KR20010098881A - 유전자형에 의한 생물의 동정방법 - Google Patents

유전자형에 의한 생물의 동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자형에 의한 생물의 동정방법에 관한 것으로, 어느 정도 간편하고 현실적으로 실현가능한 유전자형에 의한 미생물 등의 생물에 대해서 종이나 유연성 등을 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은, (1) 동정대상인 생물의 게놈의 일부 또는 전부를 주형으로 하여 랜덤 PCR에 의해 1종 또는 2종 이상의 2중가닥 DNA 단편을 조제하고, (2) (1)에서 조제한 2중가닥 DNA 단편을 온도구배 겔전기영동(TGGE) 또는 변성제 농도구배 겔전기영동(DGGE)에 부치고, (3) (2)에서 얻어진 전기영동 패턴으로부터 각 DNA 단편의 동정 포인트를 추출하고, (4) (3)에서 얻어진 동정 포인트군으로부터 PaSS 및/또는 게놈 준거리(準距離)를 구하며, (5) (4)에서 얻어진 PaSS 및/또는 게놈 준거리에 기초하여 미생물의 동정을 실시하는 방법으로서, TGGE 또는 DGGE에 의한 전기영동시에, 동정 포인트의 기준점으로서 스탠다드 DNA (standard DNA)를 공존시키고 스탠다드 DNA와의 위치관계로부터 동정 포인트의 의(doubtful, 疑)-절대위치를 결정하는 방법이다.

Description

유전자형에 의한 생물의 동정방법 {Methods of identifying organism based on its genotype}
본 발명은 유전자형에 의한 미생물 등을 포함하는 생물의 종 또는 유연성 등을 동정하는 방법에 관한 것이다.
종래부터, 미생물을 포함하는 생물의 동정은, 기본적으로 표현형을 이용하여 실시하여 왔다. 그러나, 표현형에 따른 동정은 생물을 보다 정밀하게 구별하는 것을 목적으로 하는 동정에는 적절하지 않았다. 특히, 종의 수가 방대한 미생물에 있어서는, 표현형에 의한 동정(특정)에는 현실적인 문제로 한계가 있었다. 한편, 일상생활에 있어서 미생물이 관계되는 것이 많다. 예를 들어 O157, 결핵, MRSA, 콜레라 등의 미생물이 원인이 되는 질환이 많고 효과적인 치료법의 확립이나 감염경로의 파악을 위해서는 미생물의 정밀한 동정기술이 필요하다. 또한 농산물의 생산성이나 품질에 토양세균이 관계되어 있기도 하고, 장내세균 무리의 좋고나쁨이 호모사피엔스의 건강에 크게 영향을 미치고 있다고 말할 수 있다. 또한, 농산물의 생산성이나 품질과 토양세균의 종류와 양, 조합과의 관계, 더욱이 호모사피엔스의 건강과 장내세균 무리와의 관계에 대해서, 정밀한 검토가 실시되어 있지 않은 것이 현재 상황이다. 이것은, 지금까지와 같이 표현형에 의한 미생물의 동정으로는 정밀한 동정, 판별이 불가능한데서 기인하고 있다.
따라서, 표현형을 대신하는 방법으로서 유전자형에 의한 미생물의 동정이 제안되고 있다.
예를 들어, 각 미생물의 게놈(전체)끼리를 비교함으로써 미생물의 종의 동정 및 판별을 하는 것은, 현재의 시퀀스(sequence) 기술 수준에서는 충분히 가능하다.그러나, 상당한 수고와 시간을 드릴 필요가 있고 간편한 방법이 없다. 따라서, 게놈(전체)끼리의 비교에 의한 미생물의 종의 동정 및 판별은 현실적으로는 범용적으로 실시할 수 있는 방법이 아니다. 또한, 보다 간편한 방법으로서 게놈의 일부 서열을 비교하는 방법이 있다. 그러나, 예를 들어 16SrRNA의 서열비교로는 종의 동정 및 판별에 충분한 정보를 얻을 수 없다.
따라서 본 발명의 목적은 어느 정도 간편하고 현실적으로 실행가능한 유전자형에 의한 미생물 등의 생물에 대해서 종이나 유사성 등을 동정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은, (1) 동정대상인 생물의 게놈의 일부 또는 전부를 주형으로 하여 랜덤 PCR에 의해 1종 또는 2종 이상의 2중가닥 DNA 단편을 조제하고,
(2) (1)에서 조제한 2중가닥 DNA 단편을 온도구배 겔전기영동(TGGE) 또는 변성제 농도구배 겔전기영동(DGGE)에 부치고,
(3) (2)에서 얻어진 전기영동 패턴으로부터 각 DNA 단편의 동정 포인트를 추출하고,
(4) (3)에서 얻어진 동정 포인트군으로부터 PaSS 및/또는 게놈 준거리(準距離)를 구하며,
(5) (4)에서 얻어진 PaSS 및/또는 게놈 준거리에 기초하여 미생물의 동정을 실시하는 방법으로서,
TGGE 또는 DGGE에 의한 전기영동시에, 동정 포인트의 기준점으로서 스탠다드DNA (standard DNA)를 공존시키고 스탠다드 DNA와의 위치관계로부터 동정 포인트의 의(doubtful, 疑)-절대위치를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 게놈 프로필링 화상의 예(서열번호 1 및 2에 나타난 스탠다드 DNA에 대해서 TGGE로 얻어진 전기영동 패턴)을 나타내고,
도 2는 제1의 전형적인 밴드(band) 곡선의 형태를 나타낸 도이며,
도 3은 제2의 전형적인 밴드 곡선의 형태를 나타낸 도이고,
도 4는 3개의 밴드 곡선으로부터 추출된 합계 8개의 특징점 Pj(j=1∼8) 즉 특징점군을 모식적으로 나타내고 있으며,
도 5는 비교대상 게놈의 n개의 특징점 P0i(i=1∼n)에 대응하는 시료 미생물에 대해서의 n개의 특징점 P1i(i=1∼n)를 나타내는 도이고,
도 6은 실시예 2에서 얻어진 서열번호 39로 표시되는 cy3-pfM12 (5' cy3-AGA ACG CGC CTG 3')을 프라이머로서 이용한 경우의 영동 패턴(a) 및 서열번호 40으로 표시되는 FITC/UCS (5' FITC- CA GGA AAC AGC TAT GAC 3')를 프라이머로서 이용한 경우의 영동 패턴(b)이다.
(1) 랜덤 PCR에 의한 게놈으로부터 2중가닥 DNA 단편의 조제
랜덤 PCR은, 본 발명자들에 의해 개발된 방법이다.
통상의 PCR(폴리메라아제 연쇄반응)법은 특정의 DNA 영역을 둔 2종의 프라이머와 DNA 폴리메라아제에 의한 DNA 합성반응을 반복실시하는 것으로, 특정의 DNA 영역을 증폭시키는 방법이다. 구체적으로는, 90℃ 전후의 온도에서 열처리(디네이쳐, denature)하여 2중가닥 DNA를 단일가닥으로 하고, 50℃ 전후의 온도에서 어닐링(annealing)하여 프라이머가 이 단일가닥 DNA에 부착되고 계속하여 65℃ 전후의 온도에서 이 프라이머를 기점(起點)으로 하여 단일가닥 DNA을 주형으로서 모노머의 뉴클레오티드를 원료로 하고, DNA 가닥이 DNA 폴리메라아제에 의해 합성된다(가닥의 신장반응). 이러한 디네이쳐, 어닐링 및 신장반응의 사이클을 반복 실시하는 것으로, 2종의 프라이머와 상보적 서열을 갖는 부분에 놓여 있는 특정 DNA 영역의 서열에 대응하는 2중가닥 DNA 단편만이 증폭된다.
상기 PCR법은 특정의 DNA 영역의 DNA 단편만을 증폭시키는 것을 목적으로 하는 방법이다. 따라서, 상기 어닐링 조건은 프라이머가 이 프라이머의 서열과 상보적인 서열(G와 C의 쌍 또는 A와 T의 쌍)을 갖는, 단일가닥 DNA의 특정 부위에 결합하도록 설정되어 있다. 즉, 어닐링 조건은 프라이머와 주형인 단일가닥 DNA가 부정합(mismatch)을 일으키지 않고, 프라이머와 단일가닥 DNA가 2중가닥을 형성할 수있는 조건으로 되어 있다. 그런데, 상기 어닐링을 약 30℃에서 실시하고 또한 가닥의 신장반응을 약 50℃에서 실시하여도 DNA 가닥을 증폭시킬 수는 있다. 그러나 어닐링의 온도가 낮기 때문에, 프라이머와 주형인 단일가닥 DNA와의 사이의 일부의 염기쌍에 상보적이지 않은 부정합(예를 들어, G와 A의 쌍)이 혼재할 수 있다. 통상적으로는 완전히 상보적인 서열을 갖는 DNA 단편이 아닌 한 프라이머라는 것은 될 수 없고 가닥의 증폭은 불가능하다. 이에 비해, 상기와 같이 어닐링과 신장반응을 비교적 낮은 온도에서 실시하면 완전히 상보적인 서열을 갖지 않는 DNA 단편이라도 프라이머가 되며 가닥의 증폭이 일어난다.
그래서 게놈 DNA 등의 DNA를 주형으로 하여, 어느 특정한 서열의 DNA 단편(예를 들어 12머(mer) 정도의 길이로 주형의 DNA 서열에 관계없이 선택된 단편)을 프라이머로서 디네이쳐, 어닐링 및 신장반응의 사이클(단, 어닐링 및 신장반응을 통상보다 낮은 온도에서 실시)을 반복 실시하면, 완전히 상보적인 서열을 갖지 않는 DNA 단편이라도 프라이머가 되며 가닥의 증폭이 일어나고, 프라이머 부분에 부정합을 포함할 수 있는 2중가닥 DNA 단편이 1종 또는 2종 이상 형성된다. 이 방법은 주형상의 특정영역을 증폭시키는 것이 목적이 아니고 다소(多少)의 부정합을 포함하여도 프라이머로서 신장반응의 기점까지 되면 가닥의 증폭은 실시되기 때문에, 2종 이상의 2중가닥 DNA 단편이 형성될 가능성이 있다. 또한, 주형으로서 이용되는 DNA 및 프라이머로서 이용되는 DNA 단편이 동일하고 또한 디네이쳐, 어닐링 및 신장반응의 사이클의 조건이 동일하면, 반드시 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥(군)이 증폭되어 얻어지는 것이 발견되었다. 이 방법은 주형상의 특정영역을 증폭시키는것이 목적이 아니기 때문에, 랜덤(random) PCR이라고 부르고 있다.
랜덤 PCR에서는, 동일한 게놈 DNA를 주형으로 하여도 프라이머로서 이용하는 DNA 단편의 서열을 변화시키기도 하고, 디네이쳐, 어닐링 및 신장반응의 사이클의 조건을 변화시키면 증폭의 결과 얻어진 DNA 가닥(군)이 달라질 수 있다. 특히 프라이머의 염기길이 및 서열에 의해, 얻어진 DNA 가닥(군)이 크게 변동하기 때문에 목적에 있는 프라이머를 적절히 선택하는 것이 바람직하다. 이 성질을 이용하여 프라이머의 염기서열을 바꿔서 게놈의 서열정보를 다면적으로 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 종의 동정 등을 실시해야 하는 미생물의 게놈의 일부 또는 전부를 주형으로 하여, 1종 또는 2종 이상의 2중가닥 DNA 단편을 랜덤 PCR에 의해 증폭 조제한다. 게놈의 일부 또는 전부를 미생물로부터 게놈을 취득하는 방법은 극히 일반적으로 실시되는 방법을 그대로 이용할 수 있다. 랜덤 PCR에 있어서 주형으로서 이용되는 게놈의 일부 또는 전부를 예를 들어 Wang 등의 알카리법(H. Wang, M. Gin, A.J. Cutler, Nucl. Acids Res., 21, 4153(1993))을 이용하여 조제할 수 있다.
또한 취득한 게놈을 주형으로서 실시하는 랜덤 PCR은 이하와 같이 실시할 수 있다.
통상의 PCR법과 달리, 랜덤 PCR에서는 이용되는 프라이머의 서열, 길이 및 종류는 적절히 선택할 수 있다. 그러나, 실험적으로도 해석적으로도 가장 간편한 계(系)가 되는 것은, 비교적 짧은 유일한 프라이머를 이용하는 경우이다. 또한 유일한 프라이머를 이용하고 동일한 미생물 유래의 게놈을 증폭시키는 경우에서도 프라이머의 서열 및 길이에 의해 증폭될 수 있는 2중가닥 DNA 단편의 종류 및 양은 다르다. 또한, 유일한 프라이머를 이용하고 동일한 서열 및 길이를 갖는 프라이머를 이용하는 경우에도, 게놈이 유래하는 미생물이 다르므로 증폭될 수 있는 2중가닥 DNA 단편의 종류 및 양은 다르다. 이와 같은 것을 고려하여 프라이머의 서열, 길이 및 종류는 적절히 선택된다. 프라이머가 너무 길어지면 헤어핀 구조를 쉽게 띠며 어닐링이 어려워지고 PCR 산물의 수량(收量)이 저하되는 경향이 있다. 또한 프라이머가 너무 짧으면 부정합을 함유하는 결합이 충분히 안정화되지 않고 PCR 산물의 수량이 저하되는 경향이 있다. 그래서, 프라이머의 길이(염기길이)는 예를 들어 8∼20의 범위로 하는 것이 적절하고 10∼16의 범위인 것이 바람직하며, 10∼12 염기길이인 것이 특히 바람직하고, 12염기길이인 것이 가장 바람직하다. 12염기길이의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 이용할 수 있고 이와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머로서는, 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 pfM4(dCAGTCAGGACGT), 서열번호 4로 표시되는 pfM12(dAGAACGCGCCTG), 서열번호 5로 표시되는 pfM14(dCGTCGCTATTAA), 서열번호 6으로 표시되는 pfM19(dCAGGGCGCGTAC), 서열번호 7로 표시되는 (dA)12(dAAAAAAAAAAAA), 서열번호 8로 표시되는 (dA3T3)2(dAAATTTAAATTT), 서열번호 9로 표시되는 (dAATT)3(dAATTAATTAATT), 서열번호 10으로 표시되는 (dACG)4(dACGACGACGACG), 서열번호 11로 표시되는 (dAT)6(dATATATATATAT), 서열번호 12로 표시되는 (dC)12(dCCCCCCCCCCCC), 서열번호13으로 표시되는 (dCCGG)3(dCCGGCCGGCCGG), 서열번호 14로 표시되는 (dCT)6(dCTCTCTCTCTCT), 서열번호 15로 표시되는 (dG)12(dGGGGGGGGGGGG), 서열번호 16으로 표시되는 (dGA)6(dGAGAGAGAGAGA), 서열번호 17로 표시되는 (dGGCC)3(dGGCCGGCCGGCC), 서열번호 18로 표시되는 (dT)12(dTTTTTTTTTTTT), 서열번호 19로 표시되는 (dT3G3)2(dTTTGGGTTTGGG), 서열번호 20으로 표시되는 (dTGC)4(dTGCTGCTGCTGC), 서열번호 21로 표시되는 (TA)4C2AC(dTATATATACCAC), 서열번호 22로 표시되는 Cohesive1 (dGGGCGGCGACCT), 서열번호 23으로 표시되는 Cohesive2 (dAGGTCGCCGCCC), 서열번호 24로 표시되는 G4sand (dGGGGTCGAGGGG), 서열번호 25로 표시되는 GCTA9(dGCTAAAAAAAAA), 서열번호 26으로 표시되는 notG (dCAATTCTACAAC), 서열번호 27로 표시되는 notT (dACGAGCGAGCGC), 서열번호 28로 표시되는 Promote1 (dTATAATTATAAT), 서열번호 29로 표시되는 Promote2 (dATTATAATTATA), 서열번호 30으로 표시되는 SD1 (dGATCACCTCCTTA), 서열번호 31로 표시되는 SD2 (dTAAGGAGGTGATC), 서열번호 32로 표시되는 Telomerel (dCCCACCCACCCA), 서열번호 33으로 표시되는 Telomere2 (dTGGGTGGGTGGG), 서열번호 34로 표시되는 FITC17-H-3'(5'GAG GAA ACA GCT ATG AGA TCT TCT C 3'), 서열번호 35로 표시되는 FITC17-H-5'(5'CAG GAA ACA GCT ATG ACG TTC TCA C 3'), 서열번호 36으로 표시되는 LH-7-3' (5'GGC GAT ATC CCT GAA A 3'), 서열번호 37로 표시되는 LH-7-5' (5'TAT TAT TTC CGC AAA G 3'), 서열번호 38로 표시되는 M13 Reverse (5'CAG GAA ACA GCT ATG AC3'), 서열번호 39로 표시되는 cy3-pfM12 (5'cy3-AGA ACG CGC CTG 3')(with cy3 fluorescence), 서열번호 40으로 표시되는 FITC/UCS (5'FITC- CA GGA AAC AGC TAT GAC 3')(with FITC fluorescence), 서열번호 41로 표시되는 MA1-FITC (5'FITC- TGC TAC GTC TCT TCC GAT GCT GTC TTT CGC T 3')(with FITC fluorescence), 서열번호 42로 표시되는 cy3-MA1 (5'cy3- TGC TAC GTC TCT TCC GAT GCT GTC TTT CGC T 3')(with cy3 fluorescence), 서열번호 43으로 표시되는 HEX-pfM11 (5'HEX- GAA CCT CCC GAC 3')(with Hex fluorescence), 및 서열번호 44로 표시되는 TAM-TGC4 (5'TAM- TGC TGC TGC TGC 3')(with Tamra fluorescence) 등을 들 수 있다.
랜덤 PCR의 경우, 상술한 바와 같이 PCR 운전조건이 저온이 되는 것이 통상의 PCR법과의 현저한 차이이며, 그 외의 운전조건에서는 통상의 PCR법과 실질적으로 동일하다. 랜덤 PCR에서의 반응용액, 반응조건 등은 이하대로이다. 반응용액 100㎕에서는 200μM dNTP(N=G, A, T, C), 0.5μM 프라이머, l0mM Tris-HC1(pH9.0), 50mM KCl, 2.5mM MgC12, 0.1% Triton X-100, 0.02unit/㎕ TaqDNA 폴리메라아제, 및 적당량(예를 들어 별도설명하는 방법으로 조제한 3㎕의 DNA용액을 가하여, 반응용액 전체를 100㎕로 한 것)의 주형 DNA를 포함한다. 또 PCR 반응은 94℃에서 1분간의 처리후에, 변성(94℃, 30초), 어닐링(28℃, 2분), 가닥 신장(47℃, 2분)의 사이클을 20∼30회 반복하고, 마지막으로 47℃에서 2분간 처리한다. 단, (G+C) 함량이 낮은 pfM14를 프라이머에 이용할 때에는 어닐링 온도를 23℃로 하고, 가닥 신장반응은 42℃에서 10분간 하고, 마지막의 체이스(chase) 처리도 42℃에서 10분에 변경할 수 있다. 이상의 실험에 있어서, 반응용액의 조제혼합 등은 클린벤치에서 실시하고, 또한 주형 DNA를 더해 합하는 직전의 용액(즉, 주형 DNA 이외를 모두 포함하는 것)에 대해 자외선 조사(312nm, 10분)를 실시하고 협잡물에서 유래한 PCR 산물의 예방에 노력하는 것이 바람직하다.
상기 랜덤 PCR에 있어서, 원료로서 형광 표식기(fluorescent maker)를 갖는 물질을 이용하여 형광 표식기를 갖는 DNA를 증폭할 수 있다. 이 경우 스탠다드 DNA(standard DNA)로서 형광 표식된 DNA를 이용하고, 후술하는 동정 포인트의 추출을 DNA에 부친 형광 표식기를 이용하여 화상처리로 실시할 수 있다. 형광 표식기를 갖는 원료로서는, 프라이머 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 형광 표식기를 갖는 프라이머 및 뉴클레오티드는 시판품을 입수하거나 또는 공지의 방법에 의해 용이하게 합성 등을 할 수 있다.
(2) 2중가닥 DNA 단편의 TGGE 또는 DGGE에 의한 전기영동
본 발명의 방법에서는 (1)에서 얻어진 2중가닥 DNA 단편을 온도구배 겔전기영동(TGGE: Temperature gradient gel electrophoresis) 또는 변성제 농도구배 겔 전기영동(DGGE: Denaturant gradient gel electrophoresis)에 의해 전기영동시킨다.
TGGE 및 DGGE는 모두 공지의 방법이다. TGGE는 예를 들어 R.Riesner, et. al Electrophoresis10, 377-389(1989)에 상세한 기재가 있고, DGGE는 예를 들어 E.S. Abrams, V.P.Stanton, Jr., Methods Enzymol.,212, 71(1992)에 상세한 기재가 있다. 또한, 모든 방법도 시판의 장치를 이용하여 용이하게 실시할 수 있다. TGGE 및DGGE는 모두 슬래브 형 겔을 이용한 2차원 전기영동법이고 2중가닥 DNA의 영동방향과 수직방향으로 온도구배 또는 변성제 농도구배를 만들어 실시하는 것이다. TGGE 및 DGGE에 따르면 2중가닥 DNA가 갖는 염기서열에 고유의 멜트(melt)(2중가닥의 해리) 거동을 파악할 수 있다. 즉, 영동에 부쳐진 2중가닥 DNA에 존재하는 어느 영역중의 일군의 염기쌍이 갖는 결합 강도(내열성 또는 내변성제성)를 TGGE 및 DGGE에 의해 시각화할 수 있다.
TGGE에 있어서는 통상 30∼70℃의 범위의 온도구배가 부여된다. DGGE의 경우, 사용되는 변성제로서는 예를 들어 요소나 포름아마이드를 이용할 수 있고 농도구배는 예를 들어 0∼15M의 범위이다.
본 발명의 방법에서는 TGGE 또는 DGGE에 따른 전기영동시에 동정 포인트의 기준점으로서, 스탠다드 DNA를 공존시키고 스탠다드 DNA와의 위치관계로부터 동정 포인트의 의(疑)-절대위치를 결정한다. 랜덤 PCR에서 증폭된 2중가닥 DNA에 동정 포인트의 기준점으로서 스탠다드 DNA를 공존시키고 이것을 전기영동하며, 스탠다드 DNA도 그 서열에 맞는 전기영동 패턴을 나타낸다. 이 스탠다드 DNA의 전기영동 패턴을 기준으로 하고, 그와의 위치관계로부터 각 2중가닥 DNA의 동정 포인트의 의-절대위치를 결정할 수 있다. 스탠다드 DNA는 일종의 표준내부 참조시료가 된다. 이와 같은 스탠다드 DNA를 이용하는 것으로, 조건에 어느 정도의 분산이 있는 전기영동에 의해 얻어진 데이터를 동일한 기준에 기초하는 것으로서 해석할 수 있다. 즉, 스탠다드 DNA를 이용하는 것으로 전기영동 패턴으로부터 얻어지는 데이터를 보정하고 규격화할 수 있게 된다.
TGGE 또는 DGGE에 의한 전기영동에 있어서는, 2중가닥 DNA의 적어도 일부는 융해개시점, 최감속점(가장 이동속도가 느리게 되고 있는 점), SS 이동도 수속점(단일가닥 DNA의 이동속도에 수속(收束)하는 점)을 특징점으로서 갖는다. 전기영동조건에 따라서는, 주어진 조건내에서는 이와 같은 특징점을 나타내지 않는 경우도 있을 수 있다. 스탠다드 DNA에 대해서는 채용되는 전기영동 조건에 있어서 융해개시점, 최감속점, SS 이동도 수속점 등의 특징점이 명료하게 관찰되는 것이, 기준점을 제공한다는 관점에서 바람직하다. 또한, 동정대상으로 하는 게놈 유래의 2중가닥 DNA 전기영동 패턴과 용이하게 분별할 수 있는 패턴을 갖는 것이 스탠다드 DNA로서는 바람직하다.
스탠다드 DNA는 예를 들면 설정 온도구배(또는 농도구배)의 범위에서 양단의 각각에 가까운 곳에서 명료한 전이를 일으키는 것 (2중가닥 DNA 또는 헤어핀형 DNA/RNA 등) 1쌍이고, 통상적으로 전이를 관찰하는 200∼1000염기길이의 전이영역에 있어서 혼동되지 않는 타입인 것이 적당하다.
또한 보다 정확하게 기준점(군)을 제공한다는 관점에서는, 2종 이상의 스탠다드 DNA를 이용할 수도 있다.
스탠다드 DNA로서는, 예를 들어 서열표에 나타난 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타난 서열을 들 수 있다. 단, 이들의 서열에 한정되지 않는 것은 당연하다.
서열번호 1 및 2에 나타난 스탠다드 DNA에 대해서 TGGE에서 얻어지는 전기영동 패턴을 도 1에 나타냄과 동시에, 그 특성을 표 1에 나타낸다. 또한, 상기 TGGE는 타이텍크(taitec)사제 전기영동 장치 TG-180이고, 4% 폴리아크릴아미드겔(8M 요소함유 40mM 트리스완충액(pH 8.0)을 이용하며 30℃∼70℃의 직선 온도구배를 이용하고, 300V 하에서 90분간의 조건으로 실시된 것이다.
서열번호 1 서열번호 2
환원온도 Ti(℃) 60 70
Tp(℃) 67 72
(3) 전기영동 패턴으로부터 종의 동정 포인트의 추출
TGGE 및 DGGE에 의해 얻어진 전기영동 겔상의 DNA(스탠다드 DNA를 포함함)의 밴드(전기영동 패턴)을 예를 들어 은염색(銀染色)하는 것으로 시각화하고, 시각화한 각 패턴으로부터 동정 포인트를 추출한다.
겔의 은염색은, 예를 들어, Boulikas와 Hancock들의 방법(T. Boulikas, R. Hancock, J. Biochem. Biophys. Methods, 5, 219(1981))을 기초로 하여, Ohsawa와 Ebata들의 PEG 처리의 개선점(K. Ohsawa, N. Ebata, Anal. Biochem., 135, 409(1983))을 부가한 방법에 의해 가능해진다.
이하, 방법의 개요를 진술한다.
1) 겔 결합 필름(gel bond film)에 부착한 상태의 겔을 그대로 30% PEG 2000 수용액(200ml)에 넣은 플라스틱 용기에 옮기고 실온(15∼30℃)에서 30분간 흔들어섞는다. 이 사이에 겔은 필름으로부터 박리되고 더욱 수축, 백탁된다.
2) 일회증류수 150ml로 치환하고, 잘 헹군다. 이것을 2회 실시한다. 또한 헹굼액은 아스피레이터(aspirator)에서 완전히 흡수하여 빼낸다.
3) 헹굼액을 제거한 후에, 약 200ml의 은염색액(200ml의 2회증류수에 10ml의1M NaOH와 2ml의 25% 암모니아수를 첨가, 혼합한 후에 질산은 0.4g을 용해시킨 것)을 주입하고 30분간 흔들어 섞는다.
4) 2회증류수 200ml로 치환하고 1분간 흔들어 섞고, 배액한 후 다시 동일한 세정을 실시한다.
5) 약 200ml 현상액(200ml의 2회증류수에 200㎕의 10% 구연산(citric acid)과 200㎕의 포르말린을 가하고 용해시킨 것)으로 치환하고, 가볍게 흔들면서 밴드가 적당한 농도가 되기를 기다린다.
6) 적당한 농도가 되면 재빨리 현상액을 제거하고 미리 조제하여 둔 200ml의 정지액(10% 초산, 40% 메탄올의 수용액)을 가하고, 약 10분간 흔들어 섞어 염색된 겔 시료를 얻는다(또한, 현상폐액은 건조시켜서는 안된다. 폭발성의 뇌은(雷銀)을 발생시킬 경우가 있기 때문). 이상의 처리로 PCR 반응용액 100㎕ 중에 수 ng 존재하는 DNA 단편(만약에, 21ng이고, 300 염기길이로 하면 약 10fmol 즉, 6×109분자)이 충분히 검출된다. (조건까지 좋으면 실질적으로는 이 10분의 1 양이라도 검출될 수 있다.)
DNA 양이 충분히 많은 경우(수 10ng/밴드)에는 EtBr(에티듐브로마이드)법, 영동후의 겔을 수세한 후 5㎕/ml의 농도의 EtBr 용액에 담그고(10분정도), 직접, 자외선 램프(360nm 정도)하에서 형광을 관찰하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.
또는 (1)의 랜덤 PCR에 의한 증폭공정에 있어서, 랜덤 PCR의 원료에 형광 표식기를 갖는 물질을 이용하여 형광 표식기를 갖는 DNA를 증폭시키고, 종 동정 포인트의 추출을 DNA에 부친 형광 표식기를 이용하여 실시할 수도 있다. 형광 표식기를 갖는 원료는 프라이머 또는 DNA 폴리메라아제의 기질이 되는 뉴클레오티드일 수 있으며, 형광 표식기를 갖는 프라이머 및 뉴클레오티드는 모두 공지이며 시판품을 용이하게 입수할 수 있다.
랜덤 PCR의 원료, 예를 들어 프라이머에 형광 표식기를 갖는 것을 이용하고 또한 다른 여기파장 및 형광파장을 갖는 형광 표식기를 이용하여 별도로 증폭된 복수의 DNA 군을 한 개의 플레이트(plate)에서 전기영동시키고, 각 DNA에 대한 패턴을 다른 여기파장 및 형광파장을 이용하는 것으로 별도로 검출할 수 있게 된다. 구체적으로는, 동일한 서열을 갖는 프라이머로서 다른 형광 표식기를 갖는 프라이머 A, B, C를 다른 종의 생물 a, b, c의 DNA의 증폭에 각각 사용하고, 얻어진 증폭 DNA를 생물 a에 대해서는 프라이머 A의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하고, 생물 b에 대해서는 프라이머 B의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하고, 생물 c에 대해서는 프라이머 C의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하여, 각각 별도로 검출할 수 있다. 또는, 서열 및 형광 표식기 모두가 다른 프라이머 A, B, C를 동일한 생물의 DNA 증폭에 각각 사용하고, 얻어진 증폭 DNA를 프라이머 A에 대해서는 프라이머 A의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하고, 프라이머 B에 대해서는 프라이머 B의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하며, 프라이머 C에 대해서는 프라이머 C의 형광 표식기에 대응하는 여기파장 및 형광파장을 이용하여 각각 별도로 검출할 수 있다.
여기서 동정 포인트라는 것은 각 패턴(곡선)이 갖는 변곡점이나 등이동도점 등이다.
동정 포인트(변곡점이나 등이동도점)의 선택은, 예를 들어 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 융해개시점(Ti)은 2차 미분의 극대값 또는 2차 미분의 값이 0이 되는 2점의 중간점을 구한다. 불연속점(X의 미소 증가에 대해 큰 Y의 변화가 있는 점)을 구하고, 그것을 Tmin(최소 이동도점)으로 한다. 단일가닥 상태의 이동도에 종착하는 점(최종적 이동도에 최초로 도달하는 점) Te를 구한다. 이상의 작업을 명확한 밴드로부터 순차적으로 실시하고 예를 들어 전체에서 10∼12 점 얻을 때까지 실시한다. 단, 샘플링하는 밴드의 수는 적절히 선택할 수 있다. 또한, 예를 들어 미리 종이 알려져 있고 대응하는 밴드가 명확한 경우에는, 미리 지정된 밴드에 대해서 상기 조작을 실시할 수 있다.
동정 포인트의 추출은 구체적으로는 CCD 카메라와 컴퓨터를 이용한 화상처리에 의해 실시될 수 있다. 화상처리에는 상술한 바와 같이 은염색하는 것으로 시각화한 전기영동 패턴을, 적당한 촬영수단을 통해 적당한 전자기록매체에 칼라 화상 또는 글레이스 겔 화상으로 구한다. 구체적으로는, 디지탈 카메라와 같은 촬영수단을 이용하여, 전기영동 패턴의 화상을 컴퓨터에 게놈 프로필링 화상으로서 얻을 수 있다. 게놈 프로필링 화상의 예를 도 1에 나타낸다. 도 1은 상술한 바와 같이 내부 표준용의 서열의 게놈 프로필링의 화상이다.
게놈 프로필링 화상은 컴퓨터상에서 필요하다면 비틀림 보정을 한 후, 규격화 처리를 실시한다. 비틀림 보정은 게놈 프로필링 화상의 비틀림이 통상의 오차범위내에 있으면 생략할 수 있다. 규격화 처리는, 내부표준 참조시료의 특징점 및 실험조건 파라미터 등에 기초하여, 종축(Y축: 이동도) 방향 및 횡축(X축: 온도 또는 농도)방향을 규격화하는 화상처리이다. 이 규격화 처리에 의해 이동도 M은 0에서 1까지의 사이에서 무차원화된다. 또는 온도 T로서, 예를 들어 겔 중에 존재하는 요소의 변성효율을 온도환산한 후에 얻어지는 실효적 온도 즉 환원온도가 적용된다.
규격화 처리후, 선분을 추출하고, 더욱 추출된 선분을 관수화 처리한다.
선분 추출(진한 선분 추출)은 게놈 프로필링 화상 중의 몇 개인가의 밴드의 각각에 대해서, 이른바 연형성(連形成) 참조점 시프트(shift) 방식에 의해 실시된다. 또한 대상이 되는 밴드가 변성전과 변성후에 연속되고 있는 경우에는, 밴드 상의 1점을 지정하면 진한 선분을 추출할 수 있다. 그러나, 대상이 되는 밴드가 변성전과 변성후에서 연속되고 있지 않은 경우에는 변성전과 변성후의 2점을 지정하여 진한 선분을 추출한다. 또한, 연형성 참조점 시프트 방식에 더하여 2값화 방식을 이용하여 진한 선분의 추출을 할 수도 이다.
게놈 프로필링 화상으로부터 추출된 각 밴드에 대응하는 진한 선분은 계속하여 슬림화 처리된다. 슬림화 처리는 진한 선분을 이른바 1가 관수의 슬림화 선분으로 변환시키는 처리이다. 슬림화 처리는 예를 들어 러닝 에버리지(running average)법을 이용하여, 어느 중심의 Y 좌표와 양쪽에 인접하는 중심점의 Y좌표와의 평균좌표를 그 중심점에 있어서 Y 좌표로 설정하는 스므싱(smoothing) 처리에 의해 다수의 중심점으로 이루어진 매끄러운 연쇄(곡선)로 이루어진 슬림화 선분을얻을 수 있다.
슬림화 선분에 대해서 관수화 처리가 실시된다. 관수화 처리는 예를 들어 뉴튼·랩손 법을 이용하여 각 슬림화 선분을 적당한 차수(예를 들어 10차)의 n차제관수나 삼각관수에 근사하다.
슬림화 선분 및 관수화 처리된 각 밴드 곡선에 대해서, 특징점 추출 처리를 실시한다. 추출된 특징점으로서는, 예를 들어 융해 개시점 Pint, 최소 이동도점 Pmin, 이동도 종착점 Pend를 들 수 있다. 융해 개시점 Pint는 변성전에 있어서의 융해의 개시에 대응하는 밴드 곡선상의 점이다. 최소 이동도점 Pmin은 이동도가 최소값에 달하는 밴드 곡선상의 점이다. 이동도 종착점 Pend는 변성후의 단일가닥 상태의 이동도에 종착하는 밴드 곡선상의 점이다.
도 2는 제1의 전형적인 밴드곡선의 형태를 나타내는 도이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 전형적인 제1밴드 곡선(51)에서는 융해가 개시되는 온도 Tint보다도 낮은 온도에 있어서 이동도 M은 온도 T에 관해서 거의 선형적으로 증대된다. 융해 개시점 Pint에 대응하는 온도 Tint에 달하여 융해가 개시되면, 이동도 M은 온도 T에 대해서 거의 선형적으로 감소한 후에 그 감소율이 절감하면서 바로 최소 이동도점 Pmin에 달한다.
최소 이동도점 Pmin에 대응하는 온도 Tmin에 도달할 후, 온도의 상승에 대해이동도 M이 급증하고 바로 변성후의 단일가닥의 이동도 즉 이동도 종착점 Pend에 달한다. 이동도 종착점 Pend에 대응하는 온도 Tend보다도 높은 온도에서는 이동도 M은 다시 온도 T에 대해서 거의 선형적으로 증대한다. 이것은 온도 상승에 수반하는 점도의 저하 때문으로서, 형태의 변화는 거의 없다고 생각된다. 또한, 최소 이동도점 Pmin이 불연속점이되고, 최소 이동도점 Pmin에 대응하는 온도 Tmin과 이동도 종착점 Pend에 대응하는 온도 Tend보다도 간신히 낮은 온도와의 사이에서 밴드 곡선이 불연속이 되는 경우가 많다.
도 3은 제2의 전형적인 밴드 곡선의 형태를 나타내는 도이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 전형적인 제2밴드 곡선(61)에서는 제1밴드 곡선(51)과 같이, 융해가 개시되는 온도 Tint보다도 낮은 온도에 있어서 이동도 M은 온도 T에 관하여 거의 선형적으로 증대하고, 융해 개시점 Pint에 대응하는 온도 Tint에 달하여 융해가 개시되면 이동도 M은 온도 T에 관해서 거의 선형적으로 감소한다. 그러나, 제1밴드 곡선(51)의 경우와는 다르고, 간신히 최소 이동도점 Pmin에 달한 후, 최소 이동도점 Pmin에 대응하는 온도 Tmin보다도 높은 온도에서는 이동도 M은 다시 온도 T에 관하여 거의 선형적으로 증대한다. 즉, 제2밴드 곡선(61)에서는 최소 이동도점 Pmin과 이동도 종착점 Pend가 일치하고 밴드 곡선이 불연속이 되는 일은 없다.
관수화 처리를 통해 얻어진 밴드 곡선의 1차 미분, 2차 미분, 그 불연속점 등의 정보에 기초하여, 예를 들어 융해 개시점 Pint, 최소 이동도점 Pmin, 이동도 종착점 Pend를 특징점으로서 추출한다.
구체적으로는 융해 개시점 Pint는 2개의 직선부분 52(62)와 53(63)에 의해 놓여진 곡선부분의 중간점으로서 추출된다. 따라서, 융해 개시점 Pint는 밴드곡선51(61)의 1차 미분값 및 2차 미분값에 기초하여 구해진다.
또한, 최소 이동도점 Pmin은 제1밴드 곡선(51)의 경우, 예를 들어 곡선상의 불연속점으로서 추출된다. 한편, 제2밴드 곡선(61)의 경우, 최소 이동도점 Pmin은 이동도 종착점 Pend와 동일한 점으로서 후술하는 바와 같이 얻어진다.
더욱이, 이동도 종착점 Pend는 직선부분54(64)을 -X방향을 따라 보면 직선부분으로부터 나뉘는 점으로서, 밴드 곡선51(61)의 1차미분값 및 2차미분값에 기초하여 얻어진다.
이상의 특징점 추출처리는 명료한 밴드 즉 명료하게 선분화된 밴드 곡선으로부터 순차적으로 실시되며 전체로서 소정수의 특징점이 얻어질 때까지 실시된다. 또한, 시료 미생물의 종(種)이 미리 알려져 있고 특징점을 추출해야 하는 지정 밴드가 자명한 경우에는 그것들의 지정 밴드에 대해서 특징점 추출처리를 실시한다. 도 4에서는 3개의 밴드 곡선으로부터 추출된 합계 8개의 특징점 Pj(j=1∼8) 즉 특징점군을 모식적으로 나타내고 있다. 실질적으로는 3개보다도 많은 밴드 곡선으로부터 8개보다도 많은 특징점을 추출한다.
또한, 상술한 설명에서는 슬림화 처리 및 관수화 처리를 통해 얻어진 밴드 곡선으로부터 특징점을 추출하고 있지만, 슬림화 처리 및 관수화 처리를 실시하지 않고 각 진한 선분으로부터 직접적으로 특징점을 추출할 수도 있다.
(4) 동정 포인트군(온도 및 이동도)으로부터 PaSS 및/또는 게놈 준거리를 구한다
PaSS라는 것은, 패턴 유사도(Pattern Sililarity Score)이고, 게놈 준거리(準距離)라는 것은 PaSS를 이용한 2종의 미생물의 게놈의 유연 상황을 나타내는 지표이며, (1-PaSS)/PaSS로 표시된다. PaSS 및 게놈 준거리는 상기와 같이 하여 추출방법으로 얻어진 특징점군(spiddos: species identification dots)으로부터 이하와 같이 하여 계산되고 PaSS 및/또는 게놈 준거리를 이용하여 유전자형에 의해 미생물을 동정할 수 있다. 미생물의 동정은 비교대상 게놈에 대해서 얻어지는 특징점군과, 동정대상인 미생물의 게놈에 대해서 얻어진 특징점군을 비교하여 실시된다.
동정대상인 미생물의 종이 미리 알려져 있는 경우, 그 종을 비교대상으로 한다.
또한, 동정대상인 미생물의 종이 미지인 경우, 게놈 프로필링 화상의 전체적인 형태에 기초하여 미리 선정된 대표종(예를 들어 수십종)을 임의의 비교대상으로 한다.
또는 시료 미생물의 종이 미지인 경우, 상술한 특징점 추출처리에 의해 얻어진 각 특징점에 대해서 유사한 특징점(예를 들어 도 4에 있어서 원점 O로부터 각 특징점까지의 거리의 차이가 5% 이내)을 갖는 종을 순차적으로 리스트업(list-up)한다. 그리고, 리스트업된 종을 임의의 비교대상으로 한다.
계속하여 비교대상 게놈의 특징점군에 기초하여 상술한 특징점 추출처리로 얻어진 특징점군으로부터 대상 특징점(예를 들어 10점)을 결정한다. 여기서 대응특징점이라는 것은, 비교대상 게놈의 특징점군의 각 특징점에 대해서 위치적으로 대응하는 특징점이다. 대응 특징점의 결정은, (1) 실험자가 컴퓨터 디스플레이상에서 대응 특징점을 1개씩 수동으로 지정하는 실험자 지정방식, (2) 비교대상 게놈의 특징점군의 각 특징점이 속하는 좌표 존(zone)(XY 좌표에 있어서 2차원적인 소정의 면적을 차지하는 영역)을 결정하고, 그 좌표 존에 속하는 시료 특징점을 대응 특징점으로 하여 순차적으로 자동적으로 나누어 맞추는 자동할당방식, (3) 대응 특징점수를 적당히 설정하고 비교대상 게놈의 특징점군 및 추출된 시료 특징점으로부터 각각 대응 특징점 수만 임의로 선택하고, 대응설정을 조합하여 논적으로 실시하고, 후에 정의하는 PaSS가 가장 크게 되는 조합에 기초하여 대응 특징점을 자동적으로 구하는 최적 대응설정 자동계산법을 들 수 있다.
이렇게 하여, 도 5에 나타난 바와 같이, 비교대상 게놈의 n개의 특징점 P0i(i=1∼n)에 대응하여 시료 미생물에 대해서 n개의 특징점 P1i=(i=1∼n)가 얻어진다. 여기서 각특징점, Pi(비교대상 게놈의 n개의 특징점 P0i및 시료 미생물에 대해서 n개의 특징점 P1i)은 위치벡터 Vi(비교대상 게놈의 n개의 특징점의 위치 벡터 V0i및 시료 미생물에 대해서 n개의 특징점의 위치 벡터 V1i)를 갖는다. 또한, 위치 벡터 Vi의 원점으로서 예를 들어 M=0이고 T=최소온도의 점 O를 채용할 수 있다.
각 특징점 Pi의 위치 벡터 Vi를 이용하여 하기 수학식 1에서 규정되는 PaSS가 얻어진다.
여기서 ∑은 i=1∼n까지의 총계 기호이며, γ(i)는 하기 수학식 2로 표시된다.
또한 상술한 설명에서는 벡터(의존)형의 계산법에 따라서 PaSS의 값을 구하고 있지만, 이하에 나타난 바와 같이 스칼라형의 계산법에 기초하여 PaSS의 값을 구할 수도 있다.
여기서, 여기서 ∑은 i=1∼n까지의 총계 기호이며, r(i)는 하기 수학식 4로 표시된다.
여기서, T0i는 비교대상 게놈의 n개의 특징점 P0i의 온도이고, T1i는 시료생물의 n개의 특징점 P1i의 온도이다. 또한, M0i는 비교대상 게놈의 n개의 특징점 P0i의 이동도이고, M1i는 시료생물의 n개의 특징점 P1i의 이동도이다. 더욱이 TW는 특징점이 나타나는 온도범위폭(예를 들어 약 60℃)에 상당하는 온도규격화 인자이다. 또한, α는 이동도 변화와 온도변화의 양쪽이 「겹침」의 상대값으로서 통상은 1이다. 그런데, 상기 수학식 4의 분모부분(α2+12)1/2는 제2의 규격화 인자 (r(i)의 값을 1이하로 하기 위해)를 구성하고 있다.
또한, 상기 수학식 1 또는 수학식 3에 기초하여 얻어진 PaSS를 이용하여 하기 수학식 5로 규정되는 게놈 준거리 ds가 얻어진다.
일반적으로 시료 미생물의 종과 비교대상 게놈의 종이 동일한 경우, PaSS의 값(스코어)은 1에 가까워지고 게놈 준거리 ds의 값은 0에 가까워진다.
(5) PaSS 및/또는 게놈 준거리에 기초하여 미생물의 동정(종동정 및/또는 유연성 동정)
동정대상인 미생물의 종이 미지인 경우, 각 비교대상 게놈에 대해서 PaSS 및 필요에 따라서는 게놈 준거리 ds를 계산한다. 그리고, PaSS의 값이 표준값(예를 들어 0.96)을 상회할 때까지 또는 게놈 준거리 ds의 값이 기준값(예를 들어 0.04)을 하회할 때까지 다른 대상 게놈과의 비교를 반복한다. 이렇게 하여, PaSS의 값 또는 게놈 준거리 ds의 값에 기초하여 시료 미생물의 종의 동정을 실시할 수 있다.
한편, 동정대상인 미생물의 종이 공지인 경우, PaSS의 값 또는 게놈 준거리 ds의 값에 기초하여 동일한 종에 있어서의 개체간의 유연성을 판정할 수 있다. 즉, 동일종에 속하는 2개의 시료 미생물에 대해서 PaSS 또는 게놈 준거리 ds를 구하고, 2개의 PaSS의 값이 충분히 가까운 경우 또는 2개의 게놈 준거리 ds의 값이 충분히 가까운 경우에는 2개의 시료 미생물이 동일 종으로서 그 고체간의 유연성이 높은 것이라고 판정된다.
더욱이 어느 일정한 게놈 준거리 이내에 있는 종이나 고체의 집합을 근린정보로서 게놈 서열공간에 플럿(plot)하여 보존하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여, 게놈 프로필링 화상, 특징점군, 판단정보, 근린정보 등은 적당한 데이터 베이스에 등록되고, 수시 이용가능하게 구성되는 것이 바람직하다.
이상과 같이 하여 변성전에 있어서의 융해의 개시에 대응하는 융해 개시점, 가닥 해리전에 있어서 이동도가 최소값에 달하는 최소 이동도점, 및 변성후의 단일가닥 상태의 이동도에 최초로 종착하는 이동도 종착점을 특징점으로서 게놈 프로필링 화상으로부터 추출되어 있다. 그 결과, 얻어진 특징점군을 이용한 정량적인 수법으로, 미생물의 종의 동정 및 동일종의 미생물에 있어서의 고체간의 유연성의 동정을 정확하게 또한 간편하게 실시할 수 있다.
또한, 이상은 유전자형에 의한 미생물의 종 동정방법 및 유연성 동정방법에 대해 설명하였다. 그러나, 본 발명의 방법은 미생물에 한정되는 것이 아니라, 일반의 생물의 종동정방법 및 유연성 동정방법 등의 동정방법에도 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더 상세히 설명한다.
실시예 1
미리 효모균, 대장균, 고초(枯草)균, 납두(納豆)균의 각각에 대해서, 각각의 변이체주를 포함하여 이하에 나타난 방법에 의해 본 발명의 게놈 프로필링(GP)를 실시하고, 그 spiddos를 컴퓨터상에서 구하며, 데이터베이스 등록하였다(전 20종류). 새롭게 시판하는 납두로부터 납두균을 추출하고 그 DNA를 조제하고, GP를 실시하며, spiddos를 얻었다. 이것을 임의의 미지 재료 X의 spiddos로 하였다.
[랜덤 PCR에 의한 2중가닥 DNA 단편의 조제]
200μM dNTP(N=G, A, T, C), 0.5μM 프라이머(서열번호 4로 표시되는 pfM12(dAGAACGCGCCTG)), l0mM Tris-HC1(pH9.0), 50mM KCl, 2.5mM MgC12, 0.1%Triton X-100, 0.02unit/㎕ TaqDNA 폴리메라아제, 및 적당량(3㎕의 DNA용액을 더하여, 반응용액 전체를 100㎕로 하였다.)의 주형 DNA를 포함하는 반응용액 100㎕를 각 DNA에 대해서 조제하였다. 또한 PCR반응은 94℃에서 1분간의 처리후에, 변성(94℃, 30초), 어닐링(28℃, 2분), 가닥 신장(47℃, 2분)의 사이클을 20∼30회 반복하고, 최후에 47℃에서 2분처리하여 2중가닥 DNA 단편을 조제하였다.
[2중가닥 DNA 단편의 TGGE]
상기에서 얻어진 2중가닥 DNA 단편(약 3μg)으로 스탠다드 DNA로서, 서열번호 1의 서열을 갖는 DNA를 0.3μg 첨가한 후, TGGE에 의한 전기영동을 실시하였다. TGGE에 의한 전기영동의 조건은 이하대로이다.
4% 폴리아크릴아미드겔(8M 요소함유 40mM 트리스 완충용액(pH 8.0)을 이용하고, 30℃∼70℃의 직선온도구배를 이용하고, 400V의 하에서 110분간 전기영동을 실시하였다. 또한, 이 전기영동에서는 타이텍크사제 전기영동장치 TG-180을 이용하였다.
[전기영동 패턴으로부터 각 DNA 단편의 동정 포인트 추출]
TGGE에 의해 얻어진 전기영동 겔상의 DNA(스탠다드 DNA를 포함)의 밴드(전기영동 패턴)을 이하의 방법에 의해 은염색하고, 시각화한 각 패턴으로부터 동정 포인트를 추출하였다.
1) 겔결합 필름에 부착한 상태의 겔을 그대로, 30% PEG 2000 수용액(200ml)이 들어간 플라스틱 용기에 이동하고, 실온(15∼30℃)에서 30분간 흔들어 섞는다. 이 사이에 겔은 필름으로부터 박리되고 더욱 수축, 백탁된다.
2) 일회증류수 150ml로 치환되고 잘 헹군다. 이것을 2회 반복한다. 헹굼액은 아스피레이터에서 완전히 흡수되어 배출된다.
3) 헹굼액을 제거한 후에, 약 200ml의 은염색액(200ml의 2회 증류수에 10ml의 1M NaOH와 2ml의 25% 암모니아수를 첨가, 혼합한 후에 질산은 0.4g을 용해한 것)을 주입하고 30분간 흔들어 섞는다.
4) 2회증류수 200ml로 치환하고 1분간 흔들어 섞고 배액한 후 다시 동일한 세정을 실시한다.
5) 약 200ml 현상액(200ml의 2회 증류수에 200㎕의 10% 구연산과 200㎕의 포르말린을 가하고 용해한 것)에 치환하고, 가볍게 흔들면서 밴드가 적당한 농도가 되기를 기다린다.
6) 적당한 농도가 되면 재빨리 현상액을 제거하고 미리 조제하여 둔 200ml의 정지액(10% 초산, 40% 메탄올의 수용액)을 가하고, 약 10분간 흔들어 섞고 염색된 겔 시료를 얻는다.
이상의 방법으로 시각화한 각 패턴으로부터 동정 포인트를 추출하고, spiddos를 구하였다. 동정 포인트의 추출은 이하의 방법에서 실시되었다.
GP의 겔 사진을 스캐너로 컴퓨터에 입력하고, 얻어진 화상을 컴퓨터에 의해 보정 규격화 처리를 실시한 후에, 디스플레이상에서 나타내는 화상에 대해서 마우스를 이용하여 특징점을 지정하는 방법(맨-머신(man-machine)방법)으로 동정 포인트를 추출하였다.
이와 같이 하여 얻어진 미지시료 X의 spiddos와 데이터 베이스 상의 여러 게놈의 spiddo 10점을 대비하고, PaSS를 전조합계산법에 의해 계산하였다.
X와의 사이에서 가장 높은 PaSS를 부여하는 게놈을 먼저 등록한 20종류의 중에서 자동 추출하였다.
결과를 컴퓨터 출력하고, 그 부대정보로부터 X가 가장 높은 유사성을 나타내는 생물의 게놈은 납두균인 것이 판명되었다.
실시예 2
고초균 DNA를 주형으로 하여 이용하고 또한 프라이머로서 형광체 cy3를 갖는 서열번호 39로 표시되는 cy3-pfM12 (5'cy3-AGA ACG CGC CTG 3') 또는 형광체 FITC를 갖는 서열번호 40으로 표시되는 FITC/UCS (5'FITC- CA GGA AAC AGC TAT GAC 3')를 이용한 것 외에는, 실시예 1과 같이 하여 랜덤 PCR을 각 프라이머에 대해서 실시하고, 얻어진 2중가닥 증폭 DNA 단편을 혼합한 후에 실시예 1과 같이 TGGE에 부쳤다. TGGE의 영동 패턴을 형광체 cy3의 여기파장/형광파장인 550nm/570nm 및 형광체 FITC 여기파장/형광파장인 494nm/519nm로 시각화하였다. 도 6의 (a)에는 서열번호 39로 표시되는 cy3-pfM12 (5'cy3-AGA ACG CGC CTG 3')을 프라이머로서 이용한 경우의 영동 패턴을 나타내고, (b)경우에 서열번호 40으로 표시되는 FITC/UCS (5'FITC- CA GGA AAC AGC TAT GAC 3')를 프라이머로서 이용한 경우의 영동 패턴을 나타낸다. 각 패턴으로부터 동정 포인트를 추출하였다. 얻어진 동정 포인트로부터 주형으로서 이용한 균은 고초균인 것으로 동정되었다.
상기 실시예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 동정방법은 종래의 동정방법에 비해 미생물 등의 생물의 종의 동정 및 유연성의 동정을 정확하게 또한 간편하게 실시할 수 있다.

Claims (7)

  1. (1) 동정대상인 생물의 게놈의 일부 또는 전부를 주형으로 하여 랜덤 PCR에 의해 1종 또는 2종 이상의 2중가닥 DNA 단편을 조제하고,
    (2) (1)에서 조제한 2중가닥 DNA 단편을 온도구배 겔전기영동(TGGE) 또는 변성제 농도구배 겔전기영동(DGGE)에 부치고,
    (3) (2)에서 얻어진 전기영동 패턴으로부터 각 DNA 단편의 동정 포인트를 추출하고,
    (4) (3)에서 얻어진 동정 포인트군으로부터 PaSS 및/또는 게놈 준거리(準距離)를 구하며,
    (5) (4)에서 얻어진 PaSS 및/또는 게놈 준거리에 기초하여 미생물의 동정을 실시하는 방법으로서,
    TGGE 또는 DGGE에 의한 전기영동시에, 동정 포인트의 기준점으로서 스탠다드 DNA (standard DNA)를 공존시키고 스탠다드 DNA와의 위치관계로부터 동정 포인트의 의(doubtful, 疑)-절대위치를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 스탠다드 DNA가 서열표에 나타난 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물의 동정이 생물의 종(種) 동정 또는유연성(類緣性) 동정인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (1)에 있어서 랜덤 PCR의 원료에 형광 표식기(fluorescent maker)를 갖는 물질을 이용하여 형광 표식기를 갖는 DNA를 증폭시키고 스탠다드 DNA로서 형광표식된 DNA를 이용하고, 상기 (3)에 있어서의 동정 포인트의 추출을 DNA에 붙은 형광 표식기를 이용하여 화상처리를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 형광 표식기를 갖는 원료가 프라이머 또는 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (3)에서 얻어진 동정 포인트는 온도구배 겔전기영동(TGGE)의 경우에는 온도 축과 이동도 축의 좌표로서 나타내고, 변성제 농도구배 겔전기영동(DGGE)의 경우에는 변성제 농도 축과 이동도 축의 좌료로서 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물이 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
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