KR20020059129A - 인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트 - Google Patents

인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 원암 유전자가 도입되어 암이 유발된 형질전환 포유동물 및 이 유전자를 이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트에 관한 것으로, 상세하게는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 벡터가 도입되어 암이 유발된 포유동물 세포주, 수정란 및 이 수정란으로부터 발생된 형질전환 포유동물 및, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 프로브 또는 상기 mRNA로부터 해독된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를 이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트{TRANSGENIC MAMMAL CONTAINING HUMAN PROTOONCOGENE AND KIT FOR DIAGNOSING BREAST, KIDNEY, OVARY OR STOMACH CANCER}
본 발명은 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 벡터가 도입되어 암이 유발된 포유동물 세포주, 수정란 및 이 수정란으로부터 발생된 형질전환 포유동물 및, 이 유전자를 이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트에 관한 것이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 100,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화, 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death)등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee,Science,257: 967-971(1992)).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.
예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된 mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M.,Cell,64: 235-248(1991); 및 Hunter, T.,Cell,64: 249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다. 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 자궁경부암 1(HCCR-1)으로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현된다는 것을 밝혀내어 1999년 10월 15일자 특허출원 제 99-44811 호로 출원한 바 있으며, 정상 인간 세포의 암화 과정을 규명하기 위해 이 유전자가 도입된 인간 암세포주와 암이 유발된 형질전환 포유동물을 제조하고자 예의 연구하였다.
본 발명의 목적은 인간 원암 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입되어 암이 유발된 포유동물 세포주, 수정란 및 이 수정란으로부터 발생된 형질전환 포유동물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
도 1a 및 1b는 각각 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다.
도 2는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 보여주는 사진(x250)이다.
도 3은 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포의 투과 전자현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포가 이식되어 촉지성 종양이 형성된 누드 마우스의 사진이다.
도 5는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포가 이식된 누드 마우스의 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 결과(x250)이다.
도 6은 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포가 이식된 누드 마우스의 종괴의 투과 전자현미경 사진이다.
도 7a 내지 7d는 각각 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포가 이식된 누드 마우스의 종괴에서 레티쿨린 섬유, 케라틴, 상피세포막 항원 및 비멘틴 단백질을 나타내는 면역조직화학 분석 결과(x250)이다.
도 8은 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1MN 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다.
도 9는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 및 HCCR-1MN 세포에서 인간 원암 단백질 HCCR-1의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 및 야생형 293 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다.
도 11은 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 세포가 이식된 누드 마우스의 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 결과(x250)이다.
도 12a, 12b 및 12c는 각각 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 세포가 이식된 누드 마우스의 종괴에서 사이토케라틴 8, 사이토케라틴 19 및 비멘틴 단백질을 나타내는 면역조직화학 분석 결과(x250)이다.
도 13은 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 세포에서 인간 원암 유전자 HCCR-1의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다.
도 14는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포, pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 단백질 키네이즈 C 활성을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포, pcDNA3 벡터가 도입된 비교 293 세포, 야생형 NIH/3T3 세포, 양성 대조군 세포 및 음성 대조군 세포의 텔로머레이즈 활성을 나타내는 그래프이다.
도 16a, 16b 및 16c는 각각 본 발명의 한 태양에 따른 마우스 HCCR-1M 세포에서 egr-1, c-fos 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다.
도 17a는 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 세포에서 종양 억제 유전자 p53의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 17b는 동일 블랏의 β-액틴을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 18은 야생형 인간 293 세포 및 본 발명의 다른 태양에 따른 인간 HCCR-1H 세포에서 종양 억제 유전자 p53의 발현을 보여주는 면역침강반응 결과이다.
도 19a, 19c, 19e, 19g 및 19i는 각각 본 발명의 다른 태양에 따른 HCCR-1H 세포에서 MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A 및 p14ARF유전자의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 19b, 19d, 19f, 19h 및 19j는 각각 상기 블랏의 β-액틴을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 20a 및 20b는 FLAG와 HCCR-1의 융합단백질을 발현하는 벡터 및 GST와 D52의 융합단백질을 발현하는 벡터로 공동 형질감염된 CHO 세포의 파쇄물을 항 FLAG 항체 및 항 GST 항체로 면역침강반응시켜 얻은 침전물을 항 GST 항체 및 항 FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석한 결과이다.
도 21은 형질전환 마우스의 제조에 사용되는, HCCR-1를 포함하는 DNA의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 22는 본 발명의 또 다른 태양에 따라 인간 원암 유전자 HCCR-1이 도입되어 암이 유발된 형질전환 마우스 사진이다.
도 23은 본 발명의 또 다른 태양에 따라 인간 원암 유전자 HCCR-1이 도입된 형질전환 마우스의 유방 종양 사진이다.
도 24는 본 발명의 또 다른 태양에 따라 인간 원암 유전자 HCCR-1이 도입된 형질전환 마우스의 종양을 헤마톡실린-에오신으로 염색한 결과(x100)이다.
도 25는 본 발명의 또 다른 태양에 따라 인간 원암 유전자 HCCR-1이 도입된 형질전환 마우스의 종양의 전자현미경 사진이다.
도 26a는 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 인간 원암 유전자 HCCR-1의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다.
도 27은 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 인간 원암 단백질 HCCR-1의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 28은 인간 원암 유전자 HCCR-1의 인간 염색체상 위치를 보여주는 형광 동소보합 결합(fluorescence in situ hybridization: FISH) 결과이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 핵산 구조물이 도입된 포유동물 수정란을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 수정란으로부터 발생된, 암이 유발된 형질전환 포유동물을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 프로브 또는 상기 mRNA로부터 해독된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 유방암, 신장암, 난소암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 세포주 및 포유동물의 제조에 사용되는 서열번호: 1의 유전자는 포유동물에서 과발현되어 암을 유발하는 신규 인간 원암 유전자(HCCR-1으로 명명됨)로서 염색체 12번 장완(12q) 위치에 위치하고 하나의 전사 해독 프레임(open reading frame)을 가지며, 이로부터 유추되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같고 그 분자량은 50 kDa이다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩 영역에다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 상기 유전자는 서열번호: 1의 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
상기 유전자는 인간의 암 조직으로부터 분리하거나 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 이 유전자를 당 분야에 공지된 포유동물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조할 수 있다.
이 발현 벡터를 적절한 포유동물 세포에 도입하여 형질전환 세포주를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 상기 유전자를 포유동물 발현용 벡터 pcDNA3(Invitrogen사)에 삽입하여 얻은 pcDNA3/HCCR-1로 명명된 발현 벡터를 마우스 유래의 섬유모세포주 NIH/3T3(ATCC CRL 1658) 및 인간 세포주 293 (ATCC CRL-1573)에 도입하여 HCCR-1M 및 HCCR-1H로 명명된 형질전환 세포주를 얻었으며, 이들을 각각 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000 년 12 월 26 일자 기탁번호 제 KCTC 0923BP 호 및 제 KCTC 0922BP 호로 기탁하였다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포주는 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하며 종양 거대세포의 형태학적 특성을 가진다. 예를 들어, 마우스 세포주 HCCR-1M은 다각형의 세포 모양을 가지고, 뚜렷한 핵소체(nucleoli)를 지니는 소엽 핵, 잘 발달된 세포질내 소망(rough surfaced endoplasmic reticulum: rER) 및 골지체를 가지며, 세포 표면에는 불규칙한 크기의 미세융모를 가지고 있으며, 비정형 유사분열을 한다. 또한 상기 인간 세포주 HCCR-1H는 야생형 세포에 비해 세포 크기와 세포충실성(cellularity)이 크다.
본 발명의 세포주는 종양형성능을 가지고 있어, 포유동물에 이식될 경우 촉지성 종양(palpable tumor) 등과 같은 암종을 형성한다. 또한 이러한 암종으로부터 분리된 세포주도 본 발명의 세포주와 동일한 특성을 가지는데, 예를 들어, HCCR-1M 세포가 이식된 누드 마우스에 형성된 촉지성 종양으로부터 세포를 분리하여 HCCR-1MN으로 명명된 세포주를 확립한 후 이 세포주가 HCCR-1M과 유사한 형태학적 특성을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 세포주는 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하여 다량의 HCCR-1 단백질을 생성하며, 이 단백질이 유방암과 관련된 것으로 보고된 바 있는 D52 단백질(GenBank 등록번호 NM 003288)(Byrne, J.A. et al.,Cancer Res.,55, 2896-2903 (1995); 및 Bryne, J.A. et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998))과 상호작용하고, 단백질 키네이즈 C(PKC)와 텔로머레이즈를 활성화시키고, 세포주기 체크포이트(Checkpoint) 조절 기능을 상실하게 하며, egr-1 유전자의 발현을 하향 조절하는 과정을 거쳐 악성 종양으로 전환한다. 특히 이 과정에서 세포주기 조절에 관련된 종양 억제 유전자 p53의 발현이 증가되지만 생성된 p53 단백질의 대부분이 불활성화됨으로써 종양 억제 기능을 다하지 못해 악성 종양으로 전환되는 것으로 보인다. 즉, 인간 원암 유전자 HCCR-1은 상위 단계(upstream level)에서 종양억제 유전자 p53의 기능을 불활성화(functional inactivation)시키는 것으로 보인다. 따라서, 이 HCCR-1 유전자의 부위 특이적 변이유발(site-directed mutagenesis)을 통해 p53 유전자의 조절을 담당하는 HCCR-1 유전자의 특정 서열을 확인해낸다면 이 서열을 변이시킴으로써 p53 유전자의 기능을 복원할 수 있을 것이다.
또한 상기 HCCR-1 유전자를 포함하는 핵산 구조물을 적절한 포유동물의 수정란, 예를 들어 마우스 등의 설치류 동물의 수정란에 도입하여 형질전환 수정란을 얻고 이 수정란을 적절한 대리모의 자궁에 착상시켜 발생시킨 후 출산시켜 형질전환 포유동물을 얻는다. 이러한 형질전환 포유동물의 제조 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 적어도 8 세포기 이전 단계의 수정란에 도입하는 것이 바람직하다.
이렇게 제조된 형질전환 포유동물은 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하며 유방 조직에 유두형 선암종 특성, 예를 들어, 피막(capsule)이 없는 국한성 결절(well-circumscribed nodule), 유두형 구조와 샘 또는 관 유사 구조, 중앙부에 광범위한 괴사가 일어나고 외부에는 정상 조직이 인접한 구조, 입방형 또는 난형의 세포 모양, 불명확한 세포 경계, 상당량의 과립성 호산성 세포질이 있는, 종양을 가진다.
상기 형질전환 포유동물을 교배시켜 형질전환 수정란을 얻을 수도 있다. 본 발명자들은 도 21에 나타낸 구조를 갖는, HCCR-1 유전자를 포함하는 DNA 구조물이 도입된 FVB/N 마우스의 수정란(HCCR-1으로 명명됨)을 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000 년 12 월 26 일자 기탁번호 제 KCTC 0924BP 호로 기탁하였다.
본 발명에 따른 형질전환 세포주 및 포유동물은 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하여 암을 형성하므로, 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 인간 원암 유전자 HCCR-1는 위암, 신장암, 난소암 및 유방암 조직에서 과발현되므로, 이 유전자의 발현 산물들은 이들 암의 진단에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 유전자 산물을 이용한 암 진단 방법은, 예를 들어, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질과 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 사용하여 대상자의 위, 신장, 난소 또는 유방 조직으로부터 분리한 mRNA 또는 단백질 시료와 결합시킨 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출함으로써 대상자가 과발현된 인간 원암 유전자 HCCR-1 산물을 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브 또는 항체를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 상기 유전자 산물을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 포함하는, 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암의 진단용 키트를 제공한다. 상기 프로브는 HCCR-1 유전자의 mRNA 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 이 mRNA에 특이적으로 결합하는 한 어느 것이나 사용할 수 있으며, 이 중 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 상기 프로브는 사람의 조직으로부터 분리하거나 공지의 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 상기 항체는 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단,하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 투과 현미경 관찰
세포 또는 조직 시료를 인산염 완충용액(pH 7.4) 중의 2.5% 글루타르알데하이드로 고정시킨 후 2% 오스뮴 테트라옥사이드(osmium tetroxide)로 2시간 동안 후고정시키고 20% 에탄올로 탈수시킨 다음 Epon 812(Sigma)에 포매시켰다. 중합반응(polymerization) 후 초미세절편(ultrathin section)을 만들어 우라닐 아세테이트와 시트르산 납으로 이중염색한 다음 투과 전자현미경(1200 EX, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
참조예 2: 웨스턴 블랏
문헌(Laemmli,Nature,227, 680-685 (1970))의 방법에 따라, 세포로부터 단백질 시료를 얻어 10 % SDS-PAGE를 수행하였다. 겔 상에 분리된 단백질들을 니트로셀룰로즈 막에 전기적으로 이동시킨 후, 항체와 함께 16 시간 동안 반응시켰다. 이어서 이 막을 세척한 후, 1:1,000 비율로 희석된 퍼옥시다제-결합된 염소 항-래트 면역글로불린(Jackson ImmunoResearch)을 2차 항체로 포함하는 블로킹 용액과 반응시켰다. ECL-웨스턴 블롯 검출 키트(Western blot detection kit, Amersham)를 사용하여 단백질을 확인하였다.
참조예 3: 면역조직화학(Immunohistochemistry) 분석
조직 시료를 1차 항체와 함께 반응시킨 후 5㎛ 단편으로 절단하였다. 각 단편에 결합된 1차 항체를 비오틴-결합 2차 항체, 애비딘, 비오틴-결합 서양고추냉이퍼옥시다제 및 아미노에틸 카바졸 기질 키트(Aminoethyl Carbaxzole Substrate Kit, AEC)로 염색하였다.
참조예 4: 총 RNA의 분리
신선한 조직 또는 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후 키트(message clean kit, GenHunter Corp.)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.
참조예 5: 노던 블랏
총 RNA 시료 20 ㎍을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮긴후32P-표지된 무작위 프라임된 프로브와 하이브리드화시켰다. 이때 프로브는 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조하였다. 노던 블롯 분석을 2회 반복하여 덴시토미터(densitometer)로 정량하였다. 동일 블랏을 β-액틴(actin) 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.
제조예 1: HCCR-1 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작
서열번호: 1의 염기서열로 표시되는 인간 원암 유전자 HCCR-1의 cDNA 전장 서열을 포함하는 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1가 도입된 대장균 JM-109/HCCR1(기탁번호 제 KCTC 0667BP 호)의 배양액으로부터 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1을 분리한 후 제한효소 SalI으로 절단하여 HCCR-1 전체 코딩 서열을 포함하는 2.1 kb 단편을 얻었다. 이어서 포유동물 발현용 벡터 pcDNA3(Invitrogen사)를 XhoI으로 절단하여SalI과 상용성인 말단을 만든 후, 여기에 2.1 kb SalI 단편을 삽입하여, HCCR-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3/HCCR-1을 얻었다.
제조예 2: HCCR-1에 대한 항체의 생산
먼저, 항체의 제조에 사용될 HCCR-1 단백질을 얻기 위해, 대장균 JM-109/HCCR1(기탁번호 제 KCTC 0667BP 호)의 배양액으로부터 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1을 분리한 후 서열번호: 4 및 5의 프라이머와 함께 PCR을 수행하여, 서열번호: 1의 염기서열 123 내지 473 번 영역(서열번호: 2의 아미노산 서열 39 내지 155번)만을 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 벡터 pMAL-p2(New England Biolab., 미국)의 BamHI/SalI 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pMAL-p2/HCCR-1-c-terminal을 얻은 후 이 벡터를 대장균 BL21(ATCC 47092)에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LB 배지에서 진탕 배양한 후 배양액을 1/100로 희석시켜 다시 3 시간 동안 배양한 다음 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈(IPTG, Sigma)를 첨가하여 HCCR-1 유전자의 발현을 유도하였다. 이때 발현된 단백질은 HCCR-1 단백질의 C-말단부와 pMAL-2 벡터 유래의 말토즈 결합 단백질(MBP, 약 42 kDa)이 융합된 약 64 kDa의 융합 단백질이다. 이 배양액으로부터 pMAL 단백질 융합 정제 시스템(pMAL protein fusion & purification system, New England Biolab., 미국)을 사용하여 64 kDa 융합단백질을 정제하여 후속하는 항체 생산 단계에서 항원으로 사용하였다.
이어서, 10 마리의 3 월령 뉴질랜드 화이트 토끼(체중 약 2.5 kg)에 상기 HCCR-1 항원 단백질을 1㎎의 양으로 1주일에 1회씩 3회 복강내 투여하였다. 면역화된 토끼로부터 혈액을 채혈한 후 원심분리하여, HCCR-1 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 포함하는 혈청을 얻었다.
실시예 1: HCCR-1 유전자가 도입된 마우스 세포주의 제조
제조예 1에서 얻은 발현벡터 pcDNA3/HCCR-1을 리포펙타민(lipofectamine, Gibco BRL)을 사용하여 마우스 유래의 분화된 섬유모세포주 NIH/3T3(ATCC CRL 1658)에 형질감염한 후 G418(Gibco)이 포함된 웨이마우스(Waymouth) MB 752/1 배지(Gibco, 미국)에서 배양하여 형질감염된 세포를 선별하였다. 선별된 마우스 세포를 HCCR-1M으로 명명하고, 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000 년 12 월 26 일자 기탁번호 제 KCTC 0923BP 호로 기탁하였다.
실시예 2: HCCR-1 유전자가 도입된 인간 세포주의 제조
마우스 NIH/3T3 세포 대신에 인간 태생기 신장 유래의 세포주 293(ATCC CRL-1573)을 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 형질감염된 세포를 얻었다. 얻어진 인간 세포를 HCCR-1H로 명명하고, 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000 년 12 월 26 일자 기탁번호 제 KCTC 0922BP 호로 기탁하였다.
비교예: pcDNA3 벡터가 도입된 비교 세포주의 제조
발현벡터 pcDNA3/HCCR-1 대신에 벡터 pcDNA3(Invitrogen사)을 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포주를 얻었다.
실시예 3: 마우스 세포주 HCCR-1M의 형태학적 특성
실시예 1에서 얻은 마우스 세포주 HCCR-1M의 형태학적 특성을 조사하기 위해, 위상차 현미경 관찰, 헤마톡실린-에오신 염색 및 전자현미경 관찰을 실시하였다.
(단계 1) 위상차 현미경 관찰
실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포를 웨이마우스 MB 752/1 배지 중에서 단층배양한 후 위상차 현미경(Olympus, 미국)으로 관찰하였다. 이 때 대조군으로는 야생형 NIH/3T3 세포를 사용하였다.
도 1a 및 1b는 각각 HCCR-1M 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다. 도 1a 및 1b에서 보듯이, 야생형 NIH 세포는 방추형의 모양을 가지나 HCCR-1M 세포는 난형의 핵과 다량의 세포질을 지닌 다각형으로 모양이 변화하였다.
(단계 2) 헤마톡실린-에오신 염색
실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포를 웨이마우스 MB 752/1 배지 중에서 단층배양한 후 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H & E)으로 염색하여 관찰하였다.
도 2는 HCCR-1M 세포의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 보여주는 사진(x250)이다. 도 2에서 보듯이, HCCR-1M 세포는 다형성 핵, 뚜렷한 핵소체 및 과립상 염색질 소견 및 종양 거대세포들이 나타났고, 비정형 유사분열이 관찰되었다.
(단계 3) 투과 전자현미경 관찰
실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포를 사용하여 참조예 1의 방법으로 투과 전자현미경 관찰하였다.
도 3은 HCCR-1M 세포의 투과 전자현미경 사진이며, 여기에서 스케일 바의 길이는 3㎛에 해당하고 원으로 나타낸 부분을 보다 고배율로 관찰한 결과를 삽입그림(스케일 바 길이 1㎛)에 나타내었다. 도 3에서 보듯이, HCCR-1M 세포는 그 표면에는 불규칙한 크기의 미세융모가 있고, 뚜렷한 핵소체(nucleoli)를 지니는 소엽 핵, 잘 발달된 세포질내 소망(rough surfaced endoplasmic reticulum: rER) 및 골지체를 가진다(원 내).
이상의 결과를 종합하면, HCCR-1 세포는 종양 거대세포의 형태학적 특성을 가짐을 알 수 있다.
실시예 4: 마우스 세포주 HCCR-M1의 종양형성능 시험
실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포를 5x106개씩 9 마리의 5 주령 누드 마우스(athymic nu/nu on BALB/c background; 대덕 화학연구소) 둔위 부위에 피하 주사하여 동종이식(allograft)하였다.
그 결과, 21일 후에 9 마리의 누드 마우스 모두에서 촉지성 종양(palpable tumor)이 형성되었다. 도 4는 촉지성 종양이 형성된 누드 마우스의 사진이다. 이러한 결과로부터 HCCR-1M 세포가 종양형성능을 가짐을 알 수 있다.
종양의 크기가 1.5 내지 2.5 ㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시킨 후 종양 종괴를 적출하여, 후속하는 종양 분석 및 종양 세포주 확립 과정에서 시료로 사용하였다.
실시예 5: 마우스 세포주 HCCR-1M이 이식된 누드 마우스의 종양 분석
HCCR-1M 세포에 의해 유도된 누드 마우스 종양의 특징을 조사하기 위해, 헤마톡실린-에오신 염색, 전자현미경 관찰 및 면역조직화학 분석을 다음과 같이 수행하였다.
(단계 1) 헤마톡실린-에오신 염색
실시예 4에서 얻은 누드 마우스의 종괴를 헤마톡실린-에오신 염색하였다.
도 5는 누드 마우스 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 결과(x250)이다. 도 5에서 보듯이, 누드 마우스 종괴는 섬유상 간질 조직에 의해 분리된 전형적인 상피성 세포소를 가진다.
(단계 2) 투과 전자현미경 관찰
실시예 4에서 얻은 누드 마우스의 종괴를 참조예 2의 방법으로 투과 전자현미경 관찰하였다.
도 6은 누드 마우스 종괴의 투과 전자현미경 사진이며, 여기에서 스케일 바의 길이는 3㎛에 해당하고 원으로 나타낸 부분을 보다 고배율로 관찰한 결과를 삽입그림(스케일 바 길이 0.5㎛)으로 나타내었다. 도 6에서 보듯이, 누드 마우스의 종괴의 세포는 잘 발달한 소기관을 가지며, 세포 간에는 상피 세포의 특징인 데스모좀(desmosome)에 의해 단단하게 연결되어 있다. 이러한 결과로부터 HCCR-1M 세포가 상피 세포로 변화하였음을 알 수 있다.
(단계 3) 면역조직화학 분석
실시예 4에서 얻은 누드 마우스의 종괴를 1차 항체로서 항-레티쿨린 섬유, 항-케라틴, 항-EMA 항체(DAKO) 및 항-비멘틴에 대한 항체(DAKO)를 사용하여 참조예 3의 방법으로 조직면역화학 분석을 실시하였다.
도 7a 내지 7d는 각각 누드 마우스의 종괴에서 레티쿨린 섬유, 케라틴, EMA 및 비멘틴 단백질을 나타내는 면역조직화학 분석 결과(x250)이다. 도 7a에서 보듯이, 종괴 세포소는 레티쿨린 섬유로 둘러싸여 있으며, 도 7b 내지 7d에서 보듯이, 종괴 세포는 상피 표지 단백질인 케라틴 및 상피 막 항원과, 간엽 표지 단백질인 비멘틴을 함께 발현한다. 이러한 결과로부터, HCCR-1 유전자가 간엽 세포인 NIH/3T3 세포를 상피 세포로 변화시킴을 알 수 있다.
특히, 중배엽에서 유래한 NIH/3T3 세포에 발암 유전자(oncogene)가 도입되면 일반적으로 육종(sarcoma)으로 진행하지만, 본 발명에 따라 HCCR-1M 세포가 이식된 누드 마우스에서는 상피성 암종의 특징을 갖는 종양이 형성되었다는 점은 특이하다.
실시예 6: 마우스 세포주 HCCR-M1이 이식된 누드 마우스로부터 암 세포주의 제조
실시예 4에서 얻은 누드 마우스의 종괴로부터 세포를 분리하여 20 % 우태아 혈청이 포함된 웨이마우스 MB 752/1 배지에서 배양하였다. 이 세포를 HCCR-1MN으로 명명하였다.
실시예 7: 마우스 암 세포주 HCCR-1MN의 형태학적 특성
실시예 6에서 얻은 HCCR-1MN 세포의 형태학적 특성을 조사하기 위해, 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 위상차 현미경 관찰하였다.
도 8은 HCCR-1MN 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다. 도 8에서 보듯이, HCCR-1MN 세포는 실시예 3의 단계 1에 나타낸 HCCR-1M 세포와 유사한 형태학적 특성을 가진다.
실시예 8: 마우스 세포주 HCCR-1M과 HCCR-1MN의 웨스턴 블롯 분석
마우스 세포주 HCCR-1M과 HCCR-1MN에서 HCCR-1 유전자의 발현을 조사하기 위해, 실시예 1 및 6에서 얻은 HCCR-1M 및 HCCR-1MN 세포에 대해 제조예 2에서 얻은 항-HCCR-1 혈청을 사용하여 참조예 2의 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 이 때 비교를 위해 야생형 NIH/3T3 세포와 비교예에서 얻은 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포를 사용하여 동일하게 실시하였다.
도 9는 HCCR-1M 및 HCCR-1MN 세포에서 HCCR-1 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기에서 제1열은 야생형 NIH/3T3 세포의 단백질 시료이고, 제2열은 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포의 단백질 시료이며, 제3열은 HCCR-1M 세포의 단백질 시료이고, 제4열은 HCCR-1MN 세포의 단백질 시료이다. 도 9에서 보듯이, HCCR-1M과 HCCR-1MN 세포에서는 50 kDa 크기의 HCCR-1 단백질이 과발현되었으나, 야생형 세포 및 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 세포에서는 HCCR-1 단백질의 발현이 미미하여 희미한 밴드로 나타났다.
실시예 9: 인간 세포주 HCCR-1H의 특성
인간 세포주 HCCR-1H의 형태학적 특성을 조사하기 위해, 실시예 2에서 얻은 인간 HCCR-1H 세포를 사용하여 실시예 3의 단계 1에서와 동일한 방법으로 위상차 현미경 관찰하였다.
도 10a 및 10b는 각각 HCCR-1H 및 야생형 293 세포의 위상차 현미경 사진(x300)이다. 도 10a 및 10b에서 보듯이, HCCR-1H 세포는 야생형 293 세포에 비해 세포 크기와 세포충실성(cellularity)이 증가하였다.
실시예 10: 인간 세포주 HCCR-1H의 종양형성능 시험
인간 세포주 HCCR-1H의 종양형성능을 조사하기 위해, 실시예 2에서 얻은 HCCR-1H 세포를 사용하여 실시예 4에서와 동일한 방법으로 종양형성능 시험을 수행하였다.
그 결과, HCCR-1H 세포가 이종이식(xenograft)된 후 21일째에 누드 마우스에서 1 ㎝ 이상의 크기를 가진 촉지성 종괴가 형성되었다. 이러한 결과로부터 HCCR-1H 세포가 종양형성능을 가짐을 알 수 있다.
종양의 크기가 1 내지 1.5 ㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시킨 후 종양을 적출하여, 후속하는 종양 분석 과정에서 시료로 사용하였다.
실시예 11: 인간 세포주 HCCR-1H가 이식된 누드 마우스의 종양 분석
인간 세포주 HCCR-1H에 의해 유도된 누드 마우스 종양의 특징을 조사하기 위해, 헤마톡실린-에오신 염색 및 면역조직화학 분석을 수행하였다.
(단계 1) 헤마톡실린-에오신 염색
실시예 10에서 얻은 누드 마우스 종양 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다.
도 11은 누드 마우스 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 결과(x250)이다. 도 11에서 보듯이, 누드 마우스 종괴는 부정형(atypism)의 세포 모양, 다형성(pleomorphism), 핵인의 증대(nucleolar enlargement), 세포질에 대한 핵의 비율(nuclearcytoplasmic ratio) 증가 등의 전형적인 상피세포 암종(typical epithelial cell carcinomas)의 특징을 가진다.
(단계 2) 면역조직화학 분석
실시예 10에서 얻은 누드 마우스 종양 종괴를 1차 항체로서 항-사이토케라틴 8, 항-사이토케라틴 19 및 항-비멘틴 항체(DAKO)를 사용하여 참조예 3의 방법으로 면역조직화학 분석하였다.
도 12a, 12b 및 12c는 각각 누드 마우스 종괴에서 사이토케라틴 8, 사이토케라틴 19 및 비멘틴 단백질을 나타내는 면역조직화학 분석 결과(x250)이다. 도 12a 내지 12c에서 보듯이, 누드 마우스 종괴 세포들은 상피 표지 단백질인 사이토케라틴 8과 19 및, 간엽표지 단백질인 비멘틴을 함께 발현한다. 이러한 결과로부터, HCCR-1 유전자가 신장 유래의 293 세포를 상피 세포로 변화시킴을 알 수 있다.
실시예 12: 인간 세포주 HCCR-1H의 노던 블랏 분석
인간 세포주 HCCR-1H에서 HCCR-1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 실시예 2에서 얻은 HCCR-1H 세포로부터 참조예 4의 방법으로 총 RNA를 분리한 후32P-표지된 무작위 프라임된 HCCR-1 전체 cDNA 프로브를 사용하여 참조예 5의 방법으로 노던 블랏을 실시하였다.
도 13은 HCCR-1H 세포에서 HCCR-1 유전자의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 여기에서 제1열은 야생형 293 세포의 총 RNA 시료이고, 제2열 내지 제6열은 HCCR-1H 세포의 총 RNA 시료이다. 도 13에서 보듯이, HCCR-1H 세포는 약 2.1 kb 크기의 단일 mRNA를 과발현하는데 반해 야생형 293 세포는 발현이 확인되지 않았다.
실시예 13: 마우스 세포에서 HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정
마우스 세포에서 HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정을 조사하기 위해, 일반적인 종양형성 과정에 관련있는 것으로 보고된, 단백질 키네이즈 C(PKC)와 텔로머레이즈 활성의 이상, 세포주기 체크포인트(checkpoint) 조절 기능의 상실, egr-1, c-fos 및 GAPDH 발현의 변화 등을 다음과 같이 조사하였다.
(단계 1) PKC 활성 분석
일반적으로 종양에서는 PKC-매개 신호전달 과정에서의 이상이 나타나는데, HCCR-1 유전자에 의한 종양형성과정에서 PKC 활성을 다음과 같이 조사하였다.
실시예 1에서 얻은 마우스 HCCR-1M 세포, 비교예에서 얻은 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 PKC 활성을 SigmaTECTTM단백질 키네이즈 C 분석 시스템(Promega)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 이 때 PKC 활성은 인지질 부재시와 존재시에 분 당 기질에 도입되는 PKC 양의 차이로 정의된다. 각각의 값은 3회의 독립적인 실험 후 평균±표준편차로 나타내었다.
도 14는 HCCR-1M 세포, pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 PKC 활성을 나타내는 그래프이다. 도 14에서 보듯이, HCCR-1M 세포의 PKC 활성은 야생형 세포보다 약 10배 정도 더 높으며, 이러한 결과로부터 HCCR-1 유전자가 세포내 PKC 활성을 증가시킴을 알 수 있다.
(단계 2) 텔로머레이즈 활성 분석
일반적으로 종양에서는 증가된 PKC 활성으로 인해 텔로머레이즈 활성이 비정상적으로 증가하는데, HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정에서의 텔로머레이즈 활성을 다음과 같이 조사하였다.
실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포, 비교예에서 얻은 pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 텔로머레이즈 활성을 텔로머레이즈 PCR-ELISA 키트(Boehringer Mannheim, 미국)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 이 때 이 키트에 포함된 인간 텔로머레이즈에 양성인 불멸화된 인간 신장 유래의 293 세포를 양성 대조군으로 사용하였으며, RNase로 미리 처리된 293 세포(+RNase)를 음성 대조군으로 사용하였다. 분석 시험은 1 x 103세포 해당량의 추출량으로 수행되었다. 4 회의 독립적인 실험에서 얻은 흡광도(OD) 값을 나타내었다(평균 ±표준편차).
도 15는 HCCR-1M 세포, pcDNA3 벡터가 도입된 비교 NIH/3T3 세포, 야생형 NIH/3T3 세포, 양성 대조군 세포 및 음성 대조군 세포의 텔로머레이즈 활성을 나타내는 그래프이다. 도 15에서 보듯이, 야생형 세포의 텔로머레이즈 활성은 검출가능한 정도로 미미한 반면, HCCR-1M 세포의 텔로머레이즈 활성은 야생형에 비해 약 7배 정도 증가하였다. 또한 양성 대조군 세포는 높은 텔로머레이즈 활성을 보인 반면, 음성 대조군 세포는 활성을 보이지 않았다. 이러한 결과는 이전의 연구(Holt, S. E., Wright, W. E. and Shay J. W.Mol. Cell Biol. 16, 2932-2939 (1996)))와도 일치하는 것으로, HCCR-1M 세포가 활성화된 PKC에 의해 높은 텔로머레이즈 활성을 보임을 나타낸다.
(단계 3) 세포주기 시험
일반적으로 종양 세포는 세포주기 조절 과정에 이상을 보이는데, HCCR-1 유전자에 의해 종양이 유도된 실시예 1의 HCCR-1M 세포의 세포 주기 프로필을 다음과 같이 조사하였다.
대수증식기(mid-log phase)의 HCCR-1M 및 야생형 NIH/3T3 세포를 0.5% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 36 시간 동안 배양하여 성장을 중지시킨 후, 트립신으로 처리하고 수확한 다음 70% 에탄올에서 고정시켰다. 이어서, 고정된 세포 2 x 106개에 프로피디움 요오다이드 염색 용액(Sigma) 50㎍/㎖ 및 RNase A (Boerhinger Mannheim) 100 단위/㎖를 가하고 30 분 동안 반응시킨 후, FACS Caliber(Becton Dickinson)를 이용하여 488 ㎚ 파장에서 형광 분석하여 세포 DNA 함량을 측정하였다. 이 결과를 Modfit 5.2 소프트웨어(Becton Dickinson)로 분석하여, 시료 당 최소 1x104개 세포가 있음이 확인되었다.
이어서, HCCR-1 세포 및 야생형 NIH/3T3 세포의 G0/G1, S 및 G2/M 기에서의 상대적 세포 함량을 측정하였으며, 그 결과는 표 1과 같다.
표 1에서 보듯이, 야생형 및 HCCR-1M 세포에서 S 기 세포 함량은 각각 20.6%및 31.5%이었다. 이러한 결과로부터 다수의 HCCR-1M 세포가 G0/G1기에서 S 기로 변화함을 알 수 있다.
혈청-의존성 세포주기 변화를 조사하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 HCCR-1M 세포와 야생형 NIH/3T3를 각각 0.5% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 36 시간 동안 배양하여 세포 성장을 중지시킨 후, 20% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지로 옮겨 배양하면서 미리 정한 시간에 수확하여, G0/G1, S 및 G2/M기의 상대적 세포 함량을 측정하였으며, 그 결과는 표 2와 같다.
표 2에서 보듯이, 혈청 부족 상태인 0 시에 정상 세포의 S기 세포 함량은 8%인데 반해, HCCR-1M 세포의 S기 세포 함량은 21.8%이었는데, 이러한 결과는 혈청 부족으로 유도되는 G0/G1기 정체(arrest)가 HCCR-1 유전자의 과발현으로 인해 상대적으로 저지되었음을 나타낸다. 또한 20 % 혈청이 포함된 배지로 옮겨 세포의 성장 정체를 해소시킨 후에는 HCCR-1M 세포의 S 기 세포 함량이 야생형 세포에 비해 10% 이상 일관되게 증가하였다. 이러한 결과로부터 HCCR-1 유전자의 과발현이G0/G1기를 단축시키고, S 기 세포수를 증가시켜 세포 성장을 교란시킴을 알 수 있다.
(단계 4) egr-1, c-fos 및 GAPDH 발현 양상
일반적으로 erg-1, c-fos 및 GAPDH 발현 양상이 종양 형성에 관련되는데, 실시예 1에서 얻은 HCCR-1 세포에서 egr-1, c-fos 및 GAPDH의 발현 양상을 다음과 같이 조사하였다.
대수증식기(mid-log phase)의 HCCR-1M 및 야생형 NIH/3T3 세포를 0.5% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 36 시간 동안 배양하여 성장을 중지시킨 후(휴지기), 신선한 20 % 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 0, 15, 30, 60, 120 분 동안 배양하여 성장을 촉진하였다(분열기). 휴지기와 분열기의 세포로부터 참조예 4의 방법으로 총 RNA를 분리한 후32P-무작위 프라임된 egr-1, c-fos 및 GAPDH cDNA 프로브를 사용하여 참조예 5의 방법으로 노던 블랏을 실시하였다.
도 16a, 16b 및 16c는 각각 HCCR-1M 세포에서 egr-1, c-fos 및 GAPDH의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이며, 여기에서 제1열 내지 제5열은 각각 0, 15, 30, 60, 120 분 배양 후 얻은 야생형 NIH/3T3 세포의 총 RNA 시료이고 제6열 내지 제10열은 각각 0, 15, 30, 60, 120 분 배양 후 얻은 HCCR-1M 세포 총 RNA 시료이다. 도 16a 내지 16c에서 보듯이, HCCR-1M 세포는 분열기에 erg-1의 발현이 야생형 세포에 비해 하향 조절(down-regulation)되었으며, 이와는 대조로 GAPDH의 발현이 상향 조절(up-regulation)되었고, c-fos 발현에는 유의미한 변화가 없었다.
이러한 결과를 종합하면, 마우스 NIH/3T3 세포에서 HCCR-1 유전자가 조절 이상으로 과발현되면(deregulation), PKC와 텔로머레이즈가 활성화되고, 세포주기 체크포인트 조절 기능이 상실되며, egr-1의 발현이 하향 조절되어, 악성 종양으로 전환됨을 알 수 있다.
실시예 14: 인간 세포에서 HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정
인간 세포에서 HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정을 조사하기 위해, 일반적으로 종양과 관련된 것으로 보고된 p53 종양 억제 유전자, MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A 및 p14ARF유전자의 발현 양상을 조사하였다.
(단계 1) p53 종양 억제 유전자의 발현 양상
HCCR-1H 세포에서 p53 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해, 웨스턴 블랏과 노던 블랏을 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 실시예 2에서 얻은 HCCR-1H 세포 및 야생형 293 세포를 파쇄한 후, 야생형 p53에 반응하는 항-p53 모노클로날 항체 DO-7(아미노산 37 내지 45; Novocastra laboratories, Ltd., 영국) 또는 야생형과 변이형 p53 모두에 반응하는 항-p53 모노클로날 항체 DO-7(아미노산 잔기 37 내지 45; NEOMARKERS, INC.)를 사용하여 참조예 2의 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 이 때, 동일 블랏을 항-인간 마우스 β-액틴 항체(시그마사)와 반응시켜 단백질 총량을 확인하였다.
도 17a는 HCCR-1H 세포에서 p53의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 17b는 동일 블랏의 β-액틴을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다. 도 17a에서 제1열은 야생형 293 세포의 단백질 시료이고, 제2열 및 제3열은 HCCR-1H 세포의 단백질 시료이다. 도 17a에서 보듯이, HCCR-1 세포는 p53을 강하게 발현하지만 야생형 세포는 p53을 약하게 발현하였다.
또한 실시예 2에서 얻은 HCCR-1H 세포를 2% 우태아 혈청과 2 mM 글루타민(Sigma)이 함유된 메티오닌 결핍 RPMI 1640 배지(Sigma)에서 2 시간 동안 배양한 후 100 ㎕의 L-35S 메티오닌(Amersham)으로 세포들을 표지화시켰다. 이 세포들을 완충용액으로 세척한 후 L-메티오닌이 포함된 정상 RPMI-1640 배지에서 0.5, 1, 2 또는 4 시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 면역침강 반응액에 용해시킨 후 50 ㎕의 단백질 A-세파로즈 용액(Sigma)으로 세척한 다음 정량하였다. 세포 용해질들을 항 p53 항체로 면역침강반응시킨 후(Kessler, S. W.J Immunol.,115, 1617-1623 (1975)) SDS-PAGE를 수행하였다. 이때 p53 유전자가 없는 대조군으로서 Hep 3B 간암세포(ATCC HB-8064)를 사용하여 동일하게 실시하였다.
도 18은 야생형 인간 293 세포 및 인간 HCCR-1H 세포에서 종양 억제 유전자 p53의 발현을 보여주는 면역침강반응 결과이며, 여기에서 제1열은 대조군 세포의 단백질 시료이고, 제2열 내지 제6열은 야생형 293 세포를 0, 0.5, 1, 2 및 4 시간 동안 배양한 후 얻은 단백질 시료이고, 제7열 내지 제11열은 HCCR-1H 세포를 0.5, 1, 2 및 4 시간 동안 배양한 후 얻은 단백질 시료들이다. 도 18에서 보듯이, HCCR-1H 세포에서 p53 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비해 현저히 상승하였다. 따라서 HCCR-1 유전자에 의한 종양형성 과정에서 p53 단백질은 높은 수준으로발현되지만, 불활성화된 단백질로만 남아 종양억제 기능을 다하지 못하는 것으로 생각된다.
(단계 2) MDM2, bax, p21WAF1, p16INK4A 및 p14ARF유전자의 발현 양상
p53 종양 억제 단백질은 MDM2, Bax 및 p14ARF가 관여하는 조절 고리(loop)의 일부이며 종양억제유전자 p21WAF1 및 p16INK4A에 직접 영향을 미치므로, HCCR-1H 세포에서 MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A 및 p14ARF활성을 조사하였다.
실시예 2에서 얻은 HCCR-1H 세포와 MDM2, Bax, p21WAF1 및 p16INK4A 항체(Oncogene, research products, 미국) 및 p14ARF항체(Lab Vision, 미국)를 사용하여 참조예 2의 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다. 동일 블랏을 β-액틴으로 하이브리드화시켜 단백질 총량을 확인하였다.
도 19aa, 19ba, 19ca, 19da 및 19ea는 각각 본 발명의 다른 태양에 따른 HCCR-1H 세포에서 MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A 및 p14ARF유전자의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이고, 도 19ab, 19bb, 19cb, 19db 및 19eb는 각각 상기 블랏의 β-액틴을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다. 여기에서 제1열은 야생형 293 세포의 단백질 시료이고, 제2열 및 제3열은 HCCR-1H 세포의 단백질 시료이다. 도 19a 내지 19d에서 보듯이, HCCR-1H 세포에서 MDM2, Bax, p21 및 p16 단백질은 야생형 293 세포에 비해 감소하였다. 이러한 결과는 HCCR-1 유전자의 과발현 신호가 MDM2, Bax, p21WAF1 및 p16INK4A 유전자의 전사를 억제하여 그 발현을 감소시킨다. 이결과를 (단계 1)의 결과와 종합하면, HCR-1 유전자의 과발현은 p53 단백질의 안정성을 증가시키나, 이 p53 단백질은 MDM2, bax 및 p21WAF1 유전자의 발현을 양성 조절하는 자기조절 고리를 형성하지 않는 것으로 보인다. 특히, 도 19c 및 19d에서 보듯이, HCCR-1H 세포에서 키네이즈 억제 단백질 패밀리 p21WAF1과 p16INK4A는 p53-비의존적 기작에 의해 하향조절되었다. 또한 도 19e에서 보듯이, p14ARF는 야생형 293 또는 HCCR-1 세포에서 이상 발현되지 않는 것으로 보이며, 이러한 결과는 MDM2-p14ARF고리의 변화가 p53 불활성화 기작이 아님을 나타낸다.
이러한 결과를 실시예 13의 단계 3의 결과와 종합해 볼 때, 마우스와 인간 세포 모두에서 HCCR-1 유전자의 과발현이 세포 주기 조절에 영향을 미치며, 세포 주기 조절자인 p53 및 p21과도 관련성이 있음을 알 수 있다.
(단계 3) HCCR-1 단백질과 상호작용하는 단백질의 분석
HCCR-1 단백질과 상호작용하는 파트너 단백질을 조사하기 위해, 효모 2-하이브리드 스크린(yeast two-hybrid screen) 분석을 다음과 같이 수행하였다.
대장균 JM-109/HCCR1(기탁번호 제 KCTC 0667BP 호)의 배양액으로부터 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1을 분리한 후 제한효소 SalI으로 절단하여 얻은 HCCR-1 유전자를 pLexA DNA-결합 도메인을 포함하는 효모 2-하이브리드 벡터(Clontech)의 BamHI/SalI 부위에 삽입하여, pLex DNA-결합 도메인과 HCCR-1 단백질의 융합 단백질을 발현하는 벡터 pLexA-HCCR-1을 얻었다. 이 벡터 pLexA-HCCR-1을 효모 EGY48(Clontech, 미국)와 함께 42 ℃에서 10 분 동안 가열하여 효모를 형질전환시켰다. 이 효모를 pB42AD(pLexA-활성화 도메인을 포함함)와 융합된 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech, 미국)로 동일 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체가 있는 평판으로부터 리플리카-플레이팅 방법에 따라 리플리카를 얻은 후 Trp-, Leu-, His- 선택 평판 배지위에서 배양하여, β-갈락토시데이즈 필터 리프트 분석(β-galactosidase filter lift assay)을 수행하였다. 이 때, 형질전환체가 라이브러리로부터 유래하는 파트너 유전자를 가지는 경우에는, pLexA 활성화 도메인과 융합된 파트너 단백질이 pLexA DNA-결합 도메인과 융합된 HCCR-1 단백질와 결합함으로써, X-gal 이 들어있는 평판 배지에서 청색 콜로니를 형성한다. 가양성(false positive)를 제거하기 위해 효모 교배 분석(yeast mating assay)을 수행하였다(Guarente, L.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1639-1641 (1993)).
얻어진 클론으로부터 HCCR-1 단백질과 상호작용하는 파트너 단백질을 코딩하는 유전자를 스크린닝하였다.
이 콜로니를 글루코즈 배지에서 배양한 후 글래스 비드를 이용하여 파트너 유전자를 포함하는 벡터를 추출하였다. 이 벡터를 대장균 KC8(Clontech, 미국) 균주에 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 도입한 후 형질전환체를 M9 최소 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후 다시 대장균 DH5α에 형질전환시키고 LB 배지에서 배양하여 플라스미드 DNA를 증폭하였다. 이 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후 HindIII로 절단하여 파트너 유전자를 포함하는 약 1 kb 단편을 얻었다. 이 유전자의 염기서열을 분석한 결과 이 유전자는 TPD52L2(GenBank 등록번호 제 NM 003288호)로 확인되었다. 이 유전자가 코딩하는 D52 단백질은 인간 유방암에서 상승된 발현 수준을 통해 확인된 것으로, 칼슘-매개 신호전달 과정과 세포 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Byrne, J.A., et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); 및 Bryne, J.A. et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998)).
(단계 4) HCCR-1과 TPD52L2 유전자의 공동 형질감염
HCCR-1 단백질과 D52 단백질의 상호작용을 확인하기 위해, 다음과 같이 공동 형질감염하였다.
우선, 대장균 JM-109/HCCR1(기탁번호 제 KCTC 0667BP 호)의 배양액으로부터 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1을 분리한 후 SalI으로 절단하여 HCCR-1 전장 cDNA 서열을 얻은 다음 발현 벡터 N-terminal pFALG-CMV(Sigma, 미국)의 SalI 부위에 삽입하여, FLAG와 HCCR-1 의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터 pFLAG-HCCR-1을 얻었다. 또한, 단계 3에서 얻은 TPD52L2 유전자를 GST 유전자가 삽입된 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen, 미국)의 NotI 부위에 삽입하여 GST와 D52의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터 pGST-TPD52L2를 얻었다.
상기 발현 벡터 pFLAG-HCCR-1와 pGST-TPD52L2를 CHO 세포에 공동 형질감염시킨 후 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 48 시간 후에 CHO 세포를 트립신 처리한 다음 수확하고 27 게이지 바늘을 이용하여 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 전면역 혈청(Sigma, 미국)으로 미리청소(preclear)한 다음, 세포 파쇄물 중의 FLAG-HCCR-1 또는 GST-TPD52L2 융합 단백질을 항-FLAG 또는 항-GST 항체(Sigma, 미국)를 사용하여 면역침강시켜 제거하였다(Kesler, S.W.,J Immunol.,115, 1617-1623 (1975)).남은 단백질 시료를 항-GST 또는 항-FLAG 항체를 사용하여 참조예 2의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
도 20a 및 20b는 FLAG와 HCCR-1의 융합단백질을 발현하는 벡터 및 GST와 D52의 융합단백질을 발현하는 벡터로 공동 형질감염된 CHO 세포의 파쇄물을 항 FLAG 항체 및 항 GST 항체로 면역침강반응시켜 얻은 침전물을 각각 항 GST 항체 및 항 FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석한 결과이다. 도 20a 및 20b에서 보듯이, 항 FLAG 항체 및 항 GST 항체를 사용한 경우 모두에서 융합 단백질이 검출되었다. 이러한 결과로부터 D52 단백질은 HCCR-1 단백질과 결합하여 상호작용함을 알 수 있다.
실시예 15: 형질전환 마우스의 제조
HCCR-1 유전자가in vivo에서 종양형성을 유도하는지를 확인하기 위해, CMV 프로모터 하에서 HCCR-1 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 제조하였다.
먼저 형질전환 마우스의 제조에 사용할 DNA를 얻기 위해, 대장균 JM-109/HCCR1(기탁번호 제 KCTC 0667BP 호)의 배양액으로부터 발현벡터 pCEV-LAC/HCCR-1을 분리한 후 SalI으로 절단하여 HCCR-1 유전자를 얻고 이를 pcDNA3 벡터에 삽입하여 발현 벡터 pcDNA3-HCCR-1를 얻었다. 이 발현벡터를 SalI과 XmnI으로 절단하고 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 일렉트로일루션(electroelution) 방법으로 분리하였으며, 분리된 DNA 절편을 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)/0.2 mM EDTA 용액 중에서 투석하고 최종 농도가 4 ng/㎖가 되게 하였다. 이렇게 얻어진 DNA는 도 21에 나타낸 바와 같이, CMV 프로모터, HCCR-1 cDNA 유전자 및 소성장호르몬(bGH) 폴리A 서열을 포함하는 구조를 가진다.
이 DNA를 마우스 FVB/N((주)샘타코)의 수정란에 전핵 DNA 미세주입(pronuclear DNA microinjection) 방법(Gordon, J.W., et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7382-7384 (1980))에 따라 다음과 같이 도입하였다. 상기 DNA 용액을 1 세포기 수정란의 전핵에 미세주입한 후 20 시간 동안 배양하여 2 세포기에 이른 수정란만을 선별하여 가임신된 ICR 종 대리모 마우스((주)샘타코)의 난관 팽대부에 이식하였다. 대리모로부터 출산된 산자 마우스를 얻었으며, 산자 마우스의 꼬리 생검 DNA 시료로 서던 블랏을 수행하여 형질전환 여부를 확인하였다.
도 22는 HCCR-1 유전자가 도입되어 암이 유발된 형질전환 마우스 사진이다. 도 22에서 보듯이, 형질전환 마우스는 흉부에 인접한 오른쪽 겨드랑이 부위에 약 1.5 x 1.5 ㎝ 크기의 종양을 가지고 있다.
형질전환 마우스의 종양을 분리한 후 육안으로 관찰하였다.
도 23은 형질전환 마우스의 흉부 종양 사진이다. 도 23에서 보듯이, 형질전환 마우스의 종양은 피막(capsule)이 없는 국한성 결절(well-circumscribed nodule)이었다.
종양의 형태학적 특성을 조사하기 위해, 형질전환 마우스의 종양을 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 도 24는 형질전환 마우스 종양의 헤마톡실린-에오신 염색 결과(x100)이다. 도 24에서 보듯이, 종양은 유두형 구조와 샘 또는 관 유사 구조로 이루어졌으며, 중앙부에는 광범위한 괴사가 일어나있으며, 종양의 외부에정상 흉부 조직이 인접해있다. 종양 세포는 입방형 또는 난형이며 그 경계가 구별하기 어렵고 상당량의 과립성 호산성 세포질을 가진다. 이러한 결과로부터, 형질전환 마우스의 종양은 흉부의 생식관 유두형 선암종 특성을 가짐을 알 수 있다.
도 25는 형질전환 마우스 종양의 전자현미경 사진(스케일바는 2 ㎛)이다. 도 25에서 보듯이, 종양 세포는 난형의 모양을 가지며 다량의 세포 소기관을 가진다. 종양 세포의 핵은 덩어리(clump)를 이루며 가장자리에 염색질과 핵소체를 가지며, 세포질은 상당량의 미토콘드리아와 소낭화된 조면 소포체로 차 있다. 세포들은 데스모좀에 의해 연결되어 있다.
얻어진 형질전환 마우스의 수정란 HCCR-1으로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000 년 12 월 26 일자 기탁번호 제 KCTC 0924BP 호로 기탁하였다.
실시예 16: 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 HCCR-1 유전자의 발현
인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 HCCR-1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 암환자로부터 적출된 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직으로부터 참조예 4의 방법으로 총 RNA를 분리한 후32P-표지된 무작위 프라임된 HCCR-1 전체 cDNA 프로브를 사용하여 참조예 5의 방법으로 노던 블랏을 실시하였다. 이 때 비교를 위해 적출된 정상 유방, 신장, 난소 및 위암 조직을 사용하여 동일하게 실시하였다.
도 26a는 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 인간 원암 유전자 HCCR-1의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이고, 도 26b는 동일 블랏을 β-액틴 프로브로 하이브리드화한 노던 블랏 결과이다. 여기에서 제1열 및 제2열은 각각 정상 유방 및 유방암 조직의 총 RNA 시료이고, 제3열 및 제4열은 정상 신장 및 신장암 조직의 총 RNA 시료이며, 제5열 및 제6열은 정상 난소 및 난소암 조직의 총 RNA 시료이고, 제7열 및 제8열은 정상 위 및 위암 조직의 총 RNA 시료이다. 도 26에서 보듯이, HCCR-1 유전자는 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 정상 조직에 비해 과발현되었다.
또한 상기 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 발현된 HCCR-1 단백질을 조사하기 위해, 상기 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에 대해 제조예 2에서 얻은 항-HCCR-1 혈청을 사용하여 참조예 2의 방법으로 웨스턴 블랏을 실시하였다.
도 27은 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 인간 원암 단백질 HCCR-1의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다. 여기에서 제1열 및 제2열은 각각 정상 유방 및 유방암 조직의 단백질 시료이고, 제3열 및 제4열은 정상 신장 및 신장암 조직의 단백질 시료이며, 제5열 및 제6열은 정상 난소 및 난소암 조직의 단백질 시료이고, 제7열 및 제8열은 정상 위 및 위암 조직의 단백질 시료이다. 도 27에서 보듯이, 인간 유방암, 신장암, 난소암 및 위암 조직에서 50 kDa 크기의 HCCR-1 단백질이 과발현되었다.
실시예 17: 인간 원암 유전자 HCCR-1의 염색체상 위치
제조예 1에서 얻은 HCCR-1의 cDNA 전장 서열을 무작위 프라임 표지 키트(random prime labelling kit, Promega, 미국)를 이용하여 표지시킨 후 이를프로브로 사용하여 인간 태반 게놈 라이브러리(Stratagene, 미국)를 스크린닝하여, 약 20 kb 크기의 게놈 DNA를 얻었다.
이 게놈 DNA를 이용하여 문헌((Cherif, D. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 6639-6643 (1990))의 방법에 따라 형광 동소보합 결합(Fluorescence in situ hybridization; FISH) 분석을 실시하였다. 즉, 게놈 DNA를 닉 트랜스레이션 키트(nick translation kit, Vysis, IL, USA)를 이용하여 SpectrumRed-dUTP (Vysis, IL, USA)로 표지한 후 슬라이드를 형광현미경(Zeiss, 미국)로 관찰하고 염색체를 DAPI(Sigma, USA)로 대조염색하였다.
그 결과, 도 28에서 보듯이, HCCR-1 유전자는 12 번 염색체의 장완(12q)에 위치함을 알 수 있다.
본 발명의 세포주와 형질전환 마우스는 HCCR-1 유전자의 과발현으로 인해 암을 형성하므로, 항암성 물질의 탐색에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 진단 키트는 위암, 신장암, 난소암 및 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 포유동물 세포주.
  2. 제 1 항에 있어서,
    마우스 세포주 HCCR-1M(기탁번호 제 KCTC 0923BP 호) 또는 인간 세포주 HCCR-1H(기탁번호 제 KCTC 0922BP 호).
  3. 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자를 포함하는 핵산 구조물이 도입된 포유동물 수정란.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 포유동물이 마우스 FVB인 수정란.
  5. 제 4 항에 있어서,
    마우스 수정란 HCCR-1(기탁번호 제 KCTC 0924BP 호).
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항의 수정란으로부터 발생된, 암이 유발된 형질전환 포유동물.
  7. 제 6 항에서,
    유두형 선암종이 유발된 형질전환 포유동물.
  8. 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 원암 유전자로부터 발현된 mRNA 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 프로브 또는 상기 mRNA로부터 해독된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 유방암, 신장암, 난소암 및 위암으로부터 선택된 암의 진단용 키트.
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