KR20020013487A

KR20020013487A - 성인 성상세포, 이의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR20020013487A
Application number: KR1020017008509A
Authority: KR
Inventors: 리데쟝-뤽; 말레자크
Original assignee: 추후제출; 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1999-01-05
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2002-02-20
Also published as: EP1141241B1; JP2003524391A; DE60039579D1; WO2000040699A3; EP1141241A2; HUP0105066A2; CA2355967A1; IL143382A0; AU2315100A; WO2000040699A2; US6943016B1; ATE402253T1; CN1340098A

Abstract

본 발명은 성인 성상세포의 본질적으로 순수한 제조물 및 이의 생산방법을 제공한다. 정제된 성상세포는 신경퇴행성 장애 또는 중추신경계의 외상 치료에 유용하다.

Description

성인 성상세포, 이의 제조방법 및 용도{HUMAN ADULT ASTROCYTES, THEIR PREPARATION AND USES THEREOF}

성상세포

세포 이식 및 유전자 전달 기술의 조합은 신경퇴행성 질환 및 외상성 상해의 치료학적 접근을 제공한다. 다수의 세포형, 예를 들면 선조세포, 뉴런, 신경교질세포, 섬유아세포 및 근원세포가 중추신경계(CNS)로의 유전자 전달을 위한 비히클로서 연구되어 왔다(Wolff et al., 1989; Horellou et al., 1990a,b; Fisher et al., 1991, 1993, Gage et al., 1995; Sabate et al., 1995; Fisher, 1997; Martinez-Serrano 및 Bjorklund, 1997). 유전공학 처리된 성상세포의 치료 활성에 특히 주목하여 왔다(Cunningham et al., 1991, 1994; La Gamma et al., 1993; Castillo et al., 1994; Pundt et al., 1995; Lundberg et al., 1996; Lin et al., 1997). 성상세포는 이들이 정상 CNS 성분이고, 효율적인 분비 메카니즘을 부여받았으며, 이들의 생존, 분화 및 재생을 촉진하는 영양인자의 배출을 통해 뉴런에 대한 지지체를제공하기 때문에 특히 뇌 치료를 목적으로 한다. 또한, 이들은 배양액에서 증식할 수 있고 외래 트랜스진을 발현하도록 유전공학 처리될 수 있다. 최근에, 합법적 낙태로부터의 태아 성상세포를 배양하여 활성 NGF의 발현을 유도하는 레트로바이러스로 성공적으로 형질도입하였다(Lin et al., 1997).

성인 성상세포는 인간의 뇌 치료를 위해 더욱 적절한데, 그 이유는 이들이 자지(自知)의 생체외 유전자 전달을 허용하여, 면역학적 거부반응과 면역억제인자의 부작용을 제거하기 때문이다. 성인 성상세포를 배양하고자 하는 최근의 연구에서, 소교세포에 의한 오염이 보고되었다(Yong et al., 1991, 1992).

유전자 요법

생체외 유전자 전달은 치료 세포의 환자로의 전달을 포함한다(Wolff et al., 1989; Horellou et al., 1990a,b; Fisher et al., 1991, 1993, Gage et al., 1995; Sabate et al., 1995; Fisher, 1997; Martinez-Serrano 및 Bjorklund, 1997; Taylor, 1997). 유전자 요법을 위한 불멸화 세포주의 사용은 이들이 종양발생성을 지니고 있기 때문에, 제한된 가치가 있다. 반대로, 1차 배양된 세포가 더 적당하다. 생체외 유전자 전달 및 후속 이식을 위한 최상의 세포형중 하나는 효율적인 분비 조직을 지니는 주요 지지 세포로서 CNS에 통상 존재하는 성상세포이다(La Gamma et al., 1993; Castillo et al., 1994; Cunningham et al., 1994; Ridoux et al., 1994; Pundt et al., 1995; Lundberg et al., 1996; Lin et al., 1997). 효소, 신경전달물질 또는 영양인자를 생성하도록 이미 변형된, 이식 성상세포는 CNS에서 적당하게 합체되고 기능을 수행할 수 있다(참조: Taylor,1997). 래트의 1차 배양된성상세포는 NGF 및 BDNF를 생성하도록 유전공학 처리되었고, 뇌에 이식한 후에도 생존하였다(Cunningham et al., 1991, 1994; Yoshimoto et al., 1995).

최근에, 인간 성상세포에 대한 관심이 커졌다(Yong et al., 1991, 1992; Aloisi et al., 1992; Perzelova and Mares, 1993; Pundt et al., 1995; Lin et al., 1997). Yong과 동료들은(1992) 1차 배양된 세포의 80% 이하가 마크로파지/소교세포였음을 보고하였다. 대부분의 핍지신경교질세포와 소교세포를 제거한 후에는, 세포의 70%가 성상세포였다(Yong et al., 1992). 성상세포 배양액에 소교세포의 존재는 시험관내 및 생체내 모두에서 목적하지 않는 효과를 초래할 수 있는데, 그 이유는 이들이 활발하게 증식하고 면역세포 모집단의 주성분이기 때문이다. 그러므로, 소교세포 오염이 안된 성상세포 모집단의 생성방법이 요구되고 있다. 본 발명은 하기에 설명된 바와 같이 이러한 요구를 다루고 있다. 본 발명은 성상세포의 불순한 제조방법의 단점을 극복하고, CNS의 외상 치료 및 파킨슨병, 헌팅톤병 또는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 장애의 치료를 위해 적당한 세포 제조물을 제공한다.

본원의 참조문헌 인용은 이러한 참조문헌이 본 출원의 "선행기술"로 이용가능함을 승인하는 것으로 이해되어서는 안된다.

발명의 요약

본 발명은 정제된 성상세포 및 이의 제조방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 성상세포는 성인 성상세포이다.

그러므로, 본 발명은: a) 성상세포 제조물을 배양 용기에 도입하고, b) 성상세포의 배양 용기로의 부착을 가능하게 하는 조건하에서 단계 a)로부터의 성상세포를 배양한 다음, c) 단계 a)의 개시 후 약 48시간에 배양 용기에 부착되지 않은 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단 생성방법을 제공한다. "본질적으로 순수한" 세포 모집단은 적어도 75%의 성상세포, 바람직하게는 적어도 85%의 성상세포, 더 바람직하게는 적어도 약 95%의 성상세포, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 성상세포이다. 용어 "약"은 주어진 수치 또는 범위의 20%내, 바람직하게는 10%내, 더 바람직하게는 5%내를 의미한다. "배양 용기"는 배양 디쉬 또는 플라스크를 포함하는(이에 한정되지 않는다) 세포 부착 및 성장을 위해 적당한 지지체일 수 있다.

바람직한 양태에서, 성상세포는 인간 성상세포이다. 더 바람직하게는, 이들은 성인 성상세포이다.

본 발명에 따라 생성된 성상세포는 본질적으로 소교세포가 부재한다. 즉, 소교세포의 존재는 OX42 면역염색하고Griffonia simplicifolia로부터의 B4 이소렉틴으로 표지함으로써 검출되지 않는다.

본 발명 방법의 일면에서, 외생성 핵산이 성상세포에 도입될 수 있다. 핵산은 칼슘-포스페이트 침전, 리포솜-매개 형질감염, 양이온 지질 형질감염 또는 리포폴리아민-매개 형질감염에 의해, 바이러스성 벡터로 성상세포에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 신경활성 물질을 암호화한다.

본 발명은 또한 본질적으로 순수한 성상세포 모집단을 제공한다. 바람직하게는, 성상세포는 인간 성상세포이다. 더 바람직하게는, 이들은 성인 성상세포이다.본 발명에 따라 생성된 성상세포 모집단은 소교세포가 본질적으로 부재한다.

본 발명의 일면에서, 성상세포의 모집단은 외생성 핵산을 포함한다. 바람직한 양태에서, 핵산은 신경활성 물질을 암호화한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일면에서, 핵산은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA이다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 성장인자, 신경영양인자 또는 효소일 수 있다. 이와 달리, 핵산은 안티센스-RNA 또는 리보자임을 암호화하는 DNA일 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산은 조절가능한 프로모터, 유도가능한 프로모터, 신경세포-특이적 프로모터 또는 바이러스성 프로모터를 포함하는 조절 영역에 작동적으로 연결되어 있다.

본 발명은 또한 본질적으로 순수한 성상세포의 모집단을 포함하는 이식편을 제공한다. 본 발명은 신경활성 물질을 암호화하는 외생성 핵산을 포함하는 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

이들 목적과 기타 목적은 첨부된 도면과 하기의 상세한 설명 및 실시예에 더욱 상세히 설명되어 있는, 본 발명에 의해 다뤄진다.

본 발명은 신경생물학 분야에 관한 것이다. 더 자세히 설명하면, 이는 정제된 성인 성상세포, 이의 제조방법 및 특히, 신경퇴행성 장애 또는 중추신경계의 외상을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

도 1: 성인 뇌 피질로부터의 1차 배양액.

(A), 성인 성상세포의 1차 배양액을 저배율(×70)로 보여주는 위상차 현미경사진. (B), 납작해진 세포의 분열 종기의 고배율(×560).

도 2: 성인 성상세포의 1차 배양액의 면역세포화학적 성상확인.

모든 세포가 GFAP-(A) 및 S100β-양성(B)임을 보여주는 저배율(×280) 현미경사진.

도 3: 성인 성상세포의 시험관내 증식

증식율은 t₀이후 세포수의 증가율%로 표시된다. 성인 성상세포는 FCS에서 배양될 때 시험관내에서 증식한다. 10% FCS에서보다 20% FCS의 존재하에 배양할 때 세포가 2배 더 신속하게 증식함을 주목한다(A). NGF 및 bFGF(50 ng/㎖)는 1차 배양된 성인 성상세포에 끼치는 유사분열물질 효과를 가지지 않는다(B). HS가 배지에 첨가될 때, 대부분의 세포는 배양 디쉬에 부착하지 않고 이들이 배지로부터 제거됨을 주목한다.

도 4: 성인 성상세포의 아데노바이러스 형질도입 후 TH 면역세포화학.

(B), 세포의 50-60%가 감염후 1주일에 TH-양성임을 보여주는 저배율(×70) 현미경사진(A, 비-감염 세포). (C), hTH를 함유하는 형질도입된 성상세포를 보여주는 고배율(×560).

도 5: 형질도입된 성인 성상세포의 TH 활성

TH 활성이 감염후 첫째주 안에 검출된 다음, 14일째에는 35650 pmol[³H]H₂O/mg prot./h까지 증가한다. TH 활성이 감염후 14일에 독시사이클린의 존재하에서는 적어도 10배 감소함을 주목한다.

정의

하기에 정의된 용어가 본 명세서 전반에 걸쳐서 사용되고, 본 발명의 범위및 실행을 이해하는 데 도움이 될 것이다.

"폴리펩타이드"는 공유결합된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체 화합물이다. 아미노산은 하기 화학식을 가진다:

화학식

아미노산은 측쇄 R을 기준으로 7 그룹으로 분류된다: (1) 지방족 측쇄, (2) 하이드록실(OH) 그룹을 함유하는 측쇄, (3) 황 원자를 함유하는 측쇄, (4) 산성 또는 아마이드 그룹을 함유하는 측쇄, (5) 염기성 그룹을 함유하는 측쇄, (6) 방향족 환을 함유하는 측쇄, 및 (7) 프롤린, 즉 측쇄가 아미노 그룹에 융합된 이미노산.

"단백질"은 살아 있는 세포에서 구조적 또는 기능적 역할을 하는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다.

폴리펩타이드 또는 단백질의"변종"은 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유도되고 폴리펩타이드 또는 단백질의 적어도 한 가지의 생물학적 성질을 가지는 유사체, 단편, 유도체 또는 돌연변이체이다. 폴리펩타이드 또는 단백질의 상이한 변종이 자연히 존재할 수 있다. 이러한 변종은 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 차이로 특징지워지는 대립형질의 변종일 수 있거나, 상이한 스플라이싱 또는 해독후 변형을 포함할 수 있다. 숙련인은 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 복위가 일어난 변종을 생성할 수 있다. 이러한 변종은 그중에서도 특히: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비-보존 아미노산으로 치환되는 변종, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩타이드 또는 단백질에 첨가되는 변종, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환체 그룹을 포함하는 변종, (d) 폴리펩타이드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같이 또다른 폴리펩타이드와 융합되는 변종을 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적 및 효소적 기술을 포함하는, 이러한 변종의 수득기술은 당분야의 숙련인에게 알려져 있다.

대안의 mRNA 스플라이싱 형태 및 대안의 해독후 변형 형태를 포함하는, 이러한 대립형질의 변이, 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 및 변형은 폴리펩타이드의 생물학적 성질을 가지는 폴리펩타이드의 유도체를 초래하고, 이들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

"핵산"은 공유결합된 뉴클레오타이드라고 불리는 서브유니트로 구성된 중합체 화합물이다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하고, 이들 둘 모두 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함한다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 센스 서열이라고 불린다.

"외생성 핵산"은 천연적으로 핵산 서열을 함유하지 않는 세포에 도입되는 유전물질이다.

"조절 영역"은 제 2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정 핵산의 발현을 자연히 수행하는 서열을 포함할 수 있거나(상동성 영역) 상이한 기원의 서열을 포함할 수 있다(상이한 단백질 또는 심지어 합성 단백질의 발현 수행). 특히, 서열은 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 서열 또는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 및 유도가능하거나 유도불가능한 방식으로 유전자의 전사를 촉진하거나 억제하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제의 기원, RNA 스플라이스 부위, 인핸서, 전사 종결 서열, 폴리펩타이드를 표적 세포의 분비 경로로 인도하는 시그널 서열 및 프로모터를 포함한다.

"이종원"으로부터의 조절 영역은 발현된 핵산과 본래 관련이 없는 조절 영역이다. 이종 조절 영역 중에서 상이한 종으로부터의 조절 영역, 상이한 유전자로부터의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열 및 자연적으로 발생하지는 않지만, 당분야의 숙련인에 의해 디자인되는 조절 서열이 포함된다.

"벡터"는 숙주 세포에 해당 핵산을 전달하기 위한 수단이다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 핵산을 세포에 도입하기 위한 바이러스성과 비바이러스성 수단을 모두 포함한다. 비-바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(시토펙틴), DNA-단백질 착체 및 바이오중합체를 포함한다. 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스, 폭스, 바큘로바이러스, 백시니아, 헤르페스 심플렉스, 엡스타인-바 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 핵산은 하나 이상의 조절 영역 및/또는 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현 기간 등)를 선별하고, 측정하며 모니터하는 데 유용한 선별가능한 마커를 함유할 수있다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 투여방법을 위해 약학적으로 허용가능하고, 멸균되었으며, 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 제형된 수성 또는 유성 현탁액일 수 있는 희석제 및 충진제를 포함한다. 특정의 약학적으로 허용가능한 담체 및 활성 화합물 대 담체의 비는 조성물의 용해도 및 화학적 성질, 특정 투여 모드 및 표준 약학적 실행에 의해 결정된다.

성상세포

본 발명의 일면은 본질적으로 순수한 인간 성상세포의 모집단 제공이다. 정제된 세포는 해당 산물을 암호화하는 도입된 유전 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 또다른 일면은 목적하는 치료학적 성질을 가지고, 생체외 세포 요법을 위해 적당한 성인 성상세포의 제공이다. 유전자 변형된 인간 세포의 래트 뇌로의 이식은 Sabate et al. (Nature Genetics, Volume 9, pp. 256-260(1995))에 기재되어 있고, 이의 내용 전체는 본원에 참조로 인용된다.

본 발명은 이제 생체외 유전자 요법을 위한 신경활성 물질과 같이 생물학적 효능을 지니는 인자를 생성할 수 있는, 고순도의 성인 성상세포를 수득하기 위한 매우 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명자는 본 발명에 이르러 이러한 세포의 성공적인 정제, 증폭 및 시험관내 변형을 가능하게 하는 조건을 발견하였다. 유전자 발현의 실질적인 수준은 재조합 아데노바이러스로 변형된 세포에서 얻어진다. 유전자 변형된 성상세포는 신경퇴행성 질환 및 CNS 외상의 유전자 요법을 가능하게 한다.

유전자 전달 기술과 세포 이식의 조합은 CNS에 치료 분자를 전달하기 위한 접근법을 제공한다. 성상세포는 이의 CNS 기원, 이의 효율적인 분비 메카니즘 및 뉴런 지지체로서의 이의 역할 때문에 CNS 치료를 위해 특히 매우 적당하다. 가장 중요한 것은, 생체외 유전자 전달을 위한 세포성 비히클로서 성인 성상세포의 사용이 자지의 이식을 가능하게 하여, 면역학적 거부반응 및 면역억제물질의 부작용을 제거하였다는 것이다. 본원에서 제공된 것처럼, 이러한 세포는 정제되고, 증식하여 시험관내에서 유전자 변형될 수 있다. 성인 뇌 피질로부터 유도된 성상세포는 적어도 10개월 동안 순수한 1차 배양액으로서 시험관내에서 성장하고 유지된다. 또한, 세포는 신경활성 물질을 암호화하는 바이러스성 벡터에 의해 효율적으로 형질도입된다. 신경활성 물질이 테트라사이클린-기본 조절 시스템(tet-off)의 네가티브 제어하에 있는 인간 티로신 하이드록실라제(hTH)이면, 감염된 세포는 다량의 활성 hTH를 합성하고 L-Dopa를 방출한다. 또한, 테트라사이클린의 강력한 유사체인 독시사이클린도 트랜스진 발현을 효율적으로 조절한다.

벡터

전술한 바와 같이, "벡터"는 본 발명에 따라 숙주 세포에 핵산을 전달하기 위한 수단이다. 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-수반 바이러스와 같은 바이러스성 벡터이다. 따라서, 해당 핵산을 포함하는 유전자가 바이러스성 벡터를 사용하여 또는 DNA의 직접 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입된다. 표적 조직에서의 발현은 예를 들면, 바이러스성 벡터 또는 수용체 리간드로 트랜스제닉 벡터가 특이적 세포를 표적화함으로써 또는 조직-특이적 프로모터를 사용함으로써 또는 두가지 방법 모두에 의해 실행될 수 있다.

생체내 또는 생체외 표적화 및 치료 과정에 통상적으로 사용되는 바이러스성 벡터는 DNA-기본 벡터 및 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스성 벡터의 작제방법 및 사용방법은 당분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)]. 바람직하게는, 바이러스성 벡터는 복제 결손, 즉 이들은 표적 세포에서 자가복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 복제 결손 바이러스성 벡터의 게놈은 감염된 세포에서 바이러스의 복제를 위해 필요한 적어도 하나의 영역이 결실되었다. 이러한 영역은 제거되었거나(전체적으로 또는 부분적으로), 당분야의 숙련인에게 공지된 기술에 의해 비-기능성이 될 수 있다. 이러한 기술은 전체 제거, 치환(다른 서열, 특히 삽입된 핵산에 의해), 부분 결실 또는 하나 이상의 염기의 필수(복제용) 영역으로의 첨가를 포함한다. 이러한 기술은 유전자 조작 기술을 사용하거나 돌연변이 유발제 처리에 의해, 시험관내(분리된 DNA 상에서) 또는 현장에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 복제 결손 바이러스는 바이러스 입자를 캡시드화하기 위해 필요한 이의 게놈 서열을 보유하고 있다.

DNA 바이러스성 벡터는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스 등(이에 한정되지 않는다)과 같은 약독화 또는 결손 DNA 바이러스를 포함한다. 바이러스 유전자 전체가 또는 거의 전체가 결실된 결손 바이러스가바람직하다. 결손 바이러스는 세포로의 도입 후에 복제할 능력이 없어서, 생산성 바이러스 감염을 유도하지 않는다. 결손 바이러스성 벡터의 사용은 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있음을 상관하지 않고, 특이적인 국부 영역에서 세포로의 투여를 허용한다. 따라서, 특이적 조직이 특이적으로 표적화될 수 있다. 특정 벡터의 예는 결손 헤르페스 바이러스 1(HSV 1) 벡터[Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], 당단백질 L 유전자가 결실된 결손 헤르페스 바이러스 벡터[특허 공개 RD 371005A] 또는 기타 결손 헤르페스 바이러스 벡터[1994년 9월 29일자로 공개된 국제 특허 공개 제WO94/21807호; 1994년 4월 2일자로 공개된 국제 특허 공개 제WO92/05263호]; Stratford-Perricaudet et al[J, Clin. Invest. 90:626-630 (1992); 또한 La Salle et al., Science 259:988-990 (1993) 참조]에 의해 설명된 벡터와 같은 약독화 아데노바이러스 벡터; 및 결손 아데노-수반 바이러스 벡터[Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)]를 포함하고, 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 생체내 투여를 위해, 적당한 면역억제 처리가 바이러스성 벡터, 예를 들면 아데노바이러스 벡터와 함께 이용되어, 바이러스성 벡터와 형질감염된 세포의 면역불활성화를 회피한다. 예를 들면, 인터루킨-12(IL-12), 인터페론-γ(IFN-γ) 또는 안티-CD4 항체와 같은 면역억제 시토킨이 바이러스성 벡터에 대한 체액성 또는 세포성 면역반응을 막기 위해 투여될 수 있다[참조: 예를 들면, Wilson, Nature Medicine (1995)]. 또한, 항원 최소 수를 발현하도록 공학처리된 바이러스성 벡터를 이용하는 것이 유리하다.

물론, 본 발명은 유전자 요법 적용을 위해 벡터의 해당 유전자의 치료 유효량을 발현할 성상세포로의 전달을 포함한다. 구 "치료 유효량"은 숙주의 활성, 기능 및 반응의 임상적으로 상당한 결실을 적어도 약 15%, 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 90% 감소시키고, 가장 바람직하게는 이를 방지하는 충분량을 의미하도록 본원에서 사용된다. 이와 달리, 치료 유효량은 숙주에서 임상적으로 중요한 증상의 개선을 초래하기에 충분하다.

본 발명의 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 담체로 성상세포에 생체외 도입될 것이다. 구 "약학적으로 허용가능한"은 인간에게 투여되었을 때, 생리학적으로 내성이고 위 장애, 현기증 등과 같은 알레르기성 반응 또는 유사한 부적당한 반응을 통상적으로 일으키지 않는 분자 및 조성물을 언급한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 것처럼, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 특히 인간에게 사용하기 위해 연방정부 또는 주정부의 관리기관에 의해 승인되었거나 U.S. 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에 일람되었음을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 이러한 약학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는(예, 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 호마유 등) 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 물 또는 식염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 바람직하게는 담체로, 특히 주사액으로 이용된다. 적당한 약학적 담체는 E.W. Martin에 의해 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 설명되어 있다.

아데노바이러스 벡터

바람직한 양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 다양한 세포형에 효율적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵의 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스의 다양한 혈청형이 존재한다. 이러한 혈청형 중에서, 인간 아데노바이러스 2형 또는 5형(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용하는 것이 본 발명의 범위 내에서 바람직하다(참조, WO94/26914). 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새 및 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다(예를 들면, Manhattan 또는 A26/61 계통(ATCC VR-800)).

바람직하게는, 본 발명의 복제 결손 아데노바이러스 벡터는 ITR, 캡시드화 서열 및 해당 핵산을 포함한다. 더 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역은 비-기능성이다. E1 영역의 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스의 서열에서 뉴클레오타이드 455에서 3329로(PvuⅡ-BglⅡ 단편) 또는 382에서 3446으로(HinfⅡ-Sau3A 단편) 연장한다. 다른 영역, 특히 E3 영역(WO95/02697), E2 영역(WO94/28938), E4 영역(WO94/28152, WO94/12649 및 WO95/02697) 또는 후기 유전자 L1-L5 어디에서도 변형될 수 있다.

바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역이 결실되었다(Ad 1.0). E1-결실 아데노바이러스의 예는 본원에 참조로 인용되는, EP 185,573에 기재되어있다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E4 영역이 결실되었다(Ad 3.0). E1/E4-결실 아데노바이러스의 예는 본원에 참조로 인용되는, WO95/02697 및 WO96/22378에 기재되어 있다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E4 영역과 핵산 서열이 삽입되는 E1 영역이 결실되었다(참조: 본원에 참조로 인용되는 FR94 13355).

본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당분야의 숙련인에게 공지된 기술로 제조될 수 있다(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). 특히, 이들은 그중에서도 특히, 해당 DNA 서열을 운반하는 아데노바이러스와 플라스미드 사이의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상동 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드의 적당한 세포주로의 동시형질감염으로 실행된다. 이용되는 세포주는 바람직하게는 (ⅰ) 요소에 의해 형질전환될 수 있고, (ⅱ) 복제 결손 아데노바이러스의 게놈 일부를, 바람직하게는 재조합의 위험을 회피하기 위해 합체형으로 보완할 수 있는 서열을 함유해야 한다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 게놈으로 합체된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분(12%)을 함유하는 태아의 신장 세포주 293(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) 및 출원 WO94/26914 및 WO95/02697에 설명된 것처럼 E1 및 E4 기능을 보완할 수 있는 세포주이다. 재조합 아데노바이러스는 당분야의 숙련인에게 익히 공지된, 표준 분자생물학 기술을 사용하여 회수되고 정제된다.

아데노-수반 바이러스 벡터

아데노-수반 바이러스(AAV)는 안정하고 부위-특이적 방식으로, 이들이 감염시키는 세포의 게놈으로 합체될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 끼치는 영향을 유도하지 않으면서, 넓은 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있고, 이들이 인간 병리학과 관련있다고는 생각되지 않는다. AAV 게놈이 클로닝되고, 서열분석되며, 특징규명되었다. 이는 대략 4700개의 염기를 포함하고 바이러스를 위한 복제 기원으로 소용되는, 각 말단에 대략 145개 염기의 역전된 말단 반복(ITR) 영역을 함유한다. 나머지 게놈은 캡시드화 기능을 수행하는 두 필수 영역으로 분리되는데: 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측 부분: 및 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측 부분.

시험관내 및 생체내 유전자 전달을 위한 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 설명되었다(참조: WO91/18088: WO93/09239: US4,797,368, US5,139,941, EP488 528). 이들 공보물은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자로 대체된 다양한 AAV-유도 작제물 및 시험관내(배양된 세포로) 또는 생체내(유기체로 직접)에서 해당 유전자를 전달하기 위한 이러한 작제물의 사용을 설명하고 있다. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 AAV는 두 AAV 역전된 말단 반복(ITR) 영역에 의해 플랭킹된 해당 핵산 서열을 함유하는 플라스미드와 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 인간 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스)로 감염된 세포주로 운반하는 플라스미드를 동시형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 생성된 AAV 재조합물은 이어서 표준 기술에 의해 정제된다.

따라서, 본 발명은 또한 게놈이 AAV ITR에 의해 플랭킹된 해당 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 AAV-유도 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 AAV로부터의 두 ITR에 의해 플랭킹된 항-맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 플라스미드는 적당하고, 리포솜 벡터(수도(pseudo) 바이러스)로 도입된 플라스미드로 핵산 서열을 전달하기 위해 그대로 사용될 수 있다.

레트로바이러스 벡터

또다른 양태에서 유전자는 예를 들면, Anderson et al., U.S. 특허 제5,399,346호; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., U.S. 특허 제4,650,764호; Temin et al., U.S. 특허 제4,980,289호; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., U.S. 특허 제5,124,263호; EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; 1995년 3월 16일자로 Dougherty et al.,에 의해 공개된 국제 특허 공개 제WO95/07358호; 및 Kuo et al., 1993, Blood 82:845에 설명되어 있는 것처럼 레트로바이러스 벡터에 도입될 수 있다. 레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 합체형 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 두 LTR, 캡시드화 서열 및 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전체적으로 또는 부분적으로 결실되고, 이종의 해당 핵산 서열로 대체된다. 이러한 벡터는 HIV, MoMuLV("쥐 몰로니 백혈병 바이러스"), MSV("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV("라우스 육종 바이러스") 및 프렌드 바이러스와 같은 상이한유형의 레트로바이러스로부터 작제될 수 있다. 결손 레트로바이러스 벡터는 WO95/02697에 기재되어 있다.

일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드가 작제된다. 이 작제물은 세포주가 플라스미드에서는 결실된 레트로바이러스 기능을 트랜스 상태로 제공할 수 있는, 팩키징 세포주를 형질감염시키는 데 사용된다. 일반적으로, 팩키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 이렇게 발현할 수 있다. 이러한 팩키징 세포주, 특히 세포주 PA317(US4,861,719); PsiCRIP 세포주(WO90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주(WO89/07150)은 선행기술에 설명되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 전사 활성을 억제하기 위한 LTR 내에서의 변형 및 gag 유전자의 일부를 포함할 수 있는 광범위한 캡시드화 서열을 함유할 수 있다(Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). 재조합 레트로바이러스 벡터는 당분야의 숙련인에게 공지된 표준 기술로 정제된다.

레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로 기능하거나 단일 형질감염을 진행하도록 작제될 수 있다. 전자의 경우에, 바이러스는 종양원성 형질전환 성질의 원인인 것들을 제외하고는 모든 유전자를 보유하고, 이종 유전자를 발현하도록 변형된다. 비-감염 바이러스성 벡터는 바이러스 팩키징 시그널을 파괴하도록 제조되지만, 이종 유전자 및 팩키징 시그널을 함유하도록 공학처리된 동시도입된 바이러스를 팩키징하기 위해 필요한 구조 유전자를 보유한다. 따라서, 생성된 바이러스 입자는 부가의 바이러스를 생성할 수 없다.

표적화 유전자 전달은 1995년 10월에 공개된 국제 특허 공개 WO95/28494에 설명되어 있다.

비-바이러스성 벡터

이와 달리, 벡터는 리포펙틴에 의해 성상세포에 도입될 수 있다. 과거 수십년간, 시험관내에서 핵산의 캡시드화 및 형질감염을 위한 리포솜의 사용이 증가해왔다. 리포솜 매개된 형질감염과 관련있는 어려움과 위험을 제한하도록 디자인된 합성 양이온 지질이 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포솜을 제조하는 데 사용될 수 있다[Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417(1987); 참조, Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)]. 양이온 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캡시드화를 촉진할 수 있고, 또한 음으로 하전된 세포막과의 융합을 촉진한다[Felgner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. 핵산의 전달을 위해 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물은 국제 특허 공개 WO95/18863과 WO96/17823 및 U.S. 특허 제5,459,127호에 설명되어 있다. 외생성 유전자를 특이적 세포에 생체외 도입하기 위한 리포펙틴의 사용은 특히 실용적인 장점을 가진다. 리포솜의 특이적 세포에 대한 분자 표적화는 이점 한 분야를 나타낸다. 지질은 표적화를 목적으로 다른 분자와 화학적으로 커플링될 수 있다[참조: 상기의 Mackey, et al.,]. 표적화 펩타이드, 예를 들면 호르몬 또는 신경전달물질 및 항체와 같은 단백질 또는 비-펩타이드 분자가 리포솜과 화학적으로 커플링될 수 있다.

다른 분자 또한 양이온 올리고펩타이드(예를 들면, 국제 특허 공개 WO95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유도된 펩타이드(예를 들면, 국제 특허 공개 WO96/25508) 또는 양이온 중합체(예를 들면, 국제 특허 공개 WO95/21931)와 같은 핵산의 형질감염을 촉진하는 데 유용하다.

네이키드 DNA 플라스미드로서 벡터를 도입하는 것도 가능하다. 유전자 요법을 위한 네이키드 DNA 벡터는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염, 전기투공, 현미주사법, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 유전자 건의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용으로 목적하는 숙주 세포에 도입될 수 있다[참조: 예를 들면, Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., 1990년 3월 15일자로 출원된 캐나다 특허 출원 제2,012,311호; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. 수용체-매개 DNA 전달 접근법 또한 청구될 수 있다[Curiel et al., Hum. Gene Ther, 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)].

핵산

성상세포의 유전자 변형 및 이식은 도입된 유전물질에 따라, 다양한 적용에서 이들을 사용할 수 있다.

Lac Z 유전자와 같은 리포터 유전자는 신경 발명 분야에서 과학적으로 중요한 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있다. 특히, 기원과는 독립적으로 뇌의 다양한 지역으로부터 외식된 선조세포의 생존 및 분화능은 자라고 있거나 다 자란 뇌의 다양한 지역에 이식한 후에 이들을 하기와 같이 연구할 수 있다.

치료 유전자를 포함하는 핵산이 특정 관심사이다. 이러한 유전자는 신경활성 물질; 중추신경계의 세포 상에서 이로운 효능을 발휘할 수 있는 물질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 이는 과량의 내생성 물질을 감소시키는 데서 또는 이의 결손을 보충할 수 있는 물질일 수 있다. 이와 달리, 세포에 신규 성질을 수여하는 물질일 수 있다.

신경활성 물질은 안티센스 서열, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 본 발명의 실행에 적당한 폴리펩타이드 및 단백질은 성장인자, 신경영양인자, 시토킨, 신경전달물질, 효소, 신경전달물질 수용체 및 호르몬 수용체이다.

바람직하게는, 성장인자는 콜로니 자극 인자(G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF 등), 내피세포 성장인자(ECGF, FGF1), 섬유아세포 성장인자(aFGFa, bFGF) 또는 맥관세포 성장인자(VEGF)이다. 신경영양인자 중에서, 바람직한 인자는 섬모 신경영양인자(CNTF), 신경교질세포 성숙인자(GMFa, b), GDNF, BDNF, NT-3, NT-5 등이다. NT-3을 암호화하는 완전한 뉴클레오타이드 서열은 본원에 참조로 인용되는, WO91/03569에 기재되어 있다.

바람직한 시토킨은 인터루킨 및 인터페론이다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 효소는 신경전달물질의 생합성을 위한 효소(티로신 하이드록실라제, 아세틸콜린 트랜스퍼라제, 글루탐산 데카복실라제) 및 리소좀 효소(헥소사미니다제, 아릴설파타제, 글루코세레브로시다제, HGPRT)이다. 유리 라디칼의 해독에 관여하는 효소(과산화물 분자변위보효소 Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제)가 바람직하다. 수용체는 안드로겐 수용체를 포함한다(케네디병과 관련).

이러한 단백질은 천연 형태로, 또는 이의 변종 또는 단편 형태로 사용될 수 있다.

신경활성 물질은 또한 안티센스 서열일 수 있다. 안티센스 핵산을 사용하는 유전자 발현의 다운 조절은 해독 또는 전사 단계에서 달성될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 바람직하게는 내생성 신경활성 물질을 암호화하는 핵산 또는 상응하는 메신저 RNA와 특이적으로 하이브리드화될 수 있는 핵산 단편이다. 이러한 안티센스 핵산은 안정성 및 선택성을 증가시키기 위해 임의로 변형된, 합성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이들은 또한 세포내 발현이 내생성 신경활성 물질을 암호화하는 mRNA의 전체 또는 부분에 상보적인 RNA를 생산하는 DNA 서열일 수 있다. 안티센스 핵산은 EP 140308에 설명된 것처럼, 반대 배향으로 내생성 신경활성 물질을 암호화하는 핵산 전체 또는 부분의 발현에 의해 제조될 수 있다. 안티센스 서열의 임의의 길이는 내생성 신경활성 물질의 발현을 다운-조절 또는 방해할 수 있다면 본 발명의 실행에 적당하다. 바람직하게는, 안티센스 서열은 적어도 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 안티센스 핵산, 암호화 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA의 제조 및 사용과 올리고 및 유전적 안티센스의 사용은 본원에 참조로 인용되는, WO92/15680에 기재되어 있다.

핵산은 천연 또는 인공 기원의 것일 수 있다. 특히 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 이는 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등의 것일 수 있다. 이는 당분야의 숙련인에게 공지된 기술, 특히 라이브러리 스크리닝, 화학적 합성 또는 이와 달리 스크리닝 라이브러리에 의해 수득되는 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합된 방법에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는 이는 cDNA 또는 gDNA이다.

더 바람직한 치료 산물은 파킨슨병의 경우에 도파민 작용성 뉴런의 생존을 촉진하는 티로신 하이드록실라제(TH)를 암호화하는 cDNA 또는 BDNF(뇌 유도된 신경영양인자)와 같은 신경영양 인자를 포함한다.

유사하게, 알츠하이머병의 경우에, 콜린 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 cDNA 및/또는 NGF(신경 성장인자)는 콜린 작용성 뉴런의 퇴행을 방지할 수 있다.

최근의 발견은 BDNF 및 GDNF와 같은 신경영양인자가 도파민 작용성 세포의 영양인자일 수 있음을 설명한다. 신경영양인자를 암호화하는 유전 물질의 성상세포로의 도입은 이식 생존율을 증가시킨다고 생각된다.

치료 유전자를 암호화하는 다수의 아데노바이러스 벡터가 본 발명에 이르러 작제되었다. 예를 들면, 티로신 하이드록실라제(TH)를 암호화하는 아데노바이러스가 작제되었다. 본 발명에 따른 시험관내 감염된 성상세포의 이식은 뇌에서 TH의 치료량을 전달하기 위한 매우 효율적인 방법을 구성한다. 치료 유전자를 암호화하는 다른 아데노바이러스-유도 벡터는 Ad-aFGF, Ad-bFGF, Ad-GDNF, Ad-GAD를 포함한다.

해당 유전 물질은 또한 안티센스-RNA 또는 리보자임 또는 안티센스-RNA 또는 리보자임을 암호화하는 DNA 분자일 수 있다. 이러한 산물은 β-아밀로이드 전구체, TAU 단백질 등과 같은 독성 단백질의 생성을 억제하기 위한 특정 관심사이다.

바람직하게는, 유전 물질은 해당 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA이다. 전술한 바와 같이, 단백질 또는 펩타이드는 바람직하게는 성장인자(즉, 시토킨), 신경영양인자, 효소 또는 신경전달물질과 같은 신경활성 물질이다.

다른 양태에서, 유전 물질은 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호화하는 DNA이다.

조절 영역

일반적으로, 본 발명의 핵산은 하나 이상의 조절 영역과 연결되어 있다. 영역은 조절가능하거나 유도가능한 프로모터; 뉴런 세포-특이적 프로모터 또는 바이러스성 프로모터를 포함할 수 있다. 적당한 조절 영역(들)의 선택은 당분야의 숙련인에게 일상적이다.

조절 영역은 성상세포에서 기능성 전사를 위한 프로모터 영역 및 해당 유전자의 3'에 위치하는 영역을 포함할 수 있고, 전사의 종결을 위한 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 특화한다. 모든 이러한 요소는 발현 카세트를 구성한다.

본 발명에 사용될 수 있는 프로모터는 구성 프로모터 및 조절된(유도가능한) 프로모터를 모두 포함한다. 프로모터는 본래 핵산의 발현을 초래한다. 이는 또한 이종원으로부터 공급될 수 있다. 특히, 이는 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 감염시키기를 목적으로 하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 마찬가지로, 사용된 아데노바이러스를 포함하는, 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 측면에서, 예를 들면 아데노바이러스 E1A 또는 주요 후기 프로모터(MLP), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터가 언급될 수 있다.

또한, 프로모터는 조직-특이적 또는 우세한 발현을 허용하는 활성화 또는 조절 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다(에놀효소 및 GFAP 프로모터 등). 더욱이, 핵산이 프로모터 서열을 함유하지 않으면, 이는 이러한 서열의 바이러스 게놈 하류와 같은 곳에 삽입될 수 있다.

본 발명의 실행을 위해 유용한 일부 프로모터는 편재하는 프로모터(예를 들면, HPRT, 비멘틴, 액틴, 튜불린), 중간체 필라멘트 프로모터(예를 들면, 데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP), 치료 유전자 프로모터(예를 들면, MDR형, CFTR, 인자 Ⅷ), 조직-특이적 프로모터(예를 들면, 평활근 세포의 액틴 프로모터), 분열하는 세포에서 우선적으로 활성화되는 프로모터, 자극에 반응하는 프로모터(예를 들면, 스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체), 테트라사이클린-조절된 전사 조절자, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기, 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오닌, SV-40, E1a 및 MLP 프로모터이다. 테트라사이클린-조절되는 전사 조절자 및 CMV 프로모터는 본원에 참조로 인용되는, WO96/01313, US 5,168,062 및 5,385,839에 설명되어 있다.

약학적 투여

본 발명은 성인 성상세포의 정제와 증폭 및 고효율로 유전자의 시험관내 성공적인 전달을 위한 이의 사용을 가능하게 한다. 이어서 이러한 세포는 수용 유기체의 CNS에 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 CNS의 외상 및 신경퇴행성 장애의치료와 같은 중요한 임상적 및 과학적 적용을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 전달되는 치료 유전자 및 치료할 장애에 따라, 뇌 안의 부위와 같이, CNS의 특정 영역을 정확하게 표적화할 수 있다. 따라서, 치료할 손상 부위에 따라서, 예를 들면, 선조체, 해마 또는 흑질을 포함하는 뇌의 부위로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 선조체에 이식된다.

본 발명에 따라서, 이식을 위한 성상세포의 전달은, 스테레오택틱 주입에 의해 본 발명에 이르러 가능해졌다. 투입을 위한 등가물의 결정은 치료할 장애를 기준으로 하고, 숙련인에 의해 결정될 것이다. 주입(들) 부위, 주입 횟수 및 스케쥴과 특정 투여량(들)을 포함한 실제 치료법 또한 숙련인에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 부위에 이식된 세포의 수는 1 ×10³내지 1 ×10¹⁰, 바람직하게는 1 ×10⁵내지 1 ×10⁹, 더 바람직하게는 1 ×10⁶내지 1 ×10⁸일 것이다.

또한 본 발명의 목적은 전술한 바와 같은 성상세포를 포함하는 이식편을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이식편은 세포의 생존 및 생체내 증식과 분화를 증가시키는 비-세포성 물질을 함유한다. 이식편은 예를 들면, 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 렉틴, 뼈와 같은 생체-상용성 지지체 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 섬유 등을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 치료 산물을 암호화하는 도입된 유전 물질을 함유하는 수용자의 유전자-변형된 인간 성상세포의 뇌로의 이식을 포함하는 수용자의 CNS에 치료 산물의 전달방법에 관한 것이다.

본 발명은 치료 유전자의 안정하고, 비독성인 장기간의 생체내 발현을 제공한다. 본 발명은 신경병, 발작, 척수 손상, 근위축성측색경화증, 헌팅톤무도병, 알츠하이머병 및 파킨슨병, 뇌성마비, 간질, 리소좀 질환(예를 들면, 테이병 및 샌드호프병, 변색성 가족성뇌중엽경화증, 고셰병, 뮤코다당류증, Lesh Nyhan 등) 및 뇌종양과 같은 신경퇴행성 장애의 치료에서 특정 관심사이다.

본 발명은 본 발명의 예시로서 제공되는, 하기의 비-제한 실시예를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다.

본 발명은 설명적이고 비제한적이라고 이해되어야 하는 하기 실시예의 도움으로 더욱 상세히 설명될 것이다. 실시예 1은 성인 성상세포의 장기간의 순수한 1차 배양액의 회수를 가능하게 하는 세포 배양 프로토콜을 설명하고 있다. 실시예 2는 이러한 세포가 테트라사이클린-기본(tet-off) 조절 시스템의 제어하에 인간 티로신 하이드록실라제(TH)를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 사용함으로써 유전자 변형될 수 있음을 나타낸다(Gossen and Bujard, 1992). TH는 티로신을 L-Dopa로 전환시킴에 의한, 카테콜라민의 합성을 위한 속도 제한 효소이다. 여러 연구가 파킨슨병의 동물 모델에서 이의 치료적 잠재력을 보여주었다(Wolff et al., 1989; Horellou et al., 1990a,b; Fisher et al., 1991). 감염된 세포는 테트라사이클린의 강력한 유사체인 독시사이클린의 부재하에 다량의 활성 hTH를 생성한다.

일반 분자생물학

본 발명에 따라서, 당분야의 기술 내에서 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.참조: 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (본원에서 "Sambrook et al., 1989");DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes Ⅰand Ⅱ(D.N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];Transcription And Translation[B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)];Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)];Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press, (1986)]; B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al. (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

실시예 1: 1차 배양된 성인 성상세포의 외식 및 특징규명

1.1 세포 배양

성인 조직을 병원의 방침에 따라 환자의 동의하에, 외과 절제술을 받은 환자(평균 연령 51.5 ±16.8세)의 뇌 피질로부터 분리한다. 수술 직후에, 조직을 기계적으로 해리하여 D-글루코스(3.15 g/ℓ), HEPES(3.57 g/ℓ), 나트륨 비카보네이트(1.2 g/ℓ)를 함유하고, 10% 태 송아지 혈청(FCS, 혈청화), 2 mM 글루타민(Gibco), 항생물질(페니실린/스트렙토마이신 혼합물, 100 ㎍/㎖, Gibco) 및 펑가이존(Gibco)이 보충된 DMEM/F12(Sigma, pH 7.4)에서 원심분리한다. 펠렛을 동일한 배지에 재현탁하고 5 cm 배양 플라스크(Costar)에 플레이팅한다. 배양액을10% CO₂를 함유하는 가습 대기, 37℃에서 유지한다. 48시간 후에, 배지를 교환한다. 이러한 1차 배양액을 이후 1주일에 한번씩 배지를 교환하여 유지한다.

냉동/해동 과정으로, 융합성 세포를 0.25% 트립신 및 0.2% EDTA(Gibco)로 수확하고 식염수로 완충된 포스페이트(PBS, 0.1 M, pH 7.4)로 신속하게 세척하여 배지-함유 혈청을 제거한다. 이어서 세포를 -20℃에서 1차 냉동시키고 10% 디메틸설폭사이드(DMSO, Sigma)가 보충된 DMEM/F12에서, -80℃에서 최종적으로 저장한다. 세포를 40℃에서 2-4분간 수조에 바이얼을 둠으로써 해동시키고, Costa 배양 플라스크에 재플레이팅한다. 48시간 후에, 배지를 교체하여 DMSO를 제거한다.

1.2 세포 증식 평가

두가지 상이한 방법이 사용된다: 2 mm²으로 예정된 지역에서 위상차하에 직접 계수 및 이중 면역형광 프로토콜로 나타나는 GFAP-브로모데옥시우리딘 표지(BrdU, 복제 DNA로만 도입되는 티미딘의 유사체). 1차 배양된 세포를 DMEM/F12내 그리드(2 mm²)를 지니는 NUNC^TM페트리 디쉬(60 ×15 mm)에 플레이팅한다.

증식 속도는 다양한 배양 조건하에서 측정된다: (a) FCS 없이, (b) 10% FCS 하에, (b) 20% FCS하에, (c) 10% FCS 및 5% 호스 혈청(HS), (d) 10% FCS 및 10% HS, (e) NGF(50 ng/㎖, Sigma), (f) bFGF(50 ng/㎖, Boehringer-Mannheim). 증식 실험을 위해, 배지는 1주에 두번 교체한다. 모든 배양액을 80시간 동안 매 10시간마다 계수한다. 사용된 NGF 및 bFGF의 활성은 생물학적 정량으로 확인된다: NGF(50 ng/㎖)에 노출된 PC12 세포(10% HS 및 5% FCS가 보충된 RPMI에서 폴리오르니틴-코팅된 디쉬 상에서 배양)의 축색 연장 및 bFGF(DMEM/HAMF 12내 10 ng/㎖)의 존재하에 신경상피 선조세포의 분화(참조: Sabate et al., 1995).

BrdU 도입 실험을 위해, BrdU가 플레이팅후 2일에 1차 배양액에 첨가된다. 배양액을 4일간 5 또는 10 μM BrdU의 존재하에 배양한다. BrdU 처리는 증식 대조로서 3T3 및 293 세포에서 동시에 수행된다. 포지티브 세포는 하기에 언급한 것처럼, 면역세포화학에 의해 검출된다.

1.3 면역세포화학적 과정

1차 배양액내 세포를 PBS에서 신속하게 세정하고, 고정액(PBS 중의 4% 파라포름알데하이드)에서 10분간 실온에서 배양한다. PBS에서 세정한 후에, 세포를 블로킹액(PBS 중의 10% 염소 혈청 및 0.2% 트리톤 X-100)으로 실온에서 30분간 처리한 다음, PBS 중의 5% 염소 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 1차 복합클론 항체(GFAP, Dakopatts, 1:100; S100, Sigma, 1:100으로 희석; TH, Inst. J. Boy, 1:200으로 희석; BrdU, Jackson, 1:50; OX42, Cedarlane, 1:200)와 배양한다.

BrdU 면역검출을 위해, 세포를 실온에서 20분간 2 N HCl에서 1차 변성시킨다. 0.1 N 나트륨 보레이트에서 10분간 중화한 후에, 샘플을 PBS에서 세정하고 GFAP 면역세포화학에 대해 설명한 것처럼 공학처리한다.

1.4 배양된 성상세포의 특징규명

CNS로의 자지 이식을 위한 성인 성상세포의 잠재력을 평가하기 위해, 이러한 세포가 1차 배양액으로 유지될 수 있는지를 먼저 시험할 필요가 있다. 이전의 연구는 성인 성상세포의 1차 배양엑에 소교세포가 풍부한 것으로 보고하였다(Yong etal., 1991, 1992). 배지의 조성 및 조직 절단, 해리 및 세포 시딩 사이의 시간은 배양 과정을 최적화하도록 다양하여 성상세포-풍부한 제조물을 수득한다. 혈청이 보충된 DMEM이 설치류의 성상신경교질 배양액의 적당한 배양 배지이다. 태 송아지 혈청(FCS)과 HAM/F12 영양물이 보충된 풍부한 DMEM이 성상세포 배양액을 위해 사용된다. 해리 및 시딩 후에 배양 디쉬에 가장 먼저 부착한 세포는 성상세포이다. 비부착 및/또는 사멸한 세포 및 세포 파편을 함유하는 배지의 1차 교체까지 다양한 지체기(24-120시간)가 시험되었다. 48시간(2일) 지체가 본질적으로 순수한 성상신경교질 배양액을 수득하기 위해 최적이다. 놀랍게도, 소교세포는 이러한 조건하에서 배양 디쉬에 부착하지 않는다.

10% FCS가 보충된 DMEM/F12에서 2일 후에, 세포는 배양 디쉬에서 납작하게 된다. 세포 형태는 배양액 융합에 따라 좌우되지만, 대부분의 세포는 납작한 다각형 형태를 보인다(도 1A-B). 납작해진 세포는 GFAP, 주요 신경교질필라멘트 단백질 및 S100β, 세포질 칼슘-결합 단백질을 포함하는 성상신경교질 마커의 면역검출에 의해 동정된다(도 2). 사실상 모든 1차 배양된 세포는 GFAP-(도 2A) 및 S100β-(도 2B) 양성이다. 배양액내 소교세포의 존재는 OX42 면역염색하고 소교세포에 대해 특이적인 마커로 사용되는,Griffonia simplicifolia로부터의 B4 이소렉틴으로 표지함으로써 시험된다(Streit, 1990). 염색이 관찰되지 않았는데, 이는 소교세포가 본질적으로 부재하는 성상세포의 배양액 존재를 확인해준다. 이러한 결과를 종합하면 본 발명은 성인 성상세포의 본질적으로 순수한 배양액을 제공함을 보여준다. 배양액의 현미경 관찰은 다수의 GFAP-양성 세포가 유사분열 중임을 나타낸다(도 1B).

1.4.1 성인 성상세포의 시험관내 증식

예비 관찰은 FCS 없이는, 배양된 세포가 전혀 또는 거의 분열하지 않고, 반면 유사분열 프로파일은 종종 10% FCS가 DMEMF12 배지에 첨가되면 관찰된다. GFAP 및 BrdU의 이중 면역형광 표지는 분열하는 세포가 성상세포임을 나타낸다. 1차 배양된 성인 성상세포가 다양한 배양 조건에서 증식하는 능력이 분석된다. 영양인자 NGF 및 bFGF와 다양한 종의 혈청을 포함하는 가용성 분자가 배양된 설치류 및 태아의 성상세포 상에서 유사분열물질의 성질을 가진다(참조: Yong et al., 1991, 1992 및 Stachowiak et al., 1997). 세포 증식할 때 FCS, HS, bFGF 및 NGF를 포함하는 다양한 배합물의 효과가 시험된다: 0, 10 및 20% FCS, 5 또는 10% HS가 보충된 10% FCS, bFGF 50 ng/㎖가 보충된 DMEM, NGF 50 ng/㎖가 보충된 DMEM(도 3A-B). FCS의 존재하에 시딩한 후 12시간에, 세포는 디쉬 표면에 부착하고 납작해진다. FCS의 존재하에서만이 세포가 증식하고(도 3A), 증식은 20% FCS에서 최고이다. 10% 또는 20% FCS의 존재하에 배양될 때, 성상신경교질 모집단은 각각 40시간과 20시간에 두배가 된다(도 3A). 20% FCS 존재하의 세포 증식 속도는 단일 생검으로부터 1개월 안에 성인 성상세포 1-5 ×10⁶의 회수를 가능하게 하는, 세포 이식을 위해 적당하다.

놀랍게도, NGF 또는 bFGF(50 ng/㎖ 배지)의 첨가는 성인 성상세포의 증식을 촉진하지 않는다(도 3B). 5 또는 10% HS가 보충된 FCS와 배양할 때, 대부분의 성인 성상세포는 배양 디쉬에 부착하지 않고 배지에 남는다. 그럼에도 불구하고, 소수의구형 세포가 부착하지만 배양 디쉬 상에 납작해지지는 않는다. 플레이팅 후 3일부터, 일부 부착된 세포가 납작해지고 매우 서서히 증식한다(도 3B). 요약하면, 성인 성상세포는 FCS의 존재하에서 시험관내 증식할 수 있다. 20% FCS가 세포 이식을 위해 적당한 다수의 세포 회수를 가능하게 한다.

1.4.2 냉동/해동 과정에 따른 세포 특징규명

환자는 한가지 이상 이식받을 수 있다. 따라서, 인간의 자지 이식의 개발에서 한가지 논점은 단일 생검으로부터 1차 배양된 성상세포의 냉동보존이다. 성인 성상신경교질세포가 냉동/해동 과정 후에 성장에 대해 시험된다. 10% FCS가 보충된 DMEM/F12에서의 시험관내 3-4주에 상응하는, 1차 계대에서, 배양된 세포는 냉동되고 2-6개월간 -80℃에서 유지된다. 이어서, 세포를 신속하게 해동하고 10% FCS가 보충된 DMEM/F12에 시딩한다. 세포를 주의깊게 매일 관찰한다. 해동과 시딩 후 10시간에, 세포는 배양 디쉬에 부착하고 납작해진다. 이들은 냉동 과정을 가하지 않은 세포와 유사한 형태학적 및 면역세포화학적 특징을 보인다. GFAP 및 S100β면역염색은 이러한 세포가 이들의 성상신경교질세포 표현형을 보존함을 확인해준다. 플레이팅 후 첫째날 중에는, 세포가 증식하지 않았다. 2일 내지 3일에, 1차 유사분열 프로파일이 관찰되었다. 이어서, 세포 증식이 촉진되고, 평균 분열시간은 10% FCS의 존재하에 60시간이다(도 3A). 따라서, 본 발명에 따라 수득되는 성인 성상세포는 냉동/해동 과정 후에 분열하는 능력을 유지한다.

실시예 2. 배양된 성상세포의 유전적 변형

2.1. 아데노바이러스 벡터

아데노바이러스 벡터는 설치류 뇌에 직접적인 뇌내 주입이 중추신경계의 유전자 요법을 제공한다는 최근의 연구에 의해 나타난 것처럼 신경세포에 외래 유전자를 전달하기 위한 효율적인 수단을 나타낸다(WO94/08026). 이식에 적당한 세포 수를 증폭시키기 위해, 본 발명자는 재조합 아데노바이러스가 배양된 인간 성상세포에 유전자 전달을 효율적으로 허용할 수 있음을 설명하였다.

다수의 아데노바이러스-유도된 벡터가 문헌에 기재되어 있고 당분야의 숙련인에 의해 제조될 수 있다. 이러한 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다(참조: 특히 EP 185 573, Perricaudet et al., FEBS Letters 267 (1990) 60; Levrero et al, Gene 101 (1991) 195, FR 9305954, FR 9308596, WO94/12649). Ad.RSVβgal 벡터는 문헌에 이미 기재되어 있었다. 예를 들면 Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90, 626-630 (1992))를 참조하라. 이 벡터는 E1 및 E3 영역이 결실된 아데노바이러스 Ad5에 삽입된 대장균 LacZ 유전자를 함유한다.

2.2 성인 성상세포의 AdPGKtet hTH-1로의 감염

세포를 혈청 없이(FCS) DMEM/F12에 6 ×10⁴세포/웰의 밀도로 6 웰 배양 플레이트에 시딩한다. 이어서, 세포를 인간 티로신 하이드록실라제 유전자(hTH-1)가 테트라사이클린-기본 "tet-off" 조절 시스템의 제어하에 있는, AdPGKtet hTH-1과 4-6시간 동안 배양한다(Gossen and Bujard, 1992). hTH 유전자 및 트랜스활성제는각각 최소의 CMV 및 포스포글리세라이트 키나제(PGK) 프로모터에 의해 유도된다. 상이한 감염 중복도(MOI)가 시험된다(75, 150 및 300 pfu/세포). 독시사이클린이 10 ng/㎖의 최종 농도까지 배양 배지에 첨가된다. 배지는 이틀에 한번씩 새로한다.

2.3 형질도입된 성인 성상세포에 의한 TH 활성 및 L-Dopa 생산성 평가

감염 후 3일, 7일 및 14일에, 세포를 수확하여 TH 활성을 측정하고 L-Dopa 생산성을 평가하도록 공학처리한다. 세포 펠렛의 TH 활성은 전술한 바와 같이 평가된다(Reinhard et al., 1986). L-Dopa의 생산성은 FCS 없이 DMEM/F12에서 24시간 동안 인간 성상세포를 성장시킨 후에 평가한다. 조건화 배지가 수집되고, 0.5 ㎖ 분획을 0.05 M 트리스-HCl(pH 8.6)에서 알루미나 현탁액(40 mg/㎖)과 혼합한다. 이어서 각 혼합물을 10분간 연속 교반하고, 트리스-HCl 완충액으로 세척한 다음 알루미나를 원심분리로 최종 수집한다(800 g, 5분, 4℃). 알루미나 겔 상에 흡착된 카테콜은 0.6 N 퍼클로르산(샘플당 0.1 ㎖)으로 용출되고, 용출액을 2 M 칼륨 포스페이트 pH 7.4(샘플당 20 ㎕)로 중화한다. 원심분리 후에(30 000 g, 15분, 4℃), 다른 문헌에 더욱 상세히 설명된 것처럼, L-Dopa의 전기화학적 정량을 위해 세척한 상등액 10 ㎕ 분획을 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(Ultrasphere IP, 25 cm, 0.46 cm 외경, 5 ㎛)으로 주입한다.

2.4 성인 성상세포의 유전공학 처리 결과

배양된 성인 성상세포는 재조합 아데노바이러스 벡터에 의해 변형될 수 있다. 최적의 형질도입은 세포를 6시간 동안 300 pfu/세포의 바이러스 제조물로 감염시킴으로써 달성된다. 명백히 독성은 관찰되지 않았다. 세포의 50-60%가 면역세포화학적으로 평가하면 hTH-양성이다(도 3A-B). Reinhard와 그의 동료(1986)에 의해 개발된 효소적 평가가 hTH가 감염후 3, 7 및 14일에 활성인지를 시험하는 데 사용된다. TH 활성은 감염후 3일에 검출되고(1,290 pmol/mg prot/h), 7일(19,000 pmol/mg prot/h)과 14일(35,650 pmol/mg prot/h)에 더욱 증가한다. 또한, HPLC 분석은 TH-형질도입된 인간 성상세포가 감염후 14일에 1 ㎍ L-Dopa/10⁶세포/24시간을 생성함을 보여준다.

테트라사이클린-기본 제한 시스템의 효능을 시험하기 위해, 성상신경교질 배양액을 테트라사이클린의 강력한 유사체인 독시사이클린(10 ng/㎖)으로 처리한다. 독시사이클린은 TH 발현을 효율적으로 감소시킨다. TH 활성은 14일째에 독시사이클린의 존재하에서 적어도 10배 감소한다(독시사이클린-처리한 세포에서 3,590 pmol/mg prot/h 대 비처리 배양액에서 35,650 pmol/mg prot/h)(도 4). 이는 hTH-1 발현이 독시사이클린에 의해 효율적으로 조절됨을 나타낸다. 그러나, 도 4에서 보여진 것처럼, 독시사이클린-처리된 성상세포에서, TH 활성의 수준은 기준선으로 돌아가지 않는다. 이 관찰은 AdPGKtet hTH-1 벡터에서 hTH-1의 발현을 유도하는, 최소의 프로모터 P^*hCMV가 1차 배양된 성인 성상세포에서 기본적인 활성을 가짐을 설명해준다. 실제로, 선행 연구는 손상 후와 같이 특정 실험 조건하의 성상세포에서, hCMV 프로모터의 환경적인 조절을 설명해주는 hCMV 프로모터의 활성을 보고하였다(McCarthy et al., 1995; Fritschy et al., 1996).

2.5 다른 벡터의 사용

전술한 바와 같이, 다른 유형의 벡터가 본 발명에 따른 성상세포를 유전자 변형시키는 데 사용될 수 있다. 이는 바이러스성 또는 비-바이러스성(화학적) 벡터일 수 있다. 바람직한 바이러스성 벡터는 AAV, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 비-바이러스성 벡터는 칼슘-포스페이트 침전, 리포솜-매개 형질감염, 양이온 지질 형질감염 및 리포폴리아민-매개 형질감염을 포함한다.

본원에 설명된 모든 참조문헌은 참조로 인용되었다.

본 발명을 쉽게 감지할 당분야의 숙련인은 목적을 실행하고 언급된 결과와 장점 및 원래의 것들을 달성하기 위해 잘 변형시킬 것이다. 본원에 설명된 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 방법, 과정 및 기술은 바람직한 양태의 전형으로 제시되었고, 예시이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 취지 내에 포함되거나 첨부된 청구범위의 범위로 한정된 본원에서의 변화 및 다른 사용이 당분야의 숙련인에게 일어날 것이다.

참조문헌

Claims

a) 성상세포 제조물을 배양 용기에 도입하고,

b) 성상세포의 배양 용기에의 부착을 가능하게 하는 조건하에서 단계 a)로부터의 성상세포를 배양한 다음,

c) 배양 용기에 부착하지 않은 세포를 단계 a)의 개시 후 약 48시간에 제거하는 단계를 포함하는, 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단 생산방법.
제 1 항에 있어서, 성상세포가 인간 성상세포인 방법.
제 2 항에 있어서, 인간 성상세포가 성인 성상세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단에 소교세포가 본질적으로 부재하는 방법.
제 1 항에 있어서, 성상세포가 환자의 외과 절제술에 의해 수득되는 1차 성상세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 비부착 세포가 배양 배지의 교체에 의해 배양 용기로부터 제거되는 방법.
제 1 항에 있어서, 핵산을 성상세포에 도입하는 단계 d)를 추가로 포함하는 방법.
제 7 항에 있어서, 핵산이 바이러스성 벡터로 성상세포에 도입되는 방법.
제 8 항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, AAV, 레트로바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 9 항에 있어서, 바이러스성 벡터가 복제 결손 아데노바이러스 벡터인 방법.
제 7 항에 있어서, 핵산이 칼슘-포스페이트 침전, 리포솜-매개 형질감염, 양이온 지질 형질감염 또는 리포폴리아민-매개 형질감염에 의해 성상세포에 도입되는 방법.
제 7 항에 있어서, 핵산이 신경활성 물질을 암호화하는 방법.
제 1 항에 따른 방법으로 생성되는 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단.
성상세포의 본질적으로 순수한 모집단.
제 14 항에 있어서, 성상세포가 인간 성상세포인 성상세포의 모집단.
제 15 항에 있어서, 인간 성상세포가 성인 성상세포인 성상세포의 모집단.
제 16 항에 있어서, 성상세포의 모집단에 소교세포가 본질적으로 부재하는 성상세포의 모집단.
제 14 항에 있어서, 성상세포가 환자의 외과 절제술에 의해 수득되는 1차 성상세포인 성상세포의 모집단.
제 14 항에 있어서, 외생성 핵산을 추가로 포함하는 성상세포의 모집단.
제 19 항에 있어서, 핵산이 바이러스성 벡터로 성상세포에 도입되는 성상세포의 모집단.
제 20 항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, AAV, 레트로바이러스 및 백시니아 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 성상세포의 모집단.
제 21 항에 있어서, 바이러스성 벡터가 복제 결손 아데노바이러스 벡터인 성상세포의 모집단.
제 19 항에 있어서, 핵산이 칼슘-포스페이트 침전, 리포솜-매개 형질감염, 양이온 지질 형질감염 또는 리포폴리아민-매개 형질감염에 의해 성상세포에 도입되는 성상세포의 모집단.
제 19 항에 있어서, 핵산이 신경활성 물질을 암호화하는 성상세포의 모집단.
제 29 항에 있어서, 핵산이 DNA 또는 RNA인 성상세포의 모집단.
제 25 항에 있어서, 핵산이 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA인 성상세포의 모집단.
제 26 항에 있어서, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 성장인자, 신경영양인자 및 효소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 성상세포의 모집단.
제 25 항에 있어서, 핵산이 안티센스-RNA 또는 리보자임을 암호화하는 DNA인성상세포의 모집단.
제 24 항에 있어서, 핵산이 조절 영역과 작동적으로 연결되는 성상세포의 모집단.
제 29 항에 있어서, 조절 영역이 조절가능한 프로모터, 유도가능한 프로모터, 신경세포-특이적 프로모터 또는 바이러스성 프로모터를 포함하는 성상세포의 모집단.
제 14 항에 따른 성상세포의 모집단을 포함하는 이식편.
신경활성 물질을 암호화하는 외생성 핵산을 포함하는 성상세포의 본질적으로 순수한 모집단을 포함하는 조성물.