MXPA01006852A - Astrocitos adultos humanos, su preparacion y su uso - Google Patents

Abstract

La invención proporciona una preparación esencialmente pura de los astrocitos adultos humanos, y un 5 método de producción de los mismos. Los astrositos purificados sonútiles para el tratamiento de los desórdenes neurodegenerativos o los traumas para el sistema nervioso central.

Description

ASTROCITOS ADULTOS HUMANOS, SU PREPARACIÓN Y SU USO Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de la neurobiologia. Más específicamente, la misma se refiere a astrocitos adultos humanos purificados, a los métodos para su preparación, y a su uso, especialmente para el tratamiento de desórdenes neurodegenerativos o los traumas del sistema nervioso central.

Antecedentes de la Invención Astrocitos . .

La combinación de las técnicas de trasplante de las células y la transferencia de los genes proporciona un enfoque terapéutico a las enfermedades neurodegenerativas y las lesiones traumáticas. Varios tipos de células, por ejemplo las células progenituras, las neuronas, las células guales, los fibroblastos y los mioblastos, han sido investigados como los vehículos para el suministro de los genes al sistema nervioso central (SNC) (Wolff y colaboradores, 1989; Horellou y colaboradores, 1990a, b; Ref.129898 Fisher y colaboradores, 1991, 1993, Gage y colaboradores, 1995; Sabate y colaboradores, 1995; Fisher, 1997; Martinez-Serrano y Bjorklund, 1997) . Se ha puesto una atención particular a la actividad terapéutica de los astrocitos diseñados genéticamente (Cunningham y colaboradores, 1991, 1994; La Gamma y colaboradores; 1993; Castillo y colaboradores, 1994; Pundt y colaboradores, 1995; Lundberg y colaboradores, 1996; Lin y colaboradores, 1997) . Los astrocitos fueron ubicados como blanco especialmente para la reparación del cerebro a causa de que los mismos son constituyentes del SNC normales, están dotados con suficientes mecanismos secretorios y proporcionan un soporte a las neuronas por medio de la liberación de los factores tróficos que promueven su supervivencia, su diferenciación y su regeneración. Además, los mismos pueden ser expandidos en el cultivo y diseñados genéticamente para expresar los transgenes extraños. Recientemente, los astrocitos fetales humanos de los abortos legales han sido cultivados y transducidos exitosamente con un retrovirus que activa o estimula la expresión del NGF activo (Lin y colaboradores, 1997) . Los astrocitos adultos humanos son más relevantes para la reparación del cerebro humano, puesto que los mismos permiten la transferencia de los genes ex vivo, autóloga, evitando asi el rechazo inmunológico y los efectos laterales de los inmunosupresores. En estudios recientes en los que se intentó cultivar los astrocitos adultos humanos, se reportó la contaminación con células microgiales (Young y colaboradores, 1991, 1992).

Terapia Genética La transferencia de los genes ex vivo involucra el suministro de las células terapéutica a un paciente Wolff y colaboradores, 1989; Horellou y colaboradores, 1990a, b; Fisher y colaboradores, 1991, 1993, Gage y colaboradores, 1995; Sabate y colaboradores, 1995; Fisher, 1997; Martinez-Serrano y Bjorklund, 1997; Taylor, 1997). El uso de las lineas celulares inmortalizadas para la terapia genética es de un valor limitado, puesto que las mismas retienen las propiedades tumorigénicas. En contraste, las células cultivadas primarias son más adecuadas. Uno de los mejores tipos de células para la transferencia de los genes ex vivo y el trasplante subsiguiente son los astrocitos (La Gamma y colaboradores, 1993; Castillo y colaboradores, 1994; Cunningham y colaboradores, 1994; Ridoux y colaboradores, 1994; Pundt y colaboradores, 1995; Lundberg y colaboradores, 1996; Lin y colaboradores, 1997), los cuales están presentes normalmente en el SNC como las células de soporte mayor con una maquinaria secretoria eficiente. Los astrocitos injertados, modificados previamente para producir las enzimas, los neutrotransmisores o los factores tróficos, pueden integrarse y funcionar adecuadamente en el SNC (véase las referencias en Taylor, 1997) . Los astrocitos cultivados primarios de la rata han sido diseñados genéticamente para producir NGF y BDNF, y sobrevivir después del trasplante en el cerebro (Cunningham y colaboradores, 1991, 1994; Yoshimoto y colaboradores, 1995) . Recientemente, el interés en los astrocitos humanos ha crecido (Yong y colaboradores, 1992, 1992; Aloisi y colaboradores, 1992; Perzelova y Mares, 1993; Pundt y colaboradores, 1995; Lin y colaboradores, 1997) . Young y colegas (1992) reportaron que hasta 80% de las células cultivadas primarias fueron células microgliales/macrófagos. Después de la remoción de la mayoría de los oligodendrocitos y las células microgliales, 70% de las células fueron astrocitos (Yong y colaboradores, 1992) . La presencia de las células microgliales en los cultivos de astrocitos pueden provocar efectos indeseables tanto in vitro como in vivo, puesto que los mismos proliferan activamente y son los componentes mayores de la población de células inmunes. Por lo tanto, es necesario un método para producir una población de astrocitos que esté libre de las células microgliales contaminantes. La presente invención está dirigida a esta necesidad, como se describe posteriormente. La presente invención supera las desventajas de las preparaciones impuras de los astrocitos, y proporciona una preparación de células adecuadas para el tratamiento de los traumas para el SNC y para el tratamiento de los desórdenes neurodegenerativos, tales como las enfermedades de Parkinson, Huntington o Alzheimer. La cita de cualquier referencia aqui debe ser interpretada como un reconocimiento de que tal referencia está disponibles como el "Arte Previo" para la presente solicitud.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporcionar métodos y astrocitos purificados para su preparación. En una modalidad preferida, los astrocitos son astrocitos adultos, humanos. Por lo tanto, la invención proporciona un método de producción de una población de astrocitos esencialmente puros que comprende: a) la introducción de una preparación de astrocitos para un recipiente de cultivo, b) la incubación de los astrocitos del paso a) bajo condiciones que hagan posible la unión o fijación de los astrocitos al recipiente de cultivo, y c) remover las células las cuales no han sido unidas o fijadas al recipiente de cultivo en un tiempo de aproximadamente 48 horas desde el inicio del paso a) . Por "esencialmente pura" se entiende una población celular que es al menos 75% de astrocitos, preferentemente de al menos 85% de astrocitos, más preferentemente de al menos aproximadamente 95% de astrocitos, y aún más preferentemente mayor que aproximadamente 98% de astrocitos. El término "aproximadamente" significa dentro del 20%, preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. Un "recipiente de cultivo" puede ser cualquier soporte adecuado para la fijación y el crecimiento de las células incluyendo, pero sin estar limitado a, un frasco o caja de cultivo. En una modalidad preferida, los astrocitos son los astrocitos humanos. Más preferentemente, los mismos son astrocitos adultos humanos. Los astrocitos producidos de acuerdo con la presente invención están esencialmente libres de las células microgliales. Es decir, la presencia de las células microgliales no es detectada por el inmunoteñido con 0X42 y la etiquetación con la isolectina B4 de Griffonia simplici folia . En un aspecto del método de la invención, un ácido nucleico exógeno puede ser introducido en los astrocitos. El ácido nucleico puede ser introducido en los astrocitos con un vector viral, por una precipitación con el fosfato de calcio, por transfección mediadas por los liposomas, la transfección de los lipidos catiónicos, o la transfección mediada por la lipopoliamina. Preferentemente, el ácido nucleico codifica una substancia neuroactiva. La invención también proporciona una población esencialmente pura de astrocitos. Preferentemente, los astrocitos son los astrocitos humanos. Más preferentemente, los mismos son astrocitos adultos humanos. Una población de astrocitos producidos de acuerdo con la presente invención está esencialmente libre de células microgliales. En un aspecto de la invención, la población de los astrocitos comprende un ácido nucleico exógeno. En una modalidad preferida, el ácido nucleico codifica una substancia neuroactiva. El ácido nucleico puede ser el ADN o el ARN. En un aspecto, el ácido nucleico es un ADN que codifica una proteina, un polipéptido o péptido. La proteina, polipéptido o péptido puede ser un factor de crecimiento, factor neurotrófico, o enzima. Alternativamente, el ácido nucleico puede ser un ADN que codifica un ARN antisentido o una ribozima. En una modalidad preferida, el ácido nucleico está enlazado operativamente a una región reguladora que comprende un promotor regulable, un promotor inducible, un promotor especifico para la célula neural o un promotor viral. La presente invención también proporciona un implante que comprende una población de astrocitos esencialmente puros. La invención proporciona además una composición que comprende una población esencialmente pura de astrocitos que comprenden un ácido nucleico exógeno que codifica una substancia neuroactiva.

Breve descripción de los Dibujos Estos y otros objetos son logrados por esta invención, los cuales son explicados con mayor detalle en los dibujos anexos y la siguiente descripción detallada y los ej emplos . Figura 1 : Cultivo primario de la corteza cerebral de un adulto humano. (A) , Micrografias de contraste de la fase que muestran una amplificación pequeña (x70) de los cultivos primarios de los astrocitos adultos humanos. (B) , Una amplificación más grande (x560) de una división de una célula plana en la etapa de telofase. Figura 2 : Caracterización inmunocitoquimica de los cultivos primarios de los astrocitos adultos humanos. Micrografias de amplificación pequeña (x280) que ilustran que la totalidad de las células fueron GFAP- (A) y SlOOß-positivas (B) . Figura 3 : Proliferación in vi tro de los astrocitos adultos humanos.

Las velocidades de proliferación son expresadas como el porcentaje de crecimiento en el número de las células desde to. Los astrocitos adultos humanos proliferaron in vitro cuando se cultivan en FCS. Nótese que las células proliferaron dos veces tan rápido cuando fueron cultivadas en la presencia de 20% de FCS que en 10% de FCS (A) . El NGF y el bFGF (50 ng/ml) no tuvieron ningún efecto mitogénico sobre los astrocitos adultos humanos cultivados primarios (B) . Nótese que cuando el HS fue agregado al medio, la mayoría de las células no se fijaron sobre la caja de cultivo y las mismas fueron removidas del medio. Figura 4 : La inmunocitoquimica de TH después de la transducción de los astrocitos adultos humanos. (B) , micrografias de amplificación pequeña (x70) que ilustran que 50-60% de las células fueron positivas al TH una semana después de la infección (A, células no infectadas). (C) , Amplificación más elevada (x560) que ilustra los astrocitos transducidos que contienen hTH. Figura 5: Actividad de TH en los astrocitos adultos humanos transducidos. La actividad de TH se detectó dentro de la primera semana después de la infección y luego se incrementó a 35650 pmoles [3H] H20/mg prot./h el dia 14. Nótese que la actividad de TH se redujo al menos 10 veces en la presencia de doxiciclina 14 dias después de la infección.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Los siguientes términos definidos son utilizados en toda la presente especificación, y debe ser útil en el entendimiento del alcance y la práctica de la presente invención. Un "polipéptido " es un compuesto polimérico comprendido de residuos de aminoácidos enlazados covalentemente. Los residuos de aminoácidos tienen la siguiente estructura general.

H R-C-COOH NH, Los aminoácidos son clasificados en siete grupos con base en la cadena lateral R: (1) cadenas laterales alifáticas, (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxilico (OH), (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre, (4) cadenas laterales que contienen un grupo ácido o de amida, (5) cadenas laterales que contienen un grupo básico, (6) cadenas laterales que contienen un anillo aromático, y (7) prolina, un aminoácido en el cual la cadena lateral está fusionada al grupo de amino. Una "proteina" es un polipéptido que desempeña un papel estructural o funcional en una célula viviente. Los polipéptidos y las proteínas de la invención pueden ser glicosilados o no glicosilados. Una "variante" de un polipéptido o proteína es cualquier análogo, fragmento, derivado, o mutante el cual es derivado de un polipéptido o proteína y el cual retiene al menos una propiedad biológica del polipéptido o proteína. Diferentes variantes del polipéptido o proteína pueden existir en la naturaleza. Estas variantes pueden ser las variaciones alélicas caracterizadas por las diferencias en las secuencias de nucleótidos del gen estructural que codifica la proteína, o puede involucrar el empalme diferencial o la modificación postransductora. El artesano experto puede producir variantes que tienen substituciones, deleciones, adiciones, o reemplazos de los aminoácidos únicos o múltiples. Estas variantes pueden incluir, inter alia: (a) variantes en las cuales uno o más residuos de aminoácidos son substituidos con los aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) las variantes en las cuales uno o más aminoácidos son agregados al polipéptido o proteína, (c) las variantes en las cuales uno o más de los aminoácidos incluyen un grupo substituyente, y (d) variantes en las cuales el polipéptido o proteína es fusionado con otro polipéptido tal como la albúmina del suero. Las técnicas para obtener estas variantes incluyendo las técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas, y enzimáticas, ya son conocidas para las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte. Si tales variaciones alélicas, análogos, fragmentos, derivados, mutantes, y modificaciones, incluyendo las formas de empalme del ARNm alternativas y las formas de la modificación postransductora alternativas conducen a los derivados del polipéptido los cuales retienen cualquiera de las propiedades biológicas del polipéptido, las mismas están propuestas para ser incluidas dentro del alcance de esta invención. Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico comprendido de las subunidades enlazadas covalentemente llamadas nucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen el ácido polirribonucléico (ARN) y el ácido polidesoxirribonucléico (ADN) , ambos de los cuales pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. El ADN incluye el ADNc, el ADN genómico, el ADN sintético, y el ADN semisintético. La secuencia de los nucleótidos que codifica una proteína es llamada la secuencia de sentido.

Un "ácido nucleico exógeno" es un material genético el cual ha sido introducido en una célula que contiene de manera no natural la secuencia de los ácidos nucleicos. La "región reguladora" significa una secuencia de ácidos nucleicos la cual regula la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos. Una región reguladora puede incluir las secuencias las cuales son responsables de manera natural de la expresión de un ácido nucleico particular (una región homologa) o puede incluir las secuencias de un origen diferente (responsables de la expresión de diferentes proteínas o aún de proteínas sintéticas) . En particular, las secuencias pueden ser las secuencias de los genes eucarióticos o virales o las secuencias derivadas las cuales estimulan o reprimen la transcripción de un gen de una manera específica o no específica o de una manera inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen los orígenes de replicación, los sitios de empalme del ARN, los mejoradores, las secuencias de terminación transcripcional, las secuencias de la señal las cuales dirigen el polipéptido hacia las rutas secretorias de la célula de blanco u objetivo, y los promotores. Una región reguladora de una "fuente heteróloga" es una región reguladora la cual está asociada de manera no natural con el ácido nucleico expresado. Incluidas entre las regiones reguladoras heterólogas están las regiones reguladoras de unas especies diferentes, las regiones reguladoras de un gen diferente, las secuencias reguladoras híbridas, y las secuencias reguladoras las cuales no están presentes en la naturaleza, pero las cuales son diseñadas por una persona que tiene experiencia ordinaria en el arte. Un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de interés en una célula huésped. El término "vector" incluye medios tanto virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vi tro, ex vivo o in vivo. Los vectores no virales incluyen los plásmidos, los liposomas, los lípidos cargados eléctricamente (citofectinas) , los complejos de proteína-ADN, y los biopolímeros. Los vectores virales incluyen los vectores de los retrovirus, los virus adeno-asociados, los poxvirus, los baculovirus, el virus de vaccinia, el virus del herpes simple, el virus de Epstein-Barr y los adenovirus. Un ácido nucleico puede contener una o más regiones reguladoras, y/o los marcadores seleccionables útiles en la selección, la medición, y la verificación de los resultados de la transferencia del ácido nucleico (la transferencia a cuales tejidos, la duración de la expresión, etc.). El "portador aceptable farmacéuticamente" incluye los diluyentes y rellenadores los cuales son aceptables farmacéuticamente para los métodos de administración, son estériles, y pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas formuladas utilizando agentes de dispersión y humectación adecuados y agentes de suspensión. El portador aceptable farmacéuticamente particular y la relación o proporción del compuesto activo con respecto al portador son determinados por las propiedades de solubilidad y químicas de la composición, el modo particular de la administración, y la práctica farmacéutica.

Astrocitos Un aspecto de la presente invención es proporcionar una población de células de astrocitos humanos esencialmente puros. Las células purificadas pueden contener un material genético introducido que codifica un producto de interés. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar astrocitos adultos humanos que tienen las propiedades terapéuticas deseadas, y adecuados para la terapia celular ex vivo. El trasplante de las células humanas modificadas genéticamente al cerebro de la rata se describe en Sabate y colaboradores (Nature Genetics, volumen 9, pp. 256-260 (1995), el contenido de la cual se incorpora aquí para referencia. La presente invención proporciona ahora una manera muy eficiente de obtener los astrocitos humanos adultos de alta pureza, capaces de producir factores con efectos biológicos, tales como las substancias neuroactivas para una terapia del gen ex vivo. Los inventores han encontrado ahora condiciones que hacen posible la purificación, la amplificación, y la modificación in vi tro exitosa de estas células. Los niveles substanciales de la expresión de los genes fueron obtenidos en las células modificadas con un adenovirus recombinante. Los astrocitos modificados genéticamente hacen posible la terapia genética de las enfermedades neurodegenerativas y de los traumas del SNC. La combinación de las técnicas de transferencia de los genes y el trasplante de las células proporciona un enfoque para el suministro de las moléculas terapéuticas en el SNC. Los astrocitos son particularmente muy adecuados para la terapia del SNC a causa de su origen del SNC, sus mecanismos secretorios eficientes y su papel como soporte neuronal. De manera más importante, el uso de los astrocitos adultos humanos como vehículos celulares para la transferencia de los genes ex vivo abre una ruta para el trasplante autólogo, eliminando así el rechazo inmunológico y los efectos laterales de los inmunosupresores . Como se mencionó aquí, estas células pueden ser purificadas, expandidas y modificadas genéticamente in vi tro. Los astrocitos derivados de la corteza cerebral de los adultos se han hecho crecer y son mantenidos in vitro como cultivos primarios durante al menos 10 meses. Además, las células son transducidas eficientemente por los vectores virales que codifican una substancia neuroactiva. Cuando la substancia neuroactiva es la tirosina hidroxilasa humana (hTH) bajo el control negativo del sistema regulador a base de la tetraciclina (tet-off) , las células infectadas sintetizan grandes cantidades del hTH activo y liberan la L-Dopa. Además, la doxiciclina, un análogo potente de la tetraciclina, regula de manera eficiente la expresión del transgen.

Vectores Como se describió anteriormente, un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de conformidad con la invención en una célula huésped. Los vectores preferidos son los vectores virales, tales como los retrovirus, los virus del herpes, los adenovirus, los virus adeno-asociados. Por consiguiente, un gen que comprende un ácido nucleico de interés es introducido in vivo, ex vivo, o in vi tro utilizando un vector viral o por medio de la introducción directa del ADN. La expresión en los tejidos ubicados como blanco puede ser efectuada por la ubicación como un blanco del vector transgénico para las células específicas, tal como con un vector viral o un ligando del receptor, o utilizando un promotor específico para el tejido, o ambos. Los vectores virales utilizados comúnmente para la ubicación como blanco in vivo o ex vivo y los procedimientos de la terapia, son los vectores a base del ADN y los vectores retrovirales . Los métodos para la construcción y el uso de los vectores virales ya son conocidos en el arte [véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniq?es 7:980-990 (1992)]. Preferentemente, los vectores virales son defectuosos en la replicación, es decir, los mismos son incapaces de replicarse autónomamente en la célula de blanco u objetivo. En general, el genoma de los vectores virales defectuosos en la replicación los cuales son utilizados dentro del alcance de la presente invención, carece de al menos una región la cual es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas (totalmente o en parte), o hechas no funcionales por cualquier técnica conocida por una persona experta en el arte. Estas técnicas incluyen la remoción, la substitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado, la deleción parcial o la adición de una o más bases a una región esencial (para la replicación) . Tales técnicas pueden ser efectuadas in vi tro (sobre el ADN aislado) o in si tu, utilizando las técnicas de manipulación genética o por el tratamiento con los agentes mutagénicos.

Preferentemente, el virus defectuoso en la replicación retiene las secuencias de su genoma las cuales son necesarias para el encapsulamiento de las partículas virales. Los vectores virales del ADN incluyen el virus del ADN defectuoso o atenuado, tales como pero sin estar limitado al virus del herpes simple (VHS), el papilomavirus, el virus de Epstein Barr (EBV) , el adenovirus, el virus adeno-asociado (AAV) , el virus de vaccinia, y semejantes. Los virus defectuosos, los cuales completamente o casi completamente carecen de los genes virales, son preferidos. El virus defectuoso no es competente para la replicación después de la introducción en una célula, y por consiguiente no conduce a una infección viral productiva. El uso de los vectores virales defectuosos permite la administración a las células en un área localizada, específica, sin importar que el vector pueda infectar otras células. Por consiguiente, un tejido específico puede ser ubicado como blanco específicamente. Los ejemplos de los vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector del virus 1 del herpes defectuoso (VHS1) [Kaplitt y colaboradores, Molec. Cell . Neurosci . 2:320-330 (1991)], el vector del virus del herpes defectuoso que carece de un gen de la glico-proteína L [Publicación de Patente RD 371005 A] , u otros vectores del virus del herpes defectuosos [Publicación de Patente Internacional No. WO 94/21087, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional No. WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994]; un vector del adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y colaboradores [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); véase también La Salle y colaboradores, Science 259:988-990 (1993)]; y un vector del virus adeno-asociado defectuoso [Samulski y colaboradores, J. Virol . 61:3096-3101 (1987); Samulski y colaboradores, J. Virol . 63:3822-3828 (1989); Lebko ski y colaboradores, Molí . Cell . Biol . 8:3988-3996 (1988)]. Preferentemente, para la administración in vivo, un tratamiento inmunosupresivo adecuado es empleado en conjunción con el vector viral, por ejemplo, el vector del adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y las células transfectadas. Por ejemplo, las citocinas inmunosupresivas tales como la interleucina-12 (IL-12), la interferona-? (IFN-?), o el anticuerpo de anti-CD4, pueden ser administradas para bloquear las respuestas inmune humorales o celulares para los vectores virales [véase, por ejemplo, Wilson, Nature Medicine (1995)]. Además, es ventajoso emplear un vector viral que está diseñado para expresar un numero mínimo de los antígenos. Naturalmente, la invención contempla el suministro de un vector para los astrocitos que expresará una cantidad efectiva terapéuticamente de un gen de interés para las aplicaciones de terapia genética. La frase "cantidad efectiva terapéuticamente" es utilizada aquí para que signifique una cantidad suficiente para reducir al menos aproximadamente 15 por ciento, preferentemente en al menos 50 por ciento, más preferentemente al menos 90 por ciento, y aún más preferentemente para prevenir, una deficiencia significativa clínicamente en la actividad, la función y la respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad efectiva terapéuticamente es suficiente para provocar una mejora en una condición significativa clínicamente en el huésped. Cualquier vector, viral o no viral, de la invención, preferentemente será introducido ex vivo a los astrocitos en un vehículo o portador aceptable farmacéuticamente. La frase "aceptable farmacéuticamente" se refiere a las entidades y composiciones moleculares que son toleradas fisiológicamente y no producen típicamente una reacción alérgica o similar desfavorable, tales como malestares gástricos, vértigos y semejantes, cuando se administra a un ser humano. Preferentemente, cuando se utilice, el término medios "aceptables farmacéuticamente" significa aprobado por una agencia reguladora Federal o de un gobierno del estado o listado en la U.S. Pharmacopeia u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en los seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, auxiliar, excipiente, o vehículo con el cual el compuesto es administrado. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como el agua y los aceites, incluyendo aquellos del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como el aceite de cacahuete, el aceite de soya, el aceite mineral, el aceite de sésamo y semejantes. El agua o las soluciones saladas de una solución acuosa y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas son empleadas preferentemente como portadores, particularmente para las soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

Vectores de adenovirus En una modalidad preferida, el vector es un vector de adenovirus. Los adenovirus son los virus del ADN eucarióticos que pueden ser modificados para suministrar eficientemente un ácido nucleico de la invención a una variedad de tipos de células. Existen varios serotipos del adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, a la utilización de los adenovirus humanos del tipo 2 o del tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o los adenovirus de origen animal (véase W094/26914) . Estos adenovirus de origen animal los cuales pueden ser utilizados * dentro del alcance de la presente invención incluyen los adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard y colaboradores, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, de aves, y de simios (ejemplo: SAV) . Preferentemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus de canino, más preferentemente un adenovirus de CAV2 (por ejemplo Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo) . Preferentemente, los vectores adenovirales defectuosos en la replicación de la invención comprenden los ITRs, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. Todavía más preferentemente, al menos la región El del vector adenoviral es no funcional. La deleción en la región El se extiende preferentemente desde los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento PvuII-BglII) o 382 a 3446 (fragmento HinfII-Sau3A) . Otras regiones también pueden ser modificadas, en particular la región E3 (WO95/02697) , la región E2 (W094/28938) , la región E4 (W094/28152, W094/12649 y WO95/02697), o en cualquiera de los genes finales o tardíos L1-L5. En una modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región El (Ad 1.0). Los ejemplos de los adenovirus delecionados en El son descritos en EP 185,573, el contenido de la cual es incorporado aquí para referencia. En otra modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en las regiones El y E4 (Ad 3.0). Los ejemplos de los adenovirus delecionados en E1/E4 se describen en WO95/02697 y W096/22378, los contenidos de las cuales se incorporan aquí para referencia. En todavía otra modalidad preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región El dentro de la cual la región E4 y la secuencia de los ácidos nucleicos son insertados (véase FR94 13355, el contenido de la cual es incorporado aquí para referencia) . Los adenovirus recombinantes defectuosos en la replicación de acuerdo con la invención pueden ser preparados por cualquier técnica conocida por la persona experta en el arte (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 95, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, los mismos pueden ser preparados por la recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido el cual lleva, inter alia, la secuencia del ADN de interés. La recombinación homologa es efectuada a continuación de la cotransfección del adenovirus y del plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular la cual es empleada debe ser: (i) preferentemente transformable por el elemento, y (ii) contener las secuencias las cuales sean capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectuoso en la replicación, preferentemente en la forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. Los ejemplos de las líneas celulares las cuales pueden ser utilizadas son la línea celular 293 del riñon embriónico humano (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977)59) la cual contiene la porción a mano izquierda del genoma de un adenovirus de Ad5 (12%) integrada en su genoma, y las líneas celulares las cuales son capaces de complementar las funciones El y E4, como se describe en las solicitudes W094/26914 y WO95/02697. Los adenovirus recombinantes son recuperados y purificados utilizando las técnicas biológicas moleculares estándares, las cuales son bien conocidas por una persona con experiencia ordinaria en el arte.

Vectores del virus adeno-asociado Los virus adeno-asociados (AAV) son los virus del ADN de tamaño relativamente pequeño los cuales pueden integrarse, de una manera estable y específica para el sitio, en el genoma de las células las cuales los mismos infectan. Ellos son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular, y parece que no van a estar involucrados en las patologías humanas. El genoma de AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. El mismo abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una región de repetición terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, la cual sirve como un origen de replicación para el virus. El resto del genoma es dividido en dos regiones esenciales las cuales llevan las funciones de encapsulación: la parte a mano izquierda del genoma, la cual contiene el gen rep involucrado en la replicación y expresión viral de los genes virales, y la parte a mano derecha del genoma, la cual contiene el gen cap que codifica las proteínas de encapsidación del virus. El uso de los vectores derivados de los AAVs para la transferencia de los genes in vitro e in vivo ya ha sido descrito (véase WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Estas publicaciones describen varias construcciones derivadas de AAV en las cuales los genes rep y/o cap son delecionados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para la transferencia del gen de interés in vitro (en las células cultivadas) o in vivo, (directamente en el organismo) . Los AAVs recombinantes defectuosos en la replicación de acuerdo con la invención pueden ser preparados cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de interés flanqueada por dos regiones de repetición terminal invertida (ITR) de AW, y un plásmido que lleva los genes de encapsulación humanos (genes rep y cap) , en una línea celular la cual es infectada con un virus auxiliador humano (por ejemplo un adenovirus) ._ Los recombinantes de AAV los cuales son producidos, son purificados entonces por técnicas estándares .

.La invención también se refiere, por lo tanto, a un virus recombinante derivado de AAV cuyo genoma abarca una secuencia que codifica un ácido nucleico de interés flanqueado por los ITRs del AAV. La invención también se refiere a un plásmido que abarca una secuencia que codifica un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiogénico flanqueado por dos ITRs de un AAV. Tal plásmido puede ser utilizado como tal para transferir la secuencia de los ácidos nucleicos, con el plásmido, en donde sea apropiado, siendo incorporado en un vector liposómico (seudovirus) .

Vectores de retrovirus En otra modalidad el gen puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson y colaboradores, Patente U.S. No. 5,399,346; Mann y colaboradores, 1983, Cell 33:153; Te in y colaboradores, Patente U.S. No. 4,650,764; Temin y colaboradores, Patente U.S. No. 4,980,289; Marko itz y colaboradores, 1988, J. Virol. 62:1120; Temin y colaboradores, Patente U.S. No. 5,124,263; EP 453242, EP 178220; Bernstein y colaboradores, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995, por Dougherty y colaboradores; y Kuo y colaboradores, 1993, Blood 82:845. Los retrovirus son virus de integración los cuales infectan las células de división. El genoma del retrovirus incluye dos LTRs, una secuencia de encapsulación y tres regiones de codificación (gag, pol y env) . En los vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env son generalmente delecionados, totalmente o en parte, y reemplazados con una secuencia de los ácidos nucleicos heterólogos de interés. Estos vectores pueden ser construidos a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como, HIV, MoMuLV (virus de la leucemia de Moloney de murino") ; MSV ("virus de sarcoma de Moloney de murino") , HaSV ("virus de sarcoma de Harvey") ; SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV (virus del sarcoma de Rous") y el virus de Friend. Los vectores retrovirales defectuosos se describen en WO95/02697. En general, para construir los retrovirus recombinantes que contienen una secuencia de ácidos nucleicos, se construye un plásmido el cual contiene los LTRs, la secuencia de encapsulación y la secuencia de codificación. Esta construcción es utilizada para transfectar una línea celular de empaque, tal línea celular es capaz de suministrar en trans las funciones retrovirales las cuales son deficientes en el plásmido. En general, las líneas celulares de empaque son capaces así de expresar los genes de gag, pol y env. Tales líneas celulares de empaque han sido descritas en el arte previo, en particular la línea celular RA317 (US 4,861,719); la línea celular PsiCRIP (WO90/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (WO89/07150) . Además, los vectores recombinantes retrovirales pueden contener las modificaciones dentro de los LTRDs para la supresión de la actividad transcripcional así como las secuencias de encapsulación extensivas las cuales pueden incluir una parte del gen gag (Bender y colaboradores, J. Virol. 6 (1987) 1639) . Los vectores retrovirales recombinantes son purificados por técnicas estándares conocidas por aquellos que tienen una experiencia ordinaria en el arte. Los vectores retrovirales pueden ser construidos para funcionar como partículas infecciosas o para padecer una ronda única de transfección. En el primer caso, el virus es modificado para retener la totalidad de sus genes excepto aquellos responsables de las propiedades de transformación oncogénica, y para expresar el gen heterólogo. Los vectores virales no infecciosos son preparados para destruir la señal de empaque viral, pero retienen los genes estructurales requeridos para empacar el virus cointroducido diseñado para contener el gen heterólogo y las señales de empaque. Así, las partículas virales que son producidas no son capaces de producir el virus adicional. El suministro del gen ubicado como blanco se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494 publicada en octubre de 1995.

Vectores no virales Alternativamente, el vector puede ser introducido a los astrocitos por lipofección. Durante la década pasada, se ha estado incrementando el uso de los liposomas para la encapsulación y la transfección de los ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y los peligros encontrados con la transfección mediada por los liposomas pueden ser utilizados para preparar los liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner, y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackey, y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S. A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer y colaboradores, Science 259: 1145-1748 (1993)]. El uso de los lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de los ácidos nucleicos cargados negativamente, y también promueve la fusión con las membranas celulares cargadas negativamente [Felgner y Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. Particularmente, los compuestos y composiciones de los lípidos particularmente útiles para la transferencia de los ácidos nucleicos se describen en las Publicaciones de Patente Internacional W095/18863 y W096/17823, y en la Patente U.S. No. 5,459,127. El uso de la lipofección para introducir los genes exógenos en las células específicas ex vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La ubicación como blanco molecular de los liposomas para las células específicas representa un área de beneficio. Los lípidos pueden ser acoplados o unidos químicamente a otras moléculas para el propósito de la ubicación como un blanco [véase Mackey, y colaboradores, supra] . Los péptidos ubicados como blanco, por ejemplo, las hormonas o los neurotransmisores, y las proteínas tales como los anticuerpos, o las moléculas diferentes de los péptidos podrían ser acopladas o unidas a los liposomas químicamente. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico, tales como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional W095/21931), los péptidos derivados de las proteínas de unión del ADN (por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional W095/21931) . También es posible introducir el vector como un plásmido de ADN puro. Los vectores de ADN puros para la terapia genética pueden ser introducidos en las células huésped deseadas por los métodos conocidos en el arte, por ejemplo, la transfección, la electroporación la microinyección, la transducción, la fusión celular, el DEAE dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola de genes, o el uso de un transportador del vector del ADN [véase, por ejemplo, Wu y colaboradores, J. Biol . Chem. 267:963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol . Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut y colaboradores, Canadian Patent Application No. 2,012,311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:2726-2730 (1991)]. Los enfoques de suministro del ADN mediados por un receptor también pueden ser solicitados [Curiel y colaboradores, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu y Wu, J. Biol . Chem. 262-4429-4432 (1987)]. Ácidos Nucleicos La modificación genética y el injerto de los astrocitos hace posible su uso en numerosas aplicaciones, dependiendo del material genético introducido. Los genes reporteros, tales como el gen Lac Z pueden ayudar a resolver cuestiones científicas importantes en el campo del desarrollo neuronal. En particular, el potencial de los progenitores explantados desde varias zonas del cerebro que sobreviven y se diferencian independientemente de su origen podría ser investigado vigilándolos después del injerto en varias zonas de desarrollo o en los cerebros de los adultos. Los ácidos nucleicos que comprenden un gen terapéutico son de interés particular. Estos genes incluyen cualquier gen que codifica una substancia neuroactiva; una substancia capaz de ejercer un efecto benéfico sobre las células del sistema nervioso central. Puede ser una substancia capaz de compensar una deficiencia en, o de reducir un exceso de una substancia endógena. Alternativamente, puede ser una substancia que confiera nuevas propiedades sobre las células. La substancia neuroactiva puede ser una secuencia antisentido, un polipéptido o una proteína. Entre los polipéptidos y las proteínas adecuadas para la práctica de la invención están los factores del crecimiento, los factores neurotróficos, las citocinas, los neurotransmisores, las enzimas, los receptores de los neurotransmisores y los receptores de las hormonas . Preferentemente, el factor de crecimiento es un factor estimulante de las colonias (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF, y semejantes), el factor del crecimiento de las células endoteliales (ECGF, FGF1), el factor de crecimiento de los fibroblastos (aFGGa, bFGF) o el factor del crecimiento de las células vasculares (VEFG) . Entre los factores neurotróficos, los factores preferidos son el factor neurotrófico ciliar (CNTF) , los factores de maduración de las células guales (GMFa,b), GDNF, BDNF, NT-3, NT-5 y semejantes. La secuencia de nucleótidos completa que codifica NT-3 se describe en WO91/03569, el contenido de la cual es incorporado aquí para referencia. Las citocinas preferidas son las interleucinas y las interferonas. Las enzimas incluidas dentro del alcance de la invención son las enzimas para la biosíntesis de los neurotransmisores (tirosina hidroxilasa, acetilcolina transferasa, ácido glutámico descarboxilasa) y las enzimas lisosómicas (hexosaminidasas, arilsulfatasa, glucocerebrosidasa, HGPRT) . Las enzimas involucradas en la destoxificación de los radicales libres (super óxido dismutasa I, II o III, catalasa, glutationa peroxidasa) son preferidas. Los receptores incluyen los receptores de los andrógenos (involucrados en la enfermedad de Kennedy) . Estas proteínas pueden ser utilizadas en la forma natural, o en la forma de una variante o fragmento de la misma. La substancia neuroactiva también puede ser una secuencia antisentido. La regulación descendente de la expresión de los genes utilizando los ácidos nucleicos antisentido puede ser lograda al nivel traduccional o transcripcional. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son preferentemente los fragmentos de los ácidos nucleicos capaces de hibridizarse específicamente con un ácido nucleico que codifica una substancia neuroactiva endógena o el ARN mensajero correspondiente. Estos ácidos 3$ nucleicos antisentido pueden ser los oligonucleótidos sintéticos, opcionalmente modificados para mejorar su estabilidad y su selectividad. Los mismos también pueden ser las secuencias del ADN cuya expresión en la célula produce un ARN complementario con respecto a la totalidad o una parte del ARNm que codifica una substancia neuroactiva endógena. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser preparados por la expresión de todo o parte de un ácido nucleico que codifica una substancia neuroactiva endógena, en la orientación opuesta, como se describió en EP 140308. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención siempre que la misma sea capaz de la regulación descendente o el bloqueo de la expresión de la substancia neuroactiva endógena. Preferentemente, la secuencia de antisentido es de al menos 20 nucleótidos de longitud. La preparación y el uso de los ácidos nucleicos antisentido, el ADN que codifica los ARNs antisentido y el uso del antisentido oligo y genético se describe en WO92/15680, el contenido de la cual es incorporado aquí para referencia. El ácido nucleico puede ser de un origen natural o artificial. El mismo puede ser especialmente el ADN genómico (ADNg), el ADN complementario (ADNc), las secuencias híbridas o las secuencias sintéticas o semisintéticas. Las mismas pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano o viral y semejantes. También puede ser obtenido por cualquier técnica conocida por las personas expertas en el arte, y especialmente por la selección de las bibliotecas, por síntesis química, o alternativamente por los métodos mezclados que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por la selección de las bibliotecas. El mismo es preferentemente el ADNc O el ADNg. Los productos terapéuticos más preferidos incluyen en el caso de la enfermedad de Parkinson, el ADNc que codifica la tirosina hidroxilasa (TH) , un factor neurotrófico tal como el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) el cual favorece la sobrevivencia de las neuronas dopaminérgicas . De manera similar, para la enfermedad de Alzheimer, el ADNc que codifica la colina acetil transferasa y/o el NGF (factor del crecimiento de los nervios) podría- prevenir la degeneración de las neuronas colinérgicas. Los descubrimientos recientes sugieren que los factores neurotróficos semejantes al BDNF y GDNF pueden ser los factores tróficos para las células dopaminérgicas. La introducción en los astrocitos del material genético que codifica los factores neurotróficos se espera que mejore la sobrevivencia de los injertos. Varios vectores del adenovirus que codifican los genes terapéuticos han sido construidos ahora. Por ejemplo, un adenovirus que codifica la tirosina hidroxilasa (TH) , ha sido construido. El injerto de los astrocitos infectados in vi tro de acuerdo con la invención constituye una forma muy eficiente de suministrar cantidades terapéuticas del TH en el cerebro. Otros vectores derivados del adenovirus que codifican los genes terapéuticos incluyen el Ad-aFGF, Ad-bFGF, Ad-GDNF, Ad-GAD. El material genético de interés también puede ser un ARN antisentido o ribozima o una molécula de ADN que codifica el ARN antisentido o el ribozima. Estos productos son de interés particular para inhibir la producción de las proteínas tóxicas tales como el precursor del ß-amiloide, las proteínas TAU, etc. Preferentemente, el material genético es un ADN que codifica una proteína o péptido de interés. Como se indicó anteriormente, la proteína o péptido es preferentemente una substancia neuroactiva tal como un factor de crecimiento (es decir una citocina) , un factor neurotrófico, una enzima o un neurotransmisor. En otra modalidad, el material genético es un ADN que codifica un ARN antisentido o un ribozima.

Regiones Reguladoras En general, los ácidos nucleicos de la presente invención están enlazados a una o más regiones reguladoras.

Las regiones pueden incluir un promotor inducible o regulable; un promotor específico para las células neurales, o un promotor viral. La selección de la región o regiones reguladoras apropiadas es un asunto de rutina, dentro del nivel de experiencia ordinaria en el arte. Las regiones reguladoras pueden comprender una región promotora para la transcripción funcional en los astrocitos, así como una región situada en 3' del gen de interés, y el cual especifica una señal para la terminación de la transcripción y un sitio de poliadenilación. Todos estos elementos constituyen un cásete de expresión. Los promotores que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen tanto los promotores constitutivos como los promotores regulados (inducibles) . El promotor puede ser responsable naturalmente de la expresión del ácido nucleico. También puede ser de una fuente heteróloga. En particular, pueden ser secuencias promotoras de los genes eucarióticos o virales. Por ejemplo, pueden ser secuencias promotoras derivadas del genoma de la célula la cual se desea infectar. De manera semejante, pueden ser secuencias promotoras derivadas del genoma de un virus, incluyendo el adenovirus utilizado. A este respecto, se pueden mencionar, por ejemplo, el adenovirus E1A o el promotor final mayor (MLP) , un promotor de citomegalovirus (CMV) o un promotor del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) .

Además, el promotor puede ser modificado por la adición de las secuencias de activación o reguladoras o las secuencias que permiten una expresión predominante o específica para el tejido (promotores de enolasa y GAFP y semejantes) . Además, cuando el ácido nucleico no contiene las secuencias promotoras, puede ser insertado, tal como en el genoma del virus corriente abajo del tal secuencia. Algunos promotores útiles para la práctica de esta invención son los promotores ubicuos (por ejemplo HPRT, vimentina, actina, tubulina), los promotores de los filamentos intermedios (por ejemplo desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP), promotores del gen terapéutico (por ejemplo del tipo de MDR, el CTFR, el factor VIII), los promotores específicos para el tejido (por ejemplo el promotor de la actina en las células de los músculos lisos) , los promotores los cuales son activados preferentemente en la división de las células, los promotores los cuales responden a un estímulo (por ejemplo el receptor de la hormona esteroide, el receptor del ácido retinóico) , los moduladores transcripcionales regulados por la tetraciclina, los promotores del citomegalovirus inmediato-inicial, el LTR retroviral, la metalotioneina, el SV-40, el Ela, y MLP. Los moduladores transcripcionales regulados por la tetraciclina y los promotores de CMV se describen en WO 96/01313, las patentes US 5,168,062 y 5,385,839, los contenidos de las cuales son incorporados aquí para referencia.

Administración Farmacéutica La presente invención hace posible la purificación y la amplificación de los astrocitos humanos adultos, y su uso para el suministro exitoso de los genes in vi tro con una eficiencia elevada. Estas células pueden ser administradas entonces al SNC de los organismos receptores. La invención por medio de esto proporciona aplicaciones clínicas y científicas importantes, tales como el tratamiento de los traumas para el SNC y de los desórdenes neurodegenerativos. El proceso de acuerdo con la presente invención hace posible ubicar como blanco de una manera precisa una región particular del SNC, tal como un sitio dentro del cerebro, dependiendo del gen terapéutico transferido y el desorden que va a ser tratado. Por consiguiente, de acuerdo al sitio de la lesión que va a ser tratada, la administración se hace en los sitios del cerebro que incluyen, por ejemplo, el striatum, el hipocampo o la substancia nigra. Preferentemente, los genes son injertados en el striatum o cuerpo estriado. De acuerdo con la presente invención, ahora es posible, por la inyección estereotáctica, suministrar los astrocitos para el injerto. La determinación de las coordenadas para la administración podría estar basada en el desorden que va a ser tratado, y podría ser determinada por el practicante experto. El régimen terapéutico real, incluyendo el sitio de la(s) inyección (es) , el número y el programa de las inyecciones, y la(s) dosificación.(es) particular (es) , también podría ser determinado por el practicante experto. En general, el número de las células injertadas en el sitio será de entre 1 x 103 y 1 x 1010, preferentemente 1 x 105 a 1 x 109, y más preferentemente 1 x 106 a 1 x 108. También es un objeto de la invención proporcionar un implante que comprende las células de astrocitos como se describieron anteriormente. De manera preferente, el implante contiene el material no celular que incrementa la supervivencia y la proliferación y diferenciación in vivo de las células. El implante puede contener por ejemplo colágeno, gelatina, fibronectina, lectinas, soportes biocompatibles tales como hueso o fibras de politetrafluoroetileno, etc.). La invención también se refiere a un método para el suministro de un producto terapéutico para el SNC de un receptor que comprende el injerto en el cerebro del receptor de los astrocitos humanos modificados genéticamente que contienen el material genético introducido que codifica el producto terapéutico.

La invención proporciona la expresión segura, no tóxica, a largo plazo de los genes terapéuticos in vivo. La invención es de interés particular en el tratamiento de los desordenes neurodegenerativos tales como las neuropatías, los ataques, las lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica, la corea de Huntington, las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, la parálisis cerebral, la epilepsia, las enfermedades lisosómicas (por ejemplo las enfermedades de Tay Sachs y Sandhoff, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Gaucher, la mucopolisacaridosis, Lesh Nyhan, etc.), así como los tumores cerebrales. La presente invención puede ser mejor entendida por la referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos, los cuales son provistos como ejemplares de la invención.

Ejemplos La presente invención será descrita con mayor detalle con la ayuda de los siguientes ejemplos los cuales deben ser considerados co o ilustrativos y no como limitativos. El Ejemplo 1 describe un protocolo de cultivo celular que hace posible la recuperación de cultivos primarios puros, a largo plazo, de los astrocitos adultos humanos. El Ejemplo 2 demuestra que estas células pueden ser modificadas genéticamente utilizando un vector adenoviral que codifica una tirosina hidroxilasa (TH) humana bajo el control del sistema regulador basado en la tetraciclina (tet-off) (Gossen y Bujard, 1992) . La TH es la enzima limitante de la velocidad para la síntesis de las catecolaminas, convirtiendo la tirosina a la L-Dopa. Varios estudios han demostrado su potencial terapéutico en el modelo animal de la enfermedad de Parkinson (Wolff y colaboradores, 1989; Horellou y colaboradores, 1990a,b; Fisher y colaboradores, 1991) . Las células infectadas produjeron grandes cantidades de la hTH activa en la ausencia de la doxiciclina, un análogo potente de la tetraciclina.

Biologia Molecular General De acuerdo con la presente invención se pueden emplear la biología molecular convencional, la microbiología, y las técnicas del ADN recombinantes dentro de la experiencia del arte. Tales técnicas son explicadas totalmente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Labora tory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (aquí posteriormente "Sambrook * y colaboradores, 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)], Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel y colaboradores (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) .

Ejemplo 1: Explantación y caracterización de los astrocitos adultos humanos cultivados primarios 1.1 Cultivo de las células El tejido humano adulto fue aislado de la corteza cerebral de los pacientes (edad promedio 51.5+16.8 años de edad que padecen resecciones quirúrgicas, con el consentimiento del paciente de acuerdo con la política del hospital. Inmediatamente después de la cirugía, el tejido fue disociado mecánicamente y centrifugado en DMEM/F12 (Sigma) que contiene la D-glucosa (3.15 g/1), HEPES (3.57 g/1), bicarbonato de sodio (1.2 g/1), y suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FCS, Seromed) , 2 mM glutamina (Gibco), antibióticos (mezcla de penicilina/estreptomicina, 100 µg/ml, Gibco), y fungizona (Gibco), pH 7.4. La pildora fue resuspendida en el mismo medio y colocada en un recipiente de cultivo de 5 cm (Costar) . Los cultivos fueron mantenidos a 37 °C en una atmósfera húmeda que contiene 10% de C02. Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio fue cambiado. Estos cultivos primarios fueron mantenidos cambiando el medio una vez a la semana después de esto. Como en los procedimientos de congelamiento/descongelamiento, las células confluentes fueron colectadas con 0.25% de tripsina y 0.2% de EDTA (Gibco) y se lavaron rápidamente con una solución salada amortiguada con fosfato (PBS, 0.1 M, pH 7.4) para remover el medio que contiene el suero. Las células fueron congeladas entonces a -20 °C y finalmente se almacenaron a -80 °C en DMEM/F12 suplementado con sulfóxido de dimetilo al 10% (DMSO, Sigma) . Las células fueron licuadas o descongeladas colocando la ampolleta en un baño de agua a 40 °C durante 2-4 minutos, y se volvieron a colocar en placas en un recipiente de cultivo Costa. Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio fue reemplazado para eliminar el DMSO. 1.2 Evaluación de la proliferación de las células Se utilizaron dos métodos diferentes; el conteo directo bajo el contraste de la fase en un área predeterminada de 2 mm: la etiquetación con GFAP-bromodesoxiuridina (BrdU, un análogo de la timidina la cual es incorporada solamente replicando el ADN) , revelados con un protocolo de inmunofluórescencia doble. Las células cultivadas primarias fueron colocadas en placas sobre cajas de Petri NUNC® (60x15 mm) con rejillas (2 mm2) en DMEM/F12. La velocidad de proliferación fue determinada bajo varias condiciones de cultivo: (a) sin FCS, (b) con 10% de FCS, (b) 20% de FCS, (c) 10% FCS y 5% de suero de caballo (HS), (d) 10% de FCS y 10% de HS, (e) NGF (50 ng/ml, Sigma), (f) bFGF (50 ng/ml, Boehringer-Mannheim) . Para los experimentos de la proliferación, el medio fue cambiado dos veces a la semana. Todos los cultivos fueron contados cada 10 horas durante 80 horas. La actividad de NGF y el bFGF utilizados fueron averiguados por bioensayo: la extensión neurítica de . las células de pC12 (cultivados sobre las placas recubiertas con poliornitina en RPMI suplementado con 10% de HS y 5% de FCS) expuesta a NGF (50 ng/ml), y la diferenciación de las células progenitoras neuroepiteliales en la presencia de bFGF (10 ng/ml en DMEM/HAMF12 (véase las referencias en Sabate y colaboradores, 1995) ) . Para los experimentos de incorporación de BrdU, el BrdU fue agregado a los cultivos primarios 2 días después de la colocación en las placas. Los cultivos fueron incubados en la presencia de 5 o 10 µM de BrdU durante 4 días. El tratamiento con BrdU se efectuó simultáneamente sobre las células 3T3 y 293 como los controles de la proliferación. Las células positivas fueron detectadas por inmunocitoquímica, como se indica posteriormente. 1.3 Procedimientos inmunocitoquimicos Las células en los cultivos primarios fueron enjuagados rápidamente en PBS, incubados en una solución de fijación (4% de paraformaldehido en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de los enjuagues en PBS, las células fueron tratadas con una solución de bloqueo (10% de suero de cabra y 0.2% de Tritón X-100 en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se incubaron con el anticuerpos policlonal primario (GFAP, Dakopatts, 1:100; SlOOß, Sigma, diluida 1:100; TH, Inst. J. Boy, diluida 1:200; BrdU, Jackson, 1:50; 0X42, Cedarlane, 1:200) que contiene 5% de suero de cabra y 0.1% de Tritón X-100 en PBS. Para la inmunodetección del BrdU, las células fueron desnaturalizadas primero en HCl 2N durante 20 minutos, a temperatura ambiente. Después de la neutralización en borato de sodio 0.1 N durante 10 minutos, las muestras fueron enjuagadas en PBS y procesadas como se describió para la inmunocitoquímica de GFAP. 1.4 Caracterización de los astrocitos cultivados Para evaluar el potencial de los astrocitos adultos humanos para el trasplante autólogo en el SNC, fue necesario primero probar si estas células pueden ser mantenidas como cultivos primarios. Los estudios previos reportaron que los cultivos primarios de los astrocitos adultos humanos fueron enriquecidos en las células microgliales (Yong y colaboradores, 1991, 1992) . La composición del medio y los tiempos entre la resección del tejido y la siembra de las células se hicieron variar para optimizar los procedimientos del cultivo para obtener las preparaciones enriquecidas con los astrocitos. El DMEM suplementado con el suero es un medio de cultivo apropiado para los cultivos astrogiales de los roedores . El DMEM enriquecido suplementado con el suero de bovino fetal (FCS) y con los nutrientes de HAM/F12, fue utilizado para los cultivos de los astrocitos. Las primeras células para fijarse al disco o placa de cultivo después de la disociación y la siembra son los astrocitos. Se probaron varios tiempos de retardo (24-120 horas) hasta el primer cambio del medio que contiene las células no fijadas y/o muertas y los desechos celulares. Un retardo de 48 horas (2 días) fue óptimo para obtener los cultivos astrogliales esencialmente puros. Sorprendentemente, las células microgliales no se fijan a la placa de cultivo bajo estas condiciones. Después de dos días en DMEM/F12 suplementado con FCS al 10%, las células fueron aplanadas en la placa de cultivo. Aunque la morfología celular dependió de la confluencia del cultivo, la gran mayoría de las células exhibió una morfología poligonal plana (Figuras 1A-B) . Las células aplanadas fueron identificadas por la inmunodetección de los marcadores astrogliales incluyendo el GFAP, la proteína de gliofilamento mayor, y SlOOß, una proteína de unión del calcio citoplásmica (Figura 2) . Virtualmente la totalidad de las células cultivadas primarias fueron positivas a GFAP (Figura 2A) y positivas a SlOOß (Figura 2B) . La presencia de las células microgliales en los cultivos fue probada por inmunoteñido con OX42 y la etiquetación con la isolectina de B4 a partir de Griffonia simplici folia, la cual fue utilizada como un marcador específico para las células microgiales (Streit, 1990) . No se observó ningún teñido, que confirme la presencia de un cultivo de los astrocitos esencialmente libre de las células microgliales. Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que la presente invención proporciona un cultivo esencialmente puro de los astrocitos adultos humanos. La inspección microscópica de los cultivos reveló que muchas células positivas a GFAP estuvieron en la mitosis (Figura IB) . 1.4.1 Proliferación in vitro de los astrocitos adultos humanos Las observaciones preliminares indicaron que sin el FCS, ninguna o pocas de las células cultivadas se estuvieron dividiendo, mientras que los perfiles mitóticos fueron observados frecuentemente cuando el FCS al 10% fue agregado al medio de DMEMF12. La etiquetación in unofluorescente doble del GFAP y BrdU reveló que las células de división fueron los astrocitos. La capacidad de los astrocitos adultos humanos cultivados primarios para proliferar en varias condiciones de cultivo fue analizada. Las moléculas solubles que incluyen los factores tróficos de NGF y bFGF, y el suero de varias especies tienen propiedades mitogénicas sobre los astrocitos fetales de los roedores y los seres humanos, cultivados (véanse las referencias en Yong y colaboradores, 1991, 1992, y Stachowiak y colaboradores, 1997). Los efectos de varias combinaciones, incluyendo el FCS, el HS, el bFGF y el NGF, sobre la proliferación celular, fueron probados: FCS al 0, 10 y 20%, FCS al 10% suplementado con 5 o 10% de HS, DMEM suplementado con 50 ng/ml de bFGF, DMEM suplementado con 50 ng/ml de NGF (Figuras 3A-B) . Doce horas después de la siembra en la presencia del FCS, las células se fijaron y aplanaron sobre la superficie de la placa. Las células solamente proliferaron en la presencia del FCS (Figura 3A) , y la proliferación fue máxima al 20% de FCS. Cuando se cultivaron en la presencia de 10% o 20% de FCS, la población astroglial se duplicó en 40 horas y 20 horas respectivamente (Figura 3A) . La velocidad de proliferación de las células en la presencia de FCS al 20% es adecuada para el trasplante de las células, haciendo posible la recuperación de l-5xl06 astrocitos adultos humanos dentro del transcurso de un mes desde una sola biopsia. Sorprendentemente, la adición de NGF o bFGF (50 ng/ml del medio) no aceleró la proliferación de los astrocitos adultos humanos (Figura 3B) . Cuando se cultivó con el FCS suplementado con 5 o 10% de HS, la mayoría de los astrocitos adultos humanos no se fijó a la placa de cultivo y permaneció en el medio. Sin embargo, una cantidad pequeña de las células esféricas se fijaron pero no se aplanaron sobre la placa de cultivo. Desde los 3 días después del aplanado, algunas de las células fijadas se aplanaron y proliferaron muy lentamente (Figura 3B) . En resumen, los astrocitos adultos humanos pueden ser expandidos in vi tro en la presencia del FCS. Veinte por ciento del FCS hace posible la recuperación de un gran número de células adecuadas para el trasplante de las células. 1.4.2 Caracterización de las células a continuación de las procedimientos de congelamiento/descongelamiento Un paciente puede recibir más de un trasplante. Por lo tanto, un asunto en el desarrollo del injerto autólogo en los seres humanos es la criopreservación de los astrocitos cultivados primarios a partir de una sola biopsia. Las células astrogliales de un adulto humano fueron probadas para verificar el crecimiento después de los procedimientos de congelamiento y descongelamiento. En el primer paso, que corresponde a 3-4 semanas in vi tro en DMEM/F12 suplementado con 10% de FCS, las células cultivadas fueron congeladas y mantenidas a -80 °C durante 2-6 meses. Luego, las células fueron descongeladas rápidamente y sembradas en DMEM/F12 suplementado con 10% de FCS. Las células fueron observadas cuidadosamente todos los días . Diez horas después del descongelamiento y la siembra, las células se fijaron y se aplanaron sobre la placa de cultivo. Las mismas exhibieron características morfológicas e inmunocitoquímicas similares que las células las cuales no han sido sometidas a procedimientos de congelamiento. El inmunotefiido con GFAP y SlOOß confirmó que estas células conservaron su fenotipo astroglial. Durante el primer día después de la colocación en placas, las células no proliferaron. Entre el día 2 y el día 3, se observaron los primeros perfiles mitóticos. Luego, se aceleró la expansión celular, y el tiempo de división promedio fue de 60 horas en la presencia de FCS al 10% (Figura 3A) . Por lo tanto, los astrocitos adultos humanos obtenidos de acuerdo con la presente invención mantienen su capacidad para dividirse a continuación de los procedimientos de congelamiento/descongelamiento.

E emplo . Modificación genética de los astrocitos cultivados 2.1. Vectores adenovirales Los vectores adenovirales representan herramientas eficientes para transferir los genes extraños a las células nerviosas como es mostrado por estudios recientes en donde la inyección intracerebral directa al cerebro de un roedor proporciona una terapia genética del sistema nervioso central (WO94/08026) . Para amplificar el número de las células adecuadas para el injerto, los inventores han demostrado que los adenovirus recombinantes pueden permitir eficientemente la transferencia de los genes a los astrocitos humanos cultivados. Muchos vectores derivados de los adenovirus han sido descritos en la literatura y pueden ser preparados por un experto en el arte. Tales vectores pueden ser utilizados en la presente invención. (Véase en particular EP 185 573, Perricaudet y colaboradores, FEBS Letters 267 (1990) 60; Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195, FR 9305954, FR9308596, W094/12649) . Un vector de Ad.RSVßgal ha sido descrito previamente en la literatura. Véase por ejemplo Stratford-Perricaudet y colaboradores ( J. Clin . Invest . 90, 626-630 (1992)). Este vector contiene el gen LacZ de E. coli insertado en un adenovirus Ad5 delecionado para las regiones El y E3. 2.2 Infección de los astrocitos adultos humanos con AdPGKtet hTH-1 Las células fueron sembradas sobre placas de cultivo de 6 cavidades a una densidad de 6x1O4 células/cavidad en DMEM/F12 sin suero (FCS) . Luego, las células fueron incubadas durante 4-6 horas con AdPGKtet hTH-1, en las cuales un gen de tirosina hidroxilasa humana (hTH-1) está bajo el control del sistema regulador "tet-off" basado en la tetraciclina (Gossen y Bujard, 1992) . El gen de hTH y el transactivador son estimulados respectivamente por un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) y CMV mínimo. Las diferentes multiplicidades de infección (MOI) fueron probadas (75, 150 y 300 pfu/células) . La doxiciclina fue agregada al medio de cultivo a una concentración final de 10 ng/ml. El medio fue renovado cada segundo día. 2.3 Evaluación de la actividad de TH y la producción de L-Dopa por los astrocitos adultos humanos transducidos Tres, 7 y 14 días después de la infección, las células fueron colectadas y procesadas para medir la actividad de TH y evaluar la producción de L-Dopa. La actividad de TH de las microesferas celulares fue evaluada como se describió previamente (Reinhard y colaboradores, 1986) . La producción de L-dopa fue evaluada después de hacer crecer los astrocitos humanos durante 24 h en DMEM/F12 sin FCS. El medio acondicionado fue colectado, y se mezclaron alícuotas de 0.5 ml con una suspensión de alúmina (40 mg/ml) en Tris-HCl 0.05 M, pH 8.6. Cada mezcla fue agitada entonces continuamente durante 10 minutos, se lava con la solución amortiguadora Tris-HCl, y la alúmina se colecta finalmente por centrifugación (800 g, 5 minutos, 4 °C) . Los catecoles adsorbidos sobre el gel de alúmina fueron eluidos con ácido perclórico 0.6 N (0.1 ml por muestra), y el eluido se neutralizó con fosfato de potasio 2 M pH 7.4 (20 µl por muestra) . Después de la centrifugación (30 000 g, 15 minutos, 4 °C), se inyectaron alícuotas de 10 µl del sobrenadante despejado en una columna de cromatografía líquida de alta resolución (Ultrasphere IP, 25 cm, 0.46 cm de diámetro externa, 5 µm) para la cuantificación electroquímica de L-dopa, como se describió con detalle aquí en otra parte (Darién y colaboradores, 1989) . 2.4 Resultado del diseño Genético de los Astrocitos Adultos Humanos Los astrocitos adultos humanos cultivados pueden ser modificados por un vector adenoviral recombinante. La transducción óptima es obtenida por la infección de las células con una preparación viral de 300 pfu/célula durante 6 horas. Ninguna toxicidad obvia fue observada. Cincuenta-60% de las células fueron positivas a hTH como se evaluó por la inmunocitoquímica (Figuras 3A-B) . Un ensayo enzimático desarrollado por Reinhard y colegiados (1986) se utilizó para probar si el hTH fue activo a los 3, 7 y 14 días después de la infección. La actividad de TH fue detectable 3 días después de la infección (1,290 pmoles/mg prot/h), y más elevada los días 7 (19,000 pmoles (mg prot/h) y 14 (35,650 pmoles/mg prot/h) . Además, los ensayos de CLAR mostraron que los astrocitos humanos transducidos con TH produjeron 1 µg de L-Dopa/106 células/24 h, 14 días después de la infección. Para probar la eficacia del sistema regulador a base de tetraciclina, los cultivos astrogliales fueron tratados (10 ng/ml), un análogo potente de la tetraciclina. La doxiciclina redujo eficientemente la expresión de TH. La actividad de TH fue reducida al menos 10 veces en la presencia de la doxiciclina el día 14 (3,590 pmoles/mg prot/h en las células tratadas con doxiciclina contra 35,650 pmoles/mg prot/h en los cultivos no tratados) (Figura 4). Esto indicó que la expresión de hTH-1 fue controlada eficientemente por la doxiciclina. Sin embargo, como se muestra en la Figura 4, en los astrocitos tratados con la doxiciclina, el nivel de la actividad de TH no regresó a la línea base. Esta observación sugirió que el promotor mínimo P*hCMV, el cual estimula la expresión de hTH-1 en el vector de AdPGKtet hTH-1, tiene una actividad basal en los astrocitos adultos humanos cultivados primarios. Realmente, los estudios previos reportan la activación de un promotor de hCMV en los astrocitos bajo ciertas condiciones experimentales, tales como después de las lesiones, sugiriendo una regulación ambiental del promotor de hCMV (McCarthy y colaboradores, 1995; Fritschy y colaboradores, 1996) . 2.5 Uso de otros vectores Co o se indicó anteriormente, otros tipos de vectores pueden ser utilizados para modificar genéticamente los astrocitos de acuerdo con la invención. Estos pueden ser vectores virales o no virales (químicos) . Los vectores virales preferidos incluyen AAV, los retrovirus, los virus del herpes y el virus de vaccinia. Ninguno de los vectores virales incluyen la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por los liposomas, la transfección de los lípidos catiónicos y la transfección mediada por la lipopoliamina . Todas las referencias descritas aquí son incorporadas para referencia. Un experto en el arte apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes aquí. Los péptidos, polinucleótidos, métodos, procedimientos y técnicas descritos aquí son presentados como ejemplos representativos de las modalidades preferidas, y están propuestos para que sean ejemplares y no están propuestos como limitaciones sobre el alcance de la presente invención. Los cambios allí y otros usos serán evidentes para aquellas personas con experiencia en el arte, los cuales están abarcados dentro del espíritu de la invención o definidos por el alcance de las reivindicaciones anexas.

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Claims (32)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método de producción de una población esencialmente pura de astrocitos, el método está caracterizado porque comprende: a) introducir una preparación de astrocitos a un recipiente para cultivo, b) incubar los astrocitos del paso a) bajo condiciones que hacen posible la fijación de los astrocitos al recipiente de cultivo, y c) remover las células las cuales no han sido fijada al recipiente de cultivo en un intervalo de tiempo de aproximadamente 48 horas desde el inicio del paso a) .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los astrocitos son los astrocitos humanos .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los astrocitos humanos son astrocitos adultos humanos.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población esencialmente pura de los astrocitos está esencialmente libre de las células microgliales.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los astrocitos son los astrocitos primarios obtenidos por la resección quirúrgica de un paciente.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células no fijadas son removidas del recipiente de cultivo por un cambio del medio de cultivo.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un paso d) de introducir un ácido nucleico en los astrocitos.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico es introducido en los astrocitos con un vector viral.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el vector viral es seleccionado del grupo que consiste de los adenovirus, el virus del Herpes, el AAV, los retrovirus y el virus de vaccinia.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el vector viral es- un vector adenoviral defectuoso en la replicación.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico es introducido en los astrocitos por la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por los liposomas, la transfección de los lípidos catiónicos, o la transfección mediada por la lipopoliamina.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico codifica una substancia neuroactiva.
13. 13. Una población esencialmente pura de astrocitos, caracterizada porque es producida por el método de conformidad con la reivindicación 1.
14. 14. Una población, caracterizada porque es una población esencialmente pura de astrocitos.
15. 15. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los astrocitos son los astrocitos humanos.
16. 16. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los astrocitos humanos son los astrocitos adultos humanos.
17. 17. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la población de los astrocitos está esencialmente libre de células microgliales.
18. 18. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque los astrocitos son los astrocitos primarios obtenidos por la resección quirúrgica de un paciente.
19. 19. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque además comprende un ácido nucleico exógeno.
20. 20. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el ácido nucleico es introducido en los astrocitos con un vector viral.
21. 21. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el vector viral es seleccionado del grupo que consiste del adenovirus, el virus del herpes, el AAV, los retrovirus y el virus de vaccinia.
22. 22. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el vector viral es un vector adenoviral defectuoso en la replicación.
23. 23. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el ácido nucleico es introducido en los astrocitos por la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por los liposomas, la transfección de los lípidos catiónicos, o la transfección mediada por las lipopoliaminas.
24. 24. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el ácido nucleico codifica una substancia neuroactiva.
25. 25. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el ácido nucleico es el ADN o el ARN.
26. 26. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el ácido nucleico es un ADN que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido.
27. 27. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la proteína, el polipéptido o el péptido es seleccionado del grupo que consiste de los factores del crecimiento, los factores neurotróficos, y las enzimas.
28. 28. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el ácido nucleico es un ADN que codifica un ARN antisentido o un ribozima.
29. 29. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el ácido nucleico está enlazado operativamente a una región reguladora.
30. 30. La población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la región reguladora comprende un promotor regulable, un promotor inducible, un promotor específico para las células neurales o un promotor viral.
31. 31. Un implante, caracterizado porque comprende una población de astrocitos de conformidad con la reivindicación 14.
32. 32. Una composición, caracterizada porque comprende una población esencialmente pura de los astrocitos que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una substancia neuroactiva.