KR101101369B1 - 솔잎 발효액에서 분리한 혈전분해 활성을 갖는 아세토박터 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

솔잎 발효액에서 분리한 혈전분해 활성을 갖는 아세토박터 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈전분해 활성을 가지는 아세토박터 속 (Acetobacter sp.) 균주 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈전분해용 미생물 제제에 관한 것이다.

Description

솔잎 발효액에서 분리한 혈전분해 활성을 갖는 아세토박터 속 균주 및 이의 용도{Acetobacter sp. strain having fibrinolytic activity isolated from fermentation broth of pine needles and uses thereof}
본 발명은 솔잎 발효액으로부터 분리한 아세토박터 속 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈전분해 활성을 가지는 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주 (기탁번호: KCTC 11629BP), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈전분해용 미생물 제제에 관한 것이다.
혈전(thrombus)은 혈액응고 과정의 산물로서, 혈소판 플러그(platelet plug)를 형성하는 혈소판의 응집(aggregation) 및 혈액응고인자들의 상호작용을 통해 생성된다. 혈관이 손상을 받아 출혈이 일어나게 되면 체내 혈액응고 시스템이 작동하게 되는데, 이는 활성화된 트롬빈(thrombin)에 의해 피브리노겐(fibrinogen)이 피브린(fibrin)으로 전환됨으로써 유도된다. 이와 같은 혈액응고과정에서 생성된 혈전은 상처 회복 후 플라스민(plasmin)과 같은 혈전분해효소(fibrinolytic enzyme)에 의해 분해되는데, 만약 생성된 혈전이 체내에 과도하게 축적되거나 혈전분해 기작이 원활하게 작동하지 못할 경우 혈전증(thrombosis)이 유발된다. 혈전증은 심혈관계 내에 혈전이 형성된 것으로, 이는 혈류를 감소시키거나 혈류를 막음으로써 조직이나 장기에 치명적인 손상을 줄 수도 있다.
혈전증의 원인은 크게 3가지로 분류할 수 있는데, 혈액의 과응고 (hypercoagulability)와 같은 혈액 구성성분의 이상, 혈관내피세포(endothelial cell injury)의 손상과 같은 혈관벽의 이상 그리고 울혈(congestion) 및 와류(turbulence)와 같은 혈류의 이상이 그것이다. 또한 여러 질환의 임상증상 중 하나인 파종성혈관내응고병증 (disseminated intravascular coagulation, DIC) 또는 자가면역질환인 전신성 홍반성 루프스 (Systemic Lupus Erythematosus, SLE)에 의해서도 혈전증이 유발될 수 있으며, 혈관의 협착(stenosis) 및 폐색(obstruction)에 의해서도 혈전증이 유발될 수 있다.
혈전에 의해 야기될 수 있는 대표적인 질환으로는, 혈전에 의해 뇌경색(cerebral infarction) 또는 뇌출혈(cerebral hemorrhage)이 발생하여 뇌에 혈액공급이 부족하여 생기는 신경증상인 뇌졸중(stroke 또는 cerebrovascular accident: CVA), 심장에 영양소 및 산소를 공급하는 혈관인 관상동맥(coronary artery)에서 혈전에 의해 순환장애가 발생하여 생기는 심근경색(myocardial infarction) 등이 있으며, 이 질환들은 생명에 매우 치명적일 수 있다.
혈전증의 치료를 위해 사용되고 있는 치료제로는 항혈전제로서 유기합성제제인 쿠마린(coumarin) 및 와파린(warfarin) 제제, 거머리의 침샘에서 생성되는 히루딘(hirudin) 제제 그리고 소(bovine)의 폐(lung) 및 돼지(porcine)의 장(intestine)에서 분리한 헤파린(heparin)이 사용되어 왔다. 와파린은 혈액응고작용에 있어서 필수적인 비타민 K의 작용을 억제함으로써 혈전의 형성을 방해하는 약제이며, 히루딘은 혈액응고과정의 트롬빈(thrombin)을 선택적으로 억제하여 항응고 작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 헤파린은 항트롬빈(anti-thrombin)의 활성화(activation)를 통해 트롬빈을 비활성화(inactivation)시켜서 혈액의 응고능력을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
또한, 혈전에 의해 야기될 수 있는 질환들의 예방 및 치료를 위하여 생성된 혈전을 제거하는 혈전분해제에 대한 많은 연구가 수행되어 왔는데, 현재 사용중인 혈전분해제로는 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase) 및 조직 플라스미노겐 활성화제 (tissue-type plasminogen activator: tPA) 등이 있다. 생체 내에는 혈전을 분해하는 플라스민(plasmin)이 존재하는데, 이 플라스민의 전구체는 플라스미노겐(plasminogen)이다. 현재 사용중인 스트렙토키나제, 유로키나제 및 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)는 이러한 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 플라스미노겐 활성화 인자들이다. 하지만 상기 혈전분해제들은 전신출혈(systemic hemorrhage) 및 알러지 반응 등 부작용이 크고, 가격이 매우 높으며, 경구투여가 불가능하고 혈전에 대한 특이성이 없다. 따라서 보다 경제적이고 부작용이 적으며, 경구투여가 가능한 혈전분해제의 개발이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-0737736호에는 혈전분해능이 있는 토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 균주가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0718013호에는 동충하초의 유효성분을 함유하는 혈전분해제가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 솔잎 발효액으로부터 분리한 아세토박터 속 균주가 혈전분해 활성을 가지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 혈전분해 활성을 가지는 아세토박터 속 (Acetobacter sp.) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈전분해용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 균주 및 미생물제제는 혈전분해 활성이 우수하여 혈관 내의 혈전을 제거함으로써 혈관이 정상적인 역할을 하도록 도와주고, 뇌졸중 및 심근경색과 같은 성인병의 예방 및 치료에 유용할 것으로 사료된다.
도 1은 각 솔잎 발효액에서 확인된 미생물의 콜로니 형태를 나타낸다. 미생물 2번은 SFPE2, SFPE4에서 관찰되었다.
도 2는 아세토박터 속 AAB 균주와 아세토박터 속에 포함된 종간의 계통수 결과를 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈전분해 활성을 가지는 아세토박터 속 (Acetobacter sp.) 균주를 제공한다. 상기 아세토박터 속 균주는 바람직하게는 솔잎 발효액에서 분리되는 것을 특징으로 하는 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주 (기탁번호: KCTC 11629BP)를 말한다.
상기 혈전분해 활성이란 혈액응고인자인 피브린을 분해할 수 있는 능력을 가진 것을 말한다. 혈전은 혈소판의 응집 및 혈액응고인자들의 상호작용을 통해 생성되므로, 혈액응고인자 중 하나인 피브린에 대한 분해활성을 조사함으로써 혈전분해 활성을 나타낼 수 있다.
상기 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주는 솔잎 발효액에서 분리한 세균들 중 혈전분해 활성이 있는 균주를 선발한 것이다. 상기 균주를 한국유전자은행에 2010년 2월 2일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11629BP).
또한, 본 발명은 상기 아세토박터 속 균주, 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈전분해용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 아세토박터 속 균주, 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 세균 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 재료 준비
청정지역(해발 350m 이상)에서 자란 건강한 소나무를 선택하여 영양상태가 좋은 가지 부분을 채취한 후 싱싱하고 푸른 잎만 선별하여 사용한다. 솔잎의 불순물이 녹아 나오도록 맑은 물에 담근 후 맑은 물이 나올 때까지 3~4회 세척하고, 다시 숯을 우려낸 물로 1회 세척한다. 솔잎 표면의 수분이 완전히 제거될 때까지 탈수시킨다. 탈수된 솔잎을 녹즙기(인화정밀, 삼광무력공사, 명신상사; 특허: '소화촉진용 솔잎 발효액'에서 사용된 녹즙기와 동일)를 이용하여 분쇄한다. 착즙된 솔잎액을 저온(3 ~ 4℃)에서 3시간 동안 방치하여 피브린층과 상징액이 분리되도록 한다. 분리된 상징액을 수득하여(이하 솔잎 엑기스) 결정이 생기지 않도록 -70℃ 이하의 냉동고에서 저장한다. 솔잎 엑기스를 37℃ 진탕 배양기에서 270rpm으로 6개월 동안 배양하여 발효시켰으며, 이를 솔 골드라 명명하였다.
2. 균 배양 및 배지 조성
솔잎 발효액의 년도 발효액과 발효 전 솔잎 발효액에서 균을 분리하기 위해서 영양 배지(1차 증류수 1L에 펩톤 5g, 소고기 추출물(Beef extract) 5g, 염화나트륨 5g, 한천 15g)와 GPAY 배지(1차 증류수 1L에 글루코스 40g, 펩톤 5g, 효모 추출물 5g, pH 5.0~5.2)에 평판 도말하여 솔잎 발효액에 존재하는 미생물을 조사하였다. 각 솔잎 발효액은 1차 증류수를 이용하여 1/1000 희석하여 영양 배지와 GPAY 배지는 37℃와 28℃에서 48시간 배양하였다. 두 배지에서 성장한 균을 다시 각 액체배지에서 28℃와 37℃에서 24시간 배양하여 피브린 플레이트(fibrin plate)에 접적하여 혈전분해능을 조사하였다.
3. 솔잎 발효액의 발효
솔잎 발효액의 발효조건은 암 상태에서 25℃로 발효시켰으며, 모든 발효액의 pH는 3~4를 유지하도록 하였다. 샘플의 오염을 막기 위해서 pH 측정은 머크(Merck) 사의 color pHast Indicator Strips pH 0-14를 이용하였다. pH 측정은 각 샘플이 들어있는 유리병을 후드에 옮긴 후 1일 정도 후드에서 다시 보관하였고 1일 후 각 샘플 1 mL을 취하여 pH를 측정하였다.
4. 피브린 플레이트의 제조 및 피브린 플레이트 분석
피브린 아가로스 플레이트 (Fibrin agarose plate)는 두께가 1 mm가 되도록 만들었다. 조성은 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충액을 1% 아가로스로 15mL이 되도록 만들고, 20 mM tris-HCl 완충액에 30 mg/mL 이 되도록 인간 피브리노겐 용액 (human fibrinogen solution)을 3mL 만들었다. 20mM Tris-HCl 완충액에 인간 트롬빈 (human thrombin)이 100 unit/mL이 되도록 18μL를 만들고, 상온에서 1시간 동안 두고 아가로스를 굳혔다. 피브린 플레이트에 5mm 직경의 구멍을 만들기 위해 유리관(glass tube)을 이용하여 조심스럽게 구멍을 만들고, 샘플 20μL를 접적한다. 37℃ 인큐베이터에서 3~5시간 동안 관찰하였다. 샘플에서 혈전이 분해되어 나타내는 투명환의 직경을 측정한다. 스트렙토키나제 (Streptokinase, 100 unit/mL, Sigma)는 대조군으로 샘플과 동일한 양 (20μL)을 접적한다.
5. 중합효소 연쇄 반응( PCR )을 이용한 16s rRNA 증폭
16s rRNA 유전자를 증폭하기 위해 분자분류에 사용한 프라이머는 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2)와 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3) (Lane, 1991, 16S/23S rRNA sequencing, In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115∼176. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley)을 사용하였다. 중합효소 연쇄 반응 수행시 어닐링(annealing) 온도는 60℃를 사용하였다.
6. 16s rRNA 시퀀싱 및 분석
이 프라이머 세트를 이용하여 세균의 16S rRNA 유전자를 중합효소 연쇄 반응 (MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)으로 증폭한 후, 중합효소 연쇄 반응의 산물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen, Hiden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 정제한 중합효소 연쇄 반응 산물의 염기서열 분석은 ABI 310 DNA 시퀀서 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석된 세균의 염기서열은 NCBI (National Center Biotechnology Information)에서 블라스트 (BLAST, Basic Local Alignmnet Search Tool) 검색을 통해 유전자은행에 등록된 균주의 서열과 비교하였으며, 염기서열 비교결과 가장 높은 유사도를 나타내는 표준 균주를 기준으로 균주를 동정하였다.
실시예 1: GPAY 와 영양 배지를 이용하여 솔잎 발효액에서 분리한 균주
각각의 솔잎 발효액에서 미생물을 확인하기 위해, 솔잎발효액을 GPAY와 영양 배지에서 배양하여 관찰하였다. 먼저, 발효 단계별 솔잎발효액에서 미생물 관찰 결과 총 8가지의 미생물이 관찰되었다. 우선 분리된 미생물의 속을 확인하기 전에 임의의 번호를 부여하였다. SFPE1에서는 3가지 미생물 (4, 6 및 7번)이 , SFPE2에서는 2가지 미생물 (2 및 8번), SFPE3에서는 2가지 미생물 (5 및 8번)이, SFPE4에서는 3가지 미생물 (2, 4 및 5번), SFPE6에서는 1가지 미생물 (1번)이 각각 분리되었다(표 1). 확인된 미생물은 총 8가지였다(도 1).
각 솔잎발효액에서 분리된 미생물
솔잎발효액 SFPE1 SFPE2 SFPE3 SFPE4 SFPE6
분리된 미생물 4, 6, 7 2, 8 5, 8 2, 4, 5 1
실시예 2: 분리된 균에서 혈전분해능의 분석
각 솔잎 발효액에서 관찰된 미생물들의 혈전분해능을 확인하기 위해서 8가지 미생물을 피브린 플레이트에 접적하여 혈전분해를 확인하였다. 혈전분해 활성 확인 결과 미생물 2번이 가장 강한 활성을 나타냈다. 다음으로 미생물 1번이 강한 활성을 나타냈고, 나머지 미생물들은 비슷한 활성을 나타냈다(표 2).
8가지 미생물의 혈전분해 테스트
미생물 번호 미생물을 분리한 솔잎 발효액 혈전분해 활성 (mm)
1 SFPE6 13
2 SFPE2, SFPE4 18
3 PE 11
4 PE, SFPE1, SFPE4 8
5 PE, SFPE3, SFPE4 10
6 PE, SFPE1 12.5
7 PE, SFPE1 10
8 SFPE2, SFPE 3 10.5
실시예 3: 8가지 미생물의 16s rRNA 분석
8가지 미생물의 균주(strain)를 확인하기 위해, 16s rRNA 시퀀싱을 하였다. 각 미생물의 16s rRNA 시퀀싱 결과를 가지고 블라스트 분석을 실시하여 미생물을 확인하였다. 이 중 혈전분해가 가장 좋은 미생물 2번은 AAB 균주에 속하는 것으로 확인되었으며, 16s rRNA 전체 염기서열 분석 결과 1,362bp 길이의 염기서열을 확인하였다(서열번호 1). 세균 AAB 균주와 아세토박터 (Acetobacter) 속에 포함된 종간의 16S rRNA 염기서열 비교 결과 아세토박터 속의 균주들과 유전적으로 가까운 것으로 나타났으며, 유사도는 대략 96~100% 수준으로 나타났다. 또한 세균 AAB는 아세토박터 속 중 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis ) 종과 16S rRNA 유전자의 염기서열이 가장 유사한 것으로 나타났으며, 아세토박터 트로피칼리스 종의 표준균주인 NRIC 0312T 균주의 염기서열과 비교할 시, 조사된 16S rRNA 유전자 서열 1,358 bp의 염기서열 중 1개의 치환이 관찰되어 두 균주 사이의 유사도는 99.926%로 나타났다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 작성한 세균 AAB 균주의 계통수는 도 2에 나타내었으며, 계통수 작성 결과 세균 AAB 균주는 아세토박터 트로피칼리스 표준 균주와 하나의 그룹을 형성해 염기서열 유사도 결과와 동일한 결과를 나타내었다. 세균 AAB 균주의 염기서열을 아세토박터 속에 포함된 각종의 표준균주들과 비교한 결과는 표 3에 정리하였고 각 표준 균주와 염기서열 유사도는 96-99% 수준으로 나타났다.
따라서, 상기 세균 AAB 균주를 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9이라 명명하고, 상기 균주를 한국유전자은행에 2010년 2월 2일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11629BP).
세균 AAB 균주와 아세토박터 속에 포함된 종간의 16S rRNA 염기서열 비교 결과
순위 균주명 균주 등록번호 염기서열
유사도
1 아세토박터 트로피칼리스
(Acetobacter tropicalis)		 NRIC 0312(T) AB032354 99.926
2 아세토박터 세네갈렌시스
(Acetobacter senegalensis)		 CWBI-B418(T) AY883036 99.544
3 아세토박터 세레비지애
(Acetobacter cerevisiae)		 LMG 1625(T) AJ419843 98.899
4 아세토박터 말로룸
(Acetobacter malorum)		 LMG 1746(T) AJ419844 98.752
5 아세토박터 인도네시엔시스
(Acetobacter indonesiensis)		 NRIC 0313(T) AB032356 98.744
6 아세토박터 오리엔탈리스
(Acetobacter orientalis)		 21F-2(T) AB052706 98.744
7 아세토박터 올레아넨시스
(Acetobacter orleanensis)		 LMG 1583(T) AJ419845 98.678
8 아세토박터 시비논겐시스
(Acetobacter cibinongensis)		 4H-1(T) AB052710 98.532
9 아세토박터 오에니
(Acetobacter oeni)		 B13(T) AY829472 98.081
10 아세토박터 아세티
(Acetobacter aceti)		 NCIMB 8621(T) X74066 98.015
11 아세토박터 에스투넨시스
(Acetobacter estunensis)		 LMG 1626(T) AJ419838 97.794
12 아세토박터 가넨시스
(Acetobacter ghanensis)		 430A(T) EF030713 97.724
13 아세토박터 시지기
(Acetobacter syzygii)		 9H-2(T) AB052712 97.577
14 아세토박터 로바니엔시스
(Acetobacter lovaniensis)		 LMG 1617(T) AJ419837 97.504
15 아세토박터 파바룸
(Acetobacter fabarum)		 985(T) AM905849 97.504
16 아세토박터 니트로제니피젠스
(Acetobacter nitrogenifigens)		 RG1(T) AY669513 97.335
17 아세토박터 페록시단스
(Acetobacter peroxydans)		 IFO 13755(T) AB032352 97.079
18 아세토박터 포모룸
(Acetobacter pomorum)		 LHT2458(T) AJ001632 96.838
19 아세토박터 파스튜리아누스
(Acetobacter pasteurianus)		 LMG 1262(T) X71863 96.394
한국생명공학연구원 KCTC11629 20100202
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 혈전분해 활성을 가지는 아세토박터 트로피칼리스 (Acetobacter tropicalis) F9 균주 (기탁번호: KCTC 11629BP).
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 혈전분해용 미생물 제제.
KR1020100021614A 2010-03-11 2010-03-11 솔잎 발효액에서 분리한 혈전분해 활성을 갖는 아세토박터 속 균주 및 이의 용도 KR101101369B1 (ko)

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