KR20020060927A - 저산소조건에서 동물세포 배양시 세포생존율을 향상시키는방법 - Google Patents
저산소조건에서 동물세포 배양시 세포생존율을 향상시키는방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항생제를 동물세포 배양배지에 가하여, 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포생존율을 향상시키는 방법은 퀴놀론(quinolone) 계열, 퀴논(quinone) 계열, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열의 항생물질 또는 클로람페니콜 등의 항생제를 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위로 배양배지에 가하여 동물세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 재조합 단백질 또는 배양세포를 생산하기 위한 고밀도 동물세포 배양에 실제적 방법으로 적용될 수 있다.
Description
거의 모든 동물세포들은 그 세포들이 생존하기 위해서는 여러 가지 영양분 이외에도 산소가 기질로서 꼭 필요하다. 따라서, 산소공급이 충분하지 않을 경우에는, 의학 및 산업적으로 여러가지 문제점이 발생하게 된다. 예를 들면, 인공간을 포함한 인공장기의 개발에 있어서, 이용된 세포로의 물질전달의 한계로 인해 외부에서 배양되는 간세포에 산소를 포함한 영양분이 충분하게 공급되지 않으면, 그 세포들은 사멸하게 되며 특히, 캡슐화되어 있는 세포를 이용하는 경우에는 산소전달의 문제가 더욱 심각하게 된다(참조: Catapano et al., Int. J. Artif. Organs,19(1):61-71, 1996).
한편, 심장 및 뇌경색의 경우에는, 각각의 조직에 혈액을 공급하는 혈관이 막히게 되고, 이에 따라 혈액의 공급이 줄어들게 되며 각 조직에 공급되는 산소의 양도 줄어들게 되어 각각의 세포는 괴사(necrosis)에 이르게 된다(참조: Selwyn et al., Ischemic Heart Disease, 1077-1085, In: Isselbacher et al.(eds.), Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th ed. McGraw-Hill, Inc., New York). 이 경우 조직에 공급되는 산소뿐만 아니라, 세포가 에너지원으로 사용하는 포도당의 양도 줄어들게 되어 문제를 더욱 어렵게 만든다.
최근에는, 재조합 단백질을 생산하거나 또는 배양된 세포 그 자체를 이용하기 위해 고농도 동물세포 배양이 많이 이루어지고 있다. 이 경우, 동물세포는 미생물과는 달리 세포벽이 없어, 기계적 교반이나 공기와의 접촉에 의해서도 세포막 파괴현상이 일어나기 쉬우므로, 교반에 의한 산소전달이 어려우며, 산소전달이 낮아지게 되면 최종적으로 얻을 수 있는 세포의 농도도 따라서 낮아지게 된다.
이러한 산소전달 문제를 해결하기 위하여, 산소의 용해도를 높일 수 있는 과불화탄화수소나 산소와 결합할 수 있는 정제된 헤모글로빈을 배지에 넣어 용존산소농도를 높이는 방법; 푸마르산과 같은 산소 이외의 전자 수용체를 이용하여 에너지생산 효율을 높이는 방법; 및, 헤모글로빈을 유전자조작에 의해 세포 내에서 발현되게 함으로써 세포가 이용할 수 있는 산소의 양을 높이는 방법 등이 시도되어 왔다. 아울러, 최근에는 트리메타지딘(trimetazidine)이라는 물질을 이용하여 에너지 대사과정에 영향을 미쳐, 심장세포로 하여금 저산소 농도에서도 저항성을 가지도록 하는 방법이 시도되기도 하였다. 그러나, 전술한 방법들은 다음과 같은 문제점들을 내포하고 있다: 첫째, 과불화탄화수소나 헤모글로빈을 배양배지에 첨가하는 경우에는 세포 자체의 성질을 변화시키는 것이 아니라, 배양배지 내의 용존산소 농도 또는 산소전달만을 향상시키므로, 그 효과에는 한계가 있다; 둘째, 푸마르산과 같이 전자수용체를 첨가하는 경우에는 그 전자수용체가 환원되기 때문에 작용할 수 있는 농도 범위에 한계가 있다: 유전자 조작에 의해 세포내의 산소전달을 높이는 방법에서는 세포에 유전자를 도입하여 발현시키는 과정이 복잡할 뿐만 아니라, 비용이 많이 소요된다.
따라서, 전술한 선행기술의 문제점을 해결하면서, 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 놀랍게도 퀴놀론(quinolone) 계열, 퀴논(quinone) 계열, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열의 항생물질 또는 클로람페니콜 등의 항생제를 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위로 배양배지에 가하여 동물세포를 배양할 경우, 저산소조건에서 동물세포의 생존율을 획기적으로 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포의 생존율을 향상시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 항생제를 동물세포 배양배지에 가하여, 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
상술한 본 발명의 목적 및 구성은 하기 첨부도면 및 설명에 의하여 더욱 명확해 진다.
도 1은 산소농도에 따른 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 저산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2b는 저산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 저산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 pH의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 저산소, 고포도당 조건에서 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 저산소, 고포도당 조건에서 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 저산소, 고포도당 조건에서 배양시간에 따른 pH의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 정상산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 정상산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 정상산소, 저포도당 조건에서 배양시간에 따른 젖산의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 5은 여러가지 항생물질에 의한 세포생존 효과를 비교한 그래프이다.
본 발명의 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법은, 퀴놀론(quinolone) 계열, 퀴논(quinone) 계열, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열의 항생물질 또는 클로람페니콜을 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위로 배지에 가하고, 동물세포를 배양시키는 단계를 포함한다: 이때, 사용되는 퀴놀론 계열, 퀴논 계열 또는 아미노글리코사이드 계열의 항생제는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 퀴놀론 계열의 항생제로는 레보플록사신(levofloxacin), 오플록사신(ofloxacin) 또는 시프록사신(ciprofloxacin)을 사용함이 바람직하고; 퀴논 계열의 항생제로는 테트라싸이클린(tetracycline), 미노싸이클린(minocycline), 독시싸이클린(doxycycline) 또는 옥시테트라싸이클린(oxytetracycline)을 사용함이 바람직하며; 및, 아미노글리코사이드 계열의 항생제로는 제네티신(geneticin), 네오마이신(neomycin) 또는 젠타마이신(gentamicin)을 사용함이 바람직하다.
동물세포는 사람 간암세포주 HepG2(ATCC HB 8065), 형질전환된 사람의 간세포인 창(Chang) 간세포주(ATCC CCL 13), 쥐의 신경교종세포인 C6 세포주(ATCC CCL 107), 사람의 신경아세포종인 BE2 세포주(ATCC TIB 182), 림프잡종 세포종의 하나인 5F12AD3 세포주(ATCC HB 8209) 또는 소의 대동맥 내피(bovine aortic endothelial, BAE) 세포를 포함한 다양한 근원의 세포라 하더라도 적용이 가능하다. 각 동물세포의 배양배지는 세포에 따라서 선택될 수 있으나, 바람직하게는 HepG2의 경우, 70 내지 130단위/㎖의 페니실린(penicillin), 90 내지 110㎍/㎖의스트렙토마이신(streptomycin), 0.8 내지 1.5g/ℓ의 포도당, 1.5 내지 3.0g/ℓ의 중탄산나트륨 및 8 내지 12% 송아지 태아 혈청이 첨가된 최소배지; BAE 세포, 창 간세포 또는 C6 세포주의 경우, 8 내지 12% 송아지 태아혈청이 첨가된 둘베코의 변형된 배지; 사람의 신경아세포종인 BE2 세포의 경우, 8 내지 12% 불활성화된 송아지 태아혈청이 첨가된 둘베코의 변형된 배지; 5F12AD3의 경우, 8 내지 12% 송아지 태아혈청이 첨가된 이스코베의 변형된 둘베코 배지를 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 정상상태에서 세포를 배양한 후, 산소 및 포도당의 공급을 중단시키고, 이들 세포의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 산소가 고갈되면, 포도당이 고갈됨과 동시에 젖산의 이용없이 세포가 괴사함을 알 수 있었다. 또한, 포도당이 고갈된 직후 다시 산소가 공급될 경우, 젖산을 이용하여 세포가 생존하기도 하지만, 젖산의 소진과 동시에 세포가 괴사함을 알 수 있었다. 그러나, 퀴놀론 계열, 퀴논 계열, 아미노글리코사이드 계열의 항생제 또는 클로람페니콜을 적정량으로 처리할 경우, 포도당 및 젖산이 소모된 후에도 일정기간 동안 세포를 생존시킬 수 있음을 알게 되었다.
이러한 실험군의 세포를 대상으로 분석한 결과, 산소 및 포도당의 공급이 중단된 세포 중, 항생물질이 처리되지 않은 세포는 전형적인 세포자멸의 상태를 나타내었으나, 전기 항생물질이 처리된 세포는 일정기간 동안 세포자멸의 상태를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 이는 전기 항생물질이 산소와 포도당이 공급되지 않는 허혈성 세포에서 발생하는 세포자멸을 억제하는 역할을 한다는 것을 의미한다. 추가적인 실험결과, 허혈성 세포에서 세포자멸 억제물질로 알려진 bcl-2 단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 산소농도에 따른 세포의 생존율
사람 간암세포주인 HepG2 세포(ATCC HB 8065, 1×106개/60mm 배양접시)를 100단위/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1g/ℓ의 포도당, 2.2g/ℓ의 중탄산나트륨 및 10%(w/v) 송아지 태아 혈청이 첨가된 최소배지에서 2일 동안 배양한 후, 동일한 새 배지로 교체하여 각각 1, 2 및 5%(v/v) 산소농도에서 배양하였다. 이때, 시간별로 살아있는 세포의 수는 0.4%(w/v) 트립판 블루와 세포 현탁액을 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 10 내지 15분 경과한 후, 혈구계(hemocytometer)로 푸르게 염색되지 않는 세포들의 수를 측정하는 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion) 방법으로 측정하였으며, 세포의 생존율은 시간에 따라 생존한 세포수를저산소 농도 상태로 만들기 직전에 존재하는 세포 수로 나눈 비율로 표시하였다(참조: 도 1). 도 1은 산소농도에 따른 세포의 생존율을 나타낸 그래프로서, (●)는 1%(v/v), (▼)는 2%(v/v), (■)는 5%(v/v) 및 (◆)는 21%(v/v)의 산소농도를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, HepG2 세포는 저농도 포도당이 첨가된 최소배지에서 산소농도가 5%(v/v) 이상이면 생존하는 반면, 2%(v/v) 이하가 되면 세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이하의 저산소 농도 조건은 산소 농도를 1%(v/v)로 설정하였다.
실시예 2: 제네티신에 의한 세포의 생존율
1%(v/v)의 저산소 조건에서 제네티신에 의한 세포의 생존율을 1g/L의 저포도당 조건과 4.5g/L의 고포도당 조건으로 나누어 측정하고, 정상농도의 산소조건에서 제네티신에 의한 세포의 생존율을 측정하였다.
실시예 2-1: 저산소 및 저포도당 조건에서 세포의 생존율
1g/L의 포도당농도 및 1%(v/v)의 산소농도 조건하에, 60mm 배양접시 당 5×105개의 HepG2 세포를 넣고, 제네티신을 처리하지 않고 배양한 세포주와 10㎍/㎖의 농도로 제네티신을 처리하여 배양한 세포주의 시간에 따른 생존율, pH 변화량및 포도당농도 변화량을 측정하였다(참조: 도 2a, 2b, 2c). 도 2a는 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내고, 2b는 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내며, 2c는 배양시간에 따른 pH의 변화를 나타내는데, 각 그래프에서 (●)는 제네티신이 처리되지 않은 경우를 나타내고, (○)는 10㎍/㎖의 농도로 제네티신을 처리한 경우를 나타낸다. 도 2a 내지 도 2c에서 보듯이, 저산소 및 저포도당 조건에서 제네티신은 포도당이 고갈된 후에도 세포의 생존을 유지시킴을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 저산소 및 고포도당 조건에서 세포의 생존율
4.5g/L의 포도당농도 및 1%(v/v)의 산소농도의 조건을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양한 HepG2 세포주의 시간에 따른 생존율, pH 변화량 및 포도당농도 변화량을 측정하였다(참조: 도 3a, 3b, 3c). 도 3a는 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내고, 3b는 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내며, 3c는 배양시간에 따른 pH의 변화를 나타내는데, 각 그래프에서 (●)는 제네티신이 처리되지 않은 경우를 나타내고, (○)는 10㎍/㎖의 농도로 제네티신을 처리한 경우를 나타낸다. 도 3a 내지 도 3c에서 보듯이, 저산소 및 저포도당 조건에서와 마찬가지로, 제네티신은 저산소 및 고포도당 조건에서도 세포의 생존을 유지시킴을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 정상산소 및 저포도당 조건에서 세포의 생존율
1g/L의 포도당농도 및 21%(v/v)의 산소농도의 조건을 제외하고는, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 배양한 HepG2 세포주의 시간에 따른 생존율, 포도당농도 변화량 및 젖산농도의 변화량을 측정하였다(참조: 도 4a, 4b, 4c). 도 4a는 배양시간에 따른 HepG2 세포의 생존율을 나타내고, 4b는 배양시간에 따른 포도당의 농도변화를 나타내며, 4c는 배양시간에 따른 젖산의 농도변화를 나타내는데, 각 그래프에서 (●)는 제네티신이 처리되지 않은 경우를 나타내고, (■)는 10㎍/㎖의 농도로 제네티신을 처리한 경우를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4c에서 보듯이, 정상상태의 산소농도에서는 포도당이 고갈된 후, 축적된 젖산을 사용하여 세포의 생존을 유지시키며, 젖산이 소모됨과 동시에 세포가 사멸하지만, 제네티신을 처리한 경우에는 젖산의 소모에 큰 영향을 받지 않고 세포가 생존함을 알 수 있었다.
실시예 3: 여러가지 항생물질에 의한 세포생존 효과
제네티신 외의 항생물질 중, 제네티신과 유사한 효과를 나타내며 는 다른 화학적 구조를 가지는 항생물질을 찾기 위하여, 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 사람 간암 세포주 HepG2(ATCC HB 8065)를 2일간 배양하고, 각 실험조건에 적합한 배양액으로 교체하여 배양한 다음, 2일 후의 세포 생존률을 비교하였다. 이때, 각 실험조건에 따라 21%(v/v)의 산소농도와 4.5g/L의 포도당을 가지는 실험군 A, 21%(v/v)의 산소농도와 1g/L의 포도당을 가지는 실험군 B, 1%(v/v)의 산소농도와4.5g/L의 포도당을 가지는 실험군 C, 1%(v/v)의 산소농도와 1g/L의 포도당을 가지는 실험군 D, 실험군 D에 아미노글리코사이드 계열인 10㎍/㎖의 제네티신이 처리된 실험군 E, 실험군 D에 퀴놀론 계열인 10㎍/㎖의 오플록사신이 처리된 실험군 F 및 실험군 D에 퀴논 계열인 0.1㎍/㎖의 독시싸이클린이 처리된 실험군 G로 구분하였다(참조: 도 5). 도 5는 여러가지 항생물질에 의한 세포생존 효과를 비교한 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 실험군 A, B 및 C에 비하여 실험군 D는 세포생존율이 매우 낮았고, 이러한 실험군 D에 각종 항생물질을 처리한 경우, 원래의 세포생존률을 회복할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 세포생존 효과를 나타내는 항생물질의 검색
전기 실시예 3에 의하여, 아미노글리코사이드 계열의 항생물질 뿐만 아니라, 퀴놀론 계열 및 퀴논 계열의 항생물질도 저산소조건에서 세포생존율을 향상시킬 수 있음을 알게 되었으므로, 여러가지 항생물질이 모두 유사한 기능을 나타내는지 알아보았다. 즉, 제네티신, 네오마이신, 젠타마이신, 테트라싸이클린, 미노싸이클린, 옥시테트라싸이클린, 독시싸이클린, 클로람페니콜, 레보플록사신, 오플록사신, 시프록사신, 앰피실린(ampicillin), 아목실린(amoxycillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 에리트로마이신(erythromycin), 설파디아진(sulfadiazine), 시클로헥시미드(cycloheximide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 푸로마이신(puromycin) 및 트리메타지딘(trimetazidine)과 같은 항생물질로서 각각 실시예 2-1 내지 실시예 2-2의 방법을 수행하고, 이들 중, 저산소조건에서 세포생존효과를 향상시키는 효과를 나타내는 항생물질들을 선별한 다음, 이들의 유효농도를 측정하였다(참조: 표 1).
| 항생제 | 농 도(㎍/㎖) |
| 제네티신(geneticin) | 10-100 |
| 네오마이신(neomycin) | 1000 |
| 젠타마이신(gentamicin) | 100-1000 |
| 테트라싸이클린(tetracycline) | 0.1-10 |
| 미노싸이클린(minocycline) | 0.1-10 |
| 독시싸이클린(doxycycline) | 0.1-10 |
| 옥시테트라싸이클린(oxytetracycline) | 0.1-10 |
| 클로람페니콜(chloramphenicol) | 1-10 |
| 레보플록사신(levofloxacin) | 10-100 |
| 오플록사신(ofloxacin) | 10-100 |
| 시프록사신(ciprofloxacin) | 1-10 |
표 1의 유효농도범위는 1%(v/v)의 산소농도에서 HepG2 세포주의 생존능을 향상시키는 항생제들과 그 효과를 나타내는 농도범위이다. 표 1에서 보듯이, 대장균의 리보솜(ribosome)에 있는 30S 소단위(subunit)에 영향을 미친다고 알려진 항생제들 중에서 아미노글리코사이드 계열의 항생제들은 제네티신 이외에 네오마이신과 젠타마이신이 효과가 있는 것으로 나타났다. 아울러, 대장균의 30S 소단위에 영향을 미치는 항생제 중에서 퀴논 계열의 항생제 테트라싸이클린은 매우 낮은 농도(0.1 내지 10㎍/㎖)에서도 효과가 있었으며, 테트라싸이클린 유도체인 미노싸이클린, 옥시테트라싸이클린 및 독시싸이클린이 같은 농도범위에서 효과가 있었다. 한편, 대장균의 리보솜에 있는 50S 소단위에 영향을 미친다고 알려진 항생제들 중에서 방향족(aromatic) 화합물 계열인 클로람페니콜은 효과가 있었으나, 마크로라이드(macrolide) 계열인 에리트로마이신은 효과가 없었다. 또한, DNA 선회효소(gyrase)에 영향을 미쳐 항생작용을 나타낸다는 퀴놀론 계통의 항생제들은 조사된 레보플록사신, 오플록사신 및 시프록사신 모두 효과가 있었다. 그러나, 미생물의 세포벽의 합성을 방해하여 항생제의 효과를 나타내는 앰피실린, 아목실린 및 세팔로스포린은 효과가 없었다. 뿐만 아니라, 엽산(folic acid) 대사에서 디하이드로프테로에이트 합성효소(dihydropteroate synthetase)의 활성을 억제한다고 알려진 설파디아진, 진핵세포의 단백질 합성을 억제한다고 알려진 시클로헥시미드, 우라실(uracil)과 경쟁적으로 작용하여 DNA 합성을 저해한다고 알려진 5-플루오로우라실 및 단백질 합성을 억제한다고 알려진 푸로마이신도 효과가 없었다. 이러한 결과로부터, 저산소농도에서 세포의 생존능을 향상시키는 효과와 항생제가 작용하는 기전사이에는 큰 상관관계가 없으며, 화학구조와도 상관관계가 없음을 확인하였다. 저산소 농도에서 세포를 생존시키는 항생제의 효과는 항생제의 종류에 따라 다르나, 대략 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위에서 사람 간암 세포주의 생존능을 향상시켰다. 한편, 저산소상태에서 포도당의 사용률을 증가시켜 세포의 생존을 증가시킨다고 알려진 트리메타지딘도 본 발명에서는 유효한 결과를 나타내지 않았다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 항생제를 동물세포 배양배지에 가하여, 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법은, 퀴놀론 계열, 퀴논 계열, 아미노글리코사이드 계열의 항생물질 또는 클로람페니콜을 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위로 배지에 가하고, 동물세포를 배양시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법은, 재조합 단백질을 생산하거나 배양된 세포 그 자체를 이용하기 위한 고농도 동물세포 배양시 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 퀴놀론(quinolone) 계열, 퀴논(quinone) 계열, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열의 항생물질 또는 클로람페니콜을 0.1 내지 1000㎍/㎖의 농도 범위로 배지에 가하고, 동물세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는 방법.
- 제 1항에 있어서,퀴놀론(quinolone) 계열의 항생물질은 레보플록사신(levofloxacin), 오플록사신(ofloxacin) 또는 시프로플록사신(ciprofloxacin)인 것을 특징으로 하는저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는방법.
- 제 1항에 있어서,퀴논(quinone) 계열의 항생물질은 테트라싸이클린(tetracycline), 미노싸이클린(minocycline), 독시싸이클린(doxycycline) 또는 옥시테트라싸이클린(oxytetracycline)인 것을 특징으로하는저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는방법.
- 제 1항에 있어서,아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열의 항생물질은 제네티신(geneticin), 네오마이신(neomycin) 또는 젠타마이신(gentamicin)인 것을 특징으로 하는저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는방법.
- 제 1항에 있어서,동물세포는 사람 간암세포주 HepG2(ATCC HB 8065), 형질전환된 사람의 간세포인 창(Chang) 간 세포(ATCC CCL 13), 쥐의 신경교종세포인 C6 세포주(ATCC CCL 107), 사람의 신경아세포종인 BE2 세포주(ATCC TIB 182), 림프잡종세포종의 하나인 5F12AD3 세포주(ATCC HB 8209) 또는 소의 대동맥 내피(bovine aortic endothelial, BAE) 세포인 것을 특징으로 하는저산소조건에서 동물세포의 배양시 세포생존율을 향상시키는방법.
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