KR20020079719A

KR20020079719A - 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42와 이로부터생산되는 신규 혈전 분해효소

Info

Publication number: KR20020079719A
Application number: KR1020020061116A
Authority: KR
Inventors: 김학응; 유영춘; 황보식; 구정모; 김재수; 김현지; 박원순
Original assignee: 주식회사 제노바이오텍
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2002-10-19

Abstract

본 발명은 전통 발효식품인 청국장에서 분리한 혈전 분해능이 우수한 신규주 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB-42) [KCTC 10341BP] 균주 및 본 균주가 생산하는 혈전 분해효소에 관한 것으로서, 기존의 혈전용해제와 달리 곡물을 기질로 하여 가격이 저렴하고, 출혈부작용이 없으며 안정성이 뛰어나, 상기 균주 및 효소를 유효 성분으로 하는 조성물은 경구로도 투여할 수 있어 혈전에 의한 질환의 치료제 및 혈행 개선을 위한 건강 보조식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42와 이로부터 생산되는 신규 혈전 분해효소 {Bacillus megaterium JB-42 and the novel fibrinolytic enzyme produced by JB-42}

최근 생활수준의 향상과 더불어 건강에 대한 관심이 급속히 높아져 가고 있는 추세이며, 특히 40대 중반부터 많이 발생되는 성인병의 예방과 치료에 대한 관심이 대단히 높다. 성인병중에서 고혈압, 동맥경화, 심장병, 뇌졸중 등은 대표적인 순환기계 질병으로 지금까지 치료약제가 다수 개발되어 있음에도 불구하고 개선되지 않고 있다. 최근 선진국의 조사에 의하면 혈관기계 질환이 현대인의 사망원인의 1위를 차지하고 있으며, 우리나라에서도 1위는 악성종양, 2위는 뇌혈관질환, 3위는 심장질환 순으로 나타났다. 이러한 혈관 내 장해 중 특히 혈전에 의한 질환의 경우, 현재 의학적으로 많은 관심과 함께 활발한 연구가 진행되고 있다.

생체 내에서 혈액은 응고와 용해작용이 항상 균형을 이루고 있으며 정상적으로 순환하고 있느 동안 생성된 혈전은 즉시 분해되어 인체에 영향을 주지 않는다. 그러나 여러 가지 원인으로 분해되지 않은 혈전은 혈관을 막아 혈액순환이 방해되어 조직으로의 영양분 및 산소공급이 중단되게 되며 뇌졸중 및 심장질환의 원인이 되기도 한다.

현재까지 혈전증의 치료제로 사용된 의약품은 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), tPA (tissue-type plasminogen activator) 등은 몇 가지 문제점을 가지고 있어, 최근에는 이들 혈전용해제의 연구방향은 혈전에 대한 친화력이 높고, 혈전 용해활성이 높은 새로운 물질을 찾기 위한 노력이 진행되고 있다. 일본의 미야자키 의과대학팀은 중풍치료에 사용되어왔던 지렁이로부터 6가지의 혈전 용해효소(lumbrikinase)를 분리하여 경구용 치료제로 만들었고, 스미(Sumi) 등의 보고에 의하면 유로키나제(urokinase)를 경구 투여하여 흡수시키면 혈액내의 혈전용해 효소활성이 현저히 증가한다고 발표하였다. 최근에는 심혈관계 질환을 치료하는 의약품이 다양하게 개발 시판되고 있으나 혈전치료제는 부작용이 있을 수 있다. 이에 따라 뇌졸중, 심근경색, 혈전증 등을 식품섭취를 통해 미연에 방지하거나 개선시킬 수 있는 콩의 발효산물인 나토키나제(nattokinase)가 최근 기능성 소재로서 주목을 끌고 있다. 나토키나제는 대두에는 들어 있지 않지만, 콩을 발효시킬 때 미생물(나토균)이 대두의 영양성분을 섭취, 생육하면서 만들어 내는 혈전용해 효소이다. 이 효소는 일본의 스미 박사가 1987년 200여종의 식품검색과정 중에 납두(natto, 일본식 청국장)로부터 발견하여 명명한 것이다. 나토키나제는 직접적이고 강력한 혈전 분해능력과 pro-urokinase 활성화 능력을 갖고 있는 혈전용해효소로서 경구 섭취에 의해서도 효과가 있는 것으로 알려지고 있다.

본 발명자들은 우리나라의 전통 발효식품인 청국장에서 혈전 분해능이 우수한 균주 및 혈전 분해효소를 발견하고자 하여, 바실러스 메가테리움 제이비-42 (Bacillus megateriumJB-42)[KCTC 10341BP] 균주를 분리하고 이로부터 혈전 분해효소를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 전통 발효식품인 청국장으로부터 혈전용해능이 나토키나제보다 우수하고 온도 및 pH에 안정한 효소를 생성하는 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB-42)[KCTC 10341BP]을 분리하였다. 따라서, 본 발명은 바실러스 메가테리움 제이비-42 균주 및 혈전 분해효소를 제공하는데 있다 . 또한, 본 발명은 발효공정에 일체의 첨가물질을 사용하지 않기 때문에 일반 및 건강식품 등에 넓게 안심하고 사용할 수 있고, 특히 상기 균주 및 효소를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 경구로도 투여할 수 있어 혈전 관련 질환의 치료제 및 건강 보조 식품 등의 원료를 제공하는데 또다른 목적이 있다.

도 1은 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB-42) [KCTC 10341BP]이 생산하는 인공혈전 분해활성을 나타낸 사진이고, 도 2는 본 발명의 신균주에 의해 생산된 혈전 분해효소의 pH에 따른 활성 및 pH 안정성을 나탄낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 신균주에 의해 생산된 혈전 분해효소의 온도에 따른 활성 및 열 안정성을 나탄낸 그래프이다.

본 발명은 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB-42) [KCTC 10341BP] 및 이로부터 생산되는 혈전 분해효소를 제공하는데 그 목적이 있다. 이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 신규한 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB-42) [KCTC 10341BP]에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 신균주가 생산하는 혈전 분해효소에 관한 것을 포함한다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미생물균주의 분리

혈전 분해효소를 분비하는 균주를 분리하기 위하여 국내에서 제조된 청국장을 균원시료로 이용하였다. 시료 0.1 g을 생리식염수(NaCl 0.85%) 9.9 ㎖에 현탁시킨 후 적당히 희석하여 탈지분유를 1.5% 포함하는 영양한천배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, agar 1.7%)에 도말한 다음 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 형성된 투명환이 큰 균주를 선별하였다(제 1도). 1차 선별된 균주를 대상으로 혈전 분해 활성을 측정하여 활성이 가장 높은 제이비(JB)-42 균주를 선별하였다. 균주의 보존은 분리용 고체배지에 게대배양 및 앰플(ampoule)에 동결건조하여4℃에서 보존하였다.

실시예 2: 미생물의 동정

전통 발효식품인 청국장으로부터 혈전분해능이 우수한 미생물을 분리한 것으로서 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)과 의약 박테리아의 동정 매뉴얼(Manual for the Identification of Medical Bacteria)을 참고하여 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 조사한 후 균주 동정을 실시하였고, 균체 지방산 분석은 대수증식기의 습균체 40 ∼ 50 mg에서 지방산을 추출하여 MIS(Microbial Identification System)[휴렛-팩커드 5890A]에 의해 가스액체크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 상기 분리균주는 고체배지에서 원형의 집락(colony)을 형성하며, 집락 색깔은 연노랑색을 띄었다. 본 분리균주는 그람 양성균으로 생육 pH 범위는 5.5 ∼ 10.0이었고, 생육 온도 범위는 20 ∼ 45℃이며, 호기적 조건과 혐기적 조건에서 생육이 가능한 편성 혐기성 세균이며, 운동성과 포자형성능이 있는 간균이다. 카탈라제와 옥시다제는 생성하며, 글루코즈를 이용하여 산을 생성하였다. 젤라틴 액화, 카제인과 우레아제 및 니트레이트(nitrate) 환원능은 양성이고, 전분 가수분해와 인돌생성은 음성이었다. 탄수화물(carbohydrate)로 마니톨과 아라비노즈로부터 호기적 조건에서 산을 생성하였고, 자일로즈로부터는 산을 생성하지 못하였다. 이상의 결과로부터 본 분리균주는 바실러스 메가테리움으로 추정되었지만 더 정확한 균주 동정을 위하여 균체 지방산 조성을 분석한 결과, 주성분은 C 15:0 안테이소와 C 15:0 이소로 확인되어 상기한 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성에 기초하여 본 균주가 바실러스 메가테리움과 가장 유사한 균체 지방산을 나타내므로 본 발명에서 분리된 미생물을 바실러스 메가테리움 제이비-42 (Bacillus megateriumJB-42)라 명명하고 균주기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2002년 9월 23일자로 기탁하였고 수탁번호 10341BP를 부여받았다.

또한, 바실러스 메가테리움 제이비-42의 배양은 LB, NB의 액체 및 고체배지를 이용하였으며, 중온(30 ℃) 과 고온(45 ℃)에서 생육이 왕성하였으며, 군락(colony) 형성능이 우수하였다.

신균주의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성

인 자	특 성
형태학적 특성그람염색모양크기 (㎛)운동성포자형성	+간균0.6 ∼ 0.8 × 1.5 ∼ 3.0++
배양학적 특성호기적 배양혐기적 배양생육온도 30℃45℃65℃생육 pH 5.7생육 7% 염분	++++-++
생리학적 특성카탈라제 생성옥시다제 생성글루코즈로부터 산 생성탄수화물(O/F¹/-)탄수화물로부터 산 생성마니톨아라비노즈자이로즈시트레이트 이용니트레이트 환원젤라틴 액화카제인 가수분해전분 가수분해인돌우레아제브이-피 시험라이소자임지방산 주성분	+++-d²+-++++--++d²15:0 안테이소(49%)15:0 이소(30%)
1: 산화-발효시험, 2: 균주마다 다른반응

실시예 3: 배양 및 조효소의 조제

본 발명의 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42(Bacillus megateriumJB -42)[KCTC 10341BP]를 생산배지(탈지대두분 25g/L, 제이인산칼륨 2.2g/L, 제일인산칼륨 0.3g/L, 효모추출물 5g/L, 염화칼륨 0.5g/L, 황산마그네슘 0.2g/L, 포도당 20g/L)에 종배양액을 접종하여 37℃에서 2일간 발효한 후 원심분리하여 균체를 제거하고, 0.2 마이크로미터(㎕)의 필터를 통과시켰다. 이 배양액을 상기 기술한 활성측정법으로 혈전 분해활성을 측정한 결과 735 FU/ml로서 높은 활성을 나타내었다. 이 배양액을 한외여과 기기(cut-off; 10,000 M.W.)를 사용하여 농축하였다. 이 농축액을 동결시킨 후 진공건조 후 분말로 하여 조효소를 조제하였다.

실시예 4: 효소활성 측정

본 발명의 신균주가 생산하는 혈전 분해효소의 활성은 다음과 같이 측정하였다. 즉, 시험관에 0.05 M 붕산완충용액 1.4 ml과 피브리노겐(Fibrinogen) 용액 0.4 ml을 취하고 37℃의 항온수조에 5분간 가온 한 후 트롬빈(Trombin) 용액 0.1 ml (100 NIH unit)을 첨가고 교반한 다음 그 용액을 37℃의 항온수조에서 정확하게 10분간 정치한 후 시료용액 0.1 ml을 첨가하고 5초간 교반하여 37℃의 항온수조에 정치한다. 시료용액을 첨가하고 20분 후와 40분 후의 각 5초간 교반하고, 60분 후 0.2 M 트리클로로아세트산(TCA) 용액 2 ml을 첨가하고 교반한 다음 37℃의 항온수조에 20분간 방치한다. 그 용액을 15,000 rpm에 5분간 원심분리한 후 상청액 1 ml을 회수하고, 분광광도계(Beckman DU-60)를 이용하여 275 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성은 시료용액을 첨가하기 전 트리클로로아세트산 용액을 먼저 첨가한 대조구와의 흡광도 차이를 측정하여 아래 계산식에 의해 계산하였다.

활성(FU/ml) = (A1-A0)/0.01 × 1/60 × 10 × D

A1:반응구, A0:대조구, D: 시료의 희석배수

상기한 활성측정 방법으로 바실러스 메가테리움 제이비-42(BacillusmegateriumJB-42)[KCTC 10341BP] 균주가 생산하는 혈전 분해효소의 활성을 각각의 pH와 온도에서 측정하여 그 결과를 제 2도와 제 3도에 나타내었다. 본 발명의 혈전 분해효소의 최적 pH는 7.0이었으며, pH 4.0 ∼ 8.0까지 80%이상의 활성이 유지되는 안정성을 나타내었다(제 2도). 또한, 혈전 분해효소의 최적온도는 50℃이고, 열 안정성은 20 ∼ 50℃까지 약 90%정도 유지되었으나 그 이상에서는 급격히 활성저하를 나타내었다(제 3도). 본 발명의 신균주가 생산하는 정제된 혈전 분해효소의 분자량을 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동법(PAGE)으로 측정한 결과 약 31,000 달톤 이었으며, 이는 이미 보고된 다른 혈전 분해효소와는 분자량이 상이함을 알 수 있다.

실시예 5: 혈전 분해효소의 피브린 분해양상

혈전 분해효소는 피브린(fibrin)을 분해하는 양상에 따라 플라스미노겐 활성형(plasminogen activator type)과 직접 활성형(direct activator type)으로 나뉜다. 본 발명의 신균주가 생산하는 혈전 분해효소의 피브린(fibrin)을 분해하는 양상을 검토하기 위하여 플라스미노겐이 첨가된 피브린 고체배지와 플라스미노겐을 제거한 고체배지에서 효소의 활성을 확인한 결과 양쪽 모두에서 활성을 발현하였다. 따라서 본 발명의 혈전 분해효소는 피브린을 직접 분해하는 것으로 판별되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 특히 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42 (Bacillus megateriumJB-42)[KCTC 10341BP] 와 이로부터 생산되는 혈전 분해효소에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 혈전 분해효소의 생산원료는 대두로서 8가지 필수아미노산을 포함한 양질의 단백질을 가지고 있으며, 콜레스테롤을 씻어내는 레시틴이나 혈액의 흐름을 원활하게 하는 리놀산이 함유되어 있어 콜레스테롤을 감소하는 효과가 있다. 또한, 본 효소는 대두를 원료로 하여 발효한 후 농축하여 제조하였으며, 글루타민산, 플락탄 및 프로테아제를 함유하는 천연발효 추출물의 분말 형태로서 부작용은 없고, 장시간(4-8시간) 동안 효과가 지속된다. 본 효소는 발효공정 상에 일체의 첨가물질을 사용하지 않기 때문에 일반 및 건강식품 등에 넓게 안심하고 사용할 수 있고, 특히 상기 균주 및 효소를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 경구로도 투여할 수 있어 혈전에 의한 질환의 치료제 및 건강 보조 식품으로 유용하게 사용 가능하다.

Claims

전통 발효식품인 청국장에서 분리한 신균주 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주.
제 1항에 있어서 혈전 분해활성을 가지는 신균주 바실러스 메가테리움 제이비-42 (Bacillus megaterium JB-42)[KCTC 10341BP].
제 1항의 신균주 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 제이비-42 균주가 생산하는 혈전 분해효소.
제 3항에 있어서, 혈전 분해효소의 분자량이 31,000 달톤, 최적 pH는 7.0, 최적 온도는 50℃인 것을 특징으로 하는 효소.
제 1항과 제 3항의 신균주 또는 혈전 분해효소를 유효성분으로 하는 혈전에 의한 질환 치료제용 조성물 및 건강 보조식품.