EA006631B1

EA006631B1 - Синтетическая биологически активная молекула и способы ее получения

Info

Publication number: EA006631B1
Application number: EA200101066A
Authority: EA
Inventors: Вольф Бертлинг; Кристиан Райзер; Юрген Вальтер
Original assignee: Респонсиф Гмбх
Priority date: 1999-04-10
Filing date: 2000-04-03
Publication date: 2006-02-24
Also published as: AU768669B2; AU4285000A; NO20014891L; EP1173475A1; MXPA01010189A; DE10080849D2; US20070009921A1; CZ20013621A3; HUP0200679A2; PL355852A1; US7011968B1; ZA200107658B; JP2002544122A; BR0011178A; WO2000061616A1; NO20014891D0; DE50011068D1; ATE303401T1; KR20020007361A; DE19916224C1

Abstract

Изобретение касается синтетической биологически активной молекулы для фиксирования фармацевтически активного компонента на вирусном белке 1 (VP1) полиомавируса. В соответствии с изобретением аминокислотная последовательность А1, которая происходит от С-концевой части вирусного белка 2 (VP2) или 3 (VP3) полиомавируса, связывается с активным компонентом на одном из своих концов. Предложены способы получения указанной молекулы, а также лекарственное средство, содержащее указанную биологически активную молекулу.

Description

Изобретение касается синтетической биологически активной молекулы и способа ее получения.

У Х.8.С11СП. Т.81с111с & З.С.Напкои, 1998, ГиГстасбои оГ ро1уотаупи8 1и1егиа1 ргсйст УР2 \νί11ι 111с та)ог сармб ргсйст УР1 аиб 1трйсабои8 Гог ратйс1райои οί УР2 ίη У1та1 еиру, ТПс ЕМВО 1оитиа1, Уо1. 17, № 12, рр.3233-3240 описаны взаимодействия, обеспечивающие прикрепление вирусных белков УР2 и УР3 полиомавируса к вирусному белку 1. В соответствии с указанной публикацией прикрепление имеет место на участке С-концевого сегмента УР2 или УР3.

В патенте И8 4950599 описано, что полиомавирус пригоден для переноса активных веществ в клетки. Более того, в ИЕ 19618797-А1 заявлено, что капсомер, происходящий от полиомавируса, пригоден для транспортировки молекулярного материала в клетки.

В ЕР-0-259149 А2 описано использование ротавирусного внутреннего капсидного белка УР6 в качестве иммунологической молекулы-носителя и в качестве вакцины для стимулирования иммунного ответа на ротавирусные инфекции. В этой связи иммуногенные пептиды связывают с УР6 за счет пептидпептидных взаимодействий, которые не определены в каких бы то ни было подробностях. В этом случае УР6 не образует структурного капсомера, но, напротив, проявляет отчетливый структурный полиморфизм. УР6 представлен в качестве мономерной или олигомерной формы. Хотя олигомерный УР6 способен образовывать частицы, такие частицы не являются капсидами или капсомерами, будучи неструктурированными белками-переносчиками.

У МЭ.К.сбтоиб с1 а1., 1991, Ко1ау1ги8 рагйс1с5 Гиисйои а§ 1ттипо1ощса1 сатсга Гог 111с бсБусгу оГ рср(|бс5 Ггот тГссйощ адсик аиб сибодсиош ргокшк, Мо1. 1ттиио1., 28, 269-278 описано использование ротавирусного внутреннего капсидного белка УР6 в качестве транспортной частицы. В этой связи УР6 связывают с иммуногенными пептидами или белками через связывающий белок, происходящий от пептидной последовательности ротавирусного белка УР4. Антиген, соединённый с пептидной последовательностью, происходящей от УР4, расположен с внешней стороны частицы-переносчика и, следовательно, не защищен от разрушения.

СВ 2257431-А описывает использование химерного белка, который происходит от оболочечного белка фага М8-2. Этот белок способен образовывать капсиды. Антигенные пептиды или подобное, присоединенные к нему, связаны с наружней частью капсида. Спонтанное образование химерного белка в ходе экспрессии в Е.соБ несет в себе высокий риск загрязнения бактериальными ДНК или белками.

ИЕ 4335025-А1 заявляет эндосомолитически активную вирусоподобную частицу, которая была модифицирована мембрано-активными пептидами на ее внешней поверхности. Получение упомянутой частицы является сложным.

Объектом настоящего изобретения является преодоление недостатков, имеющихся в известном уровне техники. В частности, оно призвано предоставить простую возможность специфического связывания активных веществ с белком УР1 полиомавируса.

Указанная цель достигается созданием новой биологически активной молекулы и разработкой способа ее получения. Биологически активная молекула применяется в составе лекарственных средств.

В описании используются следующие определения.

Производная аминокислотная последовательность - аминокислотная последовательность, которая не изменена по сравнению с аминокислотной последовательностью, от которой она происходит, или которая отличается от неё заменами, вставками или делециями аминокислот.

С-концевая часть - участок или область С-концов.

Синтетическая молекула - искусственно полученная молекула.

Сочетание или присоединение - ковалентное или нековалентное связывание. Нековалентное связывание может быть осуществлено, например, с помощью хелатной связи.

Генная инженерия - технология, которая включает методы внесения определённых нуклеиновых кислот в клетки.

В соответствии с настоящим изобретением заявляется синтетическая биологически активная молекула, причем аминокислотная последовательность (А1), происходящая от С-концевой части вирусного белка 2 (УР2) или 3 (УР3) полиомавируса, соединена с активным веществом.

Предлагаемая синтетическая биологически активная молекула делает возможным простое специфическое связывание активных веществ с УР1 полиомавируса. Это приводит к образованию структурированного капсомера. С использованием упомянутого капсомера возможно простым образом получать капсиды в качестве универсальных переносчиков активных веществ.

Преимущественно аминокислотная последовательность (А1) включает от 10 до 55, предпочтительно от 28 до 38 аминокислот. Ограничение относительно короткой аминокислотной последовательностью снижает стоимость и упрощает получение синтетической биологически активной молекулы.

Целесообразно, чтобы аминокислотная последовательность, по крайней мере, в некоторых участках соответствовала последовательности УР2 по аминокислотным положениям 250-319, предпочтительно по аминокислотным положениям 260-300 и, в частности, предпочтительно по аминокислотным положениям 287-297. Упомянутая аминокислотная последовательность обеспечивает гарантированное прикрепление к УР1.

- 1 006631

В синтетической биологически активной молекулеаминокислотная последовательность (А1) предпочтительно характеризуется аминокислотами в нижеследующей последовательности:

Тгр Мек Ьеи Рго Ьеи Не Ьеи С1у Ьеи Туг С1у

10

Предпочтительно активное вещество связывают с аминокислотной последовательностью (А1) через линкер. Такой линкер может быть составлен по крайней мере одной аминокислотой, пептидом, белком, липидом или подобным. Активное вещество может быть выбрано из следующей группы: нуклеиновая кислота, олигонуклеотид, белок, пептид, пептидное вещество, РНП, модификации указанных веществ и низкомолекулярные фармацевтически активные вещества. Конкретно приемлемыми являются те активные вещества, которые сочетаются с аминокислотной последовательностью через одну из реактивных групп, упомянутых далее.

Синтетическая биологически активная молекула может быть представлена соединенной с аминокислотной последовательностью, происходящей от УР1 полиомавируса, и/или может являться компонентом лекарственного средства.

Далее в соответствии с настоящим изобретением представляется способ получения синтетической биологически активной молекулы по настоящему изобретению, который включает следующие стадии:

(a) получение аминокислотной последовательности (А1), происходящей от С-концевой части УР2 или УР3 полиомавируса, включающей средство для связывания, причем средство для связывания способно присоединять активное вещество; и (b) связывание активного вещества с аминокислотной последовательностью (А1) через связывающий агент.

Связывающий агент может представлять собой аминокислоту глицин, цистеин или глицин, связанный с лизином.

Преимущественно связывающий агент получают в виде дополнительной, предпочтительно синтетической аминокислотной последовательности (А2), связанной с Ν- или С-концом аминокислотной последовательности (А1).

Синтетическая биологически активная молекула может быть получена, по крайней мере частично, методами генной инженерии. В этом случае аминокислотная последовательность (А1), дополнительная аминокислотная последовательность (А2) и активное вещество могут быть полностью или частично получены с помощью методов генной инженерии. Целесообразным является наличие в дополнительной аминокислотной последовательности (А2) остатков глицина и/или аминокислот с функциональными боковыми группами, чтобы было возможным выбрать функциональные боковые группы из следующих групп: амино, сульфгидрильный, карбоксильный, гидроксильный, гуанидиновый, фенильный, индольный и имидазольный радикал.

Связывающий агент может быть реактивной (реакционно-способной) группой, связанной с С- или Ν-концом аминокислотной последовательности (А1) через аминокислоту, предпочтительно глицин, цистеин или глицин, связанный с лизином. Указанное может иметь один из следующих компонентов: аминокислоту с монобромацетильным радикалом, аминокислоту с монохлорацетильным радикалом, аминокислоту с 3-нитро-2-пиридинсульфенильным радикалом (Νργδ). Предполагаемые реактивные группы могут быть использованы как универсальные. Они подходят для присоединения множества активных веществ.

В частности, была подтверждена предпочтительность связывания активного вещества с аминокислотной последовательностью (А1) или с дополнительной аминокислотной последовательностью (А2) через тиоэфирный или дисульфидный «мостик». На практике такой тип связи легко может быть получен. Понятно, что также допустимо использование других реактивных групп. Подходящими группами являются, например, Ν-сукцинимидилбромацетат или №сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8ΡΌΡ).

Активное вещество может быть связано с аминокислотной последовательностью (А1) или с дополнительной аминокислотной последовательностью (А2) через линкер. Линкер может быть составлен по крайней мере из одной аминокислоты, пептида, белка, липида или подобным.

Далее в соответствии с настоящим изобретением представляется способ получения синтетической биологически активной молекулы по настоящему изобретению, причём способ включает следующие стадии:

(a) синтез аминокислотной последовательности (А1), происходящей от С-концевой части белка 2 (УР2) или 3 (УР3) полиомавируса; и (b) синтез фармацевтически активного вещества, а именно пептида, и обеспечение связывания его с аминокислотной последовательностью (А1), причем стадии (а) и (Ь) осуществляют методами пептидного синтеза или методами генной инженерии.

На стадии (Ь) аминокислотную последовательность (А1) достраивают активным веществом. Удлинение и присоединение активного вещества осуществляют путем последовательного присоединения аминокислотных остатков. Данный способ может быть осуществлен достаточно легко.

- 2 006631

Дальнейшие преимущественные варианты, касающиеся обоих упоминавшихся выше способов, можно найти в зависимых пунктах.

Примеры

А. Синтез и очистка пептидов

Пептиды синтезируют с помощью одновременного множественного пептидного синтеза (О.8сйпоггепЬегд & Н.Оегйагб!, 1989, Те!гайебгоп, 45, 7759) в пептидном синтезаторе (модель Р88М-8, 8Ь11пас1/н, Япония) с использованием стратегии с 9-флуоренилметоксикарбонилом (Етос) и третбутилом (Ви!) в соответствии с методом Шеппарда (Е.А!йег!оп & К.С.8йеррагб, 1989, δοϊίά рЬазе рерббе зуп!йез1з - а ргас!1са1 арргоаей, 1К1. Ргезз, ОхЕогб). Реакции соединения проводят в каждом случае с 6 эквивалентами Етос-защищенной аминокислоты, 1-гидроксибензотриазола (НОВ!), 12 эквивалентами нметилморфолина с использованием 2-(1 Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторбората (ТВТи) на полимерной смоле-носителе (тип: смола Теп!аде1 8 Тп!у1, КАРР Ро1утеге, ТиЬтдеп, Германия) с загрузкой 2 ммоль на 1 г смолы. Пептиды включают С-концевую СООН-группу.

В синтезе используют следующие защитные группы: Суз (Тг!), Агд (РЬ!), 8ег (Ви!), Тйг (Ви!), Азр (ОВи!), С1и (ОВи!), Азп (Тг!), С1п (Тг!), Ьуз (Вос), Н1з (Тг!), Тгр (Вос), где Тг! - тритил; Ви! - трет-бутил; ОВи! - сложный трет-бутиловый эфир; Вос - трет-бутоксикарбонил; и РЬ! - 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил.

Все защитные группы удаляют с использованием трифторуксусной кислоты (ТФУ), тиоанизола и тиокрезола (95:2,5:2,5) при комнатной температуре в течение 3 ч с добавлением 3% триизопропилсилана и последующим добавлением 10% триметилхлорсилана в течение 1 ч. После лиофилизации пептиды находятся в форме своих трифторацетатных кислых солей.

Пептиды очищают с помощью препаративной ВЭЖХ на делительной колонке В1зсЬо!Г Ро1уепсар 300, 10 мкм, 250x16 мм, с использованием градиента от 0,05% трифторуксусной кислоты в воде (элюент А) до 0,05% трифторуксусной кислоты в 80% ацетонитрила в воде (элюент В).

В качестве альтернативы использовали делительную колонку Уубас типа 218-ТР 101522 (10-15 мкм, 250x22 мм) с градиентом 43-73% элюента В в течение 30 мин при скорости протока 15 мл/мин.

С помощью пептидного синтеза, например, синтезируют следующую аминокислотную последовательность:

Тгр МеЕ Ьеи Рго Ьеи Не Ьеи С1у Ьеи Туг С1у

10

В данной последовательности реактивную группу связывают с Ν-концевой частью аминокислотной последовательности через аминокислоту, предпочтительно глицин. Реактивная группа может быть представлена монохлорацетилглицином. Как альтернатива, также возможным является присоединение монобромацетильного радикала.

Присоединение монохлорацетилглицина в твердофазном синтезе

Равное количество эквивалентов монохлорацетилглицина и 1-гидроксибензотриазола (НОВ!) растворяют в диметилформамиде (ЭМЕ), смешивают с эквивалентным количеством Ν,Ν'диизопропилкарбодиимида (Э1С) и добавляют к смоле с пептидом. По отношению к смоле, на которую загружен пептид, монохлорацетилглицин присутствует в избытке. Реакцию проводят, изредка помешивая, в течение по крайней мере 1 ч.

Реактивная группа облегчает ковалентное присоединение биологически активной молекулы, полученной таким образом, к активному веществу, например, пептиду, который имеет свободную 8Н-группу. Реакция 8Н-группы с атомом хлора в монохлорацетильной группе приводит к образованию стабильного тиоэфирного соединения в соответствии со следующим уравнением:

белок-ЗН + С1-СН₂-СО-С1у-пептид-НС^ белок-3-СН₂-СО-01у-пептид

Образование конъюгата между якорным пептидом, модифицированным монохлорацетилом, и пептидом, имеющим концевой цистеин

Якорный пептид, модифицированный монохлорацетилом, используют в избытке по отношению к пептиду, с которым он должен быть конъюгирован. Реакцию проводят в 0,1 М \а11СО₃ при [з1с] рН=7-8 при комнатной температуре. В случае плохой растворимости пептида или якоря в водном растворе получение конъюгата проводят в 4М гуанидингидрохлориде, рН=8,0 (П.Ешбпег & Е.А.КоЬеу, 1987, 1п!. 1. Рер!. Рго!еш Кез., 30, 794-800). Как альтернатива, в реакционной смеси соотношение органического растворителя, например ДМСО, может быть увеличено. С целью избежания образования нежелательных побочных продуктов в качестве восстанавливающих агентов могут быть добавлены водорастворимые фосфины.

Также, что необязательно, возможным является проведение реакции конъюгации при следующих условиях. Монохлорацетилированный якорный пептид и пептид, имеющий концевую 8Н-группу, инкубируют при комнатной температуре в 1-метил-2-пирролидоне в присутствии примерно 10-кратного избытка диизопропилэтиламина и приблизительно 5-кратного избытка трибутилфосфина. По завершении

- 3 006631 реакции добавляют Н₂О и продукт осаждают добавлением эфира и очищают методом гель-фильтрации (ТР.ПеГоой, В.ЫагйеШ, ЖНиапй & ГР.Тат, 1992, Ιηΐ. 1. Рго1еш Век., 40, 214-221).

Также, что необязательно, реакцию конъюгации можно провести следующим образом. Пептид, включающий 8Н-группу, растворяют в 0,2М фосфатном буфере, 10 мМ ЭДТА - рН=7,4. К полученной смеси добавляют якорный пептид, модифицированный монохлорацетилом, растворенный в диметилформамиде. После реакции очистку проводят методами гель-фильтрации или ОФ-ВЭЖХ (Ь.2йапд & ТР.Тат, 1997, 1. Атег. Сйет. 8ос, 119, 2363-2370).

Выделенные пентамеры УР1 получают путем экспрессии УР1 в качестве рекомбинантного белка с Ν-концевой аффинной гексагистидиновой меткой (Н1к-1ад) в Е.сой. Белок очищают с помощью аффинной хроматографии Νί-ΝΤΑ. Метку Н1к-1ад удаляют обработкой фактором Ха. Белок анализируют методом электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием кумасси голубым.

Данный исходный материал (белок УР1 в 20 мМ НЕРЕ8, рН=7,3, 1 мМ ЭДТА, 200 мМ №С1, 5% глицерина) концентрируют на фильтре Сеп1псоп-100 (Атшсоп [к1с]) и разделяют с помощью гельфильтрационной жидкостной хроматографии быстрого разрешения (8ирегйех 200) с элюционным буфером (50 мМ Трис, 0,15М №С1, 5 мМ ЭДТА, рН=8,5) на высокомолекулярную капсидную фракцию и пентамерные субъединицы (молекулярная масса примерно 225 кД). Обе фракции концентрируют на Сеп1псоп-100. Иодацетамид (8фта) добавляют к содержащему пентамеры раствору в 10-кратном молярном избытке с целью блокирования потенциально реактивных 8Н-групп. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч. Фракцию модифицированных пентамеров отделяют от избытка иодацетамида с помощью гель-фильтрации. УР1-специфичные моноклональные антитела адсорбируют с помощью УР1 -специфичных антител и аффинного матрикса (подложка с белком А от ВюВай). Покрытый антителами матрикс используют для осаждения очищенной фракции пентамеров. На следующей стадии инкубации к пентамерному матриксу добавляют якорную последовательность. Образцы анализируют в ДСН-полиакриламидном геле (12,5%).

Образование конъюгата между якорным пептидом, Νρνκ-модифицированным, и пептидом, имеющим концевой цистеин

В дополнение к реакции между монохлор- или монобромацетилированным якорным пептидом и пептидом, имеющим концевой цистеин, с образованием тиоэфира конъюгат между якорным пептидом и пептидной последовательностью необязательно может быть образован через 3-нитро-2пиридинсульфенильную группу (Νρνκ) у концевого цистеина якоря и 8Н-группы пептида, который должен быть присоединен. Для этого ^ук-модифицированный цистеин вместо монохлорацетилированного глицина присоединяют к Ν-концу якорной последовательности. Упомянутый ^ук-модифицированный цистеин является «активированным дисульфидом», который способен взаимодействовать с тиолами, такими как, например, цистеины, с образованием асимметричного дисульфида. В результате происходит удаление 3-нитро-2-тиопиридона, УФ-максимум которого при 329 нм позволяет исследовать кинетику реакции между двумя соединениями спектрометрическими методами.

Для реакции выбирают следующие условия (Е.А1Ьепсю, Э.Апйгеи, Е.6йа11, С.№уа1ро1го, Е.Рейгоко, В.Ропкай & М.Вшх-бауо, 1989, 1п1. 1. Рерййе Век., 34, 124-128). ^ук-модифицированный пептид добавляют к пептиду, предназначенному для присоединения, имеющему концевую 8Н-группу, и растворяют в 0,1М ацетата натрия, 0,1М хлорида натрия, рН=4,5, и рН затем доводят до 5,0 с последующей инкубацией при перемешивании в течение по крайней мере 12 ч. Затем рН доводят до 7,0 добавлением 1Н №1ОН с последующей дополнительной инкубацией в течение 3 ч. После реакции смесь диализуют против 10 мН Νη^Οβ.

Оптимальный диапазон рН реакции находится между 4,5 и 7,0. Такие условия гарантируют минимизацию нежелательных побочных реакций, таких как, например, образование симметричных дисульфидов между пептидными молекулами, предназначенными для присоединения, или потеря группы Хрук. Хрук-модифицированный пептид должен присутствовать в реакции в избытке по отношению к конъюгированному пептиду (Е.А1Ьепсю, Э.Апйгеи, Е.61га11, С^ун^оВо, Е.Рейгоко, В.Ропкай & М.Вш/-6ауо, 1989, 1п1. 1. Рерййе Век., 34, 124-128).

Примеры настоящего изобретения проиллюстрированы в следующих списках последовательностей.

Список последовательностей 1 показывает аминокислотную последовательность, происходящую от УР2 полиомавируса, положения 287-297. Она в составе синтетической биологически активной молекулы выполняет роль якоря для прикрепления активного вещества к УР1.

Список последовательностей 2 показывает первый служащий примером вариант синтетической биологически активной молекулы. Производная от ВИЧ-1 пептидная последовательность соответствует положениям 1-21; присоединенная аминокислотная последовательность, являющаяся якорем, занимает положения 22-33. Она происходит от УР2 полиомавируса.

Список последовательностей 3 показывает другой пример аминокислотной последовательности, пригодной в качестве якоря.

Список последовательностей 4 показывает последовательность УР2 полиомавируса. Показаны последовательности между положениями 250 и 300, которые пригодны в качестве якорей.

- 4 006631

Списки последовательностей 5 и 6 показывают дополнительные синтетические биологически активные молекулы. Они могут быть соединены с УР 1 полиомавируса и затем внесены в инфицированные клетки с целью лечения ВИЧ-инфекции.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 1 <110> поуетЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> Минимальная последовательность УР2 <140>

<141>

<160> 1 <170> РаСепС1п, уегз. 2.1 <210> 1 <211> 11 <212> белок <213> полиомавирус (зр.) <300>

<302> Последовательность, происходящая от УР2, положения

282-297 <303> ЕМВО 3.

<304> 1998 <305> 17/12 <306> 3233-3240 <308> Д02288/ЕМВЬ <309> 22 августа 1995 г.

<400> 1 .

Тгр Мер Ьеи Рго Ьеи Не Ьеи С1у Ьеи Туг С1у

10

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 2 <110> поуетЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> Пример УР2-якоря и пептидного активного вещества

- 5 006631 <140>

<141>

<160> 1 <170> РабепЫп, уегз. 2.1 <210> 1 <211> 33 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: положения 1-21 КТ от ВИЧ-1; положения 22-33 от последовательности УР2 полиомавируса

<400>	1
Ьеи А1а	С1и	Азп Агд С1и	Не Ьеи Ьуз С1и	Рго Уа1 Нхз С1у Уа1 Туг
1		5	10	15

Туг Азр Рго Бег Ьуз	Рго Азр Тгр МеЕ Ьеи	Рго Ьеи 11е Ьеи С1у Ьеи
20	25 ’	30

Туг

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 3 <110> по'/ешЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> Якорный УР2, положения 263-296 <14 0>

<141>

<160> 1 <170> РаРепС1п, уегз. 2.1 <210> 1

- 6 006631 <211> 34 <212> белок <213> полиомавирус (зр.) <300>

<302>

УР2-якорь, происходящий от последовательности ΥΡ2, положения 263-296 <303> ЕМВО σ.

<400> 1

С1п 1

Аар

С1и

Зег

С1у С1и Уа1 5

Не

Ьуз РЬе Туг С1п А1а С1п Уа1 Уа1

10

15

Зег

ΗΪ8

С1п

Агд

Уа1 ТЬг Рго

Аар

Тгр

Мес

Ьеи

Рго

Ьеи

Не

Ьеи

С1у

20

25

30

Ьеи Туг

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 4 <110> поуегпЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> νΡ2 РгоОЗец Ро1уота зр.

<140>

<141>

<160> 1 <170> Ра0еп01п, νθΓ3. 2.1 <210> 1 <211> 319 <212> белок <213> полиомавирус (зр.) <300>

<302> УР2 (капсидный белок), генный локус РЬУ2СС, полный геном полиомавируса штаммов а2 и аЗ под депозитарным номером Д02288 Европейской молекулярно-биологической лаборатории (ЕМВЬ, ОикзТаМоп Еиг. Βίοίηίοπη. 1пзГ.)

<зоз> емво σ.

<304> 1998

<305> 17/12

<306> 3233-3240

<308> 602288/ЕМВЪ

<309> 22 августа 1995 г

<400> 1

- 7 006631

Мег С1у 1

А1а

А1а Ьеи ТЬг 11е Ьеи Уа1 Азр

Ьеи

11е С1и С1у

Ьеи А1а 15

5

10

С1и

Уа1

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

С1у

Ьеи

Зег

А1а

С1и

А1а

11е

Ьеи

Зег

С1у

20

25

30

С1и

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

Азр

С1у

С1и

11е

ТЬг

А1а

Ьеи

ТЬг

Ьеи

С1и

35

40

45

С1у

Уа1

Мес

Зег

61и

ТЬг

А1а

Ьеи

А1а

ТЬг

Мес

С1у

11е

Зег

С1и

50

55

60

<31и

Уа1

Туг

СЯу

РЬе

Уа1

Зег

ТЬг

Уа1

Рго

Уа1

РЬе

Уа1

Зег

Агд

ТЬг

65

70

75

80

А1а

С1у

А1а

11е

Тгр

Ьеи

Мес

С1п

ТЬг

Уа1

С1п

С1у

А1а

Зег

ТЬг

11е

85

90

95

Зег

Ьеи

С1у

11е

С1п

Агд

Туг

Ьеи

ΗΪ3

Азп

С1и

Уа1

Рго

ТЬг

Уа1

100

105

но

Азп

Агд

Азп

МеС

А1а

Ьеи

11е

Рго

Тгр

Агд

Азр

Рго

А1а

Ьеи

Азр

115

120

125

Не

Туг

РЬе

Рго

С1у

Уа1

Азп

С1п

РЬе

А1а

ΗΪ3

А1а

Ьеи

Азп

Уа1

130

135

140

- 8 006631

ΗΪ8 145

Азр Тгр С1у ΗΪ3

С1у Ьеи 150

Ьеи ΗΪ3 Зег

Уа1 С1у 155

Агд

Туг Уа1

Тгр 160

С1п

МеС

Уа1

С1п

С1и

ТЫ

С1П

Н13

Агд

Ьеи

С1и

С1у

А1а

Уа1

Агд

165

170

175

С1и

Ьеи

ТЬг

Уа1

Агд

С1п

ТЬг

ΗΪ5

ТЬг

РЬе

Ьеи

Азр

С1у

Ьеи

А1а

Агд

180

185

190

Ьеи

С1и

Азп

ТЬг

Агд

Тгр

Уа1

Зег

Азп

А1а

Рго

С1п

Зег

А1а

195

200

205

Не

Азр

А1а

11е

Азп

Агд

С1у

А1а

Зег

А1а

Зег

С1у

Туг

Зег

210

215

220

8ег

Ьеи

Зег

Азр

Туг

Агд

С1п

Ьеи

С1у

Ьеи

Азп

Рго

РГО

С1п

Агд

225

230

235

240

Агд

А1а

Ьеи

РЬе

Азп

Агд

11е

С1и

С1у

Зег

Мес

С1у

Азп

С1у С1у

Рго

245

250

255

ТЬг

Рго

А1а

НЬз

Не

С1п

Азр

С1и

Зег

С1у

С1и

Уа1

11е

Ьуз

РЬе

260

265

270

Туг

С1п

А1а

61п

Уа1

Зег

ΗΪ8

С1п

Агд

Уа1

ТЬг

Рго

Азр

Тгр

МеС

275

280

285

Ьеи

Рго

Ьеи

Не

Ьеи

С1у

Ьеи

Туг

О1у

Азр

Не

ТЬг

Рго

ТЫ

Тгр

А1а

290

295

300

ТЬг

Уа1

Не

С1и

Азр

С1у

Рго

С1п

Ьуз

Агд

Ьеи

305

310

315

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 5

<110> поуетЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> Активное вещество 1 КТ/часть последовательности ВИЧ <140>

- 9 006631 <141>

<160> ΐ <170> РаЬепЫп, νθΓ3. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

положения 1-20 КТ от ВИЧ-1 (депозитарный № АБ006287) и дополнительный С-концевой Суз <400> 1

Ьеи А1а С1и Азп Агд С1и 11е Ьеи Ьуз С1и Рго Уа1 Нхз С1у Уа1 Туг

10 15

Туг Азр Рго 5ег Суз

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 6 <110> почетЬег АС <120> Синтетическая аминокислотная молекула <130> Активное вещество 2 (ЗАС/часть последовательности

ВИЧ <140>

<141>

<160> 1 <170> РаЬепЫп, чегз. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> белок <213> вирус иммунодефицита человека 1-го типа <220>

<223> Часть последовательности САС от ВИЧ-1 (депозитарный № АД006287) <400> 1

С1у Зег С1и С1и Ьеи Агд Зег Ьеи Туг Азп ТЬг Уа1 А1а ТЬг Ьеи Туг

10 15

Суз

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Синтетическая биологически активная молекула, состоящая из фармацевтически активного вещества и аминокислотной последовательности (А1), происходящей от С-концевой части белка 2 (УР2) или 3 (УР3) полиомавируса, причём активное вещество связано с аминокислотной последовательностью (А1) таким образом, что может быть ассоциировано с белком 1 (УР1) полиомавируса через аминокислотную последовательность (А1) с образованием структурного капсомера, причем указанная молекула может необязательно содержать средство для связывания активного вещества с аминокислотной последовательностью (А1), и при этом аминокислотная последовательность (А1), связанная с активным веществом, не является УР2 или УР3.

- 10 006631
2. Синтетическая биологически активная молекула по п.1, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность (А1) включает 10-55, предпочтительно 28-38 аминокислот.
3. Синтетическая биологически активная молекула по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность (А1) по крайней мере в некоторых участках соответствует последовательности УР2 по аминокислотным положениям 250-319, предпочтительно по аминокислотным положениям 260-300 и, особенно предпочтительно по аминокислотным положениям 287-297.
4. Синтетическая биологически активная молекула по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность (А1) имеет следующую структуру:

Тгр МеЪ Ьеи Рго Ьеи Не Ьеи С1у Ьеи Туг <31у

15 10
5. Синтетическая биологически активная молекула по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что средство связывания включает линкер, или реактивную группу, или дополнительную аминокислотную последовательность (А2).
6. Синтетическая биологически активная молекула по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что фармацевтически активное вещество выбрано из группы, включающей нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид, белок, пептид, пептидное вещество, рибонуклеопротеин (РНП), модификации указанных веществ и низкомолекулярные фармацевтически активные вещества.
7. Синтетическая биологически активная молекула по любому из предыдущих пунктов, дополнительно связанная с аминокислотной последовательностью, происходящей от УР1 полиомавируса.
8. Лекарственное средство, содержащее синтетическую биологически активную молекулу по любому из предыдущих пунктов.
9. Способ получения синтетической биологически активной молекулы по любому из пп.1-7, включающий следующие стадии:

(a) получение аминокислотной последовательности (А1), происходящей от С-концевой части УР2 или УР3 полиомавируса, включающей средство для связывания, причем средство для связывания способно присоединять фармацевтически активное вещество; и (b) обеспечение связывания фармацевтически активного вещества с аминокислотной последовательностью (А1).
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что средство для связывания содержит глицин, цистеин или глицин, связанный с лизином.
11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что средство для связывания выбрано из группы, включающей линкер, реакционно-способную группу и дополнительную аминокислотную последовательность (А2).
12. Способ по пп.9-11, отличающийся тем, что дополнительная аминокислотная последовательность (А2) соединена с Ν- или С-концевой частью аминокислотной последовательности (А1), получена синтетическим путем и может содержать не только аминокислоты, указанные в п.10, но и дополнительно другие природные и/или синтетические аминокислоты.
13. Способ по любому из пп.9-12, отличающийся тем, что составные части молекулы по пп.1-7, а именно, последовательность А1, необязательно последовательность (А2), фармацевтически активное вещество, так же как и вся молекула по пп.1-7, могут быть получены методами генной инженерии.
14. Способ по пп.9-13, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность (А2) дополнительно содержит глицин и/или аминокислоты с боковыми реакционно-способными группами.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что боковые реакционно-способные группы выбраны из группы, включающей амино, сульфгидрильный, карбоксильный, гидроксильный, гуанидиновый, фенильный, индольный и имидазольный радикалы.
16. Способ по любому из пп.9-15, отличающийся тем, фармацевтически активное вещество связано с С- или Ν-концевой частью аминокислотной последовательности (А1) предпочтительно через глицин, цистеин или глицин, связанный с лизином.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что реакционно-способная группа представляет собой монобромацетильный радикал, монохлорацетильный радикал или 3-нитро-2-пиридинсульфенильный радикал (Νργδ).
18. Способ по любому из пп.9-17, отличающийся тем, что фармацевтически активное вещество связано с аминокислотной последовательностью (А1) или с дополнительной аминокислотной последовательностью (А2) через тиоэфирный или дисульфидный «мостик».
19. Способ по любому из пп.9-18, отличающийся тем, что активное вещество связано с аминокислотной последовательностью (А1) или с дополнительной аминокислотной последовательностью (А2) через дополнительный линкер.
20. Способ получения синтетической биологически активной молекулы по п.1, включающий следующие стадии:

(а) синтез аминокислотной последовательности (А1), происходящей от С-концевой части белка 2 (УР2) или 3 (УР3) полиомавируса; и

- 11 006631 (Ь) синтез фармацевтически активного вещества, а именно пептида, и обеспечение связывания его с аминокислотной последовательностью (А1), причем стадии (а) и (Ь) осуществляют методами пептидного синтеза или методами генной инженерии.
21. Способ по любому из пп.9-20, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность (А1) включает 10-55, предпочтительно 28-38 аминокислот.
22. Способ по любому из пп.9-21, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность (А1), по крайней мере, в некоторых участках соответствует последовательности УР2 по аминокислотным положениям 250-319, предпочтительно по аминокислотным положениям 260-300 и особенно предпочтительно по аминокислотным положениям 287-297.
23. Способ по любому из пп.9-22, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность (А1) имеет следующую структуру:

Тгр МеЪ Ьеи Рго Ьеи Не Ьеи С1у Ьеи Туг С1у

15 10
24. Способ по любому из пп.9-19 и 21-23, отличающийся тем, что фармацевтически активное вещество выбрано из группы, включающей нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид, белок, пептид, РНП, пептидное вещество и модификации указанных веществ.
25. Способ по любому из пп.9-24, отличающийся тем, что синтетическая биологически активная молекула дополнительно связана с аминокислотной последовательностью, происходящей от УР1 полиомавируса.