JP2003524391A

JP2003524391A - アストロサイト、その製造およびその使用

Info

Publication number: JP2003524391A
Application number: JP2000592397A
Authority: JP
Inventors: リデ，ジヤン−リユク; マレ，ジヤツク
Original assignee: アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date: 1999-01-05
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2003-08-19
Also published as: HUP0105066A2; EP1141241B1; WO2000040699A2; DE60039579D1; US6943016B1; KR20020013487A; CN1340098A; IL143382A0; WO2000040699A3; CA2355967A1; ATE402253T1; AU2315100A; EP1141241A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なヒト成人アストロサイト調製物およびその製造方法を提供する。その精製されたアストロサイトは、神経変性障害または中枢神経系の外傷の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、神経生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、精製された
ヒト成人アストロサイト、その製造方法、およびその使用、特に、神経変性障害
または中枢神経系の外傷の治療のための使用に関する。

【０００２】（発明の背景）アストロサイト細胞移植と遺伝子導入技術との組合せは、神経変性疾患および外傷性損傷に対
する治療アプローチを提供する。いくつかの細胞型、例えば前駆細胞、ニューロ
ン、グリア細胞、線維芽細胞および筋芽細胞が、中枢神経系（CNS）への遺伝子
送達用の運搬手段として研究されている（Wolffら, 1989; Horellouら, 1990a,b
; Fisherら, 1991, 1993, Gageら, 1995; Sabateら, 1995; Fisher, 1997; Mart
inez-SerranoおよびBjorklund, 1997）。遺伝的に操作されたアストロサイトの
治療活性が特に注目されている（Cunninghamら, 1991, 1994; La Gammaら, 1993
; Castilloら, 1994; Pundtら, 1995; Lundbergら, 1996; Linら, 1997）。アス
トロサイトは、正常なCNS構成成分であり、効率的な分泌機構を備えており、ニ
ューロンの生存、分化および再生を促進する栄養因子の放出によりニューロンを
支持するため、アストロサイトは、特に、脳の修復のための標的とされている。
さらに、それを培養内で成長させ、遺伝的に操作して、外来性トランスジーンを
発現させることができる。最近、合法的流産から得られたヒト胎児アストロサイ
トが培養され、活性なNGFの発現を駆動するレトロウイルスがそれに首尾よく導
入されている（Linら, 1997）。

【０００３】ヒト成人アストロサイトは、免疫拒絶および免疫抑制剤の副作用が回避される
よう自己エクスビボ遺伝子導入を可能にするため、ヒトの脳の修復に、より適し
ている。ヒト成人アストロサイトの培養を試みた最近の研究において、ミクログ
リア細胞の混入が報告された（Yongら, 1991, 1992）。

【０００４】遺伝子治療エクスビボ遺伝子治療は、患者への治療用細胞の送達を伴う（Wolffら, 1989;
Horellouら, 1990a,b; Fisherら, 1991, 1993, Gageら, 1995; Sabateら, 1995
; Fisher, 1997; Martinez-SerranoおよびBjorklund, 1997; Taylor, 1997）。
遺伝子治療用の不死化細胞系の使用は、限られた価値しか有していない。なぜな
ら、該細胞系は腫瘍形成性を保有しているからである。これとは対照的に、初代
培養細胞は、より適している。エクスビボ遺伝子導入およびそれに続く移植のた
めの最も優れた細胞型の1つはアストロサイトであり（La Gammaら, 1993; Casti
lloら, 1994; Cunninghamら, 1994; Ridouxら, 1994; Pundtら, 1995; Lundberg
, 1996; Linら, 1997）、これは、効率的な分泌機構を備えた主要支持細胞とし
てCNS内に通常存在する。酵素、神経伝達物質または栄養因子を産生するように
予め修飾され移植されたアストロサイトは、CNS内で統合され安定に機能しうる
（Taylor, 1997中の参照文献を参照されたい）。ラット初代培養アストロサイト
は、NGFおよびBDNFを産生し脳内移植後に生存するように遺伝的に操作されてい
る（Cunninghamら, 1991, 1994; Yoshimotoら, 1995）。

【０００５】最近、ヒトアストロサイトに対する関心が高まってきている（Yongら, 1991,
1992; Aloisiら, 1992; PerzelovaおよびMares, 1993; Pundtら, 1995; Linら,
1997）。Yongら（1992）は、初代培養細胞の80％までがマクロファージ／ミクロ
グリア細胞であったと報告している。オリゴデンドロサイトおよびミクログリア
細胞のほとんどが除去された後、該細胞の70％がアストロサイトであった（Yong
ら, (1992)）。アストロサイト培養物内のミクログリア細胞の存在は、インビト
ロおよびインビボの両方において、望ましくない作用を引き起こしうる。なぜな
ら、該細胞は活発に増殖し、免疫細胞集団の主要成分であるからである。したが
って、混入ミクログリア細胞を含有しないアストロサイトの集団の製造方法が必
要とされている。本発明は、後記のとおり、この要求について検討するものであ
る。本発明は、アストロサイトの不純調製物の欠点を克服し、CNSの外傷の治療
および神経変性障害（例えば、パーキンソン病、ハンチントン病またはアルツハ
イマー病）の治療に適した細胞調製物を提供する。

【０００６】本明細書中のいずれの参照文献の引用も、そのような参照文献が本発明の「先
行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。

【０００７】（発明の概要）本発明は、精製されたアストロサイト、およびその製造方法を提供する。好ま
しい実施形態においては、該アストロサイトはヒト成人アストロサイトである。

【０００８】したがって、本発明は、a）アストロサイトの調製物を培養容器に導入し、b）
工程a）からのアストロサイトを、該培養容器への該アストロサイトの付着を可
能にする条件下でインキュベートし、c）工程a）の開始から約48時間の時点で該
培養容器に付着していない細胞を除去することを含んでなる、実質的に純粋なア
ストロサイト集団の製造方法を提供する。「実質的に純粋」であるは、該細胞集
団の少なくとも75％がアストロサイトである、好ましくは、少なくとも85％がア
ストロサイトである、より好ましくは、少なくとも約95％がアストロサイトであ
る、最も好ましくは、約98％以上がアストロサイトであることを意味する。「約
」なる語は、与えられた値または範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好
ましくは約5％以内を意味する。「培養容器」は、培養皿またはフラスコを含む
（これらに限定されるものではない）、細胞の付着および成長に適した任意の支
持体でありうる。

【０００９】好ましい実施形態においては、該アストロサイトはヒトアストロサイトである
。より好ましくは、それはヒト成人アストロサイトである。

【００１０】本発明に従い製造されたアストロサイトは、ミクログリア細胞を実質的に含有
しない。すなわち、ミクログリア細胞の存在は、OX42免疫染色およびグリフォニ
ア・シンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）由来のB₄イソレクチンで
の標識により検出されない。

【００１１】本発明の方法の1つの態様においては、外因性核酸を該アストロサイト内に導
入することができる。該核酸は、ウイルスベクター、リン酸カルシウム沈殿、リ
ポソーム媒介トランスフェクション、陽イオン脂質トランスフェクションまたは
リポポリアミン媒介トランスフェクションにより該アストロサイト内に導入する
ことができる。好ましくは、該核酸は神経活性（neuroactive）物質をコードし
ている。

【００１２】本発明はまた、実質的に純粋なアストロサイト集団を提供する。好ましくは、
該アストロサイトはヒトアストロサイトである。より好ましくは、それはヒト成
人アストロサイトである。本発明に従い製造されたアストロサイト集団は、ミク
ログリア細胞を実質的に含有しない。

【００１３】本発明の1つの態様においては、アストロサイト集団は外因性核酸を含む。好
ましい実施形態においては、該核酸は神経活性物質をコードしている。該核酸は
DNAまたはRNAでありうる。1つの態様においては、該核酸は、タンパク質、ポリ
ペプチドまたはペプチドをコードするDNAである。該タンパク質、ポリペプチド
またはペプチドは、増殖因子、神経栄養因子または酵素でありうる。あるいは、
該核酸は、アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードするDNAでありうる。好ま
しい実施形態においては、該核酸は、調節（regulatable）プロモーター、誘導
プロモーター、神経細胞特異的プロモーターまたはウイルスプロモーターを含む
調節領域に作動的に結合している。

【００１４】本発明はまた、実質的に純粋なアストロサイト集団を含んでなるインプラント
を提供する。本発明は更に、神経活性物質をコードする外因性核酸を含む実質的
に純粋なアストロサイト集団を含んでなる組成物を提供する。

【００１５】これらの及び他の目的を本発明で検討する。本発明は、添付図面および以下の
詳細な記載および実施例において更に詳しく説明される。

【００１６】（図面の簡単な記載）図1：ヒト成人大脳皮質からの初代培養。

【００１７】（A）低倍率（×70）のヒト成人アストロサイト初代培養を示す位相差顕微鏡
写真。（B）高倍率（×560）の終期分裂扁平細胞。

【００１８】図2：ヒト成人アストロサイトの初代培養の免疫細胞化学的特徴づけ。

【００１９】すべての細胞がGFAP陽性(A)およびS100β陽性（B）であったことを示す低倍率
（×280）の顕微鏡写真。

【００２０】図3：ヒト成人アストロサイトのインビトロ増殖。

【００２１】増殖速度は、t₀以降の細胞数の増加の割合（％）として表されている。ヒト成
人アストロサイトは、FCS内で培養した場合にインビトロで増殖した。該細胞は
、20％ FCSの存在下で培養した場合には、10％ FCS内より2倍速く増殖したこと
に注目されたい（A）。NGFおよびbFGF（50ng/ml）は、初代培養ヒト成人アスト
ロサイトに対する分裂誘発効果を有さなかった（B）。HSを該培地に加えた場合
には、該細胞のほとんどが培養皿に付着せず、それらは該培地と共に除去された
。

【００２２】図4：ヒト成人アストロサイトのアデノウイルストランスダクション後のTH免
疫細胞化学。

【００２３】（B）感染の1週間後に該細胞の50〜60％がTH陽性であったことを示す低倍率（
×70）顕微鏡写真（A、非感染細胞）。（C）トランスダクションされたhTH含有
アストロサイトを示す高倍率（×560）顕微鏡写真。

【００２４】図5：トランスダクションされたヒト成人アストロサイトにおけるTH活性。

【００２５】 TH活性は、感染の1週間以内に検出され、ついで第14日に35650 pmol[³H] H₂O/
mg prot./h(時間)に上昇した。TH活性が、感染の14日後にドキシサイクリンの存
在下で少なくとも10倍減少したことに注目されたい。

【００２６】（発明の詳細な記載）定義以下に定義する用語が本明細書の全体にわたり用いられており、それらは本発
明の範囲および実施の理解に役立つはずである。

【００２７】「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から構成される高分子化合物
である。アミノ酸は、以下の一般構造：

【００２８】

【化１】を有する。アミノ酸は、以下のとおり側鎖Rに基づき7つの群に分類される：（1
）脂肪族側鎖、（2）ヒドロキシル（OH）基を含有する側鎖、（3）硫黄原子を含
有する側鎖、（4）酸性またはアミド基を含有する側鎖、（5）塩基性基を含有す
る側鎖、（6）芳香環を含有する側鎖、および（7）プロリン（側鎖がアミノ基に
融合したイミノ酸）。

【００２９】「タンパク質」は、生きた細胞内で構造的または機能的役割を果たすポリペプ
チドである。

【００３０】本発明のポリペプチドおよびタンパク質はグリコシル化されていてもグリコシ
ル化されていなくてもよい。

【００３１】ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」は、ポリペプチドまたはタンパク
質に由来し該ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの生物学的特性を
保有する任意の類似体、断片、誘導体または突然変異体である。該ポリペプチド
またはタンパク質の種々の変異体が天然で存在しうる。これらの変異体は、該タ
ンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の相違により特徴づけられ
る対立遺伝子変異体であってもよく、あるいは差次的（differential）スプライ
シングまたは翻訳後修飾を伴いうる。当業者であれば、単一または複数のアミノ
酸の置換、欠失、付加または置き換えを有する変異体を製造することが可能であ
る。これらの変異体には、とりわけ、（a）1以上のアミノ酸残基が同類または非
同類アミノ酸で置換された変異体、（b）1以上のアミノ酸が該ポリペプチドまた
はタンパク質に付加された変異体、（c）該アミノ酸の1以上が置換基を含む変異
体、および（d）該ポリペプチドまたはタンパク質が別のポリペプチド（例えば
、血清アルブミン）に融合した変異体が含まれる。遺伝的技術（抑制、欠失、突
然変異など）、化学的技術および酵素的技術を含むこれらの変異体を得るための
技術は、当業者に公知である。

【００３２】そのような対立遺伝子変異体、類似体、断片、誘導体、突然変異体および修飾
体（選択的mRNAスプライシング形態および選択的翻訳後修飾形態を含む）が、該
ポリペプチドの生物学的特性のいずれかを保有するポリペプチドの誘導体となる
場合、それらは本発明の範囲内に含まれると意図される。

【００３３】「核酸」は、ヌクレオチドと称される共有結合したサブユニットから構成され
る高分子化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（RNA）およびポリデオキシリボ
核酸（DNA）（これらは共に、一本鎖または二本鎖でありうる）を含む。DNAは、
cDNA、ゲノムDNA、合成DNAおよび半合成DNAを含む。タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列はセンス配列と称される。「外因性核酸」は、該核酸配列を天然
で含有しない細胞内に導入された遺伝物質である。

【００３４】「調節領域」は、もう1つの核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。
調節領域は、特定の核酸の発現を天然で引き起こす配列（相同領域）を含んでい
たり、あるいは異なる起源の配列（異なるタンパク質または更には合成タンパク
質の発現を引き起こすもの）を含んでいてもよい。特に、該配列は、真核性また
はウイルス性遺伝子の配列、あるいは特異的もしくは非特異的に又は誘導的もし
くは非誘導的に遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導化配列でありうる。調節
領域には、複製起点、RNAスプライス部位、エンハンサー、転写終結配列、該ポ
リペプチドを標的細胞の分泌経路内に導くシグナル配列、およびプロモーターが
含まれる。

【００３５】「異種起源」の調節領域は、発現される核酸に天然で付随していない調節領域
である。該異種調節領域には、異なる種に由来する調節領域、異なる遺伝子に由
来する調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然で存在しないが当業者によ
り設計される調節配列が含まれる。

【００３６】「ベクター」は、関心のある核酸を宿主細胞内に導入するための任意の手段で
ある。「ベクター」なる語は、該核酸をインビトロ、エクスビボまたはインビボ
で細胞内に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段を含む。非ウイルスベ
クターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチ
ン）、DNA-タンパク質複合体、および生体高分子が含まれる。ウイルスベクター
には、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワ
クシニア、単純ヘルペス、エプスタインバーおよびアデノウイルスベクターが含
まれる。核酸は、1以上の調節領域、および／または核酸導入の結果（どの組織
に導入されたか、発現の持続時間など）に関する選択、測定およびモニターに有
用な選択マーカーを含有しうる。

【００３７】「医薬上許容される担体」には、投与方法に医薬上許容される無菌の希釈剤お
よび増量剤であり、それは、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用し
て製剤化される水性または油性懸濁液でありうる。個々の医薬上許容される担体
、および活性化合物と担体との比は、該組成物の溶解度および化学的特性、個々
の投与経路ならびに標準的な医薬プラクティスにより決定される。

【００３８】アストロサイト本発明の1つの態様は、実質的に純粋なヒトアストロサイト細胞の集団を提供
することである。その精製された細胞は、関心のある産物をコードする導入され
た遺伝物質を含有しうる。本発明のもう1つの態様は、所望の治療特性を有しエ
クスビボ細胞療法に適したヒト成人アストロサイトを提供することである。遺伝
的に修飾されたヒト細胞をラットの脳に移植することは、Sabateら（Nature Gen
etics, Volume 9, pp. 256-260 (1995)）（その全内容を参照により本明細書に
組み入れる）に開示されている。

【００３９】そして本発明は、エクスビボ遺伝子治療のための神経活性物質などの生物学的
効果を有する因子を産生しうる高純度の成人ヒトアストロサイトを得るための非
常に効率的な方法を提供する。本発明者らは、本発明において、これらの細胞の
精製、増幅およびインビトロ修飾の成功を可能にする条件を見出した。組換えア
デノウイルスで修飾された細胞において、相当なレベルの遺伝子発現が得られた
。遺伝的に修飾されたアストロサイトは、神経変性疾患およびCNS外傷の遺伝子
治療を可能にする。

【００４０】遺伝子導入技術と細胞移植との組合せは、治療用分子をCNSに送達するための
アプローチを提供する。アストロサイトは、CNS由来であり、効率的な分泌機構
を有し、ニューロン支持体としての役割を果たすため、CNSの治療に特によく適
している。最も重要なことは、エクスビボ遺伝子導入のための細胞性運搬手段と
してのヒト成人アストロサイトの使用は自家移植への道を開き、それにより免疫
拒絶および免疫抑制剤の副作用を回避することである。本明細書に記載のとおり
、これらの細胞は、精製され、増殖され、インビトロで遺伝的に修飾されうる。
ヒト成人大脳皮質由来のアストロサイトは、純粋な初代培養としてインビトロで
少なくとも10ヵ月間、増殖および維持されている。さらに、神経活性物質をコー
ドするウイルスベクターが、細胞に効率的に導入される。該神経活性物質が、テ
トラサイクリンに基づく調節系の負の制御下（tet-off）のヒトチロシンヒドロ
キシラーゼ（hTH）である場合、該感染細胞は大量の活性hTHを合成し、L-Dopaを
放出する。さらに、強力なテトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンは、
トランスジーンの発現を効率的に調節する。

【００４１】ベクター前記のとおり、「ベクター」は、本発明の核酸を宿主細胞内に導入するための
任意の手段である。好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレト
ロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙
げられる。例えば、関心のある核酸を含む遺伝子を、ウイルスベクターを使用し
て又はDNAの直接導入によりインビボ、エクスビボまたはインビトロで導入する
。標的組織内での発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化す
ることによりもたらされうる。そのような標的化は、例えば、ウイルスベクター
または受容体リガンドを使用して又は組織特異的プロモーターを使用して又はそ
の両方を使用することにより行うことができる。

【００４２】インビボまたはエクスビボターゲッティングおよび治療操作において一般に使
用されるウイルスベクターとしては、DNAに基づくベクターおよびレトロウイル
スベクターが挙げられる。ウイルスベクターを構築し使用するための方法は、当
技術分野において公知である [例えば、MillerおよびRosman, BioTechniques 7:
980-990 (1992)を参照されたい]。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損型
である。すなわち、それらは標的細胞内で自律的には複製されない。一般に、本
発明の範囲内で使用される複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞内で
の該ウイルスの複製に必要な少なくとも1つの領域を欠く。これらの領域は、当
業者に公知の任意の技術により除去（全部または一部）または非機能化されうる
。これらの技術には、全摘出、置換（他の配列、特に、挿入される核酸による置
換）、（複製に）必須の領域に対する1以上の塩基の付加または部分的欠失が含
まれる。そのような技術は、遺伝子操作の技術を用いて又は突然変異誘発剤での
処理によりインビトロ（単離されたDNA上）またはin situで行うことができる。
好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子を被包するのに必要なそのゲノ
ムの配列を保有する。

【００４３】 DNAウイルスベクターには、弱毒化または欠損DNAウイルス、例えば、単純ヘル
ペスウイルス（HSV）、乳頭腫ウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、ア
デノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルスなどが含まれ
るが、これらに限定されるものではない。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ完全
に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞内に導入された後、複製
不能であり、したがって生産的ウイルス感染を引き起こさない。欠損ウイルスベ
クターの使用により、特定の限局領域内の細胞への投与が可能となり、この場合
、該ベクターが他の細胞に感染する心配がない。このようにして、特定の組織が
特異的に標的化されうる。個々のベクターの具体例には、欠損ヘルペスウイルス
1（HSV1）ベクター [Kaplittら, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)]、
糖タンパク質L遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター [特許公開RD 371005
A]または他の欠損ヘルペスウイルスベクター [1994年9月24日付け公開の国際特
許公開WO94/21807; 1994年4月2日付け公開の国際特許公開WO92/05263]；弱毒化
アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetら [J. Clin. Invest
. 90:626-630 (1992); また、La Salleら, Science 259:988-990 (1993)も参照
されたい]；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター [Samulskiら, J. Virol. 6
1:3096-3101 (1987); Samulskiら, J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski
ら, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)]が含まれるが、これらに限定される
ものではない。

【００４４】インビボ投与の場合には、好ましくは、ウイルスベクターおよびトランスフェ
クト化細胞の免疫不活性化を回避するために、ウイルスベクター（例えば、アデ
ノウイルスベクター）での処理と共に適当な免疫抑制処理を行う。例えば、ウイ
ルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を阻止するために、免疫抑制
性サイトカイン、例えばインターロイキン12（IL-12）、インターフェロンγ（I
FN-γ）または抗CD4抗体を投与することができる [例えば、Wilson, Nature Med
icine (1995)を参照されたい]。また、最小数の抗原を発現するように操作され
たウイルスベクターを使用するのが好都合である。

【００４５】もちろん、本発明は、遺伝子治療用途のために、関心のある遺伝子の治療的に
有効な量を発現するベクターをアストロサイトへ送達することを意図するもので
ある。本発明で用いる「治療的に有効な量」なる表現は、宿主の活性、機能およ
び応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも
50％、より好ましくは少なくとも90％減少させ、最も好ましくはそれを予防する
のに十分な量を意味する。あるいは、治療的に有効な量は、宿主における臨床的
に有意な状態の改善をもたらすのに十分な量である。

【００４６】本発明の任意のウイルス性または非ウイルス性ベクターが、医薬上許容される
ビヒクルまたは担体中でアストロサイトにエクスビボで好ましく導入されるであ
ろう。「医薬上許容される」なる表現は、ヒトに投与された場合にアレルギー性
または同様の不都合な反応（例えば、胃の不調、眩暈など）を典型的には引き起
こさない生理的に許容されうる分子または組成物に関して用いられる。好ましく
は、本発明で用いる「医薬上許容される」なる語は、連邦政府または州政府の統
制機関により承認されていること、または米国薬局方もしくは一般に認められた
他の薬局方（動物、特にヒトでの使用に関するもの）に掲載されていることを意
味する。「担体」なる語は、該化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、
賦形剤またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌液、例えば水お
よび油（石油、動物、植物または合成技術に由来するものを含み、例えば、ラッ
カセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる）であってもよい。水また
は水溶液、食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、担体、特に
注射液用担体として好ましく使用される。適当な医薬担体は、E.W. Martinによ
りRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。

【００４７】アデノウイルスベクター好ましい実施形態においては、該ベクターはアデノウイルスベクターである。
アデノウイルスは、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達するよう修飾さ
れうる真核性DNAウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。
本発明の範囲内においては、これらの血清型のうち、2型または5型ヒトアデノウ
イルス（Ad2またはAd5）または動物由来のアデノウイルス（WO94/26914を参照さ
れたい）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用されうる動物由来のアデノウ
イルスには、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Mav 1, Beardら, Virology 75 (199
0） 81）、ヒツジ、ブタ、トリおよびシミアン（例えば、SAV）由来のアデノウ
イルスが含まれる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスは、イヌアデノウイ
ルス、より好ましくは、CAV2アデノウイルス（例えば、ManhattanまたはA26/61
株 (ATCC VR-800)）である。

【００４８】好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、ITR、カプシド化
配列、および関心のある核酸を含む。より好ましくは、該アデノウイルスベクタ
ーの少なくともE1領域が非機能的である。E1領域における欠失は、好ましくは、
Ad5アデノウイルスの配列のヌクレオチド455〜3329（PvuII-BglII断片）または
ヌクレオチド382〜3446（HinfII-Sau3A断片）に伸長する。また、他の領域、特
にE3領域（WO95/02697）、E2領域（WO94/28938）、E4領域（WO94/28152、WO94/1
2649およびWO95/02697）または後期遺伝子L1-L5のいずれかが修飾されていても
よい。

【００４９】好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1領域に欠失を
有する（Ad 1.0）。E1欠失アデノウイルスの具体例はEP 185,573（その内容を参
照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。もう1つの好ま
しい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1およびE4領域におけ
る欠失を有する（Ad 3.0）。E1/E4欠失アデノウイルスの具体例はWO95/02697お
よびWO96/22378（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）
に開示されている。さらにもう1つの好ましい実施形態においては、該アデノウ
イルスベクターは、E4領域および該核酸配列が挿入されたE1領域における欠失を
有する [FR94 13355（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）
を参照されたい]。

【００５０】本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術（Levr
eroら, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917）
により製造することができる。特に、とりわけ対象DNA配列を保持するプラスミ
ドとアデノウイルスとの間の相同組換えにより、それらを製造することができる
。該アデノウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系内にコトランスフェクトし
た後、相同組換えが生じる。使用する細胞系は、好ましくは、（i）前記要素に
より形質転換されうるべきである；そして（ii）好ましくは組換えの危険性をな
くすために組込み形態として、該複製欠損アデノウイルスのゲノム部分を相補し
うる配列を含有すべきである。使用されうる細胞系の具体例としては、ヒト胎児
腎細胞系293（これは、そのゲノム内に組込まれたAd5アデノウイルスのゲノムの
左側部分（12％）を含有する）（Grahamら, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59）、
およびE1およびE4の機能を相補しうる細胞系（出願WO94/26914およびWO95/02697
に記載されている）が挙げられる。当業者によく知られた標準的な分子生物学的
技術を用いて、組換えアデノウイルスを回収し精製する。

【００５１】アデノ随伴ウイルスベクターアデノ随伴ウイルス（AAV）は、それが感染する細胞のゲノム内に安定かつ部
位特異的に組込まれうる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。それは、細
胞の増殖、形態学または分化に何ら影響を及ぼすことなく広域スペクトルの細胞
に感染することが可能であり、ヒトの病理には関与しないらしい。AAVゲノムは
既にクローニングされ配列決定され特徴づけられている。それは、約4700塩基を
含み、両端に約145塩基の逆方向末端反復配列（ITR）領域を含有し、これは該ウ
イルスの複製起点として働く。該ゲノムの残りの部分は、被包化機能を保持する
2つの必須領域、すなわち、ウイルスの複製および該ウイルス遺伝子の発現に関
与するrep遺伝子を含有する該ゲノムの左側部分、および該ウイルスのカプシド
タンパク質をコードするcap遺伝子を含有する該ゲノムの右側部分に分けられる
。

【００５２】インビトロおよびインビボで遺伝子を導入するためのAAV由来のベクターの使
用は既に記載されている（WO91/18088; WO93/09239; 米国特許第4,797,368号,
米国特許第5,139,941号, EP 488 528を参照されたい）。これらの刊行物は、rep
および／またはcap遺伝子が欠失し対象遺伝子で置換された種々のAAV由来構築物
を記載しており、該対象遺伝子をインビトロで（培養細胞内）またはインビボで
（生物内に直接的に）導入するための、これらの構築物の使用を記載している。
2つのAAV逆方向末端反復配列（ITR）領域に隣接した対象核酸配列を含有するプ
ラスミドと、AAV被包化遺伝子（repおよびcap遺伝子）を保持するプラスミドと
を、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞系内にコ
トランスフェクトすることにより、本発明の複製欠損組換えAAVを産生させるこ
とができる。ついで、産生されたAAV組換え体を標準的技術により精製する。

【００５３】したがって、本発明はまた、AAV ITRに隣接した対象核酸をコードする配列を
含むゲノムを有するAAV由来組換えウイルスに関する。本発明はまた、AAV由来の
2つのITRに隣接した抗血管新生性因子をコードする核酸をコードする配列を含む
プラスミドに関する。そのようなプラスミドを、そのまま該核酸配列の導入に使
用することが可能であり、その場合、該プラスミドは、適宜、リポソームベクタ
ー（偽ウイルス）内に封入されていてもよい。

【００５４】レトロウイルスベクターもう1つの実施形態においては、該遺伝子をレトロウイルスベクター内に導入
する（例えば、Andersonら, 米国特許第5,399,346号; Mannら, 1983, Cell 33:1
53; Teminら, 米国特許第4,650,764号; Teminら, 米国特許第4,980,289号; Mark
owitzら, 1988, J. Virol. 62:1120; Teminら, 米国特許第5,124,263号; EP 453
242, EP 178220; Bernsteinら, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTec
hnology 3 (1985) 689; 1995年3月16日付け公開のDoughertyら, 国際特許公開WO
95/07358; およびKuoら, 1993, Blood 82:845に記載されている）。レトロウイ
ルスは、分裂中の細胞に感染する組込み性ウイルスである。レトロウイルスゲノ
ムは、2つのLTR、被包化配列および3つのコード領域（gag、polおよびenv）を含
む。組換えレトロウイルスベクターにおいては、一般には、gag、polおよびenv
遺伝子を完全に又は部分的に欠失させ、関心のある異種核酸配列で置換する。こ
れらのベクターは、HIV、MoMuLV（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、MSV（
「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハーベイ肉腫ウイルス」）、SNV
（「脾臓壊死ウイルス」）、RSV（「ラウス肉腫ウイルス」、フレンドウイルス
などの種々の型のレトロウイルスから構築することができる。欠損レトロウイル
スベクターはWO95/02697に開示されている。

【００５５】一般には、核酸配列を含有する組換えレトロウイルスを構築するために、LTR
、被包化配列およびコード配列を含有するプラスミドを構築する。この構築物を
、パッケージング細胞系（この細胞系は、該プラスミドに欠損しているレトロウ
イルス機能をトランスで供給しうる）にトランスフェクトするために使用する。
したがって、一般には、該パッケージング細胞系はgag、polおよびenv遺伝子を
発現しうる。そのようなパッケージング細胞系は先行技術において既に記載され
ており、特に、細胞系PA317（米国特許第4,861,719号）、PsiCRIP細胞系（WO90/
02806）およびGP+envAm-12細胞系（WO89/07150）が挙げられる。また、該組換え
レトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTR内の修飾、と、gag遺
伝子の一部を含みうる長い被包化配列とを含有していてもよい（Benderら, J. V
irol. 61 (1987) 1639）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標
準的技術により精製する。

【００５６】レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するように又は一連のトラン
スフェクションに付されるように構築されうる。前者の場合には、腫瘍原性トラ
ンスフォーメーション特性を与える遺伝子以外のその遺伝子の全部を保有するよ
うに及び異種遺伝子を発現するように、該ウイルスを修飾する。非感染性ウイル
スベクターの調製は、該ウイルスパッケージングシグナルが破壊されるように、
かつ、該異種遺伝子と該パッケージングシグナルとを含有するよう操作された共
導入ウイルスのパッケージングに必要な構造遺伝子が保有されるように行う。し
たがって、産生されるウイルス粒子は、さらなるウイルスを産生する能力を有さ
ない。

【００５７】標的化遺伝子運搬は、1995年10月に公開された国際特許公開WO95/28494に記載
されている。

【００５８】非ウイルスベクター別法として、リポフェクションにより該ベクターをアストロサイトに導入する
ことができる。過去10年の間に、インビトロでの核酸の封入およびトランスフェ
クションのためのリポソームの使用が益々増加してきている。リポソーム媒介ト
ランスフェクションの際に遭遇する問題点や危険性を制限するように設計された
合成陽イオン脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランス
フェクション用のリポソームを調製することができる [Felgnerら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackeyら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85:8027-8031 (1988)を参照されたい; Ulmerら, Science 259:1745-174
8 (1993)]。陽イオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の封入を促進することが
可能であり、また、負に荷電した細胞膜との融合を促進することが可能である [
FelgnerおよびRingold, Science 337:387-388 (1989)]。核酸の導入に特に有用
な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863およびWO96/17823ならび
に米国特許第5,459,127号に記載されている。外因性遺伝子を特定の細胞内にエ
クスビボで導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実用的利点を有
する。特定の細胞に対するリポソームの分子ターゲッティングは、有益な1つの
領域を代表するものである。ターゲッティングの目的のために、脂質を他の分子
と化学的に共役させることができる [Mackeyら, 前掲を参照されたい]。ターゲ
ッティングされるペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパ
ク質（例えば、抗体）、または非ペプチド性分子を、リポソームに化学的に共役
させることができる。

【００５９】また、核酸のトランスフェクションを促進するためには、他の分子、例えば陽
イオンオリゴペプチド（例えば、国際特許公開WO95/21931）、DNA結合タンパク
質由来のペプチド（例えば、国際特許公開WO96/25508）または陽イオン重合体（
例えば、国際特許公開WO95/21931）も有用である。

【００６０】また、該ベクターを裸のDNAプラスミドとして導入することも可能である。当
技術分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーショ
ン、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキスト
ラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体の使
用）[例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); WuおよびWu, J. Bio
l. Chem. 263:14621-14624 (1988); 1990年3月15日付け出願のHartmutら, カナ
ダ国特許出願第2,012,311号; Williamsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:272
6-2730 (1991)を参照されたい]により、遺伝子治療用の裸のDNAベクターを所望
の宿主細胞内に導入することができる。受容体介在DNA運搬アプローチを用いる
ことも可能である [Curielら, Hum. Gene Ther: 3:147-154 (1992); WuおよびWu
, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]。

【００６１】核酸アストロサイトの遺伝的修飾および移植は、導入される遺伝物質に応じた多数
の用途におけるその使用を可能にする。

【００６２】レポーター遺伝子（例えば、LacZ遺伝子）は、神経の発生の分野における重要
な科学的問題を解決するのに役立つであろう。特に、種々の脳領域から外植され
た前駆体が生存しそれらの起源から独立して分化する潜在能力を、発生中の又は
成体の脳の種々の領域における移植後にそれを追跡することにより研究すること
が可能であろう。

【００６３】治療用遺伝子を含む核酸に特に関心が持たれる。これらの遺伝子は、神経活性
物質、中枢神経系の細胞に有益な効果をもたらしうる物質をコードする任意の遺
伝子を含む。それは、内因性物質の欠損を補足しうる又は過剰の内因性物質を減
少させうる物質でありうる。あるいは、それは、新たな特性を該細胞に付与する
物質でありうる。

【００６４】該神経活性物質は、アンチセンス配列、ポリペプチドまたはタンパク質であり
うる。本発明の実施に適したポリペプチドおよびタンパク質としては、増殖因子
、神経栄養因子、サイトカイン、神経伝達物質、酵素、神経伝達物質受容体およ
びホルモン受容体が挙げられる。

【００６５】好ましくは、該増殖因子は、コロニー刺激因子（G-CSF、GM-CSF、M-CSF、CSF
など）、内皮細胞増殖因子（ECGF、FGF1）、線維芽細胞増殖因子（aFGFa、bFGF
）または血管細胞増殖因子（VEGF）である。神経栄養因子のなかで好ましい因子
としては、毛様体神経栄養因子（CNTF）、グリア細胞成熟因子（GMFa, b）、GDN
F、BDNF、NT-3、NT-5などが挙げられる。NT-3をコードする完全なヌクレオチド
配列は、WO91/03569（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）
に開示されている。

【００６６】好ましいサイトカインとしては、インターロイキンおよびインターフェロンが
挙げられる。本発明の範囲内に含まれる酵素としては、神経伝達物質の生合成の
ための酵素（チロシンヒドロキシラーゼ、アセチルコリントランスフェラーゼ、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ）およびリソソーム酵素（ヘキソサミニダーゼ
、アリールスルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、HGPRT）が挙げられる。
フリーラジカルの解毒に関与する酵素（スーパーオキシドジスムターゼI、IIま
たはIII、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ）が好ましい。受容体に
は、アンドロゲン受容体（ケネディー病に関与する）が含まれる。

【００６７】これらのタンパク質は、天然形態またはその変異体または断片として使用する
ことができる。

【００６８】また、該神経活性物質はアンチセンス配列でありうる。アンチセンス核酸を使
用した遺伝子発現のダウンレギュレーションが、翻訳または転写レベルで達成さ
れうる。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、内因性神経活性物質をコー
ドする核酸に又は対応メッセンジャーRNAに特異的にハイブリダイズしうる核酸
断片である。これらのアンチセンス核酸は、その安定性および選択性を改善する
ように所望により修飾されていてもよい合成オリゴヌクレオチドでありうる。そ
れらはまた、内因性神経活性物質をコードするmRNAの全部または一部に相補的な
RNAを該細胞内での発現により与えるDNA配列でありうる。アンチセンス核酸は、
EP 140308に記載のとおり、逆配向で内因性神経活性物質をコードする核酸の全
部または一部を発現させることにより製造することができる。内因性神経活性物
質の発現をダウンレギュレーションまたは阻止する限り、任意の長さのアンチセ
ンス配列が、本発明の実施に適している。好ましくは、アンチセンス配列は、少
なくとも20ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸、アンチセンスRNAをコー
ドするDNAの製造および使用ならびにオリゴおよび遺伝的アンチセンスの使用は
、WO92/15680（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示
されている。

【００６９】該核酸は、天然または人工由来でありうる。それは、特に、ゲノムDNA（gDNA
）、相補的DNA（cDNA）、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列であ
りうる。それは、ヒト、動物、植物、細菌またはウイルスなどに由来するもので
ありうる。それは、当業者に公知の任意の技術により、特に、ライブラリーのス
クリーニング、化学合成、またはライブラリーのスクリーニングにより得られた
配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混合方法により得ることができる。それ
は、好ましくは、cDNAまたはgDNAである。

【００７０】より好ましい治療用産物には、パーキンソン病の場合には、チロシンヒドロキ
シラーゼ（TH）、または神経栄養因子、例えばBDNF（脳由来神経栄養因子）（こ
れらは、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する）をコードするcDNAが含
まれる。

【００７１】同様に、アルツハイマー病の場合には、コリンアセチルトランスフェラーゼお
よび／またはNGF（神経成長因子）をコードするcDNAは、コリン作動性ニューロ
ンの変性を妨げうるであろう。

【００７２】最近の知見は、BDNFおよびGDNFなどの神経栄養因子がドーパミン作動性細胞に
対する栄養因子でありうると示唆している。神経栄養因子をコードする遺伝物質
をアストロサイト内へ導入することにより、移植片の生存が改善されると予想さ
れる。

【００７３】現在では、治療用遺伝子をコードするいくつかのアデノウイルスベクターが構
築されている。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）をコードするアデノウ
イルスが構築されている。本発明のインビトロ感染アストロサイトの移植は、脳
内に治療量のTHを運搬するための非常に効率的な方法を構成する。治療用遺伝子
をコードする他のアデノウイルス由来ベクターには、Ad-aFGF、Ad-bFGF、Ad-GDN
F、Ad-GADが含まれる。

【００７４】また、関心のある遺伝物質は、アンチセンスRNAまたはリボザイム、または該
アンチセンスRNAもしくはリボザイムをコードするDNA分子でありうる。これらの
産物は、β-アミロイド前駆体、TAUタンパク質などの毒性タンパク質の産生を抑
制する場合に特に関心が持たれる。

【００７５】好ましくは、該遺伝物質は、関心のあるタンパク質またはペプチドをコードす
るDNAである。前記のとおり、該タンパク質またはペプチドは、好ましくは、神
経活性物質、例えば、増殖因子（すなわち、サイトカイン）、神経栄養因子、酵
素または神経伝達物質である。

【００７６】他の実施形態においては、該遺伝物質は、アンチセンスRNAまたはリボザイム
をコードするDNAである。

【００７７】調節領域一般に、本発明の核酸は、1以上の調節領域に連結される。該領域は、調節可
能もしくは誘導可能なプロモーター、神経細胞特異的プロモーター、またはウイ
ルス性プロモーターを含みうる。適当な調節領域の選択は、当業者の技量の範囲
内の常套的なものである。

【００７８】調節領域は、アストロサイト内での機能的転写のためのプロモーター領域、な
らびにポリアデニル化部位および転写の終結のシグナルを特定し対象遺伝子の3'
側に位置する領域を含みうる。これらのすべての要素が発現カセットを構成する
。

【００７９】本発明で使用しうるプロモーターには、構成的プロモーターおよび調節（誘導
）プロモーターの両方が含まれる。該プロモーターは、該核酸の発現を天然で引
き起こしうる。また、それは、異種起源に由来するものであってもよい。特に、
それは、真核性またはウイルス性遺伝子のプロモーター配列であってもよい。例
えば、それは、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であって
もよい。同様に、それは、使用するアデノウイルスを含むウイルスのゲノムに由
来するプロモーター配列であってもよい。これに関しては、例えば、アデノウイ
ルスE1Aまたは主要後期プロモーター（MLP）、サイトメガロウイルス（CMV）プ
ロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターが挙げられうる。

【００８０】また、該プロモーターは、活性化もしくは調節配列または組織特異的もしくは
優先的発現を可能にする配列の付加により修飾されていてもよい（エノラーゼお
よびGFAPプロモーターなど）。さらに、該核酸がプロモーター配列を含有しない
場合には、それを、例えばそのような配列の下流のウイルスゲノム内に挿入する
ことができる。

【００８１】本発明の実施に有用ないくつかのプロモーターとしては、遍在性プロモーター
（例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメント
プロモーター（例えば、デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP）、
治療用遺伝子プロモーター（例えば、MDR型、CFTR、VIII因子）、組織特異的プ
ロモーター（例えば、平滑筋細胞におけるアクチンプロモーター）、分裂中の細
胞において優先的に活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター（
例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン
調節転写モジュレーター、サイトメガロウイルス前初期、レトロウイルスLTR、
メタロチオネイン、SV-40、ElaおよびMLPプロモーターが挙げられる。テトラサ
イクリン調節転写モジュレーターおよびCMVプロモーターは、WO 96/1313、米国
特許第5,168,062号および第5,385,839号（それらの内容を参照により本明細書に
組み入れることとする）に記載されている。

【００８２】医薬投与本発明は、成人アストロサイトの精製および増殖を可能にし、インビトロでの
首尾よい高効率遺伝子運搬のためのその使用を可能にする。そして、これらの細
胞を、受容生物のCNSに投与することができる。したがって、本発明は、CNSに対
する外傷および神経変性障害の治療などの重要な臨床的および科学的用途を提供
するものである。

【００８３】本発明の方法は、導入する治療用遺伝子および治療する障害に応じて、脳内部
位などのCNSの特定の領域に正確に標的化することを可能にする。したがって、
治療する損傷の部位に応じて、例えば、線条体、海馬または黒質を含む脳の部位
に投与を行なう。好ましくは、それらを線条体に移植する。

【００８４】本発明により、生着のためにアストロサイトを運搬することが定位固定性注射
により可能となった。注射位置は、治療すべき障害に基づいて決定され、当業者
により決定されるであろう。また、注射部位、注射の回数およびスケジュールな
らびに個々の投与量を含む実際の治療計画は、当業者により決定されるであろう
。一般に、ある部位に移植する細胞の数は、1×10³〜1×10¹⁰個、好ましくは1×
10⁵〜1×10⁹個、より好ましくは1×10⁶〜1×10⁸個となろう。

【００８５】また、前記のアストロサイト細胞を含むインプラントを提供することも本発明
の目的である。好ましくは、該インプラントは、該細胞の生存およびインビボ増
殖および分化を増強する非細胞性物質を含有する。該インプラントは、例えば、
コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、レクチン、生体適合性支持体、例え
ば骨またはポリテトラフルオロエチレンファイバーなどを含有しうる。本発明は
また、治療用産物をレシピエントのCNSに運搬するための方法であって、該治療
用産物をコードする導入された遺伝物質を含有する遺伝的に修飾されたヒトアス
トロサイトを該レシピエントの脳内に移植することを含んでなる方法に関する。

【００８６】本発明は、インビボにおける治療用遺伝子の安全で無毒性で長期にわたる発現
を提供する。本発明は、神経変性障害、例えばニューロパシー、卒中、脊髄損傷
、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、パーキンソン
病、脳性麻痺、てんかん、リソソーム病（例えば、テイ・サックス病、サンドホ
ッフ病、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ムコ多糖沈着症、レッシュ・
ナイハンなど）および脳腫瘍の治療において特に関心が持たれる。

【００８７】本発明は、本発明の典型例として記載する以下の非限定的な実施例を参照する
ことにより更に詳しく理解されるであろう。

【００８８】（実施例）以下の実施例により本発明を更に詳しく説明することとするが、これらの実施
例は例示的かつ非限定的なものと解釈されるべきである。実施例1では、ヒト成
人アストロサイトの長期間の純粋初代培養の回収を可能にする細胞培養プロトコ
ールを説明する。実施例2では、テトラサイクリンに基づく（tet-off）調節系（
GossenおよびBujard, 1992）の制御下でヒトチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を
コードするアデノウイルスベクターを使用することによりこれらの細胞が遺伝的
に修飾されうることを示す。THは、チロシンをL-ドーパに変換する、カテコール
アミンの合成の律速酵素である。いくつかの研究は、パーキンソン病のモデル動
物におけるその治療的潜在能力を示している（Wolffら, 1989; Horellouら, 199
0a,b; Fisherら, 1991）。感染細胞は、強力なテトラサイクリン類似体であるド
キシサイクリンの不存在下で大量の活性hTHを産生した。

【００８９】全般的な分子生物学本発明では、当技術分野の通常の技術である通常の分子生物学、微生物学およ
び組換えDNA技術を用いることができる。そのような技術は文献に十分に説明さ
れている。例えば、Sambrook, FritschおよびManiatis, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, New York（本明細書中では「Sambrookら, 1989」）; DNA Clo
ning: A Practical Approach, Volumes IおよびII (D.N. Glover編, 1985); Oli
gonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984); Nucleic Acid Hybridization [
B.D. HamesおよびS.J. Higgins編, (1985)]; Transcription And Translation [
B.D. HamesおよびHiggins編, (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney編
, (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal,
A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubelら (編), Cur
rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1994)を参
照されたい。

【００９０】実施例1：初代培養ヒト成人アストロサイトの説明および特徴づけ 1.1 細胞培養外科的切開を受けている患者（平均年齢51.5±16.8歳）の大脳皮質から、当該
病院の方針に従い該患者の同意を得て、成人ヒト組織を単離した。手術直後に、
該組織を機械的に解離し、D-グルコース（3.15 g/l）、HEPES（3.57 g/l）、炭
酸水素ナトリウム（1.2 g/l）を含有し10％胎仔ウシ血清（FCS, Seromed）、2mM
グルタミン（Gibco）、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン混合物、100
μg/ml、Gibco）およびフンギゾン（Gibco）（pH 7.4）で補足されたDMEM/F12（
Sigma）中で遠心分離した。該ペレットを同じ培地に再懸濁させ、5cm培養フラス
コ（Costar）内にプレーティングした。培養を、10％ CO₂を含有する湿潤雰囲気
中、37℃で維持した。48時間後、該培地を交換した。その後該培地を1週間に1回
交換することにより、これらの初代培養を維持した。

【００９１】凍結／融解操作として、コンフルエントな細胞を0.25％トリプシンおよび0.2
％ EDTA（Gibco）で回収し、リン酸緩衝食塩水（PBS, 0.1M, pH7.4）で素早く洗
浄して該培地含有血清を除去した。ついで該細胞をまず-20℃で凍結し、最終的
に、10％ジメチルスルホキシド（DMSO, Sigma）で補足されたDMEM/F12中で-80℃
で保存した。細胞を、該バイアルを40℃の水浴内に2〜4分間配置することにより
融解し、Costa培養フラスコ内に再プレーティングした。48時間後、該培地を交
換してDMSOを除去した。

【００９２】 1.2 細胞増殖の評価 2つの異なる方法、すなわち、2mm²の所定面積中の位相差顕微鏡下での直接計
数、および二重免疫蛍光プロトコールで表現されるGFAP-ブロモデオキシウリジ
ン標識（複製中のDNA内に取込まれるにすぎないチミジン類似体BrdU）を用いた
。初代培養細胞を、NUNC（商標名）Petri皿（60×15mm）上、格子（2mm²）状にD
MEM/F12内にプレーティングした。

【００９３】以下の種々の培養条件下で増殖速度を測定した：（a）FCSの不存在下、（b）1
0％FCSの存在下、（b）20％ FCSの存在下、（c）10％ FCSおよび5％ウマ血清（H
S）の存在下、（d）10％ FCSおよび10％ HSの存在下、（e）NGF（50ng/ml, Sigm
a）の存在下、（f）bFGF（50ng/ml, Boehringer-Mannheim）の存在下。増殖実験
では、該培地を週2回交換した。すべての培養を80時間にわたり10時間ごとに計
数した。使用したNGFおよびbFGFの活性をバイオアッセイ [NGF（50ng/ml）にさ
らされたPC12細胞（10％ HSおよび5％ FCSで補足されたRPMI中、ポリオルニチン
でコートされた皿上で培養されたもの）の神経炎性拡大、およびbFGF（DMEM/HAM
F12（Sabateら, 1995中の参照文献を参照されたい）中10ng/ml）の存在下での神
経上皮前駆細胞の分化]により確認した。

【００９４】 BrdU取込み実験では、プレーティングの2日後にBrdUを初代培養に加えた。培
養を、5または10μM BrdUの存在下で4日間インキュベートした。該BrdU処理は、
増殖対照としての3T3および293細胞上で同時に行なった。該陽性細胞は、以下の
とおりに免疫細胞化学的方法により検出された。

【００９５】 1.3 免疫細胞化学的方法初代培養内の細胞をPBS中で素早くリンスし、固定溶液（PBS中の4％パラホル
ムアルデヒド）中、室温で10分間インキュベートした。PBS中でのリンス後、該
細胞をブロッキング溶液（10％ヤギ血清および0.2％ Triton X-100（PBS中））
で室温で30分間処理し、ついで、5％ヤギ血清および0.1％ Triton X-100（PBS中
）を含有する一次ポリクローナル抗体（GFAP, Dakopatts, 1:100; S100β, Sigm
a, 1:100希釈, TH, Inst. J. Boy, 1:200希釈; BrdU, Jackson, 1:50; OX42, Ce
darlane, 1:200）と共にインキュベートした。

【００９６】 BrdU免疫検出のためには、該細胞をまず、2N HCl中、室温で20分間変性させた
。0.1Nホウ酸ナトリウムで10分間中和した後、該サンプルをPBS中でリンスし、G
FAP免疫細胞化学的方法に関して記載されているとおりに加工した。

【００９７】 1.4 培養アストロサイトの特徴づけ CNS内への自家移植に関するヒト成人アストロサイトの潜在能力を評価するた
めには、まず、これらの細胞が初代培養として維持されうるか否かを試験する必
要があった。これまでの研究は、ヒト成人アストロサイトの初代培養がミクログ
リア細胞に関して富化されたと報告している（Yongら, 1991, 1992）。アストロ
サイト富化調製物の培養方法を最適化するために、該培地の組成および組織切開
、解離および細胞接種の間の時間を様々に変化させた。血清で補足されたDMEMが
、げっ歯類アストログリア培養のための適当な培地である。ウシ胎仔血清（FCS
）およびHAM/F12栄養素で補足された富化DMEMをアストロサイト培養に使用した
。解離および接種の後に該培養皿に付着する最初の細胞はアストロサイトである
。未付着および／または死亡細胞ならびに細胞残渣を含有する培地の最初の交換
までの種々の時間の遅延（24〜120時間）を試験した。実質的に純粋なアストロ
グリア培養を得るためには、48時間（2日間）の遅延が最適であった。驚くべき
ことに、ミクログリア細胞は、これらの条件下で培養皿に付着しない。

【００９８】 10％ FCSで補足されたDMEM/F12中で2日後、細胞は該培養皿内で扁平化した。
細胞の形態学は培養のコンフルエンスに左右されるが、大多数の細胞が扁平な多
角形の形態学を示した（図1A〜B）。GFAP（主要グリオフィラメントタンパク質
）およびS100β（細胞質カルシウム結合タンパク質）を含むアストログリアマー
カーの免疫検出により、該扁平細胞を同定した（図2）。実質的にすべての初代
培養細胞がGFAP陽性（図2A）およびS100β陽性（図2B）であった。該培養内のミ
クログリア細胞の存在を、OX42免疫染色およびグリフォニア・シンプリシフォリ
ア（Griffonia simplicifolia）由来のB₄イソレクチン（これは、ミクログリア
細胞の特異的マーカーとして使用される（Streit, 1990））での標識により試験
した。染色は何ら観察されなかった。このことは、ミクログリア細胞を実質的に
含有しないアストロサイトの培養の存在を証明している。総合すると、これらの
結果は、本発明が、ヒト成人アストロサイトの実質的に純粋な培養を提供するこ
とを示している。該培養の顕微鏡検査は、多数のGFAP陽性細胞が有糸分裂中であ
ることを示した（図1B）。

【００９９】 1.4.1 ヒト成人アストロサイトのインビトロ増殖予備的観察は、FCSの不存在下では、該培養細胞のうち分裂中のものが全く又
はほとんど存在せず、一方、10％ FCSをDMEMF12培地に加えた場合には、有糸分
裂プロフィールがしばしば観察されることを示した。GFAPおよびBrdUの二重免疫
蛍光標識は、該分裂細胞がアストロサイトであることを示した。種々の培養条件
中での初代培養ヒト成人アストロサイトの増殖能を分析した。栄養因子NGFおよ
びbFGFを含む可溶性分子ならびに種々の種の血清は、培養されたげっ歯類および
ヒト胎児アストロサイトに対する分裂誘発特性を有する（Yongら, 1991, 1992お
よびStachowiakら, 1997）。細胞増殖に対するFCS、HS、bFGFおよびNGFを含む種
々の組合せの効果を、0、10および20％ FCS、5または10％ HSで補足された10％
FCS、50ng/ml bFGFで補足されたDMEM、50ng/ml NGFで補足されたDMEMにおいて試
験した（図3A〜B）。FCSの存在下での接種の12時間後、該細胞は該皿表面に付着
し扁平化した。細胞はFCSの存在下で増殖したにすぎず（図3A）、増殖は20％ FC
Sで最大であった。10％または20％ FCSの存在下で培養した場合には、アストロ
グリア集団はそれぞれ40時間および20時間後に倍加した（図3A）。20％ FCSの存
在下での細胞増殖速度は細胞移植に適しており、単一の生検から1ヵ月以内に1〜
5×10⁶個のヒト成人アストロサイトの回収を可能にする。

【０１００】驚くべきことに、NGFまたはbFGF（50ng/ml培地）の添加は、ヒト成人アストロ
サイトの増殖を促進しなかった（図3B）。5または10％ HSで補足されたFCSと共
に培養した場合には、該ヒト成人アストロサイトのほとんどは該培養皿に付着せ
ず、該培地内に残存した。それにもかかわらず、少数の球状細胞は該培養皿に付
着したが、扁平化しなかった。プレーティングの3日後から、該付着細胞のいく
つかが扁平化し、非常に遅く増殖した（図3B）。要約すると、ヒト成人アストロ
サイトは、FCSの存在下、インビトロで増殖しうる。20％ FCSは、細胞移植に適
した多数の細胞の回収を可能にする。

【０１０１】 1.4.2 凍結／融解操作後の細胞の特徴づけ患者は2以上の移植片を受けることが可能である。したがって、ヒトにおける
自家移植の開発における1つの問題は、単一の生検からの初代培養アストロサイ
トの低温保存である。ヒト成人アストログリア細胞を、増殖／融解操作後の増殖
に関して試験した。10％ FCSで補足されたDMEM/F12中のインビトロの3〜4週に対
応する第1継代時に、培養細胞を凍結し、-80℃で2〜6時間維持した。ついで細胞
を迅速に融解し、10％ FCSで補足されたDMEM/F12に接種した。細胞を毎日注意深
く観察した。融解および接種の10時間後、該細胞は該培養皿に付着し扁平化した
。それらは、凍結操作に付されていない細胞と同様の形態学的および免疫細胞化
学的特徴を示した。GFAPおよびS100β免疫染色は、これらの細胞がそれらのアス
トログリア表現型を保存していることを証明した。プレーティング後の最初の日
には、該細胞は増殖しなかった。第2日と第3日との間に、最初の有糸分裂プロフ
ィールが観察された。ついで該細胞増殖が加速し、平均分裂時間は、10％ FCSの
存在下で60時間であった（図3A）。したがって、本発明に従い得られたヒト成人
アストロサイトは、凍結／融解操作後に分裂能力を維持している。

【０１０２】実施例2：培養されたアストロサイトの遺伝的修飾 2.1 アデノウイルスベクターげっ歯類の脳への直接的大脳内注射により中枢神経系の遺伝子治療がもたらさ
れた最近の研究により示されているとおり（WO94/08026）、アデノウイルスベク
ターは、外来遺伝子を神経細胞に導入するための効率的な手段を代表するもので
ある。移植に適した細胞数を増幅するために、本発明者らは、組換えアデノウイ
ルスが、培養されたヒトアストロサイトへの遺伝子導入を効率的に可能にしうる
ことを示した。

【０１０３】多数のアデノウイルス由来ベクターが文献に開示されており、当業者により製
造されうる。そのようなベクターを本発明で使用することができる（特に、EP 1
85 573, Perricaudetら, FEBS Letters 267 (1990) 60; Levreroら, Gene 101 (
1991) 195, FR 9305954, FR9308596, WO94/12649を参照されたい）。Ad.RSVβga
lベクターが既に文献に開示されている。例えば、Stratford-Perricaudetら（J.
Clin. Invest. 90, 626-630 (1992)）を参照されたい。このベクターは、E1お
よびE3領域が欠失したアデノウイルスAd5内に挿入された大腸菌（E. coli）LacZ
遺伝子を含有する。

【０１０４】 2.2 AdPGKtet hTH-1によるヒト成人アストロサイトの感染細胞を6ウェル培養プレート上、血清（FCS）を含有しないDMEM/F12中、6×10⁴ 細胞/ウェルの密度で接種した。ついで該細胞を、ヒトチロシンヒドロキシラー
ゼ遺伝子（hTH-1）がテトラサイクリンに基づく「tet-off」調節系（Gossenおよ
びBujard, 1992）の制御下であるAdPGKtet hTH-1と共に4〜6時間インキュベート
した。該hTH遺伝子および該トランスアクチベーターは、それぞれ最小CMVおよび
ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターにより駆動される。種々の感
染多重度（MOI）（75、150および300 pfu/細胞）を試験した。ドキシサイクリン
を最終濃度10ng/mlまで該培地に加えた。該培地を1日おきに交換した。

【０１０５】 2.3 遺伝子導入されたヒト成人アストロサイトによるTH活性およびL-ドーパ
産生の評価感染の3、7および14日後、細胞を回収し、加工して、TH活性を測定し、L-ドー
パ産生を評価した。既に記載されているとおりに（Reinhardら, 1986）、細胞ペ
レットのTH活性をアッセイした。FCSを含有しないDMEM/F12中でヒトアストロサ
イトを24時間増殖させた後、L-ドーパの産生を評価した。ならし培地を集め、0.
5mlのアリコートを0.05M Tris-HCl（pH8.6）中のアルミナ懸濁液（40mg/ml）と
混合した。ついで各混合物を連続的に10分間攪拌し、Tris-HClバッファーと洗浄
し、最後に遠心分離（800g、5分間、4℃）により該アルミナを集めた。該アルミ
ナゲルに吸着したカテコールを0.6N過塩素酸（サンプル当たり0.1ml）で溶出し
、該溶出液を2Mリン酸カリウム（pH7.4）（サンプル当たり20μl）で中和した。
遠心分離（30 000g、15分間、4℃）の後、該清澄化上清の10μlアリコートを高
速液体クロマトグラフィーカラム（Ultrasphere IP、25cm、外径0.46cm、5μm）
内に注入して、文献（Adrienら, 1989）に詳細に記載されているとおりにL-ドー
パの電気化学的定量を行なった。

【０１０６】 2.4 ヒト成人アストロサイトの遺伝子操作の結果培養されたヒト成人アストロサイトは、組換えアデノウイルスベクターにより
修飾することができる。最適なトランスダクションは、300pfu/細胞のウイルス
調製物を該細胞に6時間感染させることにより得られる。明らかな毒性は認めら
れなかった。免疫細胞化学による評価では、該細胞の50〜60％がhTH陽性であっ
た（図3A〜B）。Reinhardら（1986）により開発された酵素アッセイを用いて、
該hTHが感染の3、7および14日後に活性であるか否かを試験した。TH活性は、感
染の3日後に検出可能であり（1,290 pmol/mg prot/時間）、第7日および第14日
には、より高い値であった（それぞれ19,000 pmol/mg prot/時間および35,650 p
mol/mg prot/時間）。さらに、HPLCアッセイは、TH導入ヒトアストロサイトが感
染の14日後に1μg L-ドーパ/10⁶細胞/24時間を産生することを示した。

【０１０７】テトラサイクリンに基づく調節系の効力を試験するために、アストログリア培
養を、強力なテトラサイクリン類似体であるドキシサイクリン（10ng/ml）で処
理した。ドキシサイクリンは、TH発現を効率的に減少させた。TH活性は、ドキシ
サイクリンの存在下、第14日に少なくとも10倍減少した（未処理培養においては
35,650pmol/mg prot/時間であるのに対して、ドキシサイクリン処理細胞におい
ては3,590pmol/mg prot/時間）（図4）。これは、該hTH-1の発現がドキシサイク
リンにより効率的に制御されることを示した。しかしながら、図4に示されてい
るとおり、ドキシサイクリン処理アストロサイトにおいては、TH活性のレベルは
基線量に戻らなかった。この観察は、AdPGKtet hTH-1ベクター内でhTH-1の発現
を駆動する最小プロモーターP*hCMVが、初代培養ヒト成人アストロサイトにおい
て基礎活性を有することを示唆した。実際のところ、これまでの研究は、ある実
験条件下（例えば、損傷後）でのアストロサイト内のhCMVプロモーターの活性化
を報告しており、このことは、hCMVプロモーターの環境的調節を示唆している（
McCarthyら, 1995; Fritschyら, 1996）。

【０１０８】 2.5 他のベクターの使用前記のとおり、本発明のアストロサイトを遺伝的に修飾するために他の型のベ
クターを使用することができる。これは、ウイルス性または非ウイルス性（化学
的）ベクターでありうる。好ましいウイルスベクターには、AAV、レトロウイル
ス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスが含まれる。非ウイルスベクタ
ーには、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション、陽イオ
ン脂質トランスフェクションおよびリポポリアミン媒介トランスフェクションが
含まれる。

【０１０９】本明細書中に記載したすべての参照文献を、参照により本明細書に組み入れる
こととする。

【０１１０】本発明は、前記および本発明に固有の目的を果たしその目標および利点を成就
するために十分に適合化されることが、当業者に明らかであろう。また、本明細
書に記載のペプチド、ポリヌクレオチド、方法、操作および技術は、好ましい実
施形態の代表例として記載されており、典型的なものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。本発明の精神に含まれ添付の請求の範囲の範囲により定義
される本発明における変更および他の用途が、当業者に理解されるであろう。

【０１１１】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】（A）低倍率（×70）のヒト成人アストロサイト初代培養を示す位相差顕微鏡
写真である。（B）ヒト成人アストロサイト初代培養の終期分裂扁平細胞の高倍率（×560）
の顕微鏡写真である。

【図２】ヒト成人アストロサイトの初代培養の免疫細胞化学的特徴づけ試験の結果を示
し、すべての細胞がGFAP陽性(A)およびS100β陽性（B）であったことを示す低倍
率（×280）の顕微鏡写真を示す。

【図３Ａ】ヒト成人アストロサイトのインビトロ増殖試験の結果を示す。

【図３Ｂ】ヒト成人アストロサイトのインビトロ増殖試験の結果を示す。

【図４Ａ】ヒト成人アストロサイトのアデノウイルストランスダクション後のTH免疫細胞
化学試験の結果を示し、（B）感染の1週間後に該細胞の50〜60％がTH陽性であっ
たことを示す低倍率（×70）顕微鏡写真（A、非感染細胞）を、（C）トランスダ
クションされたhTH含有アストロサイトを示す高倍率（×560）顕微鏡写真を示す
。

【図４Ｂ】ヒト成人アストロサイトのアデノウイルストランスダクション後のTH免疫細胞
化学試験の結果を示し、（B）感染の1週間後に該細胞の50〜60％がTH陽性であっ
たことを示す低倍率（×70）顕微鏡写真（A、非感染細胞）を、（C）トランスダ
クションされたhTH含有アストロサイトを示す高倍率（×560）顕微鏡写真を示す
。

【図４Ｃ】ヒト成人アストロサイトのアデノウイルストランスダクション後のTH免疫細胞
化学試験の結果を示し、（B）感染の1週間後に該細胞の50〜60％がTH陽性であっ
たことを示す低倍率（×70）顕微鏡写真（A、非感染細胞）を、（C）トランスダ
クションされたhTH含有アストロサイトを示す高倍率（×560）顕微鏡写真を示す
。

【図５】トランスダクションされたヒト成人アストロサイトにおけるTH活性の試験結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 19/08 19/08 21/00 21/00 25/08 25/08 25/16 25/16 25/28 25/28 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｎ 5/10 15/00 Ａ 15/09 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA71 CA02 DA03 EA02 HA17 4B065 AA93X AA93Y AB06 BA02 CA17 CA28 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA02 ZA06 ZA16 ZA94 ZA96 ZB21 ZB26 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA04 NA14 ZA02 ZA06 ZA16 ZA36 ZA94 ZA96 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA05 BB63 CA04 MA02 NA14 ZA02 ZA06 ZA16 ZA36 ZA94 ZA96 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 a）アストロサイトの調製物を培養容器に導入し、 b）工程a）からのアストロサイトを、該培養容器への該アストロサイトの付着を
可能にする条件下でインキュベートし、 c）工程a）の開始から約48時間の時点で該培養容器に付着していない細胞を除去
することを含んでなる、実質的に純粋なアストロサイト集団の製造方法。
【請求項２】該アストロサイトがヒトアストロサイトである、請求項1に
記載の製造方法。
【請求項３】該ヒトアストロサイトがヒト成人アストロサイトである、請
求項2に記載の製造方法。
【請求項４】前記の実質的に純粋なアストロサイト集団がミクログリア細
胞を実質的に含有しない、請求項1に記載の製造方法。
【請求項５】該アストロサイトが、患者から外科的切除により得られた初
代アストロサイトである、請求項1に記載の製造方法。
【請求項６】培地の交換により未付着細胞を該培養容器から除去する、請
求項1に記載の製造方法。
【請求項７】該アストロサイト内に核酸を導入する工程d）を更に含む、
請求項1に記載の製造方法。
【請求項８】該核酸をウイルスベクターにより該アストロサイト内に導入
する、請求項7に記載の製造方法。
【請求項９】該ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス
、AAV、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスよりなる群から選ばれる、請
求項8に記載の製造方法。
【請求項１０】該ウイルスベクターが複製欠損アデノウイルスベクターで
ある、請求項9に記載の製造方法。
【請求項１１】該核酸を、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トラン
スフェクション、陽イオン脂質トランスフェクションまたはリポポリアミン媒介
トランスフェクションにより該アストロサイト内に導入する、請求項7に記載の
製造方法。
【請求項１２】該核酸が神経活性物質をコードする、請求項7に記載の製
造方法。
【請求項１３】請求項1に記載の製造方法により得られる実質的に純粋な
アストロサイト集団。
【請求項１４】実質的に純粋なアストロサイト集団。
【請求項１５】該アストロサイトがヒトアストロサイトである、請求項14
に記載のアストロサイト集団。
【請求項１６】該ヒトアストロサイトがヒト成人アストロサイトである、
請求項15に記載のアストロサイト集団。
【請求項１７】該アストロサイト集団がミクログリア細胞を実質的に含有
しない、請求項16に記載のアストロサイト集団。
【請求項１８】該アストロサイトが、患者から外科的切除により得られた
初代アストロサイトである、請求項14に記載のアストロサイト集団。
【請求項１９】外因性核酸を更に含む、請求項14に記載のアストロサイト
集団。
【請求項２０】該核酸をウイルスベクターにより該アストロサイト内に導
入する、請求項19に記載のアストロサイト集団。
【請求項２１】該ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイル
ス、AAV、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスよりなる群から選ばれる、
請求項20に記載のアストロサイト集団。
【請求項２２】該ウイルスベクターが複製欠損アデノウイルスベクターで
ある、請求項21に記載のアストロサイト集団。
【請求項２３】該核酸を、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トラン
スフェクション、陽イオン脂質トランスフェクションまたはリポポリアミン媒介
トランスフェクションにより該アストロサイト内に導入する、請求項19に記載の
アストロサイト集団。
【請求項２４】該核酸が神経活性物質をコードする、請求項19に記載のア
ストロサイト集団。
【請求項２５】該核酸がDNAまたはRNAである、請求項19に記載のアストロ
サイト集団。
【請求項２６】該核酸が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコ
ードするDNAである、請求項25に記載のアストロサイト集団。
【請求項２７】該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、増殖因子
、神経栄養因子および酵素よりなる群から選ばれる、請求項26に記載のアストロ
サイト集団。
【請求項２８】該核酸が、アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードす
るDNAである、請求項25に記載のアストロサイト集団。
【請求項２９】該核酸が調節領域に作動的に結合している、請求項24に記
載のアストロサイト集団。
【請求項３０】該調節領域が、調節プロモーター、誘導プロモーター、神
経細胞特異的プロモーターまたはウイルスプロモーターを含む、請求項29に記載
のアストロサイト集団。
【請求項３１】請求項14に記載のアストロサイト集団を含んでなるインプ
ラント。
【請求項３２】神経活性物質をコードする外因性核酸を含む実質的に純粋
なアストロサイト集団を含んでなる組成物。