KR20020021448A

KR20020021448A - 생물공학적인 기술에 의한 산삼 묘목의 대량생산방법

Info

Publication number: KR20020021448A
Application number: KR1020000054152A
Authority: KR
Inventors: 이강섭; 최용의; 고성권; 최선; 김이엽
Original assignee: 김이엽; (주)파낙시아
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2002-03-21
Also published as: KR100398749B1

Abstract

본 발명은 산삼 (Wild Korean ginseng,학명은 Panax ginseng C.A. Meyer 또는 Panax schinseng NEES 라고도 함)을 생물공학적인 방법을 이용하여 배양용기 내에서 무균적으로 배양하여 묘목을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것임. 산삼의 생산방법은 캘러스유도과정을 거쳐 산삼의 체세포배를 유도하여 이를 발아시켜 묘목을 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 체세포배로부터 유식물을 유도하고 이로부터 다시 2차 체세포배를 유도하고 이를 발아시켜 산삼 묘목을 생산하는 방법에도 관계된다. 본 발명에 의하면 멸종 위기에 있으며 우수한 약효와 고가의 산삼 묘목을 생물공학적인 방법에 의하여 대량으로 번식시킬 수 있다.

Description

생물공학적인 기술에 의한 산삼 묘목의 대량생산방법{Method for mass propagation of Wild Korean ginseng (Panax ginseng C.A.Meyer) by biotechnological technique}

산삼(Wild Korean ginseng)은 예로부터 진귀한 약용식물로 알려져 온 다년생 초본식물이다.

산삼은 자연에서 발견하기가 어려워 종자를 채취하여 종자번식에 관한 연구를 포함한 번식체계가 어려운 실정이다. 따라서 이와같이 번식이 어려운 산삼을 번식시키기 위해서는 생물공학적 방법을 이용하는 것이 획기적인 수단이 될 수 있다. 특히 조직배양방법을 이용하여 실험실내에서 산삼의 묘목을 대량생산하여 이를 약용 및 식용으로 활용한다면 수출에 따른 농가의 소득증대 및 국민건강에 기여할 수 있다.

일반적으로 배양용기 내에서 무균적으로 식물체를 생산하는 방법 중 체세포배발생을 거쳐 식물체를 생산하는 방법이 있는데, 본 발명은 배양조직으로부터 캘러스를 유도한 다음 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 방법에 해당된다. 산삼의 조직배양을 이용한 체세포배의 대량생산과 그로부터 묘목의 대량생산에 관한 연구보고는 지금까지 이루어진 바 없는 실정이다.

본 발명은 산삼의 조직절편을 오옥신 (2,4-D) 이 첨가된 MS고체 배지에 배양하여 캘러스 유도과정을 거쳐 이로부터 고빈도의 체세포배를 유도하거나, 유도된 체세포배를 기내에서 발아시켜 얻어진 유식물(잎, 줄기, 뿌리)의 절편을 배양하여 2차 체세포배를 유도함과 동시에, 유도된 배발생 캘러스를 계속 증식하여 이로부터 대량의 체세포배를 유도하여 반복적으로 산삼의 묘목을 대량생산하는 새로운 방법에 관계된다.

본 발명은 산삼의 조직절편으로부터, 캘러스과정을 거쳐 체세포배를 유도하거나 또는 배발생 캘러스를 유도하여 이로부터 체세포배를 발생시켜 산삼 묘목을 생물공학적으로 대량생산하여 유식물체를 계속적으로 생산하는 방법이다.

본 발명은 1) 산삼 절편조직으로부터 캘러스 및 체세포배를 직접 유도하는 방법, 2) 배발생 캘러스를 유도하고 증식하여 이로부터 체세포배 유도를 반복하는 방법, 3) 유도된 체세포배를 지베렐린을 처리하여 발아시키는 방법,

4) 발아된 유식물의 절편조직으로부터 2차 체세포배를 유도하여 발아시키는 방법, 5) 상기과정을 통하여 어린 식물체를 토양에 이식하여 최종적으로 묘목을 생산하는 방법으로 구성된다.

도1은 본 발명이 시료로 사용한 진안 운장산 30년생 산삼의 사진

도2는 산삼 조직에서 유도된 캘러스 및 체세포배의 초기 사진

도3은 체세포배의 후기(자엽시기)의 사진

도4는 자엽시기의 배가 발아되는 사진

도5는 체세포배로부터 신초 및 뿌리가 유도되는 사진.

도6은 토양에서 대량으로 번식되고 있는 산삼의 사진.

이하 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1) 배양된 산삼 절편조직으로부터 캘러스 및 체세포배를 유도하는 단계

산삼의 잎, 줄기, 뿌리, 어린 화서를 무균적으로 70% 에탄올에 1분, 1% 차아염소산 용액에 10 ∼ 15분간 처리하여 멸균수로 3 ∼ 4회 수세한 다음 부위별로 배양한다. 각각의 절편을 뮤라시게와 스쿠그 배지에, 설탕 3∼6%, 2,4-D 0.1∼5 mg/L (이때 2,4-D의 농도는 1.0 mg/L 가 가장 적당), 한천 0.7∼0.9%를 첨가하여 조제한 고체배지에 배양하여 배양체로부터 캘러스 및 체세포배를 유도한다. 어린화서(20%), 잎(8.75%), 줄기(5.7%), 뿌리(5.4%) 순으로 체세포배가 유도되었다. 배양실 조건은 1500 LUX 백색형광등으로 16시간 광조명 하에 두었고 온도는 25±1℃로 조정한다.

2) 배양된 유식물 절편으로부터 체세포배를 간접 유도하는 단계

상기의 배양조건에서 2개월 이상 절편체를 계속 배양하였을 때, 배양체로부터 배발생 캘러스가 유도되었다. 이 배발생 캘러스를 1.0 mg/L 2,4-D가 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체(agar 0.8% 첨가) 및 액체배지에서 2∼3주 간격으로 계대배양하여 배발생세포괴를 증식시킨다. 체세포배는 2,4-D가 첨가되지 않은 배지에 배발생세포괴를 이식하여 3∼4주 이상 배양하면 유도되었다. 한편, 2,4-D가 첨가된 액체배지에서 현탁배양된 배발생 세포괴를 200 ㎛ 크기의 stainless steel 체로 거른 다음, 체를 통과한 세포괴를 50∼1000 ml 의 Erlenmeyer flask에 넣어 현탁배양하면 대량의 체세포배가 유도되었다.

1/4∼1/1 MS 배지에서 유도된 어린 유식물(2∼10cm 크기)의 잎, 줄기, 뿌리부분의 절편체를 2,4-D (0.1∼5 mg/L)가 첨가된 MS고체배지(agar 0.8% 첨가)에 각각 약 4∼6주 이상 배양하였을 때, 체세포배의 발생은 줄기(17.9%), 잎(11.8%)절편의 순으로 이루어 졌으며, 뿌리부분에서는 이루어지지 않았다.

3) 유도된 체세포배로부터 식물체를 재생시키는 단계

앞의 과정에서 발생된 체세포배를 자엽시기의 배에 이르게 한 후 5∼100 μM GA₃가 첨가된 배지에 이식하여 배양하면 체세포배가 발아되었다. 발아된 배를 유식물체로 생장시키기 위하여, 1/3 또는 1/2 뮤라시게와 스쿠그 배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하면 약 1개월 후에 경엽부와 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체(유식물체)가 유도되었으며, 소식물체로의 전환율은 100%이었다.

4) 유식물체의 토양 순화

앞의 조건에서 얻어진 약 1∼10 cm 크기의 유식물체(소식물체)를 버미큘라이트(또는 피트), 모래, 흙(1:1:1, v/v)을 함유한 플라스틱 포트 안에 이식하고 비닐로 덮어 3주간 배양실에서 적응시킨 후, 적응된 식물체는 비닐을 벗기고 온실에 이식하여 약 1∼3개월 이상 경과되어도 생존을 하고있는 식물체를 선별한다. 생존하고 있는 식물체를 노지에 이식하여, 자연조건의 겨울철을 지낸 후 다음해의 봄철에 식물체의 95%가 줄기에서 새순이 형성되어 산삼의 진정한 식물체의 대량생산을 확립하게 되어 본 발명을 완성한다.

실시예 1:

배양된 절편체로부터 캘러스를 유도하는 단계

산삼의 잎, 줄기, 뿌리 그리고 어린화서를 70%에탄올로 1분, 1% 차아염소산으로 5∼15분간 멸균시킨 후 멸균된 증류수로 수세하고 각각의 부위를 세절하여 뮤라시게와 스쿠그 고체배지(1/4∼1/1로 변형)에 이식하여 배양한다. 상기배지에 설탕 1∼6%, 2,4-D 0.1∼5 mg/L (이때 2,4-D의 농도는 1.0 mg/L 가 가장 적당), 한천 0.7∼0.9%를 첨가하여 조제한 고체배지에 배양할 경우 배양절편 표면으로부터 배양 2주후에 캘러스가 유도되었으며, 배양 약 6∼8주후에 어린화서, 잎, 줄기, 뿌리절편의 순으로 체세포배가 유도되었다. 배양실 조건은 1500 LUX 백색형광등으로 16시간 광조명 하에 두었고 온도는 25±1℃로 조정한다.

배양된 유식물 절편으로부터 체세포배를 간접 유도하는 단계

상기의 배양조건에서 5∼8주 이상 절편체를 계속 배양하였을 때, 배발생 캘러스가 유도되며, 이를 1.0 mg/L 2,4-D가 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체(agar 0.8% 첨가) 및 액체배지에서 2-3주 간격으로 계대배양하여 증식시킨다. 체세포배는 2,4-D가 첨가되지 않은 배지에 배발생세포괴를 이식하여 약 3∼4주이상 배양하면 유도되었다. 체세포배는 2,4-D가 첨가되지 않은 고체배지 및 액체배지의 조건에서 유도가 가능하였다. 한편, 2,4-D가 첨가된 액체배지에서 현탁배양된 배발생 세포괴를 200 ∼ 100 ㎛크기의 stainless steel 체로 거른 다음, 체를 통과한 세포괴를 100 ml 의 Erlenmeyer flask에 넣어 약 4∼6주이상 플라스크 및 생물반응기에 현탁배양하면 대량의 체세포배가 유도되었다.

발아 및 식물체 재생단계

앞의 과정에서 발생된 체세포배를 자엽시기의 배에 이르게 한 후 5∼100 μM GA₃가 첨가된 배지에 이식하여 배양하면 체세포배가 발아되었다. 발아된 배를 유식물체로 생장시키기 위하여, 1/4 ∼ 1/1 뮤라시게와 스쿠그 배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하면 약 3∼4주후에 경엽부와 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체(유식물체)가 유도되었다.

유식물체의 토양순화

앞의 조건에서 얻어진 약 2∼10 cm 크기의 유식물체(소식물체)를 버미큘라이트 (또는 피트), 모래, 흙(1:1:1, v/v)를 함유한 플라스틱 포트 안에 이식하고 물을 준 후 비닐로 덮어 3주간 배양실에서 적응시킨다. 적응된 식물체는 비닐을 벗기고 온실에 이식하여 약 2∼3개월 이상 경과되어도 생존을 하고있는 식물체를 선별한다. 생존하고 있는 식물체를 노지에 이식하고, 자연조건의 겨울철을 지낸 후 다음해의 봄철에 식물체의 줄기에서 새순이 형성되어 산삼의 진정한 식물체의 대량생산을 확립하게 되어 본 발명을 완성한다.

현재 재배되고 있는 인삼에는 panaxan과 saponin등이 함유되어 있어 예로부터 간장, 심장, 폐장, 신장, 비장의 오장의 양기를 돋구어주는 주약으로 사용하고 위장의 기를 열어줄 뿐만아니라 해열작용, 항결핵 작용, 신경강장 작용, 혈압조절작용, 지혈작용등 만병통치약재로 사용되어 오고 있다. 그러나, 이와같이 인삼이 효능면에서 탁월하지만 인삼은 수백년간 재배되어 오면서 특히 유전적 특질이 원래의 것과는 다르게 변형되는 점과 화학비료, 농약의 과다투여로 인한 중금속의 오염, 그리고 같은 장소에 연작할 수 없는 연작장애등의 많은 단점이 드러나고 있다. 한편, 산삼은 희귀하기 때문에 효능과 가격면에서 재배인삼보다 월등하며 인삼에서의 중금속 오염과 같은 단점이 없는 반면에 자연에서 발견하기가 용이하지 않다. 따라서 약효면에서 우수한 형질을 지닌 산삼을 선별하여 그 유전적 형질이 원래의 것과 동일한 산삼을 대량번식시킬 수 있는 획기적인 번식방법이 절실히 요구된다. 산삼의 번식은 종자로 할 수 있지만 자연에서 발견하기가 어려우므로 대량번식을 위한 생물공학적인 시스템의 확립이 요구된다. 따라서 상기 발명을 이용하여 실험실내에서 산삼묘목을 대량생산한다면 인류건강에 기여할 수 있다.

Claims

자연에서 자란 산삼의 잎, 줄기, 뿌리, 어린 화서의 조직절편을 무균적으로 약 2∼5 mm의 크기로 절편을 만든 후 오옥신이 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체 배지에 배양하여, 배양절편으로부터 배발생 캘러스 및 체세포배를 유도한다. 한편, 배발생 캘러스를 1.0 mg/L 2,4-D가 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체(agar 0.8% 첨가) 및 액체배지에서 2∼3주 간격으로 계대배양하여 증식시킨다. 이를 다시 2,4-D가 첨가되지 않은 고체배지와 액체배지에 배양하여 체세포배를 유도한다. 이상의 두 조건에서 얻어진 체세포배를 기내에서 줄기와 뿌리를 가진 건실한 식물체로 유도한다. 이 식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 조직절편을 각각 무균적으로 약 2∼5 mm의 크기의 절편을 만든 후 오옥신이 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체 배지에 배양하여, 배양절편으로부터 배발생 캘러스 및 체세포배를 반복적으로 유도한다. 이상의 방법에 의하여 유도된 체세포배를 발아시키고 나아가 잎, 줄기 뿌리가 건실한 어린 식물체를 토양에 순화시켜 생물공학적인 기술에 의한 산삼 묘목의 대량생산이 완성된다.
제 1항에서, 산삼의 잎, 줄기, 뿌리, 어린화서의 조직절편을 배양하여 캘러스 및 체세포배를 유도하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에서, 산삼의 잎, 줄기, 뿌리, 어린화서의 조직절편의 배양으로부터 유도된 체세포배를 지베렐린(0.1∼100μM)이 첨가된 배지에 이식하여 발아를 유도하고, 이를 1/4, 1/3, 1/2, 1/1 뮤라시게와 스쿠그 배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하여 잎, 줄기, 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체(유식물체)로 생장시킨다. 이 유식물의 잎, 줄기, 뿌리부위를 다시 배양하여 배발생 캘러스 및 체세포배를 유도하고, 이를 반복적으로 계속해서 뮤라시게와 스쿠그의 고체배지와 액체배지에 배양하여 체세포배를 유도하고, 나아가 식물체를 반복해서 토양순화할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에서, 유도된 자엽시기의 체세포배를 0.1∼100 μM 지베렐린을 처리하여 발아시키는 방법.
제 1항에서, 발아된 체세포배를 유식물체로 생장시키기 위하여, 1/4 또는 1/2 뮤라시게와 스쿠그 배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하여 잎, 줄기, 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체(유식물체)를 유도하는 것을 특징으로 함.
제1항에서, 이 방법이 산삼의 체세포배 유래 어린 유식물체를 모래, 버뮤클라이트(또는 피트) 및 토양이 1:1:1로 배합된 토양에 이식하여 약 2개월간 생육시켜 건실한 묘목으로 생장시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.