 연구는 리포좀 캠프토테신의 흡입이 폐 및 기타 기관에서 실질적인 약물 수준을 형성하였고 에어로졸 전달의 정지 후 급속히 제거되었음을 보여주었다(17). 이들 수준에도 불구하고 에어로졸 전달 시스템은 일반적으로 약물 침착에 효율적인 15 내지 20%에 불과하다. 따라서, 폐 침착을 증가시키는 것이 유리하다(29, 30).

이러한 약물 전달의 전신 경로를 사용할 때, 약물의 특정 양이 혈류로부터 이탈하고 호흡 조직에 국재하지만, 폐는 약물 침착에 주 기관이 아니다. 이들 약물의 캐리어로서 통상적인 리포좀의 이용은 흔히 사용되는 전신 경로에 의해 투여되는 약물의 폐 침착을 개선하지 못한다(11,27). 분무는 호흡관으로 표적 약물(예, 캠프토테신)을 전달하는데 매우 효과적인 경로이다(17). 자발적으로 발생한 원발성 및 전이성 폐 종양을 가진 개가 독소루비신과 PTX의 새로운 제제를 에어로졸화에 의해 전달되었을 때 성공적으로 치료되었다(16). 그러나, 이들 사례의 경우, 에어로졸은 보통의 공기를 사용하여 발생되었다.

다른 조직으로의 유전자 전달이 바이러스성과 바이러스성 벡터 둘 다를 사용하여 달성되었다. 비록 비바이러스성 벡터의 사용이 바이러스성 벡터와 연관된 면역원성 반응을 회피할 지라도, 양이온성 지질과 폴리양이온성 중합체와 같은 비바이러스성 벡터는 일반적으로 바이러스성 벡터의 특징인 유전자 발현의 고수준과 관련이 없다. 그러나, 양이온성 중합체인 폴리에틸렌이민(PEI)는 조직 배양 및 생체 실험 모두에서 효과적이다(36). 매 3번째 질소에 존재하는 양자성 질소는 폴리에틸렌이민에게 거대한 완충능을 제공한다. 폴리에틸렌이민은 효과적으로 DNA를 핵으로 수송하고(37) DNA를 DNAse 분해에 대해 보호할 수 있다(36). 폴리에틸렌이민의 직선형과 가지형 둘 다는 폐, 뇌 및 신장과 같은 여러 조직에서 고수준의 트랜스유전자(transgene) 발현을 생성하는 것으로 나타났다(39 내지 41). 또한, 폴리에틸렌이민은 DNA를 생체내 종양으로 효율적으로 전달하기 위해 사용되었다(42).

에어로졸 전달은 해당 유전자를 폐로 전달하는 비침해적인 방법이며 폐암 및 낭포성 섬유증과 같은 질환을 치료하는데 잠재적으로 사용될 수 있다. 그러나, 트랜스유전자 발현의 수준은 일부 경우에 있어서 분무화 동안에 DNA 생존력의 상실로 인해 높지 않다(43). PEI는 분무화 동안에 DNA를 보호할 수 있으며(44) 시험된 다른 양이온성 지질 대부분보다 폐에서 보다 고도한 수준의 형질감염을 낳을 수 있다(44,45). PEI 매개된 형질감염은 또한 폐 계면활성제에 의한 억제에 대해 내성적이다(46).

흡입 경로에 의해 호흡관으로 약물 침착의 증가된 효율은 수 가지 방식에 의해 달성된다: 1) 에어로졸화를 위해 사용된 제형에 약물의 농도를 변화시킨다(31); 2) 보다 효율적인 유형의 분무기를 사용한다(32); 3) 치료 기간을 증가시킨다; 또는 4) 호흡 패턴을 변화시킨다(4). 전술된 바와 같이, 이산화탄소는 호흡의 천연적인 조절인자이다. 저농도의 CO₂(약 3 내지 7%)를 함유한 공기의 흡입은 호흡 패턴에서 유사한 변화를 일으켰고 잘 허용되었다(13,6). 사람에게서 공기중 5% CO₂의 흡입과 보통의 육체 운동사이에서 호흡 패턴의 차이는 관찰되지 않았다(32). 공기중 5%CO₂의 유사한 효과가 사람에게서 에어로졸 처치를 사용하여 얻을 수 있다. 따라서, 흡입요법의 조절인자로서 분무화시 CO₂증가된 공기의 이용은 화학치료제의 보다 효과적인 폐 전달을 제공할 수 있다.

종래 기술은 흡입요법동안에 에어로졸화된 약물의 폐 침착을 증가시키는 수단의 결여로 인해 불완전하다. 본 발명은 종래 이러한 수년간의 필요성 및 욕구를 충족한다.

발명의 요약

본 발명은 에어로졸화된 약물을 약 10% 이하의 이산화탄소 가스를 함유하는 공기 혼합물을 통해 투여하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물의 호흡관에서 에어로졸화된 약물의 침착을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 명세서에는 2.5%, 5% 및 7.5%의 이산화탄소 농도가 사용되었다. 에어로졸은 1 내지 30분 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 투여된 약물은 용액에 용해되고 제트 분무기로 직접 에어로졸화될 수 있거나 에어로졸화이전에 리포좀, 서방성 중합체 또는 폴리양이온성 중합체와 같은 캐리어내로 혼입될 수 있는 용해성 약물, 불용성 약물 또는 치료 조성물, 예를 들면 올리고뉴클레오타이드, 유전자, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.

본 발명의 기타 및 추가의 관점, 특징 및 이점은 설명의 목적상 주어지는 본 발명의 바람직한 양태에 대한 아래의 설명으로부터 명백할 것이다.

본 발명의 상기된 특징, 이점 및 목적뿐만 아니라 자명할 수 있는 기타 특징, 이점 및 목적을 달성하고 좀더 상세히 이해될 수 있도록, 상기 요약된 본 발명에 대한 보다 특정적인 설명이 첨부된 도면에 도해된 특정 양태를 참고로 하여 주어질 것이다. 이들 도면은 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 도해한 것이므로 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1은 보통의 공기(빈 막대) 또는 5% CO₂증가된 공기(빗금 막대)로 발생된 리포좀 에어로졸에 30분 노출 후 캠프토테신의 조직 분포를 보여준다. 처치 30분 후 그룹당 3 마리 마우스의 기관을 절개하고 약물 함량을 HPLC로 측정하였다. SD를 포함한 평균값으로 계산된다. 정상 공기와 비교하여 5% CO₂-공기에 대한 P 값은 폐, 간, 비장, 신장, 혈액 및 뇌의 경우 각각 0.02, 0.13, 0.04, 0.04, 0.03 및 0.01이다(스튜던트 t-테스트, 투-테일드).

도 2는 정상 공기(○) 또는 5% CO₂-증가된 공기(●)로 발생된 에어로졸에 의해 30분 동안 투여된 CPT-리포좀에 대한 폐 농도-시간 곡선을 보여준다. 각 시점에서 3마리 마우스로부터 폐를 절개하고 약물 함량을 HPLC로 결정하였다. SD를 갖는 평균값이 계산된다.

도 3은 정상 공기(○) 또는 5% CO₂-증가된 공기(●)로 발생된 에어로졸에 의해 30분 동안 투여된 PTX-리포좀에 대한 폐 농도-시간 곡선을 보여준다. 각 시점에서 3마리 마우스로부터 폐를 절개하고 약물 함량을 HPLC로 결정하였다. SD를 포함한 평균값이 계산된다.

도 4는 에어로졸을 함유한 상이한 리포좀 제제에 노출된 마우스의 폐에서의 조직 파클리탁셀 수준을 비교한 것이다. 파클리탁셀에 대한 노출의 균등 수준은 DLPC가 사용될 때와 마찬가지로 디미리스틸포스포에탄올아민 폴리(에틸렌 글리콜) 2000으로부터 제조된 입체적으로 안정화된 파클리탁셀-리포좀의 공기중 5% CO₂에어로졸에서 달성된다.

도 5는 공기 또는 5% CO₂함유 공기를 사용하여 발생된 PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐에서의 CAT 발현사이의 비교를 보여준다. CAT 플라스미드 1㎎을 10:1의 N:P 비율인 PEI와 혼합하고 생성된 복합체를 30분 동안 마우스에 에어로졸화한다. 24시간 후 폐를 절개하고 CAT 검정을 기술된 바와 같이 실시한다. 값은 평균±SD(n=그룹당 6마리 마우스, P=0.001)이다.

도 6은 에어로졸에 의한 폐로의 PEI-DNA 전달의 효율에 미치는 CO₂%의 효과를 보여준다. 공기중 CO₂의 다른 비율이 고정된 양의 CAT 플라스미드와 함께 사용된다. 복합체는 0%, 2.5%, 5%, 10% 이산화탄소 및 대조군을 사용하여 에어로졸화되었다. 마우스를 희생시키고 폐를 분리한 다음 CAT 검정을 실시하였다. 값은 평균±SD로서 표시된다.

도 7은 PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐에서의 유전자 발현이 용량 의존적임을보여준다. 10:1의 고정된 N:P 비율로 공기중 5% CO₂를 사용하여 증가 용량의 CAT 플라스미드가 에어로졸화되었다. 전달된 DNA의 총량과 전달된 PEI-DNA의 농도 모두가 증가되었다. 24시간 후 마우스를 희생시키고 폐를 수거한 다음 CAT 단백질을 검정하였다. 값은 평균±SD(n=그룹당 5마리 마우스)이다.

도 8은 에어로졸에 의한 폐에서의 PEI-DNA 전달의 효율에 미치는 N:P 비율의 효과를 보여준다. 상이한 PEI-DNA (N:P) 비율이 고정된 양의 CAT 플라스미드(2mg)와 함께 사용된다. 공기중 5% CO₂를 사용하여 복합체를 에어로졸화한다. 24시간 후에 마우스를 희생시키고 폐를 수거한 다음 CAT 검정을 실시한다. 값은 평균±SD(n=그룹당 5마리 마우스)이다.

도 9는 폐에서 루시퍼라제 유전자 발현에 미치는 N:P 비율의 효과를 보여준다. 고정된 양의 루시퍼라제 플라스미드(2mg)가 상이한 N:P 비율로 전달된다. 복합체는 공기중 5% CO₂를 사용하여 에어로졸화한다. 에어로졸 전달 후 24시간이 경과하여 마우스를 희생시키고 폐를 수확한 다음 루시퍼라제 활성을 결정한다. 값은 평균±SD(n=그룹당 5마리 마우스)이다.

도 10은 일회 PEI-DNA 에어로졸 노출 후 트랜스유전자 발현의 시간 경과를 보여준다. 도 10a에서 마우스에는 공기중 5% CO₂를 사용하여 15:1의 N:P 비율로 2 mg의 CAT 플라스미드를 함유한 에어로졸이 전달된다. 다른 시점에서 마우스를 희생시키고 폐를 수거한 후 즉시 동결시킨다. 최종 시점에서 CAT 검정을 수행한다. 값은 평균±SD(n=그룹당 5마리 마우스)이다. 도 10b는 두 개의 상이한 N:P 비율을 사용한 CAT 발현의 연속을 보여준다. 마우스의 양 그룹(n= 그룹 당 시점 당 5마리 마우스)에 공기중 5% CO₂를 사용하여 15:1 또는 10:1 NPP 비율로 2mg의 CAT 플라스미드가 전달된다. 10:1 비율의 경우 시점은 에어로졸 노출 후 1, 2, 3 및 6일이고, 15:1 비율의 경우는 시점이 에어로졸 노출 후 1, 3, 7 및 10일이다.

도 11은 일회 PEI-DNA 에어로졸 노출 후 트랜스유전자의 조직 분포를 보여준다. 동일한 그룹의 마우스가 도 9에서와 같이 사용된다(10:1 그룹으로부터). 상이한 조직을 수거하고 즉시 동결시킨다. 최종 시점 후 CAT 단백질을 검정한다. 값은 평균±SD(n=그룹당 5마리 마우스)이다. 에어로졸 노출된 그룹에서의 폐가 아닌 조직에서 CAT의 수준은 대조 조직과 상이하지 않다(P>0.1).

도 12는 PEI-DNA 에어로졸 처리된 폐의 조직학적 분석을 보여준다. 2㎎ CAT 플라스미드는 15:1의 N:P 비율로 PEI와 혼합하고 복합체를 공기중 5% CO₂을 사용하여 30분 동안 5마리 마우스에 에어로졸화하였다. 24시간 후 마우스를 희생시키고 폐를 수거한 다음 포르말린에 고정한다. 얇은 박층을 헴톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색한다. 도 12a: 세기관지(대조); 도 12b: 세기관지(처리군). 배율 100배.

도 13은 PEI-p53 에어로졸 전달에 의한 B16-F10 폐 전이의 억제를 보여준다. 도 13a: 다음의 식으로 종양 지수를 계산하였다: 종양 지수 = 폐 중량 x 그룹에 대한 평균 등급. 값은 평균±SD(n=그룹당 10마리 마우스)이다. 도 13b: 대조군 PEI-루캔드 PEI p53 처리된 마우스로부터 대표적인 폐가 제시된다(n=그룹당 10마리 마우스). PEI 처리된 그룹으로부터의 폐(미도시)는 대조군 PEI-Luc 처리된 그룹에서나타난 것과 종양 위치의 모양, 크기 및 수에서 비슷하다. 데이터는 두 번의 별도 실험을 대표하는 것이다. 도 13c: 상이한 마우스 그룹의 폐 중량. 값은 평균±SD(n=그룹당 10마리 마우스)이다.

본 발명은 에어로졸화된 약물을 약 10% 이하의 이산화탄소 가스를 함유하는 공기 혼합물을 통해 투여하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물의 호흡관에서 에어로졸화된 약물의 침착을 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직한 농도는 2.5%, 5% 및 7.5%의 이산화탄소 가스를 포함한다. 에어로졸은 1 내지 30분 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다.

본 발명은 수용성 약물의 에어로졸 전달에 관한 것이다. 이러한 약물은 수용액 또는 완충액으로 직접 제조되고 직접 에어로졸화될 수 있다. 대표적인 수용성 약물로는 토브라마이신 및 펜타미딘과 같은 항생물질, 아세틸 시스테인과 같은 점액용해제, 알부테롤과 같은 기관지 확장제, 이프라트로피움 브로마이드와 같은 부교감신경계 제제, DNase와 같은 효소 및 리바비린과 같은 항바이러스제가 포함된다.

다른 방도로서, 본 발명은 에어로졸 전달 이전에 담체와 결합된 불용성 약물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 가능한 담체로는 리포좀, 서방성 중합체 및 폴리양이온성 중합체가 포함된다. 리포좀은 암포테리신 B와 같은 지방친화성 약물, 나이스타틴, 글루코코르티코이드, CsA, FK506, 라파마이신 또는 마이코페놀레이트와 같은 면역억제제 및 캠프토테신, 캠프토테신 유도체 및 파클리탁셀과 같은 항암제를 위해 특히 유용한 담체이다. 리포좀은 인지질 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC)과 같은 지질로부터 형성되거나 디미리스틸포스포에탄올아민 폴리(에틸렌 글리콜) 2000과 같은 변형된 인지질로 제형된 입체적으로 안정화된 리포좀일 수 있다. 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)과 같은 서방성 중합체 또는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 폴리양이온성 중합체가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 치료 단백질, 치료 펩타이드, DNA 유전자, 센스 올리고뉴클레오타이드, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 및 바이러스 벡터의 전달에 적용될 수 있다. DNA 유전자의 대표적인 예로는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(CAT) 또는 p53 유전자를 들 수 있다. 바람직하게는, 이들 유전자는 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온성 중합체 캐리어를 통해 전달된다. 양이온성 리포좀은 또한 캐리어로서 사용될 수 있다. 폴리에틸렌이민은 약 10:1 내지 약 20:1의 질소:포스페이트 비율을 가질 수 있다. 바람직한 양태로서, PEI 질소:포스페이트 비율은 약 10:1이다.

다음의 정의가 제공된다. 구체적으로 정의되지 않은 용어는 본 분야에서의 통상적인 의미를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "에어로졸"은 비교적 공기로 운반되는 안정성을 갖기에 충분한 입도 및 낮은 침전 속도를 갖는 고체 또는 액체 입자의 분산을 가리킨다(8).

본원에 사용된 용어 "리포좀 에어로졸"은 사람 또는 동물의 호흡관에서 전달하고자 하는 하나 이상의 약물을 함유한 하나 이상의 리포좀 입자 또는 리포좀이 분산되어 있는 수성 액적을 가리킨다.

본원에 사용된 에어로졸 액적의 크기는 미국 특허 제5,049,338호에 기술된 것이다. 즉, 약 1.8 내지 2.2의 기하 표준 편차를 포함한 1 내지 3㎛의 공기 동력학적 질량 중위 직경(MMAD)이다. 그러나, 9-NC 및 가능한 다른 캠프토테신 유도체의 저 농도에서 공기 동력학적 질량 중위 직경은 1㎛ 미만, 예를 들면 0.8㎛일 수 있다. 본 발명에 기술된 연구를 기초로 하여, 리포좀은 이것이 주변 상대 습도로 평형되었을 때 실질적인 모든 액적의 용적을 구성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "바이벨 폐 모델(Weibel Lung Model)"은 사람 기토의 23개 연속 분지를 인식하는 사람 폐의 구조의 분류를 가리킨다. 기관은 0으로 표지되고, 기관지 및 세기관지는 분지 16을 통해 연장된다. 기도의 이러한 부분은 섬모충 상피 및 점액선을 함유한다. 이들은 함께 점액섬모 블랭킷을 구성한다. 분지 17 내지 23은 폐의 소와상 기포 부분을 구성하고 점액섬모 블랭킷을 갖지 않는다. 따라서, 여기에 침착된 입자들은 기도로 수송되어 팽창되지 않는다.

과탄산혈증의 조절된 실험 상태하에 흡입된 약물 입자의 침착은 기본 호흡 상태 동안에 관찰된 수준 이상으로 크게 증가하는 것으로 추정된다. 연속 유동 제트 분무기를 가동하기 위해 이산화탄소 가스/공기 혼합물의 사용은 주변 폐(바이벨의 세대 17-23)로 전달된 약물 용량의 효율을 상당히 증가시킬 수 있었다. 유사하게, 이 시스템은 흡입된 약물의 생물학적 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다. 이 개념은 이론상으로 어떠한 약물, 유전자, 올리고뉴클레오타이드 또는단백질/펩타이드 제제(용해성, 리포좀, 결정 또는 중합체계 캐리어, 예를 들면 폴리에틸렌이민) 또는 어떠한 가스 또는 공기 구동된 제트 분무기와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 에어로졸화된 약물에서와 같은 흡입요법 동안에 이산화탄소 가스를 사용하여 호흡 깊이 및 빈도를 증가시키고 결과적으로 증가된 1분 호흡 용량을 제공하는 것에 관한 것이다. 증가된 호흡 폐 용량은 특히 낮은 수준의 호흡에서 완전히 환기될 수 없는 폐 주변에서 흡입된 약물 입자의 증가된 폐 침착을 유도한다. 호흡의 증가된 빈도 및 깊이로부터 발생되는 증가된 1분 용량은 증가된 일분 용량에 기여한다.

약 10%까지의 이산화탄소 가스를 함유한 공기 혼합물에 에어로졸화된 약물을 투여하는 것은 호흡게에서 약물의 증가된 침착을 유도하며, 측정가능할 정도로 에어로졸 약물 전달의 효율 및 치료 효능을 향상시킨다. 바람직한 농도는 2.5%, 5% 및 7.5% 이산화탄소 가스를 포함한다. 에어로졸은 1 내지 30분 또는 그 이상 동안 투여할 수 있다. 이산화탄소의 증가하는 효과는 30초내에 명백하다. 이산화탄소의 호흡 효과는 일시적이고 반복해서 사용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 여러 양태를 예시할 목적으로 제시되며 어떠한 형태로든 본 발명을 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

재료

PTX는 젝켐(Xechem, New Brunswick, NJ)으로부터 입수하였다. CPT는 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터, 9NC는 켐베르트(ChemWerth, Woodbridge, CN)으로부터 입수하였다. 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC)은 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)로부터 구입하였다. DMSO는 시그마로부터 구입하고 HPLC 등급 다른 유기 용매는 피셔 사이언티픽으로부터 입수하였다. 관개를 위한 멸균수는 박스터 헬쓰캐어 코포레이션(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)으로부터 입수하였다.

ICR 마우스(7 내지 8주령)는 할란-스프라그 다울리(Harlan-Sprague Dawley, Indianapolis, IN)으로부터 입수하고 표준 쥐장에 수용하여 음식과 물을 수시로 공급하였다. 암컷 C57BL/6 마우스(8 내지 9 주령) 및 암컷 Balb/C 마우스(5 내지 7주령)는 할란-스프라그 다울리(Houston, TX)로부터 입수하였다. 모든 동물은 약물 협회 동물 보호 및 사용 위원회의 배일러 칼리지(Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 보호되었다.

세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(CAT, p4119, Ref. 15)는 트랜스 유전자 발현을 측정하기 위한 리포터 유전자로서 주로 사용된다. CAT 유전자는 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터/인핸서 요소의 조절하에 있다. CMV 프로모터/인핸서 요소 및 사람 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열의 삽입에 의해 변형된 루시퍼라제 플라스미드(pGL3, Promega, Madison, WI)는 마이클 배리 박사(Center for Cell and Gene Therapy, Baylor)로부터 얻은 것이다. 모든 플라스미드는 퀴아젠 컬럼(Qiagen, Valencia, CA)에서 정제하고 내독소가 완전히 분리된다. 플라스미드는 260nm에서의 UV 흡광에 의해 정량한다. 아가로즈 겔 분석 결과 플라스미드는 소량의 니크 플라스미드와 주로 슈퍼코일된 플라스미드의 혼합물인 것으로 드러났다.

p53 유전자를 함유한 플라스미드는 와이. 케이. 풍 박사(Y.K. Fung, Children's Hospital, Los Angeles, CA)으로부터 입수하였다. p53 유전자는 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서 요소의 조절하에 있다. 대조군으로 사용된 플라스미드는 개똥벌레 루시퍼라제(Luc) 유전자를 함유하며 마이클 배리 박사(Baylor College of Medicine)으로부터 입수하였다. 플라스미드는 바유 바이오랩스(Bayou Biolabs, Harahan, LA)에 의해 상업적으로 정제되었고 내독소가 유리되었으며 UV 흡광을 사용하여 정량하였다. 아가로즈 겔 분석 결과 플라스미드는 주로 슈퍼코일된 형태이고 소량이 니크 플라스미드인 것으로 밝혀졌다.

B16-F10 흑색종 세포주는 디비젼 오브 캔서 트리트먼트 앤드 다이아그노시스 센터[Division of Cancer Treatment and Diagnosis Center(DCTDC, NCE, Frederick, MD)]로부터 입수하였고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포주는 폐에서 종양을 형성하는 것으로 나타났다(15). 마우스당 250㎕의 배지에 이만오천 B16-F10 세포가 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사된다. 폐 전이는 세포의 접종 후 2주내에 시각적으로 검출된다. 세포는 3 내지 12 계대에서 사용되었다.

실시예 2

통계

평균을 비교하기 위해 가변 원-웨이 분석(ANOVA)을 실시한 후 투-테일 비쌍 스튜던트 t-시험을 실시하였다. P≤0.05인 경우 차는 유의적인 것으로 고려되었다.

실시예 3

리포좀의 제조

DLPC, PTX 및 캠프토테신의 원액은 전기된 방법을 사용하여 각각 100, 10 및 1mg/ml로 t-부탄올에서 제조한다(17). 파클리탁셀과 DLPC의 분획을 1:10의 중량비로 혼합한다. 캠프토테신 대 DLPC 중량비는 1:50이다. 그 다음, 약물-인지질 혼합물을 액체 질소에서 동결시키고 밤새 건조 분말로 동결건조시킨다. 제제는 -20℃에서 밀봉 저장한다. 사용하기 전에 혼합물을 관개용 멸균수에 재용해시키고 균일한 다중라멜라 리포좀 현탁액이 수득될 때까지 와동시킨다. 분무하기 전에 현탁액중의 캠프토테신과 파클리탁셀의 초기 농도는 각각 0.5mg/ml 및 10mg/ml이다. 분무 전후 리포좀의 크기는 니콤프 서브마이크론 파티클 사이저 모델 370 9니콤프[Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370 9NICOMP(Santa Barbara, CA)]을 사용하여 결정한다.

실시예 4

에어로졸 입자 크기 특징

리포좀에 의해 캡슐화된 약물을 함유한 에어로졸 입자의 특징은 공개된 바와같이(31) 안더젠(Andersen)/AFCM 생육불능의 주변 입자 사이징 샘플러(Andersen Instruments, Atlanta, CA)를 사용하여 결정하였다. AERO-MIST 분무기를 통해 10 L/분으로 유동하는 공기 또는 가스 혼합물에 의해 생성된 에어로졸중의 약물의 농도는 또한 에어로졸화 개시 후 1분 경과하여 이로부터 3분 동안 샘플을 수거하여 측정한다. 공기 동력학적 질량 중위 직경(MMAD) 및 기하 표준 편차(GSD)는 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 2.0 소프트웨어(Synergy Software, Reading, PA)를 사용하여 공개된 바와 같이(30, 31) 계산한다.

실시예 5

파클리탁셀과 캠프토테신의 에어로졸 전달

에어로졸로 마우스를 처리하는 것은 전술된 바와 같이 수행한다(16 내지 18). 간단히 설명하면, AERO-MIST 제트 분무기(CIS-USA, Bedford, MA)를 사용하여 10 L/min의 공기 유속으로 에어로졸 입자를 형성한다. 마우스를 밀폐된 플라스틱 쥐장(23 x 18 x 13cm)에 넣고 에어로졸에 30분 동안 노출시킨다. 에어로졸은 보통 공기와 CO₂를 혼합기(Bird 3m, Palm Springs, CA)로 혼합시켜 얻은 5% CO₂증가된 공기 또는 보통 공기로 형성하고 CO₂농도는 플루이드 파이리트[Fluid Fyrite(Bacharach Inc., Pittsburgh, PA)]로 계산한다. 각 시점에서 3마리 쥐를 쥐장에서 꺼내어 이소플루란, USP(Abbott Laboratories, Chicago, IL)에 노출시키고 방혈하여 희생시킨다. 기관을 절개하고 중량을 잰 다음 추출할 때까지 -70℃에서동결 보관한다.

실시예 6

조직으로부터 약물의 추출

추출 전에, 샘플을 해동하고 즉시 가위로 절편시킨다. 조직으로부터 파클리탁셀을 추출하기 위해 3ml의 에틸아세테이트를 각 샘플에 첨가하고 미니-비드비터(Wig-L-Bug, Model 3110B, Crescent Dental MFR, Co., Lyons, IL)에서 2분간 균질화한다. 균질화물을 10ml 원뿔형 유리 원심분리관에 옮기고 1,000 x g로 10분 동안 원심분리한다. 상등액을 분리하고 유기 용매를 공기로 증발시킨다. 잔사를 0.2ml의 메탄올:아세토니트릴(2:1, v/v)중에 재용해시키고 수욕 초음파분쇄기에서 분쇄시키며 1,000 x g로 10분 동안 원심분리한다. 상등액을 30분 동안 37℃로 가온하고 HPLC로 분석한다.

캠프토테신 및 9NC의 추출 절차는 전술된 바와 같다(17). 간단히 설명하면, 조직을 해동한 후 20㎕중의 9NC 20㎍을 내부 표준물로서 기관에 첨가하여 추출 효율을 결정한다. 샘플을 절편으로 자르고 1ml의 0.1% 아세트산 수용액(pH 3.2)을 각 샘플에 첨가한다. 미니-비드비터에서 균질화한 후 균질화물을 1,000 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상등액을 8ml의 메틸렌 클로라이드로 재추출한다. 유기 분획을 분리하고 실온에서 공기 건조시킨다. 건조된 샘플을 0.2ml의 아세토니트릴중에 재용해시킨다.

실시예 7

HPLC 분석

227nm에서 워터스 486 UV 흡광 검출기(Waters, Milford, MA)에서 모니터링하면서 역상 HPLC하여 파클리탁셀을 정량한다. 모든 측정은 실온하에 워터스 노바-팩 C18 컬럼(3.9 x 150 cm)에서 이루어진다. 이동상은 49% 아세토니트릴과 51% 물로 구성된다. 유속은 1.5ml/min이다. 각 샘플의 25㎕ 분량을 주사하고 데이터를 워터스 밀레니움 소프트웨어로 분석한다. PTX 추출 효율 결정을 위해, 공지된 양의 파클리탁셀이 각 조직에 첨가되고 추출된 양의 파클리탁셀과 비교할 때 동일한 절차를 수행한다. 추출 효율(%)은 ((추출 후 파클리탁셀의 양)/(첨가된 파클리탁셀의 양) x 100)으로 계산한다. 모든 피건 조직의 경우 평균 추출 효율은 89±4%(데이터 미표시)이며 이 지수를 사용하여 조직내 약물의 최종 농도를 계산한다.

캠프토테신의 HPLC 분석은 워터스 노바팩 C18 컬럼(3.9 x 150cm)을 사용하여 실시한다(17). 캠프토테신에 대한 크로마토그램은 워터스 470 스캐닝 형광 검출기(λex=360nm, λem=455nm)에 대해 모니터링하는 한편 9NC는 254nm에서 모니터링하면서 워터스 440 UV 흡광 검출기를 사용하여 검출한다. 이동상은 30% 아세토니트릴과 70%의 0.1% 아세트산 수용액(pH 3.5)으로 구성되며 유속은 1.2 ml/min이다(16,17).

실시예 8

리포좀 제제의 에어로졸 특징

CPT-DLPC 및 PTX-DLPC 리포좀의 특성과 이들의 에어로졸 특징은 표 1에 요약되어 있다. 5% CO₂공기의 이용은 에어로졸중의 약물의 농도 또는 이들의 MMAD 및 GSD(P>0.1; 스튜던트 t-시험, 투-테일드)를 변화시키지 않았다. 분무 절차는 양 약물 제제에 대해 용액중의 리포좀 입자의 크기를 미크론으로부터 나노로 감소시킨다. CPT-DLPC의 리포좀의 크기는 5% CO₂-공기 혼합물의 사용에 의해 분무전 2.54±0.91㎛로부터 분무 후 0.49±0.07㎛로 감소하였다. PTX-DLPC 제제의 경우, 이들 값은 각각 13.14±12.15㎛ 및 0.23±0.17㎛이다. 분무 전후 에어로졸 입자 크기는 보통 공기 또는 5% CO₂-공기를 사용하여 에어로졸로 투여된 PTX-DLPC 또는 CPT-DLPC의 경우 다르지 않다(P>0.5; 스튜던트 t-시험, 투-테일).

5% CO₂-공기 대 보통 공기를 사용한 PTX-DLPC 및 CPT-DLPC 제제의 에어로졸 및 리포좀 특징

약물 제제	공기조성	에어로졸속의약물농도μg/l	에어로졸 액적 μm	리포좀 크기 μm
약물 제제	공기조성	에어로졸속의약물농도μg/l	MMAD㎛	GSD	분무화전	분무화후
CPT-DLPC0.5mg CPT/ml	보통5% CO₂	9.0±1.39.2±1.9	1.6±0.31.7±0.5	2.1±0.12.3±0.2	3.72±1.102.54±0.91	0.34±0.110.49±0.07
PTX-DLPC10mg PTX/ml	보통5% CO₂	153.0±27175.0±9	2.0±0.22.2±0.2	1.8±0.31.9±0.1	12.49±8.0613.14±12.15	0.13±0.180.23±0.17
값=평균±SD(각 값의 경우 n=3); MMAD=공기 동력학적 질량 중위 직경; GSD=기하 표준 편차

실시예 9

보통 공기 또는 5% CO ₂ -증가된 공기로 발생된 에어로졸에 의한 전달 후 CPT-DLPC의 조직 분포 및 약물동력학

ICR 마우스를 두 그룹으로 나눈다. 제1 그룹(n=4)은 보통 공기로 발생된 에어로졸을 통해 30분 동안 CPT-DLPC 제제를 투여받았으며 이에 따라 그들의 호흡 변수는 치료 동안에 변화되지 않았다. 제2 그룹(n=6)은 동일한 제제를 흡입하였으나 대기는 5% CO₂-증가된 공기였다.

5% CO₂-공기로 발생된 에어로졸의 흡입은 폐내로 캠프토테신의 침작을 유의적으로 증시켰다(2.1 내지 3.5배)(도 1). CPT는 제1 및 제2 그룹의 마우스의 폐조직 그램당 각각 134±123 및 476±216ng으로 검출된다. 공기중 5% CO₂의 사용은 조직 분포 패턴에 변화를 일으키지 않았다. 5% CO₂-공기로 발생된 CPT-DLPC 에어로졸의 흡입 후 간, 비장, 신장, 혈액 및 뇌에서의 약물 농도는 또한 증가된다.

보통 공기 또는 5% CO₂-공기를 사용한 CPT-DLPC의 에어로졸에 30분 노출시키는 동안 또는 노출 후 폐내에 캠프토테신의 약물 동력학적 침착이 결정된다(도 2). 캠프토테신의 폐 농도는 에어로졸 처치의 종점(30분)에서 최대 농도(Cmax)로 처치하는 동안 증가하였고 그 이후 폐 농도는 감소하기 시작하였다. 최대 호흡 수준은 보통 공기 및 5% CO₂-공기의 경우 각각 조직 그램 당 232±158 및 486±78ng이다. 에어로졸이 정지된 후 15분 동안에 약물의 농도는 지수적으로 감소한다. 양 처리의경우 투명도 반감기(T1/2)은 12 내지 15분이다. 약물동력학 곡선의 프로필은 양 처리 유형의 경우 아주 유사하다. 단지 미량의 약물이 어느 공기원으로든 에어로졸화 종점 후 90분 경과하여(120분 시점) 폐에서 검출된다.

실시예 10

보통 공기 또는 5% CO ₂ -증가된 공기로 발생된 에어로졸 PTX-DLPC로 처치한 후 PTX 약물의 조직 분포 및 약물동력학

검출 방법의 한계로 인해, 10mg의 PTX/ml 현탁액에서 파클리탁셀의 리포좀 제제가 사용된다. 마우스는 노출 동안(15분), 처리 종점(30분)에서 및 처리 종점 후 수가지 시점에서 희생시킨다. 마우스는 보통 공기 또는 5% CO₂함유 공기로 발생된 PTX-DLPC 에어로졸에 노출된다.

폐의 파클리탁셀 Cmax 값은 어느 공기원으로든 처리 종점(30분)에서 달성된다(도 3). 5% CO₂증가된 고이 그룹에서 Cmax는 주변 공기 그룹에서 보다 4.2배 크다(각각, 23.1±4.3 및 5.5±0.2㎍/g). 이러한 이산화탄소 유도된 증가는 리포좀 제제와 무관하다(도 4). 디스미리스틸포스포에탄올아민 폴리(에틸렌 글리콜) 2000 및 디라우로일포스파티딜콜린을 사용하여 제조된 입체적으로 안정화된 파클리탁셀 리포좀은 공기중 5% CO₂가 사용될 때 균등한 수준으로 폐내에 침착된다.

5% CO₂로의 처치는 보통 공기와 비교하여 폐-농도-시간 곡선하에서 5.7배 큰면적을 형성하였다(각각, 33.7 및 5.9㎍-hr/g). 양 경우에서, PTX 농도는 치료 종점 후에 폐 조직으로부터 감소하기 시작하였다. 폐내에 파클리탁셀의 T1/2α 및 T1/2β 값은 보통 공기가 에어로졸 발생을 위해 사용될 때 각각 0.3 및 1.6h이다. 5% CO₂-공기로 생성된 리포좀 에어로졸에 의해 투여된 파클리탁셀의 경우 T1/2α는 0.7h이고 T1/2β는 5.1h이다. 간, 비장, 신장 및 혈액과 같은 기타 기관에 대한 대조 분석을 실시하였다. 그러나, 에어로졸화를 위해 보통 공기를 사용하여 이들 조직에서 파클리탁셀의 수준은 검출가능한 수준이하이다.

5% CO₂-공기를 사용한 리포좀 에어로졸 전달 후 파클리탁셀의 조직 분포는 표 2에 나타나 있다. 약물의 최고 농도는 폐에서 검출된다. 보다 낮은 농도가 다른 기관에서 발견된다. 부등변사각형 규칙을 이용하여 상이한 유기체에 대해 3시간 동안의 농도-시간 곡선(AUC)하의 면적 분석은 폐, 간, 신장, 혈액 및 뇌에서 다음의 AUC 값을 보여준다. 각각 조직 그램당 34±2, 9.8±1.9, 2.4±1.4, 2.8±1.5, 0.13±0.10, 0.23±0.2㎍ PTS-hr이다.

5% CO₂-공기로 발생된 에어로졸 PTX-DLPC^*에 30분 노출 동안 및 노출 후 조직내 PTX 침착

시간(hr)	PTX 농도(㎍/조직 g)
시간(hr)	폐	간	비장	신장	혈액	뇌
0.25	20.3±7.8	1.5±0.8	0.6±0.3	1.4±0.0	0.25±0.03	0.14±0.16
0.5	23.1±4.3	5.7±3.0	1.4±0.9	1.6±0.1	0.18±0.08	0.16±0.02
0.75	18.0±3.6	5.5±1.8	0.5±0.4	1.4±0.1	0.08±0.09	0.11±0.03
1.0	14.8±9.5	4.8±3.9	2.6±2.7	1.2±0.7	0.07±0.07	0.11±0.03
1.5	8.7±2.8	2.8±0.8	1.0±1.6	0.7±0.3	0.03±0.06	0.09±0.08
2.0	6.5±2.9	3.1±0.7	0.6±0.4	0.4±0.3	0.01±0.02	0.04±0.04
3.0	7.1±2.8	2.3±0.6	0.5±0.2	0.4±0.1	0.01±0.02	0.05±0.05
값은 3회 실험의 평균±SD이다(각 실험에서 3마리 마우스의 기관을 합하고 처리하였다)

실시예 11

약물 침착에 미치는 이산화탄소 유도된 호흡 패턴의 효과

공기중 5% CO₂의 흡입 후 폐내에서 발견되는 증가된 폐 약물 농도는 변화된 호흡 패턴에 의해 설명될 수 있다. 5% CO₂증가된 공기의 대기하에 마우스의 호흡 패턴은 좀더 깊고 좀더 느리게 되고 처리 종점 후 즉시 거의 정상으로 회복되는 것으로 가시적으로 관찰된다. 조직학적 분석은 폐 조직에서의 어떠한 변화도 나타나지 않았다. 다른 연구원에 의해 실시된 혈량측정 연구는 5% CO₂증가된 공기의 흡입이 주로 호흡량의 증가로 인해(약 170 내지 180%) 포유동물에서 환기를 증가시켰음을 증명하였다(18,19). 캠프토테신과 파클리탁셀의 평균 폐 침착은 약 2 내지 4배 증가하였다. 호흡량의 증가에 따른 이러한 반비례는 호흡 변수, 예를 들면 호흡수,호흡과 토출 사이클의 호흡 기간 및 1분 환기에서의 일부 다른 생리적 변화에 기인할 수 있다(13). 호흡 정지에 의한 깊고 완전한 토출에 의해 에어로졸의 보유는 보통의 호흡과 비교하여 거의 두 배 증가하였다(15).

실시예 12

PEI-DNA 복합체의 제조

PEI(25kDa, 분지됨)는 알드리히 케미칼(Aldrich Chemical, Milwaukee, WI)로부터 구입하였다. PEI 원액을 PBS (pH 7 내지 7.5)중의 4.3mg/ml(질소중의 0.1M)의 농도로 제조하였다. PEI와 DNA를 별도로 5ml 물중에서 필요한 농도로 혼합한다. PEI 용액을 서서히 와동시키고 여기에 DNA 용액을 첨가하여 10ml의 최종 용량을 만든다. 혼합물을 분무전에 실온에서 약 15 내지 20분 동안 정치시켜 둔다. 생성된 충진 비율은 PEI 질소:DNA 포스페이트(N:P)로서 표시되며, 이것은 DNA가 밀리그램당 3nmol의 포스페이트를 가지며 1㎕의 0.1M PEI 용액은 100nmol의 아민 질소를 갖는 다는 것을 고려하여 계산할 수 있다. 10:1 N:P 비율은 1:29;1 PEI:DNA 중량비에 상응한다.

실시예 13

PEI:DNA 복합체의 에어로졸 전달

마우스를 에어로졸 전달 이전에 테이프로 밀폐시킨 플라스틱 쥐장에 넣는다(48). 이것은 억제되지 않는 전신 에어로졸 노출 시스템이다. PEI-DNA 복합체는 보통 공기 또는 5% CO₂를 함유한 공기를 사용하여 10 리터/분의 유속으로 Aero-Mist 분무기(CIS-US, Inc., Bedford, MA)를 사용하여 에어로졸화된다. 에어로-미스트(Aero-Mist)는 이전에 공개된 방법에 의해 앤더센 캐스케이드 임팩터(Andersen Instruments, Atlanta, GA)를 사용하여 2.9의 기하 표준 편차(GSD)를 포함하여 1 내지 2㎛ MMAD의 최적 범위로 에어로졸을 생성하는 것으로 입증된 효율적인 고배출 분무기이다(50). 건조 공기원(Aridyne 3500, Timeter, Lancaster, PA)이 공기 컴프레서와 CO₂탱크에 연결된 버드 3M 가스 혼합기(Palm Springs, CA)에 전달된다. 생성된 공기와 CO₂의 혼합물은 혼합기에 전달된다. 공기중 5% CO₂의 최종 농도는 파이리트 용액(Bacharach, Pittsburgh, PA)를 사용하여 결정한다. 10ml 용액의 분무는 약 30분 걸렸다.

실시예 14

CAT 검정

마우스를 마취시키고 매 시점 후에 희생시킨 다음 폐 및 기타 기관을 수거하고 중량을 잰 후 즉시 동결건조시킨다. 생체내 발현을 측정하기 위해 CAT ELISA 키트(Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)를 사용한다. Wig-L-Bug 비드 균질화기(Crescent Dental Mfg., Lyons, II)를 사용하여 700㎕ CAT 검정 용해 완충액에서 조직을 균질화한다. 균질화물을 원심분리한 후, 200㎕의 추출물은 96-웰 평판 포맷에서 실시되는 CAT ELISA를 위해 사용한다. 흡광은 미세역가 평판리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 판독한다. 천연 마우스는 대조군으로 사용한다. CAT 활성은 정제된 CAT 효소로 제조된 표준 곡선을 사용하여 CAT ng/조직 g으로서 표현된다. 검정의 민감도는 제조업자의 제안에 따라 좀더 증가되며 그 결과 CAT 단백질의 수준을 0.1 내지 0.3pg/웰 이하로 검출할 수 있다.

실시예 15

루시퍼라제 검정

마우스를 마취시키고 희생시킨 다음 폐를 수거한다. 루시퍼라제 검정 키트(Promega)를 사용하여 루시퍼라제 발현을 측정한다. 폐를 Wig-L-Bug 비드 균질화기를 사용하여 1ml의 루시퍼라제 검정 용해 완충액에서 균질화한다. 균질화물을 원심분리한 후 10㎕의 추출물을 50㎕의 루시퍼라제 기질에 첨가하고 발광계측기(Microlumat LB 96 P, EG & G Berthold, Germany)상의 96-웰 평판에서 10초 동안 발광을 판독한다. 천연 마우스를 대조군으로 사용한다. 루시퍼라제 활성은 RLU/10s/조직 g으로서 표시된다. 이 시스템에서, 10⁷RLU는 프로메가로부터의 정제된 루시퍼라제를 사용하여 1ng의 루시퍼라제에 해당한다.

실시예 16

조직 단편의 조직 분석

마우스를 이소플루란으로 마취하고 복부 대동맥을 통해 방혈시켜 희생시킨다. 폐를 분리하고 캐뉼라를 삽입한 다음 10% 중성 완충 포르말린으로 팽창시켜 고정하고, 파라핀에 내재시킨 후 조직 분석을 진행한다. 얇은 단편을 4㎛로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용하여 염증 또는 독성 징후에 대해 현미경 관찰을 한다.

실시예 17

마이엘로페록시다제(MPO) 검정

에어로졸 노출 후 24시간 경과하여 마우스를 이소플루란으로 마취하고 복부 대동맥을 통해 방혈한다. 심장을 통해 염수로 관류한 후 폐를 수거한다. 조직을 공개된 바와 같이 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(50mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)중의 0.5% HTAB; 5ml HTAB/조직 g)에서 균질화한다(51). 원심분리 후 상등액중의 MPO 활성을 o-디아시니딘 디하이드로클로라이드(0.167mg/ml) + 0.0005% 과산화수소를 사용하여 결정한다. 미세역가 평판 리더(Molecular Devices)를 사용하여 460nm에서 흡광을 측정한다. 15분 후 절대값을 기록한다. 천연 마우스는 대조군으로 사용한다.

실시예 18

5% CO ₂ 로 PEI-DNA 복합체의 분무는 보통 공기와 비교하여 폐에서 트랜스유전자 발현을 증가시킨다

공기중의 5% CO₂를 들이마시는 것은 마우스 및 사람에게서 호흡량과 호흡수의 증가와 연관이 있어 왔다(52 내지 54). 공기중 5% CO₂를 PEI-DNA 에어로졸을 전달하는데 사용할 때 마우스는 보다 깊게 그리고 보다 신속하게 호흡하는 것으로 육안으로 관찰할 수 있다. 5% CO₂를 함유한 에어로졸의 흡입은 증가된 호흡량 및 호흡수로 인해 공기에 의해 전달된 에어로졸로 달성된 것에 비하여 에어로졸 입자의 보다 증가된 흡입 및 상응하게 보다 증가된 트래스유전자 발현을 유도할 수 있었다.

PEI-DNA 복합체를 보통 공기 또는 5% CO₂를 함유한 공기를 이용한 에어로졸에 의해 Balb/C 마우스에 전달한다. 10:1의 N:P 비율로 고정양의 CAT 플라스미드(1 mg/용액 10ml)를 상기된 바와 같이 30분간 에어로졸화한다. 24시간 후 폐를 수거하고 CAT 검정을 실시하여 형질감염 정도를 결정한다. 공기중 5% CO₂는 공기만으로 분무된 에어로졸에 비하여 CAT 검출 수준에서 3배 증가(P=0.001)를 유도한다(도 5). 또한, 5% CO₂는 생성된 약물-리포좀 에어로졸 입자의 입자 크기를 변화시키지 않는다.

고정된 양의 CAT 플라스미드로 공기중 CO₂의 상이한 비율을 사용하여 에어로졸에 의한 폐로 PEI-DNA 전달의 증가를 검사한다. 공기중 0%, 2.5%, 5%, 10% 및 대조 양의 이산화 탄소를 사용하여 복합체를 에어로졸화한다. 검정된 CAT 활성은 공기중 CO₂를 2.5% 또는 10% 사용하는 것이 5% 사용할 때 만큼 양호한 수준의 형질감염을 제공한다(도 6).

증가된 CO₂는 일부 다른 생리학적 변수를 변화시킴으로써 PEI-DNA 복합체의 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, CO₂는 PEI-DNA 용액의 pH나 생성된 에어로졸 방울의 입자 크기를 바꾸지 않는다 한편 이에 비하여 공기는 유의적으로 변화시킨다. 폐에서 트랜스유전자 발현의 증가는 십중팔구 에어로졸 입자의 증가된 침착에 기인한다. 공기중 5% CO₂는 다른 중합체-DNA 또는 양이온성 지질-DNA 복합체의 에어로졸 전달을 최적화하는데 보조할 수 있었다(45). CO₂의 이러한 비율은 사람에게 잘 허용되어 왔으며 1분 호흡량을 증가시키는 것으로 제시되어 왔고(54,55) 이에 따라 이러한 전략은 사람 폐 시스템의 크기, 구조 및 생리가 고려되는 조건하에 폐 질환에 대해 효능을 발휘할 수 있었다.

실시예 19

PEI에 의한 DNA 전달은 용량 의존적이다.

트랜스유전자 발현을 최적화하기 위해, N:P 비율은 10:1로 고정하고 DNA의 양을 10ml의 에어로졸화된 용액당 250㎍ 내지 4mg으로 바꾼다. 이것은 저장 농도뿐만 아니라 에어로졸 방출을 통해 분무되는 총 DNA 양의 증가를 유도한다.

Aerotech II 분무기로부터 분무된 방출은 약 80%인 것으로 계산되었다. 올-글래스 집진기(AGI)를 사용하여 측정했을 때 저장 DNA의 약 72%가 흡입 챔버에 전달되었다(50). 나머지는 T-컨넥터 및 튜브에 잔류하였다. 쥐 무조건적 코 호흡, 폐 생리(1분 호흡량 및 침착 분량)(50) 및 에어로졸의 방출 농도(4.8㎍/ℓ)를 기초로하여, 마우스 폐내에 침착된 DNA 양은 에어로졸 노출 후(2mg DNA/10ml 용액의 출발 저장 농도의 경우) 30분 동안에 약 4 내지 5㎍인 것으로 측정된다. 이들 계산은 보통 공기 호흡을 기준으로 한 것이며, 침착은 증가된 호흡량 및 호흡수로 인해 5% CO₂의 존재하에서 보다 더 높을 수 있다(53).

폐에서 최고 수준의 CAT 발현을 제공하는 2mg DNA와 함께 공기중 5% CO₂를 사용하여 복합체를 에어로졸화한다(도 7). 250㎍ DNA로 측정된 CAT의 수준은 대조 폐와 통계상 다르지 않다(P=0.34). 또한, 4mg의 DNA는 10:1의 N:P 비율로 10 ml에 용해될 때 DNA의 일부 가시적인 침전을 유도하는데 이것은 2mg(P=0.51)과 비교하여 폐에서 검출된 CAT 수준의 추가 증가 없음을 설명할 수 있다.

전달된 DNA의 농도 및 양 모두에서 증가가 있다는 것이 주지되어야 한다. 그러나, 최적의 농도로 에어로졸의 노출 시간을 증가시킴으로써 폐에서의 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. 폐에서의 이들 발현 수준은 다른 전달 시스템을 사용한 것과 비슷하다(34).

실시예 20

PEI-DNA 비율의 최적화

비록 PEI가 분무화 동안에 DNA를 보호하고 대부분의 다른 양이온성 지질과 비교했을 때 에어로졸 전달 후 폐에서의 보다 높은 트래스유전자 발현을 유도할 수 있을 지라도 유전자 전달에 대한 최적 변수의 결정은 유익하다. 모든 양이온성 비히클과 음전하 DNA 사이의 전하 상호작용은 복합체의 형질감염 효율을 결정하는 중요한 인자이다. 이전 연구는 폐에서의 형질감염을 위한 최적의 PEI-DNA(N:P) 비율을 시험하여 왔다(38, 56). 그러나, 이들 연구는 PEI-DNA 전달의 정맥내 방식을 포함하였다. 에어로졸에 의한 유전자 전달은 다른 조건을 필요로 할 수 있었다.

생체내 에어로졸 전달을 위해 이상적인 충진 비율을 결정하기 위해, 폐를 형질감염할 수 있는 능력에 대해 상이한 PEI-DNA(N:P) 비율을 평가한다. DNA 양은 2 mg으로 고정하고 PEI 농도는 바꾸어 5:1, 10:1, 12.5:1, 15:1, 17.5:1 및 20:1의 비율을 얻는다. 이들 비율은 이전의 시험관내 및 생체내(점적에 의해) 연구를 기초로 하여 선택한다(43). 복합체는 공기중 5% CO₂를 사용하여 에어로졸화한다. 15:1의 N:P 비율이 폐에서 최고 수준의 CAT 발현을 제공한 반면 5:1은 아주 낮은 수준의 CAT 발현을 제공하였다(도 8). 10:1, 12.5:1, 15:1, 17.5:1 및 20:1 비율(P>0.1) 사이에는 통계상 차이가 없으나 15:1과 20:1 사이(P=0.05) 및 10:1과 15:1 사이(P=0.014)에는 유의적인 차이가 있다.

CAT 외의 플라스미드에 대한 최적비율을 결정하기 위해 폐내 루시퍼라제 유전자의 발현에 대한 다른 N:P 비율을 시험한다. 평가된 비율은 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1 및 40:1이다. 루시퍼라제에 대한 최적 곡선은 CAT에 비하여 우측으로 이동하였다. 20:1(다른 비율과 비교하여 P<0.05)에서 최고의 발현이 나타났다(도 8). 이것은 상이한 플라스미드가 상이한 N:P 비율을 필요로 할 수 있음을 시사한다. 루시퍼라제 플라스미드의 다른 크기는 CAT 플라스미드의 것과 비교하여 PEI와구조적으로 다른 복합체를 유도한다. 또한 이것은 플라스미드 순도 및 슈퍼코일된 구조의 비율에 의한 것일 수 있다. 이들 두 플라스미드의 최적 N:P 비율에 상당한 중첩이 있다. 상이한 플라스미드에 대한 최적 비율은 다를 수 있다. 실험 변수를 고려하여, 10:1 내지 20:1 사이의 비율이 적절하다. 10:1 보다 낮은 비율은 폐에서의 아주 높은 형질감염을 제공하지 않았다. 이들 결과는 비록 전달 방식이 정맥내일 지라도 분지된 25K PEI를 사용하여 얻은 것과 일차한다(56).

실시예 21

일회 에어로졸 전달 후 폐에서의 CAT 발현의 시간 경과

또한 CAT 발현을 사용하여 유전자 발현의 시간 경과를 모니터링하였다. 일회 에어로졸 전달 후 CAT 발현의 연속성 분석은 치료 연구를 위한 치료 섭생을 계획하는데 중요한 정보를 제공한다. 2밀리그램의 CAT 플라스미드를 상이한 두 N:P 비율, 즉 15:1 및 10:1로 마우스에 공기중 5% CO₂를 사용하여 에어로졸화한다. 10:1 그룹에 대해 시험된 상이한 시점은 에어로졸 노출 후 1, 2, 3 및 6일이다. 폐 및 다른 조직을 다른 시점에서 수거하고 즉시 동결시킨다. 모든 조직은 최종 시점(6일) 후 자발적으로 검정한다. 15:1 그룹의 경우 마우스를 에어로졸 처리 후 1, 3, 7 및 10일 경과하여 희생시킨다. 각 시점에서 폐를 수거하고 중량을 잰 다음 동결시킨다. 최종 시점(10일) 후에 CAT 단백질을 검정한다.

검정된 N:P 비율의 경우, CAT 발현은 24h에서 최고이며 3일 내내 일정하다(1일 내지 3일 사이에 통계상 차이가 없으며, 15:1 비율의 경우 P=0.4이고 10:1 비율의 경우 P=0.12이다)(도 10a 및 10b). CAT 수준은 1주일 후 최고 수준의 약 50%로 저하되며 10일 후조차 유의적인 수준이 검출된다(대조군에 비하여 P=0.001). 이것은 전달이 여러 임상 적용에 적절함 이상일 수 있음을 시사한다. 10일까지의 유전자 발현의 연속은 유전자의 점적 또는 에어로졸 전달을 위해 사용된 다른 양이온성 지질의 것과 비슷하거나 그 이상이다.

실시예 22

트랜스유전자의 조직 분포

DNA 벡터의 정맥내 또는 복강내 전달은 일반적으로 다양한 조직에서의 발현을 제공한다. PEI-DNA의 에어로졸 전달이 전신 유전자 전달을 제공하는지를 결정하기 위해 상이한 조직을 상기 실험에서와 동일한 마우스 그룹(10:1 그룹)으로부터 수거하고 최종 시점 후에 CAT 검정을 실시한다. 시험 조직은 폐, 간, 비장, 신장, 흉선, 뇌 및 혈액이다. 폐가 아닌 조직에서 검출된 CAT의 수준은 아주 낮으며 대조 조직과 유의적인 차이가 없다(모든 조직의 경우 P>0.1)(도 11).

조직 분포 데이터는 이 시스템에서 에어로졸 전달 후 유전자 발현이 폐로 국한되는 것을 보여주며 이는 최소 전신 전달을 가리킨다. 폐와 대조적으로, 유전자가 정맥내 또는 복강내 투여를 통해 전달될 때 검출가능한 수준의 발현을 정상적으로 나타내는 간, 비장 및 신장과 같은 조직은 PEI-DNA 에어로졸에 의해 전달될 때 비유의적이거나 검출할 수 없는 CAT 발현을 나타냈다. 이것은 해당 유전자의 발현이 폐로 제한된다는 점에서 중요하다. 다른 연구에서, 유전자 전달의 기관내 방식은 폐로 유전자를 국소화하는데 사용되어 왔다(58). 그러나, 이것은 에어로졸에 비하여 좀 공격적인 기술이며 일반적으로 폐의 주변 영역에 덜 균일한 침착을 유도한다. 에어로졸 전달은 폐에 전반적으로 비침투적이면서 균일하게 입자를 분포시켜 준다(49).

실시예 23

조직 분석은 염증의 징후를 보여주지 않는다.

PEI-DNA 복합체의 에어로졸 전달이 이 시스템에서 독성 또는 급성 염증을 유도하는 지를 결정하기 위해 2밀리그램의 CAT 플라스미드를 PEI와 15:1의 N:P 비율로 복합시키고 마우스를 공기중 5% CO₂를 사용하여 에어로졸에 30분 동안 노출시킨다. 마우스를 24시간 후에 희생시키고 폐를 포르말린에 고정하며 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다. 폐는 조직 이상, 예를 들면 얇은 단편을 검사할 때 폐에 염증 세포 침윤 또는 손상의 어떠한 증거도 보여주지 않았다(도 12). PEI-DNA 에어로졸에 의한 폐 유전자 전달을 최적화하기 위해 공기중 5% CO₂의 사용은 폐에 안전하고 고도로 특이적인 듯하다.

비록 고수준의 발현이 일회 에어로졸 노출 후 1주일 지나서 조차 이 시스템에서 검출될 지라도, 일부 요법은 유전자의 반복되고 빈번한 전달을 필요로 할 수 있다. 폐 및 다른 조직에 미치는 지연된 PEI-DNA 에어로졸 노출의 효과는 결정될필요가 있다.

실시예 24

마이엘로페록시다제 검정은 어떠한 염증도 나타내지 않는다.

급성 폐염증은 부분적으로 주변 조직으로의 다형핵 백혈구(PMN) 격리에 의해 매개된다. 다형핵 백혈구에 대한 생화학적 마커는 호아주르성 과립에서 발견되는 헴-함유 효소인 마이엘로페록시다제(MPO)이며 흔히 폐에서 염증 마커로서 사용된다(18). 폐내로 호중구 침윤을 평가하기 위해 2 mg의 CAT 플라스미드를 PEI와 15:1의 N:P 비율로 복합시키고 마우스를 공기중 5% CO₂를 사용하여 30분 동안 에어로졸에게 노출시킨다. 24시간 후에 마우스를 희생시키고, 폐를 수거한 다음, 마이엘로페록시다제 검정을 실시한다(표 3).

대조 및 에어로졸-노출된 폐내에 마이엘로페록시다제 함량은 유의적으로 다르지 않았다(P=0.92). 마이엘로페록시다제 검정은 대조군과 에어로졸 노출된 폐사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 즉, 반응의 배양 후 15분 경과하여 대조군과 에어로졸-노출된 폐사이에 절대 흡수값(OD)의 차이가 없다(대조군의 경우 0.078±0.009의 OD, 에어로졸-노출된 폐의 경우 0.084±0.004, P>0.5).

폐내로 호중구 침윤의 평가를 위한 마이엘로페록시다제(MPO) 검정
그룹	대조군	에어로졸
폐 MPO 활성(δA/min/조직 g)	0.0398±0.01	0.0404±0.008
주지: 2밀리그램의 CAT 플라스미드를 PEI와 15:1의 N:P 비율로 복합시키고 복합체를 공기중 5% CO₂를 사용하여 30분 동안 5마리 마우스에게 에어로졸화하였다. 마우스를 24시간 후 희생시키고 폐를 수거한 다음 MPO 검정을 실시하였다. 값은 평균±SD이다(n= 그룹당 5마리 마우스).

실시예 25

p53 검정

ELISA 키트(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 사용하여 p53 발현을 검사하였다. 시험관내 발현의 경우, 조직 배양 평판에서 성장된 B16-F10 세포(48-웰 평판내 20,000세포/웰)를 24시간 동안 PEI:DNA 복합체로 형질감염시켰다. 그런 다음 배양물을 세척하고 세포 용해 완충액으로 세포를 용해시켰다. 원심분리 후 100㎕의 용해물을 p53 ELISA를 위해 사용하였다. p53 수준을 BCA 단백질 검정(Pierce, Rockford, IL)에 의해 측정된 총 단백질 함량으로 정상화하였다. 생체내 발현을 위해 마우스를 PEI:p53 에어로졸에 노출시키고 24시간 후에 희생시킨 다음 폐를 수거하고 중량을 쟀다. 폐를 1ml의 빙냉 세포 용해 완충액(20mM 트리스, 0.5mM EDTA, 1% Nonidet P40, 0.05% SDS, 1mM PMSE, 1㎍/ml 펩스타틴, 2㎍/ml 루펩틴)에서 Wig-L-Bug 비드 균질화기(Crescent, Lyons, II)를 사용하여 균질화하였다. 4℃에서 원심분리 후 100㎕의 상등액을 96-웰 평판에서 실시된 p53 ELISA를 위해 사용하였다. 흡광(450nm)을 몰레큘러 디바이스[Molecular Devices(Sunnyvale, CA)] 미세역가 평판 리더를 사용하여 3중으로 판독하였다. p53의 양을 정제된 053으로제조된 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. 검정은 p53 수준을 10 pg/ml 이하로 검출할 수 있고 검정의 직선 측정 범위가 50 내지 1000pg/ml이다. 폐내 총 단백질 함량은 BCA 단백질 검정을 사용하여 결정하였다.

실시예 26

PEI-p53 복합체의 에어로졸 전달 후 마우스 폐내 p53 발현

PEI-p53 복합체를 상기된 PEI:DNA 복합체에 대해서와 같이 제조한다. 2밀리그램의 p53 플라스미드를 10:1의 PEI:DNA(N:P) 비율로 폴리에틸렌이민과 복합시키고 공기중 5% CO₂를 사용하여 C57BL/6 마우스에 에어로졸화한다. 마우스를 에어로졸 전달이전에 테이프로 밀폐된 플라스틱 케이지에 넣었다. 이것은 비제한된 전신 에어로졸 노출 시스템이다. PEI-p53 복합체를 전술된 폴리에틸렌이민:CAT 복합체의 에어로졸화에 대해 기술된 바와 같이 5% CO₂의 존재하에 에어로-미스트 분무기를 사용하여 에어로졸화하였다.

마우스에 PEI-p53 복합체의 에어로졸 전달 후 24시간 경과하여 ELISA로 폐내 p53 발현을 분석하였다. 복합체의 에어로졸 전달은 천연 마우스의 폐에서 검출된 것과 비교하여 폐 조직에서 검출된 p53의 수준에서 약 4배 증가를 유도한다. 대조 마우스에서 p53의 수준은 0.0398±0.01pg/mg 단백질이고 에어로졸화된 마우스내 수준은 0.0404±0.008pg/mg 단백질(값은 평균±SD)이다(59). PEI-Luc에 대한 노출은 p53 수준에서 어떠한 증가도 유도하지 않았다(데이터 미제시).

실시예 27

PEI-p53의 에어로졸 전달에 의해 B16-F10 폐 전이의 억제

C57BL/6 마우스에 0일에 25,000 B16-F10 세포를 정맥내 주사하였다. 마우스내로 암세포의 접종 후 1주에는 2회로 5% CO₂를 사용하여 발생된 폴리에틸렌이민-p53 에어로졸 복합체로 처리하고(1, 4, 8, 11, 15, 18 및 22일) 주사 후 22일째에 최종 처리하였다(총 7회 에어로졸 노출). 대조군은 비처리된 마우스, 폴리에틸렌이민 또는 폴리에틸렌이민-Luc 에어로졸 복합체로 처리된 마우스를 포함하였다. 대조 동물은 치료가 정지되고 실험이 종결되는 종양 세포 접종 후 24일 즈음에 염색한다. 처치 용량은 10:1의 폴리에틸렌이민:DNA (N:P) 비율로 2mg 플라스미드/10ml의 에어로졸화된 용액이었다. 마우스당 전달된 DNA의 양은 보통 공기의 존재하에서 약 4 내지 5㎍인 것으로 측정되고 호흡량 및 1분 호흡량의 증가로 인해 5% CO₂의 존재하에서 증가한다.

종양 접종 후 24일째에, 마우스를 희생시키고 폐를 고정한 다음 종양 지수를 계산하였다. PEI-p53으로 처치된 마우스는 종양 지수(다른 모든 그룹과 비교하여 P<0.001)가 아주 낮은 반면 모든 다른 대조군은 많은 종양 혹을 나타냈다(도 13a, 13b). 대부분의 비처리된 마우스 및 폴리에틸렌이민 단독으로 또는 폴리에틸렌이민-Luc로 처리된 마우스는 흉부벽내로 침투하는 무수히 많은 종양 혹을 나타냈고 목 및 복부 림프절과 같은 폐외 조직에서 전이를 나타냈다. 그러나,폴리에틸렌이민-p53 복합체로 처리된 모든 마우스는 아주 작고 뚜렷한 종양 위치를 나타냈으나 흉부벽으로 침투하지 않고 폐외 전이 종양을 나타내지 않았다. 비처리된 마우스와 비교하여 종양의 성장에 5% CO₂만으로 효과를 나타내지 않았다(데이터 미제시). 폐 중량은 또한 PEI-p53 처리군과 모든 대조군사이의 유의적인 차이(P<0.01)를 보여주었다(도 13c).

하기 문헌은 본원에 인용된다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 당업자의 수준을 가리킨다. 이들 특허 및 공보는 개개 공보가 특정적으로 및 개별적으로 참고로 원용되는 것과 같이 동일한 정도로 본원에 참고로 원용된다.

당업자는 본 발명이 본원에 기술된 목적 및 이점을 달성하고 얻기 위해 변형될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 기술된 방법, 절차, 처치, 분자 및 특정 화합물과 함께 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 의도는 없다. 당업자는 본 명세서를 기초로 하여 본 발명을 변형 및 다른 용도로 사용할 수 있으나 이들 모두는 본 발명의 정신 및 청구범위에 속한다.

Claims

에어로졸화된 약물을 약 10% 이하의 이산화탄소 가스를 함유하는 공기 혼합물을 통해 투여하는 단계를 포함하여, 사람 또는 동물의 호흡관에서 에어로졸화된 약물의 침착을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 공기 혼합물이 2.5% 이산화탄소 가스를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 공기 혼합물이 5% 이산화탄소 가스를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 공기 혼합물이 7.5% 이산화탄소 가스를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 에어로졸이 약 1분 내지 약 30분의 시간 동안 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 약물이 제트 분무기에 의해 에어로졸화되는 방법.
제1항에 있어서, 약물이 수용성 또는 완충제 용해성 약물인 방법.
제7항에 있어서, 수용성 또는 완충제 용해성 약물이 항생물질, 점액용해제,기관지 확장제, 부교감신경계 제제, 효소 및 항바이러스제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 약물이 캐리어를 통해 전달되는 불용성 약물인 방법.
제9항에 있어서, 캐리어가 리포좀, 서방성 중합체 및 폴리양이온성 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제10항에 있어서, 리포좀이 통상적인 리포좀 또는 입체적으로 안정화된 리포좀인 방법.
제11항에 있어서, 통상적인 리포좀이 포스파티딜콜린 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 변형된 인지질을 포함하는 지질로부터 형성되는 방법.
제12항에 있어서, 포스파티딜콜린이 디라우로일포스파티딜콜린인 방법.
제11항에 있어서, 입체적으로 안정화된 리포좀이 변형된 인지질로부터 형성되는 방법.
제14항에 있어서, 변형된 인지질이 디미리스틸포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜) 2000인 방법.
제10항에 있어서, 리포좀이 리포좀 제제 내에 지방친화성 약물을 함유하는 방법.
제16항에 있어서, 지방친화성 약물이 암포테리신 B, 나이스타틴, 글루코코르티코이드, 면역억제제 및 항암 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제17항에 있어서, 항암 약물이 캠프토테신, 캠프토테신 유도체 및 파클리탁셀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 약물이 치료 단백질, 치료 펩타이드, DNA 유전자, 센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 바이러스성 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제19항에 있어서, DNA 유전자가 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 또는 p53인 방법.
제19항에 있어서, DNA 유전자가 폴리양이온성 중합체 캐리어 또는 양이온성 리포좀을 통해 전달되는 방법.
제21항에 있어서, 폴리양이온성 중합체가 폴리에틸렌이민인 방법.
제22항에 있어서, 폴리에틸렌이민의 질소:포스페이트 비율이 약 10:1 내지 약 20:1인 방법.
제23항에 있어서, 폴리에틸렌이민의 질소:포스페이트 비율이 10:1인 방법.