KR20010089946A - 5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 그를 이용한5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포도당을 자화하여 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) MP377(KFCC-11141)에 관한 것으로서, 탄소원으로서 포도당만을 사용하여 배양액내에 5'-이노신산을 고농도로 축적할 수 있으므로, 보다 경제적인 방법으로 5'-이노신산을 고농도·고수율로 제조할 수 있다.

Description

5'-이노신산을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 5'-이노신산의 제조방법{5'-inosinic acid-producing microorganism and method for preparing 5'-inosinic acid using the same}
본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 배양액중에 5'-이노신산을 고농도로 축적시키는, 코리네박테리움(종전의 브레비박테리움(Brevibacterium)) 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 변이주 KFCC-10814(대한민국특허 제 127853 호)로부터 유래된 변이주 MP377(KFCC-11141)에 관한 것이다.
5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간 물질로서 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질뿐 아니라 식품, 의약품 등 다방면에서 이용되고 있으며, 특히 음식물의 조미료로서 글루탐산 나트륨과 더불어 소량 사용하면 맛의 상승 효과가 커지는 등 정미성 조미료로 각광받고 있는 핵산계 조미료 중의 하나이다.
종래 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 변이주인 KFCC-10814는 포도당과 과당의 1:1 혼합당을 이용하여 발효시킬 경우 고농도의 5'-이노신산을 생산한다. 그러나, 탄소원으로서 포도당만을 사용할 경우 이 변이주의 5'-이노신산 생산능은 현저히 저하된다. 일반적으로 탄소원으로서 발효에 사용하는 포도당의 가격이 원당을 가수분해하여 얻는 포도당과 과당의 1:1 혼합당에 비하여 저렴하므로 더욱 경제적인 생산을 위해서는 포도당만을 탄소원으로 하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 미생물을 개발할 필요가 있다. 이와 같은 미생물을 획득하는 방법에는 여러 가지가 있을 수 있으며, 그중 하나의 방법으로 이미 획득된 포도당과 과당의 1:1 혼합당을 이용하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 변이주로부터 포도당만을 이용하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 신규의 변이주를 제조하는 방법이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 탄소원으로서 포도당과 과당을 혼합하여 배양하면 5'-이노신산을 고농도로 생산하지만, 포도당만을 사용하면 그 자화성이 현저히 떨어지고, 특히 5'-이노신산 생성능이 현격히 저하되는 코리네박테리움 암모니아게네스의 5'-이노신산 생산용 변이주 KFCC-10814에 대해 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine) 내성을 부여함으로써, 포도당을 자화하면서 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 변이주 MP377(KFCC-11141), 및 그를 이용하여 5'-이노신산을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
첫째, 본 발명은 포도당을 자화하여 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 MP377(KFCC-11141)에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 300㎍/㎖이상의 6-머캅토퓨린에 대해 내성을 갖는 것이다.
둘째, 본 발명은 상기 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 5'-이노신산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서는, 탄소원으로서 포도당을 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 MP377은 종래의 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 변이주로서, ⅰ) 5'-이노신산을 생산하는 아데닌(adenine) 누출형 변이주(leaky mutant)[Agric. Biol. Chem., Vol. 47, No. 5, p1035-1041, 1983 (KY13102, KY13171, KY13184 등)] 또는 아데닌과 크산틴(xanthine) 또는 구아닌(guanine) 동시 요구성 균주와는 달리, 아데닌을 요구하는 반면, 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않지만 이들을 첨가함으로써 생육이 촉진되며, ⅱ) 우레아(urea)를 자화할 수 있는 우레아제(urease)가 결손되고, ⅲ) 세포내에 생성된 대량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성능력이 부분적으로 결손된 것으로 여겨지는, 세포벽 분해효소인 라이소자임(lysozyme)에 대해 높은 감수성을 가지며, ⅳ) 배양과정에 탄소원으로서 포도당과 과당의 혼합당 또는 기타 당류 등을 고농도로 첨가하거나 배양 후반에 5'-이노신산이 배양액내에 고농도로 축적되면, 균체 외부의 삼투압이 증가하여 5'-이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성이 저해됨으로 인해, 균체성장이 둔화되고 5'-이노신산 생성이 저하되는 것을 방지할 수 있는 삼투압 내성 형질이 부여되어 있으며, ⅴ) 5'-이노신산 생합성에 있어서 퓨린계 염기들에 의한 조절을 해제하기위한 일환으로, 퓨린계 염기 유사체의 일종인 6-머캅토퓨린에 대한 내성 형질을 갖는다. 특히, 6-머캅토퓨린에 대한 내성 형질을 부여하여 탄소원으로 포도당만을 사용하는 것이 가능하게 되며, 질소원 제한 영양배지에서 호기적으로 배양하여 배양액중에 5'-이노신산을 고농도·고수율로 직접 축적시킨다. 상기 균주는 2000년 1월 29일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하여, 수탁번호 제 KFCC-11141 호를 부여받았다.
본 발명에 따른 균주를 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
먼저 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872를 친주로 하여 X-선, 자외선 조사 등에 의해 5'-이노신산 생성능을 갖고 생육을 위해 아데닌을 요구하며 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(주 4)에서 생육이 촉진되는 CS101를 얻는다. 이때, 변이주 분리배지로 영양배지(주 1), 최소배지(주 2), 최소첨가배지(주 3, 4)를 사용하여 변이주를 분리한다. 다음으로, CS101을 친주로 하여 X-선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸설파이드, 에틸아민 등 화학적 돌연변이원으로 처리한후 배지(주 1)에 도말하여 콜로니(colony)를 순수 분리한다. 그후 라이소자임이 농도별로 첨가된 배지(주 5)를 사용하여 CS101 보다 높은 라이소자임 감수성을 갖는 CS1019를 선별한다. 그 다음으로, 변이주 CS1019를 상기한 유기 변이제로 처리한후 배지(주 1)에서 순수 분리하고 크리스텐센우레아 검사배지, 배지(주 7)에서 우레아제가 결손된 변이주 CS10197을 선별한다. 변이주 CS10197을 다시 동일한 방법을 사용하여 3,4-디하이드로프롤린(3,4-dehydro-DL-proline)이 농도별로첨가된 배지(주 6)를 사용하여 CS10197 보다 높은 3,4-디하이드로프롤린 내성을 갖는 변이주 CS101975를 얻는다. 이때, 대부분의 변이주들은 3,4-디하이드로프롤린의 농도가 높아 성장할 수 없으며 삼투압 내성이 높은 변이주는 성장가능하므로 3,4-디하이드로프롤린의 농도를 단계적으로 높여 3500㎍/㎖에서도 성장가능한 변이주를 얻는다. 여기에서 얻은 변이주를 원심분리하여 3,4-디하이드로프롤린이 3500㎍/㎖의 농도로 함유된 배지(주 6)에 도말하여 생성된 콜로니를 순수 분리하여 KFCC-10814를 얻는다.
본 발명에서는, 상기 변이주 KFCC-10814를 다시 동일한 방법을 사용하여 6-머캅토퓨린을 농도별로 첨가한 배지(주 8)를 사용하여 KFCC-10814 보다 높은 6-머캅토퓨린 내성을 갖는 변이주 CSJ6을 얻는다. 이때, 대부분의 변이주들은 6-머캅토퓨린의 농도가 높아 성장할 수 없으며, 6-머캅토퓨린이 300㎍/㎖의 농도로 함유된 배지(주 8)에 도말하여 생성된 콜로니를 순수 분리하여 MP377라 명명하였다.
(주 1) 영양배지; 펩톤 1, 육즙 1, 염화나트륨 0.25, 효모엑기스 1, 한천 2, pH 7.2
(주 2) 최소배지; 포도당 2, 황산나트륨 0.3, 인산제1칼륨 0.1, 인산제2칼륨 0.3, 황산마그네슘 0.3, 염화칼슘 10mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 황산아연 1mg/ℓ, 황산망간 1mg/ℓ, L-시스테인 20mg/ℓ, 칼슘판토테네이트 10mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 바이오틴 30㎍/ℓ, 요소 0.2, pH 7.3
(주 3) 아데닌 최소첨가배지; (주 2) 배지에 아데닌을 10∼500mg/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주 4) 아데닌, 구아닌 최소첨가배지; 최소배지에 아데닌, 구아닌(또는 크산틴을 각각 10∼500mg/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주 5) 라이소자임 첨가배지; (주 1) 배지에서 라이소자임 1∼100㎍/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주 6) 3,4-디하이드로프롤린 첨가배지; (주 1) 배지에서 3,4-디하이드로프롤린 100∼5000㎍/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주 7) 크리스텐센우레아 검사배지; 펩톤 1.0g ,포도당 1.0g, 염화나트륨 5.0g, 인산제1칼륨 2.0g, 페놀레드 0.012g, 한천 20g, 요소 20g, 증류수 1ℓ
(주 8) 6-머캅토퓨린 첨가배지; (주 1) 배지에서 6-머캅토퓨린 300㎍/㎖를 첨가한 배지.
본 발명에서 분리하여 획득한 신규 변이주 MP377의 생화학적 특성은 하기 표 1, 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같다.
특성 ATCC 6872(친주) KFCC-10617 KFCC-10814 MP377(KFCC-11141)
아데닌 비요구성 요구성 요구성 요구성
구아닌(크산틴) 비요구성 누출형 누출형 누출형
비오틴 요구성 요구성 요구성 요구성
라이소자임(최저억제농도) 80㎍/㎖ 15㎍/㎖ 8㎍/㎖ 8㎍/㎖
3,4디하이드로프로린내성 1000㎍/㎖ 2000㎍/㎖ 3500㎍/㎖ 3500㎍/㎖
6-머캅토퓨린 내성 20㎍/㎖ 50㎍/㎖ 100㎍/㎖ 300㎍/㎖
시험 균주명 검사배지 색깔 우레아제
ATCC 6872(친주,우레아제 보유균주) 적 색 +
E.coli(우레아제가 결여된 표준균주) 황 색 -
KFCC-10814 황 색 -
MP377(KFCC-11141) 황 색 -
세포내 프폴린(L-proline) 농도
균 주 농 도
ATCC 6872(친주) -
KFCC-10617(종래 균주) 0.91
KFCC-10814 1.77
MP377(KFCC-11141) 1.83
상기한 바와 같이, 본 발명의 균주 MP377은 발효 배양액중에 직접 5'-이노신산을 축적시키고 5'-이노신산 생산능력을 갖는 아데닌 요구성, 구아닌 누출형 변이주로서, 세포벽 외부로의 특정 대사산물의 분비기능이 증가된, 라이소자임에 대한 높은 감수성을 갖고, 배양과정중 고농도의 탄소원이 배양액에 존재하거나 5'-이노신산이 많이 생성될 경우, 균체 외부의 고농도 용질에 의해 생성된 삼투압에 의한 정상적인 생리 활성 저해현상을 방지하기 위해, 균체 내부에 특정 용질인 프롤린(L-proline)의 농도가 증대되어 삼투압에 의한 영향을 배제할 수 있는, 3,4-디하이드로프롤린에 대해 높은 내성을 가지며, 6-머캅토퓨린 내성을 가짐과 동시에 포도당 자화를 통한 5'-이노신산 생성능이 증대된 특성을 갖는 변이주이다.
5'-이노신산은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 온도 25∼35℃, pH 6.0∼8.0으로 유지하면서 3∼4일간 5ℓ 발효조에서 호기적으로 배양하여 축적된 5'-이노신산을 상법에 따라 분리정제하여 수득한다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기위한 것일뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
사용 균주: MP377(KFCC-11141)
종배지: 포도당 5, 펩톤 0.5, 육즙 0.5, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.6
발효배지: 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6(포도당 5.6, 당밀 0.4)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 3㎖를 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 3㎖를 식균한후 5일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 30℃, pH 7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 17.6g/ℓ이었다.
실시예 2
사용 균주: MP377(KFCC-11141)
종배지: 포도당 5, 펩톤 0.5, 육즙 0.5, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.6
발효배지: 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6(과당 2.8, 포도당 2.8, 당밀 0.4)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 3㎖를 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃에서 10 분간 가압 살균하여 종배양액 3㎖를 식균한후 5일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 30℃, pH 7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 15.5g/ℓ이었다.
비교예 1
사용 균주: KFCC-10814
종배지: 포도당 5, 펩톤 0.5, 육즙 0.5, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.6
발효배지: 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6(포도당 5.6, 당밀 0.4)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 3㎖를 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃에서 10 분간 가압 살균하여 종배양액 3㎖를 식균한후 5일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 30℃, pH 7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 7.2g/lℓ이었다. 이때 포도당 분석기를 이용하여 잔류 포도당을 측정한 결과, 포도당이 1.6남은 상태로 포도당을 100분해하지 못하였음을 알 수 있었다.
비교예 2
사용 균주: KFCC-10814
종배지: 포도당 5, 펩톤 0.5, 육즙 0.5, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.6
발효배지: 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6(과당 2.8, 포도당 2.8, 당밀 0.4)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 3㎖를 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 3㎖를 식균한후 5일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 30℃, pH 7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 15.2g/ℓ이었다.
실시예 3
사용균주: MP377(KFCC-11141)
종배지: 실시예 1과 동일
발효배지: 인산 2, 수산화칼륨 2, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/㎖, 황산망간 10mg/㎖, 황산아연 10mg/㎖, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/㎖, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로서 18(포도당 16.8, 당밀 1.2)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 40㎖를 500㎖ 진탕배양용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1600㎖를 5ℓ 발효조에 사입하고 120℃에서 15분간 가압 살균하여 종배양액 200㎖를 식균한후 3∼4일간 배양하였다. 회전수 분당 900회, 온도 28∼34℃, pH 7.0으로 조절하였다. 또한, 발효시 당이 2가 되었을때 1차, 2차 및 3차 추가당을 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각8되도록 첨가하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 66.4g/ℓ이었다.
실시예 4
사용균주: MP377(KFCC-11141)
종배지: 실시예 1과 동일
발효배지: 인산 2, 수산화칼륨 2, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/㎖, 황산망간 10mg/㎖, 황산아연 10mg/㎖, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/㎖, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로 18(과당 8.4, 포도당 8.4, 당밀 1.2)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 40㎖를 500㎖ 진탕배양용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1600㎖를 5ℓ 발효조에 사입하고 120℃에서 15분간 가압 살균하여 종배양액 200㎖를 식균한후 3∼4일간 배양하였다. 회전수 분당 900회, 28∼34℃, pH 7.0으로 조절하였다. 또한, 발효시 당이 2가 되었을 때 1차, 2차 및 3차 추가당을 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8되도록 첨가하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 58.8g/ℓ이었다.
비교예 3
사용균주: KFCC-10814
종배지: 실시예 1과 동일
발효배지: 인산 2, 수산화칼륨 2, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철10mg/㎖, 황산망간 10mg/㎖, 황산아연 10mg/㎖, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/㎖, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로서 18(포도당 16.8, 당밀 1.2)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 40㎖를 500㎖ 진탕배양용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1600㎖를 5ℓ 발효조에 사입하고 120℃에서 15분간 가압 살균하여 종배양액 200㎖를 식균한후 3∼4일간 배양하였다. 회전수 분당 900회, 온도 28∼34℃, pH 7.0으로 조절하였다. 또한, 발효시 당이 2가 되었을때 1차, 2차 및 3차 추가당을 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8되도록 첨가하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 44.7g/ℓ이었다.
비교예 4
사용균주: KFCC-10814
종배지: 실시예 1과 동일
발효배지: 인산 2, 수산화칼륨 2, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 10mg/㎖, 황산망간 10mg/㎖, 황산아연 10mg/㎖, 옥수수침지여액 20, 바이오틴 30㎍/㎖, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로 18(과당 8.4, 포도당 8.4, 당밀 1.2)되게 첨가하여 사용하였다.
발효방법: 상기 종배지 40㎖를 500㎖ 진탕배양용 삼각플라스크에 분주하고상법에 따라 가압 살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1600㎖를 5ℓ 발효조에 사입하고 120℃에서 15분간 가압 살균하여 종배양액 200㎖를 식균한후 3∼4일간 배양하였다. 회전수 분당 900회, 온도 28∼34℃, pH 7.0으로 조절하였다. 또한, 발효시 당이 2가 되었을때 1차, 2차 및 3차 추가당을 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8되도록 첨가하였다. 배지내 5'-이노신산의 축적량은 58.4g/ℓ이었다.
이상 설명한 바와 같이, 탄소원으로서 포도당과 과당의 1:1 혼합당을 이용하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC-10814에 대해 6-머캅토퓨린 내성을 부여함으로써, 탄소원으로서 포도당만을 이용하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 변이주를 손쉽게 획득할 수 있었다. 통상적인 발효에서 탄소원으로서 원당 가수분해물의 포도당과 과당의 1:1 혼합당에 비하여 포도당의 가격이 저렴하므로, 상기한 방법에 의해 획득한 변이주를 사용하여 보다 경제적인 방법으로 5'-이노신산을 생산할 수 있는 기반을 확립하였다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 MP377은 탄소원으로서 포도당만을 사용하여 배양액내에 5'-이노신산을 고농도로 축적할 수 있으므로, 보다 경제적인 방법으로 5'-이노신산을 고농도·고수율로 제조할 수 있다.

Claims (4)

  1. 포도당을 자화하여 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) MP377(KFCC-11141).
  2. 제 1 항에 있어서, 300㎍/㎖ 이상의 6-머캅토퓨린에 대해 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 MP377.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 5'-이노신산을 제조하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 탄소원으로서 포도당을 사용하는 방법.
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