CN1167461C - 吸入治疗的二氧化碳增强 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了提高气溶胶药物在呼吸道内沉积的方法。
Description
发明背景
发明领域
本发明一般涉及药物学和药物传递领域。更特别的是,本发明涉及一种在吸入治疗过程中用二氧化碳气体提高气溶胶药物肺部沉积的方法。
相关领域的描述
小颗粒脂质体气溶胶治疗包含掺入脂质体的脂溶性或水溶性抗癌药物,它通过喷射喷雾器中的水相分散体施用(见美国专利号5,049,388)。在喷雾后产生的1-3微米质量中位空气动力直径的气溶胶能靶向传递到呼吸道表面。沉积的脂质体然后在肺内局部释放药物或释放入血循环,并传递到肺外组织。
如果药物是脂溶性的,它将以对使用的脂质、使用的抗癌药物特异性的方式与脂类分子结合,可能被包含在起悬浮作用的水相介质中的各种可溶性成分进一步修饰。这些可溶性成分可包括缓冲盐,还可能包括环己六醇,来增强肺组织中具表面活性的磷脂的合成和分泌,并最大程度降低已存在或可由于气溶胶治疗导致的呼吸窘迫。
如果药物是水溶性的,可通过合适的方法将其掺入水相小泡,它存在于多层脂质体的脂质双层(薄片)之间的同心空间内。可制备单层脂质体,但是它们捕捉脂溶性或水溶性药物的能力降低,因为捕获仅限于一个中央小泡。气溶胶水滴可含有一个或多个药物-脂质体。另外,还可能在气溶胶脂质体治疗中,通过混合不同的含药物的脂质体,或用其中药物已混合或一起掺入的脂质体,将一种以上药物掺入一种气溶胶脂质体疗法。
喷雾将脂质体剪切成能从喷雾器喷嘴中轻易释放的大小。直径达几微米的脂质体通常被剪切成直径小于500纳米,比由喷雾器的操作特性和其它变量决定的直径可能小得多。脂质体中所含的水溶性药物的剪切将释放可观量的水溶性化合物,大约50%。这与其用途不矛盾,但意味着施用了两种形式的药物制剂,效果包括如果单独使用任一种形式,两种形式将产生的疗效。脂质体气溶胶治疗的许多其它细节在美国专利号5,049,388中描述。
一般吸入治疗的根本目的是将药物的气溶胶颗粒局部传递到中央气道和呼吸道的周围区域。然而,即使是最佳大小范围1-2微米的质量中位空气动力直径的吸入颗粒沉积部分也仅是20%左右。吸入气溶胶的肺部沉积显著受到颗粒大小、吸湿性和气道几何形态的影响(1,2)。呼吸情况也是确定吸入颗粒沉积情况的重要变量(1,2)。
特别是,屏气显著增加肺部沉积,因为提高了肺内颗粒存留的时间。这使得尤其在周围小气道中存在更长时间的重力沉降,并确保水相颗粒能在接近100%的湿度下平衡,并接近其最大尺寸,进一步增强其沉积(1,2)。计算机模拟显示人屏气30秒的做法可增加沉积部分2.2倍。该作用的生理学原理是由于在深吸气后颗粒摄入提高,其中吸入体积可以比基础潮式呼吸吸入的量高8倍。该更大的潮式呼吸体积导致颗粒能穿透到肺最深处,此处的气道直径是最小的,因此能最有效的发生由于重力和最大粒径引起的沉积。
通过延伸该生理性质,直接利用能增加吸气(含有气溶胶颗粒)体积的因素随后将显著增加中央气道中沉积的部分,和在周围肺中达到更大的程度。二氧化碳(CO2)是呼吸最重要的天然调节剂。二氧化碳从组织中循着现存的压力梯度自由弥散到血液中。血液中二氧化碳的递增水平轻易的弥散到脑脊液中,在其中转化成HCO3 -和H-。髓质腹面的中枢化学感受器响应CSF中H+的增加,并导致通气补偿性的增加(速度和潮气量)。
调查者利用二氧化碳吸入操纵实验动物和人的通气。吸入5%二氧化碳导致潮气量增加192%(3)。该增加是迅速的,在整个接触期间达到持续的坪值(4)。一旦二氧化碳接触停止,通气的改变在几分钟内回到基线水平(4)。类似的,人吸入5%二氧化碳导致分钟量增加到3倍(5)。正常人吸入5%或7.5%的二氧化碳两分钟导致呼吸频率分别增加了6.7&和19%,并分别提高了潮气量31%和52%,因此分钟量分别提高了34%和75%(6)。更长时间的接触这些浓度将产生更大的效应(5)。
喜树碱类似物和紫杉烷类是目前开发用作化疗剂的化学物质(21,26)。抗癌药紫杉醇(PTX)和不同的喜树碱(CPT)衍生物在治疗各种人肿瘤,包括肺癌中具有临床活性。当用作单一的药物或联合其它药物时,这些药物在临床试验中显示有益结果(21)。这些药物通过口腔或静脉途径全身给药:紫杉醇最有效的途径是连续静脉内输注(22,24),而口服给药的喜树碱亲脂同类物证明最有效。
毒副作用的产生常常是这些治疗方案中主要的限制。裸鼠(23)和实验性小鼠肺转移(6)中几种皮下人癌异种移植物已将通过气溶胶给药途径作为治疗的另一种方法,已用喜树碱和9-硝基喜树碱(9NC)的脂质体制剂成功治疗。在小鼠中用喜树碱进行药物动力学研究,显示吸入脂质体喜树碱在肺和其它器官中产生较大的药物水平,在停止气溶胶传递后迅速清除(17)。尽管这些水平,气溶胶传递系统在药物沉积中通常仅15-20%的效力(29,30);因此提高肺部沉积可能是有利的。
用这些药物传递的全身途径,一定量的药物会从血流中溢出,定位于呼吸道组织内,但肺不是药物沉积的主要器官。利用常规脂质体作为这些药物的载体不能改善常用全身途径施用的药物的肺部沉积(11,27)。喷雾是对呼吸道靶向药物传递非常有效的途径(17);例如喜树碱。当通过气溶胶化传递阿霉素和PTX的新制剂时,成功治疗了患有自发产生的原发性和转移性肺部肿瘤的犬(16)。然而在这些情况下,用正常空气产生气溶胶。
用病毒和非病毒载体实现了对各种组织的基因传递。虽然用非病毒载体避免了与病毒载体有关的免疫应答,阳离子脂质和聚阳离子聚合物等非病毒载体一般与病毒载体高水平的基因表达特征无关。然而聚乙烯亚胺(PEI),一种阳离子聚合物在组织培养物和体内都有效(36)。每第三个氮上的质子化氮具有巨大的缓冲能力。聚乙烯亚胺可将DNA有效引向核(37),并保护DNA免受DNAse的降解(36)。聚乙烯亚胺的线性和分枝形式都显示在各种组织,例如肺、脑和肾中产生高水平的转基因表达(39-41)。聚乙烯亚胺也用于在体内将DNA有效传递给肿瘤(42)。
气溶胶传递是将感兴趣的基因传递给肺的非侵袭性途径,可能用于治疗肺癌和囊性纤维变性等疾病。然而转基因表达的水平不是很高,因为在一些情况下,在喷雾时DNA活力会丧失(43)。PEI能在喷雾过程中保护DNA(44),并能导致肺中比其它测试的阳离子脂类更高水平的转染(44,45)。PEI-介导的转染对于肺部表面活性剂的抑制作用也具有抗性(46)。
用几种方法实现了通过吸入途径提高呼吸道中的药物沉积效率:1)改变用于气溶胶化的制剂中药物的浓度(31);2)用更有效类型的喷雾器(32);3)提高治疗持续时间;或4)改变呼吸模式(4)。如上所述,二氧化碳是呼吸的天然调节剂。吸入含有低浓度(约3-7%)二氧化碳的空气导致呼吸模式类似改变,并且能很好的耐受(13,6)。未观察到吸入含5%CO2的空气和人中度体育锻炼之间呼吸模式的差异(32)。含5%CO2的空气的类似作用可在使用气溶胶治疗的人中获得。因此利用富含CO2的空气作为吸入治疗的调节剂来喷雾可导致化疗剂的更有效的肺部传递。
现有技术的缺陷在于缺乏一种在吸入治疗过程中增强气溶胶化药物的肺部沉积的手段。本发明填补了本领域该长期的需要和需求。
发明简述
本发明提供了一种提高气溶胶化药物在个体或动物呼吸道中沉积的方法,包括步骤:以含有约达10%二氧化碳气体的空气混合物施用所述气溶胶化药物。本文使用了2.5%、5%和7.5%的二氧化碳浓度。气溶胶可以施用1-30分钟或更长。施用的药物可以是可溶性药物,或不可溶性药物或可溶于溶液并直接用喷射喷雾器气溶胶化,或在气溶胶化前掺入脂质体、缓释聚合物或聚阳离子聚合物等载体的治疗组合物,例如寡核苷酸、基因、肽或蛋白质。
本发明的其它和另外的方面、特征和优点从对于本发明目前优选例的下列描述将变得明显。提供这些优选例是为了公开。
附图简述
因此,本发明的上述以及其它特征、优点和目的将变得清楚,并被详细理解,上文简单总结的本发明的更具体描述可参考用附图说明的一些实施例。这些图构成了说明书的一部分。应注意,尽管附图说明了本发明的优选例,不应被视为限制本发明的范围。
图1显示了接触用正常空气(实线)或富含5%CO2空气(影线)的脂质体气溶胶30分钟后喜树碱的组织分布。在治疗结束时(30分钟)合并每组三只小鼠的器官,用HPLC测定药物含量。计算平均值和SD。5%CO2-空气与正常空气相比的P值分别对于肺、肝、脾、肾、血液和脑是0.02、0.13、0.04、0.04、0.03,和0.01(Student’st检验,双侧)。
图2显示CPT-脂质体通过正常空气(O)或含有5%CO2-的空气(·)产生的气溶胶给药30分钟的肺部浓度-时间曲线。对于每个时间点,切下三只小鼠的肺,并用HPLC测定药物含量。计算平均值和SD。
图3显示了PTX-脂质体通过正常空气(O)或含有5%CO2的空气(·)产生的气溶胶给药30分钟的肺部浓度-时间曲线。对于每个时间点,合并三只小鼠的肺,并用HPLC测定药物含量。每个实验重复3次,计算平均值和SD。
图4显示了接触含有不同脂质体制剂的气溶胶的小鼠肺中组织紫杉醇水平的比较。以空间稳定的紫杉醇脂质体含5%CO2的空气的气溶胶实现与紫杉醇等价水平的接触,当利用DLPC时,该脂质体是用二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚乙二醇2000制备的。
图5显示在肺中通过用空气或含5%CO2的空气产生的PEI-DNA气溶胶CAT表达的比较。将1毫克CAT质粒与PEI以N∶P比10∶1的比例复合,得到的复合物气溶胶化施给小鼠30分钟。24小时后收集肺,如所述进行CAT测定。数值是平均值±SD(n=6小鼠/组,P=0.001)。
图6显示CO2百分数对PEI-DNA通过气溶胶转移到肺的效率的影响。用空气中不同的CO2百分数和固定量的CAT质粒。复合物用0%、2.5%、5%和10%二氧化碳和对照气溶胶化。杀死小鼠,收集肺。进行CAT测定。数值是平均值±SD。
图7显示肺中通过PEI-DNA气溶胶的基因表达是剂量依赖性的。用含5%CO2的空气,以固定的N∶P比10∶1气溶胶化提高的CAT质粒剂量。传递的DNA总量和传递的PEI-DNA浓度都有提高。24小时后杀死小鼠,收集肺,并测定CAT蛋白。数值是平均值±SD(n=每组5只小鼠)。
图8显示N∶P比对PEI-DNA通过气溶胶转移到肺的效率的影响。用不同的PEI∶DNA(N∶P)比和固定量的CAT质粒(2毫克)。用含5%CO2的空气气溶胶化复合物。24小时后杀死小鼠,收集肺,进行CAT测定。数值是平均值±SD(n=每组5只小鼠)。
图9显示了N∶P比对肺中荧光素酶基因表达的影响。以不同N∶P比传递固定量的荧光素酶质粒(2mg)。复合物用含5%CO2的空气气溶胶化。气溶胶传递24小时后杀死小鼠。收集肺,测定荧光素酶活性。数值是平均值±SD(n=每组5只小鼠)。
图10显示接触PEI-DNA气溶胶一次后转基因表达的时间过程。在图10A中,用含5%CO2的空气以N∶P比15∶1给小鼠传递含有2mg CAT质粒的气溶胶。在不同的时间点杀死小鼠,收集肺,立即冷冻。在最后的时间点后进行CAT测定。数值是平均值±SD(n=每个时间点5只小鼠)。图10B显示用两种不同的N∶P比持续表达CAT。用含5%CO2的空气以15∶1或10∶1的N∶P比对两组小鼠(各组各时间点n=5小鼠)传递2mg CAT质粒。10∶1比例的时间点是气溶胶接触后1、2、3和6日,对于15∶1是气溶胶接触后1、3、7和10日。
图11显示一次PEI-DNA气溶胶接触后转基因的组织分布。如图9中使用相同组的小鼠(来自10∶1组)。收集不同组织并立即冷冻。在最后的时间点后测定CAT蛋白。数值是平均值±SD(n=每个时间点5只小鼠)。气溶胶接触组中非肺组织中CAT水平与对照组织中没有差异(P>0.1)。
图12显示经PEI-DNA气溶胶治疗的肺的组织学分析。将2mgCAT质粒与PEI以N∶P比15∶1混合,该复合物气溶胶用含5%CO2的空气对5只小鼠喷雾30分钟。24小时后杀死小鼠,收集肺,用甲醛固定。用苏木精和曙红(H&E)将切片染色。图12A:细支气管(对照);图12B:细支气管(治疗的)。放大100x。
图13显示了PEI-p53气溶胶传递抑制B16-F10肺转移。图13A:用下式计算肿瘤指数:肿瘤指数=肺重量×该组的平均级数。数值是平均值±SD(n=每组10只小鼠)。图13B:来自对照的代表性肺,显示PEI-Lucand PEI-p53处理的小鼠(n=每组10只小鼠)。用PEI-处理的组的肺(未显示)的肿瘤病灶形状、大小和数量与对照和PEI-Luc-治疗组所示相似。数据代表2个独立的实验。图13C:来自不同组的小鼠肺重量。数值是平均值±SD(n=每组10只小鼠)。
发明详述
本发明提供了一种提高个体或动物呼吸道中气溶胶化药物的沉积的方法,包括步骤:以含有达约10%CO2气体的空气混合物施用所述气溶胶化药物。优选浓度包括2.5%、5%和7.5%二氧化碳气体。可施用气溶胶1-30分钟或更长。
本发明针对水溶性药物的气溶胶传递。该药物可直接制备成水溶液或缓冲溶液,并直接气溶胶化。代表性水溶性药物包括妥布拉霉素和喷他脒等抗生素;乙酰半胱氨酸等粘液溶解剂;舒喘宁等支气管扩张药;异丙托溴铵等副交感神经药物;DNase等酶和利巴韦林等抗病毒药。
另外,本发明可用于传递在气溶胶传递前与载体结合的不溶性药物。可能的载体包括脂质体、缓释聚合物和聚阳离子聚合物。脂质体是亲脂药物特别有用的载体,这些药物包括:两性霉素B;制霉菌素;糖皮质激素;CsA、FK506、雷帕霉素或霉酚酸酯等免疫抑制剂;和喜树碱、喜树碱衍生物和紫杉醇等抗癌药。可用磷脂二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)等脂类形成脂质体,或可以是用修饰的磷脂,例如二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000配制的空间稳定的脂质体。可利用缓释聚合物,例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚阳离子聚合物,例如聚乙二亚胺(PEI)。
本发明还可用于传递治疗蛋白、治疗肽、DNA基因、有义寡核苷酸、反义寡核苷酸和病毒载体。DNA基因的代表性实施例是氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)或p53基因。优选这些基因通过聚阳离子聚合物载体,例如聚乙二亚胺传递。阳离子脂质体也可用作载体。聚乙二亚胺可具有约10∶1-20∶1的氮∶磷比。在一个优选例中,PEI氮∶磷比是约10∶1。
提供了下列定义。不特别限定的术语意味着具有本领域习惯的意义。
如本文所用的术语“气溶胶”指固态或液态颗粒在空气中的分散体,其粒径足够细和因此沉降速度低,具有相对的空气携带稳定性(8)。
本文所用的术语“脂质体气溶胶”指水相液滴,其中分散有一种或多种脂质体颗粒或含有一种或多种要传递给人或动物呼吸道的药物的脂质体(9)。
本文所用的对于本申请所定义的气溶胶液滴大小是美国专利号5,049,338所述的那些,即1-3微米的质量中位空气动力直径(MMAD),几何标准偏差约1.8-2.2。然而使用低浓度的9-NC和可能的其它喜树碱衍生物,质量中位空气动力直径可小于1微米,例如0.8微米。基于本发明公开的研究,当与环境相对湿度平衡时,脂质体可占几乎全部液滴体积。
本文所用的“Weibel肺模型”指人肺结构的类型,它认为人气道有23条顺序的分枝。气管标为0,支气管和细支气管持续到分枝16。气道的这些部分含有纤毛上皮和粘液腺。它们一起构成粘膜纤毛屏障。分枝17-23含有肺的肺泡部分,没有粘膜纤毛屏障。因此,在此处沉积的颗粒不会沿气道运送,而被吞咽。
本文考虑了在高碳酸血症的受控实验条件下,吸入的药物颗粒沉积将大大提高到超出基础潮气呼吸条件下观察到的水平。用二氧化碳气体/空气混合物驱动连续流喷射喷雾器能大大提高传递到周围肺(Weibel的17-23代)的药物剂量的效率。照此类推,可能有效利用该系统来提高吸入药物的生物效率。该概念可在理论上使用任何药物、基因、寡核苷酸或蛋白质/肽制剂(可溶的、脂质体的、晶状的或基于聚合物载体,例如聚乙二亚胺)和任何气体或空气驱动的喷射喷雾器。
本发明主要针对用二氧化碳气体提高用气溶胶化药物吸入治疗过程中呼吸的深度和频率,使得分钟量增加。提高的肺潮气量导致吸入药物颗粒的肺沉积提高,尤其在低水平呼吸中不能完全通气的肺周围沉积提高。提高呼吸频率和深度都导致分钟量提高。
以含有达约10%二氧化碳气体的空气混合物中施用气溶胶化药物,导致药物在呼吸系统中沉积提高,可测量的提高气溶胶药物传递的效率和疗效。优选浓度包括2.5%、5%和7.5%二氧化碳气体。可施用气溶胶1-30分钟或更长。二氧化碳的增强作用在30秒内是明显的。二氧化碳的呼吸作用是瞬时的,可重复使用。
给出了下列实施例,为了说明本发明的各种实施方式,而不是为了以任何形式限制本发明。
实施例1
材料
从Xechem(New Brunswick,NJ)获得了PTX。从Sigma(St.Louis,MO)获得了CPT,从ChemWerth(Woodbridge,CN)获得了9NC。从Avanti PolarLipids(Alabaster,AL)购得二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)。从Sigma(St.Louis,MO)购得DMSO,HPLC级的其它有机溶剂购自Fisher Scientific。用于冲洗的无菌水来自Baxter Healthcare Corporation(Deerfield,IL)。
从Harlan-Sprague Dawley(Indianapolis,IN)获得了ICR小鼠(7-8周龄),关在标准笼中,提供食物和水,让其自由进食。雌性C57BL/6小鼠(8-9周龄)和雌性Balb/C小鼠(5-7周龄)从Harlan-Sprague Dawley(Houston,TX)获得。所有动物的护理根据Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and UseCommittee。
主要用细菌的氯霉素乙酰转移酶基因(CAT,p4119,ref.15)作为测定转基因表达的报道基因。CAT基因在人巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子元件的控制下。插入CMV启动子/增强子元件和人生长激素聚腺苷酸化序列修饰的荧光素酶质粒(pGL3,Promega,Madison,WI)由Dr.Michael Barry(Center for Cell and GeneTherapy,Baylor)赠送。所有质粒在Qiagen柱(Qiagen,Valencia,CA)上纯化,并且是无内毒素的。用260纳米的紫外吸收定量质粒。琼脂糖凝胶分析发现质粒是主要的超螺旋质粒和少量带切口的质粒的混合物。
含有p53基因的质粒是从Dr.Y.K.Fung(Children’s Hospital,LosAngeles,Ca)获得的。p53基因在人巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子元件的控制下。作为对照的质粒含有萤火虫荧光素酶(Luc)基因,从Dr.Michael Barry(BaylorCollege of Medicine)获得。由Bayou Biolabs(Harahan,LA)商业纯化的质粒没有内毒素,用紫外吸光度定量。琼脂糖凝胶分析揭示质粒主要是超螺旋形式,有少量带切口的质粒。
B16-F10黑素瘤细胞系获自Division of Cancer Treatment and DiagnosisCenter(DCTDC,NCE,Frederick,MD),在补充有10%胎牛血清的DMEM中培养。已证明细胞系在肺中形成肿瘤(15)。每只C57BL/6小鼠通过尾静脉注射含25,000个B16-F10细胞的200微升培养液。目测接种细胞后2周内的肺转移。用3-12代的细胞。
实施例2
统计法
在进行变量单向分析(ANOVA)比较平均值时,进行了双侧不成对Student检验。如果P≤0.05,视为差异显著。
实施例3
脂质体的制备
在叔丁醇中分别以100、10和1mg/ml用先前描述的方法(17)制备DLPC、PTX和喜树碱储液。以1∶10的重量比混合紫杉醇和DLPC等份。喜树碱与DLPC的重量比是1∶50。然后在液氮中冷冻药物-磷脂混合物,过夜冻干成干粉。-20℃密封储藏制剂。在使用前用无菌水用于冲洗重建混合物,并涡动直到获得均匀的多层脂质体悬液。喷雾前悬液中喜树碱和紫杉醇的最初浓度分别是0.5mg/ml和10mg/ml。喷雾前后脂质体的大小用Nicomp亚微米颗粒分级器370型9NICOMP,SantaBarbara,CA测定。
实施例4
气溶胶颗粒大小特征
用Andersen/AFCM非生命的环境颗粒定径取样机(Andersen Instruments,Atlanta,GA)估计了含脂质体包裹的药物的气溶胶颗粒的特征(31)。在以10L/分钟流过AERO-MIST喷雾器的空气或气体混合物产生的气溶胶中药物浓度也通过采集在最初气溶胶化后1分钟开始的3分钟内的样品测量。质量中位空气动力直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)如所述(30,31)用KaleidaGraph 2.0软件(SynergySoftware,Reading,PA)计算。
实施例5
紫杉醇和喜树碱的气溶胶传递
如上所述(16-18)用气溶胶进行小鼠的治疗。简单说,用AERO-MIST喷射喷雾器(CIS-USA,Bedford.MA)以空气流速10L/min产生气溶胶颗粒。将小鼠置于密封的塑料笼(23×18×13厘米),并接触气溶胶30分钟。用混合器(Bird 3m,PalmSprings,CA)混合正常空气和CO2,用获得的正常或含5%CO2的空气产生气溶胶,用Fluid Fyrite(Bacharach Inc.,Pittsbuegh,PA)校准CO2浓度。在每个时间点从笼中取出3只小鼠,通过接触异氟烷(USP)(Abbott Laboratories,Chicago,IL)放血杀死。切下器官,称重并冷冻在-70℃直到提取。
实施例6
从组织中提取药物
在提取前,融化样品并立即用剪刀剪成小块。为了从组织抽提紫杉醇,在各样品中加入3毫升乙酸乙酯并在微型珠粒打浆机(Wig-L-Bug,3110B型,CrescentDental MFR Co.,Lyons,IL)中匀浆2分钟。将匀浆转移到10毫升锥形玻璃离心管中,1,000xg离心10分钟。分离上清液部分,用空气蒸发有机溶剂。在0.2毫升甲醇∶乙腈(2∶1,v/v)重建剩余物,在水浴超声器中超声,1,000xg离心10分钟。将上清液部分温热至37℃30分钟,用HPLC分析。
喜树碱和9NC的提取过程如前所述(17)。简单说,在融化组织后,在器官中加入20微升体积(含20微克的9NC),作为内标来确定提取效率。样品切成小块,在各样品中加入1毫升0.1%的乙酸水溶液,pH3.2。在微型珠粒打浆机中匀浆后,以1,000xg离心匀浆5分钟。重新用8毫升二氯甲烷提取上清液部分。分离有机部分并在室温下风干。干燥的样品在0.2毫升乙腈中重建。
实施例7
HPLC分析
用反相HPLC以Waters 486紫外吸光度检测器(Waters,Milford,MA)于227nm处监测定量紫杉醇。在室温下,Waters Nova-Pak C18柱(3.9×150cm)进行所有测量。流动相由49%乙腈和51%水组成。流速是1.5ml/min。注射各样品25微升一份,用Waters millennium软件分析数据。PTX提取效率的测定,当在各组织中加入已知量的紫杉醇时,采用相同的程序,并与紫杉醇的提取量比较。提取效率(%)的计算为((提取后的紫杉醇量)/(加入的紫杉醇量))×100。对于所有测试的组织,平均提取效率是89±4%(数据未显示),该指数用于计算组织中药物的最终浓度。
用Waters NovaPak C18柱(3.9×150厘米)进行喜树碱的HPLC分析(17)。以Waters 470扫描荧光检测器(λex=360nm,λem=455nm)监测喜树碱的色谱,而用Waters 440UV吸收检测器在254纳米检测9NC。流动相由30%乙腈和70%0.1%的乙酸水溶液,pH3.5构成,流速为1.2ml/min(16,17)。
实施例8
脂质体制剂的气溶胶特征
表1总结了CPT-DLPC和PTX-DLPC脂质体的性质及其气溶胶特征。用5%CO2-空气不改变气溶胶中任一药物的浓度或其MMAD和GSD(P>0.1;Student t-检验,双侧)。喷雾过程将两种药物制剂的溶液中脂质体颗粒的大小从微米减小到纳米颗粒。用5%CO2-空气混合物,CPT-DLPC的脂质体大小从喷雾前的2.54±0.91微米降低到喷雾后的0.49±0.07微米。对于PTX-DLPC制剂,这些值分别是13.14±12.15微米和0.23±0.17微米。喷雾前后气溶胶的粒径使用正常或5%CO2-空气施用的PTX-DLPC或CPT-DLPC无差异(P>0.5,Student t-检验,双侧)。
表1
用5%CO2-空气与正常空气比较,PTX-DLPC和CPT-DLPC制剂的气溶胶和脂质体特征
药物配方 | 空气组成 | 气溶胶中的药物浓度,微克/升 | 气溶胶液滴 | 脂质体粒径微米 | ||
MMAD微米 | GSD | 喷雾前 | 喷雾后 | |||
CPT-DLPC0.5mgCPT/ml | 正常 | 9.0±1.3 | 1.6±0.3 | 2.1±0.1 | 3.72±1.10 | 0.34±0.11 |
5%CO2 | 9.2±1.9 | 1.7±0.5 | 2.3±0.2 | 2.54±0.91 | 0.49±0.07 | |
PTX-DLPC10mg PTX/ml | 正常 | 153.0±27 | 2.0±0.2 | 1.8±0.03 | 12.49±8.06 | 0.13±0.18 |
5%CO2 | 175.0±9 | 2.2±0.2 | 1.9±0.1 | 13.14±12.15 | 0.23±0.17 |
数值是平均值±SD(每个值n=3)。MMAD:质量中位空气动力直径,GSD:几何标准偏差。
实施例9
用正常或含5%CO2的空气产生的气溶胶传递后CPT-DLPC的组织分布和药物动力学
ICR小鼠分成两组:第一组(n=4)接受通过用正常空气产生的气溶胶传递的CPT-DLPC制剂30分钟,因此它们的呼吸参数在治疗中不变;第二组(n=6)吸入相同的制剂,但用含5%CO2的空气。
吸入含5%CO2的空气产生的气溶胶导致肺中喜树碱的沉积显著增加(2.1-3.5倍)(图1)。分别从第一和第二组的小鼠肺组织中检测出CPT在134±123和476±216ng/g。用含5%CO2的空气不改变组织分布情况。吸入用5%CO2-空气产生的CPT-DLPC气溶胶后也提高了肝脏、脾脏、肾脏、血液和大脑中的药物浓度。
测定了在与用正常或含5%CO2的空气的CPT-DLPC气溶胶接触30分钟过程中或以后喜树碱在肺中的药物动力学沉积(图2)。治疗中喜树碱肺部浓度提高,在气溶胶治疗(30分钟)终点浓度最大(Cmax),随后肺浓度开始下降。峰呼吸水平对于正常和含5%CO2的空气分别是232±158和486±78ng/g组织。在气溶胶停用后15分钟时间内,药物浓度指数下降。两种治疗的清除半衰期(T1/2)是12-15分钟。药物动力学曲线的形状对于两种治疗类型都非常相似。在用任何空气来源气溶胶化结束后90分钟肺内(120分钟的时间点)仅检测到痕量的药物。
实施例10
通过用正常或含5%CO2的空气产生的PTX-DLPC气溶胶传递后PTX的组织分布和药物动力学
由于检测方法的限制,使用10mgPTX/ml悬液的脂质体配方。在接触(15分钟)的中途,治疗终点(30分钟)和在治疗结束后的几个时间点杀死小鼠。小鼠接触用正常空气或含5%CO2的空气产生的PTX-DLPC气溶胶。
在用任何空气来源治疗(30分钟)的终点,得到肺紫杉醇Cmax浓度(图3)。在用含5%CO2的空气组中Cmax比环境空气组增加到4.2倍(分别是23.1±4.3和5.5±0.2微克/克)。该二氧化碳诱导的增强与脂质体配方无关(图4)。当用含5%CO2的空气时,用二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000和二月桂酰磷脂酰胆碱制备的空间稳定的紫杉醇脂质体在肺中以相当的水平沉积。
用5%CO2的治疗产生了肺浓度-时间曲线下面积为正常空气的5.7倍的沉积(分别是33.7和5.9微克-小时/克)。在两种情况下,在治疗结束后PTX浓度开始从肺组织中下降。当用正常空气产生气溶胶时,肺中紫杉醇的T1/2α和T1/2β值分别是0.3和1.6小时。用含5%CO2的空气产生的脂质体气溶胶施用紫杉醇,T1/2α是0.7小时,T1/2β是5.1小时。进行了其它器官,例如肝、脾、肾和血液的比较性分析:然而用正常空气气溶胶化的紫杉醇在这些组织中的水平在可检测水平以下。
表2列出了用含5%CO2的空气脂质体气溶胶传递后紫杉醇的组织分布。在肺中检测出药物的最高浓度。在其它器官中发现更低的浓度。用梯形规则分析3小时内不同组织的浓度-时间曲线下的面积(AUC)分别显示下列对于肺、肝、肾、血液和脑的AUC值:34±2、9.8±1.9、2.4±1.4、2.8±1.5、0.13±0.10、0.23±0.2微克PTS-小时/克组织。
表2
30分钟接触用含5%CO2的空气产生的气溶胶PTX-DLPC*的过程中和过程后组织中的PTX沉积
时间(小时) | PTX浓度(微克/克组织) | |||||
肺 | 肝 | 脾 | 肾 | 血液 | 脑 | |
0.25 | 20.3±7.8 | 1.5±0.8 | 0.6±0.3 | 1.4±0.0 | 0.25±0.03 | 0.14±0.16 |
0.5 | 23.1±4.3 | 5.7±3.0 | 1.4±0.9 | 1.6±0.1 | 0.18±0.08 | 0.16±0.02 |
0.75 | 18.0±3.6 | 5.5±1.8 | 0.5±0.4 | 1.4±0.1 | 0.08±0.09 | 0.11±0.03 |
1.0 | 14.8±9.5 | 4.8±3.9 | 2.6±2.7 | 1.2±0.7 | 0.07±0.07 | 0.11±0.03 |
1.5 | 8.7±2.8 | 2.8±0.8 | 1.0±1.6 | 0.7±0.3 | 0.03±0.06 | 0.09±0.08 |
2.0 | 6.5±2.9 | 3.1±0.7 | 0.6±0.4 | 0.4±0.3 | 0.01±0.02 | 0.04±0.04 |
3.0 | 7.1±2.8 | 2.3±0.6 | 0.5±0.2 | 0.4±0.1 | 0.01±0.02 | 0.05±0.05 |
数值是三次实验的平均值±SD(在每次实验中合并来自3只小鼠的器官并处理)。
实施例11
二氧化碳诱导的呼吸模式对于药物沉积的影响
在吸入含5%CO2的空气后肺中发现的肺部药物浓度提高可以用呼吸模式的改变来解释。小鼠在含5%CO2的空气中呼吸模式可见变得深而且慢,在处理终点几乎马上回到正常。组织学分析并未揭示肺组织中的任何改变。其它研究者进行的体积描记法研究显示吸入含5%CO2的空气提高哺乳动物中的通气,主要是因为提高了潮气量(约170-180%)(18,19)。喜树碱和紫杉醇的平均肺沉积提高到约2-4倍。这与潮气量的增加不成比例,可能因为呼吸参数有一些其它的生理变化,例如呼吸频率、吸气和呼气循环的呼吸持续时间,和分钟通气(13)。通过深呼气和完全呼出以及屏息,气溶胶的滞留与正常呼吸相比增加到几乎两倍(15)。
实施例12
PEI-DNA复合物的制备
PEI(25kDa,分枝)购自Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)。制备浓度为4.3mg/ml(0.1M氮)的PBS溶液,pH7-7.5的PEI储液。分别将PEI和DNA与5毫升水以所需浓度混合。缓慢旋转PEI溶液,在其中加入DNA溶液,得到最终浓度为10毫升。混合混合物,在室温下放置15-20分钟,然后喷雾。得到的负荷比表示成PEI氮∶DNA磷(N∶P),可通过将DNA看做每微克具有3纳摩尔磷,1微升0.1MPEI溶液具有100纳摩尔胺氮计算。10∶1 N∶P比对应于1∶29.1PEI∶DNA重量比。
实施例13
PEI∶DNA复合物的气溶胶传递
将小鼠置于塑料笼中,气溶胶传递前用胶带密封(48)。这是非约束的全身气溶胶接触系统。用Aero-Mist喷雾器(CIS-US,Inc.Bedford,MA)以10升/分钟流速,用空气或含5%CO2的空气气溶胶化PEI-DNA复合物。Aero-Mist是高通量、有效的喷雾器,已证明用Andersen级联冲击取样器(Andersen Instruments,Atlanta,GA)通过先前描述的方法(50)能产生最佳范围在1-2微米MMAD,几何标准偏差(GSD)2.9的气溶胶。干燥空气源(Aridyne 3500,Timeter,Lancaster,PA)传递给Bird 3M气体混合器(Palm Springs,CA),它与空气压缩机和CO2罐相连。得到的空气和CO2的混合物传递给喷雾器。用Fyrite溶液(Bacharach,Pitt sburgh,PA)测定在空气中的最终浓度为5%CO2。喷雾10毫升溶液花约30分钟。
实施例14
CAT测定
在每个时间点后麻醉并杀死小鼠,收集肺和其它组织,称重并立即冷冻。用CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany)测量体内表达。组织在700微升CAT测定裂解缓冲液中用Wig-L-Bug珠粒匀浆器(CrescentDental Mfg.Lyon,II)匀浆组织。匀浆离心后,200卫生提取液用于以96孔板形式进行的CAT ELISA用微量滴定板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)读出吸光度。用未经处理的小鼠作为对照。用纯化的CAT酶制作的标准曲线,将CAT活性表达成ng CAT/克组织。测定的灵敏度可根据厂商的建议进一步提高,因此可检测低至0.1-0.3pg/孔的CAT蛋白水平。
实施例15
荧光素酶测定
麻醉并杀死小鼠,收集肺。用荧光素酶测定试剂盒(Promega)测量荧光素酶表达。肺在1毫升荧光素酶测定裂解缓冲液中用Wig-L-Bug珠粒匀浆器匀浆。离心匀浆后,将10微升提取物加到50微升荧光素酶底物中,在96孔板中用光度计(Microlumat LB 96 P,EG&G Berthold,Germany)读出荧光10秒钟。用未经处理的小鼠作为对照。荧光素酶活性表达成RLU/10s/g组织。在该系统中,用纯化的Promega的荧光素酶,107RLU对应于1纳克荧光素酶。
实施例16
组织切片的组织学分析
用异氟烷麻醉小鼠并通过腹主动脉放血杀死。分离肺,插管,并通过用10%中性缓冲的甲醛膨胀固定,包埋在石蜡中,加工后用于组织学分析。该切片切成4微米,用苏木精和曙红染色在显微镜下观察任何炎症或毒性的迹象。
实施例17
髓过氧化物酶(MPO)测定
接触气溶胶后24小时,用异氟烷麻醉小鼠,并通过腹主动脉放血杀死。经心脏后灌注盐水后收集肺。如前所述在溴化十六烷基三甲基铵(0.5%HTAB在50mM磷酸缓冲液中(pH6.0)的溶液;5ml HTAB/g组织)中匀浆组织(51)。在离心后,用二盐酸邻联茴香胺(o-diasinidine dihydrochloride)(0.167mg/ml)加上0.0005%过氧化氢确定上清液中的MPO活性。在460纳米用微量滴定板读数器(MolecularDevices)测量吸光度。记录15分钟后的绝对值。用未经处理的小鼠作为对照。
实施例18
用5%CO2喷雾PEI-DNA复合物与正常空气相比提高肺中的转基因表达
呼吸含5%CO2的空气与小鼠与人的潮气量和呼吸频率的增加有关(52-54)。当用含5%CO2的空气传递PEI-DNA气溶胶时,小鼠可见呼吸更深更快。吸入含5%CO2的气溶胶与用空气传递的气溶胶所实现的相比可导致气溶胶颗粒吸入更多,并相应更高的转基因表达,因为潮气量和呼吸频率增加。
用正常空气或含5%CO2的空气的气溶胶将PEI-DNA复合物传递给Balb/c小鼠。如上所述喷雾30分钟固定量的CAT质粒(1mg/10ml溶液),N∶P比为10∶1。24小时后收集肺,进行CAT测定来确定转染程度。含5%CO2的空气导致与单独用空气喷雾的气溶胶相比检测到的CAT水平增加到3倍(P=0.001)(图5)。另外,5%CO2并不改变得到的药物-脂质体气溶胶颗粒的粒径。
还检测了用不同百分比的含CO2的空气使固定量的CAT质粒气溶胶化增强PEI-DNA转移至肺。用0%、2.5%、5%、10%和对照量的空气中的二氧化碳气溶胶化该复合物。测定的CAT活性表明用2.5%或10%提供了与用含5%CO2的空气相同的转染水平(图6)。
可能是增加的CO2通过改变其它生理参数影响PEI-DNA复合物的转染效率。然而CO2与空气相比,不显著改变PEI-DNA溶液的pH,也不改变得到的气溶胶液滴的粒径。肺中转基因表达的增加最有可能与气溶胶颗粒的沉积增加有关。含5%CO2的空气能帮助优化其它聚合物-DNA或阳离子脂质-DNA复合物的气溶胶传递(45)。人完全能忍受该CO2百分数,并且显示分钟量增加(54,55),因此如果考虑到人肺部系统的大小、几何学和生理学,该策略能有效针对人的肺部疾病。
实施例19
PEI传递DNA是剂量依赖性的
为了进一步优化转基因表达,N∶P比维持在10∶1,DNA量从每10毫升气溶胶化的溶液250微克变到4毫克。这导致储器浓度和气溶胶输出中喷雾的总DNA量增加。
计算的Aerotech II喷雾器的喷雾输出大约是80%。约72%储器的DNA传递到吸入室,如用全玻璃冲击器(AGI)所估计的(50)。剩余的留在T形接头和管道中。基于小鼠被动鼻式呼吸,肺生理学(分钟量和沉积比例)(50)和气溶胶的输出浓度(4.8微克/升),沉积在小鼠肺中的DNA量估计在30分钟气溶胶接触中是约4-5微克(对于起始储器浓度是2毫克DNA/10毫升的溶液)。这些计算基于正常空气呼吸;沉积在5%CO2存在时会更高,因为潮气量和呼吸频率增加(53)。
用含5%CO2的空气气溶胶化复合物,2毫克DNA得到肺中最高的CAT表达水平(图7)。用250微克DNA测得的CAT水平与对照肺中统计上没有差异(P=0.34)。另外,当将4毫克DNA以N∶P比为10∶1溶于10毫升时,导致DNA肉眼可见沉淀,这可能是在肺中与2毫克相比未检测到CAT水平进一步提高的原因(P=0.51)。
应注意DNA传递的浓度和量都有增加。然而可能进一步通过延长最佳浓度的气溶胶接触时间提高肺中的表达。肺中的这些表达水平与用其它传递系统相当(34)。
实施例20
PEI-DNA比的优化
虽然PEI可在喷雾过程中保护DNA,并导致当与大多数其它阳离子脂类相比,气溶胶传递后在肺中更高的转基因表达,确定基因传递的最佳参数是有益的。任何阳离子载体和带负电的DNA之间的电荷相互作用是确定复合物转染效率的重要因素。先前的研究确定了用于肺中的转染的最佳PEI-DNA(N∶P)比(38,56)。然而,这些研究与PEI-DNA传递的静脉内模式有关。气溶胶基因传递可能需要不同的条件。
为了确定体内气溶胶传递理想的投料配比,评估了不同PEI-DNA(N∶P)比转染肺的能力。DNA量维持在2毫克不变,改变PEI浓度以获得5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1和20∶1的比率。基于先前体外和体内(通过滴注)研究选择这些比例(43)。用含5%CO2的空气气溶胶化复合物。15∶1的N∶P比在肺中获得最高水平的CAT表达,而5∶1得到的CAT表达水平非常低(图8)。在10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1和20∶1的比例之间没有统计学上的差异(P>0.1),但是在15∶1和20∶1之间(P=0.05),10∶1和15∶1(P=0.014)之间存在显著差异。
为了确定除了CAT以外的质粒的最佳比例,试验了肺中荧光素酶基因表达的不同N∶P比例。评估的比例是5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1和40∶1。与CAT比较,荧光素酶的最佳曲线向右漂移,最高表达在20∶1(与其它比例比较P<0.05)(图8)。这提示不同质粒可需要不同的N∶P比;荧光素酶质粒的不同大小导致其与PEI的复合与CAT质粒结构上不同。也可能是由于质粒纯度的不同以及超螺旋结构比率的不同。但在这两种质粒的最佳N∶P比例之间还有可观的重叠。不同质粒的最佳比例也许是不同的。考虑实验变异性,10∶1和20∶1之间的比例将起到合适的作用。低于10∶1的比例在肺中不产生非常高的转染。这些结果与用分枝的25K PEI获得的那些结果一致,虽然传递模式是静脉内(56)。
实施例21
一次气溶胶传递后肺中CAT表达的时间过程
还用CAT表达来监测基因表达的时间过程。单剂气溶胶传递后CAT表达持续性的分析提供了策划治疗研究的治疗方案的重要信息。用含5%CO2的空气对小鼠以两种不同的N∶P比15∶1和10∶1喷雾2毫克CAT质粒。对于10∶1组检测的不同时间点是气溶胶接触后1、2、3和6天。在不同的时间点收集肺和其它组织,立即冷冻。在最后的时间点后同时测定所有组织(第6天)。对于15∶1组在气溶胶治疗后1、3、7和10天杀死小鼠。在各时间点后收集肺,称重,冷冻,在最后的时间点后测定CAT蛋白质(第10天)。
对于检测的两种N∶P比,CAT表达在24小时时最高,并维持三天不变(在第1天和第3天之间无统计学差异,对于15∶1的比例P=0.4,对于10∶1的比例P=0.12)(图10A和10B)。CAT水平在一周后下降到峰水平的约50%,在10天后仍检测到显著的水平(与对照相比P=0.001)。这提示传递足够比各种临床应用的量多得多。基因表达持续达10天与其它用于滴注或气溶胶传递基因的阳离子脂质相似或更高(34,58)。
实施例22
转基因的组织分布
静脉内或腹膜内传递DNA载体通常导致在各种组织中的表达。为了确定气溶胶传递PEI-DNA是否也导致全身性基因传递,从上述实验(从10∶1组)的同一组小鼠收集不同组织,在最后时间点后进行CAT测定。测定的组织是肺、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、脑和血液。在非肺组织中检测到的CAT水平非常低,与对照组织相比没有显著差异(对于所有组织p>0.1)(图11)。
组织分布数据显示该系统中气溶胶传递后基因表达限于肺,表明仅有极小的全身性传递。与肺相反,当用PEI-DNA气溶胶传递时,肝、脾和肾等组织显示不显著或不能检测的CAT表达,而当静脉内或腹膜内给药时,它们通常显示可检测的表达水平。如果感兴趣的基因表达要限于肺时,这是重要的。在其它研究中,基因传递的气管内传递模式用于将基因局限于肺(58)。然而,这与气溶胶相比是一种侵入性的技术,并导致在肺周围区域较不均匀沉积。气溶胶传递帮助将颗粒非侵入性和均匀的分布在整个肺中。
实施例23
组织学分析不显示炎症迹象
为了确定用该系统气溶胶传递PEI-DNA复合物是否在该系统中导致任何毒性或急性炎症,将2毫克CAT质粒与PEI以15∶1的N∶P比复合,使小鼠与气溶胶用含5%CO2的空气接触30分钟。24小时后杀死小鼠,将肺固定在福尔马林中,用苏木精和伊红染色。如图12所示,在检查薄的切片时肺不显示任何组织学异常的证据,如炎症细胞浸润或肺损伤。用含5%CO2的空气通过PEI-DNA气溶胶优化肺部基因传递看来对于肺是安全而高度特异性的。
虽然在该系统中单剂气溶胶接触甚至一周后都检测到高水平的表达,一些治疗仍然需要重复并频繁的传递基因。需要确定延长的PEI-DNA气溶胶接触对肺和其它组织的作用。
实施例24
髓过氧化物酶测定不显示任何炎症
急性肺部炎症部分是由多形核白细胞(PMN)汇集到周围组织介导的。多形核白细胞的一个生物化学标记是髓过氧化物酶(MPO),它是在嗜苯胺蓝粒细胞中发现的含血红素的酶,常常用作肺中的炎症标记(18)。为了评估中性粒细胞对肺的浸润,将2毫克CAT质粒与PEI以15∶1的N∶P比复合,用含5%CO2的空气使小鼠与气溶胶接触30分钟。24小时后杀死小鼠,收集肺,并进行髓过氧化物酶测定(表3)。
对照和接触气溶胶的肺中的髓过氧化物酶含量无显著差异(P=0.92)。髓过氧化物酶测定不揭示对照和接触气溶胶的肺之间的任何差异,即在对照和接触气溶胶的肺的绝对吸光度值(OD)之间,甚至在反应保温15分钟后也无差异(对照OD是0.078±0.009,气溶胶接触的肺是0.084±0.004,P>0.5)。
表3
评估中性粒细胞浸润肺的髓过氧化物酶(MPO)测定
组 | 对照 | 气溶胶 |
肺MPO活性 | 0.0398±0.01 | 0.0404±0.008 |
(δA/min/g组织) |
注:将2毫克CAT质粒与PEI以N∶P比为15∶1复合,用含5%CO2的空气将复合物向5只小鼠喷雾30分钟。24小时后杀死小鼠,收集肺进行MPO测定。数值是平均值±SD(n=每组5只小鼠)。
实施例25
P53试验
用ELISA试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)测定P53表达。对于体外表达,用PEI∶DNA复合物转染在组织培养板中生长的B16-F10细胞(20,000细胞/孔,48孔培养板)24小时。然后洗涤培养物,用细胞裂解缓冲液裂解细胞。离心后,用100微升裂解液进行p53 ELISA。将p53水平标定到用BCA蛋白测定(Pierce,Rockford,IL)测定的总蛋白质含量。对于体内表达,使小鼠与PEI∶p53气溶胶接触,24小时后杀死,收集肺并称重。在1毫升冰冷的细胞裂解缓冲液(20mMTris,0.5mM EDTA,1%Nonidet P40,0.05%SDS,1mM PMSE,1微克/毫升胃酶抑素,2微克/毫升亮抑酶肽)中用Wig-L-Bug珠粒匀浆器(Crescent,Lyons,IL)匀浆肺。4℃离心后,用100微升上清液在96孔板中进行p53 ELISA。用MolecularDevices(Sunnyvale,CA)微量滴定板读数器读出吸光度(450纳米)一式三份。用纯化p53制作的标准曲线确定p53量。该测定可检测低至10pg/ml的p53水平,该测定法的线性测量范围是50-1000pg/ml。用BCA蛋白质测定法测定了肺中总蛋白含量。
实施例26
PEI-p53复合物以气溶胶传递后小鼠肺中的P53表达
如上对于PEI∶DNA复合物所述制备PEI-p53复合物。将2毫克p53质粒与聚乙二亚胺以PEI∶DNA(N∶P)10∶1复合,用含5%CO2的空气喷雾给C57BL/6小鼠。将小鼠置于塑料笼内,用胶带在气溶胶传递前密封。这是无约束的,全身气溶胶接触系统。用Aero-Mist喷雾器在如本文先前对于气溶胶化聚乙二亚胺:CAT复合物所述的5%CO2存在下气溶胶化PEI-p53复合物。
用ELISA在PEI-p53复合物气溶胶传递给小鼠后24小时分析肺中的P53表达。气溶胶传递复合物导致肺组织中检测到的p53水平与未经处理的小鼠肺中检测到的比较约增加了4倍。对照小鼠中p53的水平是0.0398±0.01pg/mg蛋白,而给予气溶胶的小鼠是0.0404±0.008pg/mg蛋白(数值是平均值±SD)(59)。与PEI-Luc接触不导致p53水平的任何增加(数据未显示)。
实施例27
气溶胶传递PEI-p53抑制B16-F10肺转移
在第0天C57BL/6小鼠静脉内注射25,000 B16-F10细胞。用含5%CO2的空气产生的聚乙二亚胺-p53气溶胶复合物一周治疗小鼠两次,从癌细胞接种入小鼠后一天开始(第1、4、8、11、15、18和22天),最后一次治疗在注射后22天(共接触7次气溶胶)。对照组包括未治疗的小鼠,用聚乙二亚胺或聚乙二亚胺-Luc气溶胶复合物治疗的小鼠。大约肿瘤细胞接种后24天对照动物开始死亡,这是停止治疗,实验终止的时间。治疗剂量是2毫克质粒/10毫升气溶胶化的溶液,聚乙二亚胺:DNA(N∶P)比是10∶1。这是给这些小鼠的气溶胶化DNA的总量。估计传递给每只小鼠的DNA量在正常空气存在下是约4-5微克,在5%CO2存在下由于潮气量和分钟量增加而增加。
在肿瘤接种后24天,杀死小鼠,固定肺并计算肿瘤指数。用PEI-p53治疗的小鼠具有非常低的肿瘤指数(与所有其它组比较P<0.001),而所有对照组都有大量的肿瘤结节(图13A、13B)。大部分未治疗的小鼠和单独用聚乙二亚胺或聚乙二亚胺-Luc治疗的小鼠具有许多不可计数的肿瘤结节,并侵入胸壁,而在肺外组织,例如颈部和腹部淋巴结中有转移。然而,所有用聚乙二亚胺-p53复合物治疗的小鼠具有非常小而明显的肿瘤病灶,不侵入胸壁,没有肺外转移肿瘤。5%CO2单独对肿瘤的生长与未治疗小鼠相比没有影响(数据未显示)。肺重量也显示PEI-p53治疗组和所有对照组之间的显著差异(p<0.01)(图13C)。
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本说明书中提到的任何专利或出版物表明了本发明涉及的领域的技术人员的水平。另外,这些专利和出版物在此引入以供参考,其程度如同指出各独立出版物特别并分别被引入以供参考。
本领域技术人员将不难理解本发明适合实施目的并获得提到的结果和优点,以及那些本文中提到的目的、结果和优点。本文的实施例以及方法、程序、疗法、分子和本文所述的具体化合物是优选例的代表,是示范性的,不意味着限制本发明的范围。对于本领域技术人员可进行改变和其他用途,这些在权利要求限定的本发明的精神内。
Claims (18)
1.含有2.5%-10%二氧化碳气体的空气混合物的用途,其特征在于,该空气混合物用于制备气溶胶化药物,所述二氧化碳气体提高气溶胶化药物在呼吸道内的沉积。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述空气混合物含有2.5%二氧化碳。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述空气混合物含有5%二氧化碳。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述空气混合物含有7.5%二氧化碳。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述气溶胶化药物通过喷射喷雾器气溶胶化。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述气溶胶化药物是水溶性的或溶于缓冲液的药物。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述水溶性或可溶于缓冲液的药物选自抗生素、粘液溶解剂、支气管扩张药、副交感神经药、酶和抗病毒剂。
8.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述气溶胶化药物是含有磷酯酰胆碱、聚乙二醇修饰的磷脂的脂质体或聚乙二亚胺携带的不溶性药物。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述磷脂酰胆碱是二月桂酰磷脂酰胆碱。
10.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述聚乙二醇修饰的磷脂是二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺聚(乙二醇)2000。
11.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述不溶性药物是脂质体携带的亲脂药物。
12.如权利要求11所述的用途,其特征在于,所述亲脂药物选自两性霉素B、制霉菌素、糖皮质激素、免疫抑制剂和抗癌药。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述抗癌药物选自喜树碱、喜树碱衍生物和紫杉醇。
14.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述气溶胶化药物选自治疗性蛋白、治疗性肽、基因、有义寡核苷酸、反义寡核苷酸和病毒载体。
15.如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述基因是氯霉素乙酰转移酶或p53。
16.如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述基因通过聚乙二亚胺传递。
17.如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述聚乙二亚胺具有约10∶1到约20∶1的氮∶磷比。
18.如权利要求17所述的用途,其特征在于,所述聚乙二亚胺具有约10∶1的氮∶磷比。
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