KR20170124467A - 저산소 조건을 이용한 면역세포의 증식 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저산소 조건을 이용한 면역세포의 증식 배양 방법에 관한 것으로, 말초혈액 단핵구와 영양세포를 사이토카인 하에서 정상산소 조건에서 공배양하여 유도된 NK 세포를 저산소 조건으로 옮겨 증식 배양할 경우 정상산소 조건에서만 연속 배양된 NK 세포에 비해 세포 증식이 높고, 세포사가 완화되며, 암세포 살상능이 증가하며, 노화가 감소되어 암 예방 또는 치료를 위한 우수한 입양 면역 세포치료제로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 말초혈액 단핵구 유래 NK 세포를 정상산소 조건에서 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양하여 암세포 살상능을 향상시키고, 체내에서 오래 생존할 수 있도록 하는 저산소 조건을 이용한 면역세포의 증식 배양 방법에 관한 것이다.
입양 면역 세포치료제는 세포를 체외에서 활성화시켜 환자에게 주입하는 방법으로 수지상 세포, T 세포, NK 세포가 임상적용을 위하여 개발되고 있다. 그 중에서도 NK 세포는 선천 면역세포 중 하나로 다양한 종류의 암세포를 살상가능하고 항원 유무에 관계없이 암세포를 인식하기 때문에 항암치료제로서 각광을 받고 있으나, 실제 임상 시험에서 뚜렷한 완치 효과를 보이지는 않고 있다. 특히 말기암 환자의 경우 커다란 종양 조직에서 발생하는 면역회피 기전으로 인해 주입해준 면역세포가 활성저하를 일으키며, 암세포 공격능을 잃어버리게 된다. 이러한 면역회피 기전에 대한 커다란 원인은 종양의 내부가 저산소 환경이고 이러한 환경이 NK 세포가 암세포를 효과적으로 살상할 수 없는 여건을 제공함으로 고형암 환자의 치료에 있어서 문제가 되고 있다.
일반적으로 우리의 체내는 조직에 따라 3% (말초조직)에서 14% (폐)의 산소 분압을 나타내며 이보다 낮은 산소 농도 상태를 저산소 상태로 칭하며 흔히 0.5%에서 3%를 가리킨다. 저산소 조건에서 종양세포는 성장 유지 및 촉진이 된다고 보고되고 있으며 이와 반대로 정상세포와 면역세포는 저산소 상태에서 잘 성장하지 못하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 면역세포의 경우에 주로 저산소 조건이 면역세포의 기능을 억제하는 것으로 알려져 있다. NK 세포에서는 1% O2에서 배양 시 주요 활성화 수용체인 NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D가 하향조절(downregulation) 되며 정상세포 조건에서 키운 NK 세포에 비해 암세포 살상능이 저하된다는 보고가 있다.
따라서, 본 발명자들은 NK 세포를 체외 확장 시 여러 농도의 저산소 조건에 미리 노출시켜 저산소 환경에서 적응시킨 후, 상기 NK 세포를 환자의 몸 속에 주입하였을 때 암 조직 내의 저산소 조건에서도 항암 활성을 유지할 수 있는 배양 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 정상산소 조건에서 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양을 통해 유도되고, 암세포 살상능이 개선된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암세포 살상능이 개선된 NK 세포의 암의 예방 또는 치료적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이토카인 하에서 말초혈액 단핵구 및 영양세포(feeder cell)를 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 3일 내지13일 동안 배양한 다음, 산소 분압이 1% 내지 5%인 저산소 조건에서 5일 내지 30일 동안 추가 배양하여 자연살해세포(NK 세포)를 유도 및 증식하는 단계를 포함하는 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 암세포 살상능이 향상된 NK 세포를 포함하고, 상기 암세포 살상능이 향상된 NK 세포는 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 CD107a, NKp44, 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현이 증가되고, IFN-gamma의 분비가 증가되며, p16의 발현이 감소된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 말초혈액 단핵구에서 NK 세포를 유도 및 증식 배양함에 있어 먼저 정상산소 조건에서 일정 시간 동안 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양하여 유도 및 증식된 NK 세포의 경우 정상산소 조건에서 유도 및 증식된 NK 세포에 비해 세포 증식이 촉진되고, 세포사가 감소되며, 노화가 억제되고, 암세포 살상능이 촉진될 수 있다.
상기 NK 세포는 생체 내에서 생존기간이 길고 암세포 살상능이 우수하여 암의 예방 또는 치료에 효과적인 입양 면역 세포치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 말초혈액 단핵구로부터 NK 세포를 유도 및 증식함에 있어 산소 조건의 효과를 확인한 결과로, 말초혈액 단핵구를 정상산소 조건(20%) 또는 저산소 조건(0.5%, 1.5%)에서 3주간 배양하거나, 정상산소 조건에서 9일간 배양한 후 저산소 조건(1.5%)에서 추가 배양하면서 측정된 세포수를 나타낸 것이다.
도 2A는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와, 정상산소 조건에서 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양하여 유도된 본 발명에 따른 NK 세포의 증식을 비교한 그래프이고, 도 2B는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 세포사를 비교한 그래프이며, 도 2C는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 암세포 살상능을 비교한 그래프이다.
도 3은 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 다양한 산소 조건에서의 흑색종 세포주인 A375 세포에 대한 살상능을 비교한 그래프이다.
도 4는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 활성화수용체와 억제 수용체의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포에서 노화 마커인 p16의 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 이종이식 혈액암 모델에서 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 2A는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와, 정상산소 조건에서 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양하여 유도된 본 발명에 따른 NK 세포의 증식을 비교한 그래프이고, 도 2B는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 세포사를 비교한 그래프이며, 도 2C는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 암세포 살상능을 비교한 그래프이다.
도 3은 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 다양한 산소 조건에서의 흑색종 세포주인 A375 세포에 대한 살상능을 비교한 그래프이다.
도 4는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 활성화수용체와 억제 수용체의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포에서 노화 마커인 p16의 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 이종이식 혈액암 모델에서 정상산소 조건에서 유도된 NK 세포와 본 발명에 따른 NK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 사이토카인 하에서 말초혈액 단핵구 및 영양세포(feeder cell)를 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 3일 내지 13일 동안 배양한 다음, 산소 분압이 1% 내지 5%인 저산소 조건에서 5일 내지 30일 동안 추가 배양하여 자연살해세포(NK 세포)를 유도 및 증식하는 단계를 포함하는 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법에 관한 것이다.
상기 정상산소 조건은 산소 분압이 20% 내지 22%인 세포 배양 조건을 의미하고, 저산소 조건은 산소 분압이 1% 내지 5%, 또는 1.5% 내지 3%인 세포 배양 조건을 의미한다.
본 발명의 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법은 정상산소 조건에서 말초혈액 단핵구를 일정 기간 배양하고, 저산소 조건에서 추가 배양하여 NK 세포를 유도 및 증식하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 사이토카인 하에서 말초혈액 단핵구를 영양세포와 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 3일 내지 13일 동안 배양하고, 산소 분압이 1% 내지 5%인 저산소 조건에서 5일 내지 30일 동안 추가 배양할 수 있다.
상기 말초혈액 단핵구는 정상 또는 암환자의 말초혈액에서 유래된 것일 수 있다.
상기 영양세포는 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 영양세포는 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포를 약 1:1의 세포수의 비율로 혼합한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 말초혈액 단핵구와 영양세포는 약 1:1의 세포수의 비율로 혼합하여 공배양할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 사이토카인은 인터루킨-2(IL-2)를 포함할 수 있다.
상기에서 유도된 NK 세포는 CD3-CD56+ 표현형을 갖는 세포일 수 있다.
상기 NK 세포의 유도 및 증식 배양에 사용하는 배지는 혈청이 첨가된 공지의 세포배양배지를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 혈청은 세포배양에 사용되는 공지의 혈청의 종류를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법에 따른 NK 세포는 정상산소 조건에서 배양한 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포 대비 세포수가 많다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 정상산소 조건에서 동안 배양한 다음 저산소 조건에서 추가 배양한 경우의 세포수를 확인한 결과, 배양 3일 미만일 때 저산소 조건(1.5% 또는 0.5%)로 옮긴 경우 NK 세포는 거의 증식하지 않았으나, 정상산소 조건에서 9일 배양 후 저산소 조건으로 옮겨 준 경우 NK 세포의 증식이 대조군과 비교하여 세포수득율이 현저히 높았다. 세포 증식을 비교한 결과, 증식율이 약 60% 정도 증가되어 있으며, 세포사 확인 실험에서는 약 50% 정도 감소되어 있으며, 암세포 살상능 조사에서는 20% 내지 40% 정도 암세포 살상능이 증가하였다.
또한, 상기 NK 세포를 저산소 조건에서 암세포 살상능을 실험한 결과, 정상산소 조건에서 연속 배양한 NK 세포 대비 고형암에 대한 암세포 살상능이 뛰어났고, 이 NK 세포는 CD107a(살상능 척도)의 발현이 높을 뿐만 아니라 IFN-γ의 분비가 증가되어 있다.
아울러, 상기 NK 세포의 활성화수용체 및 억제수용체의 변화를 확인한 결과, 활성화수용체인 NKp44와 암세포 살상능에 관계된 분자인 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현이 증가되어 있다.
또한, 노화 마커인 p16의 발현이 감소되어 있어 정상산소 조건에서 연속 배양된 NK 세포 대비 노화가 덜 되었음을 알 수 있다.
또한, 이종이식 혈액암 모델에서 정상산소 조건에서 배양 후 저산소 조건에서 추가 배양하여 유도된 NK 세포는 정상조건에서 유도된 NK 세포에 비해 현저히 우수한 암세포 살상능을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 NK 세포는 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있어, 본 발명은 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 암세포 살상능이 향상된 NK 세포를 포함하고, 상기 암세포 살상능이 향상된 NK 세포는 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 CD107a, NKp44, 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현이 증가되고, IFN-gamma의 분비가 증가되며, p16의 발현이 감소된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 하나의 양태로서, 암의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 암은 고형암, 혈액암 등을 포함하며, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
본 발명에서 "치료" 란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.
본 명세서에 있어서, "개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다.
또한, 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, 유효량은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> NK 세포의 배양
사람의 혈액을 채혈한 후, Ficoll(Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare)을 이용하여 2,500rpm에서 30분간 원심분리한 후 연막층(buffy coat)에서 말초혈액 단핵구를 분리하였다. 그 후 100 Gy로 방사선 조사한 Jurkat 세포주와 방사선 조사한 EBV-LCL 세포주를 사용하여 IL-2 500 U/ml 존재 하에 1:0.5:0.5의 비율로 RPMI1640 배지에 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 넣은 hRPMI 배지에 공배양하여 2-3일 마다 한 번씩 IL-2가 500 U/ml로 첨가된 hRPMI 배지로 교환을 해 주면서 배양을 하였다.
상기 배양은 9일간 정상산소 조건에서 수행한 후 1.5% O2 조건으로 이동하여 약 3주간 더 수행하였다. 이때 한번씩 IL-2가 500 U/ml로 첨가된 hRPMI 배지로 교환해 주면서 배양하였다.
<실험예 1> 세포수 측정
저산소 조건이 NK 세포의 증식에 미치는 영향을 보기 위하여, 실시예 1에 기재된 방식대로 정상산소 조건(20%) 및 저산소 조건(0.5% 및 1.5%)에서 말초혈액 단핵구를 3주간 배양하거나, 정상산소 조건(20%)에서 9일간 배양한 후 저산소 조건(1.5%)으로 이동하여 3주간 배양하면서 헤마토사이토미터로 세포수를 측정하였다. 이때 한번씩 IL-2가 500 U/ml로 첨가된 hRPMI 배지로 교환해 주면서 배양하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 정상산소 조건에서는 세포수가 증가하나, 저산소 조건에서는 세포가 증식하지 않거나 미비한 증식 효과를 나타내었다.
또한, 정상산소 조건에서 9일간 배양한 후 저산소 조건으로 옮긴 경우(20%→1.5%)에는 정상산소 조건보다 월등히 높은 정도로 지속적인 세포 증식이 관찰되었다.
<실험예 2> NK 세포의 증식, 세포사 및 암세포 살상능 측정
정상산소 조건(20% O2)에서 연속 배양된 NK 세포(Normoxia)와, 정상산소 조건에서 배양 5일 후 저산소 조건(1.5% O2)(Hypoxia)으로 옮겨 배양한 NK 세포의 Ki67 발현을 비교하여 세포 증식을 확인하였다. 이를 위해, 배양한 세포를 각각 3×105 세포를 취한 후 Percp-labeled CD3 mAb, APC-labeled CD56mAb로 염색한 후 CD3-CD56+인 세포의 세포 증식을 확인하였다.
실험군과 대조군을 각각 Annexin V, 7AAD를 염색하여 세포사를 확인하였다.
또한, 타겟 세포로 K562, A375 세포를 준비한 후 Chromium으로 1시간 동안 표지(labeling)한 후 NK 세포와 1:1의 비율로 공동 배양한 다음 4시간 후 상층액을 취해서 감마 카운터(gamma counter)로 동위원소 값을 확인하였다.
도 2A 및 도 2B에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에서 배양한 경우 NK 세포의 증식율이 약 60% 정도 증가되었고, 저산소 조건에서 배양한 경우 세포사가 약 50% 정도 감소되었다.
도 2C에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에서 배양한 경우 암세포 살상능이 정상산소 조건에서 배양한 세포보다 20-40% 증가되었다.
<실험예 3> 산소 농도별로 NK 세포의 암세포 살상능 측정 실험
산소 농도별, 0.5%, 1.5% 및 20% NK 세포의 암세포 살상능을 측정하였다.
타겟 세포로 A375 세포를 준비한 후 NK 세포와 타겟 세포를 1:1 비율로 섞어 1시간 동안 37℃에서 배양하고 FITC labeled anti CD107a mAb를 2.5㎕ 넣고 Golgi stop(BD pharmingen)을 넣은 후 5시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 Percp-labeled CD3 mAb, APC-labeled CD56mAb를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. Intracellular FACS를 위해 세포를 FACS 버퍼로 세척하고, 고정시킨 후 BD cytoperm/cytofix kit(BD Pharmingen, San Diego, CA)로 투과시켜 PE-labeled IFN-g mAb로 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.
도 3은 산소 농도별로 NK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과로, 저산소 조건에서 배양한 경우 정상산소 조건에서 배양한 NK 세포 대비 고형암에 대한 암세포 살상능이 더 뛰어났다.
또한, 저산소 조건에서 배양한 NK 세포가 CD107a(살상능 척도)의 발현이 높고, IFN-γ의 분비가 증가되어 있었다.
<실험예 4> NK 세포의 활성화수용체 및 억제수용체 변화 측정 실험
정상산소 조건(20% O2)에서 배양된 NK 세포와 배양 5일째에 저산소 조건(1.5% O2)으로 옮겨 배양된 NK 세포의 활성화수용체 및 억제수용체의 발현 변화를 측정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에서 배양한 경우 NK 세포의 활성화수용체인 NKp44와 암세포 살상능에 관계된 분자인 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현이 증가되었다.
<실험예 5> NK 세포의 노화 마커 발현 측정 실험
정상산소 조건(20% O2)에서 연속 배양된 NK 세포와 배양 5일째에 저산소 조건(1.5% O2)으로 옮겨 배양된 NK 세포의 노화 마커 발현 변화를 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 정상산소 조건에서 배양한 경우 23일째에 p16의 발현이 현저히 증가하나, 저산소 조건에서 배양한 경우 상대적으로 발현이 감소되었다. 따라서, 저산소 조건으로 옮겨 배양한 NK 세포가 정상산소 조건에서 배양한 NK 세포에 비해 노화가 덜 되었음을 알 수 있다.
<실험예 6> 이종이식 혈액암 동물 모델에서 NK 세포의 암세포 살상능 측정 실험
이종이식 혈액암 동물 모델에서 정상산소 조건과 배양된 NK 세포와 정상산소 조건에서 배양 9일째에 저산소 조건(1.5% O2)으로 옮겨 배양된 NK 세포의 체내 암세포 살상능을 확인하기 위해, 7~8주령 NSG 마우스에서 PKH로 표지한 인간 T 세포 림프 아세포(T lymphoblastoid cell line) CEM을 마우스 복강내에 5×106 주입하고 NK 세포를 1×107 씩 주입하여 48시간 후에 복강내에 남아 있는 암세포를 수거하여 유세포 분석기로 분석하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 저산소 조건으로 옮겨 배양한 NK 세포가 정상산소 조건에서 배양한 NK 세포 대비 혈액암에 대한 암세포 살상능이 더 뛰어났다.
Claims (5)
- 사이토카인 하에서 말초혈액 단핵구 및 영양세포(feeder cell)를 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 3일 내지 13일 동안 배양한 다음, 산소 분압이 1% 내지 5%인 저산소 조건에서 5일 내지 30일 동안 추가 배양하여 자연살해세포(NK 세포)를 유도 및 증식하는 단계를 포함하는 NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법.
- 제1항에 있어서,
말초혈액 단핵구는 정상 또는 암환자의 말초혈액에서 유래된 것인, NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법.
- 제1항에 있어서,
영양세포는 방사선 조사된 Jurkat 세포 및 방사선 조사된 EBV-LCL 세포를 포함하는, NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법.
- 제1항에 있어서,
사이토카인은 인터루킨-2(IL-2)를 포함하는, NK 세포의 유도 및 증식 배양 방법.
- 산소 분압이 20% 내지 22%인 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 암세포 살상능이 향상된 NK 세포를 포함하고,
상기 암세포 살상능이 향상된 NK 세포는 정상산소 조건에서 배양된 말초혈액 단핵구 유래의 NK 세포에 비해 CD107a, NKp44, 퍼포린(perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현이 증가되고, IFN-gamma의 분비가 증가되며, p16의 발현이 감소된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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JBC. April 2016, M116.721753. * |
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