ES2273863T3 - Celula cancerigena humana y animal transgenico portador de un protooncogen humano y kit para el diagnostico de cancer utilizand0 dicho protoocogen. - Google Patents

Celula cancerigena humana y animal transgenico portador de un protooncogen humano y kit para el diagnostico de cancer utilizand0 dicho protoocogen. Download PDF

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Abstract

Una célula de mamífero transformada con un vector de expresión que comprende un protooncogen humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la cual es la línea celular de ratón HCCR-1M depositada como KCTC 0923BP o la línea celular humana HCCR-1H depositada como KCTC 0922BP.

Description

Célula cancerígena humana y animal transgénico portador de un protooncogén humano y kit para el diagnóstico de cáncer utilizando dicho protooncogén.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con una célula de mamífero cancerosa transformada con un vector de expresión que comprende un protooncogén humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; un embrión de mamífero no humano que comprende una construcción de ácido nucleico que contiene el protooncogén; un mamífero no humano canceroso transgénico que proviene del embrión de mamífero no humano; y un kit para el diagnóstico del cáncer de mama, de riñón, de ovario o de estómago en el que se utiliza el protooncogén.
Antecedentes de la invención
En los animales superiores, incluyendo el hombre, cada individuo posee aproximadamente 100.000 genes, pero sólo se expresan alrededor del 15% de ellos, y las características de los procesos biológicos del individuo, por ejemplo, la génesis, la diferenciación, la homeostasis, las respuestas a estímulos, el control del ciclo celular, el envejecimiento y la apoptosis (muerte celular programada), están determinadas dependiendo de qué genes se expresan (Liang, P. y A. B. Pardee, Science, 25 7: 967-971 (1992)).
Los fenómenos patológicos como la tumorigénesis están causados por mutaciones de genes, las cuales provocan cambios en el modo en que los genes se expresan.
Se ha descrito que la tumorigénesis está provocada por varios cambios genéticos como la pérdida de heterozigosidad cromosómica, la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumor, por ejemplo, el gen p53 (Bishop, J. M., Cell, 64, 235-248 (1991); y Hunter, T., Cell, 64, 249-270 (1991)). Además, se ha descrito que del 10 al 30% de los cánceres humanos surgen de la activación de oncogenes a través de la amplificación de protooncogenes.
Así, la activación de protooncogenes juega un papel importante en la etiología de muchos tumores y existe la necesidad de identificar protooncogenes.
El presente inventor describió que un protooncogén, el de cáncer humano de cuello del útero 1 (HCCR-1), se sobreexpresa específicamente en células cancerosas (Publicación de patente Coreana abierta No 2001-39566). Con la finalidad de revelar el mecanismo involucrado en la tumorigénesis, el presente inventor se ha propuesto la preparación de una línea celular cancerosa y de un mamífero transgénico que desarrolla cáncer utilizando el protooncogén
HCCR-1.
Resumen de la invención
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una célula de mamífero que tiene introducido el protooncogén HCCR-1.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un embrión de mamífero no humano portador del protooncogén HCCR-1, y un mamífero no humano transgénico que proviene del embrión de mamífero no humano.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un kit para el diagnóstico del cáncer de mama, de riñón, de ovario o de estómago utilizando el protooncogén HCCR-1.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una célula de mamífero transformada con un vector de expresión que comprende el protooncogén humano HCCR-1 que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
Breve descripción de las figuras
Los objetos y características mencionados de la presente invención se desprenderán de la siguiente descripción de realizaciones preferidas, consideradas conjuntamente con las figuras que se adjuntan, en las que:
Las Figs. 1A y 1B son las respectivas figuras de contraste de fase de células HCCR-1M cultivadas en monocapa y células NIH/3T3 naturales parentales;
La Fig. 2 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina de células HCCR-1M cultivadas en monocapa;
La Fig. 3 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de células HCCR-1M;
La Fig. 4 es una fotografía del ratón "nude" con aloinjerto de células HCCR-1M mostrando los nódulos tumorales palpables;
La Fig. 5 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales palpables tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células HCCR-1M;
La Fig. 6 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de los nódulos tumorales palpables tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células HCCR-1M;
Las Figs. 7A a 7D son los resultados de los análisis inmunohistoquímicos que muestran la expresión de fibras de reticulina, queratina, de antígeno de membrana epitelial y vimentina, respectivamente, en los nódulos tumorales palpables tomados del ratón "nude" con aloinjerto de células HCCR-1M;
La Fig. 8 es una figura de contraste de fase de células HCCR-1MN cultivadas en monocapa;
Fig. 9 es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1 en células HCCR-1M y HCCR-1MN;
Las Figs. 10A y 10B son las figuras de contraste de fase de células HCCR-1H cultivadas en monocapa y de células 293 naturales parentales, respectivamente;
La Fig. 11 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales palpables tomados del ratón "nude" con xenoinjerto de células HCCR-1H;
Las Figs. 12A a 12C son los resultados de los análisis inmunohistoquímicos que muestran respectivamente la expresión de citoqueratina 8, citoqueratina 19 y vimentina, en los nódulos tumorales tomados del ratón "nude" con xenoinjerto de células HCCR-1H;
La Fig. 13 es el resultado del análisis por transferencia northern que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1 en células HCCR-1H;
La Fig. 14 es un gráfico que muestra las actividades proteína quinasa C de célula NIH/3T3 natural parental, comparada con célula NIH/3T3 transfectada con el vector pcDNA3 y célula HCCR-1M;
La Fig. 15 es un gráfico que muestra las actividades telomerasa de la célula 293 control positivo, de la célula control negativo, de célula NIH/3T3 natural parental, comparada con célula NIH/3T3 transfectada con el vector pcDNA3 y células HCCR-1M;
Las Figs. 16A a 16C son los resultados de los análisis por transferencia northern que muestran respectivamente la expresión de los genes egr-1, c-fos y gliceraldehído-2-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), en célula HCCR-1M;
La Fig. 17A es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la expresión del gen supresor de tumores p53 en célula HCCR-1H; y la Fig. 17B, \beta-actina de la misma transferencia;
La Fig. 18 es el resultado de la inmunoprecipitación que muestra la expresión del supresor de tumores p53 en célula HCCR-1H;
Las Figs. 19A, 19C, 19E, 19G y 19I son los resultados de los análisis por transferencia western que muestran respectivamente la expresión de los genes MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A y p14^{ARF} en célula HCCR-1H; y las Figs. 19B, 19D, 19F, 19H y 19J, la \beta-actina en cada una de las transferencias anteriores;
La Fig. 20A es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la proteína GST en el precipitado obtenido mediante la inmunoprecipitación de la proteína FLAG de la célula CHO cotransfectada con el vector que expresa la proteína de fusión de FLAG y HCCR-1 y el vector de expresión de la proteína de fusión de GST y D52; y la Fig. 20B, la proteína PLAG en el precipitado obtenido mediante inmunoprecipitación de la proteína GST;
La Fig. 21 es un diagrama esquemático de la construcción de ácido nucleico que contiene el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 22 es un ratón transgénico canceroso que proviene de un embrión que tiene introducido el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 23 es una fotografía del tumor de mama del ratón transgénico que proviene del embrión que lleva introducido el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 24 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina del tumor de mama tomado del ratón transgénico que proviene del embrión que lleva introducido el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 25 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión del tumor de mama tomado del ratón transgénico que proviene del embrión que lleva introducido el protooncogén HCCR-1;
La Fig. 26A es el resultado del análisis por transferencia northern que muestra la expresión del protooncogén
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de hígado, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B, muestra la misma transferencia hibridada con sonda de \beta-actina;
La Fig. 27 es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1 en tejidos tumorales humanos de tumor de mama, de riñón, de ovario, y de estómago; y
La Fig. 28 es el resultado del análisis de hibridación in situ por fluorescencia que muestra la posición del protooncogén HCCR-1 en el cromosoma humano.
Descripción detallada de la invención
El protooncogén humano (de aquí en adelante "protooncogén HCCR-1") de SEQ ID NO: 1 que se utiliza en la preparación de la célula de mamífero y del mamífero no humano transgénico inventivos está localizado en el brazo largo (12q) del 12º cromosoma y tiene un marco abierto de lectura que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y peso molecular de aproximadamente 50 kDa.
Considerando la degeneración de los codones y los codones preferidos en un animal específico donde se expresará el protooncogén de HCCR-1, pueden hacerse varios cambios y modificaciones de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, por ejemplo en su región codificante, sin alterar adversamente la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada, o en la región no codificante sin afectar adversamente la expresión del protooncogén HCCR-1. Por lo tanto, la presente invención también incluye, en su alcance, un polinucleótido que tiene sustancialmente la misma secuencia de bases que el protooncogén HCCR-1, y un fragmento de la misma. Tal y como se utiliza aquí, "sustancialmente el mismo polinucleótido" se refiere a un polinucleótido cuya secuencia de bases muestra un 80% o más, preferiblemente un 90% o más, más preferiblemente un 95% o más de homología con el protooncogén HCCR-1.
El protooncogén HCCR-1 puede obtenerse a partir de tejidos de cáncer humano o sintetizarse utilizando un método convencional de síntesis de ADN. Además, el protooncogén HCCR-1 obtenido de esta manera puede insertarse en un vector convencional para la preparación de un vector de expresión.
El vector de expresión puede, a su vez, introducirse en una célula de mamífero apropiada para obtener una célula de mamífero transfectada con el vector de expresión. Por ejemplo, las células NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), una línea celular de fibroblastos de ratón diferenciada, y las células 293 (ATCC CRL 1573), una línea celular de riñón embrionario humano, fueron transfectadas con el vector de expresión pcDNA3/HCCR-1 que contiene el protooncogén HCCR-1 para obtener las células NIH/3T3 y 293 transfectadas con el protooncogén HCCR-1, designadas como células HCCR-1M y HCCR-1H, respectivamente, las cuales fueron depositadas en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) (dirección: #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, República de Corea) el 26 de diciembre de 2000, bajo los números de acceso KCTC 0923BP y KCTC 0922BP, respectivamente, de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.
La célula de mamífero inventiva obtenida de esta manera sobreexpresa el protooncogén HCCR-1 y muestra características morfológicas de células gigantes tumorales. Concretamente, la célula de ratón HCCR-1M tiene una forma poligonal, núcleo lobulado con nucléolos prominentes, un retículo endoplasmático rugoso (rER) y complejos de Golgi bien desarrollados, y microvellosidades en la superficie de la célula, y muestra figuras mitóticas atípicas. La célula humana HCCR-1H tiene unas dimensiones celulares y una celularidad mayores que la célula natural.
La célula de mamífero inventiva presenta tumorigenicidad y por lo tanto un mamífero con injertos de la célula de mamífero inventiva desarrolla un tumor, por ejemplo, un tumor palpable. Además, una célula de mamífero aislada del tumor presenta tumorigenicidad. Por ejemplo, una célula de ratón, designada como HCCR-1MN, aislada de un tumor palpable de un ratón "nude" injertado con células HCCR-1M tiene características morfológicas similares a aquellas de la célula HCCR-1M.
La célula de mamífero inventiva produce una gran cantidad de proteína HCCR-1 que interactúa con la proteína D52 (número de acceso GenBank NM003288), de la que se ha descrito que está asociada con el carcinoma de mama (Byrne, J.A., et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); y Byrne, J.A., et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998)). Ésta también aumenta las actividades de una proteína quinasa C celular (PKC) y de la telomerasa, induce la pérdida de algunos controles concretos de las etapas del ciclo celular, y suprime la expresión de egr-1, por lo que predispone a las células a la conversión maligna. En este proceso, la expresión del gen supresor de tumores p53 involucrado en el control del ciclo celular incrementa mientras que la mayoría de las proteínas p53 se inactivan llevando, por lo tanto, a conversión maligna. El protooncogén HCCR-1 induce la inactivación funcional del supresor de tumores p53 en un nivel aguas arriba (en inglés, "upstream"). Por lo tanto, si se identifica un fragmento del protooncogén HCCR-1 que regula el gen p53, puede recuperarse la actividad p53 mediante el cambio de la secuencia de nucleótidos correspondiente.
Además, una construcción de ácido nucleico que comprende el protooncogén HCCR-1 puede introducirse en un embrión de un mamífero no humano apropiado, por ejemplo, un ratón, y el embrión de mamífero obtenido de esta manera puede implantarse en el útero de un receptor apropiado y permitir que se desarrolle para acabar obteniendo un mamífero transgénico. El método de preparación de un mamífero transgénico es bien conocido en el estado de la técnica, y es preferible introducir la construcción de ácido nucleico en un embrión en el estadio embrionario de 8 células o anterior.
El mamífero transgénico no humano obtenido de esta manera sobreexpresa el protooncogén HCCR-1 y desarrolla un adenocarcinoma intracanalicular papilar de mama que muestra los siguientes aspectos característicos: nódulo bien definido sin cápsula; estructuras papilares y estructuras glandulares o en forma de huso; necrosis extensiva localizada en la zona central; células cuboides y ovoides con límites poco definidos; tejidos normales de mama alrededor suyo; y una cantidad significativa de citoplasma eosinófilo granular.
Se puede obtener un embrión transgénico no humano cruzando un mamífero transgénico macho y una hembra. Un ejemplo de embrión transgénico es el embrión de ratón FVB/N (denominado como embrión de ratón HCCR-1) que es portador de la construcción de ácido nucleico que tiene la estructura de la Fig. 21, que se depositó bajo el número de acceso KCTC 0924BP en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) (dirección: #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, Republica de Corea) el 26 de diciembre de 2000 de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.
Puesto que la célula de mamífero y el mamífero transgénico no humano inventivos, sobreexpresan el protooncogén HCCR-1 para desarrollar cáncer, son utilizados ventajosamente en el cribado de agentes cancerígenos o anticancerígenos, por ejemplo, antioxidantes.
Además, el protooncogén HCCR-1 se sobreexpresa en cánceres de mama, de riñón, de ovario y de estómago, y por lo tanto, su producto puede ser utilizado con efectividad en el diagnóstico de los cánceres. El diagnóstico del cáncer puede realizarse mediante la reacción del ARNm o de una muestra de proteína tomada de tejido de mama, de riñón, de ovario o de estómago de un sujeto, con una sonda o un anticuerpo que se una específicamente al ARNm o a la proteína expresada por el protooncogén HCCR-1; y detectando el ARNm o la proteína HCCR-1 según varios métodos conocidos en el estado de la técnica, y determinando de esta manera si el sujeto ha sobreexpresado productos del protooncogén HCCR-1. La presencia del producto del protooncogén puede ser fácilmente detectable mediante el marcaje de la sonda o del anticuerpo con un radioisótopo o un enzima. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un kit para el diagnóstico del cáncer de mama, de riñón, de ovario o de estómago, que comprende una sonda o un anticuerpo que se une específicamente a un ARNm o a proteína expresada por el protooncogén HCCR-1. Ejemplos de sondas incluyen un polinucleótido o un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria al ARNm transcrito del protooncogén HCCR-1 o un fragmento del ARNm que se une específicamente al ARNm HCCR-1, y preferiblemente tenga la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. La sonda puede obtenerse a partir de tejidos humanos o puede sintetizarse utilizando un método convencional de síntesis de ADN. Además, el anticuerpo puede obtenerse según los métodos convencionales presentes en el estado de la técnica.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan a modo de ilustración adicional de la presente invención sin suponer una limitación de su alcance.
Ejemplo 1 de Referencia
Microscopia electrónica de transmisión (TEM)
Se fijaron células o tejidos con glutaraldehído al 2,5% en un tampón fosfato (pH 7,4) y a continuación, se fijaron con un 2% de tetróxido de osmio. Las muestras se deshidrataron en una serie gradual de etanoles y se fijaron en Epon 812. Se tiñeron secciones ultrafinas de ellos con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se fotografiaron mediante TEM (JEOL 1.200 EX, Tokio, Japón).
Ejemplo 2 de Referencia
Análisis por transferencia western
Se recogieron y se lisaron las células en un tampón de muestra Laemmli según el método descrito por Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)). Las proteínas celulares se separaron mediante un SDS-PAGE al 10% y se transfirieron mediante electricidad a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo. Después del lavado, las membranas se incubaron con una solución fijadora que contenía una dilución de 1:1.000 de inmunoglobulina antirata de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch) como anticuerpo secundario. Las proteínas se revelaron mediante un kit de detección por transferencia western ECL (Amersham).
Ejemplo 3 de Referencia
Análisis inmunohistoquímico
Los tejidos se incubaron con un anticuerpo primario y a continuación se cortaron con un grosor de 5 \mum. La unión del anticuerpo primario se visualizó mediante un anticuerpo secundario biotinado, avidina, peroxidasa de rábano biotinada y AEC (aminoetil carbazol) como cromógeno (kits HISTOSTAIN-BULK, Zymed).
Ejemplo 4 de Referencia
Aislamiento del ARN total
Se extrajeron ARNs totales de las muestras de tejido o de células mediante un sistema comercial (RNeasy total RNA Kit, Qiagen Inc., Alemania), y se eliminaron los contaminantes de ADN utilizando un kit de limpieza Message (GenHunter Corp., EE.UU.).
Ejemplo 5 de Referencia
Análisis por transferencia northern
Se hizo una electroforesis a través de gel de agarosa al 1% de formaldehído de 20 \mug de los ARNs totales y se transfirió a membranas de nylon (Boehringer-Mannheim, Alemania). La transferencia se hibridó durante la noche a 42ºC con una sonda marcada aleatoriamente con ^{32}P, que fue obtenida mediante un sistema de marcaje aleatorio de cebadores Rediprime II (Amersham, Inglaterra). Los resultados del análisis por transferencia northern se repitieron de la misma manera dos veces, tal como se cuantificó mediante densitometría y la misma transferencia se hibridó con una sonda \beta-actina para confirmar la integridad del ARNm.
Ejemplo 1 de Preparación
Construcción del vector de expresión que contiene el protooncogén HCCR-1
E. coli JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) tiene un vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 que contiene el ADNc de HCCR-1 de longitud completa representado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Se cultivaron células E. coli JM-109/HCCR-1 y se aisló el vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 obtenido de esta manera se escindió con SalI para obtener un fragmento de ADN de 2,1 kb que contenía la longitud completa del ADNc de HCCR-1.
El vector de expresión de mamífero pcDNA3 (Invitrogene) se digirió con Xhol para conseguir un extremo compatible con SalI. El fragmento SalI de 2,1 kb se ligó al pcDNA3 digerido con Xhol para obtener el vector de expresión pcDNA3/HCCR-1 que contenía el ADNc HCCR-1 de longitud completa.
Ejemplo 2 de Preparación
Preparación del anticuerpo anti-HCCR-1
Se cultivaron células E. coli JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) y se aisló el vector de expresión pCEV-LAC/
HCCR-1 con el objetivo de obtener proteínas HCCR-1 útiles para la preparación del anticuerpo anti-HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se sometió a la reacción en cadena de la polimerasa (en inglés, PCR) utilizando cebadores de SEQ ID NOs: 4 y 5 para amplificar una región del ADN que va desde el nucleótido 123 hasta el 473 de la SEQ ID NO: 1 (los residuos de aminoácido 39 a 155 de la SEQ ID NO: 2). El producto de la PCR obtenido de esta manera se insertó en las dianas de restricción BamHI/SalI del vector pMAL-p2 (New England Biolab, EE.UU.) para obtener un vector recombinante (denominado pMAL-p2/HCR-1-c-terminal), y a continuación, se transformó E. coli BL21 (ATCC CRL 47092) con el vector recombinante pMAL-p2/HCR-1-c-terminal. El transformante se cultivó en medio LB y el cultivo resultante se diluyó 100 veces en volumen con medio LB. El cultivo diluido se incubó durante 3 horas y, a continuación, se le añadió \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (IPTG, Sigma) para inducir la expresión del protooncogén HCCR-1. Se expresó el fragmento C-terminal de la proteína HCCR-1 fusionada con la proteína de unión de maltosa (en inglés MBP, 42 kDa) que proviene del vector pMAL-p2 que tiene un peso molecular de aproximadamente 64 kDa,. La proteína de fusión de 64 kDa se purificó del cultivo utilizando la proteína de fusión pMAL y un sistema de purificación (New England Biolab., EE.UU.).
A continuación, se administró intraperitonealmente 1 mg de la proteína de fusión por semana tres veces a diez conejos New Zealand blancos de tres meses de edad, cada uno con un peso aproximado de 2,5 kg. Se tomó la muestra de sangre de los ratones inmunizados y se centrifugó para obtener un suero que contuviera anticuerpos policlonales.
Ejemplo 1
Preparación de células de ratón transfectadas con el protooncogén HCCR-1
Las células NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), una línea celular de fibroblastos de ratón diferenciada, fueron transfectadas con el vector de expresión pcDNA3/HCCR-1 obtenido en el Ejemplo 1 de Preparación utilizando Lipofectamina (Gibco BRL), y las células NIH/3T3 resultantes se cultivaron en un medio Waymouth MB 752/1 suplementado con G418 (Gibco) para obtener las células NIH/3T3 transfectadas con el protooncogén HCCR-1, designadas como HCCR-1M, que fue depositada en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) el 26 de diciembre de 2000 bajo el número de acceso KCTC 0923BP.
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Ejemplo 2
Preparación de células humanas transfectadas con el protooncogén HCCR-1
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1 excepto que se utilizaron células 293 (ATCC CRL-1573) en vez de células NIH/3T3 para obtener la célula 293 transfectada con el protooncogén HCCR-1, designada como HCCR-1, que fue depositada en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) el 26 de diciembre de 2000 bajo el número de acceso KCTC 0922BP.
Ejemplo Comparativo
Preparación de una célula comparativa transfectada con el vector pcDNA3
El procedimiento del Ejemplo 1 se repitió excepto que se utilizó el vector pcDNA3 (Invitrogen) en vez del vector pcDNA3/HCCR-1 para obtener células comparativas transfectadas con el vector pcDNA3.
Ejemplo 3
Características morfológicas de la células HCCR-1M
Paso 1
Contraste de fase de células HCCR-1M
Las células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1 se cultivaron en monocapa en un medio Waymouth MB 752/1 y las células HCCR-1M resultantes se examinaron mediante un microscopio de contraste de fase. Se utilizaron células NIH/3T3 naturales parentales como control.
Las Figs. 1A y 1B son las respectivas figuras de contraste de fase de HCCR-1M cultivadas en monocapa y de células NIH/3T3 naturales parentales. Como se puede apreciar de las Figs. 1A y 1B, las células NIH/3T3 naturales son unas células en forma de huso con un núcleo largo y delgado y una escasa cantidad de citoplasma, mientras que las células HCCR-1M tienen una forma poligonal con un núcleo oval y un citoplasma ancho.
Paso 2
Tinción con hematoxilina-eosina
Las células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1 se cultivaron en monocapa en un medio Waymouth MB 752/1 y las células HCCR-1M resultantes se tiñeron con hematoxilina-eosina.
La Fig. 2 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina de células HCCR-1 cultivadas en monocapa. Como puede apreciarse en la Fig. 2, las células HCCR-1M muestran polimorfismo nuclear, nucleolos diferenciados, patrones de cromatina granulada, células gigantes tumorales y figuras mitóticas atípicas.
Paso 3
TEM
Las células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1 se sometieron a TEM según el procedimiento del Ejemplo 1 de Referencia.
La Fig. 3 es la fotografía TEM de la célula HCCR-1M, donde la escala representa la longitud de 3 \mum y el marco es una ampliación del área indicada por el círculo (escala, 1 \mum). Como puede apreciarse en la Fig. 3, las células HCCR-1M tienen microvellosidades en la superficie de la célula, un núcleo lobulado con nucléolos prominentes, retículo endoplasmático (rER) y complejos de Golgi bien desarrollados (círculo).
Dichos resultados muestran que la célula HCCR-1M tiene características morfológicas de célula gigante tumoral.
Ejemplo 4
Tumorigenicidad de la células HCCR-1M
Se inyectaron subcutáneamente 5 x 10^{6} células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1 en la zona lateral posterior del tronco de 9 ratones (5 semanas de edad, atímicos nu/nu de antecedentes BALB/c).
Todos los 9 ratones "nude" a los que se les inyectaron células HCCR-1M mostraron tumores palpables después de 21 días. La Fig. 4 es una fotografía de los ratones "nude" portadores de aloinjertos de células HCCR-1M. Esto sugiere que las células HCCR-1M presentan tumorigenicidad.
Cuando los tumores subcutáneos llegaron a los 1,5-2,5 cm de diámetro, se sacrificaron los ratones "nude" y se les extirparon los tumores para utilizarlos en el siguiente análisis del tumor y en el establecimiento de una línea celular.
Ejemplo 5
Características del nódulo tumoral de un ratón "nude" con injertos de células HCCR-1M
Las características de los nódulos tumorales de los ratones "nude" inducidos por aloinjertos de HCCR-1M se examinaron como se describe a continuación.
Paso 1
Tinción con hematoxilina-eosina
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4 se tiñeron con hematoxilina-eosina.
La Fig. 5 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina (x250) de los nódulos tumorales. Como puede apreciarse en la Fig. 5, los nódulos tumorales tienen nidos de células epiteliales típicos separados por estroma fibroso.
Paso 2
TEM
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4 se sometieron a TEM según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia.
La Fig. 6 es la fotografía tomada mediante TEM de los nódulos tumorales donde la escala representa una longitud de 3 \mum y el marco es una ampliación del área indicada por el círculo (escala, 0,5 \mum). Como puede apreciarse de la Fig. 6, las células de los nódulos tumorales tienen orgánulos bien desarrollados y están fuertemente enlazadas mediante desmosomas. Esto sugiere que las células HCCR-1M se convirtieron en células epidérmicas.
Paso 3
Análisis inmunohistoquímico
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4 se sometieron a inmunohistoquímica según el procedimiento del Ejemplo 3 de Referencia utilizando cada uno de los anticuerpos anti fibra de reticulina, antiqueratina, antiEMA (antígeno de la membrana epitelial) y antivimentina (DAKO) como anticuerpo primario.
Las Figs. 7A a 7D son los resultados de los análisis inmunohistoquímicos (x250) que muestran la expresión de fibras de reticulina, de queratina, de EMA y de vimentina, respectivamente, en los nódulos tumorales. Como puede apreciarse de las Figs. 7A a 7D, los nidos de células estaban envueltos por fibras de reticulina (Fig. 7A) y las células mostraban la coexpresión de marcadores epiteliales, tales como la queratina (Fig. 7B) y EMA (Fig. 7C) y del marcador mesenquimal vimentina (Fig. 7D). Estos resultados sugieren que el protooncogén HCCR-1 provocó la conversión de las células NIH/3T3 mesenquimales a células epiteliales.
Particularmente, la célula NIH/3T3 mesenquimal introducida con un oncogén se transforma en sarcoma, mientras el ratón "nude" portador de aloinjertos de célula HCCR-1M desarrolla un tumor palpable.
Ejemplo 6
Preparación de una línea celular cancerosa a partir de un ratón "nude" portador de aloinjertos con células HCCR-1M
Las células fueron aisladas de los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 4 y a continuación se cultivaron en medio Waymouth MB 752/1 suplementado con suero fetal bovino al 20%, las cuales se designaron como célula HCCR-1MN.
Ejemplo 7
Características de la células HCCR-1MN
Las células HCCR-1MN obtenidas en el Ejemplo 6 se sometieron a microscopia de contraste de fase repitiendo el procedimiento del Paso 1 del Ejemplo 3.
La Fig. 8 es la figura de contraste de fase (x300) de células HCCR-1MN cultivadas en monocapa. Como puede apreciarse de la Fig. 8, las células HCCR-1MN tienen unas características morfológicas similares a las de las células HCCR-1M representadas en el Paso 1 del Ejemplo 3.
Ejemplo 8
Análisis por transferencia western de la células HCCR-1M y HCCR-1MN
Las células HCCR-1M y HCCR-1MN, obtenidas en los Ejemplos 1 y 6 respectivamente, fueron sometidas a un análisis por transferencia western según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia utilizando el suero antiHCCR-1 obtenido en el Ejemplo 2 de Preparación, para examinar la expresión del protooncogén HCCR-1 en células HCCR-1M y HCCR-1MN. Para la comparación, en el análisis por transferencia western se utilizaron las células NIH/3T3 naturales parentales y las células NIH/3T3 comparativas obtenidas en el Ejemplo Comparativo.
La Fig. 9 es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1M en células HCCR-1M y HCCR-1MN. Como puede apreciarse de la Fig. 9, la proteína HCCR-1 está sobreexpresada en las células HCCR-1M y HCCR-1MN, pero no en las células NIH/3T3 naturales parentales ni en las células comparativas NIH/3T3 transfectadas con el vector pcDNA3, tal como indica la banda débil.
Ejemplo 9
Características de la célula HCCR-1H
Las células HCCR-1H se sometieron a microscopia de contraste de fase según el procedimiento del Paso 1 del Ejemplo 3, para examinar las características morfológicas de la célula HCCR-1H. Las células 293 naturales parentales fueron utilizadas como control.
Las Figs. 10A y 10B son las respectivas figuras de contraste de fase (300x) de las células HCCR-1H cultivadas en monocapa y de las células 293 naturales parentales; Como puede apreciarse de las Figs. 10A y 10B, la célula HCCR-1H ha incrementado sus dimensiones celulares y su celularidad en comparación con la célula 293 natural.
Ejemplo 10
Tumorigenicidad de célula HCCR-1H
El procedimiento del Ejemplo 4 se repitió utilizando las células HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2 para examinar la tumorigenicidad de las células HCCR-1H.
Los ratones "nude" portadores de xenoinjertos de células HCCR-1H mostraron tumores palpables después de 21 días. Esto sugiere que las células HCCR-1H presentan tumorigenicidad.
Cuando los tumores subcutáneos llegaron a 1-1,5 cm de diámetro, se sacrificaron los ratones "nude" y se les extirparon los tumores para utilizarlos en el siguiente análisis del tumor.
Ejemplo 11
Características del nódulo tumoral de un ratón "nude" con injertos de células HCCR-1H
Las características de los nódulos tumorales inducidos por los aloinjertos de HCCR-1H, de los ratones "nude" se examinaron como se describe a continuación.
Paso 1
Tinción con hematoxilina-eosina
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 10 se tiñeron con hematoxilina-eosina.
La Fig. 11 es el resultado (x250) de la tinción con hematoxilina-eosina de los nódulos tumorales palpables. Como puede apreciarse de la Fig. 11, el nódulo tumoral tiene características de los carcinomas celulares epiteliales típicos, es decir, forma celular atípica, pleomorfismo, agrandamiento nucleolar, y un aumento en la relación entre el volumen del núcleo y el del citoplasma.
Paso 2
Análisis inmunohistoquímico
Los nódulos tumorales obtenidos en el Ejemplo 10 fueron sometidos a inmunohistoquímica según el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 de Referencia utilizando cada uno de los anticuerpos anticitoqueratina-8, anticitoqueratina-19 y antivimentina (DAKO) como anticuerpo primario.
Las Figs. 12A a 12B son los resultados de los análisis inmunohistoquímicos (x250) que muestran respectivamente la expresión de citoqueratina-8, citoqueratina-19 y vimentina, en los nódulos tumorales palpables. Como puede apreciarse de las Figs. 12A a 12C, las células tumorales mostraron coexpresión de marcadores epiteliales, tales como la citoqueratina-8 y -19 (Fig. 12A y 12B) y del marcador mesenquimal vimentina (Fig. 12C). Estos resultados sugieren que el protooncogén provocó la conversión de las células 293 mesenquimales a células epiteliales.
Ejemplo 12
Análisis de las células HCCR-1H por transferencia northern
Para examinar el nivel de expresión del protooncogén HCCR-1 en las células HCCR-1H, se aislaron los ARNs totales de las células HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2 según el procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometieron a transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de Referencia utilizando sonda de ADNc HCCR-1 obtenida aleatoriamente y marcada con ^{32}P.
La Fig. 13 es el resultado del análisis por transferencia northern que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1 en las células HCCR-1H y en las células 293 naturales parentales. Como se puede apreciar de la Fig. 13, en las células HCCR-1H se sobreexpresó aproximadamente 2,1 kb de transcrito único de ARNm, pero no en las células 293 naturales parentales.
Ejemplo 13
Mecanismo de tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1 en las células de ratón
Para examinar el mecanismo de tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1 en las células de ratón, se valoraron como se describe a continuación, las anormalidades en las actividades de la proteína quinasa C (PKC) y de la telomerasa, la pérdida de puntos de control del ciclo celular, la alteración de la expresión de egr-1, de c-fos y de GADPH, de los cuales se ha descrito que son relevantes en el proceso de la tumorigénesis.
Paso 1
Actividad de la PKC
Generalmente, los tumores desarrollan secundariamente anormalidades en el proceso de transducción de señal mediada por la PKC. Para asegurar que la HCCR-1 modula la actividad proteína quinasa C (PKC), se llevó a cabo un ensayo de PKC utilizando células NIH/3T3 naturales parentales, células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el vector pcDNA3 obtenidas en el Ejemplo Comparativo y células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1.
La actividad de la PKC se midió utilizando el sistema de ensayo SigmaTECT™ Protein Kinase C Assay System (Promega) según la instrucciones del fabricante. La actividad PKC se definió como la diferencia de las cantidades de PKC incorporadas en el sustrato por minuto en ausencia y en presencia de fosfolípidos. Cada valor es la media \pm desviación estándar (d.e.) de tres experimentos independientes.
La Fig. 14 es el gráfico que muestra las actividades PKC de la célula NIH/3T3 natural parental, la célula NIH/3T3 comparativa transfectada con el vector pcDNA 3 y la célula HCCR-1M. Como puede apreciarse de la Fig. 14, la actividad PKC de las células HCCR-1M es aproximadamente 10 veces mayor que la de las células naturales. Esto sugiere que el protooncogén aumenta la actividad PKC celular.
Paso 2
Ensayo de la actividad de la telomerasa
Basándose en lo descrito que la PKC induce un incremento marcado en la actividad telomerasa, se llevó a cabo un ensayo de la actividad telomerasa utilizando células NIH/3T3 naturales, células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el vector pcDNA3 obtenidas en el Ejemplo Comparativo y células HCCR-1 obtenidas en el Ejemplo 1.
La actividad telomerasa se midió utilizando el kit PCR-ELISA para telomerasa (Boehringer Mannheim, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células humanas inmortalizadas de riñón humano positivas para la telomerasa incluidas en el kit fueron utilizadas como control positivo. Como control negativo se utilizaron células 293 tratadas previamente con RNasa. Los ensayos se llevaron a cabo con una cantidad de extracto equivalente a 1 x 10^{3} células. Los resultados muestran la media promedio de los valores de la densidad óptica (OD) de cuatro separados independientes (media \pm d.e.).
La Fig. 15 es el gráfico que muestra las actividades telomerasa de las células de control positivo, las células de control negativo, las células NIH/3T3 naturales parentales, las células NIH/3T3 comparativas transfectadas con el vector pcDNA3 y las células HCCR-1M. Como puede apreciarse de la Fig. 15, las células NIH/3T3 naturales mostraron una actividad telomerasa detectable, mientras que las células HCCR-1 tienen la actividad telomerasa incrementada en un factor de aproximadamente 7 en comparación con las células naturales parentales. La actividad telomerasa de las células de control positivo es alta, mientras que la de las células de control negativo no es detectable. Estos resultados concuerdan con el estudio previo (Holt, S. E., Wright, W. E. and Shay J. W. Mol. Cell Biol. 16, 2932-2939 (1996)), lo que sugiere que la célula HCCR-1 tiene una actividad de la telomerasa alta inducida por la PKC activada.
Paso 3
Prueba del ciclo celular
Las células tumorales normalmente han sufrido daños en los genes que regulan directamente sus ciclos celulares. Con el fin de examinar si existió una alteración en las propiedades de crecimiento de las células HCCR-1M, se determinaron los perfiles del ciclo celular como se describe a continuación.
Se cultivaron células HCCR-1M y células NIH/3T3 naturales parentales en la fase mid-log y se frenó el crecimiento mediante 36 horas de incubación en un medio DMEM con un 0,5% de suero fetal bovino. Las células fueron tratadas con tripsina, se recogieron y se fijaron en etanol al 70%. A 2 x 10^{6} células se les añadieron 50 \mug/ml de una solución de tinción de ioduro de propidio (Sigma) y 100 unidades por ml de RNasa A (Boerhinger Mannheim). Después de 30 min. de incubación, el contenido de ADN celular se determinó mediante un análisis de fluorescencia a 488 nm utilizando un FACS Caliber (Becton Dickinson). Se analizó un mínimo de 1 x 10^{4} células por muestra con el programa informático Modfit 5.2.
Se determinó el porcentaje de células NIH/3T3 naturales parentales y de células HCCR-1 en las fases G_{0}/G_{1}, S y G_{2}/M, y los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
1
Como puede apreciarse de la Tabla 1, los porcentajes de células NIH/3T3 naturales y de células HCCR-1 en la fase S fueron 20,6% y 31,5%, respectivamente. Estos resultados sugieren que hubo un desplazamiento significativo de la población de células HCCR-1M de la fase G_{0}/G_{1} a la fase S.
Para evaluar la progresión del ciclo celular dependiente de suero, se cultivaron células HCCR-1M y células NIH/3T3 naturales parentales en un medio DMEM con un 0,5% de suero fetal bovino durante 36 horas para detener el crecimiento. Las células se transfirieron a un medio DMEM con un 20% de suero fetal bovino y se recogieron a tiempos indicados para determinar el porcentaje de células en las fases G_{0}/G_{1}, S y G_{2}/M. Los resultados se muestran en la Tabla II.
TABLA II
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede apreciarse de la Tabla II, el porcentaje de células NIH/3T3 naturales parentales en la fase S en la hora 0 fue del 8%, mientras que el porcentaje de células HCCR-1M en la fase S fue del 21,8%. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión constituva del protooncogén HCCR-1 permitía una relativa resistencia a la detención de G_{0}/G_{1} inducida por la privación de suero. Después de transferir las células a un medio DMEM que contiene un 20% de suero para liberar a las células de la detención del crecimiento, en las poblaciones de las células HCCR-1M en la fase S hubieron incrementos por encima del 10% en comparación con las células NIH/3T3 naturales. De esta manera, la sobreexpresión del protooncogén HCCR-1 podrían desregular el crecimiento celular acortando la fase G_{0}/G_{1} e incrementando la población de células en fase S.
Paso 4
Patrones de expresión de egr-1, c-fos y GAPDH
En base al hecho de que los patrones de expresión de egr-1, c-fos y GAPDH están involucrados en la formación tumoral, se examinaron, como se describe a continuación, los patrones de expresión de egr-1, de c-fos y de GAPDH en células HCCR-1M obtenidas en el Ejemplo 1.
Se detuvo el crecimiento de células HCCR-1M y células NIH/3T3 naturales parentales en fase mid-log mediante incubación en un medio DMEM con un 0,5% de suero fetal bovino durante 36 horas (periodo de quiescencia). Las células se transfirieron a un medio DMEM fresco con un 20% de suero fetal bovino y se cultivaron durante 0, 15, 30, 60 y 120 min. para estimular el crecimiento (etapa mitótica). Se aislaron los ARNs totales de las células quiescentes y mitóticas según el procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometieron a transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de Referencia utilizando sonda de ADNc de egr-1, c-fos y GAPDH obtenida aleatoriamente y marcada con ^{32}P.
Las Figs. 16A, 16B y 16 C son los resultados de las transferencias northern que muestran la expresión de egr-1, de c-fos y de GAPDH respectivamente en las células HCCR-1H y en las células NIH/3T3 naturales parentales. Como puede apreciarse de las Figs. 16A a 16C, las células HCCR-1M mitóticas muestran una marcada regulación negativa de la expresión de egr-1, una regulación positiva de GAPDH y no muestran diferencia significativa en la expresión de c-fos comparado con las células naturales.
Estos resultados sugieren que la desregulación del gen HCCR-1 en las células NIH/3T3 de ratón puede provocar la activación de la PKC o de la telomerasa, la pérdida de los puntos de control del ciclo celular, y la regulación negativa de la expresión de egr-1 y por lo tanto predispone a las células a la conversión maligna.
Ejemplo 14
Mecanismo de tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1 en célula humana
Para examinar el mecanismo de tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1 en una célula humana, se valoraron como se describe a continuación los patrones de expresión de los genes supresor de tumores p53, MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A y p14^{ARF}, que han sido descritos como relevantes para el tumor.
Paso 1
Patrones de expresión del supresor de tumores p53
Para examinar el patrón de expresión de p53 en células HCCR-1H, se llevaron a cabo análisis por transferencia western y northern tal como se describe a continuación.
Se lisaron las células HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2 y las células 293 naturales parentales, y sus lisados se sometieron a transferencia western utilizando anticuerpo anti-p53 monoclonal DO-7 (aminoácidos 37 a 45; Novocastra Laboratories, Ltd., UK) que únicamente reacciona con el p53 natural; o Ab-5 (clon DO-7) (aminoácidos 37 a 45; NEOMARKERS, INC., CA) que reacciona con p53 natural y mutante, según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia. La misma transferencia se hizo reaccionar con anticuerpo \beta-actina de ratón anti-humano (Sigma), para confirmar el contenido total de proteína.
La Fig. 17A es la transferencia western que muestra la expresión del supresor de tumores p53 en células HCCR-1H y células 293 naturales parentales; y la Fig. 17B es la transferencia western mostrando la \beta-actina de la misma transferencia: Como puede apreciarse de la Fig. 17A, los niveles de proteína p53 estaban claramente elevados en las células HCCR-1H, en comparación con las células 293 naturales parentales.
Además, las células HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2 se cultivaron en un medio libre de metionina RPMI 1640 con un 2% de suero fetal bovino y 2 mM de glutamina (Sigma) durante 2 horas y a continuación se marcaron con 100 \mul de metionina L^{35}S (Amersham). Las células se lavaron con tampón 1X Hanks (Gibco, EE.UU.), y a continuación se cultivaron más en un medio RPMI 1640 normal con L-metionina durante 0,5, 1, 2 o 4 horas. Las células se disolvieron en una solución de inmunoprecipitación (50 mM Tris [pH 8,0], 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% NP-40, 1mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mM de benzamidina, 1\mug de pepsatina por ml, 10 mM de bisulfito de sodio), se lavaron con 50 \mul de solución de proteína A-sefarosa y a continuación se cuantificaron. El lisado celular se sometió a inmunoprecipitación (Kessler, S.W., J. Immunol., 115, 1617-1623 (1975)) utilizando anticuerpo anti-p53 seguido de SDS-PAGE. El procedimiento anterior se repitió utilizando células de hepatoma Hep 3B (ATCC HB-8064) como control sin gen p53.
\newpage
La Fig. 18 es el resultado de la inmunoprecipitación que muestra la expresión del supresor de tumores p53 en células HCCR-1H y células 293 naturales parentales. Como puede apreciarse de la Fig. 18, los niveles de proteína p53 están claramente elevados en las células HCCR-1H en comparación con las células 293 naturales parentales. Por lo tanto, se cree que en el mecanismo de la tumorigénesis inducido por el protooncogén HCCR-1, la proteína p53 tiene un alto nivel de expresión pero permanece en una forma inactiva que no suprime el tumor.
Paso 2
Patrones de expresión de los genes MDM2, bax, p21WAF1, p16IN4A y p14^{ARF}
Puesto que el gen p53 es una parte de un bucle regulatorio que también incluye a MDM2, Bax y p14^{ARF}, influenciando directamente los genes supresores de tumores p21WAF1 y p16INK4A, se evaluaron los patrones de expresión de MDM2, Bax, p14^{ARF}, p21WAF1 y p16INK4A.
Se llevó a cabo una transferencia western según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia utilizando las células HCCR-1H obtenidas en el Ejemplo 2; y los anticuerpos anti-MDM2, anti-Bax, anti-p21WAF1 y anti p16INK4A (Oncogene Research Products, EE.UU.), y p14^{ARF}(Lab Vision, EE.UU.). La misma transferencia se hizo reaccionar con anticuerpo anti-\beta-actina para confirmar el contenido total de proteína.
Las Figs. 19A, 19C, 19E, 19G y 19I son los resultados de los análisis por transferencia western que muestran respectivamente la expresión de MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A y p14^{ARF} en las células HCCR-1H; y las Figs. 19B, 19D, 19F, 19H y 19J son la \beta-actina en cada una de las transferencias anteriores. Como puede apreciarse de las Figs. 19A, 19C, 19E y 19G, los niveles de la proteína MDM2, Bax, p21WAF1, p16INK4A y p14^{ARF} son inferiores en comparación con las células 293 naturales parentales. Estos resultados sugieren que la sobrexpresión de HCCR-1 puede inhibir específicamente la transcripción de MDM2, Bax, p21WAF1 y p16INK4A, y por lo tanto reducir sus niveles de proteína.
Resumiendo estos resultados en conjunto con los del Paso 1, se cree que la sobreexpresión del gen HCCR-1 incrementa la estabilidad de p53, pero que la proteína p53 no forma un bucle autoregulatorio que regule la expresión del MDM2, bax y p21WAF1 de manera positiva. En particular, como puede apreciarse de las Figs. 19E a 19G, la familia de proteínas inhibidoras de quinasa p21WAF1 y p16INK4A estaba regulada negativamente en las células HCCR-1H mediante un mecanismo independiente de p53. Como puede apreciarse de la Fig. 19I, p14^{ARF} no parecía estar expresada de manera aberrante ni en las células 293 naturales parentales ni en las células HCCR-1H. Estos resultados sugieren que la alteración del bucle MDM2-p14^{ARF} no es un mecanismo del mismo tipo que la inactivación de p53.
Los resultados anteriores en conjunto con los del Paso 3 del Ejemplo 13 indican que la sobreexpresión del protooncogén HCCR-1, tanto en células de ratón como de humano, puede afectar al control del ciclo celular y tiene una correlación con los reguladores del ciclo celular p53 y p21.
Paso 3
Pareja (en inglés "partner") de HCCR-1 en la interacción proteína-proteína
Para determinar una pareja de HCCR-1 en la interacción proteína-proteína, se realizó un cribado de doble híbrido en levadura tal como se describe a continuación.
Se cultivaron células E. coli JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) de donde se aisló el vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se escindió con SalI y el protooncogén HCCR-1 obtenido de esa manera se insertó en los sitios BamHI/SalI de un vector doble híbrido en levadura (en inglés, "yeast two-hybrid vector") (Clontech, EE.UU.) que contiene el dominio de unión a ADN pLexA para obtener el vector pLexA-HCCR-1 que expresa una proteína de fusión del dominio de unión a ADN pLexA con la proteína HCCR-1. El vector pLexA-HCCR-1 se mezcló con levadura EGY48 (Clontech, EE.UU.) y se calentó a 42ºC durante 10 min. para transformar la levadura. La levadura resultante se transformó con una librería de ADNc de cerebro fetal humano fusionada por el mismo método con pB42AD que contiene el dominio activante de pLexA (Clontech, EE.UU.). Se realizaron ensayos "filter lift" de \beta-galactosidasa mediante la replicación en placas del transformante a placas de selección Trp^{-}, Leu^{-}, His^{-}. Cuando un transformante tiene un gen pareja derivado de una librería de ADNc, la proteína pareja fusionada con el dominio de unión activante de pLexA se une con la proteína HCCR-1 fusionada con el dominio de unión a ADN de pLexA para formar una colonia azul en un medio de placa que contiene X-gal. Para eliminar falsos positivos, se llevó a cabo un ensayo de "Yeast Mating Assay" (Guarente, L., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90, 1639-1641 (1993)).
De los clones obtenidos de esta manera se cribó un gen que codificara una pareja de interacción proteína-proteína de HCCR-1.
La colonia obtenida de esta manera se cultivó en un medio de glucosa y se extrajo el vector que contenía el gen pareja utilizando partículas de vidrio. El vector se introdujo en E. coli KC8 (Clontech, EE.UU.) mediante electroporación y las células resultantes E. coli KC8 se colocaron en una placa con medio mínimo M9 para seleccionar un transformante. El ADN plasmídico se extrajo del transformante y se transformaron E. coli DH5\alpha con el ADN plasmídico y se cultivó en medio LB para amplificar el ADN plasmídico. El ADN plasmídico se extrajo del cultivo y se escindió con HindIII para obtener un fragmento de 1 kb que contenía el gen pareja. Se determinó la secuencia de nucleótidos del gen pareja para identificar el gen TPD52L2 (Número de Acceso GenBank NM003288). La proteína D52 codificada por el gen TPD52L2 se identificó en un principio a través de su alto nivel de expresión en carcinoma de mama humano, y está relacionado con la transducción de señales mediadas por calcio y con la proliferación celular (Byrne, J.A., et al., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); y Byrne, J.A., et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998)).
Paso 4
Cotransfección
Se llevó a cabo la cotransfección como se describe a continuación para examinar la interacción entre las proteínas HCCR-1 y D52.
Se cultivaron las células E. coli JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) de donde se aisló el vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1 se escindió con SalI y el ADNc de HCCR-1 de longitud completa obtenido de esta manera se insertó en el sitio SalI del vector de expresión N-terminal pFALG-CMV (Sigma, EE.UU.) para obtener el vector de expresión pFLAG-HCCR-1 que expresa una proteína de fusión de FLAG con HCCR-1. El gen TPD52L2 obtenido en el Paso 3 se insertó en el sitio NotI del vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, EE.UU.) para obtener el vector de expresión pGST-TPD52L2 que expresa una proteína de fusión de GST con D52.
Se cotransfectaron células CHO con los vectores de expresión pFLAG-HCCR-1 y pGST-TPD52L2 y a continuación se cultivaron en medio RPMI 1640. Después de 48 horas, las células CHO se trataron con tripsina y se recogieron. Las células CHO se lavaron con PBS y a continuación se resuspendieron en tampón IP (10 mM de Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 2 mM de vanadato de sodio, 10 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfato de sodio, 5 mM de EDTA, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de pepsatina, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo). La suspensión celular se pasó por una aguja de calibre 27 y el lisado celular resultante se agitó para separar las células no lisadas en forma de pellet celular. El sobrenadante se preaclaró mezclándolo con partículas de IgG preinmune y proteína A (Sigma, EE.UU.). Se inmunoprecipitaron las proteínas de fusión FLAG-HCCR-1 o GST-TPD52L2 del lisado celular utilizado anticuerpos anti-FLAG o anti-GST (Sigma, EE.UU.) (Kesler, S.W., J. Immunol., 115, 1617-1623 (1975)). Las muestras de proteína residual se sometieron a transferencia western utilizando anticuerpos anti-GST o anti-FLAG según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 de Referencia.
Las Figs. 20A y 20B son los resultados de los análisis por transferencia western que muestran la expresión de la proteína GST y de la proteína PLAG, respectivamente. Como puede apreciarse de las Figs. 20A y 20B, se detectó la proteína de fusión en ambos precipitados. Estos resultados sugieren que la proteína D52 interacciona con la proteína HCCR-1.
Ejemplo 15
Preparación de ratón transgénico
Con el fin de asegurar que el protooncogén HCCR-1 induce la tumorigénesis in vivo, se preparó un ratón transgénico que expresa el protooncogén HCCR-1 bajo el promotor CMV.
Para obtener el ADNc de HCCR-1 útil en la preparación de un ratón transgénico, se cultivaron células E. coli JM-109/HCCR-1 (KCTC 0667BP) de donde se aisló el vector de expresión pCEV-LAC/HCCR-1. El vector de expresión pCEVLAC/HCCR-1 se escindió con SalI y el ADNc de HCCR-1 de longitud completa obtenido de esta manera se insertó en el sitio Xhol del vector de expresión pcDNA3 para obtener el vector de expresión pcDNA3-HCCR-1. El vector de expresión pcDNA3-HCCR-1 se escindió con SalI y XmnI, se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,7%, y se aisló por elución eléctrica. El fragmento de ADN aislado se sometió a diálisis contra una solución 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/0,2 mM de EDTA y se ajustó a una concentración final de 4 ng/ml. La estructura del ADN resultante contiene el promotor CMV, el gen del ADNc de HCCR-1 y la secuencia poliA de la hormona de crecimiento bovina (bGH) como muestra la Fig. 21.
El ADN se microinyectó en un zigoto de ratón de la cepa FVB/N (Samyuk Corp., CAMTAKO, Corea) según el método de microinyección de ADN pronuclear (Gordon, J.W., et al., Pro. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77, 7382-7384 (1980)): La solución de ADN se microinyectó en el pronúcleo del zigoto en la etapa de 1 célula y el zigoto resultante se incubó durante 20 horas para seleccionar el embrión en la etapa de 2 células. El embrión en la etapa de 2 células se implantó en el oviducto de un ratón ICR receptor pseudoembarazado (Samyuk Corp., CAMTAKO, Corea). Se obtuvo progenie de ratones a partir del ratón receptor, y se sometieron muestras de ADN obtenidas de biopsias de la cola de los ratones de la progenie a análisis de transferencia southern.
La Fig. 22 es el ratón transgénico que proviene del embrión al que se le ha introducido el protooncogén HCCR-1. Como puede apreciarse de la Fig. 22, la masa tumoral mide aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm y se aprecia en el área axilar derecha adyacente a la mama.
El tumor se aisló y se examinó a simple vista.
La Fig. 23 es una fotografía del tumor de mama del ratón transgénico. Como puede apreciarse de la Fig. 23, el tumor del ratón transgénico es un único nódulo bien definido y sin cápsula.
Para el examen de las características morfológicas del tumor, éste se tiñó con hematoxilina-eosina. La Fig. 24 es el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina del tumor. Como puede apreciarse de la Fig. 24 el tumor consiste en estructuras papilares y glandulares o estructuras en forma de huso. Se aprecia una necrosis extensiva en la parte central. Se observa tejido mamario normal adyacente al tumor. Las células ovoides o cuboides presentan unos límites indefinidos y una cantidad moderada de citoplasma eosinófilo granular. Las células tumorales tienen un núcleo grande, pleomórfico e hipercromático y muchas mitosis, incluyendo algunas formas atípicas. Se aprecian nucléolos pequeños aunque bien definidos. Estos resultados sugieren que el tumor del ratón transgénico muestra características del adenocarcinoma papilar intracanalicular de mama.
La Fig. 25 es la fotografía de microscopio electrónico de transmisión del tumor, donde la escala representa una longitud de 2 \mum. Como puede apreciarse de la Fig. 25, las células tumorales ovoides tienen abundantes orgánulos citoplasmáticos. Los núcleos presentan grumos y marginación de la cromatina y nucléolos bien definidos. El citoplasma está lleno de algunas mitocondrias y muchos rER vesiculados. Se aprecian algunos desmosomas.
El embrión del ratón transgénico se denominó HCCR-1, que se depositó el 26 de diciembre de 2000 en la Colección Coreana para Cultivos Tipo bajo en número de acceso KCTC 0924BP.
Ejemplo 16
Expresión del protooncogén HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario, y de estómago
Para examinar la expresión del protooncogén HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario, y de estómago, se aisló el ARN total de los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario, y de estómago según el procedimiento del Ejemplo 4 de Referencia y se sometió a un análisis por transferencia northern según el procedimiento del Ejemplo 5 de Referencia utilizando sonda de ADNc HCCR-1 obtenida aleatoriamente y marcada con ^{32}P. Para la comparación, los procedimientos de arriba se repitieron utilizando tejidos normales de mama, riñón, ovario, y estómago.
La Fig. 26A es el resultado del análisis por transferencia northern que muestra la expresión del protooncogen
HCCR-1 en tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago; y la Fig. 26B muestra la misma transferencia hibridada con una sonda de \beta-actina. Como puede apreciarse de las Figs. 26A y 26B, los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago mostraron una expresión incrementada del protooncogén HCCR-1 en comparación con los tejidos normales.
Para examinar la proteína HCCR-1 expresada en los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario, y de estómago, se sometieron los tejidos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago a un análisis por transferencia western utilizando el suero antiHCCR-1 obtenido en el Ejemplo 2 de Preparación según el procedimiento del Ejemplo 2 de Referencia.
La Fig. 27 es el resultado del análisis por transferencia western que muestra la expresión del protooncogén HCCR-1 en tejidos humanos cancerosos de mama, de riñón, de ovario, y de estómago. Como puede apreciarse de la Fig. 27, los tejidos humanos tumorales de mama, de riñón, de ovario y de estómago mostraron una expresión incrementada de la proteína HCCR-1 de 50 kDa en comparación con los correspondientes tejidos normales.
Ejemplo 17
Localización cromosómica del protooncogén HCCR-1
Se marcó el ADNc de HCCR-1 de longitud completa obtenido en el Ejemplo 1 Preparativo mediante el kit de marcaje aleatorio Random Prime Kit Labelling (Promega, EE.UU.) para obtener una sonda. Se cribó la librería genómica lambda de placenta humana (Human Lambda Genomic Library (Stratagene, EE.UU.)) utilizando la sonda para obtener el ADN genómico de 20 kb.
El ADN genómico se sometió a una hibridación in situ por fluorescencia (FISH) (Cherif, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, 6639-6649 (1990)): Se marcó el ADN genómico dispuesto en un portaobjetos con SpectrumRed-dUTP utilizando un kit Nick Translation (Vysis, EE.UU.). El portaobjetos se observó con un microscopio de fluorescencia Zeiss. Los cromosomas se contratiñeron con DAPI (Sigma, EE.UU.).
La Fig. 28 es el resultado del análisis de hibridación in situ por fluorescencia que muestra que el protooncogén HCCR-1 está localizado en el brazo largo (12q) del 12º cromosoma.
Aunque la materia de la invención ha sido descrita e ilustrada con referencia a las realizaciones preferidas, para el experto en la materia será evidente que pueden realizarse varios cambios y modificaciones.
<110> KIM, Jin Woo
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CÉLULA CANCEROSA DE MAMÍFERO Y MAMÍFERO TRANSGÉNICO PORTADOR DE PROTOONCOGEN HUMANO Y KIT PARA DIAGNOSTICAR EL CÁNCER QUE UTILIZA DICHO PROTOONCOGEN.
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<130> pca10102/KJW
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR 2001-41
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-01-02
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<160> 5
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<170> KOPATIN 1.5
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2118
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (9)..(1088)
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<220>
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<221> sig_peptide
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<222> (9)..(83)
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (435)..(494)
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<223> dominio transmembrana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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3
4
5
6 
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<210> 2
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<211> 360
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
7
8 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido que se une específicamente al ARNm HCCR-1.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctggacatt ttgtcacc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
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<222> (10)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diana de restricción de BamHI
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggcaactag gatccaggca tttct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> diana de restricción de SalI
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcgacgcag ttcccacagg tgtgccatg 
\hfill
29

Claims (6)

1. Una célula de mamífero transformada con un vector de expresión que comprende un protooncogén humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la cual es la línea celular de ratón HCCR-1M depositada como KCTC 0923BP o la línea celular humana HCCR-1H depositada como KCTC 0922BP.
2. Un embrión mamífero no humano portador de una construcción de ácido nucleico introducida que comprende un protooncogén humano que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
3. El embrión de mamífero de la reivindicación 2, donde el mamífero es el ratón FVB.
4. El embrión de mamífero de la reivindicación 3, que es el embrión de ratón HCCR-1 depositado como KCTC 0924BP.
5. Un mamífero no humano canceroso transgénico que proviene del embrión de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6. El mamífero transgénico de la reivindicación 5, donde el cáncer es un adenocarcinoma intracanalicular papilar de mama.
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