KR20020081742A

KR20020081742A - 항혈전성 삼성분계 공중합체

Info

Publication number: KR20020081742A
Application number: KR1020010021077A
Authority: KR
Inventors: 이진호; 오세행
Original assignee: 이진호
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2001-04-19
Publication date: 2002-10-30
Also published as: KR100431245B1

Abstract

본 발명은 항혈전성 삼성분계 공중합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 공중합체가 물에 용해되지 않도록 하는 소수성 단량체와, 친수성이며 사슬의 높은 유동성(high mobility)과 입체 안정성 효과(steric stabilization effect)로 인해 혈액적합성을 나타내는 친수성 단량체, 그리고 친수성이며 pH 7.4에서 음전하를 띠는 음이온성 단량체를 공중합시킨 것으로 혈액과 직접 접촉되는 인공장기 및 의료용구 표면에 도포물질로 사용되어 혈액응고에 핵심적인 역할을 하는 혈장단백질(plasma proteins)의 흡착과 혈소판(platelet)의 점착을 억제시켜 혈액적합성을 높이게 되는 항혈전성을 가지는 삼성분계 공중합체에 관한 것이다.

Description

항혈전성 삼성분계 공중합체{A nonthrombogenic Terpolymer}

본 발명은 항혈전성 삼성분계 공중합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 공중합체가 물에 용해되지 않도록 하는 소수성 단량체와, 친수성이며 사슬의 높은 유동성(high mobility)과 입체 안정성 효과(steric stabilization effect)로 인해혈액적합성을 나타내는 친수성 단량체, 그리고 친수성이며 pH 7.4에서 음전하를 띠는 음이온성 단량체를 공중합시킨 것으로 혈액과 직접 접촉되는 인공장기 및 의료용구 표면에 도포물질로 사용되어 혈액응고에 핵심적인 역할을 하는 혈장단백질(plasma proteins)의 흡착과 혈소판(platelet)의 점착을 억제시켜 혈액적합성을 높이게 되는 항혈전성을 가지는 삼성분계 공중합체에 관한 것이다.

체내 이식된 외부 물질이 혈액과 접촉하게 되면 가장 먼저 일어나는 현상이 혈액 내에 있는 단백질들의 흡착이다. 이들 단백질의 흡착은 혈소판 점착 및 활성화를 유도하게 되며 연이어 복잡한 반응 메카니즘을 통해 혈액을 외부 물질 표면에 응고시켜 혈전을 형성하게 한다. 이들 단백질의 흡착과 이어 일어나는 혈소판 등 세포들의 점착은 체내 이식재료가 가지고 있는 성질과 이들의 주변 환경에 크게 영향을 받는다. 따라서, 혈액과 직접 접촉이 불가피한 인공장기뿐만 아니라, 콘택트 렌즈, 의료용 센서, 분리공정에 쓰이는 멤브레인, 크로마토그래피 지지체(chromatographic supports), 혈액 및 단백질 저장 백, 면역진단시약 (immunoassays) 등 혈액과 직접 접촉이 불가피한 의료용구들은 우수한 혈액적합성이 요구된다.

종래 의료용 기구 및 인공장기 소재는 기계적 강도가 높고, 성형이 용이한 점 때문에 주로 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 등의 폴리올레핀계 수지, 가소화 연질 폴리비닐(PVC), 폴리우레탄 수지 등으로 제조되어져 왔다. 그러나, 상기 고분자 소재들은 혈액 응고를 유발하여 혈액과 직접 접촉하는 부분의 응용에는 상당한 제약을 받아왔다.

이러한 상황에서, 우수한 혈액적합성을 나타내는 재료를 개발하기 위한 많은 연구가 행해져 왔다. 대표적인 예로, 혈액과 접촉하는 인공장기나 의료용구 표면을 화학적으로 또는 물리화학적으로 친수화 처리하거나 친수성 고분자를 그라프트 반응에 의해 도입하는 방법, 헤파린 등의 항혈전제를 고정하는 방법 등이 있으나, 처리조건이 비교적 까다롭고 혈액적합성이 그다지 우수하지 못한 단점이 있다. 좀 더 효율적인 혈액적합성 향상 방법으로, 인체 내 혈관이 완벽한 항혈전성을 갖도롤 해주는 원인인 내피세포를 재료표면에 배양하여 균일하게 도포해 주는 방법이 있다. 내피세포 도포방법이 아직까지 알려진 혈액적합성 향상 방법 중에서는 가장 우수한 성능을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 이 방법은 환자의 내피세포를 채취해 실험실적으로 세포 배양을 통해 재료 표면에 도포해 주어야 하기 때문에 긴급한 상황에 사용되지 못하고 상품화가 불가능하다는 단점이 있다.

한편, 인공장기 중 인공혈관의 경우 내경 5 ∼ 6 mm 이상의 대구경 혈관은 장기간 동안 체내에서 개존율이 높으나 그 이하의 소구경 인공혈관의 경우는 아직 실패율이 높다. 소구경 혈관은 대구경 혈관에 비해 혈류속도가 느리고 혈류 저항이 크므로 혈관 재료에 의한 혈관 폐색이 일어나기 쉽지만 소구경에서 발생하는 혈관 폐색을 방지할 우수한 항혈전성 재료가 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.

본 발명은 공중합체가 물에 용해되지 않도록 하는 소수성 단량체와 친수성이며 사슬의 높은 유동성과 입체 안정성 효과로 인해 혈액적합성을 나타내는 친수성단량체, 및 친수성이며 pH 7.4에서 강한 음전하를 띠어 대부분의 혈장 단백질 및 세포들과의 정전기적 반발력을 나타내는 음이온성 단량체들을 공중합시켜 삼성분계 공중합체를 제조하였다.

따라서, 본 발명은 혈액응고에 핵심적인 역할을 하는 혈장단백질의 흡착과 혈소판의 점착을 억제시켜 혈액적합성 및 항혈전성을 높이므로 혈액과 직접 접촉되는 심혈관계 분야에서 유용하게 사용할 수 있는 항혈전성 삼성분계 공중합체를 제공하는데 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 삼성분계 공중합체와 혈액내 구성성분인 혈소판과의 상호반발작용을 나타내는 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 단량체의 조성이 다른 삼성분계 공중합체가 도포된 PMMA 필름(실시예 4 ∼ 6) 표면에 흡착된 혈장단백질들의 상대적인 양을 표면 화학성분 분석기인 ESCA를 사용하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 단량체의 조성이 다른 삼성분계 공중합체가 도포된 폴리우레탄 필름(실시예 7 ∼ 9) 표면에 점착된 혈소판들을 주사전자 현미경(SEM)을 사용하여 나타낸 것이다.

본 발명은 소수성 단량체인 메틸 메타크릴레이트; 메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트, N-비닐 피롤리돈, 비닐알콜 및 아크릴 아마이드 중에서 선택된 친수성 단량체; 그리고, 비닐 설폰산염, 아크릴산 및 메타크릴산 중에서 선택된 음이온성 단량체를 공중합시켜 얻은 항혈전성 삼성분계 공중합체를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 항혈전성 삼성분계 공중합체는 혈액 내에서 안정성을 가지며, 공중합체 내에 친수성이며 사슬의 높은 유동성과 입체 안정성 효과로 혈액 적합성을 나타내어 단백질 및 혈소판의 점착을 억제할 수 있는 친수성기를 가지며, 또한 체내에서 생성되는 항응혈제인 헤파린이 술폰산기를 많이 포함하는 음전하를 띄어 항응혈 효과를 내는 것과 마찬가지로 카르복실산 또는 술폰산기와 같은 음전하를 함유하는 고분자를 사용하여 대부분의 혈장 단백질 및 세포들과 정전기적 반발력을 나타내어 혈액적합성이 우수한 효과가 있으며, 이들은 상호상승효과(synergy effect)를 나타내어 혈액적합성이 더욱 우수하다.

소수성 단량체는 중합체가 물에 용해되지 않고 안정되게 존재하게 해주는 역할을 하며 전체 공중합체 중에 30 ∼ 99 중량% 함유하는 것이 바람직하다. 만일 그 함유량이 30 중량% 미만이면 수용성이 되고, 99 중량%를 초과하면 항혈전성을 나타내지 못하는 문제가 있다. 상기 소수성 단량체는 메틸 메타크릴레이트(methacrylate)를 사용하는 것이 바람직하다.

친수성 단량체는 친수성이며 사슬의 높은 유동성과 입체 안정성 효과로 혈액 적합성을 나타내는 단량체로서 전체 공중합체 중에 0.5 ∼ 50 중량% 함유하는 것이 바람직하다. 만일 그 함유량이 0.5 중량% 미만이면 항혈전성을 나타내지 못하는 문제가 있고, 50 중량%를 초과하면 물에 용해되는 문제가 있다. 상기 친수성 단량체는 메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트(Methoxy PEO monomethacrylate), 2-하이드록시에틸메타크릴레이트 (2-hydroxyethylmethacrylate), N-비닐 피롤리돈(N-vinyl pyrrolidone), 비닐알콜(vinyl alcohol) 및 아크릴 아마이드(acryl amide) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트를 사용하는 것이 좋다. 그리고, 상기 메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트는 곁가지에 PEO사슬이 100 ∼ 10,000 g/mol의 분자량을 가지는 단량체를 사용하는 것이 바람직하다.

음이온성 단량체는 친수성이며 pH 7.4에서 강한 음전하를 띠어 대부분의 혈장 단백질 및 세포들과의 정전기적 반발력을 나타내는 단량체로서 전체 공중합체 중에 0.5 ∼ 50 중량% 함유하는 것이 바람직하다. 만일 그 함유량이 0.5 중량% 미만이면 낮은 음전하 값을 가져 항혈전성을 나타내지 못하는 문제가 있고, 50 중량%를 초과하면 물에 용해되는 문제가 있다. 상기 음이온성 단량체는 비닐 설폰산염(vinyl sulfonic acid soium salt), 아크릴산(acrylic acid) 및 메타크릴산(methacrylic acid) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 비닐 설폰산염을 사용하는 것이 좋다. 그리고, 상기 음이온성 단량체는 음전하가 곁가지의 말단 또는 중간영역에 위치하는 단량체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기한 소수성 단량체, 친수성 단량체 및 음이온성 단량체를 공중합시켜 얻은 삼성분계 공중합체를 포함한다.

한편, 본 발명에 따른 상기 단량체들을 공중합시켜 얻은 삼성분계 공중합체의 한 예로 다음 화학식 1로 표시되는 공중합체를 포함한다.

상기 화학식 1에서: R₁, R₂, R₃, R_4,및 R₅는 각각 수소원자 또는 C₁∼ C₈의 알킬기를 나타내고; R₆는 -SO₃ ^-Na⁺또는 -COOH 등의 음이온성기를 나타내고; n은 1 ∼ 300을 나타내며; a, b, c는 각 단량체의 조성비로 나타낼 때 a는 0.3 ∼ 0.99이고, b는 0.005 ∼ 0.5이고, c는 0.005 ∼ 0.5이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항혈전성 삼성분계 공중합체는 하나의 공중합체 내에 친수성기와 음전하를 동시에 보유하여 혈액적합성이 우수하므로 소구경 혈관을 비롯하여 혈액과 직접 접촉하는 이식재료 및 의료용구에 항혈전성 도포용 소재로 적용할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 ∼ 3: 메틸 메타크릴레이트(MMA)/메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트(MPEOMA)/비닐 설폰산염(VSA) 삼성분계 공중합체의 합성

다음 표 1에 나타난 조성과 아래의 방법으로 MMA/MPEOMA/VSA 삼성분계 공중합체를 합성하였다. 시약은 단량체로 메틸 메타크릴레이트(MMA; 준세이 케이칼, 일본)를 10% NaOH 수용액으로 반응 억제제를 제거 후, 건조제를 넣고 환류(reflux)시켜, 건조제는 걸러내고 감압증류하였으며, 비닐 설폰산염(VSA; 알드리치, 미국)는 아세톤에 침전을 시켜 진공 건조하여 사용하였다. 그리고 개시제로 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN; 준세이 케미칼)을 메탄올에 재결정하여 사용하였다. 또한, 단량체로 메톡시 PEO 모노메타크릴레이트(MPEOMA; PEO 분자량 = 1,000: 폴리사이언스, 미국)를 정제하지 않고 사용하였다. 고분자 합성시 용매로 사용된 디메틸 썰폭사이드(DMSO)는 건조제를 넣고 환류 시킨후, 건조제는 걸러내고 감압증류를 하여 사용하였다. 공중합체는 라디칼 공중합 반응에 의해 합성되었다.

50mL 용량의 앰플(ampule)에 단량체 MMA와 MPEOMA 그리고 VSA를 각 조성별(표 1)로 용매인 DMSO(15 wt%)에 완전히 용해시킨 후, AIBN(단량체 무게의 0.6%)을 넣어 질소로 15분간 버블링(bubbling) 시켜주었다. 이 과정이 끝난 후 곧바로 불꽃 토치를 이용하여 앰플을 밀봉시켰다. 이렇게 제조된 앰플을 60 ℃, 70 rpm의 항온수조에서 48시간 반응을 시켰다. 반응이 완결된 후 앰플 뚜껑을 제거한 후 디에틸 에테르에 침전, 세척 후 잔여 용매를 제거해 주기 위해 상온의 진공건조기에서 24시간 건조시켜 주었다. 이렇게 합성되어진 신규 공중합체들은¹H-NMR로 조성비를 확인하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.¹H-NMR 스펙트럼은 베리언 300 스펙트로미터(Varian, 미국)를 사용하여 측정하였고, 모든 화학적 이동도는 내부 표준물질 테트라메틸 실란에 대해 ppm단위로 기록되었다.

¹H-NMR (아세톤 D⁶, ppm) 3.6 - 3.7 (MMA의 C-O-CH ₃ ), 3.6 - 4.2 (MPEOMA의CH ₂ CH ₂ O-CH₃), 3.3 - 3.4 (MPEOMA의 CH₂CH₂O-CH ₃ ), 2.4 - 2.5 (VSA의CH-SO₃ ^-Na⁺)

실시예 4 ∼ 9. 고분자 필름에 삼성분계 공중합체 도포

상기 제조된 삼성분계 공중합체를 고분자 필름에 도포하는 방법은 다음과 같고 각 실시예에 사용된 도포시료와 도포기질은 다음 표 2에 나타내었다.

실시예 1 ∼ 3의 삼성분계 공중합체를 도포할 기질로 사용하기 위해 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA, 알드리치) 및 폴리우레탄 (PU, biomedical grade, Pellethane 2363-80AE, 다우 케미칼, 미국)을 용매 캐스팅 방법으로 필름을 제조하였다 (두께, 약 100 미크론).

실시예 1 ∼ 3의 삼성분계 공중합체를 DMSO에 15 wt%로 용해시킨 액을 스핀-코터기(spin-coater)를 이용하여 PMMA 필름과 PU 필름 위에 1500 rpm으로 30초 동안 3차례 도포하였다. 공중합체가 도포된 필름들은 상온의 진공건조기에서 24시간 건조시켰다.

시험예 1: 혈액적합성의 평가

혈액적합성 평가를 위해 사용한 용액은 인체 내와 동일한 생리학적 조건을 만들어 주기 위해 PBS 용액(Phosphate Buffered Saline, pH 7.3∼7.4)을 이용하였다. 세포의 고정화를 위해 25% 글루타알데히드(시그마, 미국)를 PBS를 이용하여 2.5%로 희석시켜 사용하였으며, 혈액 적합성은 혈장단백질(plasma proteins) 흡착 실험과 혈소판(platelets) 점착 실험으로 평가하였다.

<혈장단백질 흡착실험>

혈장 내에 존재하는 알부민, 감마-글로블린, 피브리노겐 등 단백질용액은 각각의 단백질 파우더(human source: 시그마) 1 mg을 PBS 1 mL에 녹여서 사용하였고, 단백질 혼합용액인 혈장단백질 용액은 신선한 사람 혈액(human whole blood, 대한적십자사, 한국) 1100 g을 4000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상등액으로부터 채취하여 얻었다.

혈장단백질 흡착실험을 위해 공중합체가 도포된 PMMA 필름(실시예 4 ∼ 6)을 PBS를 이용하여 30분동안 인큐베이터(incubator)내에서 평형(equilibrium)시키고 위에서 얻어진 혈장단백질들을 각각 주입하여 37 ℃ 인큐베이터에서 60분간 배양하였다. 배양 후 단백질들이 흡착된 공중합체 도포 필름들을 PBS로 3회, 증류수로 3회 세척하고 상온에서 진공 건조하였다.

공중합체가 도포된 PMMA 필름 표면에 흡착되어 있는 혈장단백질의 흡착 정도는 단백질 내 펩타이드 결합으로부터의 N-1S 피크를 ESCA(electron spectroscopy for chemical analysis, ESCALAB MKⅡ, V. C. Scientific CO., U.K.)로 분석하여 얻었으며, 공중합체가 도포되지 않은 대조군 PMMA 필름과의 비교 결과를 도 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 실시예 4 ∼ 6은 도 2에 나타난 바와 같이 대조군(PMMA 필름)에 비해 고분자 필름의 표면에 흡착된 혈장단백질이 월등히 감소함을 확인할 수 있었다.

<혈소판 점착실험>

혈소판은 개 혈액(canine blood) 300 g을 1400 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP, platelet-rich plasma)으로부터 분리하여 얻었다.

혈소판 점착실험은 공중합체가 도포된 PU 필름(실시예 7 ∼ 9)을 PBS 용액에서 30분간 평형시킨 후 분리한 혈소판 풍부 혈장을 주입하여 120분 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하고, PBS 용액으로 세척한 후, 필름 표면에 부착된 혈소판을2.5% 글루타알데히드 용액으로 2시간 고정화 처리하였고, 다시 PBS 용액과 증류수로 세척하고 동결건조(freeze drying)로 수분을 제거한 후 주사전자 현미경(scanning electron microscope, SEM : S-2250M, Hitachi, Japan)을 통해 혈소판의 표면 점착 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

본 발명에 따른 실시예 7 ∼ 9는 도 3에 나타난 바와 같이 대조군(PU 필름)에 비해 공중합체가 도포된 PU 표면에 점착된 혈소판 수가 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에 따른 삼성분계 공중합체는 공중합체 내에 PEO 곁사슬과 음전하의 상호상승효과(synergy effect)로 혈액적합성이 매우 우수하여 상기 삼성분계 공중합체를 고분자 표면에 도포하였을 때 고분자 표면에 흡착하는 혈장단백질과 점착되는 혈소판이 현격히 감소함을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 삼성분계 공중합체는 혈액 내에서 안정성을 가지며 공중합체 내의 친수성기와 음전하의 상호상승효과(synergy effect)로 혈액적합성이 매우 우수하여 혈액응고에 핵심적인 역할을 하는 혈장단백질의 흡착과 혈소판의 점착을 억제시켜 혈액적합성 및 항혈전성을 높이므로 혈액과 직접 접촉되는 이식재료 및 의료용구에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

소수성 단량체인 메틸 메타크릴레이트;

메톡시 폴리에틸렌옥사이드 모노메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트, N-비닐 피롤리돈, 비닐알콜 및 아크릴 아마이드 중에서 선택된 친수성 단량체; 및

비닐 설폰산염, 아크릴산 및 메타크릴산 중에서 선택된 음이온성 단량체를 공중합시켜 얻은 것임을 특징으로 하는 항혈전성 삼성분계 공중합체.
제 1 항에 있어서, 상기 소수성 단량체가 30 ∼ 99 중량%, 친수성 단량체가 0.5 ∼ 50 중량% 및 음이온성 단량체가 0.5 ∼ 50 중량% 함유된 것임을 특징으로 하는 항혈전성 삼성분계 공중합체.
제 1 항에 있어서, 상기 항혈전성 삼성분계 공중합체가 다음 화학식 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 항혈전성 삼성분계 공중합체.

화학식 1

상기 화학식 1에서: R₁, R₂, R₃, R_4,및 R₅는 각각 수소원자 또는 C₁∼ C₈의 알킬기를 나타내고; R₆는 -SO₃ ^-Na⁺또는 -COO^-H⁺등의 음이온성기를 나타내고; n은 1 ∼ 300을 나타내며; a, b, c는 각 단량체의 조성비로 나타낼 때 a는 0.3 ∼ 0.99이고, b는 0.005 ∼ 0.5이고, c는 0.005 ∼ 0.5이다.