KR20020029445A

KR20020029445A - Ａｑｐ 돌연변이 유전자, ａｑｐ의 돌연변이 및 발현을이용한 암 검색 방법, 및 ａｑｐ 돌연변이 염기서열의올리고뉴클레오타이드를 갖는 ｄｎａ 칩

Info

Publication number: KR20020029445A
Application number: KR1020000053821A
Authority: KR
Inventors: 문우철; 문철소; 문영호; 김병구; 김동환; 엄태한; 김화수; 송미경; 신찬재; 김흥재; 송석범
Original assignee: 문우철; 문철소; 굿젠 주식회사
Priority date: 2000-09-09
Filing date: 2000-09-09
Publication date: 2002-04-19
Also published as: US8012684B2; AU2001294280A1; WO2002020787A1; US20080312094A1; US20050069872A1; US7470534B2

Abstract

본 발명은 AQP(aquaporin)의 돌연변이 유전자, AQP의 돌연변이 및 발현을 이용한 암 검색 방법, 및 AQP 돌연변이 염기서열의 올리고뉴클레오타이드를 갖는 DNA 칩에 관한 것으로, 본 발명에 따른 AQP의 돌연변이 및 발현을 이용한 암 검색 방법 및 DNA 칩을 사용할 경우 암 검색에 있어서 정확도가 뛰어나고 결과 판독이 신속하고 용이하며 효과적이다.

Description

ＡＱＰ 돌연변이 유전자, ＡＱＰ의 돌연변이 및 발현을 이용한 암 검색 방법, 및 ＡＱＰ 돌연변이 염기서열의 올리고뉴클레오타이드를 갖는 ＤＮＡ 칩{Mutated AQP, method for detecting cancer using the same, DNA chip having oligonucleotides of said mutated AQP sequence}

본 발명은 아쿠아포린(aquaporin; 이하 'AQP'라 약칭함) 돌연변이 유전자, AQP의 돌연변이 및 발현을 이용한 암 검색 방법, 및 AQP 돌연변이 염기서열의 올리고뉴클레오타이드를 갖는 DNA 칩에 관한 것이다.

오늘날 암은 인류의 대표적인 사망원인으로서 가장 치료하기 힘든 질환이며, 의학과 자연과학이 고도로 발달한 현 시점에서도 미해결 분야로 남아있는 실정이다. 미국의 경우 암은 두번째로 흔한 사망원인이며, 매년 130만명의 암환자가 새로 발견되고 암으로 인해 55만명이 사망한다. 이는 2-3명중 한 명은 태어나서 사망할 때까지 암에 걸릴 가능성이 있음을 가리킨다. 보건 통계가 잘 정리되어 있는 미국의 경우 남녀 통틀어 4대 호발암은 폐암, 대장암, 전립선암, 유방암이며, 미국인이일생동안 이들 4대암에 이환되고 사망할 위험도는 하기 표 1과 같다(방영주역, 암. 오늘의 진단과 치료, 도서출판 한우리, 1999년, 69-107쪽).

일생동안 미국인이 4대 암에 걸릴 위험도(미국 국립 암연구소 SEER자료)

종류	성별	진단위험도(%)	사망위험도(%)
폐암	남성	8.6	7.1
폐암	여성	5.4	4.2
대장암	남성	6.2	2.6
대장암	여성	5.9	2.6
전립선암	남성	18.5	3.6
유방암	여성	12.6	3.6

최근 분자생물학 및 유전학, 특히 인간 지놈 프로젝트(human genome project)와 기능유전체(functional genomics), 미세기술학(nanotechnology), 및 생물정보학 (bioinformatics)의 발전에 힘입어 인체암의 발생 기전이 좀 더 자세히 밝혀지고 있다. 암은 근본적으로 유전자 이상에 의해 발생하는 질환이다. 후천적으로 생활과정에서 인간에게 노출되는 발암물질이나 자외선, 방사선, 바이러스나 선천적으로 타고난 유전자의 이상은 지놈의 유전정보(DNA, RNA)에 돌연변이를 유발하며, 그 결과 암유전자(oncogene)가 활성화되며, 암억제 유전자(tumor suppressor gene)에 결실이 올 경우 암이 발생한다. 상기 암유전자와 암억제 유전자는 세포증식의 신호전달이나 세포주기 진행, 세포의 생존과 사망, 주위 정상조직과의 조화, 혈관형성 등을 조절하는 기능을 한다. 암유전자는 과잉증식과 생존, 주위조직 파괴, 혈관 형성 등을 촉진하는데 비해, 암억제 유전자는 이와 반대의 기능을 함으로써 암을 억제한다(Evan G, 및 Littlewood T.A, Matter of life and cell death, Science (1998) 281, 1317-1322; Harrington EA 등, Oncogene and cell death,Curr. Opin. Genet. Dev. (1994) 4, 120-129). 상기와 같은 이론에 따라 과거 약 20년간 대부분의 의학자들은 암유전자와 암억제 유전자에 관심을 기울이고, 이들의 검색을 통해 암의 유전학적 지표와 나아가 임상에서 종양 표식자를 찾으려는 연구를 해 왔다. 그 결과 여러가지 세포주기나 세포고사를 조절하는 유전자(p53, p16, CDK inhibitor, Rb 등)들이 발견되었으며(Macleod K, Tumor suppressor genes, Curr. Opin. Genet. Dev.(2000) 10, 81-93; Adams P.D., 및 Kaelin W. G. Jr., Negative control elements of the cell cycle in human tumors. Curr. Opin. Cell. Biol.(1998) 10, 791-797), 선천성 유방암과 선천성 난소암에서의 BRCA₁과 BRCA₂(Miki Y 등, A strong candidate for the brease and orarian susceptibility gene BRCA₁, Science (1994) 266, 66-71); Wooster R 등, Identification of the brease cancer susceptibility gene BRCA₂. Nature (1995) 378, 789-792) 이상, 선천성 대장암에서의 APC(Kinzier K, 및 Vogelstein B., Lessons from hereditary colorectal cancer, Cell(1996) 87, 159-170) 유전자 이상 등이 발견되었고, 이들은 모두 나름대로 암의 연구에 지대한 공헌을 한 것도 사실이다. 또한 미국에서는 가족력 등의 이유로 인해 유방암이나 난소암 등의 발생위험이 더 큰 사람들을 대상으로 BRCA₁과 BRCA₂등 유전자의 돌연변이를 상업적으로 검사해 주는 연구소도 설립되어 있다(Levine A. J., p53, the cellular gatekeeper for growth and division, Cell (1997) 88, 323-331, Frank TS, Laboratory identification of herediataryrisk of breast and ovarian cancer, Curr. Opin. Biotech. (1999) 10, 289-294).

그러나, 인체암의 대다수를 차지하는 후천성 고형암(solid tumors)들의 경우 현재까지 이상적인 유전자 지표는 발견되지 않고 있으며 현재까지 모든 암에서 이상이 나타나는 공통 유전자 지표는 보고된 바 없다. 가장 높은 빈도로 이상이 보고되는 p53의 경우에도 실제 전체 인체 암의 30-50%에서만 돌연변이나 결핍 등의 이상이 나타날 뿐이며(Levine A. J., p53, the cellular gatekeeper for growth and division, Cell(1997) 88, 323-331), 이러한 빈도는 임상에서 암을 진단하는 자료로는 부적합함을 의미한다. 최근 미국에서 p53의 돌연변이를 검색하는 DNA 칩이 개발되었으나, 폐암에서 시도해본 결과 폐암의 40%만이 p53의 돌연변이를 나타냄으로써 한계를 보여준바 있다(Ahrendt S.A., 등. Rapid p53 sequence analysis in primary lung cancer using an oligonucleotide probe array, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 7382-7387). 또한, 전체 암이 아니더라도 임상에서 지대한 문제가 되고 있으며 발생빈도가 가장 높은 폐암이나 위암, 그리고 후천성의 대장암과 유방암 등의 경우 각각의 진료에 실제적으로 도움이 되는 유전자 지표는 현 시점까지 보고된 바가 없는 실정이다.

최근 미국에서는 약 100가지의 지금까지 밝혀진 대부분의 암유전자와 암억제 유전자를 모두 한꺼번에 검색하는 DNA 칩(Human Cancer G110 Array, Affymetrix사, 미국; www.affymetrix.com)이 개발되었다. 그러나 지금까지 밝혀진 유전자가 전체 인체 유전자의 일부(5∼10%)에 지나지 않다는 사실에 따라 볼 때, 상기 DNA 칩으로 과연 모든 인체 암의 진단이 가능한 지는 회의적이다.

최근의 수술, 화학요법, 방사선치료, 및 면역요법 등의 발전에도 불구하고 일부 혈액암과 소아암을 제외한 인체 암의 치료 결과는 지난 수십 년간 크게 개선되지 않은 것이 사실이다. 오늘날 암의 치료결과가 저조한 주된 원인은 치료법 자체의 결함보다는 상당수의 암이 수술 등의 현존 치료법으로 치료가 불가능할 정도로 진행된 상태-즉 전이(확산)된 상태에서 발견되기 때문인 바, 최근에 와서는 치료 만큼이나 암의 예방 측면이 중요시 되고있는 실정이다.

암의 예방 방법으로는 첫째, 생활습관의 개선이나 약물 및 식이요법 등의 소위 화학적 예방(chemoprevention)으로 암의 다단계 발병을 지연 내지 억제시키는 방법이 활발히 사용되고 있다. 특히 가족력 또는 과거 암발생 전력 등의 이유로 암의 발생 위험이 큰 무증상의 일반인에게 권장되고 있으며, 실제로도 이전에 폐암으로 치료받고 장기 치유상태인 사람에게 암의 예방을 위해 레티노익엑시드(retinoic acid)를 투여하는 임상시험이 시도되고 있다. 그러나, 암 유발에 직접적 영향을 주는 것으로 명확하게 밝혀진 흡연을 제외하고는 대다수의 암의 원인과 예방약제가 명확히 밝혀져 있지 않은 현시점에서는 상기한 암의 예방방법은 실질적으로 그 효과가 명확하지 않으며 효과의 평가를 위한 지표가 없다는 문제점이 있다.

둘째, 조기검진 또는 선별검사(screening)를 통한 암의 2차 예방방법이 있다. 대부분 인체암의 경우 진단 당시 암의 크기와 병기에 따라 근치적 치료율과 생존기간이 결정되는바, 종양이 작고 전이가 없는 1기 내지 2기 암에서 가장 치료 성공율이 높고, 또한 실제 치유는 거의 항상 이들 조기암에서 국한되어 나타난다. 따라서, 증상이 없는 대중집단에서 암을 조기에 발견하기 위한 노력이 경주되고 있다. 현재 사용되고 있는 암선별 방법은 관찰(피부, 구강, 외음부, 자궁경부), 촉진(유방, 구강, 갑상선, 직장 및 항문, 전립선, 고환, 자궁, 림프절), 임상병리적 검사(Papanicolaou smear), 종양표식자 (tumor marker)검사 (혈청 PSA(prostate specific antigen)나 α-페토단백질(α-feto protein) 측정, 방사선검사(대장조영, 흉부방사선검사), 및 내시경검사 등이 있다. 미국 종양학회에서 권유하는 무증상인 일반 대중을 대상으로 한 암의 선별검사의 종류는 하기 표 2와 같다.

암의 선별검사: 무증상군에서의 조기암 발견을 위한 미종양학회의 지침(1993)

대상 암	검 사	성별	연령	빈도
전립선암	직장수지검사	남성	50세 이상	매년
전립선암	혈청 PSA검사	남성	50세 이상	매년
유방암	자가 검진	여성	20세 이상	매달
	이학적검진	여성	20-40세/40세 이상	3년/매년
	유방촬영술	여성	50세 이상	매년
대장암	대변잠혈검사	남여	50세 이상	매년
대장암	직장경검사	남여	50세 이상	3-5년
자궁암	Pap도말검사	여성	18세 이상	매년
	골반내진	여성	18-40세/40세 이후	1-3년/매년
	자궁내막조직검사	여성	폐경기 고위험군	폐경때 및 의사지시
폐암	흉부 X선촬영/객담세포진검사	추천되지 않음

실제적으로 유방암과 자궁경부암, 구강암, 및 피부암 등의 경우 상기 선별검사를 통해 치료결과가 향상됨이 보고되고 있다. 아울러 혈청 PSA검사는 전립선 암에서 선별검사와 진단, 치료후 추적검사 등의 다방면으로 유용하게 사용되고 있다(Rimer B. K, Schildkraut. Cancer Screening, In DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA. eds. Cancer. Principles and Practice of Oncology 5th ed., Lippincott-Rave: philadelphia, 1997; 619-631).

최근 혈액내에서 특정 유전자의 발현을 검색함으로써 그 유전자를 발현하는세포의 존재를 파악하고 특정 질환의 진단에 응용하려는 시도가 이루어지고 있다. 예컨데 혈액내에서 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA)이나 전립선막 항원(prostate specific membrane antigen, PSMA)을 발현하는 양성 또는 악성의 전립선 세포를 RT-PCR로 검색하는 것이 전립선암의 진단 뿐만 아니라 병기평가, 즉 전이암의 진단에 유효하다고 보고되고 있으며, 이를 분자적 병기판정법(molecular staging)이라고 칭하기도 한다. 혈액내 암세포의 존재가 곧 전이를 가르키는 것은 아니지만 이는 전이가 있을 가능성이 더 높음을 가르킨다고 보고되어 있다(Katz AE, Olsson CA, Rafflo AJ et al. Molecular staging of prostate cancer with the use of an enhanced reverse transcriptase-PCR assay/Israeli RS, Miller WH, Su SL et al. Sensitive nested reverse transcription polymerase chain reaction detection of circulating prostatic tumor cells: comparison of prostate specific membrane antigen and prostate specific antigen-based assays. Cancer Research(1994). 54: 6306). 그러나 오늘날 전체 암이건 특정 암이건 간에 100%에 가까운 빈도로 이상이 나타나며, 실제 임상에서 암의 진단이나 선별에 도움이 되는 유전자 지표는 보고된 바 없다.

폐암은 남녀를 통틀어 발병율 및 사망율이 가장 높은 암으로 미국의 경우 매년 약 18만명의 폐암환자가 발생하고 16만명이 폐암으로 인해 사망하며, 전체 폐암환자의 5년 이상 생존율은 약 10%에 지나지 않는다. 인체 폐암은 대부분 기관지상피에서 발생하는 암(bronchogenic carcinoma)으로서 인체의 폐암의 조직형은 크게 소세포암(small cell carcinoma) 및 비소세포암(non-small cell carcinoma)으로 구분되며, 소세포암은 단일형이고, 비소세포암에는 선암(adenocarcinoma)과 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma), 기관지 폐포암(bronchioalveolar carcinoma)이 있다. 폐암발생의 1차 원인은 흡연으로, 흡연의 양과 기간은 폐암의 발병빈도나 폐암으로 인한 사망의 빈도와 직접 비례한다. 1일 25개피이상 흡연을 10년간 계속하면 폐암으로 이환될 확률이 20배로 증가하며, 폐암으로 사망할 가능성이 13%나 된다. 이 경우 폐암은 1차흡연자 뿐만 아니라, 간접적 흡연가(가족, 부인 등)에서도 발생률이 월등하게 높아진다. 따라서 1차 흡연자와 2차 흡연자의 양군에서 폐암의 선별검사가 필요하며, 그 외에 아스베스토스(asbestos) 등의 폐암 유발물질에 직업적으로 노출된 사람들에서도 폐암의 선별검사가 필요하다.

폐암 선별검사를 목적으로 흉부촬영과 객담세포진(sputum cytology study)이 시도되어 왔으나 그 진단 민감도(diagnostic sensitivity)는 전자가 30%미만이며 후자는 40-60%에 지나지 않는다. 따라서, 실질적으로 폐암을 조기진단하기는 어려우며 상기 조기진단으로 인한 치료 효과의 개선 또한 기대하기 힘들다는 반론이 있으며, 이에 앞서 기술한 미종양학회가 권유하는 선별검사에서도 빠져있다. 상기와 같은 이유로 폐암은 일반적으로 90% 이상이 진행된 III기 이상의 상태에서 발견되며, 이 경우 적극적인 화학요법 및 방사선 요법에도 불구하고 대부분 2년내에 사망하며, 5년 생존율은 5%미만이다(최 수진, 심 영수, 및 박 성수 역: 폐. 신생물 및 악성질환. 오늘의 진단과 치료, 도서출판 한우리, 1999년, 323-332쪽). 그러나, 폐암에 대한 선별검사가 가능하여 특이한 증상이 없고 방사선 검사에서 정상을 나타내는 조기암(occult carcinoma) 상태에서 발견된다면 80%이상 치유가 가능하다. 실제 흉부방사선검사와 객담세포진만의 제한된 고전적 선별검사만으로도 폐암의 치료결과는 개선되며, 선별검사로 발견된 폐암 환자군과 증상이 나타난 후 진단된 폐암 환자군은 5년 생존율이 35%와 13%로 현격한 차이가 있음이 보고되고 있다(Berlin Ni, Buncher CR, 및 Fontana RS 등, Early lung cancer detection: summary and conclusions, American Review of respiratory diseases, 1984, 30, 565).

폐암의 경우 선별검사 외에도 진단적 검사, 치료후 추적 검사 모두 문제가 많다. 임상에서 폐암의 진단은 실제 용이하지 않다. 조기검진의 전통적 방법인 흉부방사선 및 객담 세포진검사로는 조기 암은 발견하지 어려울 뿐만 아니라, 병변이 관찰되더라도 폐암과 여타 질환을 감별하거나 원발 폐암과 전이 폐암을 감별하기는 실제 용이하지 않다. 폐암의 확진을 위해서는 기관지 내시경하 생검이나 솔생검, 기관지 세척후 세포진검사, 경피 침흡인술, 종격동경하 생검, 림프절 생검, 흉막 생검 등의 조직학적 검사가 필요하나, 이로서도 오진이 적지 않고, 종종 개흉술하의 확인(open lung biopsy)까지 필요하게 된다. 특히, 임상에서 문제가 되는 직경 5cm이하의 고립 폐결절(solitary pulmonary nodule)의 경우에는 방사선 검사는 물론 생검으로도 진단이 모호한 경우가 적지 않다(Ginsberg RJ, Vokes EE, Raben A. Cancer of the lung. Section 2. Non-small cell lung cancer. In DeVita VT Jr. Hellman S, Rosenberg SA. eds. Cancer. Principles and Practice of Oncology, 5th end., Lippincott-Rave: philadelphia, 1997; 858-910).

폐암의 진단 후에는 치료방침의 결정을 위해 암의 확산범위, 즉 병기의 평가가 필요하다. 폐암의 병기판정을 위한 검사로는 전산화단층촬영(CT scan)과 기관지내시경, 흉곽경(thoracoscopy), 종격동경(mediastinoscopy), 그리고 이들을 이용한 생검이나 세포검진 등이 있으나, 이들 검사는 모두 정확도에 한계가 있거나 침해적인 검사라는 문제가 있다. 폐암은 흔히 흉막을 침범하여 악성흉수를 동반하는 바, 이 경우 흉수세포진검사와 흉막생검이 시행되나 각각 약 절반에서만 진단이 가능하다. 따라서 폐암의 병기평가의 정확도를 개선시킬 필요가 있다.

폐암의 치료 후에는 그 결과를 정확히 평가하고, 잔존암 및 재발암을 정확하고 신속하게 파악할 수 있는 추적검사가 필요하다. 현재 주로 CT 등의 방사선검사나 내시경검사 등이 폐암의 추적검사로 사용되나, 이들 검사로는 미세 잔존암 및 재발암의 진단이 불가능하다. 따라서, 폐암의 추적검사를 위해 새로운 방법이 절실히 필요하다.

모든 개체가 정상적으로 생존하기 위해서는 세포막의 물투과(water permeability)가 적절히 유지되어야 한다. AQP는 세포로 물이 들어오고 나가는 수로(water channel)를 구성하는 단백질로서 미생물에서부터 식물, 포유류에 이르기까지 여러 종의 생물에 공통적으로 존재한다. 포유류에는 현재 제1타입으로부터 제10타입까지 서로 다른 10타입의 AQP가 존재한다고 보고되고 있다. 상대적으로 물의 흡수 및 배출이 중요한 식물의 경우 100여 종류의 AQP가 존재한다고 알려져 있다. 최초로 밝혀진 제1타입 AQP, 즉 AQP1은 적혈구에서 발견되었으며 인체 AQP1은 본 발명자에 의해 클로닝된 바 있다(Moon C, Perston GM, Griffin CA, Jabs EW 및 Agre P., Cloning of human aquaporin 1 gene., J Biol Chem (1993) 268, 15772-15778). AQP 중 AQP1과 AQP2, AQP4, AQP5, AQP6, AQP8 및 AQP10은 물의 통로 기능만 하며 AQP3과 AQP7 및 AQP9는 물뿐만 아니라 글리세롤의 통로로도 작용한다(King LS, Yasui M, 및 Agre P., Aquaporin in health and disease., Molecular Medicine Today (2000) 6, 60-65). 최근 본 발명자들은 AQP가 수로의 기능을 할 뿐만 아니라, 나아가 세포주기의 조절과 신호전달, 성장인자에 대한 핵내 지연조기반응(delayed early response), 저산소 상태하에서의 가스교환에도 관여한다는 증거를 발견한 바 있다.

AQP 단백질은 모두 세포막에 존재하며 그 구조가 수로 기능에 적합하도록 6도메인(6 domains)의 막내 존재 단백질(membrane spanning protein)과 이들을 연결하는 5개의 루프 A-E(loop(A-E))로 이루어져 있으며, 아미노단(NH₂terminal)과 카르복시단(COOH terminal)은 모두 세포질내에 존재한다. AQP의 루프 B와 루프 E에는 각각 아스파라긴-프롤린-알라닌으로 구성된 소위 NPA와 이에 인접하여 시스테인이 존재하며 상기 NPA 두 개가 합쳐져서 수로의 중심이 된다(Walz T, Hirai T. 및 Murata K. 등, Nature(1997) 387, 624-627; Lee MD, Bhakta KY 및 Raina S 등, The human aquaporine-5 gene., J. Biol. Chem. (1996) 271, 8599-8604).

AQP는 체내 조직과 세포별로 다양한 형태가 존재하며, 아울러 조직과 세포별로 다양한 기능을 한다. AQP1은 적혈구와 신장, 폐, 안구, 맥락총(choroid plexus), 담도, 창이 없는 내피세포(nonfenestrated endothelia)에서 발현되고 주된 역할은 신장의 근위세뇨관과 헨레(Henle)의 하행 루프에 존재하면서 사구체 여과액의 대부분을 재흡수함으로써 뇨를 농축시키는데 관여한다. AQP2는 신장의 집뇨관에 존재하며 항이뇨 호르몬의 자극이 있을 때 발동되어 뇨의 농축에 기여하는데 AQP2가 결핍될 경우 요농축이 되지 않는 질환인 신성요붕증(nephrogenic diabetes insipidus)이 발생한다. AQP3는 신집뇨관이나 위장관, 기도의 상피(airway epithelia), 눈의 결막 및 뇌막에 존재한다. AQP4는 주로 뇌의 신경세포들(glial cell, ependymal cell)에 존재하며, 그 외에도 망막과 기도상피에도 존재한다. AQP5는 침샘과 눈물샘, 및 폐에 존재하면서 각각에서 침과 눈물, 폐분비물의 형성에 중요한 역할을 한다. AQP6은 신장의 근위세뇨관과 집뇨관세포에 존재하며 특징적으로 세포내 수로로 작용하고, 산염기 평형에도 관여한다. AQP7과 AQP8은 정세포나 정자에 존재하고, AQP9는 주로 지방세포내에 존재한다(Deen PRT, van Os CH. Epithelial aquaporins., Current Opinion in Cell Biology.(1999) 10, 435-442; King LS, Yasui M, 및 Agre P., Aquaporin in health and disease, Molecular Medicine Today (2000) 6, 60-65; Agre P., Agre P. Aquaporin water channels in kidney., J. American Society of Nephrology (2000) 11, 764-777).

AQP가 중요한 역할을 하는 대표적 장기로는 신장과 폐, 뇌, 안구 및 적혈구 등이 있다. 폐의 경우 폐조직의 기도와 혈관, 간질조직에서는 물의 제거와 공급이 적절히 이루어져야 하는데, 특히 폐의 기도표면의 액체층(liquid layer)이 유지되어야 점막 섬모운동이 정상적으로 이루어지고 수분이 적절히 공급되어야 기도가 건조되지 않으며, 배기는 적절한 정도로 탈수되어야 하는데 상기 모든 기능에 AQP가 관여한다. 동물 임상연구에 따르면 폐에는 AQP1과 AQP3, AQP4, AQP5가 함께 존재하는데, AQP1(Genebank No. NM_000385)은 미세혈관 내피세포와 흉막의 첨부 및 기저측면의 막(apical and basolateral membrane), AQP5(Genebank No. NM_001651)는 제1형 폐포세포(type 1 alveolar pneumocytes)의 첨부막(apical membrane)과 기도점막하 선(airway submucosal gland)의 분비세포(secretory cell)에 풍부하며, AQP3(Genebank No. NM_004925)와 AQP4(Genebank No. U63623)는 기도와 구강의 서로 다른 상피세포에서 각각 발현된다. 또한, AQP는 폐포의 CO₂의 배출에도 관여한다고 보고 되고 있어 기체 통로(gas channel)로도 작용할 가능성이 제기되고 있다(Nielsen S, King LS 등, Aquaporin in complex tissue II., Cellular and subcellular distribution in resporatory tract and glands of rat., American J. Physiology (1997) 273, 1549-1561; King LS, Nielsen S 및 Agre P., Aquaporin-1 water channel protein in lung: ontogeny, steroid-induced expression, and distribution in rat., J. Clin. Invest. (1996) 97, 2183-2191). 그러나 인체 폐에서의 AQP의 분포나 기능은 밝혀져 있지 않으며 AQP가 인체암, 특히 폐암의 발생에 어떻게 관여하는지는 현재까지 명확히 밝혀져 있지 않다.

이상의 실정을 감안할 때 폐암을 위시한 인체 암에 대해 선별과 진단, 치료 후 추적조사 등에 도움이 될 수 있는 새로운 종양표식자(tumor marker)의 개발이 절실한 상태이다.

전술한 배경하에 본 발명자들이 광범위하게 연구를 수행한 결과, 암의 검색시 AQP의 발현 양상 및 돌연변이 유무를 검사하는 방법을 사용함으로써 보다 빠르고 정확하게 암인지 여부를 판단할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

본 발명의 목적은 암 여부를 검색할 수 있는 AQP5의 돌연변이 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 AQP5의 돌연변이체 및 AQP의 발현을 이용하여 암인지 여부를 좀 더 빠르고 정확하게 검색할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

그 외의 본 발명의 또 다른 목적은 AQP5 돌연변이 염기서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 칩을 제공하는데 있다.

도 1은 생체내 혼성화 방법으로 정상 성인에서 인체의 기관지 기도조직의 아쿠아포린(Aquaporin, AQP) 유전자 발현을 나타낸 사진으로,

A: AQP1 안티센스 탐침 사용 B: AQP1 센스 탐침 사용

C: AQP5 안티센스 탐침 사용 D: AQP5 센스 탐침 사용

E: AQP3 안티센스 탐침 사용 F: AQP3 센스 탐침 사용

G: AQP4 안티센스 탐침 사용 H: AQP4 센스 탐침 사용

도 2는 생체내 혼성화 방법으로 생후 17주된 남아 인체의 기관지와 폐의 공기통로(airway) 조직에서의 AQP 유전자 발현을 나타낸 사진으로,

A 및 B는 기관지 상피와 발생중인 소기관지 구조물(developing brochiolar structure)에 대하여 각각 AQP1 안티센스와 센스 탐침을 사용한 경우이고,

C 및 D는 미성숙 폐포 구조물(immature alveolar structure)에 대하여 각각 AQP1 안티센스와 센스 탐침을 사용한 경우이며,

E 및 F는 기관지 상피와 발생중인 소기관지 구조물에 대하여 각각 AQP5 안티센스와 센스 탐침을 사용한 경우이고,

G 및 H는 미성숙 폐포구조물에 대하여 각각 AQP5 안티센스와 센스 탐침을 사용한 경우이다.

도 3은 RT-PCR로 흡연 경력이 있는 세 사람의 기관지 조직에서 AQP 계통 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진으로, 각각 1은 AQP1, 3은 AQP3, 4는 AQP4, 5는 AQP5를 나타내며, 샘플 번호는 사람의 일련번호를 의미한다.

도 4는 RT-PCR로 인체 두경부암 세포주 및 폐암 세포주에서 AQP1 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 5는 RT-PCR로 인체 두경부암 세포주 및 폐암 세포주에서 AQP3 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 6은 RT-PCR로 인체 두경부암 세포주 및 폐암 세포주에서 AQP4 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 7은 RT-PCR로 인체 두경부암 세포주 및 폐암 세포주에서 AQP5 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 8은 노던 블러팅 분석법으로 인체의 폐암조직에서 AQP5 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타낸 사진으로, 여기서 SQC1 및 SQC2는 편평상피암, ADE1, ADE2 및 ADE3는 선암, BAC1은 기관지 폐포암, LAG1(Large Cell Carcinoma)는 대세포암, SMC1(Small Cell Carcinoma)은 소세포암을 의미한다.

도 9는 생체내 혼성화 방법으로 폐암조직에서의 AQP 유전자 발현 여부를 나타낸 사진이다.

A-1은 편평상피암(Squamos Cell Carcinoma)에 AQP1 안티센스를 사용한 경우이고, A-2는 편평상피암에 AQP1 센스를 사용한 경우이며, B-1은 기관지 폐포암(bronchioalveolar carcinoma)에 AQP1 안티센스를 사용한 경우이고, B-2는 기관지 폐포암에 AQP1 센스를 사용한 경우이며, C는 편평상피암에 AQP5 안티센스를 사용한 경우이고, D는 기관지 폐포암에 AQP5 안티센스를 사용한 경우이다.

도 10은 RT-PCR로 폐암 환자 및 정상인의 객담에서 AQP계 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 11은 RT-PCR로 폐암 환자 및 정상인의 혈액에서 AQP계 유전자의 발현을 검색한 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 12는 RT-PCR로 정상인의 폐조직과 폐암 환자의 폐암조직에서 AQP5 유전자의 cDNA를 클로닝 한 후 수동적으로 염기서열분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 13은 RT-PCR로 폐암 환자에서의 기관지 내시경 세척액에서 AQP5의 돌연변이 유전자의 cDNA를 클로닝 한 후 자동 염기서열분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 14는 RT-PCR로 폐암환자의 객담에서 AQP5의 돌연변이 유전자의 cDNA를 클로닝 한 후 자동 염기서열분석한 결과를 나타내는 사진이다.

도 15a는 인체 폐암에서 발견된 AQP5 유전자 돌연변이의 빈도를 엑손별로 나타낸 그래프이다.

도 15b는 인체 폐암에서 발견된 AQP 유전자 돌연변이의 빈도를 부위별로 나타낸 그래프이다.

도 16은 SSCP 방법으로 AQP5 유전자 엑손 1 부위의 돌연변이 여부를 분석한결과를 나타내는 사진이다.

도 17은 MSO(Mutant specific oligonucleotide) 혼성화의 방법으로 AQP5 유전자의 돌연변이 여부를 분석한 사진이다.

도 18은 멀티플렉스 PCR을 사용하여 AQP5 유전자 돌연변이 여부를 분석한 사진으로, 레인(lane) 1은 돌연변이형 AQP5 유전자이고, 레인 2는 정상형 AQP5 유전자이다.

도 19는 본 발명의 DNA 칩으로 폐암환자의 기관지 세척액에서 AQP5 유전자의 돌연변이 여부를 실험한 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 우선, 정상인의 기관지 조직에서의 AQP 유전자의 발현 양상을 확인하였다.

본 발명자들도 초기에는 다른 연구자들과 마찬가지로 세포주기나 신호전달, 생존 및 사망 등의 조절에 관여하는 유전자, 전사인자 등 핵내 단백질에 집중하여 연구를 수행하였으나 암의 종류 및 암발생 조직에 따라 각기 다른 유전자들이 암유발 및 증식에 관여한다는 사실 만을 확인하였을 뿐, 전체 암, 또는 한 종류의 암에서 공통된 암 관련 유전자 요인을 찾을 수 없었다. 이에 본 발명자들은 세포 표면으로 관심을 돌리게 되었고 암 조직과 정상 조직에서의 유전자 발현 및 염기서열을 비교 분석하는 과정에서 AQP계 유전자가 인체 암, 특히 폐암에서 공통적으로 이상이 나타나는 특이한 유전자 임을 발견하였다.

인체 폐에서 AQP계 유전자의 발현 양상은 현재까지 명확하게 밝혀져 있지 않기 때문에 폐암에서의 AQP 유전자의 동정을 검색하기 전에 먼저 정상인의 폐조직에 대해 여러가지 형의 AQP 유전자의 발현 여부를 생체내 혼성화 방법(in situ hybridization)으로 검색하였다. 그 결과 성인 뿐만 아니라 유아의 기관지 상피에서 모두 AQP1, AQP3, AQP4, 및 AQP5가 동시에 모두 발현되며, 폐의 미세혈관 내피세포에서 AQP1이, 그리고 제1형 폐포상피에서는 AQP5의 발현이 풍부하다는 사실을 확인하였다(도 1 및 2 참조). 또한, 이전에는 흡연하였으나 지금은 금연상태이며 조직학적으로 암의 증후가 없음이 확인된 성인들의 기관지 조직을 대상으로 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하여 AQP계 유전자들의 발현을 검색한 결과 동일하게 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5가 함께 발현됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

상기의 결과에 따라, 인체의 기관지 상피 세포는 4가지 아형의 AQP를 함께 발현하며 상기 결과는 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5의 동시발현이 기관지 상피의 유전자 표식자가 될 수 있음을 나타낸다. AQP 발현의 검색방법으로는 본 발명에서 사용된 생체내 혼성화 및 RT-PCR 방법 외에도 면역 조직 화학 분석법 (immunohistochemical study), 웨스턴 블럿(Western blot), DNA 칩 등의 다양한 공지 방법이 사용될 수 있다.

다음으로, 사람 폐암에서의 AQP의 발현 양상을 확인하였다.

RT-PCR의 방법으로 사람 두경부암 세포주 및 폐암세포주에서의 AQP1, AQP2,AQP3, AQP4, AQP5, 및 AQP6의 발현여부를 확인하였는데 결과적으로 두세포주 모두에서 AQP1, AQP3 및 AQP5가 발현되고, 그 중 특히 AQP5의 발현율이 가장 높으며 AQP4는 폐암세포주 4개중 3개에서 발현되며 AQP2와 AQP6은 발현되지 않음을 확인하였다(도 4, 5, 6, 7 참조).

아울러 인체의 다양한 조직형의 폐암세포주를 대상으로 AQP계 유전자의 발현여부와 그 정도를 노던 블러팅(Northern blotting) 방법으로 검사한 결과, 모두 공통적으로 AQP5를 높게 발현함을 확인하였다(도 8 참조). 나아가 인체의 폐암조직에서의 AQP계 유전자의 발현을 생체내 혼성화 방법으로 검색하였는 바, AQP5와 AQP1, AQP3 및/내지 AQP4를 발현함을 알 수 있었다(도 9 참조).

상기 실험에 연장하여 폐암환자의 폐암조직 뿐만 아니라, 객담, 기관지 세척액, 흉수(pleural fluid) 및 혈액에서 AQP의 발현 양상을 RT-PCR로 확인한 결과 폐암조직, 객담, 기관지 세척액, 및 흉수에서 AQP1, AQP3 및 AQP5가 뚜렷하게 발현되는 것을 확인하였다(도 10 참조). 혈액의 경우 폐암환자들에서는 AQP1, AQP3, AQP4, 및 AQP5가 모두 발현되었으나(도 11 참조) 정상인 대조군의 경우 AQP1만이 발현되고 AQP4 및 AQP5는 발현되지 않으며, 드물게 AQP3이 발현되는 결과를 나타내었다. 또한, 위장관암, 대장암, 전립선암 등의 다른 암세포들에서도 AQP1, AQP3, AQP4, 및 AQP5가 함께 발현되는 양상을 나타낸다.

상기 결과는, 첫째, 폐암 등 인체 암세포들은 동시에 AQP1과 AQP3, AQP4, AQP5를 발현하는 특징이 있으며, 둘째, 조직과 객담 등 여러 검체에서 AQP의 mRNA의 검색이 가능하고, 셋째, 폐조직이나 객담, 기관지 세척액, 흉수 및 혈액에서AQP5와 AQP3, AQP1, 및 AQP4의 존재 여부가 암인지 여부를 확인하는데 이용가능함을 시사한다.

암세포주, 폐조직, 객담, 기관지 세척액, 흉수 및 혈액 등의 검체에서 AQP의 발현 양상을 검색하는 방법으로는 상기의 RT-PCR 외에도 RT-PCR 블러팅, 생체내 혼성화 방법, 노던 블러팅, 면역조직화분석법, 웨스턴 블러팅, DNA 칩 등의 다양한 방법이 이용될 수 있다.

사람 폐암조직에서의 AQP의 발현 양상을 생체내 혼성화 방법 및 노던 블러팅(Nothern blot)으로 검색하였으며, 그 결과 폐암세포들이 AQP1, AQP3 및 AQP5를 발현하며, 특히 AQP5를 다량으로 발혐함을 재확인하였다(도 8 내지 9 참조).

인체 폐암에서 AQP유전자의 돌연변이 여부를 검색하기 위해, PCR로 정상인 및 폐암 환자의 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5의 유전자를 클로닝하고 증폭한 다음 염기서열을 분석하였다. 상기 얻어진 서열을 정상형의 AQP1(Genebank No. NM_000385), AQP3(Genebank No. NM_004925), AQP4(Genebank No. U63623) 및 서열번호 1로 표시되는 정상형 AQP5(Genebank No. NM_001651)와 비교 분석한 결과 검사한 모든 폐암 조직에서 공통적으로 AQP5의 돌연변이가 다양한 형태로 발견되었으며, 이에 대해 정상인 대조군의 경우 돌연변이나 이형성(polymorphism)은 발견되지 않음을 확인하였다. 재확인을 위해 다수의 폐암환자와 정상인군에서 얻은 폐조직에서 RT-PCR로 AQP5의 엑손 1의 대부분과 엑손 2 전체 및 엑손 3의 대부분(번역 시작점 ATG의 A에서 143번째 염기부터 593번째 염기까지)을 포함하는 중요 기능부위의cDNA를 증폭한 후 이의 염기서열을 분석하여 돌연변이 여부를 검사하였다. 그 결과 검사한 모든 폐암 조직에서 AQP5의 돌연변이가 발견되었으며, 이에 대해 대조군의 경우에는 돌연변이가 전혀 나타나지 않았다(도 12, 13, 14 참조). AQP5의 돌연변이 양상은 매우 다양한 유형으로 나타났으며 그 중 높은 빈도로 돌연변이가 발생되는 호발부위에서의 AQP5 돌연변이 양상을 하기 표 5a 및 5b에 나타내었다.

최종적으로 AQP5 유전자는 인체 폐암에서 모두 돌연변이화된 형태로 발견되며, 상기 AQP5의 돌연변이는 수로 기능에 핵심적 역할을 하는 중심부 4개 부위 즉, 루프 B, C, E와 제4도메인(TM4)에 집중되어 나타난다(도 15 참조). 따라서, AQP5 유전자의 돌연변이는 폐암을 감지할 수 있는 유전자적 종양 표식자(genetic tumor marker)가 될 수 있다. 이와 같은 결과는 그러나 폐암에만 국한된 것이 아니며, 여타 인체암, 즉 전립선암, 대장암 등에서도 AQP5의 돌연변이를 공통적으로 관찰할 수 있다.

상기 실험에 부가하여 기관기 세척액, 객담 및 악성흉수에서도 동일한 AQP5의 돌연변이 검색을 수행하였으며, 그 결과 폐암환자의 기관지 내시경 세척액의 100%, 객담검체의 96.7%, 악성흉수 100% 빈도로 AQP5의 돌연변이를 확인할 수 있었다. 따라서, 기관지 세척액, 객담 및 악성흉수에서도 폐암인지 여부를 확인할 수 있다.

상기 AQP의 돌연변이 검색시 본 발명에서는 염기 서열분석 방법외에도 SSCP(Single strand conformational polymorphism)(도 16)와 MSO(Mutant specific oligonucleotide) 혼성화 방법(도 17) 및 ARMS(amplification refractory mutationsystem)(도 18), 실시예 7)를 수행하였고, 이외에도 다양한 공지 기술을 이용하여 AQP 유전자의 돌연변이 검색이 가능하다.

DNA 칩은 기계 자동화와 전자 제어기술 등을 이용하여 적게는 수백개에서 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집어넣을 수 있도록 만든 것이다. 즉, DNA 칩이란 유전자 검색용으로서 엄청나게 많은 종류의 DNA를 고밀도로 붙여놓은 것을 말한다. 이러한 DNA 칩이 대체할 수 있는 기존의 대표적인 유전공학 기술로는 써던과 노던 블러팅, 돌연변이 검색 및 DAN 서열분석 등이 있다. 공지기술과 DNA 칩의 차이점은 유전자 물질을 붙이는 매체로 공지기술이 니트로셀룰로오즈 또는 나일론 막을 사용하는데 반하여, DNA 칩에서는 유리 등의 고형체를 사용한다는 것이며, 동시에 최소한 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간안에 검색할 수 있다는 것이 가장 큰 차이점이다(Case-Green SC, Mir KU, Prichard CE 등, Analysing genetic information with DNA arrays, Current Opinions in Chemical Biology (1998) 2, 404-410; Lemieux B, Aharoni A, 및 Schena M., Overview of DNA chip technology, Molecular Breeding(1998), 4, 277-289).

DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고뉴클레오타이드 칩으로 나뉘어 질 수 있는데, 상기 DNA 칩의 이름에서도 알 수 있듯이 cDNA 칩에서는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length Open Reading Frame 또는 EST)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 붙여져 있으며, 이중 올리고뉴클레오타이드 칩은 돌연변이 검색에 아주 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서도 AQP5 유전자의 돌연변이를 대량으로 용이하게 검색하고자 실시예 4에서 얻은 폐암 AQP5의 돌연변이의 유형 정보를 근거로 (4가지 종류의) 올리고뉴클레오타이드 칩을 제조하였고, 제조된 칩을 이용한 검색방법을 개발하였다. 상기에서 각각의 DNA 칩에 붙인 올리고뉴클레오타이드 탐침의 염기서열은 AQP5 유전자의 모든 돌연변이 유형을 근거로 한다.

상기 방법으로 본 발명에서 제조한 DNA 칩을 사용하여 폐암 환자의 폐암조직 및 정상인의 폐조직, 기관지 내시경 세척액, 및 객담내 AQP5 cDNA의 돌연변이 여부를 검사하였다. 그 결과 모든 폐암 검체에서 AQP5 cDNA의 돌연변이가 나타남을 알 수 있었으며, 대조군에서는 돌연변이가 나타나지 않음을 확인함으로써 본 발명의 DNA 칩이 특히 AQP5의 돌연변이 검색에 적합함을 확인할 수 있었다(도 19 참조).

결과적으로 암의 선별이나 검색을 위해서는 1차적으로 AQP1, AQP3, AQP4 및 AQP5의 발현여부를 조사하며, 상기 AQP가 모두 발현될 때 2차적으로 AQP5의 돌연변이를 검색하는 것이 바람직하다. AQP5의 돌연변이의 검색을 위해서는 RT-PCR후 결과물을 MSO 혼성화, SSCP, ARMS 또는 본 발명의 DNA 칩 등의 방법으로 1차 검색하며, 여기에서 돌연변이가 발견되면 이의 확인을 위해 공지의 염기서열분석법이나 또는 또 다른 올리고뉴클레오타이드 DNA 칩을 이용하여 돌연변이를 분석하는 것이 적절하다. 본 발명에서는 조직이나 세포 외에도 혈액, 대변, 소변, 뇌척수액, 흉수액 및 복수액 등의 체액 및 내시경 세척액, 및 객담을 통한 검사가 가능하다.

본 발명의 방법을 암확산의 확인에 사용할 경우 CT나 내시경하에서 폐암의 파종이 의심되는 부위의 세포, 조직, 흉수 및 혈액에서 RNA를 분리, RT-PCR로 AQP5, AQP1, AQP3, 및 AQP4를 모두 발현하는 세포를 확인하고, ASO 혼성화, SSCP,및 DNA 칩의 방법으로 AQP5의 돌연변이를 가지는 암세포를 확인하는 방법이 바람직하다. 수술이나 방사선 치료, 화학요법 등의 각종 항암 치료 후에도 상기 방법으로 치료 효과 및 국소 잔존암을 파악할 수 있으며 재발의 확인이 가능하다.

암예방법의 한 방법인 화학예방법의 시도 후 효과를 파악하기 위한 목적으로도 본 발명의 방법이 사용가능하다. 특히, 본 발명의 방법은 AQP 검색을 이용한 폐암의 선별검사시 객담 및/또는 기관지 세척액에서 AQP5의 돌연변이가 발견되어 폐암이나 전암병변이 강력히 의심되나 암의 증후는 발견되지 않는 경우에 이상적으로 적용되는데 화학예방의 시작 전과 후에 주기적으로 객담 및/또는 기관지 세척액의 AQP5 돌연변이 여부를 추적하여 효과를 판단한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

생체내 혼성화 방법 및 RT-PCR을 통한 정상 폐조직에서의 AQP 유전자의 발현의 확인

암의 증후가 없는 성인, 생후 17주 된 남아, 및 10년 흡연 경력이 있는 성인의 기관지 상피조직에 적정량의 RNAsol(TEL-TEST사, 미국)을 처리하여 균질화(homogenization)시키고 충분히 혼합한 다음 튜브로 옮겼다. 이 때, 흡연 경력이 있는 성인의 기관지 조직은 기관지 내경하 솔생검으로 얻은 것이다.

상기 혼합물에 클로로포름 0.2㎖를 첨가하고 진탕한 다음 4℃ 얼음수조에 15분간 방치하고 이후 4℃ 원심분리기를 이용 15,000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리후, 상층액의 2/3 부피를 취하여 새 튜브로 옮기고 동량의 2-프로판올(2-propanol)을 첨가한 다음 다시 4℃ 얼음수조에 15분간 방치한다. 다시 4℃ 원심분리기 15,000rpm으로 RNA를 침전시켜서 펠렛 만을 얻은 후 DEPC(Diethyl Pyrocarbonate)가 함유된 80% 에탄올로 1회 세척한 다음 상온에서 건조시키고 DEPC-탈이온수 50㎕로 녹여 토탈 RNA를 얻었으며 분광흡광기(spectrophotometer)를 사용하여 농도를 측정한 다음 cDNA 합성에 사용하였다.

상기의 방법으로 제조된 전체 RNA를 DEPC-탈이온수와 1 : 10의 비율로 섞은 다음 70℃ 수조에서 10분간 반응시켰다. 10×RT-버퍼(500 mM Tris(pH 8.3), 60 mM MgCl₂, 400 mM KCl), 0.1 M DTT(Dithiothreitol), 25 mM dNTP, 및 올리고(dT)프라이머 2㎕, RNAsin(Promega, 미국) 1㎕를 혼합하고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 역전사 효소(Superscript II reverse transcriptase; GIBCO BRL, 미국) 100 유닛을 최종 첨가한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 얻은 다음 하기의 PCR 반응에 사용하였다.

각 AQP의 종류에 따라 2개씩의 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 PCR을 위한 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 사용하였으며 각 AQP에 해당하는 서열번호는 하기 표 3에 나타난 바와 같다. 상기의 역전사 반응을 통해 얻은 cDNA을 주형으로 하고 상기에서 합성한 각각의 프라이머를 사용하여 하기 표 4에 명시된 조건으로 DNA 열 사이클러(thermal cycler; Perkin-Elmer Corp.) 상에서 PCR을 수행하였다.

AQP 종류	순방향 프라이머	역방향 프라이머
AQP1	서열번호 2	서열번호 3
AQP3	서열번호 4	서열번호 5
AQP4	서열번호 6	서열번호 7
AQP5	서열번호 8	서열번호 9
베타엑틴(대조군)	서열번호 10	서열번호 11

PCR 반응조성액	반응 조건
(퍼킨 엘머 PCR 버퍼)10×Taq 버퍼100 mM Tris-Cl500 mM KCl15 mM MgCl0.01% 젤라틴Taq 중합효소 (5유닛/㎕)dNTP 500 uM순방향 프라이머(20p 몰)역방향 프라이머(20p 몰)	1. 95℃에서 4분간 가닥분리(denaturation) 이후2. 하기의 과정을 40사이클 반복(베타 엑틴의 경우 25 사이클)94℃에서 10초63℃에서 50초72℃에서 50초3. 이후 72℃에서 10분간 최종 익스텐션(extension)

상기 PCR 결과물을 0.9% 아가로오즈 젤 상에서 확인한 결과 AQP1의 경우 230 bp, AQP3의 경우 130 bp, AQP4의 경우 220 bp, AQP5의 경우 450 bp, 베타엑틴의 경우 340 bp의 PCR 결과물을 얻었음을 확인하였다.

상기의 과정으로 얻어진 각각의 AQP의 cDNA를 염기서열분석으로 각 유전자를 확인한 후 PCR II-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 이를 주형으로 생체외 전사반응(in vitro transcription)을 통해 센스 및 안티센스 탐침을 얻었다. DIG-RNA 라벨링 키트(digoxigenin-UTP;Boehringer Mannheim, 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 전사과정을 거치면서 단일가닥 RNA 탐침을 라벨링시켰다. 상기 DIG-라벨된 탐침에 RNase 저해제를 첨가한 후 -80℃에 보관하였다가 하기의 생체내 혼성화 과정에 사용하였다.

생체내 혼성화를 위해 먼저 파라핀에 고정되어 있던 조직의 검체에서 4㎛ 두께의 절편을 얻어서 실란(silane) 코팅 슬라이드(Sigma)에 붙였다. 이후 자일렌(xyelene)용액으로 상기 샘플에 남아있던 파라핀을 제거하고 처음엔 90% 에탄올에서 시작하여 10%씩 감소시켜 50% 에탄올에 이르기까지 30초 간격으로 재수화(rehydration)시킨 다음 0.2N HCl을 떨어뜨려 처리하였다. 다음으로 1 ㎍/ml 단백질분해효소 K를 포함한 용액 내에서 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1×PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하고 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)에 5분간 고정 및 1×PBS에 세척하고 0.25% 아세틱 안히드라이드(acetic anhydride)로 아세틸화한 다음 0.1M 트리에탄올아민(triethanolamine)으로 10분간 처리하였다. 상기 슬라이드를 점차 높은 농도의 에탄올로 처리하여 탈수시켰고 대기에 건조시켰다. 전혼성화(Prehybridization)를 위해 20×(3M NaCl, 0.3M 소듐 시트레이트(sodoum citrate), pH 7.0), 이온제거된 50% 포름아미드(deionized formamide), 2.5 ㎎ 연어 정자 DNA(salmon sperm DNA), 1g 덱스트란 셀페이트(dextran sulfate), 2% 100×덴하르트 용액(Denhart solution; 20 g/ℓ Ficoll, 20 g/ℓ 폴리비닐피롤리돈, 20 g/ℓ BSA(bovine serum albumin)), 2% DTT, 및 4 ㎎ 효모(yeast) tRNA를 교반하여 혼합한 다음 얻어진 혼성화 용액으로 상기 슬라이드를 처리하였다. 다음으로 혼성화를 위해 상기한 AQP1과 AQP3, AQP5의 탐침을 상기의 혼성화 용액에 각각 400 ng/㎕의 농도로 첨가한 후 슬라이드를 42℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 슬라이드를 2×SCC(0.3M NaCl, 0.03M 소듐 사이트레이트, pH 7.0)용액으로 37℃에서 15분간 세척하였고 RNase 용액(500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA(pH 8.0), 20 ㎍/mlRNase A)에 30분간 처리하였다. 0.05% 트리톤(Triton) X-100 및 2% 양혈청을 함유한 2×SSC로 상온에서 2시간 동안 처리한 후 버퍼 1(buffer 1; 0.1M 말레익 엑시드(maleic acid), 0.15M NaCl)로 세척하고 버퍼 2(2% 양혈청, 0.3% Triton X-100)로 상온에서 30분간 처리한 다음 새로운 1차 반응액 600 ㎖에 항디곡시제닌 항체(anti-digoxigenin antibody)가 1:500으로 희석되도록 첨가한 후 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후 상기 버퍼 1로 2차례 세척한 후 버퍼 3(100mM Tris-HCl, 100mM NaCl 및 50mM MgCl)으로 잠시 세척하였다. 이후, 5-브로모-4-클로로-3-인돌 포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate)와 니트로-블루 테트라졸리움 클로라이드(nitro-blue tetrazolium chloride)를 이용하여 제조사의 프로토콜 대로 발색 반응을 유발하고 버퍼 4(10mM Tris-HCl, 및 1mM EDTA)로 세척한 후 마운팅하여 광학현미경(니콘, 일본)으로 관찰하여 샘플내 존재하는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 확인하였다. 디곡시제닌으로 라벨링한 센서 탐침으로 검색한 것을 음성 대조군(negative control)으로 하였다.

앞의 결과 정상 성인, 흡연 경력이 있는 성인 뿐만 아니라 유아의 기관지 상피에서 모두 AQP1, AQP3, AQP4, 및 AQP5가 동시에 모두 발현된다는 사실을 확인하였다.(도 1, 도 2 및 도 3 참조).

실시예 2

인체의 폐암 세포주 및 두경부암 세포주에서 AQP 유전자 발현의 검사

인체의 폐암 세포주와 두경부암 세포주에서 AQP 유전자의 발현을 RT-PCR과 노던 블러팅 및 생체내 혼성화 방법으로 검사하였다.

먼저 인체의 폐암 세포주 H460과, H1944, H596, A549 그리고 인체의 두경부암 세포주 183A, 22B, 17A, 11B를 미국의 ATCC에서 구입하여 AQP계 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. RT-PCR의 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 단 AQP5의 cDNA의 PCR의 경우 서열번호 12로 기재되는 순방향 프라이머, 그리고 서열번호 13으로 기재되는 역방향 프라이머로 달리하였다. PCR 결과물을 아가로즈 젤에서 확인한 결과 AQP1의 경우 230bp, AQP5는 247bp, 베타엑틴의 경우 340bp의 산물을 확인하였다. 이후 이들 PCR 산물은 다시 TA 클로닝 벡터에 삽입하여 염기서열을 확인하였다. 그 결과 상기 세포주 모두에서 AQP5, AQP1, 및 AQP3을 발현하고 그 중 특히 AQP5의 발현량이 가장 많았으며, AQP4는 폐암 세포주 4개중 H460, H1944, 및 A596과 두경부암 세포주 4개중 11B에서만 발현되고, AQP2와 AQP6은 모든 검체에서 발현되지 않음을 확인하였다(도 4, 5, 6, 7 참조).

인체의 다양한 조직형의 폐암에서 수립된 암세포주를 대상으로 하여 노던 블러팅을 이용하여 AQP 유전자의 발현 여부와 그 정도를 확인하였다. 사용한 세포주에는 편평상피암 세포주로 SC1 및 SC2, 선암세포주로 ADE-1, ADE-2, 및 ADE-3, 기관지 폐포암 세포주로 BAC, 대세포암 세포주로 LAC, 소세포암 세포주로 SMC이 각각 사용되었다. 상기 세포주는 모두 미국의 ATCC로부터 구입하였다. 노던블러팅의 방법은 공지의 방법을 이용하여 실시하였다(Sambrook J. 등, Molecular cloning, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). 먼저 RNAsol B(Genomed 독일)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 폐암조직의 RNA를 분리하였고, 상기에서 얻은 RNA 20 ㎍을 약 1분간 끓인 후 RNA용 아가로오즈 젤(아가로오즈 1.2g, 10×MOPS(3-[N-morpholino]propanesulfornic acid) 버퍼(41.8g/ℓ MOPS, 3M 소듐 아세테이트 16.6 ㎖, 0.5M EDTA pH 8.0의 20.0 ㎖) 10 ㎖ 및 37% 포름알데히드 18 ㎖를 첨가한 후 DEPC 처리된 탈이온수로 100 ㎖로 맞춤)에 로딩하여 전기영동하였다. 전기영동후 공지의 캐필러리 방법(capillary method; Sambrook J. 등, Molecular cloning, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))으로 상기 RNA를 나일론 막으로 이동시킨 다음 UV-크로스링커(UV-crosslinker; 1200 J/cm²)로 고정하였다. 탐침의 제조를 위해 실시예 2에서 얻은 AQP cDNA 및 대조군으로 사용할 GAPDH cDNA를 공지의 방법으로 [α-³²P]를 사용하여 라벨링 하였다(Sambrook J. 등, Molecular cloning, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). 상기 방법으로 얻은 폐암세포주의 토탈 RNA가 전이되어 있는 나일론 막과 AQP5 및 GAPDH 탐침을 사용하여 혼성화를 수행하였고, 혼성화가 끝난 막을 1차 세척액(50 ㎖ 20×SSC, 및 5 ㎖ 10% SDS를 첨가한 후 500 ㎖로 맞춤)으로 42℃에서 10분씩 2∼3회, 2차 세척액(2.5 ㎖ 20×SSC, 및 5 ㎖ 10% SDS를 첨가한 후 DEPC 처리된 탈이온수로 500 ㎖로 맞춤)으로 실온에서 2회 세척하였다. 이후 결과를 X-선 필름(Kodak, 미국)에 노출시켜 관찰하였으며, 이미지 분석기(image analyzer)로 밴드의 밀도를 측정하였다.

그 결과 폐암 세포들이 조직형에 관계없이 모든 인체 폐암 세포주에서 AQP1과 AQP4, AQP5를 발현함을 알 수 있었고, 특히 AQP5가 높게 발현됨을 확인하였다(도 8 참조).

상기 실험에 부가하여 인체에서 발생한 다양한 조직형의 폐암조직을 대상으로 생체내 혼성화 방법을 사용하여 AQP 유전자가 발현되는 세포와 그 발현 정도를 확인하였다. 생체내 혼성화 방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

그 결과 편평상피암과 기관지 폐포암, 선암 등의 세포에서 AQP5와 AQP1, AQP3이 모두 높게 발현됨을 확인할 수 있었고 특히, 조직형에 상관없이 AQP5가 강력하게 발현됨을 확인하였다(도 9 참조).

실시예 3

RT-PCR을 통한 폐암환자군과 정상인 대조군의 폐조직, 기관지 내시경 세척액, 객담, 혈액, 및 흉수에서의 AQP 유전자의 발현확인

폐암 환자군과 정상인 대조군에서 각각 폐암조직이나 정상 기관지 조직, 기관지 내시경 세척액, 객담 및 혈액을 준비하였다. 혈액검체는 병기가 3기 내지 4기인 진행된 폐암환자에서 얻었고, 흉수는 악성흉수를 동반한 폐암환자의 흉수를 채취하여 각각 얻었다. 준비된 상기의 검체 각각에서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 RNA를 추출한 후 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 단 AQP5의 경우는 실시예 2와 같은 조건으로 수행하였다. PCR 결과물을 0.9% 아가로오즈 젤상에서 확인한 결과 AQP1의 경우 230bp, AQP3의 경우 130bp, AQP4의 경우 220bp, AQP5의 경우 247bp, 베타엑틴의 경우 340bp의 PCR 결과물을 얻었음을 확인하였고, 또한 각 타입의 AQP 유전자 및 베타 엑틴에 특이한 염기서열을 가진 탐침을 사용하여 공지의 방법으로 닷 블러팅(dot blotting) 또는 써던 블러팅(Southern blotting)을 수행하여 재확인하였다(Sambrook J. 등, Molecular cloning, 2판,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

그 결과 폐암환자의 폐암조직, 객담, 기관지 세척액, 및 흉수에서 AQP1, AQP3, 및 AQP5가 뚜렷하게 발현되는 것을 확인하였다(도 10 참조).

혈액의 경우 폐암환자들에서는 AQP1, AQP3, AQP4, 및 AQP5가 모두 발현되었으나, 정상인 대조군의 경우 AQP1 만이 발현되고 AQP4 및 AQP5는 발현되지 않았으며, 적혈구의 오염시 드물게 AQP3가 발현되는 결과를 나타내었다(도 11 참조).

이는 폐암조직, 객담, 기관지 세척액, 및 흉수에서 AQP5, AQP1, 및 AQP3의 발현을 검색할 수 있으며, 또한 이들의 cDNA를 검출하여 염기서열 등의 정보를 분석할 수 있음을 나타낸다.

실시예 4

폐암조직, 기관지 내시경 세척액, 객담, 또는 혈액에서 검출된 AQP5 유전자의 염기서열 분석

폐암환자 20명으로부터 얻은 폐암조직에서 전체 RNA 및 cDNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 얻고, 상기 폐암 cDNA 및 정상 폐의 cDNA 라이브러리를 주형으로 실시예 1과 동일한 PCR 조건하에서 AQP1, AQP3, AQP4, AQP5 전체, 및 AQP5의 cDNA의 엑손 1 대부분과 엑손 2 전체 그리고 엑손 3 대부분을 증폭하여 클로닝한 후 그 염기서열을 분석한 결과를 블라스트 서치 프로그램을 이용하여 돌연변이 여부를 검색하였다. 상기 PCR에 사용한 프라이머는 상기 표 3과 동일하다.

상기 실험에 부가하여 재확인을 위해 폐암환자 112명 및 정상인 대조군 105명으로부터 암조직과 정상기관지 생검조직을 얻고 그에 따른 RNA 및 cDNA를 실시예2와 동일한 방법으로 얻은 후 이를 주형으로, 서열번호 14로 표시되는 순방향 프라이머 및 서열번호 15로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하여 상기와 동일한 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 약 450bp 크기의 AQP5 cDNA의 중심부분(엑손 1의 일부분과 엑손 2 전부, 엑손 3 일부분; 번역시작점 ATG의 A에서 143번째 염기부터 593번째 염기까지)을 얻었고, 결과물을 pGEM T-easy 키트(Promega, 미국)를 이용하여 pGEM T-easy 벡터에 삽입하거나 PCR 산물을 직접 이용하여 그 염기서열을 분석하여 AQP5 유전자 상의 돌연변이 존재 유무를 확인하였다.

서열번호 1의 정상형 염기서열과 분석된 염기서열을 비교한 결과 모든 폐암조직의 cDNA에서 AQP5의 돌연변이가 매우 다양한 유형으로 발견됨을 확인하였으며, 이에 대해 정상 대조군에서는 돌연변이나 이형성(polymorphism)이 전혀 발견되지 않았다. 다양한 돌연변이 유형 중 특히 높은 빈도로 돌연변이가 발생되는 호발부위에서의 AQP5 돌연변이 양상은 하기 표 5a 및 5b에 종합하여 나타내었다(도 12 및 도 15 참조).

인체 폐암에서 AQP유전자 cDNA의 돌연변이 양상 (돌연변이 호발부위 60염기의 정리)

No.	위치엑손	위치	코돈 No.	염기 No.	돌연변이 빈도(%)
1	1	TM2	54	162	1.8
2	1	TM2	55	164	1.8
3	1	루프 B	64	192	7.1
4	1	루프 B	66	197	2.7
5	1	루프 B	69	205	2.7
6	1	루프 B	74	221	3.6
7	1	루프 B	78	233	2.7
8	1	루프 B	79	235	14.3
9	1	루프 B	80	238	2.7
10	1	루프 B	83	247	2.7
11	1	루프 B	84	251	3.6
12	1	TM3	91	273	7.1
13	1	TM3	95	283	2.7
14	1	TM3	96	288	2.7
15	1	TM3	97	290	7.1
16	1	TM3	101	303	7.1
17	1	TM3	103	307	7.1
18	1	TM3	109	327	3.6
19	1	루프 C	111	331	7.1
20	1	루프 C	112	334	2.7
21	1	루프 C	112	335	1.8
22	1	루프 C	119	357	3.6
23	1	루프 C	121	363	2.7
24	2	루프 C	122	365	2.7
25	2	루프 C	123	367	1.8
26	2	루프 C	124	371	3.6
27	2	루프 C	126	376	17.9
28	2	루프 C	126	378	2.7
29	2	루프 C	127	381	2.7
30	2	TM4	132	394	2.7
31	2	TM4	135	404	2.7
32	2	TM4	136	407	7.1
33	2	TM4	138	412	1.8
34	2	TM4	140	419	2.7

No.	위치엑손	위치	코돈 No.	염기 No.	돌연변이 빈도(%)
35	2	TM4	142	426	14.3
36	2	TM4	144	431	2.7
37	2	TM4	145	433	2.7
38	2	TM4	146	436	14.3
39	2	루프 D	152	455	2.7
40	2	루프 D	154	460	2.7
41	2	TM5	158	476	3.6
42	2	TM5	163	488	2.7
43	2	TM5	164	491	2.7
44	2	TM5	166	498	2.7
45	2	TM5	168	502	7.1
46	2	TM5	169	506	2.7
47	2	TM5	175	524	2.7
48	3	루프 E	179	535	3.6
49	3	루프 E	179	536	7.1
50	3	루프 E	181	543	2.7
51	3	루프 E	182	544	1.8
52	3	루프 E	184	551	2.7
53	3	루프 E	184	552	2.7
54	3	루프 E	185	553	1.8
55	3	루프 E	186	558	3.5
56	3	루프 E	187	562	3.5
57	3	루프 E	189	565	2.7
58	3	루프 E	189	567	14.3
59	3	루프 E	190	569	2.7
60	3	루프 E	191	573	7.1

결과적으로 인체 폐암 조직에서 나타나는 AQP 돌연변이는 첫째, 대부분 한 검체에서 AQP5 cDNA의 다수 부위에 동시에 돌연변이가 나타났으며, 한 검체 당 돌연변이화된 염기의 수는 평균 2.9개나 되었다. 둘째, 돌연변이는 시작(ATG의 A)부터 제162번 염기에서 제573번 염기까지에 산재되어 나타났다. 셋째, 돌연변이가 호발되는 부위가 있었다. 즉, AQP5의 구조 중 수로의 기능에 핵심 역할을 하는 루프 B(메티오닌 개시 코돈으로부터 62∼86번째 아미노산, 또는 염기로는 ATG의 A부터 184∼258째 염기)와 루프 C(시작부터 110∼130번째 아미노산, 또는 328∼390째 염기), 루프 D(151째∼157째 아미노산, 또는 451∼471째 염기), 루프 E(179∼204째 아미노산, 또는 535∼612째 염기)와 그 사이의 TM(transmembrane domain) 부분에돌연변이가 편중되어 있었다. 특히, NPA(Asn-Pro-Ala)가 있는 루프 E의 전반부(535∼573째 염기)와 루프 B 및 루프 C, 그리고 TM4의 4부위에 돌연변이가 가장 흔하게 나타났다. 전체 검체 중 90%는 상기 네부위에서 1차례 이상 돌연변이를 나타내었으며, 상기 네부위가 정상이면서, 그 외의 부위에 돌연변이를 보이는 경우는 10%에 지나지 않았다(도 15 참조).

상기 실험에 부가하여 기관지 내시경 세척액, 객담, 악성흉수, 및 혈액에서도 동일한 AQP5의 돌연변이 검색을 수행하였으며, 그 결과 폐암환자에서 검출하여 AQP5의 cDNA가 정확히 증폭된 경우 기관지 내시경 세척액의 100%, 객담 검체의 96.7%, 악성흉수 100%에서 각각 AQP5의 돌연변이를 확인할 수 있었다(도 13 및 14 참조).

실시예 5

SSCP(single strand conformational polymorphism) 방법을 통한 생검조직, 폐암세포주, 기관지 내시경 세척액, 객담, 또는 혈액에서 검출된 AQP5유전자의 돌연변이 여부 분석

SSCP는 단일가닥 DNA는 분자간의 약한 결합, 특히 염기간의 수소결합에 의해 폴딩되며 이러한 구조는 비변성 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing polyacrylamide gel)상에서 전기영동시 길이 뿐만 아니라 구조에 의해 이동성(electrophoretic mobility)의 차이를 나타낸다는 사실을 그 원리로 하고 있다. 먼저 돌연변이 부위에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하고 얻은 결과물을 변성(denaturation)시킨 후 비변성 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동을 하고 실버 염색법으로 검색하면 이동 거리의 비교를 통해 돌연변이 여부를 확인할 수 있다. 통상적으로 200bp 정도의 돌연변이는 상기 방법으로 용이하게 확인할 수 있다.

먼저, AQP5의 엑손 1, 엑손 2 및 엑손 3 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 RT-PCR 방법으로 엑손 1, 엑손 2 및 엑손 3 유전자를 증폭시켰다. 상기의 과정에서 사용한 프라이머는 엑손 1의 경우 서열번호 16으로 표시되는 순방향 프라이머와 서열번호 17로 표시되는 역방향 프라이머, 엑손 2의 경우 서열번호 18로 표시되는 순방향 프라이머와 서열번호 19로 표시되는 역방향 프라이머, 엑손 3의 경우 서열번호 20으로 표시되는 순방향 프라이머와 서열번호 21로 표시되는 역방향 프라이머를 사용하였다.

각각의 증폭된 DNA 50 ng, 각각의 프라이머 30 ng, 67 mM Tris-HCl(pH 8.8), 1 mM MgCl₂, 100 μM dNTP, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0.45% 트리톤-100, 200 mg/㎖ 젤라틴, 0.5 U 텍중합효소(Taq polymerase)가 들어있는 25㎕ 반응 용액에 넣은 후, 94℃에서 4분간 변성하고 94℃에서 30초, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 35회 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR 종료후 세종류의 결과물을 각각 취하여 물로 총 부피를 7 ㎕로 맞춘 다음 로딩 버퍼(0.5% 덱스트란, 95% 포름아마이드) 8 ㎕를 넣었다. 상기 혼합물을 95℃에서 3분간 처리하여 변성시킨 다음 얼음에서 1분간 식히고, 12% 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동하였다. 실버 염색 방법으로 확인한 결과 정상 AQP5 cDNA와 달리 이동성에 변화를 보이는 돌연변이검체를 용이하게 검색할 수있었다(도 12 참조).

실시예 6

돌연변이 특이적 올리고뉴클레오타이드(MSO) 혼성화(Mutant specific oligonucleotide-hybridization) 방법을 통한 AQP5유전자의 돌연변이 여부 분석

MSO 혼성화는 정상형 외에 돌연변이형 올리고뉴클레오타이드를 미리 니트로 셀루로오즈 또는 나일론 필터에 고정한 다음 동위원소 또는 바이오틴 등의 표지 물질로 표지된 PCR 산물과 혼성화시키는 방법으로서 혼성화 결합력의 차이에 의하여 야생형과 돌연변이형을 구별하는 것이 가능하다.

이에 본 발명자들은 기존의 MSO 혼성화 방법을 변형시켜 돌연변이를 더 손쉽게 검색할 수 있는 독자적인 방법을 개발하였으며 과정은 하기와 같다.

1) 먼저 실시예 4에서 얻은 폐암 AQP5유전자의 돌연변이 유형을 종합하여 해당 변이서열을 기초로 올리고뉴클레오타이드를 합성한 다음 니트로셀루로오즈 막에 평행이 되도록 고정시켰다.

2) 실시예 2에서 얻은 검체 cDNA를 주형으로 5' 부위가 바이오틴 표지된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 바이오틴 표지된 AQP5의 엑손 1,2 및 3 cDNA를 얻었다.

3) 상기 바이오틴 표지된 AQP5의 cDNA를 변성시킨 다음, 1)에서 제조한 나일론 막과 58℃에서 30분간 혼성화하였다. 결합되지 않은 바이오틴 표지 DNA를 세척용액으로 상온에서 20초간 2번, 58℃에서 10분간 1회 세척하였다.

4) 세척된 막에 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)로 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)을 실온에서 30분간 처리하여 형성된 바이오틴 표지된 하이브리드(hybrid)에 결합시켰다. 다음으로 BCIP/NBT 크로모젠(chromogen) 기질을 넣어 발색 반응을 유도하였으며 막에 나타난 발색 반응을 분석하여 AQP5 유전자의 돌연변이 여부를 검색하였으며, 그 결과는 실시예 4의 염기분석 방법으로 재확인하였다. AQP5의 돌연변이가 확인된 검체의 SSCP 결과, 막상에 두개의 밴드가 나타나 AQP5 유전자 두 곳에서 돌연변이가 나타남을 확인하였다(도 17 참조).

실시예 7

ARMS(amplification refractory mutation system 또는 Allele-specific amplification)방법을 통한 AQP5유전자의 돌연변이 여부 분석

ARMS는 PCR 수행시 프라이머의 3'말단이 주형과 일치하지 않을 경우 DNA가 합성되지 않는 성질을 이용한 것인데(Newton CR 등, Analysis of any point mutant in DNA., The amplification refractory mutation system(ARMS) Nucleic acid Res. (1989) 17, 2503-2561), 돌연변이 부위를 알고 있을 경우 돌연변이 부위에 상보적인 서열을 가진 프라이머로 PCR을 수행하면 돌연변이형 DNA만이 증폭되므로 쉽게 돌연변이 여부를 검색할 수 있는 방법이다.

먼저 실시예 4에서 얻은 폐암 AQP5 유전자의 돌연변이 유형을 종합하여 각각의 돌연변이 부위의 3' 말단에 비상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 5쌍을 합성하였다. 4개의 DNA 절편의 증폭을 위하여 프라이머를 각각 12.5 pmol씩 혼합하고, 5㎕ 의 반응완충액(25 mM Tris-Acetate(pH 7.8), 100mM potassium acetate, 1mM DTT), DMSO 5㎕, 25mM dNTP 3㎕, 25mM MgCl₂13, 4㎕, 중합효소(Promega, 5 유닛/㎕) 0.5㎕를 넣은 후 탈이온수를 50㎕가 될 때까지 첨가하여 반응혼합물을 만들었다. 상기 반응혼합물을 94℃에서 6분간 1회 변성시킨 후, 다시 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 65℃에서 240초의 과정을 25회 반복 수행하였고 마지막으로 65℃에서 7분간 1회 더 합성시켰다. 증폭된 DNA 절편을 2% 메타포어 젤(Metaphorgel; FMC 사) 상에서 전기영동 한 후 원하는 증폭산물의 크기 및 합성 여부를 확인하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 증폭이 되지 않은 DNA 절편을 판별함으로서 AQP5유전자의 돌연변이 여부를 용이하게 검색할 수 있었다.(도 18 참조).

실시예 8

DNA 칩(microarrays)을 통한 돌연변이 검색 방법

상기 표 5a 및 5b 뿐 아니라 본 발명자들에 의해 상기 실시예 4에서 밝혀진 모든 유형의 AQP5 돌연변이 염기 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 탐침)의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실리야(silyated) 슬라이드(Telechem 사)에 스팟팅(spotting)하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2× SSC(pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS로 2분간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH₄, PBS(pH 7.4) 300㎖, EtOH 100㎖)으로 15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 완성된 올리고뉴클레오타이드 DNA칩을 얻었다.

타겟 DNA는 하기의 방법으로 제조하였다. 상기의 실시예 2에서 분리한 각각의 시료에 대한 RNA 1 ㎕을 올리고-dT-15머 프라이머와 혼합한 후 70℃에서 5분간, 및 4℃에서 5분간 처리하였다. 상기 혼합물에 25mM dATP 1㎕, dGTP, dTTP 혼합물, 1mM dCTP(Roche 사) 1㎕, 1mM 시아닌(cyanine) 3-dCTP 2㎕ 또는 시아닌 5-dCTP(NEN 사) 1㎕, RNase 저해제(Roche사) 20u, M-MLV RTase(Roche사) 100u, 10× 첫번째 스트랜드 버퍼 2㎕를 첨가하고 38℃에서 2시간 두었다. 삽입되지 않은 뉴클레오타이드는 에탄올 침전을 통하여 제거하고 형광표지된 AQP5의 cDNA절편(target cDNA)을 얻었다.

UniHyb 혼성화 용액(TeleChem 사)하에서 상기의 방법으로 제조한 올리고뉴클레오타이드 DNA 칩과 형광 표지된 cDNA절편의 혼성화를 42℃에서 4시간동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분간 2×SSC로 다시 한번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 상기 슬라이드를 스캔어레이(ScanArray) 5000(GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀드어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover 사)로 분석하여 돌연변이형을 검색하였다(도 19 참조).

상기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 검색 방법 및 DNA 칩을 암검색에 사용할 경우 정확도가 뛰어나고 결과 판독이 신속, 용이하므로 효과적이다.

Claims

서열번호 1의 염기서열 중 적어도 하나의 염기가 돌연변이화된 AQP5 유전자 돌연변이체.
제1항의 AQP5 유전자 돌연변이체의 존재 여부, 및/또는 AQP5, AQP1, AQP3 및/또는 AQP4의 발현을 이용하여 암 여부를 검색하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 전립선암 또는 두경부암 인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 AQP5 돌연변이는 면역조직화학염색, 웨스턴 블러팅, 닷 블러팅, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), RT-PCR, 염기서열분석법, 제한효소를 이용한 방법, 노던 블러팅, 써던 블러팅, RNase 프로텍션 검정법(RNase protection assay), 생체내혼성화(in situ hybridization), SSCP(single strand conformational polymorphism)방법, MSO 혼성화(Mutant specific oligonucleotide-hybridization)방법, ARMS(amplification refractory mutation system 또는 Allele-specific amplification)방법 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된적어도 하나 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, MSO 혼성화 방법은

1) 올리고뉴클레오타이드를 니트로셀루로오즈 또는 나일론 막에 평행이 되도록 고정시키는 단계;

2) 5' 부위가 바이오틴 표지된 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 바이오틴 표지된 탐침 DNA를 얻는 단계;

3) 상기 바이오틴 표지된 탐침 DNA를 변성시킨 다음 단계 2)에서 제조한 막과 혼성화하고 다음으로 결합되지 않은 바이오틴 표지 DNA를 세척 용액으로 제거하는 단계; 및

4) 세척된 막에 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)로 표지된 스트렙타비딘을 처리하여 형성된 바이오틴 표지된 하이브리드(hybrid)에 결합시키고 발색 반응을 유도하여 결과를 얻는 단계를 포함하는 스트립(Strip)을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 AQP5 유전자 돌연변이체 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 칩.