CZ20002906A3

CZ20002906A3 - Rekombinantní nukleová kyselina obsahující negativní regulační elementy pro nervově specifickou exresi transgenu a její použití

Info

Publication number: CZ20002906A3
Application number: CZ20002906A
Authority: CZ
Inventors: Hélene Kiefer; Jacques Mallet; Stéphanie Millecamps
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2000-11-15
Also published as: KR20070013362A; CN1221665C; AU2058199A; ZA991070B; IL137609A0; BR9907759A; JP2002503476A; PL342265A1; EP1053341A1; WO1999041396A1; NO20004025D0; FR2774698B1; AU766153B2; KR20010072544A; CZ299915B6; FR2774698A1; NO20004025L; PL198201B1; HUP0100660A1; EP1120466A2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových způsobů, konstruktů a vektorů, obsahujících tyto konstrukty, které umožňují regulovat expresi nukleových kyselin. Konkrétně se vynález týká nových způsobů, konstruktů a vektorů, které umožňují dosáhnout cílené exprese transgenu v nervových buňkách in vivo nebo ex vivo. Vynález je zejména vhodný pro aplikace, kde se gen přenáší in vivo, např. při léčebném nebo výzkumném použití.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie in vivo nebo ex vivo umožňuje lokání a účinný přenos genů (transgenů) kódujících požadované faktory, a to zejména do nervového systému hostitele. V tomto ohledu byla úspěšně použita řada vektorů pro přenos různých transgenů do nervových buněk in vivo nebo ex vivo. Mezi těmito vektory lze uvést zejména virové vektory adenoviru, AAV nebo HSV, některé nevirové vektory kationtových (polymerů (např. polyetylenimin) umožnily účinně a trvale přenést geny do buněk nervového systému in vivo (WO 94/08026, WO 93/09239 a WO 96/02655). Možnost uskutečnit takový přenos genů skýtá široké pole aplikací, zejména v oblasti medicíny. Tyto vektory lze užít pro genovou terapii in vivo nebo ex vivo. V současné době jsou v běhu klinické studie týkající se přenosu trofických faktorů do nervových buněk. Tyto vektory lze také užít pro typu typu Tyto vektory • · vytvoření transgenních zvířat, která umožní testování sloučenin, nebo pro různé značící studie nebo studie biologické dostupnosti. Ve všech těchto aplikacích, i když se zdá, že je dosaženo účinného a trvalého přenosu, je nezbytná potřeba regulovat expresi transgenů. Byly již popsány různé systémy, které se pokoušely omezit expresi transgenů výlučně na určitou tkáň, např. pomocí tzv. tkáňově specifických promotorů nebo komplexních chimérických systémů, které vyžadovaly použití několika konstruktů a/nebo regulačních faktorů. Jako příklad tkáňově specifického promotoru lze zmínit konkrétně promotor gliového fibrilárního kyselého proteinu, který je zejména aktivní v gliových nervových buňkách. Avšak regulační systémy, které jsou v současnosti dostupné, trpí některými nevýhodami, zejména tím, že jejich síla a/nebo selektivita nejsou vždy dostatečné. Takže u valné většiny známých systémů je dobré selektivity dosazeno na úkor síly promotoru a je tudíž obtížné dosáhnout exprese, která je současně dostatečně silná, stálá, a specifická.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby, konstrukty a vektory obsahující tyto. konstrukty, které umožňují odstranit nevýhody dosavadního stavu techniky. Předkládaný vynález popisuje chimérický neuronově zacílenou expresi, regulační elementy, které zabraňují expresi genu v jiných buňkách než nervových buňkách. Konstrukty tohoto typu vykazují řadu výhod ve srovnání se systémy dosavadního stavu. Na jedné straně, jelikož represorové sekvence a všudypřítomné (tj. nespecifické) promotory jsou často krátké a dobře charakterizované, je možné je snadno kombinovat s dalšími regulačními elementy. Na druhé straně, tyto regulační elementy lze teoreticky kombinovat s jakýmkoliv všudypřítomným promotorem a tudíž představují vtipný systém, který dovoluje dosáhnout nervově specifické exprese požadovaného transgenů jednoduchým způsobem, dokonce i tehdy, promotor, který umožňuje Vynález využívá negativní • · · · · · · · · ·« · ···· · · ·· ···· • · · ··· · · · · · · · · • · · · · · · · · ·· · ·· ·· ·· ·· ·» ·· když použitý vektor nemá žádný nebo má jen malý tropismus pro nervové buňky. Velký počet studií popisuje cis sekvence, které potlačují transkripci neuronových genů. v jiných než nervových buňkách. Jeden typ sekvence s touto vlastností je element NRSE (neurone restrictive silencer element, neuronový element restriktivního umlčení), označovaný také RE-ls (represorový element 1) . NRSE je krátká sekvence, přibližné velikosti 21 bp, která byla nalezena v poloze proti směru transkripce (upstream) několika neuronových genů: např. genu SCG10 [1], genu pro sodíkový kanál II [2] a synapsin I [3]. Kromě toho analogické sekvence byly nalezeny proti směru transkripce velkého počtu neuronových genů, i když jejich funkce nebyla dosud vždy prokázána [4]. Tyto sekvence NRSE reprimují (potlačují) expresi genů v jiných než nervových buňkách tím, že váží specifické transkripční faktory, tj . protein NRSF (neurone restrictive silencer factor, neuronový restriktivní umlčovací faktor), nazývaný také REST (RE-1, silencing transcription factor, RE-1 faktor umlčení transkripce), který je přítomen výlučně v jiných buňkách než nervových [5]. Tento protein patří k rodině transkripčních faktorů se zinkovými prsty. V průběhu vývoje zasahuje, aby inhiboval represi neuronových genů v ostatních buňkách kromě nervových, a i v dospělosti se podílí na udržování této represe. Výzkumné skupiny, které charakterizovaly přítomnost sekvencí NRSE proti směru transkripce neuronových genů také ověřily schopnost těchto sekvencí snižovat expresi reportérového genu po transfekci jiných buněk než nervových. Aby se toto ověřilo, kombinovala se sekvence NRSE s minimálním heterologním promotorem, což je promotor, který dovoluje pouze bazální transkripci. Tak např. když byla sekvence NRSE kalcióvého kanálu II umístěna proti směru transkripce promotoru thymidinkinázy, exprese reportérového genu se snížila na polovinu v buňkách jiných než nervových [9] . A podobně také dvě kopie sekvence NRSE • · • · « · · « · · · • · ·· · · ·· · • ·

synapsinu I kombinované s minimálním promotorem c-fos snížily expresi v buňkách jiných než nervových o 75 % [3]. Kromě toho přítomnost sekvence NRSE také umožnila to, že aktivita promotoru SV-40 byla regulována v buňkách jiných než nervových [10] .

Avšak sekvence NRSE nebyly nikdy užity k řízení exprese silného všudypřítomného(nespecifického) promotoru, ani nebyly využity z hlediska genové terapie. Takže dosud nebylo ukázáno, zda tyto sekvence jsou schopny potlačit expresi, která je indukována silným promotorem. Podobně také nebylo dosud nikdy ukázáno, jestli jsou tyto sekvence aktivní in vivo, když jsou umístěny do chimérického prostředí. Obecně řečeno, dosud nebylo prokázáno, zda tyto sekvence jsou aktivní in vivo, když se zkombinují s heterologním promotorem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká rekombinantních nukleových kyselin, které dovolují nervově specifickou expresi genů. Vynález se také týká vektorů, které obsahují takové nukleové kyseliny, zejména virového původu, a také buněk, které obsahují tyto nukleové kyseliny a/nebo vektory. Vynález se také týká specifických chimérických promotorů, které jsou schopny exprimovat geny specificky v nervovém systému in vivo. Vynález se dále týká přípravků, které obsahují tyto elementy a jejich použití pro přenos genů.

Prvním aspektem předkládaného vynálezu je rekombinantní nukleová kyselina, která obsahuje:

promotor jednu nebo několik sekvencí NRSE, a terapeutický gen.

• « · · ««β· ·

000 0 000 0 00

00 0 0 00 0 0 00 .0 0 00 00 00 00.

Konstrukty podle vynálezu tudíž obsahují úsek pro represi, v jiných buňkách než neuronech, aktivní exprese terapeutického genu, který je indukován promotorem. Tento represorový úsek se skládá z jednoho nebo několika motivů NRSE.

Motiv NRSE, který se užívá podle předkládaného vynálezu, výhodně obsahuje následující sekvenci velikosti 21 bp nebo alespoň její část:

TTCAGCACCACGGAGAGTGCC (sekvence id. č. 1)

Tato sekvence odpovídá sekvenci NRSE genu SCG10 [2] .

Nicméně je jasné, že motiv NRSE použitý podle předkládaného vynálezu může obsahovat i nějaké variace ve srovnání s touto sekvencí, pokud si uchovává výše uvedené represorové vlastnosti. Sekvence typu NRSE vykazující určitý stupeň variability byly nalezeny v různých genech, jak bylo popsáno v publikovaném článku Schoenherr et al. [4], který'je plně zahrnut formou odkazu. Na základě pozorovaných variant byla identifikována kanonická sekvence NRSE, která odpovídá sekvenci, se kterou se lze nejčastěji setkat. Jde o následující sekvenci:

TTCAGCACCACGGACAGCGCC (sekvence id. č. 2) .

Výhodné varianty sekvence podle předkládaného vynálezu obsahují substituce týkající se 1 až 5 párů baží v sekvenci id. č. 2. Výhodněji jsou to varianty týkající se 1 až 3 párů baží. Nejvýhodněji se varianty týkají zbytků 1, 2, 10, 11,

15, 18, 19 a/nebo 20 výše uvedené 'sekvence. Substituce mohou odpovídat deleci nebo nahrazení baze jakoukoliv jinou baží. Takže motiv NRSE je představován obecně celou následující sekvencí nebo její částí:

NNCAGCACCNNGGANAGNNNC (sekvence id. č. 3), kde N znamená bázi vybranou ze A, T, C a G. Specifické příklady motivů NRSE, které lze užít podle předkládaného vynálezu, jsou následující:

·· ·· ·· ·· ·· ·· · « · · 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 99 ' · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · ·· 99 ·9 99 99 99

TTCAGCACCACGGACAGCGCC	(sekvence	id.	č.	2)
TTCAGCACCACGGAGAGTGCC	(sekvence	id.	č.	4)
TTCAGCACCGCGGACAGTGCC	(sekvence	id.	č.	5)
TTCAGCACCTCGGACAGCATC	(sekvence	id.	č.	6)
TTCAGCACCGGGGAGAGCGTC	(sekvence	id.	č.	7)
TCCAGCACCGTGGACAGAGCC	(sekvence	id.	č.	8)
TTCAGCACCGAGGACGGCGGA	(sekvence	id.	č.	9)
ATCAGCACCACGGACAGCGGC	(sekvence	id.	č.	10)
TTCAGCACCTAGGACAGAGGC	(sekvence	id.	č.	11)

Kromě toho tyto motivy mohou obsahovat, na jednom z konců nebo na obou koncích, další baze, které neinterf eruj í. s výše popsanou represorovou aktivitou. Konkrétně tyto další baze mohou obsahovat .restrikční místa, neutrální sekvence nebo sekvence pocházející z klonovacích kroků a obsahující např. úseky plazmidu nebo vektoru, nebo sekvence, které obklopují motiv NRSE v původním genu.

Tyto různé motivy lze připravit jakýmkoliv způsobem pro přípravu nukleových kyselin odborníkovi známým. Takže je lze např. připravit postupem automatizované syntézy užitím komerčně dostupného automatického syntetizátoru nukleových kyselin. Také ke lze získat screeningem DNA knihoven, např. hybridizací se specifickými sondami nebo vazbou na specifické NRSF faktory. Kromě toho jakákoliv varianta sekvence id. č. 1 může být identifikována v DNA knihovně metodou vyhledávání homologie.

Jakmile je motiv NRSE syntetizován, může být funkčně testován. První test zejména obsahuje stanovení schopnosti daného motivu vázat NRSF faktor. To lze provádět různými způsoby, např. experimenty s retardací migrace v gelu, jak to bylo popsáno v publikacích Moři et al. [2] nebo Schoenherr et al. [5], které jsou zahrnuty formou odkazu. Pak se stanoví schopnost motivu reprimovat expresi, a to tak, že se tento motiv vloží do plazmidu, který obsahuje reportérový gen

9

9 9 9

99 (chloramfenikolacetyltransferáza, luciferáza, lacZ atd.) řízený promotorem, a porovnají se hladiny exprese reportérového genu v nervových buňkách a jiných než nervových buňkách. Tento postup je např. popsán v publikaci Schoenherr et al. [4, 5] a také v příkladech. Výhodně je motiv považován za funkční pokud poskytuje expresi reportérového genu v nervových buňkách a jiných než nervových buňkách lišící se alespoň o 40 %. Výhodněji je rozdíl v expresi alespoň 50 %, nejvýhodněji alespoň 60 %.

Jak již bylo uvedeno výše, nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje jeden nebo několik motivů NRSE,· které byly definovány výše. Pokud je přítomno několik motivů, tentýž stejný motiv se může opakovat několikrát nebo je přítomno několik variant. Výhodně konstrukty podle vynálezu obsahují jeden motiv, který se opakuje několikrát. Konstrukty mohou obsahovat až 50 motivů. Výhodně je jeden motiv opakován 2 až 20 x, výhodně 3 až 15 x. Jak . je ilustrováno v příkladech, výhodné výsledky byly získány, když byl motiv opakován 3, 6 nebo 12 x, a zvláště významné výsledky byly získány, když byl motiv opakován 6 a 12x.

Motivy NRSE se vkládají do konstruktů v jakémkoliv netranskribovaném nebo netranslatovaném úseku nebo v intronu. Výhodně se vkládají do nekódujících úseků 5'- konce a ještě výhodněji do proximálního úseku promotoru. Navíc, jelikož je aktivita těchto motivů nezávislá na jejich orientaci, je možné je vložit v orientaci souhlasné se směrem transkripce nebo v opačné. A nakonec, když se použije několik motivů, jsou výhodně uspořádány do tandemu, v jednom a témže úseku konstruktu. Avšak je jasné, že mohou být také vloženy do různých úseků.

Druhý element, který je součástí molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, je promotor, který umožňuje, aby byl transgen exprimován v požadované buňce. Výhodným promotorem je promotor, který je aktivní -v nervových » φφ φ φ φ • φφ φφ ·Φ buňkách nebo tkáních, a zvláště eukaryotický promotor. Promotor může být např. všudypřítomný, nespecifický promotor, tj. promotor, který je funkční ve většině typů buněk. Výhodnější je eukaryotický všudypřítomný promotor.

Promotor je buďto autologní, tj. promotor, který pochází ze stejného biologického druhu jako buňka, v níž má dojít k expresi, nebo je to promotor xenogenní z jiného druhu,. K výhodným příkladům eukaryotického promotoru patří silné promotor genu fosfoglycerátkinázy 1 který pochází všudypřítomného promotory jako je

PGK) . Tzv. silným promotorem je míněn jakýkoliv promotor, jehož aktivita je srovnatelná s aktivitou virového promotoru. V eukaryotických organismech je PGK enzym účastnící se glykolýzy. U myši promotor tohoto genu velikosti přibližně 500 bp obsahuje tzv.

a promotorovy úsek iniciačních míst

PGK .byla ověřena zesilovací úsek (enhancer)(-440/-120) (-120/+80), který obsahuje několik transkripce [6]. Účinnost promotoru v předchozích experimentech jak in vitro tak in vivo [7, 8).

V jednom výhodném provedení se vynález týká nukleové kyseliny, která obsahuje promotor PGK a jednu nebo několik sekvencí NRSE. Jak je ilustrováno v příkladech, tento typ konstruktu umožňuje nasměrovat nervově specifickou expresi transgenu. Vynález se dále týká chimérického promotoru, který obsahuje silný všudypřítomný promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE. Vynález ukazuje, že tyto sekvence NRSE lze aktivity silného promotoru, a to To tudíž umožňuje využít tyto nové aplikací. Specifický chimérický užít účinně k represi i v podmínkách in vivo. promotory v celé řadě promotor podle předkládaného vynálezu je představován promotorem xNRSE-PGK, kde x je celé číslo od 1 do 50, výhodně od 1 do 20.

Příkladem dalších všudypřítomných eukaryotických promotorů, které lze užít v předkládaném vynálezu, jsou promotory, které řídí expresi genů obligatorního buněčného • . 0 ·· 00 ·· 00 ·* • ·· · · · 0 0 · · 0 · ·· 0 0 00 0 0

00 000 00 000 00 0

000 0 0000 0000 00 00 00 00 00 00 metabolismu (to jsou geny základního metabolismu zvané domestic nebo housekeeping geny, které kódují proteiny nezbytné pro funkce společné všem buňkám, jako je např. dýchání). Příklady těchto genů jsou geny enzymů zúčastněných v Krebsově cyklu, v buněčném dýchání nebo transkripci a replikaci jiných genů. Specifickým příkladem promotoru, který lze zmínit, je promotor genu ocl-antitrypsinu, β-aktinu, vimentinu, aldolázy A nebo Eflct (elongační faktor) .

Promotor, který lze užít podle předkládaného vynálezu může být také eukaryotický promotor neurospecifického typu, což ještě zlepší specifitu pro nervové buňky. Příkladem takového promotoru, který lze zmínit, je promotor genu NSE (enoláza specifická pro neurony), NF (neuroifilamenta), TH (tyrosin hydroxyláza), DAT (přenašeč dopaminu), CHAT (cholinacetyltransferáza), DBH (dopamin^-hydroxyláza), TPH (tryptofanhydroxyláza) a GAD (dehydrogenáza kyseliny glutamové), obecněji řečeno všechny promotory genů pro enzymy syntézy nebo transportu nervových přenašečů (neurotrasmiterů, neuromediátorů) nebo promotory genů, jejichž exprese je specifická pro dané typy nebo subtypy nervových nebo gliových buněk.

Nakonec vynález také zahrnuje užití virových promotorů, např. CMV (cytomegalovirus), RSV (virus Rousova sarkomu), TK (thymidinkináza), SV40 (opičí virus) a LTR (dlouhá koncová repetice).

Kromě toho obsahuje nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu terapeutický gen. Terapeutický gen znamená ve smyslu předkládaného vynálezu jakoukoliv nukleovou kyselinu, která obsahuje alespoň jeden otevřený čtecí rámec, který kóduje RNA terapeutického nebo vakcinačního polypeptidu. Nukleová kyselina je komplementární, genomová, syntetická nebo semisyntetická DNA. Může být různého původu, ze savců, rostlin, virů nebo může jít o umělou sekvenci. Transkripční nebo translační produkt vykazuje terapeutické • 4« 444 44 444 Μ ·

4444 4444 4444

44 44 44 44 44 nebo vakcinační vlastnosti. Specifickým příkladem jsou enzymy, růstové faktory (zejména trofické faktory), neurotransmitery nebo jejich prekurzory, toxické faktory (thymidinkináza apod.), protilátky nebo fragmenty protilátek atd.

Vynález se také týká užití konstruktů podle vynálezu k nasměrování exprese jednoho nebo několika genů kódujících RNA nebo protein, který je třeba exprimovat v neuronu, aniž by došlo k jeho expresi v jiných buňkách, k vytvoření zvířecích modelů nebo pro účely substituční nebo supresivní, etiologické nebo symptomatické léčby. Mohou to být geny např. z rodiny trofických faktorů jako neurotrofiny (NGF, BDNF, NT3, NT4-5, GMF atd.), rodiny růstových faktorů (jako fibroblastový růstový faktor, FGFa a FGFb), rodiny vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF), epidermálního růstového faktoru (EGF) a superrodiny TGFP, včetně rodin GDNF/neurturin a TGFp.

Mohou to být také geny, které kódují cytokiny, např. CNTF, LIF, onkostatin M nebo kardiotrofin 1, nebo proteiny rodiny interleukinů.

Mohou to být také geny, které kódují receptory těchto mnoha různých faktorů nebo které kódují transkripční faktory, které regulují expresi různých faktorů. Také to mohou být geny, které kódují enzymy syntézy nebo degradace různých neurotransmiterů a neurópeptidů nebo jejich prekurzoru, nebo kofaktory, které jsou nezbytné pro jejich syntézu nebo katabolismus, nebo jiné transkripční faktory, které regulují expresi těchto proteinů, také může jít o geny kódující receptory neurotransmiterů/neuropeptidů (nebo jejich podjednotky) a nebo proteiny, které se účastní v dráze signální transdukce.

Dalšími zajímavými geny z hlediska předkládaného vynálezu jsou zejména geny kódující antioxidanty, např. SOD (superoxidismutáza), GPX (glutathionperoxidáza) , katalázu

44 44 ·· 44 44 • ·« · · * · 4 * * · · • 4 4 4 · 4 · 4 · · 4 · • 4 4 · · 4 4 4 4 4 4 ·· ·

4·· 4 44 4 4 44 4

44 44 44 44 44 nebo enzymy buněčného dýchání, enzymy zúčastněné v buněčném cyklu jako je např. p21, nebo jiné proteinové inhibitory dependentních kináz, a také geny související s apoptózou jako jsou ICE, Bcl2, BAX, atd. .

Obecně řečeno, jakýkoliv gen, jehož anomální exprese způsobuje poruchu nervového systému, může být exprimován v konstruktu podle předkládaného vynálezu, jako např. geny, jejichž mutace je přímou příčinou nemoci nebo geny, jejichž produkty se podílejí na stejné metabolické dráze. Geny mohou také být toxické geny pro protinádorovou terapii (např. thymidinkináza nebo cytosindeamináza), geny pro antisense RNA nebo ribozymy, a nebo reportérové geny pro vývojové studie nebo pro výzkum kinetiky a biologické dostupnosti, jako je gen β-galakatosidázy, luciferázy nebo zeleného fluorescenčního proteinu GFP (green fluorescent protein). Také to mohou být geny, které jsou součástí systému podmíněné rekombinace v nervovém systému pro vytvoření zvířecího modelu, jako jsou např. transgenní zvířata, včetně systému podmíněného vyřazení genu (knockout).

Je zřejmé, že odborník je schopen uzpůsobit požadovaný gen očekávanému použití.

V nukleové kyselině podle předkládaného vynálezu jsou jednotlivé elementy uspořádány tak, že promotor řídí expresi terapeutického genu a sekvence NRSE (jedna nebo několik) řídí , aktivitu promotoru. Obecně je tedy gen umístěn po směru transkripce (downstream) od promotoru a ve shodné fázi » s promotorem. Dále regulační úsek je obecně umístěn proti směru transkripce (upstream) od promotoru, ačkoliv to není pro aktivitu nezbytné, jak bylo již zmíněno výše.. Vzdálenost mezí regulačním úsekem (sekvence NRSE) a promotorem je proměnlivá v závislosti na povaze použité sekvence a počtu opakování motivu NRSE. Výhodně jsou regulační sekvence umístěny ve vzdálenosti menší než 2 kb od promotoru, ·· ··

I · · 4 » · · · ·· » i • · ·· ·· » · · <

» · · 4 » · · 4 ·· ♦ · výhodněji ve vzdálenosti menší než 1 kb od promotoru.

popsány např. v patentové je formou odkazu součástí

V jednom výhodném provedení vynálezu jsou sekvence NRSE kombinovány s regulačním systémem, aby byla jemně řízena exprese nukleové kyseliny v buňce. Lze uvést zvláště regulační systém užívající na jedné straně tetracyklinem kontrolovaný transaktivátor tTA a na druhé straně promotor senzitivní k tTA, které byly přihlášce FR 98/140080, která předkládané přihlášky. Stručně shrnuto, nukleová kyselina se skládá z prvního úseku, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující systém tetracyklinem-regulovaného transaktivátoru (tTA) řízený promotorem, který je senzitivní k tTA. Tento senzitivní promotor může být jakýkoliv promotor, dokonce i silný promotor, jehož aktivita se zvyšuje v přítomnosti transaktivátoru. Ze strukturního hlediska tento promotor obsahuje ve své sekvenci nebo ve funkční vzdálenosti od své sekvence alespoň jedno místo pro navázání faktoru tTA (operátorový úsek, Op). Výhodně jsou tyto dva úseky odděleny. Při realizaci vynálezu je možné sekvence NRSE umístit proti směru transkripce od tTA-senzitivního promotoru, ačkoliv to není podmínkou jejich aktivity, včetně polohy mezi dvěma výše popsanými úseky. Toto výhodné provedení předkládaného vynálezu umožňuje dosáhnout současně nejen regulace exprese nukleové kyseliny tetracyklinem, ale také tkáňové specifičnosti exprese, zejména pro umožňuje sekvence NRSE. Kromě toho promotor zajišťuje pozoruhodnou účinnost a spolehlivost exprese transgenů, jak jeto potřebné pro genovou terapii.

nervové buňky, což tato jemná regulace

Předkládaný vynález se také týká vektoru, které obsahují nukleové kyseliny definované v předchozím popisu. Jelikož tyto vektor jsou výhodně schopny transdukovat savčí buňky, a konkrétně lidské nervové buňky, není nutné, aby měly • · · · 0 0 0 < * · · 0 ·· ·· ·· ·0 0· 0· zvláštní tropismus pro uvedené buňky, takže vynález výhodně umožňuje použít jakýkoliv typ vektoru. Může to být plazmidový vektor (plazmid, episom, umělý chromosom atd.) neb virový vektor. Z virových vektorů jsou výhodné např. vektory odvozené z adenovirů, AA.V a herpetických. virů, jejichž tropismus pro nervovou tkáň a nervové buňky byl již důkladně dokumentován ve stavu techniky. Lze zmínit i jiné viry, jako jsou např. retroviry nebo rhabdoviry. Příklady uvedené v této přihlášce ukazují, že aktivita sekvencí NRSE, které byly vloženy do virových vektorů, je významná. Takže zcela neočekávaně bylo zjištěno, že když byly sekvence NRSE, a sice 6 a 12 sekvencí, vloženy do virového vektoru (adenovirus), snížily expresi transgenu v buňkách jiných než nervových o 91 % a 98 % in vitro a o 90 % a 96 % in vivo. Tyto výsledky demonstrují, že je možné podle tohoto jednoduchého systému díky regulačním sekvencím exprimovat požadované nukleové kyseliny specificky v nervových buňkách, niž by došlo k expresi v ostatních buňkách. Kromě toho sekvence NRSE vykazují značné výhody, neboť vzhledem ke své malé velikosti jsou zvláště vhodné pro regulaci exprese genů, které jsou vloženy do vektoru, kde je omezený prostor pro vložení regulačních sekvencí. Navíc je možné kombinovat tyto sekvence s jinými regulačními systémy v jednom a témže vektoru.

Předkládaný vynález se zvláště týká také rekombinantního defektního viru, který obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, kteréžto expresní sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.

Obecně rekombinantní virus podle předkládaného vynálezu je defektní, tzn. není schopen autonomní replikace v buňce, produkce defektních rekombinantních virů je odborníkům známa, pro ilustraci lze uvést např. publikace Graham, F. a Prevec, L, (In: Methods in Molecular Biology (1991) Murray E.J.

t ·· · · · ·· ··· · · * • 9 · · · · · · · · > · »9 ·· ·· *· ·· ·· (ed.), The Human Press lne., Clifton, NJ, kapitola 11, str. 109-128).. Každý z těchto virů může být připraven v enkapsidačnl buněčné linii, která obsahuje funkci deficitní ve viru. Takové buněčné linie byly popsány v odborné literatuře (např. linie 293 a její deriváty) .

V jednom provedení vynálezu je defektní rekombinantní virus adenovirus. Byly charakterizovány různé sérotypy tohoto viru, jejichž struktura a valstnosti jsou poněkud rozdílné. Podle předkládaného vynálezu je výhodné.užití sérotypů 2 nebo 5 lidského adenoviru (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz přihláška WO94/26914). Adenoviry zvířecího původu, které mohou být užity podle předkládaného vynálezu jsou např. psí, hovězí nebo myší adenoviry (např. Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 1981), nebo adenoviry ovcí, prasat, ptáků nebo opis (např. SAV) . Výhodné adenoviry zvířecího původu jsou psí adenoviry, výhodněji adenoviry CAV2 (např. kmen Manhattan nebo A26/61 (A.TCC VR-800) ) . Podle předkládaného vynálezu je výhodné užití adenovirů lidského nebo psího původu nebo smíšeného původu.

Výhodně adenovirus podle předkládaného vynálezu obsahuje sekvence ITR, enkapsidačnl sekvenci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. Ještě výhodněji je alespoň úsek El nefunkční v genomu adenoviru podle předkládaného vynálezu. Tento gen je možné učinit nefunkčním kterýmkoliv v oboru známým způsobem, zejména úplnou delecí, nahrazením, částečnou delecí a adicí jedné nebo několika baží. Takové modifikace lze provést in vitro (s izolovanou DNA) nebo in šitu, např. S využitím metod genového inženýrství a nebo pomocí působení mutagenů. Mohou být modifikovány i jiné úseky, zejméma E3 ((WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje adenovirus podle vynáleu deleci v úseku El a E4. V jiném výhodném provedení obsahuje deleci v úseku El, do které je vložen úsek E4 a po-žadovaná nukleová kyselina podle

9 9 9 vynálezu (viz FR94 13355). Rekombinantní adenovirus může být také adenovirus, který je defektní např. v úseku El a/nebo E2 a/nebo E4. Ve viru podle předkládaného vynálezu je delece v úseku El výhodné v úseku nukleotidu 455 až nukleotidu 3329 v případě sekvence adenoviru Ad5.

Defektní rekombinantní adenoviry podle, předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem odborníkům, známým (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny zejména např. například homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím, kromě jiného, sekvenci nukleové kyseliny podle vynálezu nebo požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresní sekvence obsahující promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE. K homologní rekombinací dojde v důsledku kotransfekce uvedeného adenoviru a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie, která se může použít, výhodně musí I) být transformovatelná uvedenými prvky a II) obsahovat sekvence, které jsou schopny komplementovat část genomu replikačně defektního adenoviru, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Příkladem buněčné linie, která se může užít, je linie lidských buněk 293 z embryonální ledviny (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 1977, 59), která obsahuje levou část genomu adenoviru Ad5 (12%) integrovanou do svého genomu, nebo buněčná linie schopná komplementovat funkce El a E4, která je popsána např. v patentových přihláškách WO94/26914 a WO95/02697, nebo v publikaci Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559.

Viry se -poté namnoží, izolují a purifikují běžnými metodami molekulární biologie, které jsou odborníkovi známy.

V jiném výhodném provedení předkládaného vynálezu defektní rekombinantní virus je AAV. Adenoasociované viry (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které se trvale a místně-specificky integrují do genomu buněk, které • · • 4 infikují. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by měly jakýkoliv vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Kromě toho se nepodílejí na žádné lidské nemoci. Genom AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje přibližně 4700 baží a na každém konci obsahuje úsek invertované koncové repetice (ITR) velikosti 143 baží, který slouží jako počátek replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou esenciálních částí, které nesou enkapsidační funkce: levá část genomu, obsahující gen rep, který se účastní vírové replikace a exprese virových genů, a pravá část genomu, která obsahuje gen cap, který kóduje proteiny virové kapsidy.

Použití vektorů odvozených z AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v patentové literatuře (viz zejména WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Tyto dokumenty popisují různé konstrukty odvozené z AAV, ve kterých byly geny rep a/nebo cap deletovány a nahrazeny požadovanými geny, a jejich použití pro přenos požadovaných genů in vitro (do buněk v kulturách) nebo in vivo (přímo do organismu) . Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu jsou defektní v celém nebo části úseku Rep a/nebo Cap. Lze je připravit kotransfekcí plazmidů obsahujících sekvence nukleové kyseliny, nebo kombinaci sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu obklopené úseky invertovaných koncových repetic (ITR) z AAV a plazmidu nesoucího enkapsidační geny AAV (cap a rep) do buněk, které jsou infikovány pomocným lidským virem (helper virus), např. adenovirem. Příkladem buněčné linie, kterou lze použít, je buněčná linie 293. Jiné produkční systémy jsou popsány např. v patentových přihláškách WO95/14771, WO95/13365, WO95/13392 a WO95/06743. Rekombinantní AAV takto připravené se pak standardním způsobem purifikují.

V dalším výhodném provedení vynálezu je defektní rekombinantní virus retrovirus, rhabdovirus nebo HSV. Konstrukce rekombinantních vektorů založených na retrovirech • · • · • · literatuře, (1991) 203;

a herpetických virech byla popsána v odborné zejména v Breakfield et al., New Biologist 3 EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Gertet. Eng. 7 (1985)

235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689. Retroviry jsou integrující, se viry, které selektivně infikují dělící se buňky. Představují proto zajímavé vektory pro nádorové aplikace. Genom retrovirů nutně obsahuje dva úseky LTR, enkapsidační sekvence a tři kódující úseky, gag, pol a env. V rekombinantních vektorech odvozených z retrovirů jsou geny gag, pol a env buďto z části nebo zcela deletovány a nahrazeny požadovanou sekvencí heterologní nukleové kyseliny. Tyto vektory lze připravit z retrovirů různých typů, jako je např. zejména MoMuLV (Moloney murine leukaemia virus, Moloneyho myší leukemický virus, také označovaný MoMLV) , MSV (Moloney murine sarcoma virus, Moloneyho myší sarkomový virus), HaSV (Harvey sarcoma

Harveyho sarkomu), SNV (spleen necrosis nekrčrzy sleziny) , RSV (Rous sarcoma virus, sarkomu) nebo Friendův virus.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirů podle předkládaného vynálezu, které obsahují nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresní sekvence obsahující promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE, připraví se plazmid obsahující zejména oba úseky LTR, enkaspidační sekvence a požadovanou nukleovou kyslinu, a pak se transfekuje do tzv. enkapsidační. buněčné linie, která je schopná v trans doplnit retrovirové funkce, které chybí v plazmidů. Takové enkapsidační linie byly popsány v dosavadním stavu techniky, zejména např PA317 (viz US 4,861,719), linie PsiCRIP (viz a linie GP+envAM-12 (viz WO89/07150). Obecně tyto enkapsidační linie jsou schopny exprimovat geny gag, pol a env. Kromě toho rekombinantní retroviry mohou obsahovat změny v úsecích LTR, které vedou k supresi transkripční virus, virus virus, virus virus Rousova linie W090/02806) • · aktivity a nebo rozšířené enkapsidační sekvence, které obsahují část genu gag (Bender et al., J. Virol 61 (1987) 1639). takto připravené rekombinantní retroviry se pak purifikují standardními postupy.

Předkládaný vynález demonstruje možnost použít sekvence. NRSE pro regulaci genové exprese in vivo. Výsledky pokusů uvedených v příkladech této přihlášky ukázaly, že tyto sekvence jsou in vivo vždy aktivní a umožňují expresi transgenu v nervových buňkách aniž by byla exprimovány v buňkách jiného typu.

Předkládaný vynález déle ukazuje, že sekvence NRSE jsou také schopny, v závislosti na jejich uspořádání (a počtu kopií) účinně regulovat aktivitu silného promotoru, což skýtá četné možnosti výhodného použití. Získané výsledky překvapivě ukázaly, že aktivita sekvencí NRSE je zesílena, když jsou tyto sekvence vloženy do vektoru virového původu. Konstrukt takového typu tedy kombinuje zvláště výhodné vlastnosti jako je účinnost přenosu a selektivita exprese.

Předkládaný vynález se také týká jakýchkoliv buněk, které obsahují nukleovou kyselinu podle vynálezu, nebo vektor či virus, které byly definovány výše. Výhodně se jedná o lidské nervové buňky. Může to být buňka, která pochází z trvalé buněčné linie nebo buňka pocházející z primární kultury. Buňky se mohou užít např. k produkci polypeptidů nebo k testování aktivity genů. Také je lze využít v buněčné terapii, kdy se buňky implantují nebo injikují subjektu.

Předkládaný vynález se také týká přípravku, který obsahuje nukleovou kyselinu nebo vektor nebo virus nebo buňku podle předkládaného vynálezu a excipient. Výhodně je přípravek farmaceutický přípravek. pro použití podle předkládaného vynálezu jsou výhodně nukleové kyseliny, vektory nebo buňky kombinovány s jedním nebo několika • ♦ • 4 4 farmaceuticky přijatelnými excipienty, aby mohly být podávány způsobem topickým, zejména stereotaktickým, perorálním, parenterálním, intranasálním, intravenózním, intramuskulárním, subkutáním, intraokulárním, transdermálním atd. Nukleové kyseliny, vektory nebo buňky podle vynálezu jsou výhodně užívány v injikovatelné formě. Tato injikovatelná formy je výhodně zejména sterilní isotonický solný roztok (dihydrogen- nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, horečnatý,draselný nebo vápenatý, nebo směsi těchto solí), nebo jsou to suché, výhodně lyofilizovaé přípravky, které umožňují po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku rekonstituovat injikovatelný roztok.

Ve výhodném provedení se přípravek podle předkládaného vynálezu podává intramuskulárně, výhodně intramuskulární injekcí. Důvodem je, že intramuskulární injekce zcela překvapivě umožňuje dosáhnout podstatného terapeutického účinků díky zpětnému transportu produktu terapeutického genu tvořeného ve svalech. Takže tyto produkty, které odpovídají nukleovým kyselinám podle vynálezu nebo jsou odvozeny z vektorů podle vynálezu, jsou absorbovány na úrovni nervosvalové ploténky (motorického zakončení) a zpětným přenosem prostřednictvím axonu se dostávají do buněčného těla motorických neuronů, tento způsob podávání má navíc výhodu, ' že zabraňuje nežádoucím důsledkům ektopické exprese terapeutických genů při léčení neurologických nemocí. Pokud se užije tato metoda, je možné okamžitě infikovat specificky nervové buňky, aniž by došlo k expresi v injikovaném svalu nebo exkreci produktů do krevního oběhu. Takže tato metoda nepochybně.překonává všechny nedostatky dosavadních terapií způsobované zejména nedostatečným přístupem neurotofických faktorů k motorickým neuronům, velmi krátkým poločasem těchto proteinů a škodlivými vedlejšími účinky, ke kterým docházelo při systémovém podávání těchto produktů. Navíc vzhledem ke snadnému přístupu k místu, které má být injikováno, lze tuto • » • · • · • · » · • · • ·

• · • · metodu výhodně užít pro jakoukoliv nemoc neuronů nebo motorických neuronů.

Množství jednotlivých elementů lze nastavit kompetentním odborníkem ve shodě s předpokládanou aplikací a ,zejména s místem podávání, počtem injekcí, genem, který má být exprimován a očekávanou dobou léčení.

Předkládaný vynález se také týká použití, pro přípravu přípravku pro přenos požadované nukleové kyseliny a její expresi v tkáni nebo nervové buňce, konstruktu, který obsahuj e:

promotor jednu nebo několik sekvencí NRSE, a nukleovou kyselinu uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.

Použití nukleové kyseliny podle vynálezu k přenosu genů in vitro a in vivo, např. při genové terapii, umožňuje omezit ektopickou expresi požadovaných transgenů a zaměřit terapeutický účinek specificky na populaci nervových buněk, zabrání se tím škodlivým, ke kterým by mohlo dojít v důsledku difúze transgenů do organismu. Tento systém může být užit při léčení mnohých poškození, degenerativních nebo traumatických, míchy nebo jiných nemocí centrálních nebo periferních nervů nebo neuropsychiatrické nervové nemoci, při kterých je specificky ovlivněna populace neuronů. V základní neurologii lze tento systém využít k objasnění původu (gliového nebo neuronového) příznaků pozorovaných in vivo nebo in vitro.

Předkládaný vynález se dále také týká použití, pro přípravu přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním požadované nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo nervových buněk, který obsahuje konstrukt, který obsahuje:

• «4

4 4

4 • 44 444 44 • 4 4 · 4 4 4

4 4 4 4 4 promotor jednu nebo několik sekvencí NRSE, a nukleovou kyselinu

Uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.

Předkládaný vynález se dále týká použití výše definovaných vektorů, které obsahují požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, kdy tyto sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.

Použití virových vektorů je založeno na přirozené »

transfekční schopnosti virů (tj. schopnosti infikovat buňku), bylo prokázáno, že tyto vektory jsou zvláště účinné při transfekci. Vektory podle vynálezu se tedy použijí k přenosu požadovaných genů a jejich expresi v nervových buňkách, in vivo, in vitro nebo ex vivo, a to zejména pro účely genové terapie. K expresi požadované, nukleové kyseliny, která je zejména pod kontrolou jedné nebo několika sekvencí NRSE, dochází specificky v nervových buňkách, přičemž ektopická exprese je omezena, tyto vektory jsou proto vhodné k léčení a/nebo prevenci různých nemocí centrálního nebo periferního nervstva nebo neuropsychiatrických nervových nemocí, které ovlivňují nervové buňky, zejména neurodegenerativních onemocnění a různých nemocí míchy, jako příklady takových nemocí lze uvést zejména Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, ataxii míchy a .Huntingtonovu nemoc.

Vektory podle vynálezu lze užít zejména k prevenci a/nebo léčení nemocí motorických neuronů jako je např. amyotrofní laterální skleróza, amyotrofie míchy typu I (Werdnig-Hoffmannova nemoc) a typu II a III (KugelbergWelanderova nemoc) a amyotrofie míšních' uzlin (např. Kennedyho nemoc).

Vektory podle vynálezu jsou zejména vhodné pro léčení • · · ·· 99 ·· ··

9 9 9 9 9 Β • ·· · · · · 9 9 9 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9 a/nebo prevenci těchto nemocí intramuskulárním podáváním. Jak již bylo vysvětleno výše, tento způsob umožňuje dosáhnout motorických neuronů prostřednictvím zpětného transportu.

Přesněji, předkládaný vynález se týká použití, pro přípravu přípravku pro přenos požadované nukleové kyseliny a její expresi v nervové tkáni nebo nervových buňkách, který obsahuje vektor definovaný výše, který obsahuje konstrukt, kde promotor jedna nebo několik sekvencí NRSE, a nukleová kyselina jsou uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.

Dále se předkládaný vynález také týká použití, pro přípravu přípravku k léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním požadované nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo nervových buněk, který obsahuje vektor definovaný výše, který obsahuje konstrukt, kde promotor jedna nebo několik sekvencí NRSE, a nukleová kyselina jsou uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a aktivita promotoru je řízena uvedenou sekvencí nebo sekvencemi NRSE.

Dále. se předkládaný vynález týká způsobu regulace exprese genu in vivo, kterýžto způsob obsahuje vložení sekvencí NRSE do místa proti směru transkripce (upstream) od požadovaného genu a in vivo podání výsledné hokonstruktu a/nebo vektoru obsahujícího tento konstrukt.

Předkládaný vynález bude dále podrobněji popsán formou následujících příkladů, které jsou ilustrativní a vynález nijak neomezují. V těchto příkladech se nejdříve popisuje

99

9 9 9

9 9 9 · 9 9 • 9 9 9

99

9 9 ·

9 99 • 9 99

9 9 9 • 9 99

9 9 9

9 «9 klonování zvětšujícího se počtu sekvencí -NRSE do místa upstream od promotoru genu PGK v plazmidu obsahujícím lucifrázový reportérovy gen a následnou selekci konstruktu, u kterých je exprese luciferázy snížena, když jsou transfekovány jiné buňky než neurony. Pak byly připraveny odpovídající adenovirové konstrukty a testovány in vitro tím, že se infikovaly buněčné linie a primární kultury, a také in vivo po té, co byly myši intramuskulárně injikovány rekombinantním adenovirem. Uvedené výsledky demonstrují výhody nukleové kyseliny podle vynálezu

Popis obrázků

Obr. 1: Schematické znázornění plazmidů, které nesou chimérický promotor podle předkládaného vynálezu

Obr. 2: Studie funkční kapacity plazmidů, která byla provedena transfekcí plazmidů do nervových (PC12, obr. 2B)) a jiných buněk (3T3, obr. 2A) a pak měřením luciferázové aktivity

Obr. 3: Studie funkční kapacity defektního rekombinantního viru in vitro, kdy se měřila luciferázová aktivit a po injekcích:

do jiných než nervových buněk (fibroblasty 373 potkana, obr. 2A) nervových buněk (feochromocytom PC12 potkana, obr. 3B) primární kultury jiných než nervových buněk, neonatálních ledvinných buněk potkana (obr. 3B), primární kultury nervových buněk, neonatálních horních krčních nervových ganglií (obr. 3D),

9 ·

9 « 9

9 • 9· ·

9 99

9 9 9 • 9 9 9

99

99 • * 9 «

9 99

9 9 «

9 9 9

9 99 • 9 99 primární kultury jiných než nervových buněk, primární kultury astrocytů pocházejících z embrya potkana (obr. 3E), primární kultury nervových buněk, infekce primární kultury kortikálních neuronů z embrya potkana (obr. 3F) .

Obr. 4: Studie funkční kapacity defektního rekombinantního viru in vivo, , kdy myš byla injikována intramuskulárně a pak byla měřena .luciferázová aktivita.

Obr. 5: Studie funkční kapacity defektního rekombinantního viru in vivo, kdy myš byla injikována intramuskulárně do svalu jazyka a pak byla měřena luciferázová aktivita.

Obr. 5A: Měření aktivity luciferázy ve svalu jazyka 8. a 35. den.

Obr. 5B: Měření aktivity luciferázy v buňkách nervového systému (prodloužená mícha) 8 a 35. den.

Příklady ppovedení vynálezu

Materiály a metody použité v následujících příkladech

Buněčné linie a primární kultury

Buňky získané z linie feochromocytomu potkana (PC12) byly kultivovány v médiu RPMI .1640 (Gibco) obsahujícím 15 % telecího fetálního séra (FCS) (Boehringer). Buňky získané z linie fibroblastů 3T3 potkana byly kultivovány v Eagleho médiu modifikovaném Dulbeccem (DMEM) s přídavkem 10 % telecího fetálního séra. Kultury buněk horních krčních nervových uzlin (SCG) získaných z novorozených potkanů Wistar • · ·* ·· • ·· · · ·· · • · ·· · · ·· • · · · · · · · · • · · · · · · · ·· ·· ·· ♦· ·· ·· • φ · » • · · · • · · · • · · · ·· ·· (Iffa-Credo) starých 1 až 2 dny, kdy buňky byly disociovány pomocí. 3 mg/ml dispázy (Boehringer) a pak naneseny na destičky, které byly předem potaženy kolagenem získaným z ocasu potkana. Buňky byly kultivovány v 0,5 ml Leibovitzova média L-15 (Gibco), které bylo .pufrováno bikarbonátem a obsahovalo různé faktory včetně 70 ng/ml NGF (nervový růstový faktor), 5% sérum dospělého potkana a ΙΟμΜ cytosinarabinofuranosid.

Primární kultury ledvinných buněk byly připraveny tak, že ledvinná tkáň ' z novorozených potkanů Wistar (Iffa-Credo) starých 1 až 2 dny byla disociována trypsinem. Buňky pak byly přeneseny na destičky do 10 % FCS, aby se umožnilo jejich dělení až do okamžiku použití k infekci.

Kultury kortikálních buněk byly získány z embryí potkanů kmene E17 Sprague-Dawley(Iffa-Credo) . Buňky byly' získány pitvou a mechanicky disociovány a pak byly kultivovány v médiu DMEM obsahujícím transferin 100 μς/πιΐ, inzulín 25 μ9/ιη1, putrescin 10^g/ml, selenit sodný 5 ng/ml, progesteron 6,3 ng/ml a 2mM glutamin (Sigma).

Primární kultury astrocytů byly odvozeny z kortikální tkáně embryí potkanů (E17, Sprague-Dawley) a kultivovány v médiu DMEM obsahujícícm 10 % FCS a v atmosféře 10% CO₂/90% vzduch.

Experimenty in vitro

Pro experimenty s přechodnou expresí byl milion buněk transfekován elektroporací pomocí systému firmy Bio-rad, při 960 μΕ a 190 V v případě buněk PC12, nebo 250 V v případě buněk 3T3, a sice 6 μg každého z testovaných plazmidů, 7 μg plazmidu Bluescript(Stratagene) a 2 gg kontrolního vektoru pCAT (Promega), který kóduje chloramfenikolacetyltransferázu (CAT), což umožňilo monitorování transfekce.

00

0 0 0

0.00 ·

0 0 ·

0 0 0

00 • 0

0 0 0

0 00

0 0 0 · • 0 0 0

00

0tt 00

0 0 0 • 0 0· * 0 0 0

0 0 0

00

Buněčné kultury byly transfekovány tak, že· kultivační médium bylo nahrazeno médiem bez séra, které obsahovalo virovou suspenzi s MOI přibližně 200 pfu (plaky tvořící jednotky) a inkubovaly se 45 minut. Pro každý konstrukt (plazmid nebo adenovirus) byly stanoveny 3 hodnoty luciferázové aktivity ze 3 různých jamek. Pro každý virový konstrukt se infekční experimenty opakovaly dvakrát vždy s užitím jiného zásobního roztoku viru.

hodin po elektroporaci nebo infekci byly buňky sklizeny do 200 μΐ lyzovacího pufru následujícího složení: 25 mM Tris/fosfát, pH 7,8, 0,08 mM luciferin; 0,1 mM ATP, mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 15% glycerol a 1% Triton. Luciferázová aktivita byla měřena luminometrem LUMAT LB9501(Berthold). V případě transfekovaných buněk byl k lyzovacímu pufru přidán 1% hovězí sérový albumin (BSA) a aktivita byla standardizována na základě aktivity CAT, která byla měřena kapalinovou scintilační metodou. V případě rekombinantních adenovirů byla . luciferázová aktivita standardizována pomocí koncentrace proteinu v buněčném extraktu, která byla stanovena pomocí -systému Bio-rad (BioRad Laboratories).

Experimenty in vivo

Samci myší kmene C57B16(Charles River) ve stáří 6 měsíců byly podrobeni anestezi směsí Rompun(Bayer)/Ketamine (UVA) a konstrukt Ad-NRSE-PGK-luc byl pomalu injikován (2,5 μΐ/ml) do jazyku (10⁹ pfu/4x2.5 μΐ) a do lýtkového svalu v dávce 2.10⁹ pfu/sval (30 μΐ) . Myši byly v období od 7. do 35. dne po infekci utraceny pentobarbitalem (Sanofi). Byly vyjmuty prodloužená mícha, jazyk a lýtkový sval pro měření aktivity luciferázy. prodloužená mícha byla disociována mechanicky ve 200 μΐ lyzovacího pufru. Sval a jazyk byly disociovány ·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · • 0 00 • ·

0 0· *

0 00 0

0 0 0 0 0

0 0 · · • 0 ·· ·· pomocí polytronu DIAX 900 (Heidolph) v 1 a 2 ml lyzovacího pufru (v uvedeném pořadí).

Příklad 1

Konstrukce chimérických promotorů a plazmidovýcgh vektorů

Cílem tohoto příkladu je popsat přípravu chimérických promotorů a konstrukci plazmidových vektorů, které obsahují právě tyto promotory.

Plazmid pPGK-Luc obsahuje gen Luc pod kontrolou všudypřítomného eukaryotického promotoru PGK. Pro získání plazmidu pPGK-Luc byl fragment velikosti 500 bp myšího promotoru PGK vložen do komerčního plazmidu pUT 103 (CAYLA FRANCE), který obsahuje luciferázový reportérový gen fúzovaný se zeocinem a polyadenylačni sekvencí SV40 v časné konfiguraci (PolyA) .

V dalším kroku byla vložena jedna nebo dvě, tři, šest a dvanáct kopií sekvenceNRSE z genu SCG10 (TTCAGCACCACGGAGÁGTGCC, sekvence id. č. 1) [2] v antiparalelní konfiguraci do polohy proti směru transkripce (upstream) od promotoru PGK. Pro tento účel byl zkonstruován fragment velikosti 26 bp obsahující sekvenci NRSE obklopenou dvěma místy Mlul, a sice hybridizací dvou odpovídajících oligonukleotidů. Tento fragment byl vložen v jedné nebo několika kopiích do Mlul místa pPGK-Luc, čímž vznikly plazmidy obsahující 1, 2 a 3 kopie NRSE sekvence. Plazmid obsahující 6 sekvencí NRSE byl získán z plazmidu obsahujícího 3 kopie (pNRSE3-PGK-Luc) následující strategií: fragment BamHI/XhoI obsahující 3 kopie NRSE byl vyjmut z pNRSE3-PGKLuc a vložen do místa Xhol v pNRSE3-PGK-Luc, čímž vznikl p6NRSE-PGK-Luc. Podobně byl plazmid obsahující 12 kopií NRSE

• 4 44

4 4 ·

4 4·

4 4 4

4 4 4 . ··

44

4 4 4

4 ·4

4 4 4 4 • ·4 4

44 ·· ·4 4

4 4 4

4 4 4 ·

4 4 4

44 připraven z plazmidu obsahujícího 6 kopií (p6NRSE-PGK-Luc) tak, že do p6NRSE-PGK-Luc bly vloženy dvě kopie fragmentu BamHI/XhoI.

Nakonec expresní kazeta PGK(s nebo bez NRSE)-Luc-PolyA z různých plazmidů popsaných výše byla vložena do ITR levé části adenoviru (invertovaná terminální repetice, replikační počátek) a sekvenci kódující polypeptid IX (virový kapsidový protein) kyvadlového plazmidu, který může být užit ke konstrukci defektních rekombinantních virů (obr. 1).

Je jasné, že stejný postup lze užít ke konstrukci dalších plazmidů, které obsahují 1 až 50 kopií motivu NRSE kombinovaných s všudypřítomným promotorem odlišným od PGK, pod jehož kontrolu lze vložit jakýkoliv transgen.

Příklad 2

Funkční analýza provedená transfekcí buněčných linií

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že plazmidové konstrukty obsahující chimérický promotor se sekvencí NRSE jsou funkční a umožňují buněčnou expresi požadovaného genu.

Plazmidové konstrukty popsané v příkladu 1 byly testovány přechodnou transfekcí (elektroporací) linie nervových buněk PC12 (feochromocytom potkana) a 3T3 (fibroblasty potkana). Výsledné hodnoty lucifrázové aktivity byly standardizovány vzhledem k aktivitě CAT (chloramfenikoltransferázy), která byla měřena v roztoku obsahujícím 125 mM tris-fosfát, pH 7,8, 125 μΜ chloramfenikol a 0,12 μΜ radioaktivně značený acetylkoenzym A. Test byl proveden, po inkubaci ve 37 °C po 1 hodinu, po přidání scintilační kapaliny Econofluor pomocí počítače KONTRON. Hodnoty luciferázové aktivity byly stanoveny pro každý

0

0 0 · 0 0 • · · 0 0 · 0 0 0 · 0

0 0 0 ·· plazmidový konstrukt, a získané průměrné hodnoty a střední chyby jsou uvedeny na obr. 2.

Získané výsledky ukázaly, že konstrukty obsahující 6 a 12 kopií NRSE byly schopny snížit expresi luciferázy o 66 a 82 % v buňkách jiných než nervových (3T3), což je snížení exprese řádu téměř logaritmu ve srovnání konstruktem pPGKLuc. Výsledky . také ukázaly, že přítomnost motivu NRSE v nervových buňkách PC12 nesnižuje expresi luciferázy a ve skutečnosti je dokonce schopní ji zvýšit. Statisticky významné zvýšení v rozsahu 25 % mezi bylo pozorováno při srovnání pl2NRSE-PGK-Luc a pPGK-Luc.

Výsledky tedy prokázaly, že plazmidové . konstrukty obsahující chimérický promotor se sekvencemi NRSE jsou funkční a dovolují buněčnou expresi požadovaného genu výlučně v nervových buňkách, zatímco exprese genu je v jiných než nervových buňkách významně inhibována.

Příklad 3

Konstrukce defektních rekombinantních virů

Cílem tohoto příkladu je popsat přípravu chimérického promotoru a konstrukci virových vektorů, které obsahují konkrétně tyto promotory.

K provedení této studie in vitro a in vivo byly připraveny tři odpovídající adenovirové konstrukty: Ad-PGKLuc, Ad-6NRSE-PCK-Luc a AD-12NRSE-PGK-Luc. tyto rekombinantní viry byly zkonstruovány pomocí odborníkovi známých technik, a to tak, že se kotransfekoval kyvadlový plazmid popsaný v příkladu 1 a defektní genom adenoviru typu 5 do enkapsidační linie (buňky 293). Kyvadlový plazmid byl nejdříve linearizován restrikčním štěpením v místě FspI a pak

9 9 9

9 · 9

9 9 9

9 9 9 ·

9 9 9

9 99 ·· • · · 9 • 9 <9 • · · · • · · · ·· ·· • 9 • ·· • 9 • 9

9· byl kotransfekován společně s dlouhým fragmentem adenoviru štěpeného Clal do buněk 293 metodou kalciumfosfátové precipitace DNA.

Enkapsidované rekombinantní genomy pak byly purifikovány standardními postupy, zejména plakovou purifikační technikou. Integrovaný fragment byl pak ověřen analýzou restrikčních fragmentů a pomocí PCR. byl připraven virový zásobní, roztok namnožením rekombinantního adenoviru na buňkách 293 a pak ultracentrifugací zejména na gradientu chloridu česného, a purifikací na purifikační koloně se Sephadexem G25M (Pharmacia). Virové titry byly stanoveny měřením opické hustoty a dodatečně byly ověřeny plakovou metodou. Všechny zásobní roztoky viru měly titr přibližně 2 x 10⁸ pfu/μΐ.

Příklad 4

Funkční analýza in vitro

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že virové konstrukty uvedené v příkladu 3, které obsahují chimérický promotor se sekvencemi NRSE, jsou funkční a umožňují řídit promotor v různých typech buněk.

Tři adenoviry zkonstruované v příkladu 3 byly testovány in vitro tak, že byly infikovány buněčné linie a primární kultury dávkami 20 a 200 pfu/buňka. Měření byla provedena s 50 μΐ supernatantu, jak bylo popsáno výše, a standardizována vzhledem k množství celkového proteinu, který byl stanoven pomocí soupravy Bio-rad ke stanovení proteinu (Bio-Rad). Prokaždý adenovirus byly stanoveny 3 hodnoty aktivity luciferázy v různých jamkách. Získané průměrné hodnoty a střední chyby jsou uvedeny na obr. 3 pro buněčné linie a na obr. 4 pro primární kultury.

99

9 9 · • · ··

9 9

9 9 • · · · • * ·*

Když byly užity rekombinantní adenoviry Ad-6NRSE-PGK-Luc a Ad-12NRSE-PGK-Luc, exprese luciferázového reportérového genu byla snížena o 97 % a 99 %, v uvedeném pořadí, v buněčné linii jiných než nervových buněk (fibroblasty 3T3).

V linii nervových buněk PC12 byla pozorovaná luciferázová aktivita dvou adenovirů obsahujících sekvence NRSE vyšší než u adenovirů Ad-PGK-Luc. Podobně také luciferázová aktivita získaná se 3 adenovirovými konstrukty je podobná po infekci primárních kultur buněk horních'krčních ganglií (SCG) z novorozených potkanů (jednofaktorová globální analýza rozptylu ANOVA neukázala žádný významný rozdíl mezi skupinami). Na druhé straně exprese luciferázy byla snížena o 91 % až 98 % po infekci primárních kultur ledvinných buněk z noivorozených potkanů konstrukty rekombinantních adenovirů Ad-6NRSE-PGK-Luc a Ad-12NRSE-PGK-Luc, což je pokles v řádu 2 logaritmů exprese řízené PGK v přítomnosti 12 kopií NRSE.

Když byly tři konstrukty užity k infekci astrocytů a nervových buněk získaných z kortexu 17denních embryí' potkana, ukázalo se, jak se dalo čekat, velmi významné snížení luciferázové aktivity (10 x) u astrocytů v případě konstruktů obsahujících 6 enbo 12 sekvencí NRSE (obr. 3E) , což potvrdilo předchozí výsledky. Jak se také očekávalo, luciferázová aktivita všech třech výše zmíněných virových konstruktů byla srovnatelná v buňkách kortexu (obr. 3F).

Tyto výsledky jsou zejména překvapující a pozoruhodné, neboť demonstrují, že (I) chimérické promotory podle předkládaného vynálezu jsou funkční v primárních kulturách, (II) promotory jsou funkční ve virovém kontextu a (III) represorová aktivita je vyšší v adenovirovém kontextu než v odpovídajícím plazmidovém vektoru (srovnej obr. 2a 3)

Takže tento příklad ukázal, že virové konstrukty obsahující chimérický promotor, který obsahuje sekvence NRSE, jsou funkční a umožňují buněčnou expresi požadovaného genu «♦ • · · · • 0 ·0 • 0 · ·

0 0 ·

0»

0* 00 • 0 « • · 00 • 0 0 · · «0 ·« výlučně v nervových buňkách, zatímco v jiných než nervových buňkách je exprese významně inhibována.

Příklad 5

Funkční analýza in vivo

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že virové konstrukty popsané v příkladu 3 obsahující chimérický promotor, který obsahuje sekvence NRSE, jsou funkční a dovolují kontrolu promotoru in vivo.

Vzhledem k velmi povzbudivým výsledkům v příkladu 4 byla aktivita konstruktů podle předkládaného vynálezu testována in vivo měřením exprese luciferázy po intramuskulární injekci (lýtkový sval a sval jazyku) těchto 3 rekombinantních adenovirů do myší.

5.1. Injekce do lýtkového svalu

Každý adenovirový konstrukt byl injikován ve 3 stadiích do pravého lýtkového svalu 7 myší v dávce 2 x 10⁹ pfu/sval a objemu 30 μΐ. Injikovaný sval byl vyjmut 7 dnů po injekci a disociován v 1 ml pufru, aby bylo možné stanovit luciferázovou aktivita, která byla měřena ve 150 μΐ supernatantu. Průměrné hodnoty a střední chyby získané ze 7 měření, vztažené k hodnotě celkového proteinu, jsou uvedeny na obr. 5.

Výsledky ukazují, že 'když byly užity rekombinantní adenoviry Ad-6NRSE-PGK-Luc a Ad-12NRSE-PGK-Luc, exprese luciferázy byla snížena o 90 % a 96 % jeden týden po injekcích.

Exprese luciferázy po intramuskulární injekci Ad-12NRSEΦ

Φ

Φ • Φ ·· • · * • · ·· • φ φ • · φ ·· φφ ·· φφ • · φ • · *· • · · • · · ·· *· •φ φφ • φ · • φ φ • 4 9

Φ Φ

Φφ ΦΦ

PGK-Luc a Ad-PGK-Luc byla u myší porovnávána v delším časovém období. Když byl užit konstrukt Ad-12NRSE-PGK-Luc, aktivita byla vždy snížena jeden měsíc (95 %) a tři měsíce (91 %) po injekcích.

5.2. Injekce do svalu jazyka jeden týden po podání aktivita byla snížena o 90 Ad-12NRSE-PGK-Luc ve konstruktem Ad-PGK-Luc

Bylo využito zpětného transportu, aby bylo možné srovnat expresi dvou konstruktů Ad-PGK-Luc and Ad-12NRSE-PGK-Luc v prodloužené míše a ve svalu jazyka u myší injikovaných intramuskulárně do jazyka.

Srovnatelně s výsledky již získanými, luciferázové aktivity dvou konstruktů v nervovém systému byly podobné (obr. 5B) . Naopak, luciferázová % ve svalu injikovaném konstruktem srovnání se svalem injikovaným (obr. 5A) . Tato represe se udržuje nejméně 35 dní po infekci. Je zajímavé, že i přes to, že hladina exprese po 35 dnech je .nižší než hladina 8 dní po infekci, rozdíly v expresi mezi uvedenými virovými konstrukty zůstávají velmi významné.

Uvedené výsledky tedy znovu potvrdily, že konstrukty podle předkládaného vynálezu jsou funkční in vivo a demonstrovaly represní účinek, který byl dokonce větší než účinek pozorovaný in vitro po transfekci plazmidu do buněk jiných než nervových.

Výsledky dále prokázaly vysokou účinnost konstruktů podle předkládaného vynálezu in vivo ve směrování exprese požadovaného genu do nervových buněk. Použití vynálezu v genové terapii umožňuje omezit ektopickou expresi požadovaného transgenů a zabránit tak škodlivým vedlejším účinkům, které mohou vznikat v důsledku difúze transgenů v organismu.

• ·

CITOVANÁ LITERATURA [1] Moři N., Stein R., Sigmund O. and Anderson D.J.

Neurone, 4: 583-594 (1990) [2] Moři N., Schoenherr C., Vandenbergh D.J. and Anderson D.J. Neurone, 9: 45-54 (1992) [3] Li L., Suzuki T., Moři N. and Greencard P.

PNAS USA, 90: 1460-1464 (1993) [4] Schoenherr C.J., Paquette A.J. and Anderson D.J.

PNAS USA, 93: 9981-9886 (1996) [5] Schoenherr C.J. and Anderson D.J.

Science, 267: 1360-1363 (1995) [6] McBurney, Sutherland, Adra, Leclair, Rudnicki, Jardine

Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 20: 5755-5761 (1991) [7] Moullier P., Marechal V., Danos O. and Heard J.M. Transplantation, 56: 427-432 (1993) [8] McDonald R.J., Lukason M.J., Raabe O.G., Canfield D.R., Burr E.A., Kaplan J.M., Wadsworth S.C. and St George

J.A. Hum. Gene Ther., 8: 411-422 (1997) [9] Maue R.A., Kraner S.D.. Goodman R.H. and Mandel G. Neurone, 4: 223-231 (1990) [10] Bessis A., Champtiaux N., Chatelin L. and Changeux J.P. PNAS USA, 94: 5906-5911 (1997).

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 1: Sekvence motivu NSRE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENí: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 2: kanonická sekvence motivu NRSE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) . DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

TTCAGCACCA CGGACAGCGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 3: Obecná sekvence motivu

NRSE (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

NNCAGCACCN NGGANAGNNN C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č.. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 , (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ.: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:

TTCAGCACCG CGGACAGTGC C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

TTCAGCACCT CGGACAGCAT C 21

9 9 9 · ♦ · · 9 · 9 9 • ••9 99 99 999« (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (iv) ANTI-SENSE: Ne (ix). DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: ODS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

TTCAGCACCG CGGAGAGCGT C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 21 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY:	cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	Ne

(iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

TCCAGCACCG TGGACAGAGC C 21 • φφ • · φ · Φ · · · · · · 9 · « • Φ Φ Φ · · · · · · · Φ

ΦΦ ΦΦ Φ· ΦΦ Φ· ΦΦ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 21 párů baží TYP: nukleotidy TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: Ne
(ix)	(iv) ANTI-SENSE: Ne DALŠÍ ZNAKY: (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21

(xi) POPIS .SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:

TTCAGCACCG AGGACGGCGG A 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleotidy
(C) (D)	TYP VLÁKNA: jednoduché
TOPOLOGIE:	: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY:	cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	Ne

(iv) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

ATCAGCACCA CGGACAGCGG C 21 • ·· · · · · · · · · · · · • · · · - · ·· · · · · · • · ·· ·· · · · · ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleotidy (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: Ne (ív) ANTI-SENSE: Ne (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

TTCAGCACCT AGGACAGAGG C 21

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rekombinantní nukleová kyselina, která obsahuje:

promotor, jednu nebo několik sekvencí NRSE a terapeutický gen uspořádané tak, že exprese terapeutického genu je řízena promotorem a přitom aktivita promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE.
2. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, kde promotor je eukaryotický nebo virový promotor, který je aktivní v nervových buňkách nebo tkáni.
3. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 2, kde promotor je všudypřítomný eukaryotický promotor, který je nervově specifický nebo je specifický pro jeden typ nervových buněk.
4. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 3, kde promotor je z genů základního metabolismu.
5. Rekombinantní nukleová . kyselina podle nároku 4, kde promotor je vybrán ze skupiny obsahující promotory genu PGK, Efla, β-aktinu, vimentinu, adolázy A a al-antitrypsinu.
6. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, kde promotor je silný promotor.

·· 9· 99 99

9 9 9 9 · · ·

9 999 9 999

9 9 9 9 · 9 9 9

9 99 · · * · ·

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 · 9
7. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje 1 až 20, výhodně 3 až 15, sekvencí NRSE.
8. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 7, která obsahuje 3, 6 nebo 12 sekvencí NRSE.
9. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 8, kde sekvence NRSE obsahuje celou nebo část sekvence id. č. 3, ve které N je A, G, C nebo T.
10. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 9, kde sekvence NRSE je část nebo celá sekvence vybraná ze skupiny obsahující sekvence id. č.l, 2 a 4 až 11 a varianty těchto sekvencí.
11. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z předchozích nároků, která obsahuje buďto shodný motiv nebo variantu motivu podle nároku 9 nebo 10, přičemž tento motiv se několikrát opakuje.
12. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde . sekvence NRSE . je umístěna/jsou umístěny proti směru transkripce od promotoru.
13. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, kde terapeutický gen je nukleová kyselina, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující RNA nebo terapeutický nebo vakcinační polypeptid.
14. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 13, kde terapeutický gen je nukleová kyselina, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující trofický faktor.

's

9 9

9 9

99 99

9 9 9 9

9 9 99

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99 9 9
15. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 13, kde terapeutický gen je nukleová kyselina, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující antioxidant.
16. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 1, která kromě sekvencí NRSE obsahuje regulační elementy.
17. Regulační element podle nároku 16, kterým je systém tetracyklinového operátoru/represoru.
18. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16,
19. Vektor podle nároku 18, který je virový vektor.
20. Defektní rekombinantní virus, který obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, kteréžto expresní sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.,

21. Virus podle nároku 20, který je adenovirus. 22 . Virus podle nároku 20, který je AAV. 9 23. Virus podle nároku 20, který je retrovirus. • 24 . Virus podle nároku 20, který je rhabdovirus
25. Buňky, které obsahují nukleovou kyselinu podle nároku 1 nebo vektor podle nároku 18 nebo virus podle nároku 20.

9 9 9 9

9 9 9

9 9

99 99 • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

99 99
26. Buňky podle nároku 25, které .jsou savčí nervové buňky.
27. Použití konstruktu, který obsahuje promotor, jednu nebo několik sekvencí NRSE a nukleovou kyselinu uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a přitom aktivita promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE, k výrobě přípravku pro přenos nukleových kyselin a jejich expresi v nervových buňkách nebo tkáni.
28. Použití konstruktu, který obsahuje promotor, jednu nebo několik sekvencí NRSE a nukleovou kyselinu uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a přitom aktivita promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE, k výrobě přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo buněk.
29. Použití defektního rekombinantního viru, který obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu pod kontrolou expresních sekvencí, přičemž expresní sekvence obsahují promotor a jednu nebo několik sekvencí NRSE.
30. Použití podle nároku 29 k přenosu genu a jeho expresi v nervových buňkách in vivo, in vitro a ex vivo.

00 00 00 ·· ·· 00 0··· 0 00 0 0 00 0 0 000 0 000 0 000

0 00 000 00 000 00 0
31. Použití vektoru, který obsahuje konstrukt, ve kterém jsou promotor, jedna nebo několik sekvencí NRSE a nukleová kyselina uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a přitom aktivita promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE, k výrobě přípravku pro přenos nukleové kyseliny a její expresi v nervové tkáni nebo buňkách.
32. Použití vektoru, který obsahuje konstrukt, ve kterém j sou promotor, jedna nebo několik sekvencí NRSE a nukleová kyselina uspořádané tak, že exprese nukleové kyseliny je řízena promotorem a přitom aktivita promotoru je řízena sekvencí (sekvencemi) NRSE,

k výrobě přípravku pro léčení nemocí motorických neuronů intramuskulárním podáváním nukleové kyseliny do nervové tkáně nebo buněk. • 33. Použití podle nároku 31 nebo 32, kdy vektor je virus. 34. Přípravek v y z n a č u j ící s e t í m, že obsahuj e nukleovou kyselinu podle nároku 1 nebo vektor podle

nároku 18 nebo virus podle nároku 20.
35. Přípravek podle nároku 34 vyznačující se tím, že je formulován pro intramuskulární podávání, výhodně pro podávání intramuskulární injekcí.

0 0 0

0 0 • 0 0

0 0 0

0 0 • 0 0« ♦ 0 · 0

0 0 00 • ·0 0 0

0 0 0 0

00 00 • 0

00 00

0 0· 0

0 0 0 0

0 0 0 0 4

0 0 4 4

04 00
36. Chimérický promotor, který obsahuje všudypřítomný promotora jednu nebo několik sekvencí NRSE.
37. Chimérický promotor xNRSE-PGK, kde x je celé číslo od 1 do 50.