이하, 본 발명의 구성에 대해 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 상지 추출물과 파이토스핑고신(Phytosphingosine)을 동시에 함유하는 피부개선 화장료 조성물에 관한 것으로, 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
상기 상지추출물은 뽕나무과의 뽕나무(Morus albaLinne)의 어린가지인 상지로부터 추출한 것으로, 티로시나제 저해 효과 및 지속성이 뛰어나며, 멜라닌 합성저해 효과가 우수한 식물 추출물로 본 발명자들은 이미 상지 추출물의 미백 효과에 대한 특허 출원(97-제47258호)을 하였다.
또한, 상기 파이토스핑고신(Phytosphingosine)은 세라마이드의 생합성 경로의 중간체로서 이를 피부에 적용함으로서 결핍된 세라마이드 성분을 보충해주거나 피부세포가 직접 세라마이드를 합성할 수 있도록 해 주는 것으로(USP5578641), 효모(yeast)로부터 분리해 사용하고 있는데 이는 구조와 성질이 사람의 피부에 존재하는 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 같다.
상기 파이토스핑고신(Phytosphingosine)은 피부에 존재하는 6가지 세라마이드(ceramide) 중 세라마이드(ceramide) 1, 3, 6 생합성의 중간체로 피부에 불필요한 미생물의 성장을 억제하고, 프로테인카이나제 C(protein kinase C)의 활성을 억제하여 염증 전구물질인 인터루킨 1α(IL-1α)의 분비를 억제함으로서 염증 및 자극을 억제하여 건강한 피부를 유지시키고 혈행촉진 및 세포활성 증진효과를 갖고 있다.
본 발명의 피부 개선 화장료 조성물은 상기 상지 추출물과 파이토스핑고신(Phytosphingosine)을 함유하여 안정화시킨 니오좀(Niosome)을 화장료 총 중량에 대해 0.05∼20.0 중량의 양으로, 바람직하게는 0.1∼10.0중량함유한다. 이때, 상지 추출물은 니오좀 총 중량에 대해 0.01-5.00중량로, 바람직하게 0.1-2.0중량로 배합하고, 파이토스핑고신(Phytosphingosine)은 니오좀 총 중량에 대해 0.01-5.00중량, 바람직하게 0.1-2.0중량로 배합한다.
상기 상지 추출물과 파이토스핑고신(Phytosphingosine)을 함유하는 화장료조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 팩, 엣센스, 팩 등 그 제형에 있어 특별히 한정되지 않고 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 상기 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지 추출물 외의 다른 성분을 적의 선정하여 배합할 수 있다.
다음은 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 아래의 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다. 배합량은 중량로 나타낸다.
제조예 1: 니오좀 제조방법
본 발명에 사용된 니오좀(Niosome)은 안정한 비이온 계면활성제, 콜레스테롤 및 그와 유사한 유도체로 구성되며 폴리옥시에칠렌 알킬에더(Polyoxyethylene alkylether), 알킬에스터(Alkylester), 사카로스디에스터(Saccharose diester)등의 비이온 계면활성제가 사용된다. 상기와 같은 비이온 계면활성제는 베이스로 피이지-5-소이스테롤(PEG-5-Soy sterol)과 콜레스테릴 올레이트(Cholesteryl oleate)를 사용하고, 아울러 피부의 지질이 갖고 있는 역할을 보완하기 위해 글리세린(Glycerin) 골격에 세라마이드3(Ceramide 3)를 결합시켜 양친매성 성질을 갖게 함으로서 천연지질성분과 유사토록 하였다. 각각의 조성을 보면 양의 털에서 추출한 콜레스테롤과 핀란드산 소나무에서 추출된 베타시토스테롤(β-sitosterol)을 60-70사용하였으며, 비이온 계면활성제로는 콩에서 추출한피이지-5-소이스테롤(PEG-5-Soy sterol)과 콜레스테릴 올레이트(Cholesteryl oleate)를 30-40사용하고 세라마이드3(Ceramide 3)를 0.1-10사용하여 Vesicle 을 만들었다. 따라서 본 발명에 사용된 니오좀을 NSV(Nonionic surfactant vesicles)라고도 한다. 본 발명의 유효성분인 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 각각 니오좀 총 중량에 대해 0.01-5.00중량로, 바람직하게 0.1-2.0중량로 배합하여 상기 Vesicle 안에 안정화함으로서 피부침투가 용이하면서 유효성분의 효과를 극대화한 니오좀(Niosome)을 제조하는 것이다.
제조예 2: 상지 추출물 제조
본 발명의 화장료에 함유되는 상지 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 상지를 정제수로 세척하고 건조한 상지 1kg을 70에탄올 5L에 넣고 4-40℃에서 5일간 추출한 후 300메쉬 여과포로 여과하고, 5-10℃에서 7-10일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 여과지로 여과한다. 이 추출물을 65℃에서 회전 감압 증발기로 건조하여 상지 파우더를 얻는다.
실시예 및 비교예: 크림 제조
본 발명의 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유하는 조성물을 실시예로, 니오좀을 함유하지 않는 조성물을 비교예로 하여 하기 표 1과 같이 배합하여 제조한다.
단위(중량부) |
배합성분 |
실시예 |
비교예 |
니오좀 |
10.0 |
- |
바셀린 |
7.0 |
7.0 |
유동파라핀 |
10.0 |
10.0 |
밀납 |
2.0 |
2.0 |
폴리솔베이트 60 |
2.0 |
2.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
2.5 |
2.5 |
스쿠알란 |
3.0 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
6.0 |
6.0 |
글리세린 |
4.0 |
4.0 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
0.5 |
카르복시비닐폴리머 |
0.5 |
0.5 |
토코페릴아세테이트 |
0.1 |
0.1 |
향, 방부제 |
미량 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
실험예 1: Anti-shadow 효과에 대한 시험
1) 실험방법
본 발명의 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 함유하는 화장료 조성물과 이를 함유하지 않는 화장료 조성물을 각각 실시예와 비교예로 하여 Anti-shadow 효과를 측정하기 위한 것으로, 30세 이상의 여성 30명을 대상으로 15명씩 2개 그룹(A, B)으로 나눈 후, A그룹에는 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 크림(실시예)을, B그룹에는 함유하지 않은 크림(비교예)을 1일 2회씩 눈가 및 눈밑을 중심으로 0.2mg씩 12주간 도포하여 Anti-shadow 효과를 측정하였다. 피부톤 밝기 변화(ΔL)의 정도는 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하였다. 육안관찰은 하기 7 등급 분류에 따라 측정하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
·평가 기준 :
-3: 매우 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화 0: 변화 없음
1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선
2)실험결과
Anti-shadow 에 대한 임상결과
피검자 |
피부색의밝기 변화(ΔL) |
숙련자의객관적 평가 |
피검자의주관적 평가 |
A |
B |
A |
B |
A |
B |
1 |
5.1 |
1.9 |
1 |
1 |
1 |
0 |
2 |
5.6 |
1.0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
3 |
3.2 |
1.8 |
1 |
-1 |
2 |
0 |
4 |
7.1 |
0.3 |
2 |
0 |
3 |
0 |
5 |
7.4 |
2.1 |
3 |
1 |
2 |
2 |
6 |
5.2 |
-0.5 |
1 |
0 |
2 |
0 |
7 |
5.5 |
1.6 |
3 |
1 |
3 |
1 |
8 |
8.8 |
2.2 |
3 |
1 |
3 |
2 |
9 |
2.9 |
0.7 |
2 |
1 |
1 |
0 |
10 |
5.2 |
-1.0 |
2 |
0 |
1 |
1 |
평균값 |
5.6 |
1.01 |
2.1 |
0.4 |
2.1 |
0.6 |
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 실시예를 도포한 A그룹의 평균 ΔL값은 5.6(P<0.01)이며, 니오좀을 함유하지 않은 비교예를 도포한 B그룹의 평균 ΔL값은 1.01(P>0.05)로 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀이 피부톤을 매우 효과적으로 밝게 개선시켜 줌을 알 수 있다. 또한, 숙련자에 의한 객관적 육안 평가에서 A그룹은 2.1(P<0.01), B그룹은 0.4(P>0.05)이 나왔으며, 피검자에 의한주관적 육안 평가에서는 A그룹은 2.1(P<0.01), B그룹은 0.6(P>0.05)로 나타남으로 보아 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 실시예가 확실한 Anti-shadow 효과를 보임을 알 수 있다.
실험예 2: 상지 추출물의 티로시나제 활성 억제능 시험
1) 실험방법
상지 추출물의 티로시나제 활성 억제 정도를 알아보기 위한 것으로, 상지 추출물은 상지 파우더를 1,3-부틸렌 글리콜에 고농도로 용해시키고 다시 완충용액에 희석하여 하기 표 3과 같은 농도로 추출물 시료액을 준비한다. 티로시나아제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로(SIGMA사) 사용하고, 기질인 티로신은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 녹여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다.
상기 티로신 용액 0.5㎖을 시험관에 넣고 여기에 하기 표 3의 농도로 준비된 상지 추출물 시료액 0.5㎖을 가하여 37℃ 항온기에서 10분간 방치한 후 200U/㎖ 티로시나아제 0.5㎖을 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨다. 이때 대조군은 강력한 티로시나제 활성 억제능을 갖고 있는 것으로 알려진 코직산을 상지추출물 대신 0.5㎖ 넣은 것이다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시키고 분광광도계(spectrophotometer)로 파장 475㎚에서의 흡광도를 측정하고 각 추출물의 티로시나아제 활성 증가 효과를 하기의 공식으로 구해 그 결과를 표 3에 나타내었다.
2) 실험결과
상지 추출물의 티로시나아제 활성 저해 효과
농도(㎍/㎖) |
티로시나아제 활성 저해율() |
상지 추출물 |
코직산 |
1 |
6.5 |
5.4 |
2 |
14.1 |
16.9 |
5 |
37.0 |
42.5 |
10 |
55.8 |
64.4 |
20 |
67.5 |
77.2 |
50 |
76.8 |
84.6 |
100 |
84.4 |
88.8 |
200 |
93.2 |
92.3 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 상지 추출물은 강력한 티로시나제 활성 억제능을 갖고 있지만 피부 자극 및 안정성의 문제점을 갖고 있는 것으로 알려진 코직산과 유사한 높은 티로시나제 활성 저해 효과를 보임을 알 수 있다.
실험예 3: 상지추출물의 멜라노사이트(Melanocyte)에서 멜라닌 생성에 대한 억제 효과 시험
1) 실험방법
멜라노사이트에서 멜라닌 합성에 대한 상지 추출물의 저해 효과를 알아보기 위한 것으로, 멜라노사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주를 구입하여 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/L, 10혈청, 1항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 50㎖ T-플라스크에 37℃에서 배양한다. 5CO2조건하에서24시간 배양한 후, 0.02EDTA가 함유된 0.05트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 50㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양한다. 이때 세포수는 5.76 × 106세포/플라스크이다. 여기에 상지추출물을 DMEM 배지에 적당 농도로 희석시켜 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 0.02EDTA와 0.05트립신을 함유한 살린-포스페이트 완충용액(PBS)을 1㎖ 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집한다. 5트리클로로아세테이트(TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 살린-포스페이트 완충용액으로 세척한다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌(시그마사)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
2) 실험결과
멜라노사이트에서 멜라닌 합성에 대한 상지추출물의 저해 효과
상지추출물 농도(㎍/㎖) |
멜라닌 생성 억제율() |
무처리 |
- |
1 |
1.17 |
2 |
10.0 |
5 |
17.2 |
10 |
27.4 |
20 |
31.4 |
50 |
43.7 |
100 |
54.2 |
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 상지 추출물의 농도가 증가함에 따라 멜라노사이트에서의 멜라닌 생성 억제율이 증가함으로 보아 상지 추출물의 멜라닌 합성 억제 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 4: 파이토스핑고신(Phytosphingosine)의 세포증식 효과에 대한 시험
1) 실험방법
인체 정상 각질형성세포(Human normal Keratinocyte)를 96웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰(well)에 1x104세포가 되도록 접종하여 디엠이엠(DMEM) 배지에서 24시간 배양한다. 배양 후 디메틸설폭시드(DMSO:Dimethyl sulfoxide)에 파이토스핑고신(Phytosphingosine)을 용해시키고 다시 완충용액에 적당한 농도로 희석하여 최종 농도가 250㎍/㎖ 되도록 조정한 시럼(serum)이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지로 교체한 후 24시간 더 배양한다. MTT 용액[3-(4,5-Dimethyl-thiazole-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide : 5 ㎎/㎖] 10㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후, 배지 부분을 버린다. 각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭시드 (DMSO :Dimethyl sulfoxide)용액을 가하여 20분간 교반 후 마이크로 플레이트 리더 (microplate Reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 효과를 하기 공식에 의해 산출하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
2) 실험 결과
케라티노사이트에서 세포증식효과
Phytoshpingosine의 농도(㎍/㎖) |
세포증식효과() |
무처리 |
- |
10 |
8.3 |
50 |
17.5 |
100 |
31.8 |
200 |
66.3 |
500 |
78.5 |
* 상기 값은 3회 실시 평균값임
실험예 5: 니오좀을 함유한 화장료에 대한 피부 안전성 실험
1) 실험방법
파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 화장료에 대한 피부 안정성을 시험하기 위해, 피검자 30명(평균연령 27.5세 , 연령분포 19세-35세)을 2그룹으로 나누어 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외하였다.
시험부위를 70에탄올로 닦아낸 뒤 건조시킨 다음 실시예 및 비교예 제품을 각각 A그룹, B그룹에 15㎍씩 Chamber에 적하 시킨 후 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시킨다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰하여 하기 표 6의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis ResearchGroup:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 실험결과는 하기 표 7에 나타내었다.
국제접촉피부염연구회의 판정 기준
기호 |
판 정 기 준 |
평 가 |
Mean Score |
±++++++- |
Doubtful or slight reaction and erythemaErythema + IndurationErythema + Induration + VesicleErythema + Induration + BullaeNegative |
미소자극경자극중자극강자극무자극 |
0∼0.91.0∼2.93.0∼4.95.0이상0 |
2) 실험결과
피부 안전성
경과시간 |
실시예 |
비교예 |
24시간 |
0 |
0.5 |
48시간 |
0 |
0 |
상기 표 7과 같이, 피부 안전성 실험결과 본 발명의 실시예인 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 크림은 평균 자극정도가 0으로 피검자 전원에서 자극을 보이지 않아 피부에 안전한 기제임을 알 수 있다.
실험예 6: 니오좀을 함유한 화장료의 제형 안정성 시험
1) 실험방법
화장료의 제형 안정성을 실험하기 위해 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지 추출물을 안정화한 니오좀을 함유하는 실시예와 함유하지 않는 비교예를 각각 45℃로 일정하게 유지되는 항온조와 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후 분리 정도 및 변색 정도를 비교 측정하였다. 제품의 분리 및 변색 정도를 하기 6등급으로 분류하여 평가하고 그 결과를 표 8에 나타내었다.
·제품 변색 평가 기준 :
0: 변화 없음 1: 극히 조금 분리(변색)
2: 조금 분리(변색) 3: 조금 심하게 분리(변색)
4: 심하게 분리(변색) 5: 극히 심하게 분리(변색)
2)실험결과
분리 및 변색정도
온도 |
시험물질 변색 정도 |
실시예 |
비교예 |
45℃ |
0 |
0 |
4℃ |
0 |
0 |
상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 파이토스핑고신(Phytosphingosine)과 상지추출물을 안정화한 니오좀을 함유한 실시예는 변색 및 분리현상이 전혀 없어 안정한 기제임을 알 수 있다.
제형예:
본 발명의 파이토스핑고신(Phytospingosine)과 상지 추출물을 안정화한 니오좀을 함유하는 조성물을 제품에 도입한 것으로, 화장료 총 중량에 대해 0.05-20.0중량, 바람직하게 0.1-10.0중량로 배합하여 통상적인 화장품 분야에서 제조 방법에 따라 제조한다. 그러나, 본 발명의 조성물이 하기의 제형예들로 한정되는 것은 아니다.
제형예 1: 유연화장수(스킨로션)
배합성분 |
중량부 |
니오좀 |
1.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
6.0 |
글리세린 |
4.0 |
올레일알코올 |
0.1 |
폴리솔베이트 20 |
0.5 |
에탄올 |
15.0 |
벤조페논-9 |
0.05 |
향, 방부제 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 2: 영양화장수(밀크로션)
배합성분 |
중량부 |
니오좀 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
6.0 |
글리세린 |
4.0 |
트리에탄올아민 |
1.2 |
토코페릴아세테이트 |
3.0 |
유동 파라핀 |
5.0 |
스쿠알란 |
3.0 |
마카다미아너트오일 |
2.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
1.0 |
카르복시비닐 폴리머 |
1.0 |
비에치티이 |
0.01 |
이디티에이-2엔에이 |
0.01 |
향, 방부제 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 3: 영양크림
배합성분 |
중량부 |
니오좀 |
10.0 |
세토스테아릴알콜 |
2.0 |
글리세릴스테아레이트 |
1.5 |
트리옥타노인 |
5.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.2 |
솔비탄스테아레이트 |
0.5 |
스쿠알란 |
5.0 |
유동파라핀 |
3.0 |
싸이클로메치콘 |
3.0 |
비에치티이 |
0.05 |
델타-토코페롤 |
0.2 |
농글리세린 |
4.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
2.0 |
산탄검 |
0.1 |
이디티에이-2엔에이 |
0.05 |
향, 방부제 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 4: 마사지크림
배합성분 |
중량부 |
니오좀 |
1.0 |
프로필렌글리콜 |
6.0 |
글리세린 |
4.0 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
밀납 |
2.0 |
토코페릴아세테이트 |
0.1 |
폴리솔베이트 60 |
3.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
2.5 |
세테아릴알코올 |
2.0 |
유동파라핀 |
30.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.5 |
향, 방부제 |
미량 |
정제수 |
to 100 |
제형예 5: 팩
배합성분 |
중량부 |
니오좀 |
2.0 |
프로필렌글리콜 |
2.0 |
글리세린 |
4.0 |
카르복시비닐 폴리머 |
0.3 |
에탄올 |
7.0 |
피이지-40 히드로게비이티드 캐스터 오일 |
0.8 |
트리에탄올아민 |
0.3 |
비에치티이 |
0.01 |
이디티에이-2엔에이 |
0.01 |
향, 방부제 |
미량 |
정제수 |
to 100 |