KR20020007361A - 활성 성분을 운반하는데 사용된 폴리오마 바이러스의바이러스 단백질 2 또는 3의 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 1(VP1)에 활성 성분을 고정하는 합성 생물학적 활성 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 A1이 그 끝의 하나에서 활성 성분에 결합된다.

Description

활성 성분을 운반하는데 사용된 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 또는 3의 단편{FRAGMENTS OF VIRUS PROTEIN 2 OR 3 OF POLYOMA VIRUS, USED FOR TRANSPORTING ACTIVE INGREDIENTS}
본 발명은 합성 생물학적 활성 분자 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
Chen, X.S., Stehle, T. 및 Harrison, S.C. (1998): Interaction of polyomavirus internal protein VP2 with the major capsid protein VP1 and implications for participation of VP2 in viral entry, The EMBO Journal, 17권, 제 12 호, 3233-3240쪽에서 바이러스 단백질 1에 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 VP2 및 VP3를 고정시키는데 확실한 상호작용을 기술한다. 상기 출원에 따라, 고정은 VP2 또는 VP3의 C-말단 끝 영역에서 일어난다.
US 4,950,599에서 폴리오마 바이러스가 활성 물질을 세포로 이동시키는데 적당하다는 것을 설명한다. 또한, DE 196 18 797 A1에서 폴리오마 바이러스에서 유도된 캡소머(capsomer)가 분자 물질을 세포에 이동시키는데 적당하다는 것을 설명한다.
EP 0 259 149 A2에서 면역 운반체 분자 및 로터바이러스 감염에 면역 반응을 자극하는 백신으로써 로터바이러스 내부 캡시드(capsid) 단백질 VP6 사용을 설명한다. 상기 연결에서, 면역유전자 펩티드는 상세하게 정의하지 않은 펩티드-펩티드상호작용으로 VP6에 결합된다. 여기서 VP6는 구조 캡소머를 형성하지 않지만 반대로 독특한 구조 다형현상을 나타낸다. VP6는 단량체 또는 올리고머 형태로 존재한다. 비록 올리고머 VP6가 입자를 형성할 수 있어도, 상기 입자는 캡시드 또는 캡소머가 아니고 구조화되지 않은 운반체 단백질이다.
Redmond, M.J.외 (1991): Rotavirus particles function as immunological carriers for the delivery of peptides from infectious agents and endogenous proteins, Mol. Immunol. 28, 269-278은 이동 입자로써 로터바이러스 내부 캡시드 단백질 VP6의 사용을 설명한다. 상기 연결에서, VP6는 로터바이러스성 단백질 VP4의 펩티드 서열에서 유도된 결합 단백질을 통해 면역유전자 펩티드 또는 단백질에 결합된다. VP4에서 유도된 펩티드 서열에 결합된 항원은 이동 입자의 외부에 위치되고 그러므로 분해(degradation)로부터 보호되지 않는다.
GB 22 57 431 A에서 상 MS-2의 표피 단백질에서 유도된 키메릭(chimeric) 단백질의 사용을 설명한다. 상기 단백질은 캡시드를 형성할 수 있다. 거기에 결합된 항원 펩티드 등은 캡시드의 외부에 결합된다.E. coli에서 발현하는 동안 키메릭 단백질의 자발적 조립이 박테리아성 DNA 또는 단백질에 의해 오염의 높은 위험을 운반한다.
DE 43 35 025 A1에서 외부 표면에서 막-활성 펩티드로 수정되어온 엔도소몰리한(endosomolytically) 활성 바이러스-유사 입자를 설명한다. 상기 입자의 제조는 까다롭다.
본 발명의 목적은 당 분야에 따른 불리한 점을 제거하는 것이다. 특히 활성물질을 폴리오마 바이러스 VP1으로 특정 결합하는 간단한 가능성을 제공한다.
상기 목적은 청구항 1, 9 및 19 항의 특징에 의해 이루어진다. 마땅한 구체예는 청구항 2 내지 8, 10 내지 18 및 20 내지 24의 특징에서 얻는다.
명세서는 하기 정의를 사용한다:
유도된 아미노산 서열: 유도된 것으로부터 아미노산 서열과 비교하여 변하지 않고, 또는 아미노산 변환, 삽입 또는 삭제에 의해 거기로부터 다른 아미노산 서열.
C-말단 끝: C 말단의 지역 또는 영역.
합성 분자: 인공적으로 제조된 분자.
결합 또는 붙임: 공유 또는 비공유 결합. 비공유 결합은 예를 들면, 킬레이트 결합을 통해 실시된다.
유전 공학: 한정된 핵산을 세포에 주입하는 방법을 포함하는 기술.
본 발명에 따라, 합성 생물학적 활성 분자는 활성 물질에 연결된 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 상기 아미노산 서열 (A1)을 위해 제공된다.
제안된 합성 생물학적 활성 분자는 간단한 방법으로 활성 물질을 폴리오마 바이러스 VP1으로 특별히 연결하는 것을 가능하게 한다. 이는 구조화된 캡소머의 형성을 이끈다. 상기 캡소머를 사용하여 간단한 방법으로 활성 물질용 보편적 운반체로 캡시드를 제조하는 것이 가능하다.
바람직하게, 아미노산 서열 (A1)은 10 내지 55, 바람직하게는 28 내지 38의아미노산을 포함한다. 비례적으로 짧은 아미노산 서열의 제한은 합성 생물학적 활성 분자의 비용을 줄이고 제조를 간략화한다.
유리하게, 적어도 일부 영역에서 아미노산 서열은 아미노산 위치 250 내지 319, 바람직하게는 아미노산 위치 260 내지 300 및 특히 바람직하게는 아미노산 위치 287 내지 297에 대응한다. 상기 아미노산 서열은 VP1에 안전하게 고정된다.
합성 생물학적 활성 분자에서, 아미노산 서열 (A1)은 바람직하게 하기 서열에서 아미노산을 갖는다:
활성 물질은 바람직하게 연결기를 통해 아미노산 서열 (A1)에 결합된다. 상기 연결기는 적어도 하나의 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질 등으로 구성된다. 활성 물질은 하기 그룹에서 선택된다: 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 펩티드 물질, PNA, 상기 물질의 수정 및 저분자량 약리 활성 물질. 특히 하기 언급된 반응성 그룹 중 하나를 통해 아미노산 서열에 결합하는 활성 물질이 적당하다.
합성 생물학적 활성 분자는 폴리오마 바이러스 VP1에서 유도된 아미노산 서열에 결합되어 존재하고 및/또는 약물의 성분이다.
또한 본 발명에 따라, 본 발명의 합성 생물학적 활성 분자의 제조 방법은 제공되고, 하기 단계를 갖는다:
a) 결합제를 갖는 아미노산 서열과 함께 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 (A1)을 제공 및
b) 결합제를 통해 아미노산 서열 (A1)에 활성 물질을 결합.
결합제는 아미노산 글리신으로 리신을 통해 결합된 시스테인 또는 글리신을 갖는다. 결합제는 아미노산 서열 (A1)의 N- 또는 C-말단 끝에 결합된 바람직하게 합성적으로 제조된 아미노산 서열 (A2)이다.
합성 생물학적 활성 분자는 유전자 공학에 의해 적어도 일부분이 제조된다. 상기 연결에서, 아미노산 서열 (A1), 또한 아미노산 서열 (A2) 및 활성 물질은 유전자 공학으로 완벽하게 또는 부분적으로 제조된다. 또한 아미노산 서열 (A2)은 편리하게 글리신 및/또는 측면 작용기를 갖는 아미노산을 갖고, 측면 작용기는 하기 그룹에서 선택되는 것이 가능하다: 아미노, 술피드릴, 카르복실, 히드록실, 구아니디늄, 페닐, 인돌 및 이미다졸 라디칼.
결합제는 아미노산, 바람직하게는 글리신, 시스테인, 또는 리신을 통해 결합된 글리신을 통해 아미노산 서열 (A1)의 C- 또는 N-말단 끝에 결합된 반응성 기이다. 상기는 하기 성분 중 하나를 갖는다: 모노브로모아세틸 라디칼의 아미노산, 모노클로로아세틸 라디칼의 아미노산, 3-니트로-2-피리딘술페닐 라디칼 (Npys)의 아미노산. 제안된 반응성 기는 흔히 사용될 수 있다. 다양한 활성 물질에 결합하는 것이 적당하다.
활성 물질를 아미노산 서열 (A1) 또는 추가의 아미노산 서열 (A2)에 티오에테르 또는 디술파이드 브릿지를 통해 결합하는 것이 특히 유리하다는 것이 증명되었다. 실제로, 상기 결합의 종류는 쉽게 제조될 수 있다. 물론, 다른 반응성 기의 사용을 또한 생각할 수 있다. 적당한 기는 예를 들면, N-숙시니미딜 브로모아세테이트 또는 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트 (SPDP)이다.
활성 물질이 아미노산 서열 (A1) 또는 연결기를 통한 추가의 아미노산 서열 (A2)에 결합된다. 연결기는 적어도 하나의 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질 등으로 구성된다.
또한 본 발명에 따라, 본 발명의 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법은 하기 단계의 방법을 제공한다:
aa) 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 (A1)을 합성 및
bb) 활성 물질, 즉 펩티드를 아미노산 서열 (A1)에 결합 및 합성,
상기 단계는 aa 및 bb 하에서 펩티드 합성 또는 유전공학 방법으로 실시된다.
단계 bb)에서 아미노산 서열 (A1)은 활성 물질에 의해 확장된다. 활성 물질의 연장 및 부착은 반복적으로 아미노산 잔류물의 부착으로 실시된다. 상기 방법은 특히 쉽게 실시될 수 있다.
상기 언급된 방법 모두에 관한 추가의 이득인 구체예는 하기 청구범위에서 알려질 수 있다.
A: 펩티드의 합성 및 정제
펩티드는 Sheppard(Atherton, E. 및 Sheppard, R.C. (1989) "Solid phasepeptide synthesis - a practical approach" IRL Press, Oxford)에 따른 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)/tert. 부틸 (But) 방법을 사용하는 펩티드 합성기(타입: SHIMADZU제품의 PSSM-8, 일본)에서 동시 다발 펩티드 합성(Schnorrenberg, G. 및 Gerhardt, H. (1989) Tetrahedron 45, 7759)으로 합성된다. 결합 반응은 2mmol/g의 수지를 적하하는 중합성 운반체 수지(타입: 텐타겔 S 트리틸 수지, RAPP Polymere, Tuebingen, 독일)에 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)를 사용하여 각 경우 6 당량의 Fmoc-보호된 아미노산/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)/12 당량의 n-메틸모르폴린으로 실시된다. 펩티드는 C-말단 COOH 기를 포함한다.
하기 보호기는 합성에 사용된다: Cys (Trt), Arg (Pbf), Ser (But), Thr (But), Asp (OBut), Glu, (OBut), Asn (Trt), Gln (Trt), Lys (Boc), His (Trt), Trp (Boc), 여기서 Trt: 트리틸, But: t-부틸, OBut: t-부틸 에스테르, Boc: t-부틸옥시카르보닐 및 Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐.
모든 보호기는 실온에서 3시간 동안 3% 트리이소프로필실란 및 차후 10% 트리메틸클로로실란을 1시간 동안 첨가하고 트리플루오로아세트산 (TFA)/티오안이솔레/티오크레솔(95:2.5:2.5)을 사용하여 제거된다. 냉동 건조후, 펩티드는 그들의 트리플루오로아세트산염의 형태로 존재한다.
펩티드는 물에 (용리액 A) 0.05% 트리플루오로아세트산 내지 80% 아세토니트릴/물 (용리액 B)에 0.05% 트리플루오로아세트산의 기울기를 사용하는 Bischoff Polyencap 300 분리 칼럼, 10㎛, 250×16㎜에 예비 HPLC로 정제된다.
선택적으로, 43-73% 용리액 B로 30분간 유속 15㎖/분의 타입 218 TP 101522 (10-15㎛, 250×22㎜)의 Vydac 분리 칼럼이 사용된다.
펩티드 합성에 의하여, 하기 아미노산 서열이 합성되고, 예를 들면:
상기 서열에서, 반응성 기는 아미노산 서열의 N-말단 끝에 아미노산을 통해 결합되고, 글리신을 통하는 것이 바람직하다. 반응성 기는 모노클로로아세틸글리신으로 구성된다. 선택적으로, 모노브로모아세틸 라디칼을 붙이는 것이 또한 가능하다.
고체상 합성에서 모노클로로아세틸글리신의 결합
같은 당량의 모노클로로아세틸글리신 및 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)은 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해되고, 같은 당량의 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)와 혼합되고 펩티드 수지에 첨가된다. 적하된 펩티드 수지와 비교할 때, 모노클로로아세틸글리신은 과량으로 존재한다. 반응은 가끔 교반하면서 실시되고 적어도 1시간 동안 지속된다.
반응성 기는 활성 물질 예를 들면, 자유 SH기를 갖는 펩티드에 상기 방법으로 제조된 생물학적 활성 분자의 공유 결합을 이용한다. 모노클로로아세틸기의 염소 원자와 SH기의 반응은 하기 반응식에 따른 안정한 티오에테르 화합물의 제형을만든다:
모노클로로아세틸-수정된 고정 펩티드와 말단 시스테인을 가진 펩티드 사이의 짝지음 제형:
모노클로로아세틸-수정된 고정 펩티드는 과량의 펩티드에서 짝을 이루기 위해 사용된다. 반응은 실온에서 [sic] pH 7-8 사이에 0.1M NaHCO3에서 실시된다. 수용액에서 펩티드 또는 고정의 낮은 용해도의 경우에, 짝지음 제형은 4M 구아니딘 히드로클로리드, pH 8.0에서 실시된다(Lindner, W. 및 Robey, F.A. (1987) Int. J. Pept. Protein Res. 30, 794-800). 선택적으로, 유기 용매, 예를 들면 DMSO의 비율은 반응 혼합물에서 증가될 수 있다. 원치 않는 부산물을 피하기 위해, 수용성 포스핀이 환원제로 첨가된다.
선택적으로 하기 조건하에서 짝지음 반응을 실시하는 것이 또한 가능하다. 모노클로로아세틸화된 고정 펩티드 및 말단 SH기를 갖는 펩티드는 약 10배의 디이소프로필에틸아민 및 대략 5배의 트리부틸포스핀의 존재에서 1-메틸-2-피롤리돈에 실온으로 배양된다. 반응 후, H2O는 그 후에 첨가되고 생성물은 에테르의 첨가로 침전되고 겔 여과로 정제된다(Defoort, J.P., Nardelli, B., Huang, W. 및 Tam, J.P. (1992) Int. J. Protein Res. 40, 214-221).
선택적으로 짝지음 반응은 또한 하기와 같이 실시된다. SH기를 포함하는 펩티드는 0.2M 인산염 완충용액, 10mM EDTA, pH 7.4에 용해된다. 상기 혼합물에, 디메틸포름아미드에 용해된 모노클로로아세틸-수정된 고정 펩티드가 첨가된다. 반응 후, 정제가 겔 여과 또는 RP-HPLC로 실시된다(Zhang, L. 및 Tam, J.P. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119, 2363-2370).
분리된 VP1 오량체를E. coli에서 N-말단 6 ×히스티딘 친화력 태그 (=His tag)를 갖는 재조합 단백질로 VP1을 발현함으로 제조한다. 단백질을 Ni-NTA 친화력 크로마토그래피를 통해 정제한다. His 태그를 요소 Xa로 처리하여 제거한다. 단백질을 차후 코오마시에(Coomassie) 얼룩의 SDS-PAGE 겔에서 분석한다.
상기 시작 물질 (20mM 헤페스, pH 7.3, 1mM EDTA, 200mN NaCl, 5% 글리세롤에 VP1 단백질)을 센트리콘(centricon) 100 (Amincon [sic])에서 농축하고 고분자량 캡시드 단편 및 오량체 서브유닛(분자량 : 약 225kD)에 용리 완충용액(50mM 트리스, 0.15M NaCl, 5mM EDTA, pH 8.5)의 FPLC 겔 여과(Superdex 200)를 통해 분리한다. 단편을 모두 센트리콘 100에서 농축한다. 요오도아세트아민 (SIGMA)을 잠재적으로 반응성 SH기를 막기 위해 10배의 몰 오량체-함유 용액에 첨가한다. 수정된 오량체 단편을 과량의 요오도아세트아민으로부터 겔 여과를 통해 분리한다. VP1-특정 모노클로날 항체를 VP1-특정 항체 및 친화력 매트릭스(BIO-RAD로부터 단백질 A 지지)를 위해 흡수한다. 항체-코팅 매트릭스를 정제된 오량체 단편을 침전하는데 사용한다. 추가의 배양 단계에서, 고정 서열을 오량체 매트릭스에 첨가한다. 샘플을 SDS 폴리아크릴아미드 겔(12.5%)에서 분석한다.
Npys-수정 고정 펩티드와 말단 시스테인을 갖는 펩티드 사이의 짝지음 제형
모노클로로- 또는 모노브로모아세틸화된 고정 펩티드와 티오에테르 제형의말단 시스테인을 갖는 펩티드 사이의 반응에 첨가하여, 고정 펩티드 및 펩티드 서열 사이의 짝지음이 선택적으로 결합된 펩티드의 고정의 말단 시스테인에 3-니트로-2-피리딘술페닐(=Npys)기 및 SH기를 통해 또한 형성된다. 상기 끝에, 모노클로로아세틸화된 글리신의 대신 Npys-수정 시스테인을 고정 서열에 N-말단으로 결합한다. 상기 Npys-수정 시스테인은 티올과 반응할 수 있는 "활성 디술파이드" 가령, 예를 들면, 비대칭 디설파이드를 형성하는 시스테인이다. 이는 분광광도법으로 2개 화합물 사이의 반응의 운동학을 연구하는 것을 허용하는 329㎚에서 UV 최고값의 3-니트로-2-티오피리돈의 제거를 일으킨다.
하기 조건이 반응에 선택된다(Albericio, F., Andreu, D., Giralt, E., Navalpotro, C., Pedroso, E., Ponsati, B. 및 Ruiz-Gayo, M. (1989) Int. J. Peptide Res. 34, 124-128). Npys-수정 펩티드를 말단 SH기를 갖는 결합된 펩티드에 첨가하고 0.1M 아세트산 나트륨, 0.1M 염화 나트륨, pH 4.5에 용해하고 그후 pH를 5.0으로 조절하여 적어도 12시간 동안 교반하면서 배양한다. 그후 pH를 1N NaOH를 첨가하여 7.0으로 조절하고 3시간 동안 또 배양한다. 반응 후, 혼합물을 10mN NaHCO3에 대해 투석한다.
반응의 최선의 pH 범위는 4.5에서 7.0 사이다. 상기 조건은 원치 않는 부반응 가령, 예를 들면, 결합된 펩티드 분자 사이의 대칭 디술파이드의 제형 또는 Npys기의 제거의 최소화를 확증한다. Npys-수정 펩티드는 짝지어진 과량의 펩티드에서 반응에 존재한다(Albericio, F., Andreu, D., Giralt, E., Navalpotro, C.,Pedroso, E., Ponsati, B. 및 Ruiz-Gayo, M. (1989) Int. J. Peptide Res. 34, 124-128).
본 발명의 실시예는 하기 서열 목록에서 설명된다:
서열 목록 1은 폴리오마 바이러스 VP2에서 유도된 아미노산 서열, 위치 287-297을 나타낸다. VP1에 활성 물질을 고정하는데 고정재로 합성 생물학적 활성 분자에서 돕는다.
서열 목록 2는 합성 생물학적 활성 분자의 1차 전형적인 구체예를 나타낸다. HIV-1-유도된 펩티드 서열은 위치 1-21에 대응되고; 고정재로 작용하는 부착된 아미노산 서열은 위치 22-33을 차지한다. 폴리오마 바이러스 VP2에서 유도된다.
서열 목록 3은 고정재로 적당한 아미노산 서열의 또 다른 예를 나타낸다.
서열 목록 4는 폴리오마 바이러스 VP2 서열을 나타낸다. 상기는 고정재로 적당한 위치 250과 300 사이의 서열을 보인다.
서열 목록 5 및 6은 또 다른 합성 생물학적 활성 분자를 보인다. 폴리오마 바이러스 VP1과 결합하고 그후, HIV 감염의 치료를 위해, 감염된 세포에 주입된다.

Claims (24)

  1. 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 (A1)이 활성 물질과 연결되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)이 10 내지 55, 바람직하게는 28 내지 38의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)이 적어도 일부 영역에서 아미노산 위치 250 내지 319, 바람직하게는 아미노산 위치 260 내지 300 및 특히 바람직하게는 아미노산 위치 287 내지 297에서의 VP2 서열에 대응되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)이 하기 서열로 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자:
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성 물질이 연결기를 통해 아미노산 서열 (A1)에 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성 물질이 하기 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자: 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 펩티드 물질, PNA, 상기 물질의 수정 및 저분자량 약리적 활성 물질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리오마 바이러스 VP1에서 유도된 아미노산 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 청구된 합성 생물학적 활성 분자를 갖는 약물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법:
    a) 결합제를 갖는 아미노산 서열 (A1)과 함께, 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 (A1)을 제공 및
    b) 활성 물질을 결합제를 통해 아미노산 서열 (A1)에 결합.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 결합에 의한 아미노산은 글리신, 시스테인 또는 리신을 통해 결합된 글리신인 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 결합 방법은 또한 바람직하게 아미노산 서열 (A1)의 N- 또는 C-말단 끝에 결합된 합성 제조된 아미노산 서열 (A2)인 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 합성 생물학적 활성 분자가 유전공학에 의해 적어도 일부가 제조되는것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가의 아미노 서열 (A2)이 측면 작용기를 가지는 아미노산 및/또는 글리신을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 측면 작용기가 하기 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법: 아미노, 술피드릴, 카르복실, 히드록실, 구아니디늄, 페닐, 인돌 및 이미다졸 라디칼.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 방법이 아미노산 바람직하게는 글리시딘, 시스테인 또는 리신을 통해 결합된 글리신을 통해 아미노산 서열 (A1)의 C- 또는 N-말단 끝에 결합된 반응성 그룹인 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 반응성 그룹이 하기 성분 중 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법: 모노브로모아세틸 라디칼의 아미노산, 모노클로로아세틸 라디칼의 아미노산, 3-니트로-2-피리딘술페닐 라디칼 (Npys)의 아미노산.
  17. 제 9 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성 물질이 아미노산 서열 (A1) 또는 추가로 티오에테르 또는 디술파이드 브릿지를 통해 아미노산 서열 (A2)에 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  18. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성 물질이 아미노산 서열 (A1) 또는 추가의 아미노산 서열 (A2)에 추가로 연결기를 통해 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  19. 하기 단계를 갖는 제 1 항에 따른 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법:
    aa) 폴리오마 바이러스의 바이러스 단백질 2 (VP2) 또는 3 (VP3)의 C-말단 끝에서 유도된 아미노산 서열 (A1)을 합성 및
    bb) 활성 물질, 즉 펩티드를 아미노산 서열 (A1)에 결합 및 합성,
    상기 aa 및 bb 하의 단계는 펩티드 합성 또는 유전공학 방법으로 실시된다.
  20. 제 9 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)이 10 내지 55, 바람직하게는 28 내지 38의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  21. 제 9 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)은 적어도 일부 영역, 아미노산 위치 250 내지 319, 바람직하게는 아미노산 위치 260 내지 300 및 특히 바람직하게는 아미노산 위치 287 내지 297에서의 VP2 서열이 대응되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
  22. 제 9 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 서열 (A1)이 하기 서열의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법:
  23. 제 9 항 내지 제 18 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 활성 물질이 하기 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법: 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, PNA, 펩티드 물질 및 상기 물질의 수정.
  24. 제 9 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 합성 생물학적 활성 분자가 폴리오마 바이러스 VP1에서 유도된 아미노산 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 합성 생물학적 활성 분자의 제조방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19916224C1 (de) * 1999-04-10 2000-06-21 November Ag Molekulare Medizin Synthetisches biologisch aktives Molekül
GB2357084A (en) * 1999-12-06 2001-06-13 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd A hydrophobic carrier peptide
DE10306789A1 (de) * 2003-02-18 2004-08-26 Responsif Gmbh Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Lebewesen und Verfahren zur Markierung von Mitteln
US20090062237A1 (en) * 2007-06-15 2009-03-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Evaluating immune competence
EP2636746A1 (en) 2012-03-06 2013-09-11 Life Science Inkubator A novel drug delivery system based on JCV-VLP
CN113278634B (zh) * 2020-11-16 2022-06-28 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司 一种预防和治疗默克尔细胞癌的新型疫苗

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1319101C (en) 1986-09-03 1993-06-15 Marta Iris Sabara Rotavirus nucleocapsid protein with or without binding peptides as immunologic carriers for macromolecules
US4950599A (en) * 1987-01-29 1990-08-21 Wolf Bertling Method for exchanging homologous DNA sequences in a cell using polyoma encapsulated DNA fragments
GB9114003D0 (en) 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
JP2702285B2 (ja) 1992-08-21 1998-01-21 バイオジェン，インコーポレイテッド Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド
US5618536A (en) * 1992-09-03 1997-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric papillomavirus-like particles
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
DE19543553B4 (de) 1995-11-22 2009-04-09 Deutsches Primatenzentrum Gmbh VP-Antigene des JC-Virus
DE19618797C2 (de) * 1996-05-10 2000-03-23 Bertling Wolf Vehikel zum Transport molekularer Substanz
US5858648A (en) * 1996-11-04 1999-01-12 Sienna Biotech, Inc. Assays using reference microparticles
DE19916224C1 (de) * 1999-04-10 2000-06-21 November Ag Molekulare Medizin Synthetisches biologisch aktives Molekül

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