KR20020073185A - 인간 단일클론 항체를 제조하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 단일클론 항체, 특히 특정 세포 유형에 대표적인 표면항원에 특이적인 것을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 단일클론 항체의 집단, 관심의 세포 유형에 대표적인 항원에 결합하는 능력이 있는 면역글로불린 또는 그것의 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 집단 역시 포함한다.

Description

인간 단일클론 항체를 제조하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES}
Kohler와 Milstein에 의한, 사전결정된 항원에 대한 특이적인 단일클론 항체 분비능이 있는 마우스 하이브리도마의 발견은 임상 면역학의 분야에 새로운 장을 열었다. 이같은 하이브리도마 세포주의 클론 선택성 및 불사성은 단일클론성, 단일특이성 및 그것의 항체의 영구적 이용가능성을 보장한다. 그러나, 종종 바람직하지 않은 면역 반응을 유발하는 내재적 면역원성 때문에 마우스 항체는 인간을 위한 임상적 적용에 있어 치명적인 한계를 가진다. 예를 들어, 면역적격성 인간 환자에 마우스 단일클론 항체를 치료학적 유효량 투여하면, 환자는 마우스 면역글로불린 분자에 대한 항체를 생산하고; 이들 인간 항-마우스 항체는 치료학적 항체를 중화시키고 급성 독성을 유발할 수 있다. 따라서, 이같은 단점이 없는 항체를 제조하는 것이 바람직하다.
인간 단일클론 항체의 제조는 몇가지 이유 때문에 현실적으로 난점이 있었다. 첫째, 관심의 면역원으로 인간을 면역화하는 것이 현실적이지 못하다. 제조된 인간 항체는 사용가능한 비장의 우발적인 존재에 기초하고 있을 따름이다. 소망의 항원-결합 특이성을 가지는 인간 단일클론 항체를 제조하는 네가지 대안적 방법이 개발되었으나, 그것들 역시 두드러진 단점들을 가진다. 제 1의 접근은 재조합 DNA 기술을 사용하여 키메라 항체를 제조하는 것과 관련된다. 그 같은 항체는 인간 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 불변부를, 항원-결합 특이성이 확인된 비-인간 항원의 가변부와 융합함으로써 제조한다. 결과의, 부분적으로 이종인 키메라 항체는 완전히 이종인 항체를 사용하는 것보다는 실질적으로 더 유용하지만, 여전히 다수의 단점을 가진다. 가변부와 불변부의 동정, 분리 및 연결은 상당량의 작업을 요구한다. 또한, 한가지 종으로부터의 불변부와 다른 종으로부터의 가변부를 연결하는 것은 가변부의 특이성과 친화성을 변화시켜 가변부의 바람직한 성질을 잃을 수 있다. 게다가, 가변부에는 종에 대하여 특이적인 골격과 고도가변부 서열이 존재한다. 이들 골격과 고도가변부는 바람직하지 않은 항원반을을 결과할 수 있다. 이 접근의 한 변형은 비-인간 항체의 항원-결합 도메인 외부 잔기를 대응하는 인간 서열로 교체하는 것이다(WO 94/11509). 이 같은 방법 역시 노동집약적이다.
인간 단일클론 항체의 제조를 위한 두번째 접근은 U. S. 특허번호 5,814,318과 U. S.특허번호 5,939,598에 기재된 것과 같은 이종 마우스의 사용이다. 이들 유전적으로 조작된 마우스는 자신의 내인성 면역글로불린 유전자가 불활성화되고 특정 미-재배열 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 발현하는 능력을 가진다."이종 마우스"는 인간 항체를 제조하는 대안적 시스템을 제공하지만, 그것은 반드시 인간 면역 반응을 완전히 모방하지는 못한다: 첫째, 면역글로불린 전체 레퍼토리는 마우스에서 복제되지 않았다; 둘째, 내인성 면역글로불린 유전자의 불완전한 불활성화는 키메라 항체를 결과할 수 있다; 셋째, 바람직한 단일클론 항체의 동정은 일반적으로 전통적 하이브리도마 기술이 관련되는데 이는 소망의 항체를 동정하기 위하여 다수의 하이브리도마의 광범위한 스크리닝과 서브클로닝을 요한다.
인간 단일클론 항체를 제조하는 세번째 접근은 파지 디스플레이 라이브러리 제조이다. 이 방법은 인간 말초혈 세포의 레퍼토리로부터의 mRNA를 추출한 다음, 바람직하게는 모든 면역글로불린의 가변부의 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 제조하는 것으로 시작된다. 그 다음, cDNA를 면역글로불린 가변부를 Fab 단편으로서 디스플레이할 파지 내로 삽입시킨다. 이론적으로, 파지 라이브러리가 충분히 크다면, 관심의 항원에 대하여 파지를 검색함으로써 소망의 Fab 단편을 디스플레이하는 특정 파지를 분리하는 것이 가능하다. 그러나, 이 방법은 일반적으로 실직적으로 정제된 항원에 대하여만 적용가능하고 세포 상에서 발현되는 수천가지 표면항원 같은 항원의 혼합체에는 적용가능하지 않다.
마지막으로, 면역화 인간 B 세포를 단일클론 항체 제조에 채용하였다. 이 접근은: (a) B 세포에 집적된 말초혈 림프구의 분리; (b) B 세포를 EBV-바이러스로 형질전환시키거나 불사화 인간 림프블라스토이드 세포와 융합한 다음 바람직한 항원-결합 특이성을 나타내는 B 세포 형질전환체나 하이브리도마에 대한 광범위한 스크리닝 단계와 관련된다. B 세포 형질전환 자체는 최대한으로 0.1% 내지 10% 안정한 형질전환체를 생산하는 비효율적 방법이고, 따라서 바람직한 특이성의 대부분의 B 세포는 후속의 선택 과정에서 사용되기 위한 수집물에서 상실된다. 실험자들(예를 들어 Abe, Tsutomu et al. EP 0218158에서)은 관심의 항원에 대한 시험관내 면역화/활성화에 의하여 바람직한 면역글로불린을 발현시키는 B 세포 집단을 집적하려고 시도하였지만, 이 과정에서 비-특이적 B 세포 또한 증식하였다는 측면에서 활성화는 역시 비효율적이었다. 따라서, 특이적 B 세포의 동정은, 수만개의 형질전환된 B 세포를 항원을 결합시키는 능력에 대하여 시험하는, 스크리닝의 최종 단계에 크게 의존한다. 상기 언급된 방법과 같이 이 접근도 시간이 많이 걸리고, 노동 집약적이며, 고-효율 항체 스크리닝 및 제조에 쉽지 않다.
따라서, 인간 단일클론 항체를 제조하는 대안적 경로의 상당한 필요성이 있다.
발명의 개요
본 발명의 주요한 양태는 인간 단일클론 항체 제작에 사용할 수 있는 효율적 스크리닝 기술의 고안이다. 이 기술은 최소한의 노동력으로 특이적 항체의 생산을 허용한다. 그것은 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 면역반응성인 인간 단일클론 항체의 대규모 생산에 특히 유용하다. 하이브리도마 및/또는 불사화 B 세포의 제조가 관련된, 상기-언급된 접근과는 달리, 본 발명의 방법은 비-형질전환 B 세포를 채용하고, 항체 생산 및/또는 항체를 코딩하는 유전자의 분리에 대하여 요구되는 항원-결합 특이성을 가지는, 확장된 비-형질전환 B 세포를 생산한다.
구체적으로, 본 발명은 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하며, 그 방법은: (a) 다수의 비-형질전환 인간 B 림프구를 포함하는 인간 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계; (b) 소망의 항원에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 인간 B 림프구를 선택하는 단계; (c) 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 인간 단일클론 항체를 생산하는, 다수의 분리된 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하기 위하여 B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양하는 단계; 및 (d) 선택적으로, 비-형질전환 B 세포 클론을 분리하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 비-형질전환 B 세포를 선택하는 단계는 B 림프구의 소망의 항원에의 특이적 결합에 적당한 조건하에서 인간 림프구 집단을 소망의 항원과 접촉시키는 단계 및 미결합 B 림프구를 소망의 항원에 결합한 B 림프구와 분리시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 상기 약술한 방법은: (e) (d)의 분리된 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체의 중쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계; (f) (d)의 분리된 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체의 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계; 및 (g) (e)와 (f)의 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 인간 단일클론 항체 또는 그것의 항원결합 단편을 수확하는 단계를 더 포함한다.
중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분리는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분리 이전, 직후 또는 동시에 수행될 수 있다.
별개의 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 항원 결합 단편은 이(二)특이적 항체, 키메라 항체, Fab, F(ab')2, 단일사슬 V 부분 단편(scFv) 및 융합 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는데, 융합 폴리펩티드는 화학적 기능 부분에 융합된, 항원 결합 단편을 포함한다. 이 구체예에서, 용어 "부분"은 신호 펩티드, 면역적 반응성 증강제, 고형 지지체에 대한 커플링 촉진제, 백신 담체, 생체반응 변형제, 독소, 검출성 표지, 및 약물을 포괄한다.
또 다른 별개의 양태에서, 항체 제조 방법에서 채용된 항원은 생물학적 또는 화학적 화합물이다. 항원은 리셉터 리간드, 분비된 단백질, 세포 표면 리셉터, 세포질성 단백질, 및 핵 단백질 같은 세포성 단백질이다. 바람직한 구체예에서, 항원은 온전한 세포에 의하여 제시되는 표면 항원이다. 온전한 세포가 항원 제시 용도로 채용될 경우, 세포는 바람직하게는 그 표면에 혈청이 없는 상태의 진핵세포이다.
이와는 또 다른 양태에서, 면역글로불린 또는 그것의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 송달 운반체에 의하여 숙주 세포에서 발현된다. 적당한 유전자 송달 운반체는 바이러스 벡터, 리포솜, 및 플라스미드를 포함한다. 숙주세포는 바람직하게는 면역글로불린 또는 그것의 단편의 번역-후 변형을 할 수 있는 진핵 세포이다.
본 발명은 또한 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은: (a) 다수의 비-형질전환 인간 B 림프구를 포함하는 인간 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계;(b) 특정 유형의 세포에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 인간 B 림프구를 선택하는 단계; (c) B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양시켜 다수의 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하고, 그것에 의하여 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 인간 단일클론 항체의 집단을 제조하는 단계와 관련된다.
이 구체예의 한 양태에서, 이 방법은: (d) 다수의 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체 집단의 중쇄 또는 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 집단을 분리하는 단계; 및 (e) 그 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 인간 단일클론 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 집단을 수확하는 단계를 더 포함한다.
폴리뉴클레오티드의 분리된 집단과 그것에 의하여 코딩되는 폴리펩티드가 더 제공된다. 바람직한 구체예에서, 집단의 적어도 한 폴리펩티드는 화학적 기능 부분과 융합된다. 바람직한 부분은 신호 펩티드, 면역적 반응성 증강제, 고형 지지체에의 커플링 촉진제, 백신 담체, 생체반응 변형제, 독소, 검출성 표지, 및 약물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
여기에 개시된 어떤 발명 방법에 의하여 제조된, 인간 단일클론 항체의 집단을 본 발명에서 구체화한다.
본 발명은 면역학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 단일클론 항체, 특히 특정 세포 유형에 대표적인 표면항원에 특이적인 것을 제조하는 것에 관련된다. 본 발명에서 구체화된 조성물과 방법은 주요한 진단적 및/또는 치료학적인 잠재성이 있는 인간 단일클론 항체를 제조하는데 특히 유용하다.
도 1. A: 림프구에 결합하기 전의 인간 태아 난소 상피세포 단일층의 마이크로사진. B: (화살표로 지시된) 인간 태아 난소 상피세포 단일층에 결합된 림프구의마이크로 사진. C: 인간 태아 난소 상피세포에 결합된 B 세포의 마이크로사진이며, 화살표는 항-카파 경쇄 면역조직화학에 의하여 염색된 B 세포를 가리킨다. D: 6일간 배양 후의, 항-카파 경쇄 염색된 B 세포 콜로니의 컬러 마이크로 사진. E: 확장된 B 세포 콜로니로부터 증폭된 경쇄 cDNA 단편을 나타내는 PCR 산물(화살표로 지시됨)의 한천 겔 분석. 레인 1 내지 9는 9 가지의 상이한 콜로니를 나타낸다.
도 2. A: 인간 태아 난소 상피세포주에 대하여 선택된 B 세포로부터 확장된 B 세포 콜로니의 마이크로사진. B 세포는 (화살표로 지시된) 항-카파 경쇄 항체로 염색되었다. B 세포가 여전히 표적 세포에 결합되었음(화살표로 지시됨)에 주목할 것. B: 시험관내 확장된 특정 B 세포 콜로니로부터 증폭된 cDNA 삽입체를 함유하는 pTargeT 플라스미드로 트렌스펙션된 후 카파 경쇄를 발현하는 COS 세포의 항-카파 경쇄 면역세포화학 검출의 마이크로사진.
도 3: 인간 단일클론 항체를 제조하는 바람직한 발명 과정을 도시하는 흐름도.
도 4: 인간 면역글로불린에 대한 면역조직화학의 마이크로사진. A. 비-형질전환 대조표준 CHO 세포와 함께 배양되고, 인간 면역글로불린에 대하여 면역조직화학에 의하여 염색된 HPED 세포. 배양에서 염색이 없는 점에 주목할 것. B. 면역글로불린 중쇄 cDNA 삽입체를 함유하는 pDisplay 플라스미드와 B-세포 클론으로부터 증폭되고, 면역글로불린에 대하여 염색된 면역글로불린 경쇄 cDNA 삽입체를 함유하는 pTargeT 플라스미드로 공동-트랜스펙션된 CHO 세포를 흡수한 HPED 세포. hPED 단일층에 결합된 CHO 세포는 면역글로불린에 대하여 강한 염색을 나타낸 것에 주목할 것. 화살표에 의하여 지시된 예. C. 패널 B에서와 같이 트렌스펙션되고, hPED 단일층에 결합된 CHO 세포를 인간 면역글로불린에 대한 면역조직화학 전에 0.1 % 트리톤에 의하여 용균시켜 오직 CHO 세포상에서 발현되고 hPED 세포에 결합된 인간 항체민 hPED 세포 상에 남도록하여 면역조직화학에 의하여 염색한다. 화살표는 예를 가리킨다.
본 발명을 수행하는 방식
이 개시를 통하여, 다양한 간행물, 특허 및 발행된 특허 명세서가 인용문헌을 밝힘에 의하여 참조된다. 이들 간행물, 특허 및 발행된 특허 명세서의 개시는 본 발명이 속하는 업계의 상태를 더 완전히 기술하기 위하여 본 개시에 참고문헌으로써 여기에 수록된다.
정의:
본 발명의 실행은 다르게 지시하지 않는 한 당업계 기술에 속하는 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 전통적 기술을 채용한다. 예를 들어, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제 2판 (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); 시리즈물인 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 및 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)) 참조.
명세서와 청구범위에서 사용될 때, 단수형인 "하나의" "그"는 문맥상 명백하게 다르게 제한하지 않으면 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 그것들의 혼합물을 포함하는 복수개의 세포들을 포함한다.
용어 "항체"는 여기에서 사용될 때, 면역글로불린 분자와 면역글로불린 분자의 항원-결합 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는 ("항원에 면역반응성인") 항원결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 구조적으로, 가장 간단한 천연적으로 존재하는 항체(예를 들어, IgG)는 이황화결합에 의하여 상호-연결된 두개의 중(H)쇄와 두개의 경(L)쇄인 네개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 천연 면역글로불린은 IgD, IgG, IgA, IgM 및 IgE 같은 몇몇 유형의 분자를 포함하는 분자의 큰 규모의 패밀리를 가진다. 이 용어는 또한 Fab 단편, 및 Fv 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 혼성체 항체 또는 변형된 항체, 및 그것의 단편을 포괄한다. 항체의 항원-결합 기능은 천연-발생 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있다. 이들 단편은 또한 "항원-결합 단편"으로 명명된다. 용어 "항원-결합 단편"에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iii) VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (v) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vi) 경첩 영역에서 이황화 다리에 의하여 결합된 두개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 게다가, Fv 단편의 두개의 도메인은 일반적으로 분리된 유전자에 의하여 코딩되지만, 그것들을 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; Bird et al. (1988)Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) PNAS 85 : 5879-5883) 단일 단백질 사슬로서 제작되도록 재조합 방법에 의하여 합성 링커를 제작할 수 있다. 이같은 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다. 바람직한 항체 단편은 그것의 표적 항원, 예를 들어 F(ab')2단편 같은 이가 단편을 가교시킬 수 있는 것이다. 대안으로, 그 자체는 그것의 표적 항원을 가교시키지 않는 항체 단편(예를 들어, Fab)이, 항체 단편을 가교시켜 그것에 의하여 표적 항원을 가교시키는 역할을 하는 2차 항체와 융합되어 사용될 수 있다.
항체는 여기에 기재된 바와 같은 전통적 기술을 사용하여 단편화될 수 있고 단편은 전체 항체에 대하여 기술된 바와 같은 방식에서의 유용성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 면역글로불린 분자의 Fab 단편은 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄가 함께 공유결합되어 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역학적으로 활성인 부분을 함유하는 면역글로불린 분자의 부분으로 구성되는 다중체 단백질이다. Fab 단편은 당업계 주지의 방법을 사용하여 실질적으로 온전한 면역글로불린 분자의 파파인으로의 단백질 분해에 의하여 제작될 수 있다. 그러나, Fab 단편은 여기에 개시된 또는 당업계에서 알려진 어떤 다른 방법을 사용하여 소망의 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄의 소망의 부분을 적당한 숙주 세포에서 발현시킴으로써 또한 제조된다.
면역글로불린 분자의 Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 가변부와 면역글로불린 경쇄 가변부가 함께 공유결합되어 항원과 특이적으로 결합할 수 있는, 면역학적으로 활성인 부분으로 구성되는 다중체 단백질이다. Fv 단편은 여기에 기재된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 사용하여 면역글로불린 중쇄 가변부와 면역글로불린 경쇄 가변부의 소망의 부분을 적당한 숙주세포내에서 발현시킴에 의하여 전형적으로 제조된다.
본 발명의 항체는 소망의 결합 부분을 가지는, 이(二)특이성 및 키메라 분자를 포함하도록 더 의도된다. 용어 "항체"는 척추 동물 항체, 혼성 항체 또는 키메라 항체를 또한 포괄한다.
용어 "단일클론 항체"는 여기에서 사용될 때, 실질적으로 균일한 항체 집단을 가지는 항체 조성물을 지칭한다. 항원의 기원이나 그것이 제작되는 방식에 관하여는 한정하려고 의도되지 않는다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위로 방향짓도록 고도로 특이적이다. 상이한 결정인자(에피토프)에 대하여 방향짓는, 상이한 항체를 전형적으로 함유하는 전통적(폴리클론) 항체 제조와는 반대로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대하여 방향짓는다.
용어 "인간"은 단일클론 항체나 그것의 항원-결합 단편에 적용될 때, 여기에서 논의되는 바와 같이 인간 B-세포로부터 분리되거나 단일클론 항체나 그것의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 재조합적으로 제조되는 항체 조성물을 지칭한다.
"단일클론 항체의 집단"은 다수의 이종의 단일클론 항체, 즉 서로 구별되는 항원 결정인자를 인식할 수 있는 집단을 포함하는 개별 단일클론 항체를 지칭한다.
항체가 폴리펩티드나 다른 물질을 포함하는 같은 다른 대조 표준 항원에 비하여 훨씬 큰 친화도 또는 친밀도로 결합한다면 그 항체는 항원에 "특이적으로 결합"한다.
"항원"은 여기에서 사용될 때 항체에 의하여 특이적으로 인지되고 결합하는 물질을 의미한다. 항체는 펩티드, 단백질, 당단백질, 다당류 및 지질; 그것의 부분 및 그것의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "면역원"은 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 이것은 적당한 숙주내로 주사될 경우 B 세포에 의한 항원-특이적 항체의 생산을 촉진시킬 수 있거나 또는 B 세포의 시험관내 면역화에 사용되는 항원이다. 화합물은 담체와 가교 또는 융합하고, 면역 반응을 능가시키기 위하여 분열촉진인자와 혼합하고, 제시를 증강시키기 위하여 아주반트와 혼합하는 것을 포함하는, 당업계 알려진 많은 기술에 의하여 면역유발성이 부여될 수 있다.
용어 "이종"은 B 세포 시험관내 면역화 용도로 세포에 적용될 때 세포가 수용체 B 세포와 유전적으로 구별되는 개체로부터 유래함을 의미한다. 예를 들어, 이종 세포는 수용체 세포와 상이한 종 또는 동일한 종으로부터의 상이한 개체로부터 유래한다. 한 종의 개체로부터의 배(胚)아 세포는 동일한 종의 성체와 이종이다. 마찬가지로, 이종 폴리뉴클레오티드 또는 항원은 수용체 B 세포에 없는, 또는 수용체내에서 발현되는 대응물과 구조적으로 구별되는 분자이다.
세포가 각각 세가지 배엽층 - 배(胚)의 외배엽, 내배엽 또는 중배엽-중 하나로부터 유래하였다면 세포는 "외배엽성", "내배엽성", 또는 "중배엽성"이다. 외배엽은 표피 및 신경계의 세포를 만드는 외층이다. 내배엽은 췌장과 간을 포함하지만이에 한정되지 않는 소화관 및 그것의 관련 기관의 안쪽을 만드는 내층이다. 중간층인 중배엽은 (심장, 신장, 생식선을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 몇몇 기관, 연결조직 (예를 들어 근육, 힘줄), 및 혈 세포가 된다.
"림프구"는 여기에서 사용될 때, 비-자기 또는 자기 항원을 특이적으로 인식하고 이에 반응하며 특이적 면역성의 발생에 책임이 있는 세포이다. "림프구"는 다양한 유형의 B 림프구 및 T 림프구를 포함한다.
용어 "배지" "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 호환적으로 사용된다. 이 용어는 진핵 또는 원핵 세포가 배양물 내에서 성장하는 수성 환경을 지칭한다. 배지는 생리학적, 영양학적, 및 호르몬적 환경을 포함한다. 배지가 어떤 포유동물 기원으로부터의 혈청(예를 들어, 우태아, 말, 인간, 래빗으로부터의 혈청)도 본질적으로 없다면, 세포 배양 배지는 "무-혈청"이다. "본질적으로 없는"은 세포 배양 배지가 약 0-5 % 혈청, 바람직하게는 0-1 % 및 가장 바람직하게는 0-0.1 % 혈청을 포함한다는 것을 의미한다.
"특정 배지"는 배지의 성분을 알 수 있도록 세포의 생존 및/또는 성장에 필수적인 영양분과 호르몬 요구량을 포함하는 배지를 지칭한다. 전통적으로, 특정 배지는 성장 및/또는 생존에 필수적인 영양 및 성장 인자의 첨가에 의하여 조제되었다. 전형적으로, 특정배지는 하나 이상의 다음 카테고리: a) 모든 필수 아미노산과 보통 기본 20 아미노산 세트 + 시스테인; b) 보통 포도당 같은 탄수화물의 형태로서의 에너지원 c) 낮은 농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물 d) 자유 지방산; 및 e) 전형적으로 보통 마이크로몰 범위인 매우 낮은 농도로 요구되는 무기 화합물 또는 천연적으로 존재하는 원소로 정의되는 미량원소로부터의 적어도 한가지 성분을 제공한다. 특정 배지는 또한 대안으로 다음: a) 하나 이상의 분열촉진제; b) 염과 완충액, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염; c) 뉴클레오시드와 염기, 예를 들어, 아데노신과 티미딘, 하이포잔틴; 및 d) 단백질과 조직 가수분해물로부터의 하나 이상의 성분이 첨가된다.
"분열촉진제" 또는 "성장인자"는 포유동물 세포의 세포분열을 촉진하는 분자이다. 일반적으로, 분열촉진제 또는 성장인자는 세포 배양물에서 포유동물 세포의 생존과 증색을 증강시키고 폴리펩티드이다. 분열촉진 폴리펩티드는 생산 방법에 상관없이 (예를 들어, 그것은 분자의 내인적 기원으로부터 분리될 수도 있고 재조합 기술을 포함하는 합성 기술에 의하여 생산될 수도 있다), "천연적" 또는 "천연 서열" (즉, 천연적으로 발생하는 성장인자의 아미노산 서열을 가지는) 폴리펩티드 또는 그것의 변이체나 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 분열촉진 폴리펩티드는 인간 유래 성장인자 또는 그것의 단편과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 제한되지 않는 예는 erbB 리셉터 부류의 하나 이상의 구성원의 활성화제; 배양 배지내의 cAMP 수준을 높이는 작용제 (예를 들어, 폴스콜린, 콜레라 독소, cAMP 또는 그것의 유사체); 신경세포 점착 분자 (N-CAM), 라미닌 또는 피브로넥틴 같은 점착 세포; 프로게스테론; 뼈-유래 향신경성 인자(BDNF)와 섬모성 향신경성 인자 (CNTF) 같은 향신경성 인자; 뉴트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6); 또는 NGF-β 같은 신경성장인자; 혈소판-유래 성장인자 (PDGF); 산성 FGF (aFGF) 및 염기성 FGF (bFGF) 같은 섬유아세포 성장인자; 혈관표피 성장인자 (VEGF); TGF-α,및TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β 같은 형질전환 성장인자 (TGF); IGF-I, IGF-II 및 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-1)을 포함하는 인슐린-유사 성장인자; 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질; 및 에스트로겐, 테스토스테론, 갑상선 호르몬, 인슐린 및 Mather, J. P. 및 Roberts, P. E. (1998) "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York의 제 138-139면 표 8.2에서 열거된 것과 같은 분열촉진제 중의 임의의 것과 같은 호르몬을 포함한다.
"사이토카인"은 여기에서 사용될 때, (그중 가장 잘 알려진 것은 포유동물 체세포의 조절에 관여하는)어떤 종류의 세포간 신호 분자를 지칭한다. 성장촉진 및 성장저해 효과를 가지는 두가지 모두의 사이토카인의 다수의 패밀리가 예를 들어: (IL-lα, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 (P40), IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 및 IL-15 같은) 인터루킨; GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LIF, EPO, TPO ("트롬보포이에틴"), TNF-α, 및 TNF-β같은 CSF-유형 사이토카인; (IFN-α, IFN-β IFN-γ 같은) 인터페론; (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 인히빈 A, 인히빈 B, 액티빈 A, 액티빈 B 같은) TGF-β 패밀리의 사이토카인; (EGF, VEGF, SCF ("간세포 인자" 또는 "강철 인자"), TGF-α, aFGF, bFGF, KGF, PDGF-A, PDGF-B, PD-ECGF, INS, IGF-I, IGF-II, NGF-β 같은) 성장인자; (IL-8, GRO/MGSA, PF-4, PBP/CTAP/βTG, IP-10, MIP-2, KC 9E3 같은) α-유형 인터크린 사이토카인; 및 (MCAF, ACT-2/PAT 744/G26, LD-78/PAT 464, RANTES, G26, I309, JE, TCA3, MIPla, B, CRG-2 같은) β-유형 인터크린 사이토카인; 및 (NAP-1, MCP-1, MIP-lα, MIP-lβ, MIP2, SISβ, SISδ, SISε, PF-4, PBP, γIP-10, MGSA 같은) 주화성 인자를 포함하여 특성결정되었다. 다수의 다른 사이토카인 또한 당업자에게 알려져 있다. 이들 사이토카인의 기원, 성질, 표적 및 이펙터 활성이 기재되었고, 다수의 사이토카인에 대하여 이 분자를 코딩하는 DNA 서열 또한 알려져 있으며; 예를 들어, R. Callard & A. Gearing, The Cytokine facts Book (Academic Press, 1994)를 참조하고 여기에 참고문헌으로서 전체로 수록된 특정 간행물이 검토되고/또는 인용되었다.The Cytokine Facts Book같은 카탈로그에 참고문헌으로 기재되어 있는, 이같은 사이토카인을 코딩하는 많은 DNA 및/또는 단백질 서열 또한 일반적으로 GENBANK (DNA); 및/또는 SWISSPROT (단백질) 같은 서열 데이터베이스로부터 이용가능하다. 전형적으로, 공지된 서열 정보에 기초하여 사이토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하는 것 또한 가능하지만, 이같은 사이토카인을 코딩하는 클로닝된 DNA는 플라스미드로 이미 이용가능할 것이다. 사이토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 중합효소연쇄반응 (PCR) 방법학을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, Mullis & Faloona,Met. Enzymology, 155: 355 (1987) 참조. 주어진 세포 유형에 효과적인 신규 사이토카인인 동정을 위한 분석법을 포함하는 사이토카인의 검출, 정제, 및 성질결정 또한 여기에 기재된 참조문헌 뿐 아니라 다수의 간행물에 기재되었다. 예를 들어,Lymphokines and Interferons, 1987; 및 DeMaeyer, E., et al.,"Interferons and Other Regulatory Cytokines," (John Wiley & Sons 1988) 참조.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 호환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그것들의 유사체 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원적 구조를 가지며, 알려지거나 알려지지 않은 어떤 기능을 수행할 수 있다. 다음: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의되는 위치(들), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플리스미드, 벡터, 임의 서열의 분리된 DNA, 임의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머는 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예이다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 같은 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 만약 존재한다면, 뉴클레오티드 구조의 변형은 중합체의 조립전 또는 후에 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의하여 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합반응 후에 표지된 성분과 융합함으로써와 같이 더 변형될 수 있다.
용어 "재조합" 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생하지 않거나 비천연적 배열에서의 다른 폴리뉴클레오티드와 결합된, 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"뉴클레오티드 프로브"는 혼성화 반응에서 대응하는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 동정에 사용되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동성으로 연결된"은 성분들이 그들의 의도된 방식으로 작용하는 것을 허용하는 관계가 되도록한 배치를 지칭한다. 예를 들어,프로모터 서열이 코딩 서열의 전사를 촉진시킨다면 그 프로모터는 코딩서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
"유전자"는 전사 및 번역된 후 특정 단백질을 코딩할 수 있는, 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
여기에서 사용될 때, "분리된"은 그렇지 않다면 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것들의 단편이 자연상에서는 통상 공존하는 구성요소 및 세포로부터 분리된 것을 의미한다. 당업계 숙련자에게 명백한 바와 같이, 비-천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것들의 단편은 그것들의 천연적인 대응물과 구별하기 위하여 "분리"할 필요가 없다. 또한, "농축된", "분리된", 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그것들의 단편은 농도 또는 부피당 분자 수가 그것의 천연 발생의 대응물보다 "농축된" 경우 더 크고 "분리된" 경우 더 작다는 점에서 그것의 천연 발생의 대응물과 구별될 수 있다.
집적은 용액 부피당 중량 같은 절대값 기초로 측정될 수 있거나, 원료 혼합물에 존재하는, 제 2의, 잠재적으로 방해하는 물질과의 관계에 의하여 측정될 수 있다. 본 발명의 구체예에서 집적이 증가할수록 더 바람직하다. 그러므로, 예를 들어, 2-배 집적이 바람직하고, 10-배 집적은 더 바람직하고, 100-배 집적은 더욱 더 바람직하고, 1000-배 집적은 한층 더 바람직하다. 물질은 또한 화학적 합성 또는 재조합 발현 같은 인공적 조립의 과정에 의한 분리된 상태에서 제공될 수 있다.
"질병-관련" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비질병 대조표준 조직 또는 세포와 비교하여 질병-발병 조직으로부터 유래한 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 전사 또는 번역 산물을 생산하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비적상적으로 높은 수준에서 발현되는 유전자일 수 있고; 그것은 비정상적으로 낮은 수준에서 발현되는 유전자일 수 있으며, 변화된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 관련된다. 질병-연관 유전자는 또한 직접적으로 원인이 되거나 질병의 병인학의 원인이 되는 유전자와 불균형적으로 연관이 있는 유전자 보유 돌연변이 또는 유전적 변이를 지칭한다. 전사되거나 번역된 산물은 알려지거나 알려지지 않았고, 정상 또는 비적상 수준이다.
여기에서 사용될 때, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고/또는 ("전사체"라고도 지칭되는)전사된 mRNA가 그에 이어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체와 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"이라고 지칭된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래하였으면, 발현은 진핵 세포내에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"특이적으로 발현된"은 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열에 적용될 때, 대조표준에서 검출되는 것과 비교할 때 과다-발현 또는 과소-발현을 지칭한다. 과소발현은 또한 대조표준과 비교하여 시험 피험체내에서 검출가능한 발현의 부존재에 의하여 증명될 때 특정 서열의 발현의 부존재를 포괄한다.
"유전자 송달 운반체"는 숙주 세포내로 삽입된 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 송달 운반체의 예는 리포솜, 배귤로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스 같은 바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 균류 벡터, 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현을 위하여 기재된 및 간단한 단백질 발현 뿐 아니라 유전자 요법에 사용될 수 있는, 당업계에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 운반체이다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내 및/또는 사이로 전달하는 자기-복제 핵산 분자이다. 이 용어는 주로 핵산 분자를 세포로 삽입시키는 역할을 하는 벡터, 핵산의 복제를 주된 기능으로하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 주된 기능으로 하는 발현 벡터를 포함한다. 상기 기능의 하나 이상을 제공하는 벡터 또한 포함한다.
"발현 벡터"는 적당한 숙주 세포 내로 도입된 경우 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. "발현 시스템"은 보통 소망의 발현 산물을 생산하는 기능을 할 수 있는 발현 벡터를 포함하는, 적당한 숙주 세포를 나타낸다.
"숙주 세포"는 벡터 또는 핵산 분자 및/또는 단백질의 삽입의 수용체가 될 수 있거나 되었던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 그 자손은 자연, 돌발, 또는 유도 돌연변이 때문에 원래의 모세포와 (형태학적으로 또는 전체 DNA 상보성의 게놈 측면에서) 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 생체내 트렌스펙션된 세포를 포함한다.
"형질전환" 또는 "트랜스펙션"은 예를 들어 리포펙션, 트랜스덕션, 감염, 또는 일렉트로포레이션 같은 삽입에 사용된 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로의 삽입을 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-삽입 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안으로, 숙주세포 게놈에 삽입될 수 있다.
"바이러스 벡터"는 숙주세포내로 생체내, 생체외 또는 시험관내 송달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합적으로 제조된 바이러스 또는 바이러스성 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 등이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 여기에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 호환적으로 지칭하는데 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지되었을 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의하여 방해될 수도 있다. 이 용어는 또한; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실레이션, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지된 성분에 의한 융합 같은 다른 조작에 의하여 변형되었던 아미노산 중합체를 포괄한다. 여기에서 사용될 때, 용어 "아미노산"은 글리신과 D 또는 L 모두의 광학이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 포함하는 천연적 및/또는 비천연적 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
"리간드"는 리셉터의 리간드-결합 도메인에 의하여 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 분자는 화학적으로 합성되거나 천연적으로 존재할 수 있다. 리간드는 리셉터의 생물학적 활성을 촉진시킬 수 있는 "촉진물질" 또는 리셉터의 생물학적 활성을 저해하는 "길항물질"일 수 있다.
"세포 표면 리셉터" 또는 "표면 항원"은 원형질막 상에 고정된 분자이다. 그것은 원형질막의 구조적 구성성분으로 뿐만 아니라 다양한 생물학적 기능을 관장하는 조절 인자로서도 역할을 하는 단백질, 당단백질, 다당류 및 지질의 큰 규모의 패밀리를 구성한다.
여기에서 사용될 때, "막 단백질"은 원형질막 및 세포간 세포소기관의 막을 포함하는 어떤 세포막에 결합되어 있는 주변 또는 삽입 막 폴리펩티드도 포함한다.
용어 "세포질", "핵", 및 "분비"는 세포 단백질에 적용될 때, 세포 단백질이 대부분 편재된 세포외 및/또는 세포하 위치를 특정한다. 특정 단백질은 세포의 세포질과 핵 사이 내외를 가로질러 위치할 수 있는 "쉐퍼론"이다.
"발광"은 온도의 상승을 제외한 어떤 원인에 의한, 물질로부터의 빛의 방출을 지칭하는데 일반적으로 사용되는 용어이다. 일반적으로, 원자나 분자는 "여기" 상태로부터 더 낮은 에너지 상태 (일반적으로 바닥 상태)로 이동할 때 전자기 에너지(예를 들어, 빛)의 광자를 방출하는데; 이 과정은 종종 "방사성 붕괴"라고 지칭된다. 여기의 원인은 여러가지가 있다. 여기 원인이 광자인 경우, 발광 과정은 "광자발광"이라 지칭된다. 여기 원인이 전자인 경우, 발광과정은 "전자발광"으로 지칭된다. 더 구체적으로, 전자발광은 전자-구멍 짝(electron-hole pair)을 형성시키기 위한 전자의 직접 주입과 제거, 및 이에 이은 광자의 방출을 위한 전자-구멍 짝의 재조합의 결과이다. 화학 반응의 결과인 발광은 일반적으로 "화학발광"이라 지칭된다. 생체에 의하여 생산된 발광은 일반적으로 "생체발광"이라 지칭된다. 광자발광이 스핀-허용 전이의 결과인 경우(예를 들어, 단독체-단독체 전이, 삼중체-삼중체 전이), 광자발광 과정은 "형광"이라 지칭된다. 전형적으로, 형광 방출은, 이같은스핀-허용 전이를 통하여 신속하게 완화될 수 있는 단기-지속 여기 상태의 결과에 의하여 여기 원인이 제거된 후 지속되지 않는다. 광자발광이 스핀-불허 전이(예를 들어, 삼중체-단독체 전이)의 결과인 경우, 광자발광 과정은 일반적으로 "인광"이라 지칭된다. 전형적으로, 인광 방출은 이같은 스핀-불허 전이를 통하여만 완화될 수 있는 장기-지속 여기 상태의 결과로서 여기 원인이 제거된 후 장기간 지속된다. "발광 표지"는 상기 성질 중 어떤 것을 가질 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "항원-제시 세포"는 그것에 대하여 인간 단일클론 항체가 본 발명의 방법에 의하여 제조되는, 관심의 항원을 발현하는 세포를 지칭한다. 항원은 세포 표면에 바람직하게 발현된다. 항원은 그 세포에 천연적이거나, 그 발현이 외인적으로 도입된 폴리뉴클레오티드의 조절하에 있는 경우 그 세포에 대하여이종이다.
"이(二)-특이적 항체". Greenman et al. (Greenman, J., et al., Mol. Immunol. (England) 28 (11): 1243-54 (1991))에 의하여 기재된 바와 같이, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 이-특이적 재조합 펩티드내로 삽입될 수 있다. 이 예에서, 이-특이적 F(ab')는 티오에테르 결합에 의하여 연결된 두 개의 F(ab')를 포함하도록 제작되었다. 이-특이적 항체는 또한 두 개의 온전한 항체를 부착시켜 얻어질 수도 있다. 이-특이적 항체를 얻는 다른 방법은 상이한 항체 또는 그것의 단편으로부터의 사슬을 혼합함으로써 이다. 이 방법에서 이-특이적 항체의 "좌측" 곁가지가 한가지 기능을 가지며, "우측" 곁가지는 다른 기능을 가진다.
"미생물"은 육안으로는 비가시적인 생물학적 존재이다. 이들 존재는 박테리아, 균류, 바이러스 및 마이크로플라즘을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하등 생체의 거대한 문(門)을 구성한다.
"포유동물"은 신체 상의 자손 출산 및 모발을 특징으로 하는 척추 동물이다. 여기에서 사용될 때, "포유동물"은 인간, (개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등 같은) 애완동물, (염소, 양, 및 소, 등 같은) 농장 동물, 및 (여우, 사슴 등 같은) 스포츠 동물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "포유동물의"는 여기에서 사용될 때 포유동물에서 유래한 것을 지칭한다.
소망의 항원에 대하여 면역반응성인 인간 단일 클론 항체의 제조
비-형질전환 인간 B 세포의 제조:
본 발명에서 채용될 수 있는 비-형질전환 인간 B 세포는 말초혈, 림프절, 비장, 간, 골수, 탯줄, 또는 다른 인간의 조직으로부터의 림프구에 널리 분포된다. 인간 B 세포의 기원에 대한 현실적인 제한은 없지만, (예를 들어, 시중 경로나 적당한 기증자로부터) 얻기가 쉽고 다량의 B 세포를 함유하므로 말초혈이 바람직하게 채용된다. B 세포를 생산하는 체내에서 생산하는 어떤 개체도 후보 기증자일 수 있지만, 특정 관심의 항원에 노출된 적이 있어서 면역화 B 세포를 함유할 가능성이 높은 개체가 바람직한 기증자이다.
인간 말초혈 또는 다른 체조직에 함유된 림프구의 추출은 당업계 주지의 어떤 방법에 따라서도 수행될 수 있다. 대표적인 방법학은 밀도 경사 원심분리와 비-B 림프구의 면역친화도 제거이다. 밀도 경사 원심분리를 수행할 때, 말초혈 같은샘플은 전형적으로 칼슘 및/또는 마그네슘 이온이 바람직하게 없는 적당한 등장 매체에 희석한다. 희석된 혈은 그 다음 적당한 분리 매체 상에 로딩하여 원심분리를 받을 때 적혈구와 혈소판으로부터의 말초혈 림프구(PBL)의 분리를 달성한다. 일반적으로 채용되는 분리 매체는 FICOLL(Pharmacia, Sweden으로부터 구입가능), LYMPHOPREPTM(밀도: 1.077 g/ml, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway) 및 Percoll (Pharmacia, Sweden)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 원심분리의 완료 후, PBL은 혈청과 분리 매체 사이의 경계로부터 흡인될 수 있다. 정제된 PBL은 사용하기전에 낮은 온도에서 (예를 들어, 액체 질소중에서) 저장될 수 있다.
B 세포에 대하여 집적된 림프구를 제조하는 대안적 방법은 2-아미노에틸이소티오 우라늄 브로미드 하이드로브로미드(AET)-처리 양 적혈구로 처리함에 의한 T-림스구의 제거와 관련된다. 이 공정은 일반적으로 PBL을, 처리된 적혈구와 혼합하는 단계가 선행되고, 원심분리에 의하여 분리매체 상에서 T 림프구로부터 B 림프구를 분리하는 단계가 후속된다.
B 세포의 더 나아간 집적은 친화성 크로마토그래피, 단일클론 항체 코팅 배양용기 상에서의 골라내기, 자석 분리 기술, 또는 B 세포 잔류나 T 세포 제거를 달성하는 세포 분리 수단 (예를 들어, FACS)에 의하여 성취될 수 있다. 두 방법 모두 두가지 유형의 림프구를 구별할 수 있는 검출제를 채용한다. 이 같은 검출제는 우선적으로 발현되거나, 배타적으로 발현되지 않는다면 림프구 두 타입 모두에서는 발현되지 않는 세포표면 분자에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 당단백질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 다수의 T 세포 특이적 마커 분자가 당업계에 알려져 있다. T 세포 특이적 마커 분자의 비-제한적 예는 TCR/CD3 착체, CD2, CD4, CD8, 및 CD28을 포함한다. B 세포 특이적 마커 분자의 비-제한적 예는 CD19, CD20, CD21, HLA-DR, 및 B 세포 항원 36 kD를 포함한다. 다수의 비-형질전환 B 세포를 포함하는 림프구 조성물을 제조할 때, 상기-언급된 접근 또는 그것으로부터 변형된 방법 중 어느 하나도 단독으로 또는 조합하여 수행될 수 있다.
결과의 집적된 및/또는 분류된 B 세포 집단은 소망의 항원에 특이적 결합을 나타내는 B 세포를 스크리닝하는데 채용되거나, 선택적으로, 이 같은 스크리닝 과정 전에, 소망의 항원으로 시험관내 면역화/활성화시킬 수 있다. B 세포의 시험관내 스크리닝/활성화는 (a) 항원-특이적 B 세포의 제작을 촉진시키는데; 및 (b) 림프구 기증자가 그 항원에 노출된 바 없고/또는 강한 면역반응을 일으키는데 실패한 자기-항원 또는 항원을 인식할 수 있는 B 세포를 제작하는데 특히 유리하다.
비-형질전환 인간 B 세포의 시험관내 면역화/활성화:
B 세포의 시험관내 면역화의 방법은 일반적으로 B 세포 활성화의 확립된 및 전통적 기술과 일치한다. 이 방법은 소망의 항원에 대하여 특이적인 B 세포 결합에 적당한 조건하에서 비-형질전환 인간 B 세포의 집단을 소망의 항원과 접촉시키는 것과 관련된다. 소망의 항원과 B 세포 사이의 안정적이고 특이적인 결합을 결과하는 어떤 방법도 채용될 수 있으나, B 세포의 면역화는 "면역화 배지"에서 B 세포와 항원의 공동-배양에 의하여 바람직하게 수행된다. 일반적으로, 항원은 B 세포가 성장하는 고형 기질 상에 고정화된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 소망의 항원은 이같은 항원을 발현하는 세포의 단일층에 의하여 제시된다. 배양물 중에 성장할 수 있는 어떤 세포도 항원 제시에 대한 후보 세포이다. 바람직한 경우, 소망의 항원의 발현을 일으키는 외인성 폴리뉴클레오티드가 항원-제시 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명에 적당한 면역화 배지는 시험관내 B 림프구 생존을 뒷받침하고 그것의 형태학, 대사능 및 잠재적으로 세포의 증식능을 유지시킨다. 배양물내 B 세포의 생존 및/또는 성장에 요구되는 영양적 및 호르몬 필수요소를 포함하여 배지의 성분을 알 수 있도록 특정배지를 채용하는 것이 바람직하다. 포유동물 세포의 시험관내 생존을 관장하는 일반적인 매개변수는 당업계에 알려져 있다. 세포 매양 시스템에서 조절될 수 있는 생리학적 매개변수는 예를 들어 pH, CO2, 온도, 및 삼투압이다. B 세포의 영양학적 필수요소는 일반적으로 최적 환경 제공을 위하여 개발된 표준배지 제제에서 제공된다. 영양소는 몇몇 카테고리: 아미노산 및 그것의 유도체, 탄수화물, 당, 지방산, 복합지질, 핵산 유도체 및 비타민로 나눌 수 있다. 세포 대사를 유지하기 위한 영양소를 제외하고, 일반적으로 B 세포는 다음 군: 스테로이드, 프로스타글란딘, 성장인자, 뇌하수체 호르몬, 렉틴, 아주반트 펩티드, 및 무-혈청 배지에서 증식하기 위한 펩티드 호르몬(Sato, G. H., et al. in "Growth of Cells in Hormonally Defined Media", Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1982)으로부터의 하나 이상의 호르몬 또는 분열촉진제를 또한 요구한다. 호르몬에 추가하여, B 세포는 시험관내 생존 및 성장을 위하여 트랜스페린(원형질 철 수송 단백질), 세룰로플라스민(구리 수송 단백질), 및 고-밀도 리포펙틴(지질 운반체) 같은 수송 단백질을요구할 수 있다.
시험관내 활성화의 과정에 채용될 수 있는 면역원은 인간 B 세포에서 항체 생산을 유도할 것으로 기대되는 조성물이다. 다양한 다수의 면역원이 당업계에 알려져 있다. 다양한 유형의 면역원의 비-제한적 예는 단순 또는 복합 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질, 당단백질, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드), 리보자임, 및 그것들의 유도체 같은 생물학적 또는 화학적 화합물을 포함한다. 막대한 양의 일련의 화합물이, 예를 들어 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 같은 중합체 및 합성 유기 화합물이 다양한 코어 구조를 기초로 합성될 수 있고, 이들은 또한 용어 "화학적 화합물"에 포함된다. 또한, 식물 또는 동물 추출물 등 같은 다양한 천연 원료가 면역화에 사용될 수 있다.
특정 세포 유형에 대표적인 항원에 결합하는 인간 단일클론 항체를 생성하기 위하여, 정제된 항원의 샘플 뿐 아니라, 이같은 세포 유형으로 구성된 조직, 그것으로부터 유래한 조직 또는 세포의 배양물 및 그것의 자손, 이들 원료 중 어느 것으로부터 제조된 단편 또는 표본이 채용될 수 있다. 또한, 세포막 추출물, 세포질 추출물, 또는 관심의 항원에 대하여 집적된 특정 세포 유형의 세포 전체가 시험관내 면역화에 사용될 수 있다. 특히 흥미있는 것은 질병-유발 유전자를 발현하는(과다발현 또는 과소 발현하는) 세포, 다양한 세포주기 시점(G0, G1, G2, M, 또는 S 기)에서 정지된 세포, 상이한 발생 단계(성체 또는 배) 또는 발생 기원(예를 들어, 외배엽, 내배엽 또는 중배엽)의 세포, 및 박테리아, 균류, 및 바이러스를 포함하는하나 이상의 유형의 미생물로 감염된 세포이다. 당업계 숙련자에게 명백한 바와 같이, 다양한 세포주가 전통적 조직 배양 기술에 따라서 확립된다. 그것들은 공공 또는 사적인 레퍼토리로부터 얻을 수 있다. 가장 큰 규모의 기탁 기관은 막대한 수의 생체와 조직 샘플로부터 유래한 성질결정이 잘된 다양한 컬렉션을 제공하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (http://www.atcc.or)이다.
관심의 세포 유형에 대표적인 항원은 다음 카테고리: 리셉터 리간드, 분비된 단백질, 세포 표면 리셉터, 세포질 단백질, 또는 핵 단백질 중 하나 이상에 해당한다. 제한된 조직, 세포-유형 또는 세포하 분포 패턴을 나타내는 항원에 특히 흥미롭다. 이들 서브-카테고리 내에서, 주요 진단 및/또는 치료적 잠재성을 가지는 항원은 세포주기 조절, 세포 분화, 아폽토시스, 주화성, 세포 운동성 및 세포골격 재배열을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 특이적 생물학적 과정에 관련된 것들이다. 치료학적 잠재성이 있는 다른 유형의 항원은 특정 질병 또는 특이적 질병 단계와 관련된 것들을 포함한다. 이 같은 항원은 자기면역 질환, 비만, 고혈압, 당뇨병, 신경 및/또는 근육 퇴행성 질병, 심장병, 내분비 장애, 이들의 어떤 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 세포 유형의 세포-표면 항원으로 방향짓는 단일클론 항체의 제조를 위하여, 그 유형의 생존가능하고 온전한 세포, 바람직하게는 표면이 무혈청인 세포로 비-형질전환 B 세포를 면역화시키는 것이 바람직하다. 혈청-첨가 배지에서 증식한 세포에 의한 면역화는 두드러진 단점이 있다. 혈청은 정의되지 않은 활성의, 다수의 작고 큰 생물학적 분자의 복잡한 혼합물이다. 이들 혈청 생물학적 분자의 다수의 종류가 세포 표면에 부착하는 것으로 알려져 있다. 이들 생물학적 분자는 수송단백질 (예를 들어, 알부민), 부착 및 분산 인자 (예를 들어, 콜라겐 및 피브로넥틴), 및 다양한 종류의 혈청 지질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이들 외인성 분자의 세포에 의한 흡수는 특정 세포 유형에 대표적이 아닌 분자와 교차-반응하는 항체의 생성을 결과할 뿐 아니라, 천연 항원의 제시를 차단할 수도 있고, 따라서 결과의 단일 클론 항체 집합체의 "대표성"을 더 저해한다.
세포 표면에 혈청이 없음을 확실히 하기 위해서, 세포는 전형적으로 혈청은 결여하고 있지만, 특정 세포 유형의 생존 및/또는 성장에 필요한 호르몬, 성장 인자 또는 어떤 다른 인자로 보충된 제한 배지에서 배양된다. 특정 세포 유형에 대한 제한 배지를 제조하는 과정은 당업계에 잘 확립되어 있으므로, 본원에서 상세하게 개시되지 않는다(Barnes, D. 및 Sato, G.(1980) Anal. Biochem., 102:255;Mather, J.P. 및 Roberts, P.E.(1998) "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York).
소망의 항원에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 B 세포의 선택
소망의 항원-결합 특이성을 나타내는 B 세포를 스크리닝하기 전에, 농축된 B 세포 집단 또는 활성화된 B 세포를, 세포 응집체를 파괴하고 B 세포 표면으로부터 결합된 항원을 제거하는 해리제로 예비-처리한다. 해리제를 적용하는 경우에, B 세포막 통합성이 일체로 유지되고, 세포막 성분을 보존하는데 주의가 요망된다. 세린 프로테인아제, 트립신과 같은 강한 단백질 분해 효소의 작용으로 고착 세포 또는 세포층을 해리하는 전통적인 방법과 달리, 본 발명의 비-형질전환 B 세포는 전형적으로 세포 표면 분자에 대한 손상을 최소화하기 위한 제제에 의하여 배양 기질로부터 제거된다. 이러한 제제는 콜라게나제, 디스파제, 및 중성 프로테인아제를 제한없이 포함한다. 이들 제제로의 B 세포 처리는 대부분 세포 표면 면역글로불린을 유지하면서 응집체의 파괴를 초래한다. 세포 응집체를 해리하는데 요구되거나, 고체 기질상에 부착된 세포를 분리하는데 요구되는 처리시간은 선택된 프로테인아제 효소에 따라서 다양할 수 있지만, 일반적으로 약 3 분 내지 60 분, 및 바람직하게는 약 15 분 내지 30분일 것이다. 일반적으로, 효소적 처리는 약 37℃로 실온에서 수행된다. 과량의 효소는 생리 범위내의 pH 및 농도를 가지는 완충액, 또는 당업자에 의해서 통상적으로 제조된 무혈청 배지로 온화한 세척에 의해서 제거될 수 있다.
소망의 항원에 대하여 면역반응성인 B 세포의 이어지는 선택은: (a)소망의 항원과 B 림프구의 특이적 결합에 적당한 조건하에서 소망의 항원을 가진 B 세포를 포함하는 인간 림프구 집단을 접촉시키는 단계, 및 (b) 소망의 항원에 결합된 B 림프구로부터 비결합 B 림프구를 분리하는 단계를 포함한다. 과정은 전형적으로 고체 기질상에 항원을 놓고, 항원층상에 B 림프구를 플레이팅하여 진행한다. 그 다음, pH 는 6 내지 8 사이에서 유지되고, 온도는 약 20℃ 내지 40℃ 에서 유지되는 생리 조건하에서 B 림프구가 항원과 결합하도록 한다. 비결합 B 림프구를 세척, 흡인 또는 어떤 다른 적당한 수단으로 제거한다.
과정의 변형은 감쇄 선택이다. 예를 들어, 결장암 세포에 특이적으로 결합하는 B 세포 선택에서, 인간 림프구의 레퍼토리를 정상 세포의 단층과 함께 항온처리한다. 정상의 결장 세포에 대한 항체를 디스플레이하는 B 세포는 세포 단층과 결합할 것이다. 비결합 B 세포를 수집하고, 결장 암세포의 단층과 항온처리한다. 이 경우에, 결장 암세포를 특이적으로 인식하는 단일콜론 항체를 생산하는 B 세포만이 결합할 것이고, 비특이적 B 세포는 세척될 수 있다.
소망의 항원을 발현하는 온전한 세포가 선택과정에서 사용되는 경우에, 전형적으로 약 5% 내지 100% 조밀도로 무혈청 배지에서 배양된 생존가능한 세포의 단층을 고체상 기질에 접종한다. 항원-제시 세포가 접종된 기질은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 기질의 선택은 대개 세포 유형에 따라서 결정된다. 대부분의 세포는 예를 들어, 유리, 플라스틱 또는 세라믹 물질로 제조된 기질상에서 증식될 수 있다. 뉴론, 상피 및 근육 세포와 같은 어떤 세포 유형의 경우에, 세포 부착 및 퍼짐을 향상시키는 하전된 물질로 사전코팅된 기질이 바람직하다. 일반적으로 사용된 코팅 물질은 전양성 하전을 함유하는 생물학적 기질을 포함한다. 생물학적 기질의 제한되지 않는 예는 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐과 같은 세포외 기질/부착 단백질, 또는 폴리리신과 같은 합성 폴리펩티드를 포함한다. 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리테트라플루오로에틸렌으로 제조된 막과 같은 다양한 비생물학적 기질, 또는 어떤 다른 이식 물질이 또한 무혈청 배지에서 세포의 성장을 지지하도록 사용될 수 있다.
항원 제시 세포의 단층을 접종한 후에, 그 다음, 비-형질전환 인간의 B 림프구의 현탁액을 세포 단층에 첨가하고, 적당한 시간동안 약 37℃에서 항온처리했다. B 세포가 그것의 표면 면역글로불린의 특이적 인식을 통해 특정 항원에 결합하는데 요구되는 항온처리 시간은 B 림프구 및 항원 제시 세포의 상대적인 풍부성에 따라서 다양해질 수 있다. 일반적으로 약 10분 내지 120 분, 바람직하게는 약 30분 내지 60 분의 기간일 것이다. 항온처리 종료시에, 비결합 B 림프구를 Ca++/Mg++ 결여 완충액으로 세척함으로써 항원 제시 세포의 단층으로부터 제거한다. 세척된 해리 B 림프구를 원심분리로 수집하고, 그 다음 UV 조사를 받게 하였다. UV 처리된 B 림프구는 배양에서 3일내에 사멸할 것이고, 선택된 B 림프구의 후속적 클론 배양을 위해서 지지 세포로서 사용한다. 항원-제시 세포의 단층에 결합한 잔여 B 세포는 그들의 세포 표면상에 소망의 면역글로불린을 발현하는 것이다. 세포를 "선택된 B 림프구"로 명명한다.
선택된 B림프구의 클론 확장:
클론 확장전에, 선택된 B 림프구를 실질적으로 세포의 생존가능성을 유지하는 적절한 수단을 사용하여 항원과 해리시킨다. 항원에서 B 세포를 분리하는 바람직한 방법은 상기에 개시된 바와 같은 온화한 프로테인아제로의 처리이다. 선택된 B 세포의 분리된 콜로니를 발생시키기 위해서, 분리된 세포를 비-형질전환 B 세포의 생존뿐만 아니라 증식을 지지하는 배지에서 낮은 밀도로 플레이팅한다. B 세포의 클론 확장에 적합한 배지는 적어도 1회 배가 시간, 바람직하게는 3회이상, 더욱 바람직하게는 5회 이상 배가 시간동안 세포의 성장을 유지하는데 필요한 영양 및 호르몬 요구량을 포함한다. 이와같이, 여기에서 비-형질전환 인간 B 세포의 분리된 콜로니는 그 자체로, 소망의 항원-결합 특이성을 가진 단일 B 세포로부터 유래된 적어도 2 자손 세포, 바람직하게는 8 자손 세포, 더욱 바람직하게는 32 자손 세포를 포함하는 세포 집단을 말한다. 비-형질전환 B 세포의 요구되는 클론 확장을 지지할 수 있는, 제한되지 않는 배지의 예는 글루타민 및 다른 아미노산, 비타민, 미네랄 및 트랜스페린과 같은 유용한 전달 단백질 등과 같은 세포성 대사물질에 요구되는 보충물을 함유하는 MEM, DMEM, RPMI, F-12 를 포함한다. 배지는 또한 효모, 박테리아 및 균류에 의한 오염을 방지하는 항생제를 포함할 수 있다. 세포 배양에 적합한 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 및 카나마이신을 제한없이 포함한다. 배지는 선택적으로 소, 말, 닭 등으로부터 유래된 1-10% 혈청을 함유할 수 있기 때문에, 여기에 개시된 적어도 하나의 성장 인자 또는 미토겐으로 보충된 제한 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 바람직한 미토겐은 포커위드 (pokerweed) 미토겐, 인슐린, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, 항-CD40/CD-40 리간드를 포함한다. 성장 인자는 일반적으로 약 1pg/ml 내지 0.1mg/ml 범위내의 농도로 배지에 첨가된다. 일반적으로 약 1ng 내지 10㎍/ml 의 농도가 충분하다. 간단한 적정 실험을 용이하게 수행하여 특정 성장 인자의 최적 농도를 결정할 수 있다.
상기 언급된 세포 배양 인자에 추가하여, 지지 세포가 비-형질전환 인간 B 세포의 클론 확장을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 본원에 언급될때, "지지 세포"는 B 세포 증식과 관련된 공동-자극 기능을 제공하는 보조 세포이다. 말초혈 단핵 세포와 같은 지지 세포는 예를 들어, 최소한의 위험도의 표준 의료 행위인 류카포레시스(leukaphoresis) 와 같은 당업계에 알려진 기술(예를 들어, Weaveer et al., (1993)Blood82:1981-1984)로 얻어질 수 있고, 이러한 지지 세포는 사용전까지 질소 액체내에 저온보존으로 저장될 수 있다. 지지 세포의 다른 대표적인 유형는 EBV-형질전환된 림프모세포(Croosland et al.(1991) J.Immunol.146:4414-20), 골수 기질세포, 간 기질 세포, 및 3T3 섬유모세포계이다. 지지 세포의 바람직한 유형은 상기 언급된 선택 단계동안 비결합, 자유 림프구로 수확된, 소망의 항원에 결합할 수 없는 림프구이다. 바람직하게는, 지지세포 대 확장될 비-형질전환 B 림프구의 비율은 적어도 약 100:1, 더욱 바람직하게는 약 104:1, 그리고 가장 바람직하게는 약 106:1 이다.
본원발명의 지지 세포는 일반적으로 감수분열이 저지된다. 감수분열을 저해시키는 기술은 당업계에 잘 확립되었다. 가장 일반적인 절차는 방사선 조사이다. 예를 들어, 림프구는 약 5 cm 내지 25 cm 의 거리에서 30분동안 약 220 내지 290 nm 의 범위의 파장 길이(바람직하게는 254nm)를 가진 단 UV 파장으로 조사될 수 있다. 말초혈 단핵 세포는 약 3,000 내지 4,000 rads, 바람직하게는 약 3,600 rads 의 범위에서 감마 광선으로 조사될 수 있다. 어떤 림프모세포는 약 6,000 내지 12,000 rads(바람직하게는 약 10,000 rads)의 범위내의 감마 광선으로 조사될 수 있다. 세포의 다른 유형은 약 6,000 내지 12,000 rads 의 범위에서 감마 광선으로 조사될 수 있다.
B 세포 클론의 항원 특이성이 배양계에서 세포를 확장하기 전으로 한정되기 때문에, 자기 또는 동종 지지 세포가 B 세포 성장을 지지하는데 사용될 수 있다. 동종 지지 세포의 첨가는 림프구 공여자가, 예를 들어, 말초혈에 존재하여 B 세포 배양을 오염시킬 수 있는 바이러스로 감염된 상황에서 중요하다. 이러한 경우에, 미국 적십자사 기준에 의하여 적합한 혈 공여자로 여겨지고 스크리링되는 개인으로부터 유래한 동종 지지세포의 사용이 배양방법에 사용될 수 있다.
비-형질전환 B 세포 클론을 배양하는 조건은 생리학적 조건에 근접해야만 한다. 배지의 pH 는 생리학적 pH, 바람직하게는 pH 6-8, 더욱 바람직하게는 약 pH 7 내지 7.8 , 가장 바람직하게는 pH 7.4 에 근접해야만 한다. 생리학적 온도는 약 25℃ 내지 40℃의 범위이다. 세포는 바람직하게는 약 32℃ 내지 약 38℃, 및 가장 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 37℃의 온도로 배양된다.
상기 개시된 일반적인 기술을 적용하여, 인간의 태아 뇌 일차 세포계, 인간의 태아 난소 세포계, 인간의 폐암종세포계 A549, 및 성인의 슈반 세포계, 배아의 췌관세포의 대표적인 항원을 인식하는 면역글로불린을 발현하는 비-형질전환 B 세포 클론의 집단이 제조되었다.
소망의 인간의 단일클론 항체 또는 그것의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분리 및 발현
본 발명에 포함된 비-형질전환 B 세포는 소망의 결합 특이성을 가진 인간의 단일 클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하고 클로닝하는 특이적 시약을 제공한다.
구조적으로, 가장 간단한 자연 발생 항체(예를 들어, IgG)는 4 개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합에 의해서 상호 연결된 2 개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 인간의 항체는 IgD, IgG, IgA, IgA, IgM, 및 IgE 와 같은 면역글로불린의 몇 개의 클래스를 포함하는 많은 패밀리의 분자로 구성된다. 일반적으로, 사슬의 2 가지 유형은 별개의 유전자에 의해서 코딩된다. 지난 수십년 동안, 인간 항체의 배터리를 코딩하는 많은 유전자를 클로닝했고, 서열결정했다. 광범위한 서열 분석은 동일한 클래스의 면역글로불린 사슬은 항원 결합 부위를 구성하는 가변부와 함께 매우 보존적인 "불변부"를 함유한다는 것을 나타냈다. 면역글로불린의 다양한 클래스의 현존하는 서열에 기초하여, 소망의 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 면역글로불린 유전자의 분리에 다양한 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 대표적인 클로닝 방법은 PCR, cDNA 라이브러리 제작 및 스크리닝, 현존하는 핵산 데이타베이스에서 상동성 조사, 또는 이들의 어떤 조합을 포함한다. 일반적으로 사용된 데이타베이스는 GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS, 및 HTGS 를 제한없이 포함한다.
본 발명에서 인간의 단일클론 항체를 코딩하는 면역 글로불린 유전자를 분리하는 예시적인 방법은 (a) 본 발명의 비형질전환 B 세포 클론으로부터 핵산을 추출하는 단계;(b) 소망의 항체의 경쇄 또는 중쇄 또는 그것의 단편을 코딩하는 cDNA 를 합성하는 단계; 및 (c) 서브클로닝 및/또는 유전자 발현을 위해서 충분한 양의 DNA 분자를 생산하도록 cDNA 를 증폭시키는 단계를 포함한다.
비-형질전환 B 세포 클론에 함유된 핵산은 당업계의 표준 방법 또는 본원에 구체화된 과정(실시예 6)에 따라서 추출될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA 는 Sambrook et al.("Molecular Cloning:A laboratory Manual", Second Edition, 1989) 에 제시된 과정에 따라서 다양한 용균 효소 또는 화학 용액을 사용하여 분리될 수 있거나, 첨부된, 제조자에 의하여 제공된 지시에 따라서 핵산 결합 수지로 추출될 수 있다. cDNA 의 합성은 다양한 증폭 기술과 결합하여 역전사에 의해서 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 증폭은 적당한 충실성을 가진 표적 서열을 복제할 수 있는 프라이머-의존 폴리머라제를 사용하는 어떤 방법을 사용한다.
성공적인 증폭에서 제한 인자는 증폭이 효율적이고 확실하게 진행하도록 표적 서열의 충분한 수의 복제물을 추출하는 것이다. 본 발명에서, 표적 면역글로불린 유전자의 충분한 수의 복제물이 생성되어, 증폭은 상당한 정도의 성공과 확실성으로 진행될 수 있다. 초기의 면역/활성 단계에서, 선택된 비-형질전환 B-림프구를 소망의 항원에 대한 항체의 세포 표면 발현에 기초하여 선택한다. 선택된 림프구는 전형적으로 클론 확장 단계 동안 생산된 그들의 자손보다 덜 성숙한다. 이러한 더욱 성숙한 자손 세포는 부분적으로는 이들 세포에서 훨씬 많은 수의 mRNA 때문에, 더 많은 양의 항체의 생산 및 분비를 특징으로 한다. 그러므로, 세포 표면 항체를 발현하는 단일의 분리되고, 덜 성숙한 B-림프구가 그것의 발현된 면역글로불린을 코딩한는 mRNA 의 103개의 복제물의 정도를 가질 수 있는 한편, 더욱 성숙한 B-림프구는 105또는 그 이상의 mRNA 복제물을 가질 것이다. 본 발명에서, 선택된 B-림프구는 B 세포 증식에 유리한조건에서 배양되어 계속하여 항체를 생산할 수 있는 많은 B 세포 클론이 생산된다. 본 발명의 클론 확장 단계가 예를 들어, 약 20 개의 이같은 성숙한 B-림프구의 콜로니를 초래하는 경우에, 증폭을 위해서 이용가능한 mRNA 복제물은 2×106이상일 수 있다. 이러한 양은 하기에 상세히 개시된 방법에 따라서 소망의 면역글로불린의 성공적인 증폭 및 후속 발현을 보장한다. 대조적으로, 대부분 많아야 수백개의 mRAN 복제물을 가지는 분리된, 덜 성숙한 B-림프구의mRNA를 성공적이고 예측가능하게 증폭시키는 것은 매우 어렵다. 마찬가지로, 계속하여 항체를 생산하는 능력을 상실하거나, 그렇지 않으면 mRNA 발현 수준이 매우 낮아서 클론의 항체 생산이 손상될 수 있는 B-림프구 클론으로부터 mRNA를 성공적이고 예측가능하게 증폭시키는 것은 유사하게 매우 어렵다. 증폭은 T7 DNA 폴리머라제, E.coli DNA 폴리머라제의 클레나우 단편, 및/또는 역전사효소와 같은 T7 DNA 폴리머라제와 같은 천연 또는 재조합 DNA-폴리머라제에 의해서 수행될 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 PCR 이다. PCR 에 대한 일반적인 과정은 U.S. 특허번호 4,683196(Mullis) 및 4,683,202(Mullis et al)에 교시된다. 그러나, 각 출원 반응에 사용된 PCR 조건은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 실험적으로 결정 또는 측정될 수 있다. 많은 매개변수가 반응의 성공에 영향을 준다. 그것들은 어닐링 온도 및 시간, 연장 시간, Mg2+ ATP 농도, pH, 및 프라이머의 상대 농도, 주형, 및 데옥시리보뉴클레오티드이다. 본원에 예시된 것은 인간의 경쇄 및 중쇄를 복제하기 위한 조건 및 특이적 프라이머이다(실시예 6-7 참조).
증폭후에, 결과의 폴리뉴클레오티드를 아가로스겔 전기영동에 이어서 에티디움 브로마이드 염색 및 자외선 조영으로 가시화하여 검출할 수 있다. 면역글로불린 유전자의 특이적 증폭은 증폭된 폴리뉴클레오티드가 예견된 크기를 가지고, 예견된 제한 분해 패턴을 나타내거나, 올바른 클론된 DNA 서열과 혼성화함을 증명함으로써증명함으로써 확증될 수 있다.
바람직한 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 삽입될 수 있고, 교대로 벡터는 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명의 숙주 세포는 특히, 특이적 인간의 단일클론 항체를 코딩하는 유전자의 레퍼토리로서, 또는 항체를 생산하는 운반체로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 수단으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 직접적인 섭취, 엔도시토시스, 트랜스펙션, f-메이팅 또는 일렉트로포레이션에 의해서 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 트랜스펙션될 수 있다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 (플라스미드와 같이) 비통합 벡터로서 세포내에 유지되거나, 숙주 세포 게놈에 삽입될 수 있다.
본발명은 특정 세포 유형의 대표적인 항원에 결합하는 인간의 단일클론 항체집단의 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 세포는 진핵세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 더 바람직하게는 인간 세포이다. 특정 관심의 다른 세포는 질환-유발 유전자를 (과다발현 또는 과소-발현하는) 상이하게 발현하는 세포; 세포-주기 결함을 나타내는 세포(예를 들어, G0, G1, G2, M, 또는 S 기를 포함하는 다양한 세포주기점에서 정지); 및 상이한 발생 단계(성체 또는 배아)또는 발생 기원(예를 들어, 외배엽, 내배엽, 또는 중배엽)의 세포이다.
개개의 폴리뉴클레오티드는 다양한 유전자 송달 운반체를 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 유전자 송달 운반체는 나 플라스미드 DNA 또는 DNA/리포좀 복합체와 같은 바이러스 및 비바이러스 벡터를 포함한다. 벡터는 일반적으로 클로닝 및 발현 벡터로 분류된다. 클로닝 벡터는 그들이 함유하는 폴리뉴클레오티드의 복제 복제물을 얻거나, 장래의 회수를 위해서 예비적으로 폴리뉴클레오티드를 저장하는 수단으로서 유용하다. 발현 벡터(및 이러한 발현벡터를 함유하는 숙주 세포)는 그들이 함유하는 폴리뉴클레오티드로부터 생산된 폴리펩티드를 얻는데 유용할 수 있다. 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들어, 박테리아, 포유동물, 효모 및 곤충 발현 시스템용의 것과 같은 당업계에 알려진 것을 포함한다. 다양한 발현 시스템에서 생산된 폴리펩티드는 본발명의 범위내이다.
클로닝 및 발현 벡터는 전형적으로 적합한 마커(예를 들어, 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자)를 함유하지만, 이러한 마커는 숙주 세포에 공도입된 다른 폴리뉴클레오티드 서열상에 운반될 수 있다. 선택가능한 유전자가 도입된 숙주 세포만이 선택 조건하에서 배양된다. 전형적인 선택 유전자는 (a)예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트와 같은 항생제 또는 다른 독소에 내성을 부여하거나; (b) 보조영양 결핍을 보충하거나; (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 필수 성분을 보충한다. 적합한 마커 유전자의 선택은 숙주 세포에 의존할 것이고, 상이한 숙주에 적합한 유전자는 당업계에 공지된다. 벡터는 또한 전형적으로 숙주에 의해서 인식된 복제 시스템을 함유한다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라서 제조될 수 있거나, 당업게에서 이용가능한 많은 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용이 의도된 숙주 세포에 따라서 다양한 반면에, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기 복제능을 가질 것이고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가지거나, 마커 유전자를 가질 것이다. 적합한 예는 예를 들어, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1,RP4,pUC18, mp18, mp19, 파지DNA, 및 sPA3 및 pAT28 과 같은 셔틀 벡터와 같은 플라스미드 및 박테리아 바이러스를 포함한다. 이러한 및 다른 클로닝 벡터는 Clontech, BioRad, Stratagene, 및 Invitrogen 과 같은 상업적 판매원으로부터 이용가능하다.
분리된 인간의 면역글로불린 유전자 또는 유전자 단편을 함유하는 발현 벡터는 항원-결합 단편과 같은 항체 또는 항체 단편을 생산하는 숙주 벡터 시스템을 얻는데 유용하다. 이러한 발현 벡터는 에피좀 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 유기물에서 복제되어야만 함을 암시한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터, 코스미드 등을 포함한다. 효모, 조류, 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 많은 발현 벡터가 당업계에 알려진다. 발현 벡터의 한 예는, 전사가 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터/인핸서에 의해서 유도되는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)이다. 특히 유용한 발현 벡터(시스템)는 배큘로바이러스/곤충 시스템이다. 배큘로바이러스 시스템에서의 발현에 적합한 벡터는 pBackPack9(Clontech), pPbac 및 pMbac(Strategene)을 포함한다. 아데노바이러스 벡터는 시험관내 및 생체내 모두에서 높은 수준의 발현과 세포의 효율적인 형질전환때문에 생체내 조직으로 유전자를 도입하는데 특히 유용하다.
폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 핵산 및/또는 림프구에서 상응하는 유전자의 발현의 검출을 위하여 효소 표지 또는 방사성동위원소와 같은 검출가능한 마커를 함유하도록 변형될 수 있다. 다양한 적합한 검출가능한 마커는 검출가능한신호를 부여할 수 있는, 아비딘/비오틴과 같은, 형광, 방사성, 효소성 또는 다른 리간드를 포함하는 당업계에 알려진 것이다. 바람직한 구체예에서, 당업자는 방사성 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에 우레아제, 알칼리 포스파타제 또는 퍼옥시다제와 같은 형광 표지 또는 효소 태그를 사용하려고 할 것이다. 효소 태그의 경우에, 상보성 핵산 함유 샘플과의 특이적 혼성화를 확인하도록 시각 또는 분광광도계로 식별할 수 있는 수단을 제공하는데 사용될 수 있는 비색계 지표자 기질이 알려진다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 같은 전사 단위내의 서열을 코딩하는 추가의 서열, 프로모터와 같은 조절 요소, 리보솜 결합 부위, 및 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 상이한 프로모터의 조절하에 있는 추가의 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 및 형질전환을 허용하는 서열과 같은 추가의 서열을 포함할 수 있고, 어떤 이러한 구성체는 본발명의 구체예를 제공하는데 바람직할 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 결과의 폴리펩티드의 면역반응성을 증가시키거나, 폴리펩티드의 정제를 촉진하기 위한 다른 바람직한 서열과 융합될 수 있다.
본 발명에서 구체화된 폴리펩티드는 상기에 개시된 폴리뉴클레오티드의 집단에 의해서 코딩된 면역글로불린 사슬 또는 그것의 단편의 집단을 포함한다. 바람직한 면역글로불린 단편은, 전체 면역글로불린의 서열의 일부만을 포함하지만 항원-결합 특이성은 보유하는 것이다. 특히 바람직한 항원-결합 단편은 단일 사슬 V 영역 단편("scFv")이다. 단일 사슬 V 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 L 및/또는 H 사슬 V 영역을 연결하여 만들어진다. Bird et al.(1988) Science242:423-426. 충분한 가요성과 길이를 가지는 어떤 펩티드가 scFv 에서 링커로서 사용될 수 있다. 일반적으로 링커는 수용 숙주에서 면역원성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 선택된다. 연결 펩티드의 예는, 하나의 V 영역의 카르복시 말단과 다른 V 영역의 아미노 말단간에 약 3.5nm 를 연결하는 (GGGGS)3이다. 다른 연결 서열 또한 사용될 수 있고, 약물 또는 고형 지지체에 부착하는 수단과 같은 추가의 기능을 제공할 수 있다.
H 또는 L 사슬의 모든 또는 어떤 부분이 조합되어 사용될 수 있다. 전형적으로, 면역글로불린의 전 V 영역이 scFv 에 포함된다. 예를 들어, L 사슬 V 영역은 H 사슬 V 영역에 연결된다. 대안으로, L 사슬 V 영역 부분이 H 사슬 V 영역, 또는 그것의 일부에 연결될 수 있다. 또한 고려되는 것은 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역이 상이한 면역글로불린으로부터 유래된 scFvs 이다. 한 성분은 본발명의 선택된 B 세포로부터 발생된 면역글로불린으로부터 유래되고, 다른 성분은 T 세포 에피토프와 같은 상이한 폴리펩티드인 이기, scFv 를 제조하는 것이 가능하다.
ScFv 는 재조합적으로 또는 합성적으로 생산될 수 있다. scFv 의 합성 생산의 경우에, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv 의 재조합 생산을 위해서, scFv 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포인, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물, 또는 E.coli 와 같은 원핵생물로 도입될 수 있고, 폴리뉴클레오티드에 의해서 발현된 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
scFv의 생산에 특히 유용한 시스템은 E.coli 내의 플라스미드 pET-22b(+)(Novagen, Madison, WI)이다. pET-22b(+)는 발현된 단백질이 적합한 친화성 수지에서 정제되는 것을 허용하도록 6 개의 일련의 히스티딘 잔기로 구성되는 니켈 이온 결합 도메인을 포함한다. 적합한 벡터의 다른 예는 상기에 개시된 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)이다.
발현 조건은 scFv가 기능적이고, 바람직하게는, 최적의 4차원 구조를 나타내는 것을 보장하여야만 한다. 사용된 플라스미드(특히 프로모터의 활성) 및 숙주 세포에 따라서는, 생산율을 조정하는 것이 필요수적일 수 있다. 예를 들어, 약한 프로모터의 사용, 또는 더 낮은 온도에서의 발현은 원핵생물 시스템에서 적절하게 접힌 scFv 의 생산을 최적화하기에 필요할 수 있고, 또는 진핵 세포에서 scFv 를 발현하는 것이 바람직 할 수 있다.
본 발명은 또한 화학적 기능 부분에 연결된 인간의 단일클론 항체 또는 단편을 포함한다. 전형적으로, 부분은 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 표지이다. 이러한 결합된 항체는 예를 들어, 표적 항원의 검출에 유용하다. 많은 적합한 표지가 당업계에 알려지고, 방사성동위원소, 효소, 및 형광 화합물을 제한없이 포함한다. 부분은 항체에 공유결합, 재조합으로 연결되거나, 제2의 항체, 단백질 A, 또는 비오틴-아비딘 복합체와 같은 제2의 시약을 통해 결합될 수 있다.
다른 기능 부분은 신호 펩티드, 면역 반응성 증강제, 고형 지지체에 대한 결합 촉진제, 백신 담체, 생체반응 변형자, 및 약물을 포함한다. 신호 펩티드는 세포로부터 단백질의 분비를 지시하는 일반적으로 N-말단에서 위치하는 짧은 서열이다.면역 반응성 증강제는 박테리아 상항원을 제한없이 포함한다. 고형 지지체에 대한 결합 촉진제는 비오틴 또는 아비딘을 제한없이 포함한다. 면역원 담체로 생리적으로 허용가능한 완충제를 제한없이 포함한다. 생반응 변형자는 시토킨, 특히 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨-2, 인터루킨-4, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 및 γ-인터루킨을 포함한다.
적합한 약물 부분은 항종양 제제를 포함한다. 이들은 방사성동위원소, 빈블라스틴과 같은 빈카 알카로이드, 빈크리스틴 및 빈데신 술페이트, 아드리아마이신, 브레오마이신 술페이트, 카르보플라틴, 시스플라틴, 시클로포스파아미드, 시타라빈, 다카르바진, 다크틴마이신, 다우노루비신 히드로클로라이드, 독소루비신 히드로클로라이드, 에토포시드, 플루오로우라실, 로무스틴, 메클로로레타민 히드로클로라이드, 멜파란, 메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 펜토스타틴, 피포브로만, 프로카르바제 히드로클로라이드, 스트렙토조토신, 탁솔, 티오구아닌, 및 우라실 머스타드를 제한없이 포함한다.
단일 사슬 분자를 포함하는 면역독소는 재조합 수단으로 생산될 수 있다. 다양한 면역독소의 생산이 당업계에서 주지이고, 방법은 예를 들어, "Monoclonal Antibody-toxin Conjugate:Aiming the Magic Bullet, "Thorpe et al.(1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190; Vitatta(1987) Science 238:1098-1104; 및 Winter 및 Milstein(1991) Nature 349:293-299 에서 발견된다. 적합한 독소는 리신, 방사성핵종, pokeweed 항바이러스 단백질, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소, 리신 A 사슬, 제한효소 및 포스포리파제 효소와 같은 균류 독소를 제한없이 포함한다. 일반적으로, "Chimeric Toxins", Olsnes and Pihl, Pharmac. Ther. 15:355-381(1981); 및 "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy", eds. Baldwin 및 Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press(1985) 참조.
본 발명의 조성물의 사용
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 유전자 송달 운반체는 몇가지 용도를 가진다. 예를 들어, 특정 항원과 면역반응하는 인간의 단일클론 항체 및 그것의 단편의 생산을 위한 발현 시스템에 유용하다. 또한, 생물학적 샘플에서 소망의 인간의 단일클론 항체를 코딩하는 면역글로불린 유전자의 존재를 분석하기 위한 혼성화 프로브로서 유용하다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드는 소망의 폴리뉴클레오티드의 증폭을 초래하는 프라이머로서 유용하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 백신을 포함하는 약제학적 조성물 및 유전자 요법에 유용할 수 있다.
본 발명에서 구체화된 항체 및 폴리펩티드는 표준 진단 과정에 사용될 수 있는 특정 시약을 제공한다. 구체적으로, 항체 또는 그것의 면역반응 단편은 표적 항원의 검출을 위한 면역분석법에 사용될 수 있다. 본 발명의 진단 방법을 실행하기 위해서, 본 발명의 조성물의 하나는 그것과 반응하는 샘플내의 표적 항원을 검출하기 위한 시약으로 제공된다. 표적 항원은 진단 매개변수가 측정될 수 있는 개인으로부터 적합한 생물학적 샘플을 얻음으로써 제공된다. 적당한 생물학적 샘플은 표적을 함유하는 것으로 추정되는 세포 또는 조직 샘플이다. 면역분석법을 수행하기 위한 과정이 당업계에 확립되므로 본원에 상세하게 개시되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해서 발생된 인간의 단일클론 항체는 또한 인간의 질환을 치료 또는 예방하는데에 유용성을 가진다. 단일클론 항체는 질환 발생 및/또는 진행에서 중요한 역할을 하는 표적 항원의 활성을 조정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간의 유방암세포의 성장을 선택적으로 저해할 수 있는, 상표명 HERCEPTIN으로 시중구입 가능한 인간화 항-Her2 항체는 유방암 항원 Her2를 과다발현하는 수십, 수천의 유방 암 환자를 치료하기 위한 효능있는 약제로서 사용된다. 그러므로, 본 발명의 인간의 단일클론 항체는 또한 표적 항원의 생물학적 활성을 증진 또는 저해할 수 있는 그들의 효능에 대하여 시험될 수 있다.
본 발명이 인간 세포에서 만들어진 인간의 단일클론 항체로서 개시되지만, 당업자가 본원에 개시된 기술을 사용하여 인간을 제외한 포유동물로부터 단일클론 항체를 만드는데 본 발명을 사용할 수 있음은 자명할 것이다.
하기의 실시예는 본 발명의 대표적인 단일클론 항체의 제조, 특징, 및 사용의 상세한 설명을 제공한다. 이러한 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 말초혈로부터 림프구의 분리
인간의 림프구를 National Blood Bank 로부터 얻은 "연막(軟膜)"으로부터 분리했다. "연막"을 Ca++/Mg++ 결여 PBS 부피로 희석시켰다. 희석된 연막을 각 50 ml 원심분리 튜브내의 10 ml LYMPHOPREPTM분리 배지(밀도:1.077g/ml, Nycomed PharmaAs, Oslo, Norway)의 상층에 조심스럽게 깔았고, 20℃에서 30분동안 800 g으로 원심분리했다. 원심분리 후에, 적혈구가 튜브의 하층에 침전되고, 림프구는 LYMPHOPREPTM용액 상층에 흰색 밴드를 형성하였다. 림프구를 신선한 원심분리 튜브에 수집하였고, PBS 로 2차례 세척하였다. 각 제조물의 림프구 산출량은 3-5×108세포였다. 분리된 림프구를 즉시, 또는 24-48 시간동안 관심의 항원(들)과 배양한 후에 특이적 B-세포 선택에 사용하였다.
실시예 2: 관심의 항원에 의한 B 림프구의 시험관내 면역화/활성화
본 방법에 의하여, 선택전에 특이적 B-세포를 항원으로 활성화시켰다. 상기에서 분리된 림프구를 107세포/ml 의 밀도로 시험관내 면역 배지(10㎍/ml 인슐린, 10㎍/ml 트랜스페린, 10nM 셀레니움, 3nM 프로게스테론, 2.5㎍/ml 포커위드 미토겐 및 10ng/ml IL-2 로 보충된 F12/DMEM)에서 희석시켰다. 그 다음, 세포를 단일클론 항체가 전개된 세포의 단층에서 플레이팅했다. 실험자는 태아 뇌 제1차 세포계, 인간의 태아 난소 세포계, 인간의 폐암종 세포계 A549(ATCC 접수번호 CCL185), 및 성인의 슈반 세포계를 사용했다.
인간의 태아 뇌 제1차 세포계를 래트 신경상피 세포에 대하여 이미 개시된 변형된 방법으로 임신 8주에 태아 뇌로부터 배양했다. 예를 들어, Li, R.H. et al. Endocrine 15, 205-217(1996) 참조. 세포를 플레이트로 코팅된 라미닌 (lifetechnologies, cat#23017015) 상에서 인슐린(5㎍/ml, Sigma cat. No. 10259), 트랜스페린(10㎍/ml, Sigma cat #T4132), 소듐 셀레나이트(10nM, Sigma cat.#S5621), 프로게스테론(3nM, Sigma cat. #P0130), a-토코페롤(5㎍/ml, T1539), 포르스콜린(3μM, Calbiochem, cat. #344270), 상피 성장 인자(10ng/ml, Life Technologies, cat.#13247051), 소 플라스마 피브로넥틴 10㎍/ml(Sigma cat. #F1141), 및 30% 슈반 세포로 조정된 배지로 보충된 무혈청 배지 F12/DMEM 에 옮겼다.
인간의 태아 난소 세포계를 그 내용 전체가 참고문헌으로 본원에 수록된, 공유출원중인 U.S. 특허번호 09/545,659 에 개시된 방법을 사용하여 얻었다.
당업자는 성인 슈반 세포계를 Li, R., et al. Journal of Neuroscience 16:2012-2019(1996) 에 개괄된 다음의 프로토콜로 얻을 수 있다.
실시예 3: 소망의 항원-결합 특이성으로 비-형질전환 B 세포의 선택
특정 항원에 대한 B-림프구의 선택전에, 림프구 세포 표면을 클리닝하기 위해 30분동안 무혈청 배지에서 0.25% 콜라게나제/디스파제와 함께 항온처리했다. 이 단계는 B-세포의 선택적 결합동안 세포 응집을 감소시키고, 특히 체외 면역화동안 항원에 노출되었던 세포에 대해 B-세포 표면으로부터 결합된 항원을 제거하는데 있어 중요하다. 그 다음 잔여 효소를 제거하기 위해서 무혈청 배지로 2차례 세척했다. 클리닝된 세포를 계수했고, 패닝(panning)을 위해서 미리 107세포/ml 의 농도까지 무혈청 배지에서 희석시켰다.
선택 과정을 무혈청 배지에서 약 5% 내지 100% 의 조밀도로 단층 세포를 접종하여 진행했다. B 세포가 그들의 표면 면역글로불린의 특이적 인식을 통해 그들의 특이적 항원에 결합하도록 림프구 현탁액을 단층에 첨가하고, 1 시간동안 37℃에서 항온처리시켰다. 약 15분 간격으로 배양물의 온화한 와동으로 세포를 혼합시켰다. 항온처리 후에, 표적 세포의 단층으로부터 자유 림프구를 Ca++/Mg++결여 PBS로 세척, 수집하였고, 10분동안 1500 rpm 으로 원심분리하였다.
자유 림프구를 10cm 의 거리에서 UVGL-58 로 30분동안 단파장 UV(254 nm)로 35분동안 UV 조사에 노출시켜서 죽였다. UV 처리된 림프구는 배양에서 3일내에 사멸할 것이고, 선택된 B 림프구의 클론 성장을 위한 지지 세포로서 사용했다. 세척을 통해 표적 세포의 단층에 결합된 잔여 B 세포는 그것의 세포 표면상의 특이적 면역글로불린을 가진 B 세포였고, "선택된 B 림프구"로 명명했다. 그 다음, 세포를 15분동안 37℃에서 0.02% EDTA 를 가진 PBS 에서 항온처리에 의해 표적 단층 세포로 배양 플레이트로부터 제거했다. 세포를 수집하고 무혈청 배지로 세척하였다.
실시예 4: 선택된 B-세포의 클론 확장
선택된 B 세포를 인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), 셀레니움(10nM). 프로게스테론(3nM), 포커위드 미토겐(2.5㎛/ml), IL-2(10ng/ml) 및 그것의 불활성 태아 소혈청(5%)으로 보충된 배양 배지 F12/DMEM에서 96 웰 조직 배양 마이크로타이터에서 플레이팅했다. 태아 소 혈청의 첨가는 선택적이다. 배지는 선택전에 이미 활성화된 B 세포의 클론 확장을 지지할 수 있다. 108개시 림프구마다 하나의 96 웰에 선택된 B 세포를 플레이팅하였다. 항원으로의 사전-선택 활성화 없이 림프구 풀로부터 선택된 B 세포의 경우에, UV 조사 림프구(106세포/웰) 또는 인간의 간기질세포(104세포/웰)의 지지 세포를 첨가했다. 지지 세포 모두 B 세포의 증식을 지지했다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 배양 배지는 3 일내에 반 교환했다. 배양말기, 일반적으로 제 6-10 일에, 배양물을 면역세포화학을 위해 고정하거나, 총 RNA 추출에 대해 사용했다.
실시예 5: 면역세포화학
확장된 비-형질전환 B 세포가 항체를 생산하는 능력을 유지하는지를 확인하기 위하여 면역세포화학적 분석을 수행했다. 96웰 플레이트내의 배양물을 10분동안 2500 rpm 으로 원심분리했다. 배지를 조심스럽게 제거하고, 세포를 즉시 에탄올(-20℃)로 고정했고, 대기중에서 건조시켰다. 그 다음 고정된 배양물을 내인성 퍼옥시다제 활성을 불활성하기 위하여 30분동안 실온에서 100% 에탄올내의 3% H2O2로 처리하였고, 그 다음 잔여 H2O2를 제거하기 위해서 PBS로 3 차례 헹구었다. 배양물을 10% 태아 소혈청 및 0.1% 트윈 20 을 포함하는 PBS 에서 1:100으로 희석된, 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 결합 항-인간 카파 경쇄 항체(Sigma, Cat#A7164)와 함께 항온처리하였다. 실온에서 2시간 항온처리후에, 배양물을 PBS 로 3차례 세척하였고, 새롭게 제조된 Milli-Q 물로 2 차례 세척했다. 최종적으로, 배양물을 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.05, 및 H2O2(0.003%)에서 제조된 퍼옥시다제 기질 디아미노벤즈아딘 (1mg/ml)로 5분동안 항온처리했다. 항온처리 종료 후에, 배양물을 물로 세척했고, 현미경으로 검사했다. B 세포 발현 카파 경쇄가 적갈색으로 염색되었다. 카파-경쇄 양성 콜로니뿐만 아니라 각 웰에서 많은 양성 세포를 함유하는 많은 웰을 계수했다. 결과는 카파 경쇄 양성 콜로니를 함유하는 비율은 0 내지 95 %로 제조에 따라 매우 다양하다는 것을 보여주었다. 다양성은 림프구의 각각의 공여자에 의존하였고 따라서, 예측되었었다. 콜로니의 평균 크기는 약 20 세포였다. 가장 큰 콜로니는 약 100 개의 세포를 가졌다.
실시예 6: 면역글로불린 유전자의 분리
Qiagen Mini-spin 총 RNA 분리 키트로 배양물의 각각의 웰로부터 총 RNA를 추출했다. 최종 용출 부피는 30㎕ 였다. 제1의 cDNA 가닥을 4.6㎕ 총 RNA 샘플, 20mM Tris, pH 8.3, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 각각 1mM 의 데옥시뉴클레오티드(dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP), 25 유니트의 RNAase 저해제, 및 10 유니트의 AMV 역전사효소의 반응 혼합물 10㎕ 내에서, 경쇄 역 전사 프라이머(ctc tcc cct gtt ga) 또는 중쇄 역전사 프라이머(agt ttt gtc aca aga)(1μM)를 사용하여 제1의 cDNA 합성 키트로 합성했다. 반응을 10분동안 37℃, 60분동안 42℃ 및 10분동안 99℃에서 열순환기로 수행했다.
경쇄 cDNA 의 제2의 가닥을 축퇴 프라이머(gga gaa ata gtg atg ac(c/t/g) cag(t/a)ct c), 1 유니트 Taq 폴리머라제, 및 DNA 폴리머라제의 1 유니트 클레나우 단편으로 합성했다. 반응을 10분동안 37℃에서 수행한 다음, 온도를 분당 2℃의 비율로 50℃까지 상온시켰고, 최종적으로는 1 분동안 72℃ 였다. 경쇄의 증폭을 증폭 프라이머(tca ctc tcc cct gtt gaa gct ctt)의 첨가 및 50㎕ 의 10 mM Tris, pH8.3, 50mM KCl, 및 1.5mM MgCl2로의 반응 혼합물의 희석으로 폴리머라제 사슬 반응으로 완성시켰다. 순환 말기에, 최종 연장을 7분동안 72℃에서 허용했다. PCR 산물을 75 볼트로 5 시간동안 Tris-Borate EDTA 완충액내의 1% 아가로스 겔상에서 분별했다. 경쇄 생성물의 예상되는 크기는 약 630 bp 였다.
중쇄의 합성 및 증폭은 경쇄와 유사하였다. 제2의 사슬 합성동안, 프라이머(ct cag tgt cag atc ctc a(c/t)c atg g)를 중쇄의 개시 코돈의 부위에 어닐링했다. PCR 의 경우에, 증폭 프라이머(tca agt ttt gtc aca aga ttt ggg ctc aa)를 사용했다. 열순환기용 세팅은 경쇄와 같았다.
실시예 7: PCR 생성물의 클로닝
증폭된 DNA 산물을 겔 전기영동하에 놓았다. 예상되는 크기의 cDNA 밴드를 Qiagen 겔 정제 키트로 절단 및 정제했다. Promega로부터 구입한 TA 클로닝 키트로 하룻밤동안 4℃에서 경쇄 cDNA를 pTaregT 벡터에 바로 리게이션했다. 경쇄의 경우에, 신호 펩티드(사용된 프라이머:atg gaa acc cca gct cag ctt ctc ttc ctc cta cta ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg ac 및 tca gtt gaa gct ctt tgt gac)를 제2 순환 PCR 로 그것의 5'-프라임에 부착하고, 생성물을 다시 겔 정제 키트로 정제한다. 최종 생성물을 pTargeT 벡터로 리게이션한다. 연결된 생성물로 E.coli 의 J109 균주를 형질전환시켰고, LB/암피실린/x-Gal/IPTG 플레이트에 플레이팅했다. 플레이트를 하룻밤동안 37℃에서 배양했다. 각 플레이트는 일반적으로 수백개의 백색 콜로니를 산출했다.
실시예 8: 포유동물 세포에서 면역글로불린 cDNA의 발현
pTargeT 벡터는 cDNA 삽입체가 포유동물 세포에서 발현되도록 허용하는 CMV 프로모터, 원핵생물 발현을 허용하는 T7 프로모터, 및 G418 내성을 코딩하는 neo 유전자를 함유한다. 클론 B 세포로부터 면역글로불린 mRNA 가 성공적으로 증폭되고 pTargeT 플라스미드로 클로닝되었다는 것을 확인하기 위해서, 플라스미드 DNA 의 미니-프렙을 상기의 LB 플레이트의 각각에서 배양된 약 200개의 백색 콜로니의 풀로부터 제조했다. 그 다음 플라스미드 DNA 를 Gibco BRL 로부터의 리포펙타민 시약으로 COS 세포를 트랜스펙션시켰다. 요약하면, 1㎍ 의 플라스미드 DNA 를 100㎕ F12 DMEM 에서 희석하고, 5㎕의 리포펙타민 시약을 100㎕ F12/DMED 에서 희석한다. 트랜스펙션 혼합물을 만들기 위해서, 두가지의 용액을 즉시 함께 혼합하고, 실온에서 15분동안 유지한다. 그 다음 혼합물을 800㎕ F12/DMEM 으로 희석하고, 50% 조밀도인 COS 세포 단층에 깔고, 무혈청 배지로 세척했다. COS 세포를 37℃에서 4 시간동안 트랜스펙션 혼합물과 함께 항온처리했다. 그 다음, 트랜스펙션 혼합물을 제거하고, 세포를 무혈청 배지로 한차례 세척한다음, 10% 혈청을 가진 F12/DMEM 으로 배양하였다. 24 시간 후에, 배양물을 PBS 로 세척하고, 에탄올로 고정하고, 면역세포화학을 진행시켰다.
면역글로불린-발현 COS 세포를 확인한 다음, 플라스미드의 풀로 세포를 다시 형질전환시켜서 특정 콜로니를 분리한다. PCR, 항체 검출과 함께 원핵생물 발현, 및 포유동물 발현을 특정 콜로니를 스크리닝하기 위해서 사용한다. 경쇄 및 중쇄 모두를 각각의 B 세포 클론으로부터 클론한 경우에, 경쇄 및 중쇄는 포유동물 세포에서 공발현하여 Fab 로서 직적접으로 또는 Fc 단편을 함유하는 벡터에 서브클로닝 다음에 전면역글로불린으로 인간의 단일클론 항체를 생산한다. 적절한 세포계가 인간 항체의 연속적인 생산을 위해 확립될 수 있다.
실시예 9: 인간의 태아 췌장 세포에 대한 인간의 항체 제조
B-세포의 배양
인간의 림프구를 LYMPHOPREPTM층을 통해 원심분리(30분동안 1500rpm)로부터 분리했다. 림프구를 10분동안 1500 rpm으로 원심분리하고 PBS로 세척했다. 약 5×108의 림프구를 무혈청 배지에서 헹군, 조밀한 hPED 세포의 신선한 플레이트(100 nm 디쉬)에 첨가했다. hPED 세포는 참고문헌으로 그 내용 전체가 본원에 수록된 공유출원중인 U.S. 특허번호 09/546,577 에 개시된 다음의 방법으로 얻어질 수 있는 인간의 태아 췌장 전구체 세포이다. 배양물을 1 시간동안 37℃ 에서 항온처리하여 특정 B 세포가 hPED 세포에 결합하도록 하였다. 항온처리후에, 세포 배양 플레이트를 PBS 로 5 차례 헹구어 미결합 백혈구를 제거하였다. 자유 림프구를 원심분리에 의해 수집하고 10 ml 무혈청 F12/DMEM 에서 재현탁하고, 2 개의 100 mm 디쉬로 나누었다. 플레이트를 Stratalinker(Stratagene로부터의 UV 링커)에 놓았고, 고에너지 세팅으로 15 분동안 UV 선에 리드와 함께 노출시켰다. UV-조사 세포를 결합 B-세포의 배양용으로 지지 층으로 사용했다. hPED 세포의 단층과 함께 결합된 B 세포를 37℃에서 0.02% EDTA/PBS 에서 15분 항온처리에 의해 플레이트로부터 분리했다. 그 다음, 세포를 10분동안 1500 rpm 으로 원심분리하여 수집했고, 3 개의 96웰 플레이트내에 플레이팅했다. 각 웰은 5% 소 혈청, IL-2(10 ng/ml), 포커위드 미토겐(2.5 ㎍/ml)으로 보충된 150㎕ F12/DMEM, 및 무백혈구로부터 제조된 UV-조사된 지지 세포를 함유했다. 배양 제 3일에, 배지의 반을 제거한 후(즉, 총 150㎕ 부피로부터 제거된 75㎕), 제 1일에서와 같은 배지 동 부피로 교체했다. 제 6 일에서, 하나의 플레이트를 에탄올로 고정하고 항-인간의 카파 사슬 면역조직화학으로 염색했다. 거의 모든 배양 웰은 Ig 카파+콜로니를 함유했다. 제 7일에 다른 2 개의 플레이트내의 세포를 용해시키고 Qiagen RNeasy 키트(Cat No. 74104)로 공급된 용해 완충액으로 -80℃에서 동결시켰다.
B 세포로부터의 면역글로불린 cDNA의 클로닝
B-세포 콜로니로부터 면역글로불린의 클로닝 전략은 세포 표면 디스플레이 시스템에 기초하였다. 본 방법에 의하여, 하기에 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 모두를, B 세포 콜로니로부터 제조된 총 RNA로부터 역전사된 제1의 가닥의 cDNA로부터 증폭시켰다. 중쇄를 제한 부위 Bgl II 및 Sal I 으로 pDisplay(Invitrogen cat no. V660-20)에 클로닝했다.
중쇄 Fd 영역은 헤마글루틴 A-Fd-myc-PDGF 트랜스멤브레인 도메인(Fd 영역은 면역글로불린 중쇄의 N-말단에서 경첩 영역까지를 의미한다.)을 함유하는 융합 단백질로서 발현된다. 본 전략으로, 중쇄는 B 세포 표면상에 디스플레이되었다. 그러나, 경쇄는 pTargeT 벡터내의 분비된 단백질로서 발현되었다. 그러므로, 경쇄 및 중쇄의 공발현은 세포 표면상의 Fab 를 초래했다. 항원과 Fab의 특이적 결합은 표적 세포와 숙주 세포의 결합으로 증명되었다. 한편, Fab 융합 단백질을 특이적 결합에 대하여 시험하기 위해서 세포 표면으로부터 추출했다.
더욱 구체적으로, 총 RNA를 하나의 플레이트로부터 Qiagen Rneasy 키트(Cat. No. 74104)에 의해 추출했다. 역전사를 10/3/2000 상의 Promega cDNA 합성 키트(cat. No. A3500)로 수행했다. 반응 혼합물을 각 샘플에 대하여 하기와 같이 제조했다.
시약 부피 ㎕/샘플
10x 역전사 완충액 2
MgCl2 4
dNTP 2
RNase 저해제 RNasin 1
랜덤 프라이머 0.5
RNA 샘플 9.7
역전사효소 0.8
총 반응 부피는 20㎕ 였고, RNA 샘플을 5분동안 65℃에서 변성시켰고 사용 직전에 아이스상에서 즉시 냉각시켰다.
반응 혼합물을 열순환기에 놓았고(Techne 에서 제조된 Genius model). 다음의 요인을 따랐다: 25℃에서 10분, 42℃에서 30분, 99℃에서 10분. 특정 cDNA 를 Qiagen hot start DNA 폴리머라제로 증폭시켰다.
PCR 반응 혼합물을 다음의 표에 개시된 바와 같이 제조했다.
시약 부피/샘플 (㎕)
10x PCR 반응 완충액 5
25 mM MgCl2 1
데옥시뉴클레오티드 혼합물 1
HHR1 0.5
HHF1 0.5
Taq 중합효소 0.25
증류수 36.75
RT로부터의 주형 5
전체 부피 50
중쇄 프라이머 셋트:
HHR1: gccagatctcccgtkgtgcagtcyggrscwgaggtg
HHF1: ttcgtcgacctgtttgtcacaagatttgggctcaa
여기에서 y=c 또는 t, w=a 또는 t, s=c 또는 g, r=a 또는 g, 및 k=t 또는 g 이다.
프라이머는 Gibco BRL에 의해 제조된 제품이다. 최초 변성을 위해서 2분동안 95℃ 열순환기상에서 PCR 반응을 수행하였고, 그 다음 30초동안 95℃, 30초동안 55℃에서 45 회 수행하였고, 7분동안 72℃에서 최종 연장을 하였다.
생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분별하였고, DNA 단편을 Qiagen(cat. No. 28706)으로부터의 겔 정제에 의해서 겔로부터 정제했다. DNA를 50㎕ EB 완충액에서 용출시켰다. 정제된 cDNA 단편을 제한효소로 분해했다. 6.5㎕ 10×완충액 H 및 5㎕ Sal I(cat no. 567 663, 10 유니트/㎕) 및 5㎕ Bgl II(cat. No. 567 639, 10 유니트/㎕)를 50㎕ DNA 샘플에 첨가했다. 이 두가지 효소는 Roche Molecular Biochemicals로부터 구입했다. 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간동안 항온처리했다. 반응 종료 후, 반응 혼합물을 PCR 정제 키트로 정제했고(cat. No. 28106), 키트에 의해서 공급된 30㎕ 용출 완충액에서 용출시켰다.
플라스미드 pDisplay 를 Invitrogen으로부터 구입했다. 플라스미드를 증폭시키기 위해서, 20㎍ 플라스미드 DNA 를 pH 7.0 의 200㎕ Tris-EDTA 완충액에 용해시켰다. 플라스미드로 JM109 컴피턴트 세포(Promega pTargeT 벡터 시스템 cat. No. A1410)를 형질전환시켰고, LB/암피실린(100㎍/ml) 플레이트상에 플레이트했다. 단일 콜로니를 선택, 하룻밤동안 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 25 ml LB 배지에서 배양했다. 플라스미드 DNA를 Qiagen midi-prep 키트로 분리했다. 약 100㎍의 분리된 플라스미드 DNA를 4 시간동안 완충액 H 내의 SalI 및 BalII 의 200 유니트로 분해했다. 분해된 DNA 를 1% 아가로스 겔상에서 2차례 분별했고, 겔추출 키트로(Qiagen cat. #28706) 정제했다. 정제된 pDisplay Sal I/Bal II 단편을 별개의 앨리쿼트로 분산시켰고, 사용전까지 -80℃에서 저장했다.
중쇄 cDNA 단편을 하룻밤동안 공급자에 의해서 제공된 10×(300 mM tris-HCl(pH7.80), 100 mM MgCl2, 100mMDTT, 10mM ATP) 내의 리가제 완충액에서 T4 DNA 리가제(Promega, Cat. No. M1794)로 pDisplay Sal I/Bal II 에 리게이션했다. 리게이션된 DNA 를 JM109 컴피턴트 세포로 트랜스펙션시켰고, 암피실린/LB 플레이트상에 플레이트했다. 동일한 조건에서 플라스미드 DNA 단독의 연결로 측정하였을때, 기초 암피실린 내성 콜로니 수는 약 2-3 콜로니였다. 각 플레이트로부터, 10 개의 콜로니를 수집하였고, 하룻밤동안 5ml LB/암피실린에서 배양했다. 플라스미드 DNA 를 Qiagen mini-prep 키트(Cat. No. 27106)로 분리했다.
경쇄 cDNA 를 2 개의 PCR 반응으로 증폭시켰다. 제1의 순환을 경쇄 프라이머셋트:ggagaaatagtgatgacbcagwctc 및 tcactctcccctgttgaagctctt(여기에서, w=a또는 t 이고, b= t 또는 c 또는 g 이다)로 실행했다. PCR 산물을 겔 정제했고, 5'프라임 말단에 신호 서열을 부착하기 위해서 제2의 PCR 순환을 수행했다. 사용된 프라이머는: atg gaa acc cca gcg cag ctt ctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca gtt tca gat acc act gga gaa ata gtg atg ac, 및 tca gtt gaa gct ctt tgt gac였다. 열순환기 셋팅은: 2분동안 95℃, 3분동안 50℃, 및 30초동안 72℃에서 개시한 다음, 30초동안 95℃, 30초동안 55℃, 30초동안 72℃에서 40회였다. 생성물을 다시 겔 정제하고 pTargeT 포유동물 발현 벡터(Promega pTargeT 벡터 시스템 Cat. No.A1410)에 리게이션했다. 리게이션된 DNA로 JM109 세포를 형질전환시켰다. LB/암피실린 플레이트상에서 하룻밤동안 배양한 후에, 10 개의 콜로니를 모아서 플라스미드 DNA의 미니-프렙 을 제조했다.
특정 항체의 스크리닝
경쇄 cDNA 및 그것의 각각의 중쇄 cDNA의 수집물을 세포 표면 전개 항체의 발현을 위해서 CHO-k1 세포로 공동트랜스펙션시켰다. CHO-k1 세포주를 Bio-Whitaker로부터 구매하여, 5% 태아 소 혈청을 함유한 F12/DMEM 에서 배양했다. CHO 세포의 35mm 디쉬를 트랜스펙션시키기 위해서, B-세포 클론으로부터 제조된 경쇄 cDNA 및 그것의 각각 중쇄 cDNA, (100㎕ F12/DMEM 배지내) 경쇄 및 그것의 각각의 중쇄 cDNA 의 각각 1㎍을 7㎕ 리포펙타민 시약(Gibco BRL cat no. 1081302)을 함유하는 100㎕ F12/DMEM 과 혼합했다. 혼합물을 리포좀이 형성되도록 실온에서 30분동안 유지되도록 허용했다. 그 다음, 혼합물을 0.8 ml F12/DMEM으로 희석하였고, 무혈청 배지로 세척된 CHO 세포 단층에 첨가했다. 트랜스펙션 혼합물이 제거되기 전에, 배양물을 4 시간동안 트랜스펙션시켰고, 세포를 5% 태아 소 혈청으로 보충된 F12/DMEM 으로 배양하였다.
배양 24 시간 후에, 트랜스펙션된 CHO 세포를 PBS로 세척하였고, 15분동안 37℃에서 0.02% EDTA 로 Ca++및 Mg++결여 PBS 에서 항온처리하였다. 세포를 온화하게 분쇄하여 피펫으로 배양 디쉬로부터 분리했다. 결과의 세포 현탁액을 10분동안 1000 rpm 원심분리에 의해서 침전시켰다. 상청액을 제거한 후에, 세포 펠렛을 0.02% EDTA 및 0.5% BSA 를 가진 Ca++및 Mg++결여 PBS 에서 재현탁시켰다.
35mm 디쉬에서 배양된 hPED 세포의 단층을 1시간동안 실온에서 3% 수크로스 용액내의 0.125% 글루타르알데히드에서 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS 내에서 3회 세척하였고, 37℃에서 1시간동안 0.1M NH4HCO3내의 1%BSA 내에서 차단시켰다. 고정된 세포를 PBS로 다시 세척했다. CHO 세포 표면상에 발현된 항체가 hPED 세포에 결합하는지를 시험하기 위해서, 상기에서 제조된 트랜스펙션된 CHO 세포 현탁액을 고정된 hPED 세포에 첨가하였고, 4℃에서 하룻밤동안 항온처리했다. 비결합 세포를 흐르는 PBS로 세척했다. 결합 세포를 에탄올로 고정하기전에 즉시 제자리에서 고정하거나, PBS 내의 0.2% Triton X-100(Sigma cat no. T9284)로 용해시켰다. 고정된 배양물을 다시 통상의 고우트 혈청(PBS 내의 5%)으로 차단시켰고, 4℃에서 하룻밤동안 항-인간 IgG(H+L)-퍼옥시다제(Southern Biotechnology Associates, Inc., Cat. No. 6005-05, 1:100 희석)에서 항온처리했다. 항온처리후에, 세포를 각각 5분동안 PBS 로 3 차례, Milli-Q 물로 2 차례 헹구었다. 헹군 후에, 세포를 0.1M 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.05 및 0.003% 과산화수소(Sigma cat. No. H1009)내의 디아미노벤지딘(1mg/ml, Sigma cat. No. D 5637)내의 실온에서 20분동안 항온처리했다. 20 웰의 B 세포로부터 증폭된 20 세트의 경쇄 및 중쇄를 시험한 후에, 3세트가 hPED 세포에 특이적 결합을 보였다는 것이 발견되었다. 도4는 하나의 실시예 클론 #3를 보여주었다. 대조군으로서 인간의 면역글로불린 cDNA로 트랜스펙션되지 않은 CHO 세포계는 분석에서 네거티브 염색을 보였다(패널 A). CHO 세포는 hPEC 세포에 결합된 클론 #3로부터 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 cDNA로 코트랜스펙션되었고, 인간의 면역글로불린에 대하여 특이적 염색을 보였다(패널 B). 코트랜스펙션된 CHO 세포의 결합이 세포 표면상의 인간 항체의 특이적 결합을 제외한 메카니즘에 의한 가능성을 배제하기 위해서, 결합된 CHO를 고정전에 Triton X-100 용액에서 용해시켰다. 그러므로, hPED 세포에 특이적으로 결합된 인간 항체만이 제자리에 남아서, 갈색 염색으로 염색된다(패널 C). CHO 세포 표면상에 발현된 항체는 pPED 세포에 특이적으로 결합한다.

Claims (41)

  1. (a) 다수의 비-형질전환 포유동물 B 림프구를 포함하는 포유동물 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계; (b) 소망의 항원에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 포유동물 B 림프구를 선택하는 단계; (c) 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 포유동물 단일클론 항체를 생산하는, 다수의 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하기 위하여 B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양하는 단계; 및 (d) 선택적으로, 비-형질전환 B 세포 클론을 분리하는 단계를 포함하는, 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 포유동물 단일클론 항체의 제조방법.
  2. (a) 다수의 비-형질전환 인간 B 림프구를 포함하는 인간 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계; (b) 소망의 항원에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 인간 B 림프구를 선택하는 단계; (c) 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 인간 단일클론 항체를 생산하는, 다수의 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하기 위하여 B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양하는 단계; 및 (d) 선택적으로, 비-형질전환 B 세포 클론을 분리하는 단계를 포함하는, 소망의 항원에 대하여 면역반응성인 인간 단일클론 항체의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 비-형질전환 B 세포를 선택하는 단계는 B 림프구의 소망의 항원과의 특이적 결합에 적당한 조건하에서 포유동물 림프구 집단을 소망의 항원과 접촉시키는 단계 및 미결합 B 림프구를 소망의 항원에 결합한 B 림프구와 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 비-형질전환 B 세포를 선택하는 단계는 B 림프구의 소망의 항원과의 특이적 결합에 적당한 조건하에서 인간 림프구 집단을 소망의 항원과 접촉시키는 단계 및 미결합 B 림프구를 소망의 항원에 결합한 B 림프구와 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, (e) (d)의 분리된 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체의 중쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계; (f) (d)의 분리된 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체의 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계; 및 (g) (e)와 (f)의 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 인간 단일클론 항체 또는 그것의 항원결합 단편을 수확하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 서열은 이(二)특이적 항체, 키메라 항체, Fab, F(ab')2, 단일사슬 V 부분 단편(scFv) 및 융합 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하고, 융합 폴리펩티드는 화학적 기능 부분에 융합된 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 부분은 신호 펩티드, 면역적 반응성 증강제, 고형 지지체에 대한 커플링 촉진제, 백신 담체, 생체반응 변형제, 독소, 검출성 표지, 및 약물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 면역적 반응성 증강제는 박테리아 수퍼 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 고형 지지체에 대한 커플링 촉진제는 비오틴과 아비딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 생체반응 변형제는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 사이토카인은 종양괴사인자, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨-12, 과립백혈구 마크로파지 콜로니 촉진인자 및 γ-인터페론으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 검출성 표지는 효소, 방사성 부분, 및 발광 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항원은 생물학적 또는 화학적 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항원은 리셉터 리간드, 분비된 단백질, 세포 표면 리셉터, 세포질성 단백질, 및 핵 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항원은 온전한 세포의 표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 세포의 표면은 혈청이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서 세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 5 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 송달 운반체에 의하여 숙주 세포내에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 유전자 송달 운반체는 바이러스 벡터, 리포솜 및 플라스미드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. (a) 다수의 비-형질전환 포유동물 B 림프구를 포함하는 포유동물 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계; (b) 특정 유형의 세포에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 포유동물 B 림프구를 선택하는 단계; (c) B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양시켜 다수의 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하고, 그것에 의하여 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 포유동물 단일클론 항체의 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 특이적으로 결합하는 포유동물 단일클론 항체의 집단을 제조하는 방법.
  22. (a) 다수의 비-형질전환 인간 B 림프구를 포함하는 인간 림프구의 분리된 집단을 제공하는 단계; (b) 특정 유형의 세포에 특이적으로 결합하는 비-형질전환 인간 B 림프구를 선택하는 단계; (c) B 세포 증식에 적당한 조건하에서 (b)의 B 림프구를 배양시켜 다수의 비-형질전환 B 세포 클론을 수확하고, 그것에 의하여 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 인간 단일클론 항체의 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 특정 세포 유형에 대표적인 항원에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체의 집단을 제조하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, (d) 다수의 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 포유동물 단일클론 항체 집단의 중쇄 또는 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 집단을 분리하는 단계; 및 (e) 그 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 포유동물 단일클론 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 집단을 수확하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, (d) 다수의 비-형질전환 B 세포 클론으로부터의 인간 단일클론 항체 집단의 중쇄 또는 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 집단을 분리하는 단계; 및 (e) 그 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 인간 단일클론 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 집단을 수확하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21 항 또는 제 23 항의 방법에 의하여 제조되는 포유동물 단일클론 항체의 집단.
  26. 제 22 항 또는 제 24 항의 방법에 의하여 제조되는 인간 단일클론 항체의 집단.
  27. 제 23 항 또는 제 24 항의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 집단.
  28. 제 27 항에 있어서, 집단의 적어도 하나의 폴리펩티드가 화학적 기능 부분에 융합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  29. 제 28 항에 있어서, 부분은 신호 펩티드, 면역적 반응성 증강제, 고형 지지체에 대한 커플링 촉진제, 백신 담체, 생체반응 변형제, 독소, 검출성 표지, 및 약물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  30. 제 29 항에 있어서, 면역적 반응성 증강제는 박테리아 수퍼 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  31. 제 29 항에 있어서, 고형 지지체에 대한 커플링 촉진제는 비오틴과 아비딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  32. 제 29 항에 있어서, 생체반응 변형제는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  33. 제 29 항에 있어서, 사이토카인은 종양괴사인자, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨-12, 과립백혈구 마크로파지 콜로니 촉진인자 및 γ-인터페론으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  34. 제 29 항에 있어서, 검출성 표지는 효소, 방사성 부분, 및 발광 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  35. 제 29 항에 있어서 폴리펩티드는 방사성동위원소, 항종양체, 면역조절물질, 생물학적 반응 변형물질, 렉틴 및 독소로 구성된 군으로부터 선택되는 치료학적 부분으로 융합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 집단.
  36. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포는 단일층 형태로 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포는 배 또는 성체 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포는 외배엽, 내배엽 또는 중배엽 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포의 표면은 혈청이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 세포는 무-혈청 배지에서 성장되었던 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 15 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포는 박테리아, 균류, 바이러스 및 마이크로플라스마로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물로 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100850416B1 (ko) * 2006-06-21 2008-08-04 남상윤 자가세포 파괴에 의해 야기되는 자가면역질환의 치료를위한 세포치료제 및 그 제조 방법

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541225B1 (en) * 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
US6794141B2 (en) * 2000-12-22 2004-09-21 Arcturus Bioscience, Inc. Nucleic acid amplification
US20030096414A1 (en) * 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
JP2007514752A (ja) * 2003-12-16 2007-06-07 ソシエテ・ドゥ・コンセイユ・ドゥ・ルシェルシュ・エ・ダプリカーション・シャンティフィック・エス・ア・エス Ｇｌｐ−１医薬組成物
US7855074B2 (en) * 2004-04-28 2010-12-21 Vaxdesign Corp. Artificial immune system: methods for making and use
US7785806B2 (en) * 2004-04-28 2010-08-31 Vaxdesign Corporation Method for determining the immunogenicity of an antigen
US7709256B2 (en) * 2004-04-28 2010-05-04 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US7771999B2 (en) * 2004-04-28 2010-08-10 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US8298824B2 (en) 2004-04-28 2012-10-30 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corporation Methods of evaluating a test agent in a diseased cell model
US8030070B2 (en) * 2004-04-28 2011-10-04 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Artificial lymphoid tissue equivalent
US7785883B2 (en) * 2004-04-28 2010-08-31 Vax Design Corp. Automatable artificial immune system (AIS)
US8071373B2 (en) 2004-04-28 2011-12-06 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Co-culture lymphoid tissue equivalent (LTE) for an artificial immune system (AIS)
AU2005252699B2 (en) * 2004-06-07 2010-12-23 Macrogenics West, Inc. Transferrin receptor antibodies
WO2006084078A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Jam-3 and antibodies that bind thereto
JP5328156B2 (ja) * 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
ATE551367T1 (de) * 2005-02-04 2012-04-15 Macrogenics West Inc Epha2-bindende antikörper und verfahren zu ihrer verwendung
WO2007003041A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 John Schrader Methods of isolating cells and generating monoclonal antibodies
JP2009521228A (ja) * 2005-12-21 2009-06-04 ヴァックスデザイン コーポレーション 単球の樹状細胞への分化を促進する多孔質膜デバイス
AU2006331504A1 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 Vaxdesign Corporation In vitro germinal centers
WO2008094178A2 (en) * 2006-06-27 2008-08-07 Vaxdesign Corporation Models for vaccine assessment
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
WO2009009424A2 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 Vaxdesign Corporation Rapid generation of t cell-independent antibody responses to t cell-dependent antigens
US8647837B2 (en) * 2007-07-16 2014-02-11 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Artificial tissue constructs comprising alveolar cells and methods for using the same
AU2008284015B2 (en) 2007-08-03 2014-05-15 Musc Foundation For Research Development Human monoclonal antibodies and methods for producing the same
WO2009054556A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Sang Yun Nam Method for preparation of therapeutic b cells against autoimmune diseases which are induced by autoimmune cytotoxicity
JP5414535B2 (ja) * 2007-12-03 2014-02-12 株式会社アドバンス １本鎖抗体ｓｃＦｖの製造方法
WO2009105150A2 (en) * 2008-01-28 2009-08-27 Thomas Jefferson University Method of making hybrid cells that express useful antibodies
EP2252631B1 (en) 2008-04-02 2016-04-13 MacroGenics, Inc. Bcr-complex-specific antibodies and methods of using same
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
US9150656B2 (en) 2010-03-04 2015-10-06 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
EP2400298B1 (en) * 2010-05-28 2013-08-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Single B-cell cultivation method and specific antibody production
WO2012175741A2 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
TWI477603B (zh) * 2011-01-28 2015-03-21 Hon Hai Prec Ind Co Ltd 培育基體之製備方法
SI2723769T2 (sl) 2011-06-23 2022-09-30 Ablynx Nv Tehnike za napovedovanje, zaznavanje in zmanjševanje nespecifične motnje proteina v testih, ki vključujejo domene imunoglobulina z eno spremenljivko
JP2014518080A (ja) * 2011-06-27 2014-07-28 バルネバ 細胞のスクリーニング方法
CN102321720B (zh) * 2011-07-28 2014-09-03 万晓春 一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
US9395367B1 (en) 2016-02-29 2016-07-19 Rarecyte, Inc. Method to identify antigen-specific B cells for antibody development
US10222373B2 (en) 2016-02-29 2019-03-05 Rarecyte, Inc. Method to identify antigen-specific immune cells
US9442113B1 (en) 2016-02-29 2016-09-13 Rarecyte, Inc. Method to identify antigen-specific immune cells for therapeutic development
KR102514317B1 (ko) 2016-04-15 2023-03-27 마크로제닉스, 인크. 신규 b7-h3-결합 분자, 그것의 항체 약물 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
TW202016144A (zh) * 2018-06-21 2020-05-01 日商第一三共股份有限公司 包括cd3抗原結合片段之組成物及其用途

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4643971A (en) * 1983-03-11 1987-02-17 Sloan-Kettering Institute Monoclonal antibodies to human bladder and ureter cancers and method
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0218158A3 (en) 1985-09-30 1988-12-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Human monoclonal antibody, B-cell line for producing this antibody and method for preparing this B-cell line and antibody.
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2103770T3 (es) * 1990-11-26 1997-10-01 Akzo Nobel Nv Procedimiento de produccion de anticuerpos monoclonales.
US5256542A (en) * 1992-03-09 1993-10-26 Tanox Biosystems, Inc. Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
CA2149529C (en) 1992-11-16 2006-05-02 Fernado J. R. Do Couto Peptides and anti-sense peptides with broad neoplastic specificity
GB9526131D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US5882644A (en) * 1996-03-22 1999-03-16 Protein Design Labs, Inc. Monoclonal antibodies specific for the platelet derived growth factor β receptor and methods of use thereof
IL122233A (en) * 1996-12-06 2001-04-30 Akzo Nobel Nv Method of generating monoclonal antibodies to cell wall and pharmaceutical preparations and diagnostic agents containing them
CA2290485C (en) * 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6004528A (en) * 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
US6541225B1 (en) * 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100850416B1 (ko) * 2006-06-21 2008-08-04 남상윤 자가세포 파괴에 의해 야기되는 자가면역질환의 치료를위한 세포치료제 및 그 제조 방법

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