KR20020063853A - 단백질 분체의 제조 방법 - Google Patents

단백질 분체의 제조 방법 Download PDF

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도엔다까유끼
아사까와나오끼
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

단백질 함유 용액을 약 -300 내지 -10℃/분의 냉각속도로 동결시킨 후 건조하는 것을 포함하는, 고차 구조가 높은 수준으로 유지되는 안정한 단백질 분체의 편리한 제조 방법.

Description

단백질 분체의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN POWDER}
최근, 유전자 공학 및 세포 기술의 발전으로 인해, 대장균, 효모, 동물 세포, 또는 염소, 햄스터 등과 같은 생체를 이용함으로써 다량의 단백질이 생산되고 있으며, 의약적 용도에 사용되고 있다. 그러나, 이들 단백질은 산성 조건 및 소화 효소에 대해 반응성이 매우 높기 때문에, 경구 투여에 의해 흡수되지 않는다. 따라서, 통상적으로 이들은 피하 또는 근육내 투여된다. 그러나, 이들은 생물학적 반감기가 통상 짧기 때문에 빈번히 투여되어야 한다. 반복적인 주사는 환자에게 현저한 신체적 부담을 준다.
예를 들어, 뇌하수체 전엽에서 본래 생성되고 분비되는 대표적인 호르몬인, 성장 호르몬(이하, 때때로 GH 로 칭함)은 신체의 성장 촉진, 당과 지질의 대사, 단백질 동화, 및 세포의 증식과 분화와 같은 매우 다양한 생리적 활성을 갖는 단백질이다. 또한, GH 는 최근, 유전자 재조합 기술 분야에서 대장균을 이용함으로써 대규모로 생산되어, 임상학적으로 그리고 전세계적으로 의약적 용도에 사용되고 있다. 그러나, GH 는 생물학적 반감기가 짧기 때문에 유효 혈중 수준을 유지하기 위해서는 빈번히 투여되어야 한다. 특히, 뇌하수체성 소인증의 경우, 유아 또는 젊은 환자에 대한 수개월 내지 10년 이상의 장기간에 걸친 연일 피하 투여가 실제로 수행된다.
단백질 의약품의 이와 같은 특유한 문제점을 다루기 위하여, 약물 전달 체계에 대한 다양한 연구가 행해졌다. 상기 체계의 한 예가 단백질 방출을 장기간에 걸쳐 유지하는 서방성 제제이다. JP-A 8-217691 (WO 96/07399)에는 수용성 펩티드 형의 생리적 활성 물질 및 염화아연 수용액 등을 사용하여 제조된 수불용성 또는 수난용성 다가 금속염, 및 생분해성 폴리머를 함유한 서방성 제제의 제조 방법이 개시되어 있다. 또한, JP-A 8-503950 (WO 94/12158)에는 인간 GH(이하, 때때로 hGH로 칭함) 및 생분해성 폴리머를 함유한 서방성 제제의 제조 방법으로서, hGH 및 폴리머의 유기 용매 용액을 액체 질소 내로 분무함으로써, 생물학적 활성이 유지되고 있는 다공성 입자로서의 마이크로캡슐을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, JP-A 10-504017 (WO 95/29664)에는 고체 탄산아연 등을 중합체 용액으로 분산시킨 후, 생리적 활성 물질(호르몬 등)을 이에 첨가하여, 생리적 활성 물질 및 금속 양이온을 개별적으로 생분해성 폴리머에 분산시킴으로써 서방성 마이크로캡슐을 제조하는 방법이 개시되어 있다. JP-A (WO 98/27980) 및 JP-A 10-7538 (WO 97/01331) 에는 생리적 활성 폴리펩티드 함유 서방성 제제의 제조 방법이 개시되어 있으나, 생리적 활성 폴리펩티드의 동결건조에 대한 조건이 개시되어 있지 않다.
따라서, 단백질의 생리적 활성이 유지되는 약물 전달 체계를 구축하기 위한많은 시도가 있어 왔다. 그러나, 고차 구조를 갖는 단백질에 있어서의 특유의 문제점으로서, 제제의 제조 단계 동안의 변성, 제제에서의 시간에 따른 단백질 변화로 인한 변성, 및/또는 투여 이후 생체내 변성 등으로 발생되는 단백질의 안정성에 관한 문제가 있을 가능성이 있다. 구체적으로, 제제로의 단백질 주입의 낮은 효율, 투여 초기 단계에서의 약물의 과도한 방출, 장기간에 걸친 약물 방출 제어의 어려움, 제제 투여 이후 약물의 낮은 혈중 수준 등과 같은 서방성 제제의 문제점이 해결되지 않고 남아있을 가능성이 있다.
그러나, 단백질을 미분 분체의 형태로 제조할 수 있으면, 분자 운동성의 저하로 인해 단백질의 안정성이 보다 향상될 것으로 기대된다.
JP-A 4-500527 (WO 90/13285) 에는 단백질 수용액을 액화 가스 내로 분무하여 용액을 동결시킨 후 건조함으로써 미분 단백질 분체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
또한, [Journal of Pharmaceutical Science, Vol. 87, p 152 (1998)]는 분무 건조에 의한 미분 단백질 분체의 제조 방법을 보고한다. 그러나, 상기 보고는, 분무에 의해 형성된 단백질 수용액 입자의 입자 크기와 역상관적으로 변성도가 증가하며, 이를 제어하기 위해 다량의 계면활성제가 첨가되어야 한다고 개시하고 있다.
또한, 본 출원의 우선일 이후에 공개된, WO 99/48519 에는 수혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성 염을 생리적 활성 폴리펩티드 수용액에 첨가하고 이 용액을 동결건조시킴으로써 생리적 활성 폴리펩티드 분체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
또한, JP-A 9-248177 는 빙점 이하로 냉각된 금속판 상에 미생물 세포 배양물의 액적을 적하하여 세포를 급속히 동결시킴으로써 건조된 미생물 세포를 제조하는 방법을 개시하고 있다.
통상적으로, 동결건조의 냉각속도는 -10℃/분 미만이다. 예를 들어, 의약품의 동결건조 (Yoji OHOHASHI, 제제 및 기계, 8 페이지, 1988년 1월 15일, Crest, Co., Ltd. 출판)는 하기와 같이 기술하고 있다. "통상의 바이알로의 동결건조에서, 급속 동결을 수행하거나, 또는 유리질 상태를 형성할 정도로 높은 농도로 당류를 함유한 용액을 사용하는 것은, 특수 기구를 사용하지 않는한, 매우 빈번히 이루어지지 않는다. 즉, 냉각속도는 0.3 내지 5.0℃/분이다." 반면에, 수용액을 액체 질소 등과 같은 액화 가스 내로 분무하는 경우, 냉각속도는 극히 빠른데, 예를 들어 액체 질소의 경우 -300℃/분 초과이다.
본 명세서에서 사용된 냉각속도에서의 - 기호는 단순히 냉각을 표현하고자 하는 것이다. 따라서, 예를 들어, -300℃/분의 냉각속도란 측정될 물질이 1 분당 300℃만큼 냉각되는 것을 나타내며, 측정될 물질이 30 초에 150℃만큼 냉각된 경우, 냉각속도가 -300℃/분으로 나타내어진다. 보다 구체적으로, 측정될 물질이 30초에 20℃에서 -130℃로 냉각된 경우, 냉각속도가 -300℃/분으로서 나타내어진다.
분무 건조와 마찬가지로, 단백질 용액을 액화 가스 내로 분무하여 그 용액을 동결한 후 건조하는 것을 포함하는 단백질 분체의 제조 방법에서, 단백질 변성이 야기될 가능성이 높다. 또한, 액화 가스가 액체 냉매로서 사용되기 때문에, 온도차로 인한 기구재료의 팽창과 수축 및 단열, 무균 상태의 유지, 액화 가스의 배출 등에 대항하기 위해 대규모 고가의 설비가 요구된다.
또한, 다량의 계면활성제를 사용함으로써 평균 입자 크기가 수 마이크론인 미분 단백질 분체 생성물이 얻어질 수는 있지만, 다량의 계면활성제 사용으로 인해 생성물의 용도가 제한된다.
그러므로, 그의 고차 구조를 유지하는 안정한 단백질 분체를, 액화 가스와의 접촉이 없이 간편하게 제공하는 것이 요구된다.
본 발명은 단백질 분체의 제조 방법 및 이 단백질 분체를 함유한 서방성 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 기재를 함유한 서방성 제제 등에 관한 것이다.
도 1 은, hGH 분체(이는 각각 도포 [도포량: 10 mL/5 분(- ▲-), 60 mL/5 분(- ●-)] 및 분무 [분무량: 50 mL/5 분(-△-), 80 mL/5 분(- ○-)]에 의해 hGH 함유 용액을 동결시켜 수득한 hGH 분체)를 사용하여 제조한 마이크로캡슐을 면역 억제 SD 래트(rat)에 투여한 이후 hGH 혈청 수준 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은, 상기 문제를 해결하기 위하여 연구하였고, 단백질 분체 제조시, 단백질 함유 용액 동결을 위한 냉각속도를 제어함으로써, 그의 고차 구조를 유지하는 단백질 분체가 수득될 수 있다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 수득된 단백질 분체를 세립화(atomizing)함으로써 미분 분체가 수득될 수 있다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 수득된 단백질을 서방성 제제의 제조에 사용하는 경우, 제제의 단백질 포집율, 투여초기 단계에서의 약물의 과도한 방출, 및 서방성이 개선될 수 있다는 사실도 발견하였다.
또한, 본 발명자들은, 용액의 동결시 단백질 함유 용액을 도포 또는 적하함으로써 냉각속도를 제어하여 그의 고차 구조가 고도로 유지되는 단백질 분체가 수득될 수 있다는 사실을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은, 의약물의 동결건조에 통상 사용되는 동결건조기의 선반을 사용하여 상기 동결을 수행함으로써 목적 생성물이 저가로 보다 간편하게 수득될 수 있다는 사실도 발견하였다.
상기 발견을 기초로, 본 발명자들은 본 발명을 완결하였다.
다시 말해서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
(1) 단백질 함유 용액을 냉매 담체와 접촉시켜 그 용액을 약 -300 내지 -10℃/분의 냉각속도로 동결시킨 후 건조하는 것을 포함하는, 단백질 분체의 제조 방법;
(2) 상기 (1)에 있어서, 단백질 함유 용액을 냉매 담체 상에 도포 또는 적하하는 것을 특징으로 하는 방법;
(3) 상기 (2)에 있어서, 약 0.1 내지 40 mm 직경의 적하 유체를 도포 또는 적하하는 것을 특징으로 하는 방법;
(4) 상기 (1)에 있어서, 단백질 함유 용액이 액체 냉매와 직접 접촉하는 것을 방지하는 것에 의해 동결이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법;
(5) 상기 (1)에 있어서, 단백질 함유 용액에 휘발성 염 또는 수혼화성 유기 용매를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법;
(6) 상기 (5)에 있어서, 휘발성 염이 암모늄 아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법;
(7) 상기 (1)에 따른 방법으로 수득가능한 단백질 분체;
(8) 상기 (7)에 있어서, 단백질의 분자량이 약 5,000 내지 1,000,000 달튼(dalton)인 것을 특징으로 하는 단백질 분체;
(9) 상기 (7)에 있어서, 단백질이 호르몬, 사이토킨, 조혈 인자, 성장 인자및 효소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 분체;
(10) 상기 (7)에 있어서, 단백질이 성장 호르몬 또는 인슐린인 것을 특징으로 하는 단백질 분체;
(11) 상기 (7)에 있어서, 단백질이 단백질 함유 용액 중의 α-헬릭스(α-helix) 총함량에 대하여 45% 이상의 α-헬릭스를 유지하는 것을 특징으로 하는 단백질 분체;
(12) 상기 (7)에 따른 단백질 분체를 세립화하는 것을 포함하는 미분 단백질 분체의 제조 방법;
(13) 상기 (12)에 있어서, 평균 입자 크기가 약 0.5 내지 20 ㎛ 인 미분 단백질 분체가 수득되도록 세립화가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법;
(14) 상기 (12)에 따른 방법으로 수득된 미분 단백질 분체를 함유하는 서방성 제제;
(15) 상기 (14)에 있어서, 서방성 제제의 기재가 생체에서 유래된 물질 또는 합성 폴리머인 것을 특징으로 하는 서방성 제제;
(16) 상기 (15)에 있어서, 생체에서 유래된 물질 또는 합성 폴리머가 생분해성 폴리머인 것을 특징으로 하는 서방성 제제;
(17) 락트산/글리콜산의 몰비가 60/40 내지 70/30인 락트산/글리콜산 공중합체 및 성장 호르몬을 함유하는 서방성 제제;
(18) 상기 (12)에 따른 방법으로 수득한 미분 단백질 분체를 사용하는 것을 포함하는 서방성 제제의 제조 방법;
(19) 서방성 제제의 제조를 위한 상기 (7)에 따른 미분 단백질 분체의 용도;
(20) 상기 (1)에 있어서, 단백질 함유 용액이 분무에 의해 동결되지 않는 것을 특징으로 하는 방법;
(21) 상기 (1)에 있어서, 단백질 함유 용액이, 도포 또는 적하 이전에 약 -25℃ 이하로 냉각된 냉매 담체 1300 ㎠ 에 대해 약 10 내지 250 mL/5분의 속도로 도포 또는 적하되는 것을 특징으로 하는 방법;
(22) 상기 (1)에 있어서, 건조가 감압 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법; 및
(23) 상기 (1)에 있어서, 동결이 동결건조기의 선반을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명에 사용될 단백질은 천연 생성물, 합성 생성물, 반합성 생성물 및 유전자 재조합 기술로 제조한 것들 등과 같은 임의 단백질일 수 있다. 또한, 이들의 유도체, 유사체 및 뮤테인(mutein)도 포함될 수 있다. 통상적으로, 다량의 고순도 단백질을 얻기 위해서는, 유전자 재조합 기술이 빈번히 사용된다.
본 발명에 사용될 단백질의 예로는 분자량이 바람직하게는 약 5,000 내지 1,000,000 달튼, 더욱 바람직하게는 약 6,000 내지 약 200,000 달튼인 것들이 포함된다.
본 발명에 사용될 단백질의 구체적 예로는 호르몬, 사이토킨, 조혈 인자, 성장 인자 등이 포함된다.
전술한 호르몬은 임의의 작동성(agonistic) 및 길항성 기능을 갖는 것들일 수 있다. 상기 호르몬의 예로는 인슐린, 성장 호르몬 (GH), 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체형성 호르몬 (LH), 난포 자극 호르몬 (FSH), 인간 융모성 성선자극 호르몬 (HCG), 티모신(thymosin), 부갑상선 호르몬 (PTH) 등이 포함된다. 상기 호르몬은 바람직하게는 인슐린 및 성장 호르몬, 더욱 바람직하게는 성장 호르몬이다.
성장 호르몬의 예는 임의 종에서 유래된 것들, 바람직하게는 인간에게서 유래된 것들일 수 있다. 본 발명에 사용될 성장 호르몬은 뇌하수체 전엽 등에서 추출한 성장 호르몬과 같이 천연 공급원에서 유래된 것들일 수 있지만, 이들은 바람직하게는 유전자 재조합형 GH (JP-B 6-12996, JP-B 6-48987), 더욱 바람직하게는 N-말단에 메티오닌을 포함하지 않는 천연 발생형의 구조와 동일한 구조를 갖는 재조합형 hGH 이다. N-말단에 메티오닌을 포함하지 않는 천연 발생형의 구조와 동일한 구조를 갖는 상기 hGH 는 JP-A 10-72489 (EP-A 812856) 또는 WO 00/20439 에 기술된 방법에 따라 얻어질 수 있다. GH 는 금속염(금속 착물 포함; 금속은 아연 등임)일 수 있으며, 실질적으로 금속이 없는 GH 도 또한 사용될 수 있다. hGH 로서, 분자량이 약 22 k달튼인 것 뿐만 아니라 분자량이 약 20 k달튼인 것 (JP-A 7-101877, JP-A 10-265404)이 사용될 수 있다. 또한, hGH 로서, hGH의 유도체 또는 이의 관련 단백질 (WO 99/03887)도 사용될 수 있다.
사이토킨으로는 예를 들어, 림포킨 및 모노킨 등이 포함된다. 림포킨의 예로는 인터페론 (알파, 베타 및 감마) 및 인터류킨 (IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) 등이 포함된다. 모노킨의 예로는 인터류킨-1 (IL-1), 종양 괴사 인자 (TNF) 등이 포함된다. 바람직한 사이토킨은 림포킨 등이며, 더욱 바람직한 것은 인터페론 등이고, 특히 바람직한 것은 인터페론-α이다.
조혈 인자의 예로는 에리트로포이에틴 (EPO), 집락 자극 인자 (G-CSF, GM-CSF, M-CSF 등), 트롬보포이에틴 (TPO), 혈소판 유래 성장 인자, 거핵세포 강화인자 등이 포함된다.
성장 인자의 예로는 염기성 및 산성 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 및 이들의 패밀리(예컨대, EGF, TGF-α, TGF-β, PDGF, 산성 FGF, 염기성 FGF, FGF-9 등), 간 세포 성장 인자 (HGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 신경 성장 인자 (NGF) 및 이의 패밀리(예컨대, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF, GDNF 등), 인슐린형 성장 인자 (예컨대, IGF-1, IGF-2 등) 및 골 형성(bone morphogenetic) 단백질 (BMP) 및 이의 패밀리 등이 포함된다.
효소의 예로는 슈퍼옥시드 디스무타아제 (SOD), 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA), 아스파라기나아제, 칼리크레인 등이 포함된다.
또한, 본 발명에 사용될 단백질로는 티모포이에틴(thymopoietin), 혈액 흉선인자 (FTS) 및 이의 유도체 (US 특허 제 4,229,438 호), 기타 흉선 인자 [의학의 추이(Igaku no Ayumi), Vol.125, No.10, pp. 835∼843 (1983)] 등이 포함된다.
본 발명에 사용된 단백질은 바람직하게는 호르몬, 더욱 바람직하게는 성장 호르몬 및 인슐린이며, 특히 바람직한 것은 인간 성장 호르몬이다.
본 발명에서, 단백질은 금속을 함유할 수 있다. 단백질이 금속을 함유하는 경우, 금속의 함량은 바람직하게는 0.1%(w/w) 이하, 더욱 바람직하게는 0.01%(w/w) 이하, 가장 바람직하게는 0.001%(w/w) 이하이다. 따라서, 실질적으로 금속이 없는 생리적 활성 폴리펩티드가 본 발명에 가장 적합하다. 예를 들어, 결정성 인슐린은 일반적으로 아연, 니켈, 코발트 및 카드뮴 등과 같은 중금속을 소량 함유한다. 0.4%(w/w) 아연을 함유한 인슐린은 안정한 6량체(hexamer)로서 존재하며, 생분해성 폴리머의 금속염과의 상호작용에 대해 비교적 불활성인 것으로 나타난다.
필요한 경우, 단백질에서 발생한 금속을 미리 제거할 수 있다. 단백질에 대한 금속 제거 방법으로서, 공지의 방법이 사용된다. 예를 들어, 인슐린의 산성 염산 수용액을 물 또는 암모늄 아세테이트 수용액에 대하여 투석하고 투석물을 동결건조하여 최소 금속 함량의 무정형 인슐린을 제공할 수 있다.
목적 단백질을 조직, 체액, 화학합성 조(粗) 제조물, 또는 재조합 세포나 재조합 균체로부터 퍼어지 또는 정제하는 것이 필요한 경우, 표준 단백질 단리 또는 정제 방법이 채용될 수 있다(["단백질", Kazuo SATAKE 저, Asakura Shoten 출판]; ["생리적 활성 펩티드", Pharmacia Review, No.3, Pharmaceutical Society of Japan 출판]). 특히, 일부 액체 크로마토그래피를 조합함으로써("단백질 또는 펩티드의 고속 액체 크로마토그래피", Nobuo UI 등 편집, Kagakudojin 출판), 고순도의 단백질을 생리적 활성의 손실없이 고수율로 수득하는 것이 가능하다. 필요한 경우, 정제 방법의 최종 단계로서 탈염 단계가 바람직하게는 채용될 수 있다.
본 발명의 단백질 함유 용액의 용매는 단백질을 용해시킬 수 있는한, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 용매는 빙점이 -130℃ 이상인 것이다. 이의 구체적 예로는 물, 알콜(예컨대, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등), 아세톤, 물과 상기 알콜의 혼합 용매, 물과 유기 용매(예컨대, 아세톤 등)의 혼합 용매 등이 포함된다. 바람직하게는, 물이 사용된다. 알콜, 아세톤 등과 같은 유기 용매는 이하 기술되는 "수혼화성 유기 용매"로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 휘발성 염 또는 수혼화성 유기 용매가 상기 용매를 사용한 단백질 함유 용액에 첨가된다. 휘발성 염 또는 수혼화성 유기 용매를 첨가하여 수득한 단백질 함유 용액을 동결건조함으로써, 취급이 용이하고(조작성이 우월하고) 매우 미세한(보다 작은 입자 크기를 가지는) 단백질 분체를 제조하는 것이 가능하다.
단백질 함유 용액에 첨가될 수 있는 휘발성 염으로서, 예를 들어 암모늄염(예컨대, 암모늄 아세테이트, 중탄산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄 등, 바람직하게는 암모늄 아세테이트 등)이 있다. 휘발성 염은 적절한 비율로의 이의 부가혼합물로 사용될 수 있다. 단백질 함유 용액에 대한 휘발성 염의 첨가량은 예를 들어, 몰비로서 약 1 내지 약 80배 몰(특히, 약 10 내지 약 80배 몰), 바람직하게는 약 10 내지 약 70배 몰, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 70배 몰, 더더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 50배 몰, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 40배 몰이다.
단백질 함유 용액에 첨가될 수 있는 수혼화성 유기 용매의 예로는 상기 알콜, 아세톤 등이 포함된다. 상기 유기 용매는 적합한 혼합비를 갖는 이의 부가혼합물로 사용될 수 있다. 바람직한 유기 용매는 알콜이며, 더욱 바람직한 것은 에탄올 단독이다. 수혼화성 유기 용매의 첨가량(농도)은 부피비로 약 0.03 내지 0.5%(V/V), 바람직하게는 약 0.06 내지 0.25%(V/V), 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 0.15%(V/V) 이다.
단백질 함유 용액에 첨가되는 수혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성 염은 단독으로, 또는 그의 부가혼합물로 사용될 수 있다. 수혼화성 유기 용매 및 휘발성 염이 그의 부가혼합물에서 사용되는 경우, 이들은 각각 상기 양에 따라 단백질 함유 용액으로 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 휘발성 염이 단백질 함유 용액에 첨가된다. 더욱 바람직하게는, 암모늄 염이 첨가되며, 더더욱 바람직하게는 암모늄 아세테이트가 첨가된다.
동결에 적용될 단백질 함유 용액의 농도는 예를 들어, 0.01%(W/V) 내지 30%(W/V), 바람직하게는 0.03%(W/V) 내지 10%(W/V), 더욱 바람직하게는 0.05%(W/V) 내지 3%(W/V) 등이지만, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 단백질이 hGH 인 경우, 단백질 함유 용액 중에서의 hGH 농도는 바람직하게는 약 0.01%(W/V) 내지 약 5%(W/V), 더욱 바람직하게는 약 0.05%(W/V) 내지 약 2%(W/V), 더더욱 바람직하게는 약 0.05%(W/V) 내지 약 0.5%(W/V) 이다.
동결에 적용될 단백질 함유 용액 중의 단백질은 바람직하게는 단일 단백질이다.
본 발명에서 단백질 함유 용액의 동결 및 건조 방법은 구체적으로 제한되지 않는다. 그러나, 감압하 건조(예컨대, 진공 건조)가 바람직하다. 예를 들어, 동결건조기를 사용하여 연속 단계에서 동결건조를 수행하거나, 동결건조기를 사용하지 않고 개별적으로 동결시킨 단백질 함유 용액을 동결건조기로 건조할 수 있다.
동결에 사용될 기구는 구체적으로 제한되지 않는다. 그러나, 단백질 분체의 경제적이고 간편한 제조에 대한 관점에서, 의약물의 주사용 제제의 동결건조에 통상 사용되는 동결건조기의 선반(동결건조기 선반)을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 동결건조기의 상세한 소개는 ["의약품 제조 및 동결건조 기술", Masakazu KOBAYASHI 저, 제제 및 기계, Nos. 17∼23, 25∼35 및 38∼46]에 기술되어 있다. 이들 문헌에 따라, 통상의 염수로 냉각하는 동결건조기 선반을 사용하여 온도를 -70℃ 까지 저하시킬 수 있다. 이들 동결건조기의 예로는 Kyowa Shinkuu Gijyutsu K.K. 에서 제조된 것들(예컨대, RL 시리즈, RLC 시리즈, RLE 시리즈, R2L 시리즈, R2LW 시리즈 또는 Triomaster 시리즈), Nippon Shinkuu Gijyutsu K.K. 에서 제조된 것들(예컨대, DF 시리즈, DFM 시리즈) 등이 포함된다. 또한, 이들 동결건조기의 예비동결기는, 건조기가 주사용 제제의 제조에 맞도록, 물질이 무균무진 조건 하에 조작될 수 있게 하는 방식으로 본래 설계되기 때문에, 상기 동결건조기들은 단백질 분체의 제조에 적합하다. 액화 가스를 동결건조기의 1차 냉매로서 사용하고 2차 냉매를 통해 도입함으로써, 통상의 염수에 의해 달성되는 온도보다 더 낮게 동결건조기 선반의 온도를 추가로 저하시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 액체 질소를 1차 냉매로서 사용하고 히드로플루오로에테르 (HFE: 3M 제)를 통해 냉각함으로써, 각각, HFE-7100 (3M 제)를 사용하는 경우 -135℃로, HFE-72100 (3M 제)를 사용하는 경우 -117℃로 온도를 저하시키는 것이 가능하다. 상기 방법을 사용함으로써, 단백질 함유 용액이 액화 가스와 직접 접촉하는 것을 방지할 수 있으며, 액화 가스의 무균무진 처리의 필요성과 같은 어려운 문제점이 회피될 수 있다. 바람직한 선반 온도는 약 -130 내지 -20℃, 더욱 바람직하게는 약 -100 내지 -30℃, 더더욱 바람직하게는 약 -80 내지 -40℃ 이다. 따라서, 동결건조기 선반으로 단백질 함유 용액을 동결시킴으로써, 동결된 물질이 차례로 급속히 진공 건조 단계로 이행되는 것이 가능하다.
바람직하게는, 동결은 동결건조기 선반에 위치한 냉매 담체 상에서 수행된다. 냉매 담체는 구체적으로 한정되지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 냉매 담체는 예를 들어, 단백질 함유 용액의 도포 또는 적하를 허용하는, 판, 트레이 등, 바람직하게는 트레이 등이다. 상기 판, 트레이 등은 편평한 표면을 가진 것으로 한정되지는 않으며, 요철 또는 굽은 표면을 가질 수 있다. 상기 판, 트레이 등은 이들이 본 발명의 냉각속도를 견딜 수 있는한, 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 금속(예컨대, 스테인리스 등)으로 만들어진 냉매 담체가 사용된다. 바람직하게는, 도포 또는 적하 시작시 냉매 담체(예컨대, 트레이)의 온도는 약 -25℃ 이하(예컨대, -25 내지 -100℃, 특히 -25 내지 -50℃) 이다. 단백질 함유 용액은 이미 동결된 용액 상에 부가적으로 도포 또는 적하될 수 있다. 도포 또는 적하 시작시, 동결된 단백질 함유 용액의 표면 온도는 바람직하게는 약 -25℃이하(예컨대, -25 내지 -100℃, 특히 -25 내지 -50℃)이다. 냉매 담체 및 동결된 단백질 함유 용액의 표면 온도는, 예를 들어 온도 감지기 [예컨대, 열전쌍 (TYPE T: Okazaki Seisakusyo 제)]에 의해 측정될 수 있다.
동결건조기를 사용하지 않고 개별적으로 동결된 단백질 함유 용액을 동결건조기로 건조하는 경우, 건조는, 예를 들어 동결 용액의 동결 상태를 유지시키면서 동결 용액을 동결건조기의 선반으로 이송함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 단백질 함유 용액의 냉각속도는 특정 종류의 단백질 함유 용액, 그의 단백질 농도, 첨가제 농도 등에 따라 적절히 제어될 수 있다. 통상적으로, 본 발명에서 단백질 함유 용액의 냉각속도는 약 -300 내지 -10℃/분, 바람직하게는 약 -250 내지 -40℃/분, 더욱 바람직하게는 -210 내지 -40℃/분, 특히 -210 내지 -70℃/분이다. 본 발명에서의 냉각속도는 도포 또는 적하 이전의 단백질 함유 용액 온도, 도포 또는 적하 이후 동결시의 단백질 함유 용액 온도, 및 동결 완료시까지 필요한 시간을 기초로 산출될 수 있다. 도포 또는 적하 이후 동결시의 단백질 함유 용액의 온도는 전술한 바와 동일한 온도 감지기로 측정될 수 있다.
상기 냉각속도를 구하기 위해, 예를 들어, 도포 또는 적하 이전에 약 -25℃ 이하 (바람직하게는 약 -100 내지 -25℃, 더욱 바람직하게는 약 -100 내지 -30℃, 더더욱 바람직하게는 약 -80 내지 -40℃)로 냉각된 냉매 담체 1300 ㎠ 에 대해 약 10 내지 250 mL/5 분, 바람직하게는 약 15 내지 200 mL/5 분, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 175 mL/5 분의 속도로 단백질 함유 용액을 도포 또는 적하할 수 있다. 단백질 함유 용액의 접촉(도포 또는 적하) 속도는 상기 냉각속도가 달성될 수 있도록 하는 범위에서 적절히 선택할 수 있다. 단백질 함유 용액의 도포 또는 적하 속도는 접촉 동안 적절히 변화될 수 있다. 도포 또는 적하 동안의 냉매 온도는 약 -2℃ 등일 수 있다.
본 발명에서 도포란, 단백질 함유 용액을 액적의 형성 없이 개구부(예컨대, 단백질 함유 용액의 충진 노즐)에서 연속적 유체의 형태로 냉매 담체와 접촉시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 적하란, 단백질 함유 용액을 개구부(예컨대, 단백질 함유 용액의 충진 노즐)에서 액적 형태로의 비연속적 유체로서 냉매 담체와 접촉시키는 것을 의미한다.
도포 또는 적하시, 동결될 단백질 함유 용액의 총량을 한번에 도포 또는 적하할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 용액을 몇 부분으로 나누고, 이들을 간헐적으로 도포 또는 적하하여, 이미 동결된 부분의 온도를 저하시킴으로써, 목적 냉각속도를 유지시킨다. 단백질 함유 용액을 간헐적으로 도포 또는 적하하는 경우, 바람직하게는, 각각의 도포 또는 적하 작업을 일정 시간 간격으로 수행하여, 냉매 담체 또는 이미 동결된 부분의 온도를 -25℃ 이하로 저하시킨다.
본 발명에서 적하 유체란, 액적의 형성없이 접촉되는 전술한 연속적 유체, 및 적하시의 비연속적 유체 모두를 의미한다. 단백질 함유 용액의 도포 또는 적하시, 적하 유체의 직경(수평 단면의 최대 길이)은 예를 들어 약 0.1 내지 40 ㎜, 바람직하게는 약 0.2 내지 40 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 10 ㎜ 이다. 적하 유체는 단백질 함유 용액의 도포시 바람직하게는 원주 모양이지만, 다각형 단면(예컨대, 삼각, 사각, 오각 또는 육각 단면 등)을 갖는 주상 모양과 같이 개구부의 모양에 따라 다양한 모양을 가질 수 있다. 단백질 함유 용액의 적하시, 액적의 직경은 바람직하게는 약 0.1 내지 10 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 0.7 내지 7 ㎜, 더더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 ㎜ 이다. 단백질 함유 용액의 적하시, 개구부(예컨대, 충진 노즐)의 직경은 바람직하게는 약 0.05 내지 10 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 ㎜ 이다. 또한, 단백질 함유 용액의 적하시, 액적 중량은 바람직하게는 약 0.0005 내지 500 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 180 mg, 더더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 65 mg 이다.
본 발명에서, 단백질 함유 용액의 도포 또는 적하시 냉매 담체 상에 빙상(ice laying)을 형성시키는 것도 가능하다.
또한, 본 발명에서, 단백질 함유 용액을 층상화된 상태로 동결시키는 것도 가능하다. 상기 층은 두께가 바람직하게는 약 0.5 내지 100 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 80 ㎜, 더더욱 바람직하게는 약 3 내지 50 ㎜ 이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법으로 수득한 단백질 분체를 추가로 세립화 처리에 적용시켜, 보다 미분화된 입자를 수득한다. 세립화 처리로서, 제약학적 방법에 공지된 각종 세립화법이 사용될 수 있다. 세립화법의 예로는 제트 밀(jet mill) 방법과 같은 건식 세립화가 포함된다. 또한, 습식 세립화로서, 예를 들어, 단백질 분체를 그의 불용성 용매에 분산시키고, 분산액을 초음파처리(탐침형 또는 배스(bath)형), 교반형 세립화기(Polytron(Kinemachica 제), Minimixer, Fillmix (Tokushukika 제), Cleamix(M Tech 제)) 등으로 처리한 후, 용매를 제거한다. 본발명의 방법으로 수득한 단백질 분체를 또한 단백질 분체의 불용성 용매(예컨대, 디클로로메탄 등) 중에서 가볍게 교반 또는 진탕함으로써 세립화시킬 수도 있다.
이에 수득된 단백질 분체를 서방성 제제용으로 사용할 경우, 바람직하게는 단백질 분체를 기재(예컨대, 생분해성 폴리머 용액)에 직접 첨가한 후, 그 혼합물을 초음파처리, 교반형 세립화기 등으로 세립화 처리에 적용한다.
예를 들어, 회전 직경이 약 9 ㎜ 인 Polytron(Kinemachica 제)을 교반형 세립화기로 사용하는 경우, 바람직하게는, 세립화 처리를 바람직하게는 약 500 내지 40,000 rpm, 더욱 바람직하게는 약 1,000 내지 35,000 rpm, 더더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 30,000 rpm 의 회전수로 수행한다. 이 때, 교반은 바람직하게는 약 5초 내지 30분, 더욱 바람직하게는 약 10초 내지 20분, 더더욱 바람직하게는 약 15초 내지 10분 동안 수행된다. 예를 들어, 회전 직경이 약 9 ㎜인 Polytron (Kinemachica 제)을 교반형 세립화기로 사용하는 경우, 세립화 처리는 바람직하게는 약 500 내지 40,000 rpm 으로 약 5초 내지 30분 동안, 더욱 바람직하게는 약 1,000 내지 35,000 rpm 으로 약 10초 내지 20분 동안, 더더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 30,000 rpm 으로 약 15초 내지 10분 동안 수행된다.
세립화 처리 이후 미분 단백질 분체의 평균 입자 크기는 분체가 적용되는 특정 약물 전달 체계에 따라 변할 수 있지만, 통상적으로, 평균 입자 크기는 바람직하게는 약 0.5 내지 20 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 0.7 내지 10 ㎛, 더더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 ㎛ 이다. 본 발명의 미분 단백질 분체의 평균 입자 크기는 레이저 회절식 입도 분포 분석기 (SALD 2000A: Shimadzu 제)에 의해 측정될 수 있다. 상기 측정에서, 미분 단백질 분체를 분체의 불용성 용매(예컨대, 디클로로메탄 등) 중에 분산시킨 후, 상기 입도 분포 분석기에 의한 측정가능 범위까지 동일 용매로 적절히 희석하여, 평균 입자 크기를 측정한다.
본 발명에 의해 제조된 단백질 분체 및 미분 단백질 분체는, 본 발명의 방법에 적용시키기 이전의 단백질 함유 용액(예컨대, 단백질 함유 수용액) 중에의 단백질의 비율과 비교했을 때 조차도 단백질의 고차 구조를 높은 비율로 유지한다.
단백질 분체 및 미분 단백질 분체에서의 단백질의 2차 구조를 FT-IR 분광 분석으로 확인하는 것도 가능하다. 상기 분석은 Carpenter 등의 리뷰 (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol.45, pp 231∼238, 1998) 에 상세히 기술되어 있다. 상기 리뷰에 따르면, 2차 구조 중의 하나인 α-헬릭스의, 동결건조에 의해 수득된 단백질 분체 및 미분 단백질 분체 중에서의 함량은 단백질 수용액에서의 함량 미만으로 저하되며, 변성도가 높아질수록 α-헬릭스 함량의 저하율이 높아진다는 것이 보고되어 있다. 이에, 고차 구조의 변성도는 본 발명의 방법에 적용하기 이전의 단백질 함유 용액(예컨대, 단백질 함유 수용액) 중에의 단백질의 α-헬릭스 함량에 대한 본 발명의 방법으로 수득된 단백질 분체 또는 미분 단백질 분체의, FT-IR 분광 분석에 의해 측정한 α-헬릭스 함량의 비로 정의할 수 있다.
단백질의 변성도를 전술한 바와 같이 정의하는 경우, 본 발명으로 수득된 단백질 분체 및 미분 단백질 분체는 α-헬릭스를 바람직하게는 약 45% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상 보유한다.
본 발명으로 얻어진, 고차 구조(구체적으로, 2차 구조, 더욱 구체적으로 α-헬릭스)가 유지되는 단백질 분체 및 미분 단백질 분체는 각종 약물 전달 체계에 대해 사용될 수 있다. 이의 투여 경로의 예로는 폐를 통한 투여, 점막(눈, 구강, 코, 자궁, 질, 직장)을 통한 투여, 경구 투여, 피내, 근육내 또는 피하 주사 또는 임플란트(implantation), 장기 등으로의 주사 또는 임플란트 등이 포함된다. 단백질 분체 및 미분 단백질 분체는 그 자체로의 분체 형태로 투여될 수 있다. 대안적으로는, 이들은, 이들을 다양한 제약학적 제제(예컨대, 정제, 과립제, 서방성 제제 등), 바람직하게는 서방성 제제로 제형화하여, 투여될 수 있다. 서방성 제제는 단백질 분체 또는 미분 단백질 분체 및 후술되는 다양한 기재를 사용하여, 압착법, 분무-칠링(chilling)법, 분무건조법, 에멀션화법, 상분리법(코아세르베이션 (Coacervation)법), 수중건조법(S/O/W 법) 등에 의해 제조될 수 있다.
상기 서방성 제제의 제조에 사용될 기재는 생체에서 유래한 임의 기재 또는 합성으로 얻어진 것(예컨대, 합성 폴리머)일 수 있다. 다수의 경우, 합성 폴리머가 사용된다
생체에서 유래한 기재의 예로는 겔라틴, 콜라겐, 유지(지질, 트리글리세리드 등), 혈청에서 유래한 단백질(알부민, 글로불린 등), 케라틴, 키틴, 키토산, 풀루란, 셀룰로스(히드록시메틸 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 등) 등이 포함된다.
합성 폴리머로서, 임의의 생분해성 폴리머 및 비생분해성 폴리머가 사용될 수 있다. 그러나, 생분해성 폴리머가 바람직하게는 사용된다.
생분해성 폴리머의 예로는 α-히드록시카르복실산(예컨대, 글리콜산, 락트산등), 히드록시디카르복실산(예컨대, 말산 등), 히드록시트리카르복실산(예컨대, 시트르산 등) 등 중의 하나 이상을 무촉매 탈수 중축합에 의해 합성한, 유리 카르복실기(들)를 갖는 중합체, 이의 혼합물, 폴리-α-시아노아크릴산 에스테르, 폴리아미노산 (예컨대, 폴리-γ-벤질-L-글루탐산 등) 및 말레산 무수물 공중합체 (예컨대, 스티렌/말레산 공중합체 등)가 포함된다. 상기 중합체는 단독중합체 또는 공중합체일 수 있다. 중합은 랜덤식, 블록식 또는 그래프트식일 수 있다. 전술한 α-히드록시카르복실산, 히드록시디카르복실산 및 히드록시트리카르복실산이 이들 분자 구조 내에 광학적 활성 중심을 갖는 경우, 이들은 D-, L- 또는 DL-공간배열일 수 있다.
이들 중합체 중에서, 말단 유리 카르복실기를 갖는 생분해성 폴리머, 예컨대 α-히드록시카르복실산(예컨대, 글리콜산, 락트산 등)으로 합성한 중합체(예컨대, 락트산/글리콜산 공중합체, 폴리락트산 등) 및 폴리-α-시아노아크릴산 에스테르가 바람직하다. 생분해성 폴리머는 더욱 바람직하게는 α-히드록시카르복실산에서 합성한 중합체 등, 특히 바람직하게는 락트산/글리콜산 공중합체 등이다. 본 명세서에서, 락트산/글리콜산 공중합체 뿐만 아니라, 폴리락트산 및 폴리글리콜산과 같은 단독중합체도 때때로 간단히 락트산/글리콜산 중합체로 칭한다.
사용된 생분해성 폴리머가 락트산/글리콜산 중합체(락트산/글리콜산 공중합체 또는 단독중합체)인 경우, 이의 조합비(몰%)는 바람직하게는 약 100/0 내지 약 40/60, 더욱 바람직하게는 약 85/15 내지 약 50/50 이다.
전술한 락트산/글리콜산 중합체의 중량평균분자량은 바람직하게는 약 3,000내지 약 50,000, 더욱 바람직하게는 약 3,000 내지 약 25,000, 더더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 약 20,000 이다.
락트산/글리콜산 중합체의 분산도(중량평균분자량/수평균분자량)는 바람직하게는 약 1.2 내지 약 4.0, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5 이다.
중량평균분자량 및 분산도에 있어서, 본 명세서는, 전자는 중량평균분자량이 각각 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,050, 580 및 162 인 9개 폴리스티렌을 기준물질로서 사용한 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정한 폴리스티렌으로 환산한 것이고, 후자는 이로부터 산출된 것으로 한다. 상기 측정은 클로로포름을 이동상으로 하는 GPC 칼럼 KF804L ×2 (Showa Denko, Japan 제) 및 RI 모니터 L-3300 (Hitachi, Ltd., Japan 제)를 사용하여 수행된다.
말단 유리 카르복실기(들)를 갖는 생분해성 폴리머는 GPC 측정에 기초한 수평균분자량 및 말단기 정량에 기초한 수평균분자량이 서로 거의 일치하는 생분해성 폴리머이다. 말단기 정량에 기초한 수평균분자량은 하기와 같이 산출된다:
약 1 내지 3 g 의 생분해성 폴리머를 아세톤(25 mL) 과 메탄올(5 mL)의 혼합 용매에 용해하고, 그 용액을 실온(20℃)에서 교반하면서 페놀프탈레인을 지시제로 하여 수산화칼륨의 0.05N 알콜성 용액으로 재빨리 적정하여, 카르복실기 함량을 측정하고; 하기 식에 따라 말단기 정량에 기초한 수평균분자량을 산출한다:
말단기 정량에 기초한 수평균분자량 = 20000 ×A/B
A: 생분해성 폴리머의 질량 (g)
B: 적정 종말점에 이를때까지 첨가된 수산화칼륨의 0.05 N 알콜성 용액의 양(mL)
말단기 정량에 기초한 수평균분자량은 절대 값이지만, GPC 측정에 기초한 것은 각종 분석적 조건(예컨대, 이동상의 종류, 칼럼 종류, 기준물질, 슬라이스 폭 선택, 기준선(baseline) 선택 등)에 따라서 변할 수 있는 상대 값이며; 따라서, 이들 두 값의 절대적 수치 표현은 어렵다. 그러나, GPC 측정에 기초한 수평균분자량과 말단기 정량에 기초한 수평균분자량이 거의 일치한다는 설명은, 예를 들어, 하나 이상의 α-히드록시카르복실산으로부터 합성한 중합체에서 말단기 정량에 기초한 수평균분자량이 GPC 측정에 기초한 수평균분자량의 약 0.5 내지 약 2배, 바람직하게는 약 0.7 내지 약 1.5배의 범위 내에 들어간다는 것을 의미한다.
예를 들어, 무촉매 탈수 중축합에 의해 하나 이상의 α-히드록시카르복실산으로 합성한, 말단 유리 카르복실기(들)를 갖는 중합체의 경우, GPC 측정에 기초한 수평균분자량 및 말단기 정량에 기초한 수평균분자량이 거의 서로 일치한다. 반면에, 촉매를 사용한 고리 열림 중합에 의해 시클릭 이합체로 합성한, 실질적으로 말단 유리 카르복실기가 없는 중합체의 경우, 말단기 정량에 기초한 수평균분자량이 GPC 측정에 기초한 것보다 현저히 크다(약 2배 이상). 상기 차이는 말단 유리 카르복실기(들)를 갖는 중합체와 말단 유리 카르복실기가 없는 중합체를 명확히 구별하는 것을 가능하게 한다.
말단 유리 카르복실기(들)를 갖는 락트산/글리콜산 중합체는 그 자체의 공지 방법, 예컨대 JP-A 61-28521 에 기술된 방법(예컨대, 무촉매 탈수 중축합 반응 또는 무기 고체 산 촉매의 존재 하의 탈수 중축합 반응에 의한 방법)에 의해 제조될수 있다.
락트산/글리콜산 중합체의 분해/소실 속도는 조성비 또는 중량평균분자량에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 일반적으로 글리콜산 비율이 감소함에 따라 분해/소실이 지연되기 때문에, 글리콜산 비율을 감소시키거나 또는 분자량을 증가시킴으로써, 생리적 활성 폴리펩티드 방출 지속시간을 연장시킬 수 있다 (예컨대, 약 6개월까지). 반대로, 글리콜산 비율을 증가시키거나 또는 분자량을 감소시킴으로써, 약물 방출 지속시간을 단축시킬 수 있다 (예컨대, 약 1주까지). 1주 내지 2개월에 걸친 기간 동안 생리적 활성 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있는 서방성 제제를 얻기 위해서는, 그의 조성비 및 중량평균분자량이 전술한 범위 내에 있는 락트산/글리콜산 중합체를 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에 사용되는 생분해성 폴리머의 조성은 바람직하게는 목적하는 생리적 활성 폴리펩티드의 종류 및 목적 지속시간에 따라 선택된다. 구체적인 예로, 예를 들어 GH 가 생리적 활성 폴리펩티드로서 사용되는 경우, 생분해성 폴리머는 바람직하게는 락트산/글리콜산 중합체, 더욱 바람직하게는 락트산/글리콜산 공중합체이다. 락트산/글리콜산 공중합체에서, 락트산/글리콜산 조성비 (몰%)는 바람직하게는 약 85/15 내지 약 50/50, 더욱 바람직하게는 약 75/25 내지 약 50/50 이다. 락트산/글리콜산 공중합체의 중량평균분자량은 바람직하게는 약 8,000 내지 약 20,000, 더욱 바람직하게는 약 10,000 내지 약 20,000 이다. 또한, 락트산/글리콜산 중합체의 분산도(중량평균분자량/수평균분자량)는 약 1.2 내지 약 4.0, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5 이다.
사용되는 락트산/글리콜산 중합체는 공지 방법, 예컨대 상기 공보 등에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 중합체는 바람직하게는 무촉매 탈수 중축합에 의해 제조된 것이다. 말단기 정량에 기초한 수평균분자량 및 GPC 측정에 기초한 수평균분자량이 거의 서로 일치하는 락트산/글리콜산 중합체 (PLGA)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 조성비 및/또는 중량평균분자량이 상이한 2종의 락트산/글리콜산 중합체를 소정 비율의 부가혼합물로 사용할 수도 있다. 대표적 예는 락트산/글리콜산의 조성비(몰%)가 약 75/25 이고, 중량평균분자량이 약 10,000인 락트산/글리콜산 중합체 및 락트산/글리콜산 조성비(몰%)가 약 50/50 이고 중량평균분자량이 약 12,000인 락트산/글리콜산 공중합체의 혼합물이다. 혼합물의 이들 공중합체의 바람직한 중량비는 각각 약 25/75 내지 약 75/25 이다.
본 발명에서 사용되는 생분해성 폴리머는 전술한 생분해성 폴리머의 금속염일 수 있다. 예를 들어, WO 97/01331 에 기술된 생분해성 폴리머의 각종 다가 금속염 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 락트산/글리콜산 중합체의 다가 금속염 등(더욱 바람직하게는, 아연염, 칼슘염, 마그네슘염 등, 더더욱 바람직하게는 아연염 등)이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 다가 금속염의 금속은 생체에 대해 어떠한 악영향을 야기하지 않는한, 특별히 제한되지 않는다. 2가 염(예컨대, Fe, Zn, Cu, Ca, Mg, Al, Sn, Mn 등), 3가 염(예컨대, Fe, Al, Mn 등), 4가 염(예컨대, Sn 등) 등과 같은 다가 금속을 예로 들 수 있다.
본 명세서에서, 생분해성 폴리머는 그것이 그의 금속염인 경우에도 때때로생분해성 폴리머로서 칭해진다. 예를 들어, 또한 락트산/글리콜산 중합체는 그것이 그의 다가 금속염인 경우에도 때때로 락트산/글리콜산 중합체로서 칭해진다.
생분해성 폴리머의 상기 다가 금속염은 WO 97/01331 에 기술된 방법 또는 그 방법에 준하는 기타 방법에 의해 제조될 수 있다.
생분해성 폴리머의 다가 금속염이 아연염인 경우, 이는 또한 유기 용매 중에서의 생분해성 폴리머와 산화아연의 반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 생분해성 폴리머의 아연염은 하기 방법에 따라 제조될 수 있다.
먼저, 유기 용매 중에 생분해성 폴리머와 산화아연을 함께 존재시켜, 생분해성 폴리머-산화아연 착물의 유기 용매 용액을 제조한다. 상기 경우, 용매 중의 생분해성 폴리머 농도는 그의 분자량 또는 유기 용매의 종류 등에 의존하지만, 예를 들어, 그 농도는 약 0.1 내지 약 80%(W/W), 바람직하게는 약 1 내지 약 70%(W/W), 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 60%(W/W) 이다. JP-A 10-231252 에 기술된 바와 같이, 첨가된 산화아연의 양은 유기 용매의 종류에 따라 상이하지만, 예를 들어, 그 양은 생분해성 폴리머의 양에 대하여 약 0.001 내지 약 2%(W/W), 바람직하게는 약 0.01 내지 약 1.5%(W/W), 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1%(W/W) 이다. 생분해성 폴리머와 산화아연의 유기 용매로의 첨가 순서에 있어서, 생분해성 폴리머를 유기 용매 중에 용해시켜 제조한 용액 중으로 분체 상태로의 산화아연 또는 유기 용매에 현탁된 산화아연을 첨가하거나, 또는 반대로, 산화아연을 유기 용매 중에 현탁시켜 제조한 현탁액 중으로 생분해성 폴리머의 유기 용매 용액을 첨가할 수 있다. 생분해성 폴리머와 산화아연 모두 분체 상태로 혼합한 후, 유기 용매를 첨가할 수 있다.
서방성 제제의 제조에서 생분해성 폴리머 용해용으로 사용되는 유기 용매는 바람직하게는 비점이 120℃ 이하이다. 유기 용매의 예로는 할로겐화 탄화수소(예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 등), 알콜(예컨대, 에탄올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올 등), 에틸 아세테이트, 아세토니트릴 등이 포함된다. 이들 용매는 또한 소정 비율로의 혼합물로서도 사용될 수 있다. 단독으로 사용되는 바람직한 유기 용매로는, 예를 들어 디클로로메탄 및 아세토니트릴 등이 포함된다. 혼합물로서 사용되는 바람직한 유기 용매로는, 예를 들어 할로겐화 탄화수소(예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름 등) 및 알콜(예컨대, 에탄올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올 등) 또는 아세토니트릴의 조합물이 포함된다. 특히, 디클로로메탄과 아세토니트릴의 조합물이 널리 사용된다. 알콜 또는 아세토니트릴에 대한 할로겐화 탄화수소의 혼합비(부피비)는 약 40:1 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 1:1 의 범위이다. 특히, 탄화수소 할라이드(예컨대, 디클로로메탄 등)를 단독으로 사용하거나, 혼합비가 9:1 내지 1:1 인 탄화수소 할라이드 및 아세토니트릴로 본질적으로 이루어진 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 용액 중의 생분해성 폴리머 농도는 분자량, 유기 용매 종류 등에 따라 상이하다. 예를 들어, 약 0.01 내지 약 80%(W/W), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70%(W/W), 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 60%(W/W) 일 수 있다.
서방성 제제는, 수혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성 염이 첨가된 단백질 함유 용액(예컨대, 생리적 활성 폴리펩티드 용액)을 동결건조시켜 수득한 단백질 분체(S 상)를 유기 용매 중의 생체 유래 물질 또는 합성 폴리머(예컨대, 생분해성 폴리머)의 용액(O 상) 중에 분산시킨 S/O 분산액에서 유기 용매를 제거함으로써 제조된다. 제조 방법은, 예를 들어 (a) 수중건조법(S/O/W 법), (b) 상분리법 (코아세르베이션법), 및 (c) 분무건조법, 또는 이들 방법에 준하는 기타 방법이 있다. 이하, 예를 들어 서방성 제제로서 마이크로캡슐의 제조 방법을 기술한다.
(a) 수중건조법 (S/O/W 법)
이 방법에 따라, 먼저 수혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성 염을 단백질 수용액에 첨가한 후, 동결건조하여 단백질 분체(S 상)를 제조한다. 생분해성 폴리머를 유기 용매에 용해시킨 후, 생성된 유기 용매 용액에 상기 단백질 분체를 분산시킨다. 단백질 및 생분해성 폴리머의 비(중량비)는, 예를 들어 약 1:1000 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1:200 내지 약 1:5, 더욱 바람직하게는 약 1:100 내지 약 1:5 이다.
바람직하게는, 외부 물리적 에너지를 적용시켜, 단백질 분체를 유기 용매 용액 중에 균일하게 분산 및 세립화한다. 이를 위하여, 예를 들어 초음파 조사, 터빈 교반기, 호모게나이저 등이 사용될 수 있다. 유기 용매 용액 중 단백질의 평균 입자 크기에 있어서, 바람직하게는 약 0.5 내지 20 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 0.7 내지 10 ㎛, 더더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 ㎛ 이며, 이는 본 발명의 방법으로 수득한 단백질 분체를 사용함으로써 용이하게 달성된다.
그 후, 이에 제조된 유기 용매 분산액 (S/O 분산액)을 수성 용매 (W 상)에 추가로 첨가한 다음, 전술한 바와 동일한 외부 물리적 에너지, 예를 들어 초음파조사, 터빈 교반기, 호모게나이저 등을 적용하여, S/O/W 에멀션을 형성시킨다. 그 후, O 상의 유기 용매를 증발시켜, 마이크로캡슐을 제조한다. 수상의 부피는 O 상의 부피에 대하여, 통상적으로 약 1 내지 약 10,000배, 바람직하게는 약 2 내지 약 5,000배, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 2,000배의 수에서 선택된다.
에멀션화제가 상기 외부 수상에 첨가될 수 있다. 에멀션화제로서, 통상적으로 안정한 S/O/W 에멀션을 형성할 수 있는 임의의 것이 사용될 수 있다. 상기 에멀션화제의 예로는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 카르복시메틸 셀룰로스, 레시틴, 겔라틴, 하이알루론산 등이 포함된다. 이들 에멀션화제는 소정 비율로의 이의 부가혼합물로 사용될 수 있다. 외부 수상 중 에멀션화제(들)의 농도는 바람직하게는 약 0.001 내지 20%(W/W), 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 10%(W/W), 특히 바람직하게는 약 0.05 내지 5%(W/W) 이다.
이에 수득된 마이크로캡슐을 원심분리 또는 여과에 의해 회수하고, 마이크로캡슐의 표면에 부착된 에멀션화제(들) 등을 증류수로 세척하여 제거하고, 증류수에 재분산시키고 동결건조한다. 그 후, 필요한 경우, 마이크로캡슐 중의 물 및 유기 용매를 가온에 의해 추가로 제거한다. 가온은 감압 하에 수행될 수 있다. 가온 조건에 있어서, 가열 및 건조는, 생분해성 폴리머의 유리 전이 온도 이상이면서, 각각의 마이크로캡슐 입자 응집을 야기할 정도로 높지는 않은 온도에서 수행된다. 가열 및 건조는 바람직하게는 생분해성 폴리머의 유리 전이 온도 10℃ 미만 내지 유리 전이 온도 약 20℃ 초과 범위의 온도에서 수행된다. 유리 전이 온도는, 온도를 1분 당 10 내지 20℃의 속도로 증가시켰을 때 시차 주사 열량계를 사용하여 얻어진 중간 유리 전이점으로서 정의된다.
(b) 상분리법 (코아세르베이션법)
마이크로캡슐을 본 방법에 의해 제조하는 경우, 상기 (a)에서 기술한 S/O 분산액에 코아세르베이션제를 교반 하에 점진적으로 첨가하여, 마이크로캡슐을 침전 및 고화시킨다. 사용되는 코아세르베이션제의 양은 약 0.01 내지 약 1,000 부피배, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 500 부피배, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 약 200 부피배이다. 그것이 생분해성 폴리머 용해용 유기 용매와 혼화가능한 중합성, 광물유 또는 식물유 화합물이고, 사용된 생분해성 폴리머를 용해하지 않는한, 임의의 코아세르베이션제가 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 코아세르베이션제의 예로는, 실리콘유, 참깨유, 대두유, 옥수수유, 면실유, 코코넛유, 아마인유, 광물유, n-헥산 및 n-헵탄 등이 포함된다. 이들 중 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이에 수득된 마이크로캡슐을 여과에 의해 회수하고, 헵탄 등으로 반복 세척하여, 코아세르베이션제를 제거한다. 추가로, 상기 (a) 에서와 동일한 방식으로 세척을 수행한 후, 동결건조한다.
수중건조법 또는 코아세르베이션법에 의한 마이크로캡슐의 제조에서, 입자의 응집을 방지하기 위해 응집방지제를 첨가할 수 있다. 응집방지제의 예로, 예를 들어, 수용성 다당류, 예컨대 만니톨, 락토스, 글루코스, 전분(예컨대, 옥수수 전분 등), 하이알루론산 및 그의 알칼리 금속염; 단백질, 예컨대 글라이신, 피브린 및 콜라겐; 및 무기염, 예컨대 염화나트륨 및 인산수소나트륨 등을 사용할 수 있다.
(c) 분무건조법
마이크로캡슐을 본 방법에 의해 제조하는 경우, 상기 (a)에서 기술한 S/O 분산액을 노즐을 통해 분무건조기의 건조 챔버 내로 분무하여, 유기 용매를 매우 짧은 시간 내에 미세 액적으로 휘발시켜, 마이크로캡슐을 제조한다. 상기 노즐로는, 예를 들어 2유체 노즐형, 압력 노즐형 및 회전 디스크형 등이 포함된다. 또한 필요한 경우, 각 마이크로캡슐 입자의 응집을 방지하기 위해, 전술한 응집방지제의 수용액을 다른 노즐을 통해 분무하는 것도 유리하다. 이에 수득된 마이크로캡슐을 상기 (a)에서와 동일한 방식으로 세척하고, 필요한 경우, 가열하여(필요한 경우, 감압 하에) 물 및 유기 용매를 제거한다.
본 발명의 서방성 제제는 바람직하게는 미분 입자(마이크로 입자)의 상태이다. 왜냐하면, 서방성 제제는 피하 주사 또는 근육내 주사에 통상 사용되는 주사 바늘을 통해 적용되기 때문에, 환자가 과도한 고통을 느끼지 않도록 하기 위한 것이다. 서방성 제제의 입자 크기는, 예를 들어, 평균 입자 크기로서 약 0.1 내지 300 ㎛, 바람직하게는 약 1 내지 150 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 100 ㎛ 이다.
서방성 제제에 함유된 단백질의 양은, 예를 들어 약 0.1 내지 40%(W/W), 바람직하게는 약 0.2 내지 20%(W/W) 이다. 단백질의 평균 입자 크기는 바람직하게는 약 0.5 내지 20 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.7 내지 10 ㎛ 이하, 더더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 ㎛ 이하이다.
서방성 제제에 함유되는 생체 유래 폴리머 또는 합성 폴리머의 양은, 예를 들어 약 30 내지 99.9%(W/W), 바람직하게는 약 60 내지 97%(W/W), 더욱 바람직하게는 약 70 내지 90%(W/W)이다.
서방성 제제로부터의 단백질 초기 방출율 [투여 후 하루(24시간) 동안의 초기 방출율]은 바람직하게는 약 50% 이하, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 40%, 더더욱 바람직하게는 약 3 내지 35% 이다. 초기 방출율은 피하 투여 이후 처음 24시간 동안의 초기 방출량에 의해 산출될 수 있다. 상기 초기 방출량은, 서방성 제제의 피하 투여 이후 24시간 동안의 혈중 농도의 AUC(농도하 면적: Area Under the Concentration)를 측정하고; 그 AUC 값을, 단백질 함유 용액의 피하 투여로 얻어진 곡선인 투여량-AUC의 표준 보정 곡선에 적용함으로써 얻어질 수 있다.
예를 들어, 서방성 제제는 마이크로캡슐 형태로 사용하거나, 또는 원료 물질로서 마이크로캡슐을 사용한 각종 투여 형태로 제제화하기 위해 사용할 수 있으며, 비경구 제제(예컨대, 근육, 피하, 장기 등 내로의 주사용 제제 또는 임플란트제, 비강, 직장, 자궁 등으로의 점막 투여용 제제), 경구 제제(고형 제제, 예컨대 캡슐제(예컨대, 경질 캡슐제, 연질 캡슐제 등), 과립제, 산제 등, 액형 제제, 예컨대 현탁액 등) 등으로서 투여될 수 있다.
특히, 서방성 제제는 바람직하게는 주사용 제제이다. 예를 들어, 서방성 제제가 마이크로캡슐인 경우, 마이크로캡슐을 분산화제(예컨대, Tween 80, HCO-60 등과 같은 계면활성제, 카르복시메틸 셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 하이알루론산 등과 같은 다당류), 보존제(예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등), 등장화제(예컨대, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨, 글루코스 등) 등과 함께 현탁시킨 수성 현탁액을 사용하여 실용적인 주사용 서방성 제제를 수득하는 것이 가능하다. 또한, 마이크로캡슐을 참깨유, 옥수수유와 같은 식물유, 레시틴과 같은 인지질과 이의 혼합물, 또는 중쇄 지방산 트리글리세리드(예컨대, Miglyol 812)와 함께 현탁시킨 유성 현탁액을 사용하여 실용적인 서방성 제제를 수득하는 것도 가능하다.
서방성 제제가 예를 들어, 마이크로캡슐인 경우, 주사용 현탁액을 위한 서방성 제제의 입자 크기는 분산도 및 주사용 바늘 통과성에 대한 필요사항을 만족시키는 범위에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 입자 크기는 평균 입자 크기로서, 약 0.1 내지 약 300 ㎛, 바람직하게는 약 1 내지 약 150 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 100 ㎛의 범위 내이다.
멸균 제제로서의 상기 마이크로캡슐의 제조 방법으로는, 전 제조공정을 멸균으로 하는 방법, 감마선이 멸균제로서 사용되는 방법, 및 방부제가 제조 공정 동안 첨가되는 방법이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
서방성 제제는 낮은 독성으로 포유류(예컨대, 인간, 소, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼 등)에 안전하게 사용될 수 있다.
서방성 제제의 적응증은 사용되는 단백질에 따라 변화할 수 있다. 서방성 제제는, 인슐린이 단백질로서 사용되는 경우 당뇨병; 인터페론-α가 사용되는 경우 바이러스성 간염(예컨대, C형 간염, HBe 항원 양성 활동성 간염 등) 및 암(예컨대, 신장 암종, 다발성 골수종 등); 에리트로포이에틴이 사용되는 경우 빈혈(예컨대, 신장 투석동안의 빈혈 등); G-CSF 가 사용되는 경우 호중구감소증(예컨대, 암 요법시 등) 및 감염증; IL-2 가 사용되는 경우 암(예컨대, 혈관내피종 등); FGF 가 사용되는 경우 골절, 창상(예컨대, 욕창 등), 치주염 및 위궤양; FGF-9 가 사용되는 경우 혈소판감소증; NGF 가 사용되는 경우 노인성 치매 및 신경병증; TPA 가 사용되는 경우 혈전증; 종양 괴사 인자가 사용되는 경우 암의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, GH 함유 서방성 제제는 GH의 성장 호르몬 작용에 기초하여, 뇌하수체성 소인증 이외에도, 터너 (Turner) 증후군, 만성 신질환, 연골발육부전증, 성인 뇌하수체기능저하증 및 또한 감퇴, 예컨대 성인 성장 호르몬 결핍 (성인 GHD), AIDS 등의 치료에 적용된다. 또한, GH 는 다운(Down) 증후군, 실버(Silver) 증후군, 골형성부전증 및 연소성 만성 관절염과 같은 질환에 적용되어 탁월한 치료적 효과를 제공하는 것으로 보고되어 있기 때문에, GH 함유 서방성 제제를 이들 질환에 적용할 수 있다. 또한, GH 함유 서방성 제제는 울혈성 심부전 등의 예방 또는 치료에도 유용하다. 또한, GH 함유 서방성 제제는, 예를 들어 장기 이식시 및 AIDS 환자의 화학요법시의 조혈, 영양 개선, 신장성 빈혈, 협심증, 고지혈증, 비만증, 화상, 손상 및 궤양의 치유 촉진, 외과적 침입(수술, 외상)/수술후 초기 회복, 패혈증, 골다공증으로 인한 골절 예방, 골다공증으로 인한 골절이 있는 환자의 수술후 초기 회복, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 욕창 등에 적용될 수 있다. 또한, 상기 제제는 유약한 노인의 삶의 질(QOL)의 향상을 위한 노화방지제로서 유용할 것으로 기대되며, hGH의 신경 보호 활성에 의해 신경퇴행성 질환 (알쯔하이머(Alzheimer) 질환, 파킨슨 질환, 뇌혈관 질환 등)을 개선하고 그 진행을 억제할 것으로 기대된다. GH의 연일 피하 주사와 비교하여, GH 를 서방성 제제의 형태로 제형화함으로써 이들 질환에 대한 보다 우수한 약리학적 활성이 얻어질 수 있다.
서방성 제제의 투여량은 단백질의 종류 및 함량, 방출 지속시간, 표적 질환, 대상 동물 종 및 기타 인자에 따라 변할 수 있지만, 그 투여량은 체내 단백질 유효 농도가 유지되는 한, 임의 수준으로 설정될 수 있다. 예를 들어, 서방성 제제가 2주 방출용으로 설계된 것인 경우, 단백질 투여량은 성인 1인에 대하여 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 10 mg/체중 1kg, 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 1 mg/체중 1kg의 범위에서 적합하게 선택될 수 있다. 서방성 제제가 1개월 방출용으로 설계된 것인 경우, 단백질 투여량은 바람직하게는 약 0.0002 내지 약 20 mg/체중 1kg, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 2 mg/체중 1kg의 범위에서 적합하게 선택될 수 있다.
서방성 제제의 바람직한 투여빈도는 단백질의 종류 및 함량, 투여 형태, 방출 지속시간, 표적 질환, 대상 동물 종 및 기타 인자에 따라, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 1회, 2개월마다 1회 등에서 적합하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 서방성 제제는 1주 방출 내지 2개월 방출용으로, 더욱 바람직하게는 1주 내지 1개월 방출용으로 설계되는 것이다.
예를 들어, 약 2주의 기간 동안 단백질을 효과적으로 방출할 수 있는 서방성 제제의 경우, 서방성 제제의 기재로서 락트산/글리콜산의 몰비가 55:45 내지 45:55 (예컨대, 약 50:50)인 락트산/글리콜산 중합체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는, 락트산/글리콜산 중합체의 중량평균분자량은 약 10,000 내지15,000 (예컨대, 13,000)이다.
서방성 제제 중 활성 성분으로서의 단백질이 예를 들어, 인슐린인 경우, 당뇨병 성인 1인에 대한 투여에 대하여 투여량은 유효 성분으로서 일반적으로 약 0.001 내지 약 1 mg/체중 1kg, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 0.2 mg/체중 1kg 의 범위에서 적합하게 선택된다. 바람직한 투여 빈도는 1주 1회이다.
서방성 제제 중 활성 성분으로서의 단백질이 GH인 경우, 투여량은 GH 종류 및 함량, 방출 지속시간, 표적 질환, 대상 동물 종 및 기타 인자에 따라 변할 수 있지만, 체내 GH 유효 농도가 유지되는한, 임의 수준으로 설정될 수 있다. 전술한 질환의 치료에 있어서, 서방성 제제가 2주 방출용으로 설계된 것인 경우, GH 투여량은 안전한 투여를 위해 아동 또는 성인 1인에 대하여 약 0.01 내지 약 5 mg/체중 1kg (약 0.03 내지 약 15 IU/mg/체중 1kg), 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 1 mg/체중 1kg (약 0.15 내지 약 3 IU/mg/체중 1kg)의 범위에서 적합하게 선택될 수 있다. 바람직한 투여 빈도는 GH 함량, 투여 형태, 방출 지속시간, 표적 질환, 대상 동물 종 및 기타 인자에 따라, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 1회 등에서 적합하게 선택될 수 있다.
서방성 제제는 바람직하게는 상온 또는 냉소에서 보관된다. 더욱 바람직하게는, 서방성 제제는 냉소에서 보관된다. "상온" 및 "냉소"는 일본 약전에 정의되어 있다. 즉, "상온"은 15 내지 25℃를 의미하고, "냉소"는 15℃ 이하의 온도를 의미한다. "냉소"에 있어서, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 8℃이다.
한편, 약 3 내지 5주의 기간 동안 효과적으로 GH를 방출할 수 있는 GH 함유서방성 제제를 제공하는 것이 요구된다. 본 발명을 완료하는 동안, 본 발명자들은 서방성 제제용으로 특정 기재를 사용함으로써 약 3 내지 5주 방출용으로 설계된 GH 함유 서방성 제제가 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.
약 3 내지 5주 방출용으로 설계된 GH 함유 서방성 제제는, 예를 들어 상기의 마이크로캡슐 제조 방법에 따라 수득될 수 있다. 마이크로캡슐 제조용으로 사용될 GH 분체는 본 발명의 방법을 포함하는 임의 방법에 의해 제조될 수 있다. GH 분체의 평균 입자 크기는 바람직하게는 약 0.5 내지 20 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 0.7 내지 10 ㎛, 더더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 ㎛ 이다. 또한, GH 변성도의 정의에 있어서, GH 분체는 약 45% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상의 α-헬릭스를 보유한다.
서방성 제제의 기재로서, 락트산/글리콜산 몰비가 약 60:40 내지 70:30 (예컨대, 약 65:35)인 락트산/글리콜산 중합체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 락트산/글리콜산 중합체의 중량평균분자량은 약 10,000 내지 18,000 (예컨대, 14,500) 이다.
이에 수득된 약 3 내지 5주 방출용으로 설계된 GH 함유 서방성 마이크로캡슐을 전술한 질환의 치료를 위해 주사용 제제로서 사용하는 경우, 활성 성분으로서의 GH 투여량은 안전한 투여를 위해 아동 또는 성인 1인에 대하여, 약 0.02 내지 약 10 mg/체중 1kg (약 0.06 내지 약 30 IU/mg/체중 1kg), 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 2 mg/체중 1kg (약 0.15 내지 3 IU/mg/체중 1kg)의 범위에서 적합하게 선택될 수 있다.
실시예
본 발명을 하기의 실시예, 비교예, 참조예 및 실험예를 이용하여 보다 상세히 기술하고 있으나, 이것이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주하지 않아야 한다.
하기 실시예에서, 동결의 확인이 어려운 경우, 냉각속도 계산을 위해, 임의 단위 시간(10초 이상) 내의 온도 강하를 산출하고, 산출된 최대값을 냉각속도로 취하였다.
실시예 1
소 혈청 알부민(BSA) 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
20배 몰 당량의 암모늄 아세테이트를 BSA 수용액에 첨가하고 (BSA의 최종 농도 = 2 mg/mL), 혼합물을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 동결건조용 용액 제형물(제형물 1)을 제조하였다. 상기 용액을 10℃ 미만으로 냉각한 후, 약 0.3 내지 0.5 ㎜ 유체 직경의 이의 소정량 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 매 5분마다 도포하고, 동결건조하여(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), BSA 분체를 제조하였다. 도포 동안의 트레이 온도는 -40 내지 -30℃ 였다. 락트산/글리콜산 공중합체 (PLGA) (락트산/글리콜산 (몰비) = 약 50/50, 폴리스티렌에 대해 전환한 중량평균분자량 = 약 13,000) 1.85 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.7 mL 중 용액 (O)에 있어서, BSA 140 mg (S)을 Polytron(Kinemachica 제)으로 처리하여, 그 분체를 상기 용액 중에 분산 및 세립화하였다. 생성된 S/O 분산액 100 ㎕ 에 디클로로메탄 2.5 mL를 첨가한 후, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 레이저 회절식 입도 분석기 (SALD2000A, Shimadzu 제)로 측정하였다.
표 1 은 상기 공정에 따라 제형물 1 을 동결하여 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 도포량을 10 mL/5분 내지 80 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 1 의 평균 냉각 속도는 -108.7℃/분 (최대 -156℃/분) 내지 -35.1℃/분 (최소 -32.4℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 1.2 내지 6.1 ㎛ 로 제어하는 것이 가능하였다.
도포량 (양 (mL)/5분/트레이)
10 25 40 50 60 70 80
평균 입자 크기 (㎛) 1.2 2.8 3.1 2.5 3.5 4.2 6.1
평균 냉각속도 (℃/분) -108.7 -92.1 -66.0 -68.8 -58.3 -49.4 -35.1
실시예 2
BSA 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
실시예 1 에 기술한 바와 동일한 방식에 따라, 제형물 1 의 BSA 수용액을 제조하였다. 용액의 온도를 실온으로 조절하고, 약 0.3 내지 0.5 ㎜ 유체 직경의 이의 소정량 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 매 5분마다 도포하고, 동결건조하여(RL-603BS: Kyowa Vacuum (응축 용량 60 kg 형)), BSA 분체를 무균적으로 제조하였다. 도포 동안의 트레이 온도는 -40 내지 -30℃ 였다. 생성된 BSA 분체를 사용하여, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 2 는 상기 공정에 따라 제형물 1 을 동결하여 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 도포량을 30 mL/5분 내지 60 mL/5분으로 조절함으로써 제형물 1 의 평균 냉각속도는 -98.9℃/분(최대 -101.1℃/분) 내지 -80.6℃/분(최소 -70.3℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 1.2 내지 5.0 ㎛로 제어하는 것이 가능하였다.
도포량 (양 (mL)/5분/트레이)
30 40 50 60
평균 입자 크기(㎛) 1.2 1.9 2.4 5.0
평균 냉각속도(℃/분) -98.9 -97.7 -95.4 -80.6
실시예 3
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
20배 몰 당량의 암모늄 아세테이트를 유전자 재조합형 hGH 수용액에 첨가하고 (hGH의 최종 농도 = 2 mg/mL), 혼합물을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 동결건조용 용액 제형물(제형물 2)을 제조하였다. 상기 용액을 10℃ 미만으로 냉각한 후, 약 0.3 내지 0.5 ㎜ 유체 직경의 이의 소정량 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 매 5분마다 도포하고, 동결건조하여(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), 동결건조된 분체(이하, hGH 분체로 약기함)를 제조하였다. 도포 동안의 트레이 온도는 -40 내지 -30℃ 였다. 생성된 hGH 분체를 사용함으로써, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에서 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 3 은 상기 공정에 따라 제형물 2 를 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 도포량을 10 mL/5분 내지 86 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 2 의 평균 냉각속도가 -201.0℃/분 (최대 -203.7℃/분) 내지 -72.5℃/분 (최소 -54.6℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.4 내지 4.7 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
도포량 (양 (mL)/5분/트레이)
10 60 70 86
평균 입자 크기(㎛) 1.4 2.3 3 4.7
평균 냉각속도(℃/분) -201.0 -88.7 -84.1 -72.5
실시예 4
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 2 를 제조하였다. 온도를 실온으로 조절하고, 약 0.3 내지 0.5 ㎜ 유체 직경의 이의 소정량 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 매 5분마다 도포하고, 동결건조하여(RL-603BS: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), hGH 분체를 무균적으로 제조하였다. 도포 동안의 트레이 온도는 -40 내지 -30℃ 였다. 생성된 hGH 분체를 사용하여, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 4 는 상기 공정에 따라 제형물 2 를 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 도포량을 50 mL/5분 내지 80 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 2의 평균 냉각속도가 -84.6℃/분 (최대 -87.4℃/분) 내지 -67.3℃/분 (최소 -54.9℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 2.7 내지 5.5 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
도포량 (양 (mL)/5분/트레이)
50 60 70 80
평균 입자 크기(㎛) 2.7 2.7 3.2 5.5
평균 냉각속도(℃/분) -84.6 -80.6 -76.6 -67.3
실시예 5A
BSA 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 1 의 BSA 수용액을 제조하였다. 용액의 온도를 실온으로 조절하고, 약 2 내지 3 ㎜ 유체 직경의 액적 형태로 소정량의 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 매 5분마다 적가하고, 동결건조하여(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), BSA 분체를 제조하였다. 적가 동안의 트레이 온도는 트레이 당 적하량이 60 mL/5분인 경우 -40 내지 -32℃, 트레이 당 적하량이 80 mL/5분인 경우 -32 내지 -22℃, 트레이 당 적하량이 140 mL/5분인 경우 -34 내지 -9℃, 트레이 당 적하량이 160 mL/5분인 경우 -26 내지 -8℃, 그리고 트레이 당 적하량이 150 mL/5분인 경우 -22 내지 -4℃ 였다. 생성된 BSA 분체를 사용하여, 실시예 1 에 기술된 바와 동일한 방식에 따라 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 측정하였다. 트레이 당 적하량이 150 mL/5분인 경우, 충진 노즐의 직경 2 ㎜ 실리콘 튜브를 직경 4 ㎜ 실리콘 튜브로 전환하였다.
표 5 는 상기 공정에 따라 제형물 1 을 동결하여 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 적하량을 60 mL/5분 내지 160 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 1 의 평균 냉각속도가 -92.6℃/분 (최대 -101.1℃/분) 내지 -33.4℃/분 (최소 -32.6℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 1.3 내지 20.0 ㎛로 제어하는 것이 가능하였다.
적하량 (양 (mL)/5분/트레이)
50 80 140 160 150*
평균 입자 크기(㎛) 1.3 1.4 2.4 3.8 20.0
평균 냉각속도(℃/분) -92.6 -85.3 -71.7 -49.7 -33.4
*: 튜브를 전환하였음.
실시예 5B
BSA 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 1 의 BSA 수용액을 제조하였다. 용액의 온도를 실온으로 조절하고, 약 2 내지 3 ㎜ 유체 직경의 액적 형태로 이의 소정량 부분을 -50 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 지속적으로 적가하고, 동결건조하여(RL-402BS: Kyowa Vacuum (응축 용량 40 kg 형)), BSA 분체를 무균적으로 제조하였다. 500 mL의 제형물 1의 적가 동안 트레이의 온도는 트레이 당 적하량이 60 mL/5분인 경우 -40 내지 -31℃, 트레이 당 적하량이 80 mL/5분인 경우 -38 내지 -30℃, 트레이 당 적하량이 120 mL/5분인 경우 -28 내지 -12℃ 였다.
락트산/글리콜산 공중합체 (PLGA) (락트산/글리콜산 (몰비) = 약 65/35, 폴리스티렌에 대해 전환한 중량평균분자량 = 약 14,500) 1.69 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.7 mL 중 용액 (O)에 있어서, 상기 생성된 BSA 300 mg (S)을 Polytron (Kinemachica 제)으로 처리하여, 그 분체를 상기 용액 중에 분산 및 세립화하였다. 생성된 S/O 분산액 100 ㎕ 에 디클로로메탄 2.5 mL 를 첨가한 후, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 레이저 회절식 입도 분석기 (SALD2000A, Shimadzu 제)로 측정하였다.
표 6 은 상기 공정에 따라 제형물 1 을 동결하여 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 적하량을 60 mL/5분 내지 120 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 1 의 평균 냉각속도는 -93.7℃/분 (최대 -104.2℃/분) 내지 -59.8℃/분 (최소 -57.4℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 1.2 내지 2.4 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
적하량 (양 (mL)/5분/트레이)
60 80 120
평균 입자 크기 (㎛) 1.2 1.4 2.4
평균 냉각속도(℃/분) -93.7 -88.5 -59.8
실시예 6A
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 2 를 제조하였다. 온도를 실온으로 조절하고, 약 2 내지 3 ㎜ 유체 직경의 액적 형태로 소정량의 부분을 -45 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 지속적으로 적가하고, 동결건조하여(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), hGH 분체를 제조하였다. 적가 동안의트레이 온도는 트레이 당 적하량이 140 mL/5분인 경우 -38 내지 -18℃, 트레이 당 적하량이 160 mL/5분인 경우 -28 내지 -2℃ 였다. 생성된 hGH 분체를 사용하여, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에서 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 7 은 상기 공정에 따라 제형물 2 를 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 적하량을 140 mL/5분 내지 160 mL/5분으로 조절함으로써, 제형물 2 의 평균 냉각속도는 -74.1℃/분 (최대 -79.2℃/분) 내지 -42.6℃/분 (최소 -39.8℃/분)이 되었다. 따라서, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.9 내지 5.9 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
적하량 (양 (mL)/5분/트레이)
140 160
평균 입자 크기 (㎛) 1.9 5.9
평균 냉각속도 (℃/분) -74.1 -42.6
실시예 6B
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
20배 몰 당량의 암모늄 아세테이트를 hGH 수용액에 첨가하고 (hGH의 최종 농도 = 5 mg/mL), 혼합물을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 동결건조용 용액 제형물(제형물 3)을 제조하고, 제형물 2의 hGH 수용액도 또한 제조하였다. 각 제형물을 실온으로 조절하고, 약 2 내지 3 ㎜ 유체 직경의 액적 형태로 이의 소정량 부분을 -50 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 지속적으로 적가하고, 동결건조하여(RL-402BS: Kyowa Vacuum (응축 용량 40 kg 형)),hGH 분체를 무균적으로 제조하였다. 적가 동안의 트레이 온도는 트레이 당 적하량이 60 mL/5분 (접촉될 용액량: 1L)인 경우 -35 내지 -25℃, 트레이 당 적하량이 80 mL/5분 (접촉될 용액량: 500 mL)인 경우 -31 내지 -24℃, 트레이 당 적하량이 94 mL/5분 (접촉될 용액량: 250 mL)인 경우 약 -30℃ 였다. 생성된 hGH 분체를 사용하여, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 5B에 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 8 은 상기 공정에 따라 각 제형물 2와 3을 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 제형물 2 의 평균 냉각속도가 -87.4℃/분 (최대 -95.3℃/분) 내지 -83.5℃/분 (최소 -76.6℃/분)인 경우, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.3 내지 1.8 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다. 제형물 3 의 미분 hGH 분체의 경우, 평균 냉각속도가 -93.4℃/분인 때, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.8 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
적하량 (양 (mL)/5분/트레이)
94(접촉량 250 mL)제형물 2 60(접촉량 1L)제형물 2 80(접촉량 500 mL)제형물 2 80(접촉량 100 mL)제형물 3
평균 입자 크기(㎛) 1.3 1.8 1.8 1.8
평균 냉각속도(℃/분) -87.4 -86.4 -83.5 -93.4
실시예 6C
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 2의 hGH 수용액을 제조하였다. 용액을 실온으로 조절하고, 약 2 내지 3 ㎜ 유체 직경의 액적 형태로 이의 소정량 부분을 -50 내지 -40℃로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 지속적으로 적가하여 상기 용액 1 L를 접촉시키고, 동결건조하여(RL-402BS: Kyowa Vacuum (응축 용량 40 kg 형)), hGH 분체를 무균적으로 제조하였다.
트레이 당 적하량을 60 mL/5분 또는 80 mL/5분으로 하여 수득한 hGH 분체를 사용하여, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 5B 에 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다. 또한, 트레이 당 적하량을 120 mL/5분 또는 140 mL/5분으로 하여 수득한 hGH 분체를 사용하여, 실시예 1 에서 기술한 바와 동일한 방식에 따라, 제조한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 측정하였다.
표 9 는 상기 공정에 따라 제형물 2 를 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. hGH 수용액 1 L 를 접촉시키는 경우, 적하량을 60 mL/5분 내지 140 mL/5분으로 제어함으로써, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.6 내지 4.0 ㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
적하량 (양 (mL)/5분/트레이)
60(접촉량 1 L) 80(접촉량 1 L) 120(접촉량 1 L) 140(접촉량 1 L)
평균 입자 크기(㎛) 1.6 2.5 3.1 4.0
참조예 1
BSA 수용액의 동결 진공 건조
제형물 1 의 BSA 수용액을 제조하였다. 상기 용액을 트레이에 첨가하여, 두께 1 ㎜, 2 ㎜ 또는 5 ㎜의 용액층을 형성시키고, 약 -5 내지 0℃로 냉각하였다. 냉각된 BSA 수용액을 동결건조기(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg형))로 -50 내지 -40℃까지 동결하여, 동결 건조된 분체(이하, BSA 분체로 약기함)를 제조하였다. 생성된 BSA 분체를 사용하여, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에 기술한 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 10 은 상기 공정에 따라 제형물 1 의 BSA 수용액을 동결하여 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 상기 동결건조의 평균 냉각속도는 -2.1℃/분 내지 -1.6℃/분이 되었으며, 생성된 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기는 28.9 내지 35.0 ㎛ 였다.
층 두께
1 ㎜ 2 ㎜ 5 ㎜
평균 입자 크기 (㎛) 35.0 38.9 28.9
평균 냉각속도 (℃/분) -2.1 -1.6 -2.1
참조예 2
BSA 수용액의 동결 진공 건조
제형물 1 의 BSA 수용액을 제조하였다. 상기 용액을 트레이에 첨가하여, 두께 1 ㎜의 용액층을 형성시키고, 동결건조기(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형))에 두었다. 용액 온도를 0℃로 제어하였다. 그 후, 동결건조기 선반을 -4℃/시간의 냉각속도로 냉각하여, BSA 용액을 동결한 후, 동결건조하여, BSA 분체를 제조하였다. 생성된 BSA 분체를 사용하여, 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에 기술된 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 11 은 상기 공정에 따라 제형물 1 의 BSA 수용액을 동결시켜 수득한 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 상기 동결건조의 평균 냉각속도는 동결건조기 선반의 평균 냉각속도와 동일, 즉 -4℃/시간 이다. 이 때, 생성된 미분 BSA 분체의 평균 입자 크기는 32.5 ㎛ 였다.
층 두께
1 ㎜
평균 입자 크기 (㎛) 32.5
평균 냉각속도 (℃/시간) -4
실시예 1 내지 6C 를 참조예 1 및 2와 비교한 결과, 냉각속도가 느려짐에 따라, 미분 단백질 분체의 평균 입자 크기가 커진다는 것이 확인되었다.
실시예 7
hGH 수용액의 동결 및 후속 진공 건조
제형물 2 의 hGH 수용액을 제조하였다. 용액을 실온으로 조절하고, 이의 소정량 부분을 -25℃ 미만으로 냉각된 동결건조기 선반 상의 트레이(면적: 약 1,300 ㎠)에 간헐적으로 분무하고, 동결건조하여(Triomaster A04: Kyowa Vacuum (응축 용량 10 kg 형)), hGH 분체를 제조하였다. hGH 분체를 사용하여, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 실시예 1 에 기술된 바와 동일한 방식에 따라 측정하였다.
표 12 는 상기 공정에 따라 제형물 2 를 동결하여 수득한 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 나타낸다. 트레이에의 제형물 2의 분무량을 50 mL/5분 내지 100 mL/5분으로 제어한 경우, 제형물 2 의 평균 냉각속도는 -65.3℃/분 (최대 -73.9℃/분) 내지 -37.3℃/분 (최소 -34.3℃/분)이 되었고, 적하량을 60 mL/5분 내지 140 mL/5분으로 제어함으로써, 미분 hGH 분체의 평균 입자 크기를 1.5 내지 9.5㎛로 제어하는 것이 가능해졌다.
분무량 (양 (mL)/5분/트레이)
50 80 100
평균 입자 크기 (㎛) 1.5 2.9 9.5
평균 냉각속도 (℃/분) -65.3 -43.3 -37.3
실시예 8
hGH 함유 마이크로캡슐의 제조
락트산/글리콜산 공중합체 (락트산/글리콜산 = 50/50, 폴리스티렌에 대해 전환한 평균분자량 = 13,000, 점도 = 0.145 dL/g) 1.85 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.7 mL 중 용액에 실시예 3에서 도포량 10 또는 60 (트레이 당 5분 동안의 양 (mL))으로 수득한 hGH 분체 140 mg 을 첨가하였다. 그 후, 이를 Polytron(Kinemachica의 시판품)을 사용하여 세립화하였다. 상기 S/O 분산액을 0.1% 폴리비닐 알콜 수용액 800 mL 에 첨가하였다. 그 후, 생성된 액체를 호모믹서를 사용하여 교반 및 에멀션화하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반하며 디클로로메탄을 증발시킨 후, 분산액을 원심분리(약 1,800 rpm)하여, 마이크로캡슐을 수집하였다. 이어서, 마이크로캡슐을 400 mL의 증류수로 2회 세척한 후, 0.2 g 의 D-만니톨을 첨가하고, 이어서 동결건조하였다. 그 후, 생성된 물질을 3 일 동안 46℃에서 진공 건조하여 남은 용매를 제거하였다. 이에, 2종의 hGH 함유 마이크로캡슐이 수득되었다.
실시예 9
hGH 함유 마이크로캡슐의 제조
실시예 7에서 분무량 50 및 80 (5분 동안의 양(mL)/트레이)으로 제조한 hGH 분체를 사용하여, 실시예 8 에 기술된 바와 동일한 방식에 따라, 2종의 hGH 함유 마이크로캡슐을 수득하였다.
실시예 10
hGH 함유 마이크로캡슐의 제조
락트산/글리콜산 공중합체 (락트산/글리콜산 (몰비) = 약 65/35, 폴리스티렌에 대해 전환한 평균분자량 = 약 14,500) 1.69 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.7 mL 중 용액에, 실시예 6B의 제형물 2를 적하량 94 mL/5분(접촉될 양: 250 mL)으로 동결한 후 건조시켜 제조한 hGH 분체 300 mg 을 첨가하였다. 그 후, 이를 Polytron (Kinemachica의 시판품)을 사용하여 세립화하였다. 상기 S/O 분산액을 0.1% 폴리비닐 알콜 수용액 800 mL 에 첨가하였다. 그 후, 생성된 액체를 호모믹서를 사용하여 교반 및 에멀션화하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반하며 디클로로메탄을 증발시킨 후, 분산액을 원심분리(약 1,800 rpm)하여, 마이크로캡슐을 수집하였다. 이어서, 마이크로캡슐을 400 mL의 증류수로 2회 세척한 후, 0.2 g 의 D-만니톨을 첨가하고, 이어서 동결건조하였다. 그 후, 생성된 물질을 3 일 동안 46℃에서 진공 건조하여 남은 용매를 제거함으로써, hGH 함유 마이크로캡슐을 수득하였다.
실시예 11
hGH 함유 마이크로캡슐의 제조
락트산/글리콜산 공중합체 (락트산/글리콜산 (몰비) = 약 65/35, 폴리스티렌에 대해 전환한 평균분자량 = 약 14,500) 1.69 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.7 mL 중 용액에, 실시예 6B의 제형물 3을 적하량 80 mL/5분(접촉될 양: 100 mL)으로 동결한 후 건조시켜 수득한 hGH 분체 300 mg 을 첨가하였다. 그 후, 이를 Polytron (Kinemachica의 시판품)을 사용하여 세립화하였다. 상기 S/O 분산액을 0.1% 폴리비닐 알콜 수용액 800 mL 에 첨가하였다. 그 후, 생성된 액체를 호모믹서를 사용하여 교반 및 에멀션화하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반하며 디클로로메탄을 증발시킨 후, 분산액을 원심분리(약 1,800 rpm)하여, 마이크로캡슐을 수집하였다. 이어서, 마이크로캡슐을 400 mL의 증류수로 2회 세척한 후, 0.2 g 의 D-만니톨을 첨가하고, 이어서 동결건조하였다. 그 후, 생성된 물질을 3 일 동안 46℃에서 진공 건조하여 남은 용매를 제거함으로써, hGH 함유 마이크로캡슐을 수득하였다.
실시예 12
hGH 함유 마이크로캡슐의 제조
락트산/글리콜산 공중합체 (락트산/글리콜산 (몰비) = 약 65/35, 폴리스티렌에 대해 전환한 평균분자량 = 약 14,500) 1.69 g 및 산화아연 10 mg 의 디클로로메탄 2.565 mL 중 용액에, 실시예 6B의 제형물 2를 적하량 94 mL/5분(접촉될 양: 250 mL)으로 동결하고 건조시켜 수득한 hGH 분체 300 mg 을 첨가하였다. 그 후, 에탄올 0.135 mL를 첨가하고, 혼합물을 Polytron (Kinemachica의 시판품)을 사용하여 세립화하였다. 상기 S/O 분산액을 0.1% 폴리비닐 알콜 수용액 800 mL 에 첨가하였다. 그 후, 생성된 액체를 호모믹서를 사용하여 교반 및 에멀션화하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반하며 디클로로메탄을 증발시킨 후, 분산액을 원심분리(약 1,800 rpm)하여, 마이크로캡슐을 수집하였다. 이어서, 마이크로캡슐을 400 mL의 증류수로 2회 세척한 후, 0.2 g 의 D-만니톨을 첨가하고, 이어서 동결건조하였다. 그 후, 생성된 물질을 3 일 동안 46℃에서 진공 건조하여 남은 용매를 제거함으로써, hGH 함유 마이크로캡슐을 수득하였다.
실험예 1
생체내 방출 프로파일
실시예 8 및 9 에서 수득한 마이크로캡슐을 면역 억제 SD 래트(수컷, 6주령)에 피하 투여하였다(hGH 양으로서 6 mg/래트). 그 후, 래트 혈액을 시간의 경과에 따라 순차적으로 채혈하였다. 혈청 hGH 수준을 방사성면역분석기 (EIKEN CHEMICAL CO., LTD. 에서 Ab 비드(beads) HGH 이름으로의 시판품)로 측정하여, hGH 방출 프로파일을 평가하였다. 면역 억제 SD 래트는, PrografTM(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.의 시판품)을 마이크로캡슐 최초 투여 3일 전 0.4 mg/래트의 양으로, 최초 투여시 0.2 mg/래트의 양으로, 그리고 최초 투여 4일, 7일, 11일 및 14일 이후 0.2 mg/래트의 양으로 피하 주사하여 준비되었다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다.
도 1 의 결과로부터 명확히 이해되는 바와 같이, 도포에 의해 수득된 hGH 분체를 사용하여 제조된 마이크로캡슐 투여 이후의 혈액 hGH 수준은 분무에 의해 수득된 분체를 사용하여 제조된 마이크로캡슐 투여 이후의 수준보다 더 높다. 이들결과는 도포에 의해 수득된 hGH 분체를 사용하여 제조된 마이크로캡슐 제제가 보다 높은 생체이용률을 가진다는 것을 나타낸다.
실험예 2
FT-IR에 의한 미분 단백질 분체 고차 구조의 분석
2종의 hGH 분체, 즉 실시예 4 에서 도포량 80 (5 분 동안의 양(mL)/트레이)으로 수득한 hGH 분체 및 실시예 7 에서 분무량 80 (5 분 동안의 양 (mL)/트레이)으로 수득한 hGH 분체를, FT-IR 에 의한 그의 고차 구조의 분석에 적용하였다 (Journal of Pharmaceutical Science, Vol. 87, pp. 1412∼1420 (1998)). 그 결과를 평균 ±S.D. (n = 3)으로서 표 13에 나타낸다. 표 13 에서 보는 바와 같이, 도포에 의해 실시예 4 에서 수득한 hGH 분체의 α-헬릭스 함량은 분무에 의해 실시예 7 에서 수득한 hGH 분체의 α-헬릭스 함량보다 훨씬 높다. 중수(heavy water)에서 hGH의 α-헬릭스 함량이 59% 였기 때문에, 분무에 의해 실시예 7 에서 수득한 hGH 분체는 중수에서의 α-헬릭스 함량과 비교하여 39%의 α-헬릭스를 보유하였다. 반면에, 도포에 의해 실시예 4 에서 수득한 hGH 분체는 중수에서의 α-헬릭스 함량과 비교하여 59%의 α-헬릭스를 보유하였다.
실시예 4도포량: 5 분동안의 양 80 mL/트레이 실시예 7분무량: 5 분동안의 양 80 mL/트레이
파장 (cm-1) 비율 파장 (cm-1) 비율 귀속
1694.3 ±0.3 3.5 ±1.3 1694.3 ±0.2 3.5 ±0.4 β-시트
1682.9 ±0.6 18.9 ±0.4 1684.8 ±0.1 13.7 ±0.2 비정렬
1667.3 ±1.8 22.3 ±0.9 1666.9 ±0.6 35.7 ±1.7 비정렬
1654.7 ±0.6 31.2 ±2.0 1653.5 ±0.2 23.3 ±2.0 α-헬릭스
1641.5 ±0.4 14.6 ±0.7 1641.8 ±0.3 13.8 ±0.7 비정렬
1630.1 ±0.3 6.0 ±0.9 1630.7 ±0.4 6.5 ±0.7 β-시트
1615.8 ±0.2 3.6 ±0.1 1615.8 ±0.1 3.5 ±0.1 비정렬
본 발명에 따라, 그의 고차 구조가 높은 수준으로 유지되는 안정한 단백질 분체가, 액화 가스와의 접촉 없이 간편하게 제조될 수 있다. 따라서, 단백질 함유 용액을 액화 가스로 분무하여 그 용액을 동결한 후 건조하는 것에 의한 미분 단백질 분체의 제조 방법과 비교하여, 온도차로 인한 기구재료의 팽창과 수축 및 단열, 무균 상태의 유지, 액화 가스의 배출 등에 대항하기 위해 대규모 고가의 설비가 요구되지 않는다.
또한, 본 발명에 의해 수득된 단백질 분체는 간편한 세립화 처리에 의해 미분 단백질 분체로 전환될수 있으며, 상기 미분 단백질 분체를 사용함으로써, 장기간에 걸쳐 안정하고 높은 혈중 단백질 수준을 제공하는 서방성 제제가 제공될 수 있다.
또한, 기재로서 락트산 및 글리콜산의 몰비가 약 60:40 내지 70:30인 락트산-글리콜산 공중합체를 사용하여 성장 호르몬 함유 제제를 제조하는 경우, 약 1 개월에 걸쳐 성장 호르몬을 방출할 수 있는 서방성 제제를 제조할 수 있다.

Claims (19)

  1. 단백질 함유 용액을 냉매 담체와 접촉시켜 그 용액을 약 -300 내지 -10℃/분의 냉각속도로 동결시킨 후 건조하는 것을 포함하는, 단백질 분체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질 함유 용액을 냉매 담체에 도포 또는 적하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 약 0.1 내지 40 mm 직경의 적하 유체를 도포 또는 적하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단백질 함유 용액이 액체 냉매와 직접 접촉하는 것을 방지하는 것에 의해 동결이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단백질 함유 용액에 휘발성 염 또는 수혼화성 유기 용매를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 휘발성 염이 암모늄 아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 따른 방법으로 수득가능한 단백질 분체.
  8. 제 7 항에 있어서, 단백질의 분자량이 약 5,000 내지 1,000,000 달튼(dalton)인 것을 특징으로 하는 단백질 분체.
  9. 제 7 항에 있어서, 단백질이 호르몬, 사이토킨, 조혈 인자, 성장 인자 및 효소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 분체.
  10. 제 7 항에 있어서, 단백질이 성장 호르몬 또는 인슐린인 것을 특징으로 하는 단백질 분체.
  11. 제 7 항에 있어서, 단백질이 단백질 함유 용액 중의 α-헬릭스(α-helix) 총함량에 대하여 45% 이상의 α-헬릭스를 유지하는 것을 특징으로 하는 단백질 분체.
  12. 제 7 항에 따른 단백질 분체를 세립화(atomizing)하는 것을 포함하는 미분 단백질 분체의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 평균 입자 크기가 약 0.5 내지 20 ㎛ 인 미분 단백질 분체가 수득되도록 세립화가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 따른 방법으로 수득된 미분 단백질 분체를 함유하는 서방성 제제.
  15. 제 14 항에 있어서, 서방성 제제의 기재가 생체에서 유래된 물질 또는 합성 폴리머인 것을 특징으로 하는 서방성 제제.
  16. 제 15 항에 있어서, 생체에서 유래된 물질 또는 합성 폴리머가 생분해성 폴리머인 것을 특징으로 하는 서방성 제제.
  17. 락트산/글리콜산의 몰비가 60/40 내지 70/30인 락트산/글리콜산 공중합체 및 성장 호르몬을 함유하는 서방성 제제.
  18. 제 12 항에 따른 방법으로 수득한 미분 단백질 분체를 사용하는 것을 포함하는 서방성 제제의 제조 방법.
  19. 서방성 제제의 제조를 위한 제 7 항에 따른 미분 단백질 분체의 용도.
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