KR20010083070A - 오메가-하이드록시 알데하이드와 아민과의 쉬프 염기부가물의 개선된 제조 방법 및 이를 기재로 하는 물질의조성물 - Google Patents

오메가-하이드록시 알데하이드와 아민과의 쉬프 염기부가물의 개선된 제조 방법 및 이를 기재로 하는 물질의조성물 Download PDF

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실버스타인 아써 에이.
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Abstract

본 발명은 함유 성분들로 동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질 및 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 포함하는 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물의 개선된 제조 방법에 관한 것으로, 이미 존재하는 물 또는 축합 반응 도중 생성된 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)함으로써 상기 축합 반응을 실질적으로 완료시키기에 유효한 조건 하에서, 수성 환경 중의 상기 언급한 성분들을 함께 pH 7.0 이상에 두어 반응 혼합물을 형성시킴을 포함한다. 바람직한 방향족 ο-하이드록시 알데하이드에는ο-바닐린; 살리실알데하이드; 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드; 2,6-디하이드록시벤즈알데하이드; 2-하이드록시-3-에톡시벤즈알데하이드; 또는 피리독살이 있다. 매우 광범위한 범위의 단백질들이 사용될 수 있다. 상기 개선된 방법은 90% 이상의 수율, 및 알데하이드 및 단백질의 축합 부가물로의 실질적으로 정량적인 전환을 제공한다.

Description

오메가-하이드록시 알데하이드와 아민과의 쉬프 염기 부가물의 개선된 제조 방법 및 이를 기재로 하는 물질의 조성물{IMPROVED PROCESS FOR PREPARING SCHIFF BASE ADDUCTS OF AMINES WITH O-HYDROXY ALDEHYDES AND COMPOSITIONS OF MATTER BASED THEREON}
아민 화합물, 특히 단백질을 알데하이드 또는 케톤과 반응시킴으로써 그의 안정성 및 취급 특성들을 개선시킬 수 있음은 본 발명과 가장 관련있는 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 시토크롬 c를 용이한 가역적인 방법으로 살리실알데하이드와 반응시켜 상기 단백질의 성질에 대한 전하 개질 효과를 연구하여 왔다.
대부분의 기술 문헌들의 개시내용과 달리, 문헌[Williams and Jacobs, Biochim. Biophys. Acta. 154(1968) 323-331]에는 최종 쉬프 염기 부가 생성물의 단리 방법이 수록되어 있다. 살리실알데하이드와 시토크롬 c의 혼합물을 침전시키고 있으며, 사용된 장시간의 평형 시간으로부터 완전한 전환을 추측할 수 있다. 상기 내용에 수록된 부가물 형성을 하기의 부분 일반식으로 예시할 수 있다:
상기 식에서, 1 급 아민은 살리실알데하이드 분자의 카보닐 잔기와 반응하여 이민(R-(R-)C=N-R로 나타낼 수 있다)을 형성한 리신 분자상의 ε-아미노 그룹이다. 이러한 이민을 대개 쉬프 염기라 칭하며 그의 제조는 일반적으로 산 또는 염기 촉매 분해에 의해서, 또는 열에 의해서 수행된다. 쉬프 염기의 형성은 전형적으로 이민의 침전, 물의 제거, 또는 이들 모두에 의해서 완성이 촉구된다.
당해 분야에서 이러한 사용의 또 다른 예로서, 겸상 적혈구를 다양한 알데하이드 및 케톤으로 처리하여 세포내 헤모글로빈의 아미노 그룹들과 이민 결합을 형성시키는 것이 있다. 문헌[Zaugg et al., J. Biol. Chem. 252(23)(1977) 8542-8548]을 참조하시오. 방향족 알데하이드는 그의 지방족 대응물보다 더 반응성인 것으로 밝혀졌으며 케톤은 비반응성인 것으로 밝혀졌다. 상기와 같은 반응성에 대한 고리 치환의 효과는 전자 및 입체 효과와 관련하여 통상적으로 예상되는 것이었다. 특히, 2,4-디하이드록시벤즈알데하이드 및 ο-바닐린은 헤모글로빈 A 및 S의 산소 친화도를 현저하게 증가시켰다. 그러나, ο-하이드록시 알데하이드가 단백질과의 쉬프 염기 부가물의 제조에서 정량적인 수율을 얻는데 필수적일 것이라는 제안은 없었다.
기술 문헌에는 단백질 이외의 아민, 예를 들어 소 분자 약제들과의 쉬프 염기 부가물에 대한 예가 간혹 있다. 문헌[Fujiwara at al., Chem. Pharm. Bull. 30(1982) 3310; 및 Chem. Pharm. Bull. 31(4)(1983)1335-1344]에는 세파로스포린 항생물질인 세파렉신과 알데하이드와의 부가물 형성이 언급되어 있다. 그러나, ο-하이드록시 알데하이드의 사용에 대한 어떠한 제안도 없으며; 반면에, 생성물은그의 알칼리성 용액을 동결-건조시켜 수득한다. 상기 참고 문헌은 본 발명의 제조 방법 및 이에 의해 얻어진 정량적인 수율을 제시하고 있지 않다.
쉬프 염기를 지금까지는 단백질 분자량의 측정 및 단백질중의 1 급 아미노 부위(N-말단 + 리신 잔기) 수의 측정을 위한 분석 공정에 사용하여 왔다. 예를 들어 문헌[Le Blanc et al., Anal. Chem., 66(1994)3289-3296](용액중의 단백질-케톤 평형에 대한 전기분무 질량 분광측정법의 연구에 관한 것이다)을 참조하시오. 아세톤을 사용하지만 방향족 ο-하이드록시 알데하이드는 제안되어 있지 않다.
전기분무 질량 분광측정 분석은 큰 단백질들, 예를 들어 인슐린, 유비퀴틴 및 헤모글로빈을 검사하는데 사용되며, 또한 쉬프 염기 부가물이 형성된 정도를 정확하고 정밀하게 측정하는 수단을 제공하기 위해서 본 발명의 방법에 함께 사용된다. 알데하이드와 아민간의 쉬프 염기 형성 정도를 측정하기 위한 종래의 방법들은 아민이 큰 단백질일 때는 효과적이지 않은데, 그 이유는 이들 기법들이 전형적으로 용액 방법들이며, 단리된 쉬프 염기 부가물을 물에 용해시키면 가역적인 반응이 일어나 평형 혼합물이 생성되기 때문이다. 그러나, 상기 르 블랑은 아세톤을 사용하며 방향족 ο-하이드록시 알데하이드는 제안하고 있지 않다.
쉬프 염기-결합된 공액물을 표적 단백질과 하나 이상의 진단제 또는 치료제간의 링커로서 사용하여 왔다. 예를 들어 리드(Reed)의 미국 특허 제 5,633,351 호를 참조하시오. 표적 단백질은 한정된 단백질 집단, 예를 들어 수용체 또는 효소 기질에 결합하며, 치료제는 약물, 독소 또는 방사성 핵종인 반면, 진단제는 방사성 핵종이다. 수반된 쉬프 염기 결합은 하기 일반식을 갖는다:
상기 식에서, "L1" 및 "L2"는 링커의 한쪽 끝에 하이드라지드 또는 알데하이드/케톤 활성 그룹을 갖는 이종이작용성 링커이다. 그러나, 정량적인 수율의 최종 쉬프 염기 부가 생성물을 얻기 위해 pH ≥ 7.0에서 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 사용할 것을 제안하고 있지 않다.
비경구 투여를 위한 안정화된 소마토트로핀이 클라크(Clark) 등의 미국 특허 제 5,198,422 호에 언급되어 있으며, 여기에서 바람직한 방향족 알데하이드는 2-하이드록시-3-메톡시 벤즈알데하이드, 즉 ο-바닐린이라고 한다. 그러나, 클라크 등은 단지 생성물을 결정 형태로 단리시키는 경우 얻어지는 소마토트로핀 성장 호르몬의 치료학적 이점들만을 언급하고 있다. 동결건조법을 사용한 단리를 일반적으로 언급하고 있지만, 클라크 등에 의해 고려된 단리 방법은 "건조" 유형의 것, 즉 장 기간에 걸친 건조를 수반하는 것으로, 진공 오븐에서 밤새 건조시킴을 예시하고 있다. 결과적으로, 상기 참고문헌은 본 발명의 제조 방법과 동떨어진 방법을 교시하고 있다.
기술 문헌에서 분무-건조에 의해 제조된 쉬프 염기 부가물을 유일하게 한정하고 있는 참고문헌이 있다. 문헌[Tomlinson et al., Food Chemistry, 48(1993) 373-379](글루코스 및 글리신 수용액의 분무-건조가 언급되어 있음)을 참조하시오.이 방법은 식품 착색에 잠재적으로 유용한 갈색 분말을 제조한다. 관련된 실제 화학 공정은 단백질의 아미노 그룹을 당의 하이드록실 그룹과 반응시켜 갈색 안료를 제조하는 마일라드 반응 또는 "갈변" 반응이다.
상기 언급한 톰린슨 등은 또한 식품 화학에 사용하기 위한 착색된 화합물의 제조에 관한 것인 바인스(Baines) 등의 미국 특허 제 4,886,659 호의 초기 연구에 관한 것으로 이를 기본으로 한다. 바인스 등은 분무-건조의 매우 일시적인 반응 조건들, 예를 들어 모든 물이 증발하여 반응을 효과적으로 마치기 전 10 초 미만 또는 때때로 1 초 미만의 반응 시간 하에서 마일라드 출발 물질로부터 색이 생성될 수 있음을 제시한다.
소적의 크기, 건조 입자 크기 및 다른 소적의 특징들을 조절하기 위한 조절 장치가 설치된 고정 분무 노즐 또는 회전 원반의 사용이 또한 언급되어 있다. 반응 온도는 유출구 공기 온도와 비슷한 것으로 여겨진다. 수용액을 분무 건조기에 공급하기 전에, 예를 들어 60 ℃ 이하로 예열하는 것이 또한 언급되어 있으며, 생성물 수분 함량은 3.5 내지 15 중량%라고 한다. 원반이 35,000 내지 40,000 rpm의 속도로 회전하는 회전 원반 분무 건조기가 또한 언급되어 있다.
그러나, 톰린슨 등과 바인스 등은 모든 점에서 전적으로 상이한 공정인 마일라드 반응에 관한 것이기 때문에 본 발명의 제조 방법을 제시한 것이 아니다. 마일라드 반응은 전형적으로 비가역적인 것이며 올리고머들을 형성시킨다. 이러한 특징들은 짙은 안료의 제조 공정에 대한 마일라드 반응의 유용성을 제한한다.
문헌[Dhont, Proc. Int. Symp. Aroma Research, Zeist, (1975) 193-194]은대두 단백질로부터 수득한 것들과 같은 합성 식품의 방향화에 대한 연구를 언급하고 있다. 첨가된 바닐린의 약 90%가 단백질에 의해 결합된, 알부민과 바닐린 용액의 동결 건조를 언급하고 있지만, 상기 단백질은 바닐린의 일부를 캡슐화 또는 흡착에 의해 보유하고 있음이 주목된다. 쉬프 염기의 형성이 제안되어 있지만; 바닐린은 ο-하이드록시 알데하이드가 아니며 반응물들의 쉬프 염기로의 완전한 전환이 얻어지지 않는다. 따라서, 돈트에 의해 사용된 방법은 본 발명의 방법과 동일하지 않으며 이를 제시하고 있지도 않다.
발명의 요약
본 발명은 함유 성분들로 동물에 이로운 활성을 갖는 단백질 및 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 포함하는 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물들을 제조하기 위한 신규의 개선된 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법은 실질적으로 정량적인 축합 부가물의 형성 및 최종 생성물의 개선된 총 수율을 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 용이하고, 재현가능하며, 전환가능하고, 효율적이며 경제적인 최종 축합 부가 생성물의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 수성 환경 중의 상기 언급한 성분들을 함께 pH 7.0 이상에 두어 반응 혼합물을 형성시킴을 포함한다. 반응 혼합물에 대한 용매, 즉 반응이 일어나는 매질은 반응 도중 형성된 축합에 의한 물을 포함한 물이며, 이때 상기 반응은 상기 축합 반응을 상기 반응중에 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거함으로써 실질적으로 완료시키기에 유효한 조건 하에서 일어나며, 이는 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서 상기 최종 축합 부가 생성물이 상기 반응물들의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상의 수율로 생성되는 것과 일치한다.
상기 개시된 축합 반응을 또한 감소된 수분 조건 하에서 수행하여 물의 제거 속도를 가속화시키고 전체 제거량을 증가시킬 수도 있다. 이는 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.9 중량%를 제거함으로써 축합 반응의 완료를 촉구하는 목적과 일치되게, 상기 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 상응하게 상기 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 0.001 중량%, 바람직하게는 2.0 내지 3.0 중량%일 것이라는 사실을 제공한다. 상기 축합 반응을 완료시킨 후에, 존재하는 수분의 양을 최종 생성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 0.001 중량%, 또는 0.05 내지 0.005 중량%로 낮게, 또는 0.03 내지 0.01 중량% 정도로 훨씬 낮게 강하시킬 수도 있다. 또한, 단백질 안정화가 요구되는 경우 실질적으로 보다 많은 양의 수분이 또한 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 5.0 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 8.0 내지 12.0 중량%의 범위로 존재할 수도 있다.
상기 개시된 축합 공정에 유용한 방향족 ο-하이드록시 알데하이드는 바람직하게는 하나 이상의 하기 화학식 1의 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR7; -OC(=O)R7; -S(=O)2; -S(=O)2N(R7)(R9); -S(=O)2R7; -S(=O)2OR7; -C(=O)NR7R9; -C(=O)R9; 및 -N(R7)(R9)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C4)알킬이며; 여기에서 상기 R1및 R4를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있고;
X 및 Y는 독립적으로 N, 또는 각각 CHR2또는 CHR3이고, 이때 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR11; -OC(=O)R11; -S(=O)2; -S(=O)2N(R11)(R13); 및 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R13은 (C1-C4)알킬이다)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 여기에서 상기 R2및 R3를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있다.
바람직하게는, R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 트리플루오로메틸; (C1-C4)알킬; (C1-C4)알콕시; -C(=O)OR7; 또는 -N(R7)(R9)이고, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C2)이며; 보다 바람직하게는 R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; 카복실 또는 메틸아미노이고, 이 경우 R7은 수소이고 R9는 메틸이다. 바람직하게는 R1및 R4가 알킬로 정의되고 치환된 경우, 하이드록시; (C1-C2)알콕시; 카복실; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도 중에서 선택된 단일 치환체가 존재하며; 보다 바람직하게는 상기 단일 치환체는 하이드록시, 메톡시 및 디메틸아미노 중에서 선택된다.
바람직하게는, X 및 Y 중 하나는 N이고 다른 하나는 각각 CHR2또는 CHR3이며; 보다 바람직하게는 X는 CHR2이고 Y는 CHR3이며, 이때 R2및 R3는 바람직하게는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 트리플루오로메틸; (C1-C4)알킬; (C1-C4)알콕시; -C(=O)OR11; -S(=O)2N(R11)(R13); 또는 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 바람직하게는 수소 또는 (C1-C2)알킬이고, R13은 (C1-C2)알킬이다)이고; 보다 더 바람직하게는 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; 카복실 또는 메틸아미노이고, 이 경우 R11은 수소이고 R13은 메틸이다.
바람직하게는, R2및 R3가 알킬로 정의되고 치환된 경우, 하이드록시; (C1-C2)알콕시; 카복실; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도 중에서 선택된 단일 치환체가 존재한다.
가장 바람직하게는, 상기 ο-하이드록시 알데하이드는 ο-바닐린; 살리실알데하이드; 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드; 2,6-디하이드록시벤즈알데하이드; 2-하이드록시-3-에톡시벤즈알데하이드; 또는 피리독살을 포함하고; 이들을 하기의 일반식들로 나타낼 수 있다:
또한, 최종의 쉬프 염기 축합 부가 생성물의 단백질 성분은 식품의 생산에 사용되는 동물들의 성장 촉진제로서의 유용성뿐만 아니라 다수의 질병 및 불리한 증상들의 예방 및 치료를 위한 수의학적 생성물로서의 치료학적 유용성을 포함한, 동물에서 이로운 활성을 갖는 펩티드를 포함한다. 상기 단백질 성분은 또한 인간의 질병 및 불리한 증상들의 예방 및 치료에서 치료제로서의 유용성도 갖는다.
단백질 성분은 일반식에서 1 급 아민이며 적게는 2 개에서 수 백개의 아미노산을, 많게는 수천개 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 본 발명에서 제공된 상기 단백질 성분 및 이들이 형성하는 최종 축합 부가 생성물은 동물 및 인간의 치료에서 승인된 가치를 갖는다.
하기의 특정한 단백질들이 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다:
μ, κ 및 δ 오피오이드 수용체 서브유형의 선택적 및 비선택적인 작용물질 및 길항물질인 엔케팔린, 엔돌핀 및 다이놀핀을 포함하는 단백질성 내생 및 합성 오피오이드 진통제 및 길항물질, 예를 들어 [Leu5] 및 [Met5]엔케팔린; 다이놀핀 A및 B; α- 및 β-네오엔돌핀; [D-Ala2, MePhe4, Gly(올)5]엔케팔린(DAMGO); [D-Pen2, D-Pen5]엔케팔린(DPDPE); [D-Ser2, Leu5]엔케팔린-Thr6(DSLET); [D-Ala2,D-Leu5]엔케팔린(DADL); D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP); [D-Ala2, N-MePhe4, Met(O)5-올]엔케팔린(FK-33824); Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val- Val-Gly-NH2([D-Ala2]델톨핀 I; Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2, Glu4]델톨핀 II; Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(몰피세핀); Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL -017); 및 [D-Ala2, Leu5, Cys6]엔케팔린;
조직 손상, 바이러스 감염 및 알러지 반응들 중에서 선택된 염증성 사건들에 응하여 단백질 분해 반응에 의해 생성된 브래디키닌 및 칼리딘을 포함한 오타코이드(여기에서 상기 단백질들은 국소적으로 작용하여 통증, 혈관 확장, 증가된 혈관 침투성 및 프로스타글란딘의 합성을 생성시키며, 작용 활성 및 길항 활성을 갖고, 남성 불임의 치료, 혈액-뇌 장벽을 넘어선 암 화학요법제의 전달, 및 통증, 천식 및 다른 만성적인 염증 질환들의 치료에 유용하다), 예를 들어 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- Pro-Phe-Arg(브래디키닌); Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(데스-Arg9-브래디키닌); Lys-Arg-Pro-Pro- Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(데스-Arg10-칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(데스-Arg9-[Leu]8-브래디키닌); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D- Phe7]-브래디키닌); 및 [D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)(여기에서 Hyp는 트랜스-4-하이드록시-Pro이고; Thi는 β-(2-티에닐)-Ala이고; Tic는 [D]-1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-3-일-카보닐이고; Oic는 (3as,7as)-옥타하이드로인돌-2-일-카보닐이다);
각각 기능촉진 반응 및 항 이뇨 반응을 매개하는 바소프레신 수용체 서브 유형 V1및 V2에서 활성인 단백질, 예를 들어 울혈성 심장 마비, 고혈압, 수술 후 장폐색 및 복부 팽만의 치료에 이로운 V1길항물질, 다뇨증 및 다음증의 억제에 의한 중추 요붕증의 치료, 및 폰빌레브란드 질병을 포함한 출혈성 질환의 치료에 사용되는 V2작용물질, 예를 들어 구체적으로 천연 바소프레신-형 펩티드: 하기 일반식의 아르기닌 바소프레신(AVP):
및 리프레신([Lys8]-AVP; 합성 바소프레신 펩티드: V1a-선택성 작용물질 [Phe2, Ile2, Orn8]AVP; V1b-선택성 작용물질 데아미노 [D-3-(3'-피리딜)-Ala2]AVP; V2-선택성 작용물질 데즈모프레신(dDAVP); 및 데아미노[Val4, D-Arg8]AVP; 및 펩티드 길항물질, 예를 들어 하기 일반식의 V1a-선택성 길항물질 d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP:
및 V1b-선택성 길항물질 dp[Tyr(Me)2]AVP; 및 V2-선택성 길항물질 데스 Gly-NH2 9-d(CH2)5[D-Ile2, Ile4]AVP, 및 d(CH2)5[D-Ile2, Ile4, Ala-NH2 9]AVP;
위장 분비 지표로서 사용되는, 일반식: N-t-부틸옥시카보닐-β-Ala-Trp- Met-Asp-Phe-NH2의 펜타가스트린;
위장관 종양, 다른 치료에 대한 설사 불응, 운동 장애 및 위장 출혈 증상들의 치료에 유용한, 일반식: L-시스테인아미드-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys- L-Thr-N-[2-하이드록시-1-(하이드록시-메틸)프로필]-환상(2→7)-디설파이드, [R-(R*,R*)]의 옥트레오티드;
면역억제제로서 유용한 항체 시약, 예를 들어 항흉선세포 글로불린; 뮤로모냅-CD3 단클론 항체; 및 Rho(D) 면역 글로불린; 및 면역결핍 상태의 치료에 유용한 단백질 면역자극제, 예를 들어 면역 글로불린;
백혈구에 의해 생산되고 다양한 면역조절 효과를 갖는 시토킨, 예를 들어 인터페론, 콜로니-자극 인자 및 인터류킨, 및 구체적으로 α-인터페론;인터페론-γ(IFN-γ); 과립성 백혈구 콜로니-자극 인자(G-CSF); 과립성 백혈구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF); 및 인터류킨-1(IL-1) 내지 인터류킨-12(IL-12);
성숙한 혈액 세포를 연속적으로 대체하는 과정의 조절과 관련되고, 1 차 혈액작용 질병의 치료에 유용하며, 심각한 감염의 치료, 및 화학요법 또는 골수 이식 하에 있는 환자들의 관리에 보조약으로서 사용되는 조혈 성장 인자, 예를 들어 구체적으로 에리쓰로포에틴(EPO); 간 세포 인자(SCF); 인터류킨(IL-1-12); 단핵세포/대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF, CSF-1); P1XY321(GM-CSF/IL-3 융합 단백질); 및 트롬보포에틴을 포함한 성장 인자;
혈관 손상 부위의 병적인 혈전 및 피브린 침착물 모두의 용해에 유용한 혈전용해성 단백질, 예를 들어 스트렙토키나제; 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA); 및 유로키나제;
뇌하수체 전엽 호르몬 및 그의 사용을 조절하는 시상하부 인자, 예를 들어 (a) 성장 호르몬(GH), 프로락틴(Prl) 및 태반 락토젠(PL)을 포함한 성장성 호르몬; (b) 황체화 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH) 및 타이로이드-자극 호르몬(TSH)을 포함한 당단백질 호르몬; 및 (c) POMC-유도된 호르몬, 예를 들어 코르티코트로핀(ACTH), α-멜라닌세포-자극 호르몬(α-MSH), β-멜라닌세포-자극 호르몬(β-MSH), β-리포트로핀(β-LPH) 및 γ-리포트로핀(γ-LPH); 상기 호르몬들의 방출을 조절하는 시상하부 인자, 예를 들어 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 인슐린-형 성장 인자(IGF-1 및 IGF-2), 소마토스타틴 및 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH);
성장-호르몬 결핍 아동의 대체 요법으로서 유용한 성장 호르몬, 예를 들어 소마토스타틴, 상기 소마토스타틴의 합성 동족체인 옥트레오티드; 생식선 자극 호르몬, 예를 들어 LH, FSH, 및 재생성 질환의 진단 및 불임 치료에 유용한 코리온 고나도트로핀(GC), 예를 들어 유로폴리트로핀, 배란 유도에 유용한, 거의 대부분의 LH가 제거된 인간 폐경기 고나도트로핀(hMG), 및 고나도트로핀 분비의 자극에 유용한 합성 인간 GnRH인 고나도렐린; 생식선 스테로이드의 감소에 반응하는 내분비 질환의 치료에 유용한 합성 GnRH 작용물질, 예를 들어 류프롤리드, 히스트렐린, 나파렐린 및 고세렐린;
갑상선 기능 저하증 환자의 호르몬 대체 요법 및 무독성 갑상선종 환자 또는 갑상선 암 치료 후의 환자의 티로트로핀(TSH) 억제에 유용한, 티로트로핀-방출 호르몬(TRH)에 의해 분비가 조절되는 티로트로핀(TSH);
인슐린-의존성 당뇨병 환자 및 비-인슐린-의존성 당뇨병 환자의 치료를 위한 인슐린; 글루코스 및 케톤 체내 대사의 조절에서 생리적 역할을 하고 위장관의 억제를 위해 방사선 기사에 의해 사용되는, 심각한 저혈당증의 치료에 유용한 글루카곤; 내분비성 종양에서 호르몬 방출을 차단하는데 유용한 소마토스타틴, 예를 들어 인슐리노마스, 글루카고노마스, VIP오마스, 칼시노이드 종양 및 소마토트로피노마스, 및 합성 동족체인 옥트레오티드;
골 재흡수를 억제하기 위해 조골세포에 특이적으로 작용하며, 고칼슘혈증 및 증가된 골격 리모델링 질환, 예를 들어 파제씨 병의 관리에 유용한 호르몬인 칼시토닌; 척수 골다공증 환자의 치료에 유용한 파라티로이드 호르몬;
항신생물제 및 면역자극제로서 유용한 알데스류킨, 125-L세린-2-133-인터류킨 2; 글루코세레브로시다제 효소의 보급자로서 유용한, 인간 태반 조직 β-글루코세레브로시다제의 변형된 형태로 497 개의 아미노산을 갖는 단량체성 당단백질인 알글루세라제; 합성 코르티코트로핀 동족체인 알새크티드: 1-β-Ala-17[L-2,6-디아미노-N-(4-아미노부틸)헥산아미드]-α1-17-코르티코트로핀; 플라스미노겐 활성화제로서 유용한, 서열이 혈관벽의 내피 세포에 의해 생산된 천연 프로테아제와 동일한 527 개 아미노산의 세린 프로테아제인 알테플라제; 항바이러스제로서 유용한, 2 개의 링커 잔기를 통해 CD4의 세포외 영역의 처음 178 개 아미노산이 슈도모나스 엑토톡신 A의 아미노산 1 내지 3 및 253 내지 613에 결합되도록 조작된 합성 키메릭 단백질인 알비르셉트 수도톡스; 당뇨병 치료제로서 유용한, 37 개 아미노산의 단백질인 암린티드; 아모가스트린: N-카복시-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-페닐-L-알라닌아미드; 비스테로이드성 염증 치료제로서 및 염증성 장 질환의 치료를 위한 억제제로서 유용한 아나킨라: N2-L-Met-인터류킨 1 수용체 길항물질; 고혈압 치료제로서 및 이뇨제로서 유용한 아나라티드 아세테이트, 아트리오펩틴-21(래트), N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-, 아세테이트; 혈관수축제로서 유용한 안지오텐신 아미드, 안지오텐신 II, 1-L-Asn-5-L-Val-; 효소 억제제(프로테이나제)로서 유용한, 58 개 아미노산을 갖는 췌장 트립신 억제제인 아프로티닌; 고혈압 치료제로서 유용한 아르팔라신, 1-숙신암산-5-L-Val-8-(L-2-페닐글리신)안지오텐신 II; 이뇨증 치료제로서 유용한 알지프레신 탄네이트, 바소프레신, 8-L-Arg-, 탄네이트;스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에 의해 생산된 항생제로서 유용한 아스파르토신, 옥시토신, 4-L-Asn-; 옥시토신 길항물질로서 유용한 아토시반, 옥시토신, 1-(3-머캅토프로판산)-2-(O-에틸-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-; 스트렙토마이세스 칸디두스(Streptomyces candidus)로부터 수득된 글리코펩티드 항생물질인 아보파르신; 항진균제로서 유용한 바시펀진, N-[(2R,3R)-2-하이드록시-3-MeVal]-N-L-MeVal-L- Phe-N-L-MePhe-L-Pro- L-알로-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-하이드록시-N-L-MeVal α1-락톤; 간엽-유래된 세포의 증식을 증진시킴으로써 만성적인 피부 궤양의 치료에 유용한, 내생성 인간 PDGF-BB 단독이량체의 아미노산 조성과 생물 활성이 유사한, 유전자 조작된 사카로마이세스 세레비지아에에 의해 생산된 재조합 단백질인 베카플러민, 재조합 인간 혈소판-유래된 성장 인자 B; 20 개의 아미노산을 갖는 항응고성 혈전방지제인 비발리루딘; 카베토신, 1-부티르산-2-[3-(p-메톡시페닐)-L-Ala]옥시토신; 카르구토신, 1-부티르산-6-(L-2-아미노부티르산)-7-글리신옥시토신; 위액 분비 자극제로서 유용한 세룰레티드, 5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-설포-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp -L-Met-L-α-Asp-L-Phe-아미드; 112 개의 아미노산을 갖는 인간 성장 인자 β2를 전달하는 세터민; 조혈제(대식세포 콜로니-자극 인자)로서 유용한, 1-233-콜로지-자극 인자 1(인간 클론 p3ACSF-69 단백질 잔기), 환상(7→90), (48→139), (102→146)-트리스(디설파이드)·이량체인 실모스팀; 항균제로서 유용한 콜리스틴 A 성분인 콜리스티메테이트 나트륨; 부신피질 부족 및 쿠싱 증후군에 대한 진단 보조제로서 및 코르티코트로핀-방출 호르몬으로서 유용한, 코르티코트로핀-방출 인자(양) 트리플루오로아세테이트 염인 코르티코렐린, 양 트리플루테이트; 부신피질자극 호르몬으로서 유용한 코신트로핀, 테트라코색티드 아세테이트, α1-24-코르티코트로핀; 면역억제제로서 유용한, 11 개의 아미노산 및 6번 위치에 3-하이드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노일 잔기를 함유하는 환상 단백질인 사이클로스포린; 면역억제제로서 유용한, 디설파이드 가교를 통해 연결된 4 개의 서브유니트를 포함하고 대략 150 kD의 분자량을 갖는 인간화된 항-TAC 단클론 항체인 다클리시맵(Ro-24-7375); 다클리주맵; 단백질성 항균제인 다프토마이신; 항응고제로서 유용한, 63 개의 아미노산을 갖는 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터의 63-데설포히루딘인 데시루딘; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 데슬로렐린; 항이뇨제로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 데즈모프레신 아세테이트, 바소프레신, 1-(3-머캅토프로판산)-8-D-Arg-, 모노아세테이트 염, 트리하이드레이트; LHRH 길항물질로서 유용한 10 개의 아미노산을 포함하는 데티렐릭스 아세테이트; 27-L-Leu-44a-Gly 성장 호르몬 방출 인자(인간)인 듀모렐린; 엘카토닌, 1-부티르산-7-(L-2-아미노부티르산)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala 칼시토닌(연어); 2 개의 Cys 가교를 갖는 72 개의 아미노산을 포함하는 인터류킨 8(인간)인 에목타킨; 빈혈 치료제 및 보혈제로서 유용한, 적혈구 세포의 생산을 조절하고 중국 햄스터 난소 세포를 인간 에리쓰로포에틴 유전자내에 삽입시켜 제조된 165 개 아미노산 당단백질인 에포에틴 알파; 상처 치유제로서 유용한, 인간 태반으로부터 단리되고 이 콜라이에서 클로닝되고 발현된 비-글리코실화된 단백질인 157 개의 아미노산을 포함하는 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)인 에르소페르민; 혈관수축제로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 바소프레신 2-L-Phe-8-L-Lys인 펠리프레신; 호중구감소 억제제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 비-글리코실화되고 이 콜라이에 의해 발현된 175 개 아미노산 폴리펩티드 단일 쇄인 필그라스팀; 당뇨병 치료제로서 유용한, 29 개 아미노산의 단일 쇄 단백질인 글루카곤; 생식선-자극 원소로서 유용한, 10 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자 아세테이트의 디아세테이트 염인 고나도렐린 아세테이트; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 고세렐린; LHRH 작용물질로서 유용한 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 히스트렐린; 글루코세레브로시다제의 효소 보충물로서 유용한, 495-L-히스티딘글루코실세라미다제 태반 이소엔자임 단백질인 이미글루세라제; 당뇨병 치료제로서 유용한, 인슐린의 B 쇄로부터 C-말단 알라닌을 제거하여 제조된 인슐린 유도체인 달란화된 인슐린; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 유용한, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 αA(환원된 인간 백혈구 단백질 잔기)인 인터페론 알파-2a; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 유용한, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 α2b(환원된 인간 백혈구 클론 Hif-SN206 단백질 잔기)인 인터페론 알파-2b; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 유용한, 인간 인터페론 베타에 대해 조작된 유전자를 함유하는 배양된 중국 햄스터 난소 세포로부터 생산된 166 개 아미노산을 포함하는 글리코실화된 폴리펩티드인 인터페론 베타-1a; 면역조절제로서 또한 유용한, 이 콜라이로부터 생산된 165 개 아미노산 잔기로 이루어진 비-글리코실화된 폴리펩티드인 인터페론 베타-1b; 항신생물제로서 및 면역조절제로서 유용한 인터페론 감마-1b, 1-139 인터페론 γ(환원된 인간 림프구 단백질 잔기), N2-L-Met; 2 개의 Cys 가교를 갖는 71 개 아미노산 잔기를 포함하는 N-메티오닐 혈소판 인자(인간 서브유니트)인 이로플랙트; 플라스미노겐 활성화제 및 혈전 용해제로서 유용한, 펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 숙수 세포에서 발현시켜 생성된 Asn 117 내지 Gln 117의 변이, 및 피브로넥틴-유사 및 EGF-유사 영역의 결실에 의해 인간 t-PA로부터 유도된 조직 플라스미노겐 활성화제 단백질인 라노테플라제; 항신생물제로서 유용한, 8 개의 아미노산 및 1 개의 디설파이드 가교를 포함하는 란레오티드 아세테이트; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 인간 구강의 비늘모양 세포 주-mRNA로부터 유도된 인간 과립세포 콜로니-자극 인자-cDNA의 발현에 의해 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 174 개 아미노산 잔기로 이루어진 당단백질인 레노그라스팀; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 루트렐린 아세테이트; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 127 개 아미노산을 포함하는 콜로니-자극 인자 2(환원된 인간 클론 pHG25단백질 잔기)인 몰그라모스팀; 표피 성장 인자(마우스 침샘)인 뮤로더민; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 나파렐린 아세타템; 69 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는 26-L-알라닌림포킨 MiP 1α(인간 클론 pAT 464) 염증성 대식세포인 나그레스티펜; 펩신 효소 억제제로서 유용한, 펩스타틴, N-(3-메틸-1-옥소부틸)-L-Val-L-Val-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵타노일-L-Ala-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산; 당뇨병 치료제로서 유용한, 37 개 아미노산을 포함하고 1 개의 디설파이드 가교를 갖는 단백질인 프라밀린티드; 당뇨병 치료제로서 유용한, 86 개 아미노산 잔기를 포함하고 3 개의 디설파이드 가교를 갖는 프로인슐린(돼지)인 인간 프로인슐린; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 사카로마이세스 세레비지아에로부터 발현된 127 개 아미노산 잔기를 갖는 단일 쇄의 글리코실화된 폴리펩티드인 살그라모스팀, 콜로니-자극 인자 2(인간 클론 pHG25 단백질 잔기), 23-L-Leu; 재조합을 포함하여 천연 및 합성적으로 유도된 인간 및 동물 소마토트로핀(성장 호르몬), 특히 소 및 돼지 소마토트로핀; 갈락토스형성제로서, 특히 수의학적 용도에 유용한, 191 개 아미노산을 포함하는 소마그레보브, 소마토트로핀(환원된 소), 1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-글루타민]-; 호르몬(성장, 돼지)으로서 유용한, 총 191 개 아미노산을 포함하는 N-L-알라닐-성장 호르몬인 소말라포르, 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1); 성장 호르몬으로서 유용한, 191 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는 N-L-Met 소마토트로핀(인간)인 소마트렘; 성장 호르몬으로서 유용한, 인간 뇌하수체의 전엽으로부터 수득된 주요 성장 자극 호르몬의 정상적인 구조를 갖는 191 개 아미노산을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄인 소마토트로핀; 재조합체 형태로 수득할 수 있는 소마토트로핀; 갈락토스형성제로서 유용한, 소 뇌하수체 소마토트로핀의 4 개의 천연 분자 변형체들 중 하나인 소마토트로핀(소)인 소마부보브, 127-L-Leu;돼지 성장 호르몬으로서 유용한, 190 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1)인 소메노포르, N-L-Ala-32-de-L-Glu-33- de-L-Arg-34-de-L-Ala-35-de-L-Tyr-36-de-L-Ile- 37-de-L-Pro-38-de-L-Glu-; 수의학적 성장 자극제로서 유용한, 191 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(소)인 소메트리보브, 1-L-Met-127-L-Leu-; 소메트리포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C979H1527N265O287S8; 솜파세포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C938H1465N257O278S6; 소미도보브, 소마토트로핀(소 재조합체) C1020H1596N274O302S9; 안지오텐신-전환 효소 억제제로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 브래디키닌 강화제 B인 테프로티드, 2-L-Trp-3-de-L-Leu-4-de- L-Pro-8-L-글루타민-; 골 재흡수 억제제 및 골다공증 치료 보조약으로서 유용한, 34 개 아미노산을 포함하는 단백질인 테리파라티드; 항신생물제로서, 간염 및 감염성 질병의 치료에, 및 백신 강화제로서 유용한, 28 개 아미노산을 포함하는 티모신 α1(소)인 티말파신; 면역조절제로서 유용한 펜타펩티드인 티모펜틴; 항신생물제로서 유용한, 10 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 트리프토렐린, 6-D-Trp; 항신생물제로서 유용한, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 8 개의 아미노산을 포함하는 바프레오티드; 항이뇨 호르몬으로서 유용한, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 9 개의 아미노산을 포함하는 8-L-Arg- 또는 8-L-Lys-형태의 바소프레신; 미오글로빈; 헤모글로빈; β-락토글로불린; 면역글로불린-G(lgG); 항혈우인자(인자 VIII); 리소자임; 유비퀴틴; 혈소판 활성 인자(PAF); 종양 괴사 인자-α(TNF-α); 종양 괴사 인자-β(TNF-β); 대식세포 염증성단백질(MIP); 헤파린; 호산구 양이온 단백질(ECP); 재조합 인자 IX; 비-호즈킨 B-세포 병에 대한 단클론 항체; C형 간염의 치료에 유용한 인터페론 알파; 및 상처 및 화상의 치료를 위한 섬유아세포-유래된 인공 피부.
본 발명 방법의 축합 반응을 실질적으로 완료시키는데 유효한 조건들로는 존재하는 물을 액상에서 기상 또는 고상으로 변화시켜 상기 축합 반응의 환경으로부터 상기 물을 제거하는 것이 포함된다. 본 발명의 방법에서 성공적이기 위해서 상기 조건들을 또한 규모 조절성(scalability), 즉 대규모의 생산에 용이하고 효율적으로 적합하게 만드는 능력, 및 재현성, 즉 최종 결과에서 실질적으로 벗어나지 않으면서 성공적으로 수행되는 능력에 의해 특성화시켜야 한다. 따라서, 상기 조건들은 축합 반응이 일어나는 수성 환경의 물(상기 축합 반응 자체에 의해 생성된 물 포함)을 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물로부터 가장 효율적으로 분리시키는데 필요한 공정으로의 에너지 투입을 최적화하는 것들이다.
0 ℃ 이상의 온도에서 상기 공정으로의 에너지 투입을 최적화시키는 조건은 (a) 단백질인 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 최고 온도로 가열하는 것; (b) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 최소의 소적으로 세분화시키는 것; 및 (c) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기와 같이 형성된 상기 소적들에, 통과하는 것에 대해 불활성인 기체를 기준으로 최고의 상대 속도를 제공하는 것을 포함한다.
또한, 반응 혼합물을 경우에 따라 승압 하에서 액체 상중의 수성 환경을 유지시키면서, 25 내지 125 ℃, 바람직하게는 40 내지 120 ℃, 보다 바람직하게는 50 내지 115 ℃, 보다 더 바람직하게는 60 내지 110 ℃, 가장 바람직하게는 75 내지 105 ℃의 온도로 가열한다. 그러나 대개는 반응물들 중 하나가 단백질임에 비추어 볼 때 보다 낮은 압력, 즉 감압을 사용하는 것이 유리할 것이다. 감압은 반응 혼합물을 액체에서 기상으로 변화시키기 위해서, 시스템에 보다 낮은 온도를 유지시키면서 필수적으로 동일한 양의 에너지를 상기 시스템에 투입되게 한다. 따라서, 반응 혼합물이 접하게 되는 임의의 높은 온도들에 대해서 주의를 기울여야 함은 물론이다. 대부분의 경우에 상기 언급한 온도 중 최고의 온도를 단지 매우 단 시간 동안, 대개 수초 동안만 지속시킬 수 있다. 반응 혼합물에, 임의로 감압의 사용에 의해 지원되는, 보다 낮은 온도를 유지시키는 것은 반응물 또는 최종 생성물이 가공 상 문제가 될 정도로 충분히 낮은 융점을 갖는 경우 유리하거나 또는 심지어는 필요할 수도 있는 것으로 나타났다.
더욱 또한, 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 1.0 ㎛ 내지 5.0 ㎜, 바람직하게는 10 ㎛ 내지 1.0 ㎜, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 내지 900 ㎛, 보다 더 바람직하게는 200 ㎛ 내지 800 ㎛, 가장 바람직하게는 300 ㎛ 내지 700 ㎛의 평균 직경을 갖는 소적으로 분할시킨다.
상기 소적에 가해지는 상대 속도는 0.1 내지 5.0 ㎧, 바람직하게는 0.2 내지 4.0 ㎧, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3.0 ㎧, 보다 더 바람직하게는 0.4 내지 2.0 ㎧, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ㎧이다.
0 ℃ 이하의 온도에서, 상기 공정에 대한 에너지 투입을 최적화하는 상기 조건들은 (a) 상기 수성 환경 하의 상기 반응 혼합물을 상기 수성 환경 중에 존재하는 비 결합된 액체 수의 거의 모두를 동결시키기에 충분히 낮은 온도로 냉각시키는 것(이때 상기 온도는 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되는 것이다); (b) 상기 동결된 수성 환경 중의 상기와 같이 냉각된 반응 혼합물에 상기에 대해 불활성인 기체의 존재 하에서 감압을 가하는 것(이는 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관된다)을 포함한다.
또한, 반응 혼합물을 상기 수성 환경을 고체 상으로 유지시키면서 -110 내지 0 ℃, 바람직하게는 -45 내지 -5 ℃, 보다 바람직하게는 -40 내지 -10 ℃, 보다 더 바람직하게는 -35 내지 -15 ℃, 가장 바람직하게는 -30 내지 -20 ℃의 온도로 냉각시킨다.
상기 수성 환경 하의 상기 냉각된 반응 혼합물에 가해지는 감압은 5.0 내지 0.0001 mmHg(절대), 바람직하게는 1.0 내지 0.0005 mmHg(절대), 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.001 mmHg(절대), 보다 더 바람직하게는 0.2 내지 0.005 mmHg(절대), 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.01 mmHg(절대)이다.
본 발명의 축합 반응 공정을 또한 감소된 수분 조건 하에서 수행할 수도 있으며, 상기에 의해 물의 제거 속도가 가속화되며 전체 제거량이 증가한다. 이는 상기 최종 축합 부가 생성물의 전환율을 보장하기 위해서, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상이 되도록, 상기 축합 반응 동안 생성되거나 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거함으로써 상기 축합 반응을 완료시키는 목적과 일치한다. 상기 목적과 일관되게, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 상응하게 상기 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 0.001 중량%, 바람직하게는 2.0 내지 3.0 중량%일 것이다. 축합 반응을 완료시킨 후에, 존재하는 수분의 양을 최종 생성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 0.001 중량%, 또는 0.05 내지 0.005 중량%로 낮게, 심지어는 0.03 내지 0.01 중량% 정도로 낮게 낮출 수도 있다. 경우에 따라 단백질 안정성을 위해 실질적으로 보다 많은 양, 즉 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 5.0 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 8.0 내지 12.0 중량% 범위의 수분이 존재할 수도 있다.
축합 공정을 포함한 상기 개시된 제조 방법들을 감소된 수분 조건 하에서 수행하여 수 제거 속도를 가속화시키고 전체 제거량을 증가시킬 수도 있다. 이러한 공정은 상기 축합 반응 동안 생성되거나 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거함으로써 상기 축합 반응을 완료시키는 목적과 일치한다. 그러나, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 상기 최종 생성물의 완전성 유지와 일관되어야 한다. 따라서, 최종 부가 생성물 중의 바람직한 수준의 수분은 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 4.0 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 5.0 내지 10.0 중량% 범위일 것이다. 예를 들어, 생성물이 양 소마토트로핀인 경우, 최종 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 6.0 내지 9.0 중량%일 것이다.
본 발명의 제조 방법에 상기 개시된 조건들을 적용시키는 것은 상기 축합 반응 중에 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거하는데 효과적일 것이며, 이는 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지시키면서 상기 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상의 상기 최종 축합 부가 생성물 수율을 생성시키는 것과 일치한다.
더욱이, 출발 물질 반응물들을 또한 소적 형태의 최종 축합 부가 생성물의 분산 직전에 또는 이와 거의 동시에 수용액으로서 서로 긴밀히 접촉시킬 수도 있다. 이러한 수용액 형태의 긴밀한 혼합은 상기 축합 부가물의 단백질 성분을 기계적으로 분해시키지 않으면서 동시에 상기 출발 물질 반응물들을 서로 접촉시키기에 충분한 기계적 작용에 의해 성취된다. 용액의 상당한 수준의 전단 응력을 피하기 위해서 서서히 작동하는 기계적 혼합 장치의 선택에 대한 지침이 제공되어 있다. 예를 들어, 숙련가는 봉, 패들 또는 다른 유형의 교반기를 갖는 고정된 혼합 용기; 전체 수반의 흔들림과 함께 작동하는 느린 이동식 나사 또는 배플을 포함하는 교반 수단이 장착된 수반 형태의 연속적인 혼합 장치; 중심 파이프에 반응 혼합물을 함유하고 파이프들 사이의 환에 역류의 열 매질이 흐르는 이중-파이프 장치(블레이드를 갖는 중심 파이프에서 샤프트 회전에 의한 교반이 수행됨); 날개바퀴가 있는 다운커머에 가열에 사용되는 캘린더가 있는 교반식 반응 용기(강제 순환이 반응 혼합물로의 열 전달을 증가시킨다); 반응 혼합물을 농축시키는 혼합 장치; 및 낮은 압력으로 유지되는 교반식 반응기 챔버가 있는 진공 반응 용기를 선택할 수 있다.
상기 언급한 수용액 형태의 긴밀한 혼합은 또한 상기 출발 물질 반응물들이 용질로서 서로 연속적인 상(즉 용매 상)과 분산된 상(즉 수성 상)으로 분리되어 있는 역 유화액의 역전에 의해 성취된다. 상기 역 유화액의 역전은 상기 역 유화액을 수성 시스템(분산된 상과 동일한 것으로 언급됨)으로 고속 분배시킴으로써 성취된다. 이어서 상기 개시된 임의의 혼합 방법들에 의해 유도되어 생성된 최종 축합 부가 생성물은 하기에 추가로 개시되는 바와 같이 주변 조건 하에서 즉시 소적으로 분산될 준비가 되어 있다.
출발 물질 반응물을 또한 소적 형태로 서로 긴밀히 접촉시킬 수도 있다. 즉 상기 최종 축합 부가 생성물이 소적 형태로 상기 최종 생성물을 분산시키기 직전에 또는 이와 거의 동시에 형성된다. 상기 소적 형태의 출발 물질 반응물의 긴밀한 혼합은 상기 소적들이 서로에 대해 최대의 혼합, 충돌 및 접촉을 이루는 방식으로 조종된 상기 각 반응 출발 물질의 분리된 분무 형태의 기계적 작용에 의해 성취된다. 상기 공정에 사용하기 위한 분무 장치는 상기 출발 물질 반응물들을 함유하는 수성 스트림을, 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하는데 필요한 크기의 소적들로 분할하는데 필요한 에너지를 부여하는데 충분한 기계적 또는 수력 펌핑 수단을 포함할 수 있다. 상기 펌핑 수단을 노즐 수단과 함께 사용하여 기계적 전단력을 상기 출발 물질 반응물의 수성 스트림에 가한 결과, 상기 스트림이 목적하는 소적 크기가 얻어질 때까지 연속적으로 보다 작은 소적 부피로 분할된다.
목적하는 소적 크기를 갖는 소적 형태로 비말 동반되도록, 함유된 출발 물질 반응물의 수성 스트림을 분산시키는 수단 및 기체 스트림 발생기를 포함하는 분무 장치를 또한 사용할 수도 있다. 상기 기체는 상기 출발 물질 반응물 및 상기 최종 축합 부가 생성물에 대해서 실질적으로 불활성이며, 상기 출발 물질 반응물의 소적들을 비말 동반하고, 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기에 충분한 최대의 혼합, 접촉 및 충돌을 보장하는데 필요한 부피 및 속도를 갖는 기체 스트림을 제공하기에 충분히 높은 압력으로 압축된, 다른 것들 중에서도 특히, 공기, 질소 또는 헬륨을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 분무 장치는 상기 개시된 수력 펌핑 수단 및 결합된 노즐 수단과 함께 상기 개시된 기체 스트림 발생기 및 결합된 분산 수단의 임의의 적합한 조합을 포함한다.
본 발명에 따른 소적 형태의 상기 출발 물질 반응물들의 긴밀한 혼합을 또한 상기 각 반응 출발 물질을 포함하는 수성 스트림이 향하는 표면 위에서 고속으로 회전하는 원반 형태의 기계적 작용에 의해 성취할 수도 있다. 각각의 반응 출발 물질에 대한 별도의 원반을 사용하거나, 또는 달리 상기 반응 출발 물질 수성 스트림들을 모두 수용하는 방식으로 된 단일 원반을 사용할 수도 있다. 상기 각각의 수성 스트림은 소적 형태로 상기 원반의 테두리로부터 추진되는 방식으로 상기 원반을 횡단한다. 상기 원반의 회전 속도는 상기 각 수성 스트림을 상기 소적의 최대 혼합, 충돌 및 접촉을 이루는 크기 및 속도를 갖는 소적으로 분할하기에 충분한 에너지를 부여하기 위해서 가변적이다. 상기 출발 물질 반응물들의 혼합은 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기 위해서 온도, 습도 및 압력이 조절된 실질적인 주변 조건 하에서 일어난다.
상기 개시된 제조 방법을 실질적인 주변 조건 하에서 수행하는 것은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주한다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 실질적인 주변 조건을 상기 축합 반응 및 생성된 최종 부가 생성물로부터 물을 제거하는 속도 및 전체적인 제거 정도를 개선시키기 위해서 현저하게 변경시킨다. 특히, 이러한 변경에는 상기 반응 출발 물질 수성 스트림 및 본 발명에 제공된 상기 제조 방법 공정의 일부 또는 전체 과정 동안 상기를 가공하는 장치 수단들의 가열이 포함된다. 따라서, 반응 속도 및 최종 축합 생성물로의 전환 정도가 실질적으로 증가된다.
상기 제조 방법을 상기와 관련된 장치의 다양한 부품들 또는 물질들에 전장을 인가하여 변경시킴으로써 관련된 상기 반응 출발 물질 소적들의 혼합, 충돌 및 접촉을 최대화시키고 상기 최종 축합 부가 생성물의 수율을 실질적으로 개선시킬 수도 있다.
장치 수단들 및 공정 단계들, 특히 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하는데 충분한 상기 출발 물질 반응물들의 최대 혼합, 충돌 및 접촉을 성취하기 위해서, 상기 반응물들의 반응에 관련되는 수단 및 단계들을 실질적인 감압 조건 하에 둘 수도 있다.
유동화된 베드 수단을 사용하여 최종 소적 축합 부가 생성물로부터의 물의 제거 속도 및 제거 정도를 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라 상기 최종 소적 축합 부가 생성물의 수율을 상기 출발 물질 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상으로 개선시킬 수도 있다.
본 발명은 또한 함유 성분들로 단백질 및 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 포함하는 쉬프 염기 축합 부가물을 포함하는, 상기 개시된 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 물질의 신규한 조성물에 관한 것으로, 여기에서 상기 성분들은 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기에 효과적인 조건 하에서 반응 혼합물을 형성하여 최종 축합 부가 생성물을 생성시킨다. 또한, 약 0.1 내지 약 10.0 ㎛, 바람직하게는 약 1.0 내지 약 5.0 ㎛, 보다 바람직하게는 약 2.0 내지 약 4.0 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2.5 내지 약 3.5 ㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 소적 형태 물질의 상기 조성물을 또한 제공한다.
본 발명 물질의 신규한 조성물은 상기 조성물의 단백질 성분이 동물에게 투여될 수 있고, 그 후에 상기 동물로부터 섭취되고, 유리하게 이용되고, 대사되고 처리되는, 즉 제거될 수 있는 것들을 포함한다. 상기 단백질 성분은 방향족 ο-하이드록시 알데하이드와 반응하여 본 발명의 개선된 쉬프 염기 축합 부가물을 형성하기 전에 상기와 같은 특징들을 가질 수 있으나; 그럼에도 불구하고, 상기와 같은 축합 부가물의 형성은 상기와 같은 성질 및 특징들을 현저하게 향상시킬 것이며 이에 의해, 달리는 적합하지 않을 단백질 후보를 적합하게 만들 수도 있다.
상기 단백질 성분은 특정 동물 또는 동물들에게 투여될 때 이로운 유용성(가장 흔하게는 치료제)을 획득하는 능력을 갖는다. 동물에게 또는 동물의 사용에 유리한 다른 생물 활성들을 갖는 단백질들, 예를 들어 대개 식품 생산용 가축으로 기르는 동물들의 성장을 조절하는데 사용되는 소마토트로핀과 같은 단백질 호르몬이 있으며, 상기와 같은 동물들에게 투여된 소마토트로핀은 사육 이용 효율을 증가시키고 상기와 같은 가축을 시장에 가져가는데 필요한 시간을 감소시키는 유리한 유용성을 갖는다. 또한, 장기적인 보관 안정성뿐만 아니라 비경구 고체 임플란트와 같은 방식으로 동물들에 대한 투여 기회의 향상 면에서 본 발명의 방법을 사용함으로써 개선된 단백질이 포함된다. 더욱 또한, 동물 및 인간의 치료제로서 유용성이 인정되었고 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 단백질들이 포함된다.
본 발명의 기술 분야는 개선된 안정성 및 다른 바람직한 성질들을 갖는, 알데하이드 또는 케톤과 아민과의 쉬프 염기 부가물을 포함하는 유기 분자의 합성 방법과 관련된다. 본 발명은 특히 상업적인 규모로 상기와 같은 부가 생성물을 다량 생산하기 위한 경제적이고 효율적인 제조 방법에 관한 것이다. 상기 언급한 기술 분야는 특히 동물 및 인간의 치료에 승인된 가치를 갖는 단백질인 아민 성분 함유 부가물에 관한 것이며, 상기 부가 생성물은 그의 투여 및 약물 동력학과 관련하여 개선된 성질들을 갖는다.
본 발명은 기본적인 반응의 수행을 위해 동결-건조, 분무-건조 또는 관련 방법들을 사용하고, 반응 혼합물의 pH를 7.0 이상으로 유지시킴과 동시에, 알데하이드 반응물을 방향족 오르토-하이드록시 알데하이드 중에서 선택할 것을 요구함으로써 용이하고, 재현가능하며 전환가능한 방식으로 정량적인 수율로 상기 언급한 부가 생성물을 제조할 수 있다는 뜻밖의 발견을 기본으로 한다. 이러한 발견을 하기에 보다 상세히 개시한, 실용성과 관련된 몇가지 기준을 만족시키는 모든 단백질 반응물들에 광범위하게 적용할 수 있다. 본 발명은 예를 들어 돼지 소마토트로핀과 방향족 오르토-하이드록시 알데하이드, 즉 ο-바닐린의 쉬프 염기 부가물의 제조에 관한 것이다. 돼지 소마토트로핀은 돼지의 사육 효율성을 개선시키기 위해 사용되는 성장 호르몬이다.
본 발명은 ο-하이드록시 알데하이드와 단백질을 포함하는 쉬프 염기 축합 부가물의 제조 방법에 관한 것으로, 이는 상기 유형의 부가 생성물 제조 분야에서 지금까지 공지된 제조 방법에 비해 현저히 개선된 것이다. 본 발명의 제조 방법은 그의 재현성, 효율, 높은 수율 및 전환성, 즉 실행 규모의 확대에 대한 적합성으로 보아 보다 용이할 뿐만 아니라, 상기 방법의 최종 축합 부가 생성물은 또한과거에 사용되었던 제조 방법에 의해 생성된 생성물에 비해 중대하고 놀라운 개선을 나타낸다. 본 발명의 최종 축합 부가 생성물은 본 발명의 놀랍게 양호한 재현성, 효율, 높은 수율 및 전환성, 즉 실행 규모 확대에 대한 적합성에 의해 개선된 본 발명의 축합 방법 자체로부터 직접적으로 생성된다.
지적한 바와 같이, 본 발명은 기술 문헌에 개시된 쉬프 염기 축합 방법들에 비해 현저히 개선된 것이다. 이러한 방법들의 전형적인 예들이 클라크 등의 미국 특허 제 5198422 호에 언급되어 있으며, 여기에서는 성장 호르몬, 특히 돼지 소마토트로핀 pST와 방향족 알데하이드를 포함하는 안정화된 착화합물을 제조하며, 상기 최종 생성물 착화합물을 상기 성장 호르몬의 연장된 방출을 제공한다고 주장된 결정 생성물로서 수용액으로부터 단리한다.
상기 클라크 등의 방법에서 수용액으로부터 최종 생성물 착화합물을 단리시키는 특정한 공정은 수성 용매를 상당한 기간에 걸친 기화에 의해 제거하고, 그 후에 생성물을 반응이 수행된 용기의 벽으로부터 긁어내어 회수함을 포함한다. 상기 클라크 등의 방법은 조절하기가 어려워, 흔히 생성물 분해를 일으키며, 실제적으로 대규모 생산 수준으로 규모를 확대시키는 것이 불가능하다. 현저한 생성물 분해 가능성은 반응 혼합물, 즉 최종 축합 부가 생성물의 성분으로서 뿐만 아니라 출발 물질 반응물로서 특히 자주 분해되는 단백질을 함유하는 농축된 수용액을 연장된 기간 동안 승온에서 유지시킨 직접적인 결과이다. 대조적으로, 본 발명의 제조 방법, 특히 분무 건조 및 동결 건조를 포함하는 실시태양은 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물의 수용액 중에서의 체류 시간을 최소로 감소시킨다.동결 건조에 의한 수성 용매의 제거가 클라크 등에 의해서도 언급되었지만, 개시 내용은 상기 공정을 결코 시도한 적이 없음을 나타내고 있는 것처럼 보인다. 결과적으로, 숙련가는 상기와 같은 공정 작업의 어떠한 타당한 예상도 할 수가 없다. 클라크 등은 본 발명의 방법에서와 같이 ο-하이드록시 알데하이드의 사용과 7.0 이상에서의 pH의 유지에 대한 중요성을 제시하고 있지 않다. 숙련가가 바로 앞에서 개시한 기화 공정과 함께 상기 클라크 등의 동결 건조를 수행했다 하더라도, 이는 연장된 건조를 특징으로 하는 것이며, 이는 재현성, 제품의 품질 및 규모 확대 능력을 포함한 상기 개시된 공정 문제점들을 직접적으로 야기시킬 것이다.
그럼에도 불구하고, 클라크 등의 연구는 상기 보다 앞서 동물들의 처리에 있어서 유용성을 심각하게 제한하는 장기간 저장 안정성 및 전체적인 제품 순도와 관련하여 부분-최적화된 개선된 생성물을 도출시켰다. 이는 상기 생성물이, 처리하려는 상기와 같은 동물의 피부 아래에 또는 근 조직내에 점적 또는 삽입에 의해 비경구 투여하기 위한 펠렛 또는 연관된 형태의 고체 임플란트인 경우에는 특히 불리한 효과를 가졌다. 상기 클라크 등의 방법이 제품 안정성에서 일부 개선을 획득할 수 있었지만, 수성 용매의 완전한 제거를 수행함에 있어서 다량의 에너지 소모 및 장기적인 지체의 경험으로 인해 상기와 같은 방법을 효율적이고 경제적으로 용이한 보다 큰 규모의 상업적인 생산 수준으로 규모 확대시키기에는 명백히 실용적인 방식이 아니었다.
따라서, 당해 분야에는 상기와 같은 쉬프 염기 축합 부가 생성물의 현행 제조 방법에 대한 기존의 단점들을 극복할 뿐만 아니라 초기의 훨씬 덜 만족스러운방법들에 의해 생산된 불안정한 부가 생성물의 단점들을 극복할 필요성이 여전히 존재한다. 당해 분야의 이러한 필요성을 만족시키는 의미에서 본 발명의 방법을 고찰해야 한다.
기술 문헌에 언급된 방법 및 생성물들의 단점을 상기와 같이 극복함에 있어서, 수성 용매의 제거를 매우 용이하고, 재현적이며 전환성이 있는, 즉 실질적으로 보다 큰 규모로 수행하기에 효율적으로 적합할 수 있으며(예를 들어 분무 건조), 따라서 효율적이고 경제적인 상업적 생산 수준의 규모 확대에 적합한 방법들에 의해 완수할 수 있다는 발견에서 본 발명의 요지를 찾을 수 있다. 본 발명 제조 방법의 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물의 필수적인 비-단백질 성분은 하기에 보다 상세히 개시되는 유형의 방향족 ο-하이드록시 알데하이드이다.
쉬프 염기 축합 부가 생성물은 원래 당해 분야에서 함유된 염기성 단백질의 안정화와 관련된 문제를 극복하기 위한 노력에서 사용되었다. 상기 문제의 원인은 단백질 생성물의 점진적인 변성의 직접적인 결과로, 이에 의해 3 차 구조, 즉 단백질 형태의 붕괴, 및 심지어는 상기 단백질의 2 차 및 1 차 구조의 일부 변성이 일어나, 상기 단백질의 물리적 성질이 변경되며 상기 단백질에 의해 부여된 생물 활성의 상당한 손실이 발생한다. 당해 분야에서는 보다 안정한 단백질 생성물을 획득하기 위한 노력으로, 예를 들어 상기 언급된 클라크 등(소마토트로핀의 연장된 방출 형태가 제공되었다고 주장함)에 의한 상기와 같은 단백질과 카보닐 화합물의 쉬프 염기 공액물이 사용되었다. 쉬프 염기 부가물을 형성시키는 기본적인 축합 반응은 하기 반응식으로 나타낼 수 있는 평형 반응이다:
상기 쉬프 염기 축합 반응이 평형 반응이고, 상기 도시된 반응식에서 오른쪽으로 현저하게 이동하지 않는 반응이라는 사실은 클라크 등에 의해 제안되었던 해법에서도 발생되었던 문제점, 즉 함유된 상당량의 단백질이 부가물의 형태가 아니고 따라서 변성에 의해 상기 단백질 구조가 쉽게 붕괴되어 결과적으로 생물학적(이 경우 성장 촉진) 활성이 손실된다는 문제점을 예견한다.
특히 상기 클라크 등에 의해 수행된 방법과 같이 반응의 진행에 기본적인 장애가 되었던 쉬프 염기 축합 반응의 또 다른 태양이 존재한다. 이 문제는 장기간의 건조 공정 동안 알데하이드 성분, 예를 들어 방향족 ο-하이드록시 알데하이드의 상당한 정도의 승화를 포함한다. 상기와 같은 승화의 정도는 반응 혼합물의 전체 원래 알데하이드 함량의 1/3 이상 정도로 많을 수 있다. 이러한 출발 물질 반응물의 현저한 손실은 최종 생성물 수율의 불가피한 감소뿐만 아니라 다른 문제점들(이들 문제점중 다수는 비 반응된 단백질 출발 물질 반응물에 의해 생성된다)을 또한 야기시킨다. 상기 비 반응된 단백질은 건조 공정 동안 변성에 의해 분해되기 쉬우며, 생성된 부산물은 공정의 복잡성, 예를 들어 본 발명의 다른 부분에 개시된 공정 장치의 열 교환 표면 상의 침전 및 상기 표면에의 부착과 같은 복잡성을 더욱 가중시킨다. 이러한 결과와 대조적으로, 본 발명의 공정은 알데하이드 성분 승화의 문제점이 거의 전적으로 제거된 대단히 높은 수율을 생성시킨다.
상기 나타낸 반응식의 오른쪽에 나타낸 바와 같이 축합에 의해 형성된 물의 제거가 질량 작용 법칙의 적응성에 비추어 상기 반응을 이론적으로는 완료시키겠지만, 상기와 같은 축합 수의 제거는 상기 반응이 수용액 중에서 일어난다는 사실에 비추어 매우 문제가 될 것이다. 상기 축합 수의 제거는 실제로 상기 반응의 수성 환경 중에 존재하는 물을 전부 제거함을 의미한다. 당해 분야는 이제 이러한 고유의 문제점이 쉬프 염기 축합 부가물의 형성에 따른 것임을 알아챘으나, 본 발명에 의해 제공된 상기 문제에 대한 해법 이전의 기술 문헌에는 상기 해법에 대한 어떠한 제안도 존재하지 않았다.
필수적인 성공 요소인 본 발명의 첫 번째 태양은 쉬프 염기 축합 부가물의 형성을 위해 반응되는 2 개의 주요 성분들 중 하나로서 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 사용하는 것이다. 본 발명의 축합 공정에 유용한 방향족 ο-하이드록시 알데하이드는 바람직하게는 하나 이상의 하기 화학식 1의 화합물을 포함한다:
화학식 1
상기 식에서,
R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR7; -OC(=O)R7; -S(=O)2; -S(=O)2N(R7)(R9); -S(=O)2R7; -S(=O)2OR7; -C(=O)NR7R9; -C(=O)R9; 및 -N(R7)(R9)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C4)알킬이며; 여기에서 상기 R1및 R4를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있고;
X 및 Y는 독립적으로 각각 N, O, S, CHR2또는 CHR3이나, 단 X 및 Y가 모두 동시에 O 및 S 중에서 선택될 수는 없으며, 이때 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR11; -OC(=O)R11; -S(=O)2; -S(=O)2N(R11)(R13); 및 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R13은 (C1-C4)알킬이다)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 여기에서 상기 R2및 R3를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 따라서, R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 트리플루오로메틸; (C1-C4)알킬; (C1-C4)알콕시; -C(=O)OR7; 또는 -N(R7)(R9)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C2)이다.
본 발명의 보다 바람직한 실시태양에서, R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; 카복실 또는 메틸아미노로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 특히 이 실시태양에서 R7은 수소이고 R9는 메틸이다. R1및 R4가 알킬로 정의되고 치환된 경우, 하이드록시; (C1-C2)알콕시; 카복실; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단일 치환체가 존재하는 것이 또한 바람직하다. 훨씬 더 바람직하게는 상기 단일 치환체는 하이드록시, 메톡시 및 디메틸아미노로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양에서, X 및 Y는 독립적으로 N, CHR2및 CHR3로 이루어진 그룹중에서 선택되며; 본 발명의 보다 바람직한 태양에서, X 및 Y 중 하나는 N이고 다른 하나는 각각 CHR2또는 CHR3이다. 본 발명에서 보다 더 바람직하게는 X는 CHR2이고 Y는 CHR3이며, 이때 R2및 R3는 바람직하게는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 트리플루오로메틸; (C1-C4)알킬; (C1-C4)알콕시; -C(=O)OR11; -S(=O)2N(R11)(R13); 또는 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 바람직하게는 수소 또는 (C1-C2)알킬이고, R13은 (C1-C2)알킬이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 본 발명에서 훨씬 더 바람직하게는 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; 카복실 또는 메틸아미노로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 이 경우 R11은 수소이고 R13은 메틸이다.
R2및 R3가 알킬로 정의되고 치환된 경우, 하이드록시; (C1-C2)알콕시; 카복실; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단일 치환체가 존재하는 것이 본 발명에서 바람직하다.
본 발명에 사용하기에 특히 적합한 특정의 방향족 ο-하이드록시 알데하이드와 관련하여 이러한 본 발명의 태양을 추가로 예시하기 위해서, 바로 아래의 표 1a 내지 1c에 상기와 같은 바람직한 알데하이드 그룹들을 나타낸다.
본 발명의 제조 방법 및 그의 생성물에 사용하기에 적합하고 바람직한 방향족 ο-하이드록시 알데하이드에 대해 상기 인용된 종들 중에는, 상기 방법에서의그들의 이용성, 비용, 유효성 및 용이성과 효율성을 기본으로 하고, 시간에 대한 안정성 및 원래 수준의 생물 활성의 유지에 비추어 최적의 바람직한 특징들을 갖는 개선된 생성물을 생산하는 그들의 능력을 기본으로 하는 상기와 같은 용도에 가장 바람직한 것들이 다수 있다. 상기 가장 바람직한 종으로 살리실알데하이드; 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드; 2,6-디하이드록시벤즈알데하이드; ο-바닐린; 및 피리독살이 포함되며, 이들을 하기의 일반식들로 나타낼 수 있다:
본 발명의 성공에 필수적인 요소가 개선된 쉬프 염기 축합 부가물의 형성을 위해 반응되는 2 개의 주요 성분들중 하나로서 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 사용하는 것인 본 발명의 첫 번재 태양을 바로 위에 개시하였다. 따라서, 하기에는 본 발명의 제조 방법의 공정에 따라 상기 방향족 ο-하이드록시 알데하이드와 반응하여 본 발명의 개선된 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물을 형성하는 두 번째 성분인 단백질에 대한 상세한 설명을 기술한다.
본 발명의 개선된 쉬프 염기 축합 부가물의 두 번째 성분으로 사용하기 위한후보자인 단백질은 사용에 적합한가를 판단하기 전에 몇가지 요건을 만족시켜야 한다. 첫 번째 요건으로, 다른 것이 아닌 단백질 크기만을 전적으로 기준으로 할 수 있는 예리하게 한정되는 제한이 없다는 것이다. 단백질의 분자량 또는 중량을 달톤 또는 킬로달톤(kD)으로 나타내며, 적게는 2 개 내지 수백 개의 아미노산에서 많게는 수천개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 전형적인 단백질은 30,000 달톤의 질량을 갖는다. 그러나, 후보 단백질은 동물들에게 투여되고, 그 후에 상기 동물로부터 섭취되고, 유리하게 이용되고, 대사되고 처리, 즉 제거될 수 있어야 하는 것이 중요하다. 상기 단백질 후보는 방향족 ο-하이드록시 알데하이드와 반응하여 본 발명의 개선된 쉬프 염기 축합 부가물을 형성하기 전에 상기와 같은 특징들을 갖는 것이 바람직하나; 그럼에도 불구하고 상기와 같은 축합 부가물의 형성은 상기와 같은 성질 및 특징들을 현저하게 향상시킬 것이며, 이에 의해, 달리는 적합하지 않을 단백질 후보를 적합하게 만들 수도 있다.
본 발명의 쉬프 염기 축합 부가물의 제조에 사용하기 적합한 단백질 후보의 다른 주요 특징은 상기 단백질이 투여되는 특정한 동물 또는 동물들에서 이로운 유용성을 획득하는 그의 능력이다. 이러한 이로운 유용성은 가장 통상적으로는 동물에게 투여되든지 인간에게 투여되든지 간에 치료제인 것이다. 본 원에 사용된 "동물" 및 "동물들"이란 용어는 상기에 관하여 이로운 유용성을 갖는 단백질에 대해 본 발명에 의해 부과된 다른 요건들을 만족하는 동물 왕국의 모든 구성원들 및 그의 주요 부문들을 지칭한다. 본 원에 사용된 "이로운 유용성"이란 표현은 대개 동물 축산업에 대한 경제적 보상에 비추어 특정한 동물, 및 따라서 인간에게 이로운 작용을 말한다. 그러나, 상기 표현은 또한 특정한 동물들에게 불리하거나 유해한 작용으로까지 연장되지만, 역으로 인간에게 경제적인 이점이 될 수도 있다. 이러한 작용은 다양한 종류의 살충 작용, 예를 들어 경제적으로 중요한 농작물을 손상시키거나 또는 인간에게 귀중한 가축들에 해를 입히는 해충의 성장 및 번식의 억제 또는 철저한 박멸을 포함할 수 있다. 따라서, 경제적으로 중요한 모든 주요 문들 및 그의 부문들, 예를 들어 해충(Insecta), 거미 및 진드기(Arachnida), 및 갑각류(Crustacea)의 강을 포함하는 아르쓰로포다(Arthropoda) 문; 또는 포유동물(Mammalia), 조류, 파충류(Reptilia), 양서류(Amphibia) 및 어류의 강을 포함하는 벨테브라타(Vertebrata) 아문의 척추동물; 및 조개 및 달팽이를 포함한 몰루스카(Mollusca) 문; 또는 지렁이 및 거머리를 포함한 안넬리다(Annelida) 문; 또는 불가사리 또는 성게를 포함한 에키노더마타(Echinodermata) 문; 또는 심장사상충을 포함한 네마토다(Nematoda) 문의 무척추동물이 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명에 사용하기 적합한 단백질은 동물 또는 동물의 사용에 이로운, 대개는 자연에서 치료로서 분류되지 않는 더욱 다른 생물 활성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 소마토트로핀과 같은 단백질 호르몬은 대개 식품 생산용 가축으로 사육되는 동물들의 성장을 조절하는데 사용되며, 상기와 같은 동물에게 투여된 소마토트로핀은 사료 이용 효율을 증가시키며 상기와 같은 동물을 시장에 데려가는데 필요한 시간을 단축시키는 이로운 유용성을 갖는다. 이러한 단백질 호르몬의 사용은 그 자체로서 치료와 직접 관련되지 않은 분명하고 명확한 상업적 및 경제적 이점을갖는다.
단백질이며 현재 상업적으로 개발되고 있는 다른 호르몬들 및 신체 기능 조절제들을 또한 본 발명의 방법을 사용하여 개선시킬 수 있다. 이러한 개선은 개선된 부가물 축합 수준뿐만 아니라 그의 향상된 수율과 관련되며, 그 결과 비경구 고체 임플란트와 같은 방식에 의해 동물에 대한 투여 기회가 개선된다.
그러나, 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 대다수의 단백질들은 동물 및 인간에게 치료제로서의 유용성이 승인된 것들이다. 이러한 단백질들은 광범위하게 다양한 치료제 부류에서 용도를 찾거나 또는 이에 사용하기 위해 활발히 탐구되었다. 하기 단락의 설명은 상기와 같은 단백질이 다수 있을 뿐 아니라 이들 단백질 모두가 개선된 쉬프 염기 축합 부가물로서 본 발명의 방법에 따라 제조 될 때 개선된 장기간 안정성 및 그의 생물 활성의 보존 이점을 가짐을 명백히 한다. 이는 서방성 투여를 위한 이식된 저장소로 사용되도록 단백질들을 펠렛 또는 유사 형태로 제조하는 경우에 특히 사실이다.
엔케팔린, 엔돌핀 및 다이놀핀으로서 확인된 3 개의 독특한 계열로 편성된 단백질성 내생 및 합성 오피오이드 진통제 및 길항물질의 대 그룹이 존재한다. 이들 단백질은 μ, κ 및 δ 오피오이드 수용체 서브유형의 선택적 및 비선택적인 작용물질 및 길항물질이며, 주로 진통제로서 치료학적 유용성을 갖는다. 구체적인 단백질에는 [Leu5] 및 [Met5]엔케팔린; 다이놀핀 A 및 B; α- 및 β-네오엔돌핀; [D-Ala2,MePhe4,Gly(올)5]엔케팔린(DAMGO); [D-Pen2,D-Pen5]엔케팔린(DPDPE); [D-Ser2,Leu5]엔케팔린-Thr6(DSLET); [D-Ala2,D-Leu5]엔케팔린(DADL); D-Phe- Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP); [D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-올]엔케팔린(FK-33824); Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]델톨핀 I; Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]델톨핀 II; Tyr-Pro-Phe-Pro- NH2(몰피세핀); Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017); 및 [D-Ala2, Leu5, Cys6]엔케팔린이 있다.
브래디키닌 및 칼리딘을 포함한 오타코이드로서 분류되는 일단의 단백질이 조직 손상, 바이러스 감염 및 알러지 반응들 중에서 선택된 염증성 사건들에 응하여 일련의 단백질 분해 반응에 의해 생성된다. 이들 단백질은 국소적으로 작용하여 통증, 혈관 확장, 증가된 혈관 침투성 및 프로스타글란딘의 합성을 생성시킨다. 작용 활성 및 길항 활성을 갖는 이들 단백질 및 이들의 동족 유도체는 남성 불임의 치료, 혈액-뇌 장벽을 넘어선 암 화학요법제의 전달, 및 통증, 천식 및 다른 만성적인 염증 질환들의 치료에 잠재적으로 유용한 치료제들이다. 이러한 유형의 구체적인 단백질에는 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(브래디키닌); Lys-Arg- Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly- Phe-Ser-Pro-Phe (데스-Arg9-브래디키닌); Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro- Phe(데스-Arg10-칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(데스-Arg9-[Leu]8-브래디키닌); Arg- Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-브래디키닌); 및 [D-Arg]-Arg- Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)(여기에서 Hyp는 트랜스-4-하이드록시-Pro이고; Thi는 β-(2-티에닐)-Ala이고; Tic는 [D]-1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-3-일-카보닐이고; Oic는 (3as,7as)-옥타하이드로인돌-2-일-카보닐이다)이 있다.
물의 신장 보전에 영향을 미치는 바소프레신 및 관련 약제에 의한 체액 삼투성의 조절, 및 각각 기능촉진 반응 및 항 이뇨 반응을 매개하는 바소프레신 수용체 서브 유형 V1및 V2에 대해 선택적인 상기와 같은 단백질의 동족체의 생산에 의해 상이한 활성들을 갖는 다수의 치료제들이 생성되었다. 예를 들어 울혈성 심장 마비, 고혈압, 수술 후 장폐색 및 복부 팽만의 치료에 이로운 V1길항물질과, 다뇨증 및 다음증의 억제에 의한 중추 요붕증의 치료, 및 폰빌레브란드 질병을 포함한 출혈성 질환의 치료에 사용되는 V2작용물질이 있을 수 있다. 구체적인 천연 바소프레신-형 펩티드에는 하기 일반식의 아르기닌 바소프레신(AVP):
및 리프레신([Lys8]-AVP; 합성 바소프레신 펩티드: V1a-선택성 작용물질 [Phe2, Ile2, Orn8]AVP; V1b-선택성 작용물질 데아미노 [D-3-(3'-피리딜)-Ala2]AVP; V2-선택성 작용물질 데즈모프레신(dDAVP); 및 데아미노[Val4, D-Arg8]AVP; 및 펩티드 길항물질, 예를 들어 하기 일반식의 V1a-선택성 길항물질 d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP:
및 V1b-선택성 길항물질 dp[Tyr(Me)2]AVP; 및 V2-선택성 길항물질 데스 Gly-NH2 9-d(CH2)5[D-Ile2, Ile4]AVP, 및 d(CH2)5[D-Ile2, Ile4, Ala-NH2 9]AVP가 있다.
펜타가스트린은 일반식: N-t-부틸옥시카보닐-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe- NH2을 가지며 위장 분비 지표로서 사용되는 단백질 진단 보조제이다.
옥트레오티드는 소마토스타틴의 합성 동족체이며 위장관 종양, 다른 치료에 대한 설사 불응, 운동 장애 및 위장 출혈 증상들의 치료에 유용하다. 아세테이트 및 파모에이트로서 수득할 수 있는 옥트레오티드는 L-시스테인아미드-D-Phe- L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-하이드록시-1-(하이드록시-메틸)프로필]-환상(2→7)-디설파이드, [R-(R*,R*)]의 구조를 갖는다.
면역억제제로서 사용하기 위한 다수의 항체 시약들이 임상적인 용도로 승인되었다. 진보된 하이브리도마 기술은 상기와 같은 항체들을 표준화된 약리학적 시약으로서 사용될 수 있는 매우 정제되고 특이적인 항체 제제를 생성하는 연속 배양 세포로부터 다량으로 제조하였다. 이러한 항체 시약에는 항흉선세포 글로불린; 뮤로모냅-CD3 단클론 항체; 및 Rho(D) 면역 글로불린이 있다. 면역결핍 상태의 치료에서 치료제로서 개발된 단백질 면역자극제로 면역 글로불린이 있다.
시토킨은 다양한 면역조절 효과를 갖는 백혈구 및 관련 세포로부터 생산된 다양한 단백질 군이다. 현재 주요 시토킨으로 인정된 것은 인터페론, 콜로니-자극 인자 및 인터류킨이 있다. 이들 군의 구성원들에 대한 구체적 예로 α-인터페론; 인터페론-γ(IFN-γ); 과립성 백혈구 콜로니-자극 인자(G-CSF); 과립성 백혈구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF); 및 인터류킨-1(IL-1) 내지 인터류킨-12(IL-12)가 있다.
조혈 성장 인자는 성숙한 혈액 세포를 연속적으로 대체하는 과정의 조절과 관련된 일단의 호르몬성 당단백질이다. 이들 단백질의 임상 분야에는 1 차 혈액작용 질병의 치료가 있으며, 심각한 감염의 치료, 및 화학요법 또는 골수 이식 하에 있는 환자들의 관리에 보조약으로서 사용된다. 이러한 성장 인자의 구체적인 예로는 에리쓰로포에틴(EPO); 간 세포 인자(SCF); 인터류킨(IL-1-12); 단핵세포/대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF, CSF-1); P1XY321(GM-CSF/IL-3 융합 단백질); 및 트롬보포에틴이 있다.
혈전 용해성 약물은 혈관 손상 부위의 병적인 혈전 및 피브린 침착물 모두의 용해에 사용되며, 스트렙토키나제; 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA); 및 유로키나제와 같은 단백질이 포함된다.
뇌하수체 전엽 호르몬 및 그의 사용을 조절하는 시상하부 인자는 치료학적 용도를 갖는 단백질이다. 상기 뇌하수체 전엽 호르몬은 3 개의 군, 즉 (a) 성장 호르몬(GH), 프로락틴(Prl) 및 태반 락토젠(PL)을 포함한 성장성 호르몬; (b) 황체화 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH) 및 타이로이드-자극 호르몬(TSH)을 포함한 당단백질 호르몬; 및 (c) POMC-유도된 호르몬, 예를 들어 코르티코트로핀(ACTH), α-멜라닌세포-자극 호르몬(α-MSH), β-멜라닌세포-자극 호르몬(β-MSH), β-리포트로핀(β-LPH) 및 γ-리포트로핀(γ-LPH)으로 나뉜다. 상기 호르몬들의 방출을 조절하는 시상하부 인자들에는 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 인슐린-형 성장 인자(IGF-1 및 IGF-2), 소마토스타틴 및 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH)이 있다.
성장 호르몬은 성장-호르몬 결핍 아동의 대체 요법으로서 사용된다. 소마토스타틴은 성장 호르몬 방출을 억제하지만 반감기가 짧은 시상하부 물질이다. 이미 상기에 추가로 개시된 그의 합성 동족체인 옥트레오티드는 성장 호르몬의 과잉 분비에 의해 야기되는 선단 비대증을 치료하는데 사용된다. 성선 자극 호르몬에는 LH, FSH 및 코리온 고나도트로핀(GC)이 있으며 진단용으로 사용된다. CG는 임신을 진단하는데 사용되는 반면, LH 및 FSH는 여러 생식기 질환의 진단에 사용된다. 이들 고나도트로핀 단백질은 또한 불임증의 치료에 치료학적으로 사용된다. 예를 들어 유로폴리트로핀은 배란 유도에 사용되며, 대부분의 LH가 제거된, 따라서 주로 FSH인 인간 폐경기 고나도트로핀(hMG) 또는 메노트로핀 제제이다. 고나도렐린은 고나도트로핀 분비를 자극하는데 치료학적으로 사용되는 합성 인간 GnRH이다.한편으로, 합성 GnRH 작용물질, 예를 들어 류프롤리드, 히스트렐린, 나파렐린 및 고세렐린은 생식선 스테로이드의 감소에 반응하는 다양한 내분비 질환의 치료에 사용될 수도 있다.
갑상선 기능은 티로트로핀-방출 호르몬(TRH)에 의해 분비가 조절되는 당단백질인 티로트로핀(TSH)에 의해 조절된다. TSH의 치료학적 용도는 갑상선 기능 저하증 환자의 호르몬 대체 요법 및 무독성 갑상선종 환자 또는 갑상선 암 치료 후의 환자의 TSH 억제이다.
인슐린 단백질은 실제적으로 모든 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM) 환자 및 많은 비-인슐린-의존성(NIDDM) 당뇨병 환자의 치료를 위한 중심 물질이다. 피하로부터 보다 신속히 흡수되는 인슐린의 합성 동족체들도 또한 사용된다. 또한 인슐린을 수일 또는 수주에 걸쳐 서서히 방출하도록 이식성 펠렛이 고안되었다. 글루카곤은 심각한 저혈당증의 치료에 사용되며 글루코스 및 케톤의 체내 대사의 조절에서 중요한 생리적 역할을 갖는 단백질로, 위장관의 억제 효과를 위해 방사선 기사에 의해 사용된다. 상기 추가로 언급된 소마토스타틴은 주로 내분비성 종양에서 호르몬 방출을 차단하는 것으로 그 용도가 제한된, 짧은 생물학적 반감기를 갖는 호르몬이며, 예를 들어 인슐리노마스, 글루카고노마스, VIP오마스, 칼시노이드 종양 및 소마토트로피노마스가 있다. 합성 동족체인 옥트레오티드는 보다 오래 작용하며 결과적으로 치료를 위해서 보다 자주 사용된다.
칼시토닌(CT)은 골 재흡수를 억제하기 위해 조골세포에 특이적으로 작용하며, 고칼슘혈증을 관리하는데 유용하다. CT는 또한 증가된 골격 리모델링 질환,예를 들어 파제씨 병에 효과적이다. 파라티로이드 호르몬 단백질(PTH)은 척수 골다공증 환자의 치료에 잠재적으로 가치가 있다.
상기 개시된 단백질 치료제 군 이외에, 하기의 열거된 단백질 조성물 종들이 인간에 대한 용도로 승인되었다.
알데스류킨, 125-L세린-2-133-인터류킨 2는 항신생물제 및 면역자극제로서 유용하다.
알글루세라제는 글루코세레브로시다제 효소의 보급자로서 사용되며, 인간 태반 조직 β-글루코세레브로시다제의 변형된 형태로 497 개의 아미노산을 갖는 단량체성 당단백질이다.
알새크티드는 합성 코르티코트로핀 동족체인 1-β-Ala-17[L-2,6-디아미노-N-(4-아미노부틸)헥산아미드]-α1-17-코르티코트로핀이다.
알테플라제는 플라스미노겐 활성화제로서 사용되며, 서열이 혈관벽의 내피 세포에 의해 생산된 천연 프로테아제와 동일한 527 개 아미노산의 세린 프로테아제이다.
알비르셉트 수도톡스는 항바이러스제로서 사용되며, 2 개의 링커 잔기를 통해 CD4의 세포외 영역의 처음 178 개 아미노산이 슈도모나스 엑토톡신 A의 아미노산 1 내지 3 및 253 내지 613에 결합되도록 조작된 합성 키메릭 단백질이다.
암린티드는 당뇨병 치료제로서 사용되는 37 개 아미노산의 단백질이다.
아모가스트린은 N-카복시-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-페닐-L-알라닌아미드이다.
아나킨라는 비스테로이드성 염증 치료제로서 및 염증성 장 질환의 치료를 위한 억제제로서 사용되는, N2-L-Met-인터류킨 1 수용체 길항물질이다.
아나라티드 아세테이트는 고혈압 치료제로서 및 이뇨제로서 사용되는, 아트리오펩틴-21(래트), N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-,아세테이트이다.
안지오텐신 아미드는 혈관수축제로서 사용되는, 안지오텐신 II, 1-L-Asn-5-L-Val-이다.
아프로티닌은 효소 억제제(프로테이나제)로서 사용되는, 58 개 아미노산을 갖는 췌장 트립신 억제제이다.
아르팔라신은 고혈압 치료제로서 사용되는, 1-숙신암산-5-L-Val-8-(L-2-페닐글리신)안지오텐신 II이다.
알지프레신 탄네이트는 이뇨증 치료제로서 사용되는, 바소프레신, 8-L-Arg-, 탄네이트이다.
아스파르토신은 스트렙토마이세스 그리세우스에 의해 생산된 항생제이며, 옥시토신, 4-L-Asn-이다.
아토시반은 옥시토신 길항물질로서 사용되는, 옥시토신, 1-(3-머캅토프로판산)-2-(O-에틸-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-이다.
아보파르신은 스트렙토마이세스 칸디두스로부터 수득된 글리코펩티드 항생물질이다.
바시펀진은 N-[(2R,3R)-2-하이드록시-3-MeVal]-N-L-MeVal-L- Phe-N-L- MePhe-L-Pro-L-알로-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-하이드록시-N-L-MeVal α1-락톤의 구조를 갖는 항진균제이다.
베카플러민은 간엽-유래된 세포의 증식을 증진시킴으로써 만성적인 피부 궤양의 치료에 사용되는, 내생성 인간 PDGF-BB 단독이량체의 아미노산 조성과 생물 활성이 유사한, 유전자 조작된 사카로마이세스 세레비지아에에 의해 생산된 재조합 단백질인 재조합 인간 혈소판-유래된 성장 인자 B이다.
비발리루딘은 20 개의 아미노산을 갖는 항응고성 혈전방지제이다.
카르베토신은 1-부티르산-2-[3-(p-메톡시페닐)-L-Ala]옥시토신이다.
카르구토신은 1-부티르산-6-(L-2-아미노부티르산)-7-글리신옥시토신이다.
세룰레티드는 5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-설포-L-Tyr-L-Thr-L- Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-아미드의 구조를 갖는 위액 분비 자극제이다.
세터민은 112 개의 아미노산을 갖는 인간 성장 인자 β2를 전달한다.
실모스팀은 조혈제(대식세포 콜로니-자극 인자)로서 사용되는, 1-233-콜로지-자극 인자 1(인간 클론 p3ACSF-69 단백질 잔기), 환상(7→90), (48→139), (102→146)-트리스(디설파이드)·이량체이다.
콜리스티메테이트 나트륨은 항균제로서 유용한 콜리스틴 A 성분이다.
코르티코렐린 양 트리플루테이트는 부신피질 부족 및 쿠싱 증후군에 대한 진단 보조제로서 및 코르티코트로핀-방출 호르몬으로서 사용되는, 코르티코트로핀-방출 인자(양), 트리플루오로아세테이트 염이다.
코신트로핀은 부신피질자극 호르몬으로서 사용되는 테트라코색티드 아세테이트, α1-24-코르티코트로핀이다.
사이클로스포린은 면역억제제로서 사용되는, 11 개의 아미노산 및 6번 위치에 3-하이드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노일 잔기를 함유하는 환상 단백질이다.
다클리시맵(Ro-24-7375)은 면역억제제로서 사용되는, 디설파이드 가교를 통해 연결된 4 개의 서브유니트를 포함하고 대략 150 kD의 분자량을 갖는 인간화된 항-TAC 단클론 항체이다. 유사한 면역 억제제 단백질은 다클리주맵이다.
다프토마이신은 단백질성 항균제이다.
데시루딘은 항응고제로서 사용되는, 63 개의 아미노산을 갖는 히루도 메디시날리스로부터의 63-데설포히루딘이다.
데슬로렐린은 LHRH 작용물질로서 사용되는, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)이다.
데즈모프레신 아세테이트는 항이뇨제로서 사용되는, 9 개의 아미노산을 포함하는 바소프레신, 1-(3-머캅토프로판산)-8-D-Arg-, 모노아세테이트 염, 트리하이드레이트이다.
데티렐릭스 아세테이트는 LHRH 길항물질로서 사용되며 10 개의 아미노산을 포함한다.
듀모렐린은 27-L-Leu-44a-Gly 성장 호르몬 방출 인자(인간)이다.
엘카토닌은 1-부티르산-7-(L-2-아미노부티르산)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L -Ala 칼시토닌(연어)이다.
에목타킨은 2 개의 Cys 가교를 갖는 72 개의 아미노산을 포함하는 인터류킨 8(인간)이다.
에포에틴 알파는 빈혈 치료제 및 보혈제로서 사용되는, 적혈구 세포의 생산을 조절하고 중국 햄스터 난소 세포를 인간 에리쓰로포에틴 유전자내에 삽입시켜 제조된 165 개 아미노산 당단백질이다.
에르소페르민은 상처 치유제로서 사용되는, 인간 태반으로부터 단리되고 이 콜라이에서 클로닝되고 발현된 비-글리코실화된 단백질인 157 개의 아미노산을 포함하는 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)이다.
펠리프레신은 혈관수축제로서 사용되는, 9 개의 아미노산을 포함하는 바소프레신, 2-L-Phe-8-L-Lys이다.
필그라스팀은 호중구감소 억제제로서 및 조혈 자극제로서 사용되는, 비-글리코실화되고 이 콜라이에 의해 발현된 175 개 아미노산 단일 쇄 폴리펩티드이다.
글루카곤은 당뇨병 치료제로서 사용되는, 29 개 아미노산의 단일 쇄 단백질이다.
고나도렐린 아세테이트는 생식선-자극 원소로서 사용되는, 10 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자 아세테이트의 디아세테이트 염이다.
고세렐린은 LHRH 작용물질로서 사용되는, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)이다.
히스트렐린은 LHRH 작용물질로서 사용되는, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)이다.
이미글루세라제는 글루코세레브로시다제의 효소 보충물로서 사용되는, 495-L-히스티딘글루코실세라미다제 태반 이소엔자임 단백질이다.
달란화된 인슐린은 당뇨병 치료제로서 사용되는, 인슐린의 B 쇄로부터 C-말단 알라닌을 제거하여 제조된 인슐린 유도체이다.
인터페론 알파-2a는 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 사용되는, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 αA(환원된 인간 백혈구 단백질 잔기)이다. 인터페론 알파-2b는 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 사용되는, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 α2b(환원된 인간 백혈구 클론 Hif-SN206 단백질 잔기)이다. 인터페론 베타-1a는 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 사용되는, 인간 인터페론 베타에 대해 조작된 유전자를 함유하는 배양된 중국 햄스터 난소 세포로부터 생산된 166 개 아미노산 잔기로 이루어진 글리코실화된 폴리펩티드이다. 인터페론 베타-1b는 면역조절제로서 또한 사용되는, 이 콜라이로부터 생산된 165 개 아미노산 잔기로 이루어진 비-글리코실화된 폴리펩티드이다. 인터페론 감마-1b는 항신생물제로서 및 면역조절제로서 사용되는, 1-139 인터페론 γ(환원된 인간 림프구 단백질 잔기), N2-L-Met이다.
이로플랙트는 2 개의 Cys 가교를 갖는 71 개 아미노산 잔기를 포함하는 N-메티오닐 혈소판 인자(인간 서브유니트)이다.
라노테플라제는 Asn 117 내지 Gln 117의 변이, 및 피브로넥틴-유사 및 EGF-유사 영역의 결실에 의해 인간 t-PA로부터 유도된 조직 플라스미노겐 활성화제 단백질이다. 상기 단백질은 플라스미노겐 활성화제 및 혈전 용해제로서 사용되며, 펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 숙수 세포에서 발현시켜 생성된다.
란레오티드 아세테이트는 항신생물제로서 사용되며, 8 개의 아미노산 및 1 개의 디설파이드 가교를 포함한다.
레노그라스팀은 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 사용되는, 인간 구강의 비늘모양 세포 주-mRNA로부터 유도된 인간 과립세포 콜로니-자극 인자-cDNA의 발현에 의해 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 174 개 아미노산 잔기로 이루어진 당단백질이다.
루트렐린 아세테이트는 LHRH 작용물질로서 사용되는, 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)이다.
몰그라모스팀은 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 사용되는, 127 개 아미노산을 포함하는 콜로니-자극 인자 2(환원된 인간 클론 pHG25단백질 잔기)이다.
뮤로더민은 표피 성장 인자(마우스 침샘)이다.
나파렐린 아세테이트는 LHRH 작용물질로서 유용한 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)이다.
나그레스티펜은 69 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는26-L-알라닌림포킨 MiP 1α(인간 클론 pAT 464) 염증성 대식세포이다.
펩스타틴은 펩신 효소 억제제로서 사용되는, N-(3-메틸-1-옥소부틸)-L-Val- L-Val-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵타노일-L-Ala-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산이다.
프라밀린티드는 당뇨병 치료제로서 사용되는, 37 개 아미노산을 포함하고 1 개의 디설파이드 가교를 갖는 단백질이다.
인간 프로인슐린은 당뇨병 치료제로서 사용되는, 86 개 아미노산 잔기를 포함하고 3 개의 디설파이드 가교를 갖는 프로인슐린(돼지)이다.
살그라모스팀은 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 사용되는, 사카로마이세스 세레비지아에로부터 발현된 127 개 아미노산 잔기를 갖는 단일 쇄의 글리코실화된 폴리펩티드인 콜로니-자극 인자 2(인간 클론 pHG25 단백질 잔기), 23-L-Leu-이다.
소마그레보브는 갈락토스형성제로서, 특히 수의학적 용도에 사용되는, 191 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 소), 1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-글루타민]이다.
소말라포르는 호르몬(성장, 돼지)으로서 사용되는, 총 191 개 아미노산을 포함하는 N-L-알라닐-성장 호르몬인 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1)이다.
소마트렘은 성장 호르몬으로서 사용되는, 191 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는 N-L-Met 소마토트로핀(인간)이다.
소마토트로핀(때때로 선하수체 성장 호르몬, GH, 하수체성 성장 호르몬 뇌하수체 전엽 성장 호르몬, 뇌하수체 성장 호르몬 및 성장 호르몬이라고도 칭함)은 신체 성장을 촉진시키고, 단백질 합성을 자극하며, 탄수화물 및 지질 대사를 조절하는 특이적인 동화 단백질 종이다. 소마토트로핀은 시상하부 호르몬인 소마토리베린과 소마토스타틴의 조절 하에서 뇌하수체 전엽으로부터 분비된다. 다양한 종들로부터의 소마토트로핀 성장 호르몬들은 아미노산 서열, 항원성, 등전점 및 이들 호르몬이 생물 반응을 생성할 수 있는 동물의 범위가 다양하다.
인간에서 소마토트로핀은 인간 뇌하수체의 전엽으로부터 수득된 주요 성장 자극 호르몬의 정상적인 구조를 갖는 191 개 아미노산을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로, 성장 호르몬으로서 사용된다. 소마토트로핀을 또한 재조합체 형태로 이용할 수 있다. 본 원에 사용된 "소마토트로핀"이란 재조합을 포함하여 천연 및 합성적으로 유도된 인간 및 동물 소마토트로핀(성장 호르몬), 특히 소 및 돼지 소마토트로핀을 포함한다. 메티오닐 인간 성장 호르몬인 C995H1537N263O301S8은 재조합 DNA로부터 세균에서 생산되며, 천연 호르몬의 완전한 아미노산 서열 + 추가의 N-말단 메티온을 함유한다.
소 소마토트로핀의 4 개의 천연 분자 변형체들이 존재하는데, 이들 중 하나는 소마부보브로 알려져있다. 다수의 변형체들, 예를 들어 소마그레보브, C987H1550N268O291S9; 소메트리보브, C978H1537N265O286S9; 및 소미도보브 C1020H1596N274O302S9가 재조합 DNA 기법에 의해 생산되었다.
천연 돼지 소마토트로핀의 다수의 변형체들, 예를 들어 소말라포르, C977H1527N265O287S7; 소메노포르, C938H1469N255O275S7; 소메트리포르, C979H1527N265O287S8; 및 솜파세포르, C938H1465N257O278S6가 재조합 DNA 기법에 의해 생산되었다.
소마부보브는 소 뇌하수체 소마토트로핀의 4 개의 천연 분자 변형체들 중 하나이며 갈락토스형성제로서 사용되는 소마토트로핀(소), 127-L-Leu-이다.
소메노포르는 돼지 성장 호르몬으로서 사용되는, 190 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1), N-L-Ala-32-de-L-Glu-33- de-L-Arg-34-de-L-Ala-35-de-L-Tyr-36-de-L-Ile-37-de-L-Pro-38-de-L-Glu-이다.
소메트리보브는 수의학적 성장 자극제로서 사용되는, 191 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(소), 1-L-Met-127-L-Leu-이다.
소메트리포르는 재조합 돼지 소마토트로핀, C979H1527N265O287S8이다.
솜파세포르는 재조합 돼지 소마토트로핀, C938H1465N257O278S6이다.
소미도보브는 재조합 소 소마토트로핀, C1020H1596N274O302S9으로, 수의학적 성장 자극제로서 사용된다.
테프로티드는 안지오텐신-전환 효소 억제제로서 사용되는, 9 개 아미노산을 포함하는 브래디키닌 강화제 B, 2-L-Trp-3-de-L-Leu-4-de-L-Pro-8-L-글루타민-이다.
테리파라티드는 골 재흡수 억제제 및 골다공증 치료 보조약으로서 사용되는,34 개 아미노산을 포함하는 단백질이다.
티말파신은 항신생물제로서, 간염 및 감염성 질병의 치료에, 및 백신 강화제로서 사용되는, 28 개 아미노산을 포함하는 티모신 α1(소)이다.
티모펜틴은 면역조절제로서 사용되는 펜타펩티드이다.
트리프토렐린은 항신생물제로서 사용되는, 10 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지), 6-D-Trp이다.
바프레오티드는 항신생물제로서 사용되며, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 8 개의 아미노산을 포함한다.
8-L-Arg- 또는 8-L-Lys-형태의 바소프레신은 항이뇨 호르몬으로서 사용되며, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 9 개의 아미노산을 포함한다.
생명 공학 산업의 연속적인 팽창 및 생명공학 연구 장비 및 방법의 사용은 훨씬 더 많고 다양한 유형의 단백질 기재 치료제들을 임상적으로 시험하게 만들었고 결국에는 시판하게 되었다. 예를 들어 하기의 단백질 약제들이 고려된다: 미오글로빈; 헤모글로빈; β-락토글로불린; 면역글로불린-G(lgG); 항혈우인자(인자 VIII); 리소자임; 유비퀴틴; 혈소판 활성 인자(PAF); 종양 괴사 인자-α(TNF-α); 종양 괴사 인자-β(TNF-β); 대식세포 염증성 단백질(MIP); 헤파린; 및 호산구 양이온 단백질(ECP). 또한, 최근에 승인된 단백질 기재 약물에는 혈소판 성장 인자; 재조합 인자 IX; 비-호즈킨 B-세포 병에 대한 단클론 항체; C형 간염의 치료에 유용한 개선된 인터페론 알파; 및 상처 및 화상의 치료를 위한 섬유아세포-유래된 인공 피부가 있다.
상기 개시된 축합 방법을 포함하여, 본 발명의 제조 방법에 사용되는 출발 물질 반응물의 구성을 상기에 상세히 개시하였지만, 이제 하기에 본 발명의 제조 방법 자체에 대한 상세한 설명을 개시할 것이다.
본 발명의 제조 방법은 본 원에서 정의된 신규의 개선된 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물을 제공한다. 상기 방법은 먼저 단백질 및 방향족 ο-하이드록시 알데하이드 출발 물질 반응물을 포함하는 반응 혼합물을 제조함을 포함한다. 상기 반응 혼합물은 단백질 성분 반응물과 방향족 ο-하이드록시 알데하이드 성분 반응물을 서로 수성 환경 하에서 긴밀히 접촉시켜 제조한다.
본 원에 사용된 "출발 물질 반응물", "성분 반응물" 및 "반응물"이란 표현은 쉬프 염기 축합 부가물을 형성하기 위해 반응하는 단백질과 방향족 ο-하이드록시 알데하이드 존재를 지칭한다.
"수성 환경 하에서"란 표현은 상기 반응 혼합물의 용매가 물이고 이 물이 반응이 일어나는 매질임을 가리킨다. 따라서 상기 반응 중에 형성되는 축합 수는 또한 상기 "수성 환경"과 구분될 수 없는 부분으로 된다.
본 발명의 제조 방법은 출발 물질 반응물을 함께 모아 반응 혼합물을 제조한 후에, 즉시 쉬프 염기 축합 반응을 진행한다. 본 원에 사용된 "쉬프 염기 축합 반응"이란 표현은 유기 화학 및 유기 화학 화합물의 합성 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있는 반응을 지칭한다. 기본적인 쉬프 염기 축합 반응을 하기와 같이 도식적으로 나타낼 수 있다:
반응식 1
상기 식에서,
는 단편적인 형태로 나타낸 단백질이며, 따라서 그의 하나 이상의 아미노산은 상기 단백질 단편에 결합된 것으로 나타낸 1 급 아민 그룹을 갖는다.
쉬프 염기 부가물의 형성은 또한 상기 부가물이 그의 구성 성분들로 분리될 수도 있는 평형 반응이며, 이러한 분해 반응의 속도는 초기에 상기 축합 부가물의 형성을 이끄는 기본 반응만큼 빠를 수도 있음을 유의해야 한다.
본 발명의 제조 방법의 축합 공정은 실질적으로 완료되게 된다. 본 원에 사용된 "실질적으로 완료되는"이란 표현은 상기 반응이 정량적인 것, 즉 전적으로 또는 거의 완료되도록 진행되는 것임을 의미한다. 본 발명의 제조 방법의 축합 반응은 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)함으로써 정량적으로 수행된다.
본 발명의 방법 실시태양과 관련하여 본 원에 사용된 "제조 방법"이란 용어는 쉬프 염기 축합 반응뿐만 아니라 상기 반응을 완료시키기 위해 취하는 공정 단계들을 포함함을 의미한다. 상기 전체 공정의 후자 부분은 반응 혼합물로부터 거의 모든 물을 제거함으로써 수행된다.
본 원에 개시된 제조 방법을 위해서, 상기 축합 반응을 실질적으로 완료시키는데 유효한 조건들에는 존재하는 물을 액상에서 기상 또는 고상으로 변화시켜 상기 축합 반응의 환경으로부터 상기 물을 제거하는 것이 포함된다. 본 발명의 방법에 서, 상기 조건들을 또한 규모 조절성, 즉 대규모의 생산에 용이하고 효율적으로 적합하게 만드는 능력, 및 재현성, 즉 최종 결과에서 실질적으로 벗어나지 않으면서 성공적으로 수행되는 능력으로 특성화시켜야 한다. 수성 용매 중의 반응 혼합물은 주변 온도 또는 물의 비등점 아래의 승온에서 성립된 것이기 때문에, 상기 존재하는 물은 당연히 액상일 것이다. 상기 반응을 완료시키기 위해서, 상기 반응 혼합물의 인접한 부분으로부터 물을 완전히 신속히 제거해야 한다. 이는 단순히 최종 축합 부가 생성물을 수성 용매로부터 분리시켜 상기 용매를 버림으로써 수행될 수는 없다. 상기 반응이 평형 반응이고, 침전되는 생성물이 형성되지 않는다는 사실은 이러한 접근 방법을 불가능하게 한다.
본 발명의 제조 방법이 취하는 2 가지 접근법이 있다. 하나의 접근법으로, 물을 증기나 기체로 바꾸어, 예를 들어 분무-건조에 의해 제거하는 것이며, 본 발명의 상기 실시태양은 0 ℃ 이상의 온도에서 수행되는 것으로서 언급하고 있다. 다른 접근법에서는, 물을 고체로 바꾸어, 예를 들어 동결건조에 의해 제거하며, 본 발명의 상기 실시태양은 0 ℃ 이하의 온도에서 수행되는 것으로 언급하고 있다.
본 발명의 제조 방법이 취한 첫 번째 접근법은 물을 액상에서 기상 또는 증기상으로 변화시킴으로써 제거하는 것이다. 이러한 단계는 대개 상당히 신속히 수행된다. 물이 액상에서 기상 또는 증기상으로 변하는 경우, 물의 기화가 수반된다. 결과적으로, 물의 기화 잠열(LHE)(물이 액체에서 증기 상태로 변할 때 상기 물의 단위 중량에 의해 흡수된 열 에너지의 양)을 만족시키기 위해서 상기 공정에 에너지의 투입이 필요할 것이다. 필요한 에너지의 양은 식: LHE=0.02T2/E(여기에서 T는 물의 열역학적 등급의 비등점이고, E는 용액 비등점의 분자 고도이다)으로부터 산출될 수 있다. 관련된 값은 기화 비 잠열(SLHV)로, 이는 물질 1 g을 온도 변화 없이 액체에서 증기로 전환시키는데 필요한 주울의 수이다. 100 ℃ 물에 대해 상기 값은 2257 J이다.
본 발명의 제조 방법이 수행되는 조건은, 축합 반응 자체에 의해 생성된 물을 포함하여 상기 축합 반응이 일어나는 수성 환경의 물을 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물로부터 가장 효율적으로 분리시키는데 필요한 상기 공정에 대한 에너지 투입을 최적화하는 것이다.
본 원에 사용된 "공정에 대한 에너지 투입"이란 표현은 모든 형태의 에너지를 개별 및 집합적으로 지칭하며, 본 발명의 제조 방법에서 이를 사용하여 수성 환경의 물을 액상에서 증기 상 또는 고체 상으로 변화시키는 것을 의미한다. 여기에는 먼저 물 1 g을 0 ℃에서 1 ℃로 상승시키는데 필요한 열 에너지의 양인 원자 열이 포함된다. 관련된 개념으로 분자 열이 있으며, 이는 물 1 몰을 1 ℃ 상승시키는데 필요한 열 에너지의 양, 즉 비열 X 분자량이다. 이러한 열 에너지의 투입은 반응 혼합물 및 그의 수성 환경을 목적하는 온도로 상승시킬 것이다.
열 에너지의 다음 투입은 상기 논의에서 상세히 개시되었던 기화 열을 만족시키는데 필요한 것이다. 그 후에, 물을 완전히 기화시키는 분무-건조 단계를 수행하기 위해서 역학적 에너지가 수성 환경 중의 반응 혼합물에 가해져야 한다. 따라서, 0 ℃ 이상의 온도에서, 상기 공정에 대한 에너지 투입을 최적화하는 조건은 (a) 단백질인 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 최고 온도로 가열하는 것을 포함한다.
본 원에 사용된 "단백질인 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성"이란 표현은 사용될 수 있는 온도의 상한선과 관련하여 상기 출발 물질 및/또는 생성물의 단백질 성분에, 상기와 같은 가열의 결과로서 임의의 현저한 분해, 즉 임의의 생물 활성의 손실을 일으키거나 또는 방출, 특히 투여 부위로부터, 예를 들어 고체 펠렛의 피하 또는 비경구 저장소로서 최종 생성물의 지속적인 방출을 방해할 수 있는 변성이 필수적으로 가해지지 않음을 의미한다.
축합 반응을 포함하여 본 발명의 제조 방법을 수행하는데 기준이 되는 "최적의 효율성 및 경제성"이란 표현은 반응 혼합물의 온도 및 본 원에 개시된 다수의 다른 공정 변수들을 선택할 때 상기 공정을 가능한한 가장 효율적인 방식을 얻는 관점으로 수행할뿐만 아니라 최종 생성물을 다른 선택들과 일관되게 최저의 비용으로 제공하는 공정을 수행하는 것은 당연히 고려되어야 함을 의미한다. 따라서, 최종 생성물의 최고의 수율을 제공하는 공정 변수들의 선택은 오직 상기 공정의 다른 효율들이 품질 면에서 알맞은 것인가를 고집하는 것이며, 오직 생성 공정이 최상의 경제성을 얻을 수 있는 것인가를 고집하는 것이다. 도처의 모든 최선의 공정들을 성취하기 위해서 이들 요건들의 균형을 잡는 것은 숙련가의 기술 내에 있다.
따라서, 상기 고려사항 모두의 영향을 고려하여, 전형적으로는 상기 반응 혼합물을 경우에 따라 승압 하에서 액체 상중의 수성 환경을 유지시키면서, 25 내지 125 ℃, 바람직하게는 40 내지 120 ℃, 보다 바람직하게는 50 내지 115 ℃, 보다 더 바람직하게는 60 내지 110 ℃, 가장 바람직하게는 75 내지 105 ℃의 온도로 가열한다. 수성 환경을 여전히 액상으로 유지시키면서 물의 주변 비등점, 즉 100 ℃ 이상의 온도를 획득하는 것은 승압의 사용을 통해 수행될 수 있다.
상기 온도가 0 ℃ 이상인 제조 방법에서 다음 단계는 (b) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기 수성 환경 하의 상기 반응 혼합물을 최소의 소적으로 세분화시키는 것을 포함한다.
상기 단계와 관련하여, 단백질의 완전성을 유지하는 것은 상기 단백질의 크기에 어느 정도 의존될 것이다. 따라서, 매우 큰 단백질은 상기 단계에 유용한 평균 직경을 갖는 소적으로 변경시킬 수 있다. 그러나, 전형적으로는 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 1.0 ㎛ 내지 5.0 ㎜, 바람직하게는 10 ㎛ 내지 1.0 ㎜,보다 바람직하게는 100 ㎛ 내지 900 ㎛, 보다 더 바람직하게는 200 ㎛ 내지 800 ㎛, 가장 바람직하게는 300 ㎛ 내지 700 ㎛의 평균 직경을 갖는 소적으로 분할시킨다.
본 발명의 제조 방법은 상기 출발 물질 반응물을 소적 형태로 서로 긴밀히 접촉시키는 실시태양, 즉 최종 축합 부가 생성물이 소적 형태로 분산되기 직전에 또는 이와 거의 동시에 형성되는 실시태양을 포함한다. 이러한 소적 형태의 상기 출발 물질 반응물의 긴밀한 혼합은 상기 축합 부가물의 단백질 성분을 기계적으로 분해시키지 않으면서 동시에 상기 출발 물질 반응물을 서로 접촉시키기에 충분한 기계 작용에 의해 성취된다. 특정한 기계적 혼합 장치의 선택은 고려되어야 하는 다양한 변수들에 대한 본 원의 설명을 보충하여 숙련가의 기술 범위내에 있다.
가장 중요한 인자들 중 하나는 함유된 단백질 성분의 성질 및 상기 단백질이 구조적 완전성의 분해를 경험하기 전에 수용액 중에서 견딜 수 있는 전단 응력의 크기이다. 이는 사용되는 단백질의 상기 완전성에 대한 선택된 기계 혼합 장치의 영향(존재하는 경우)을 측정하기 위한 전기영동과 같은 구조적 완전성의 통상적인 시험을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 이러한 통상적인 시험은 주어진 단백질의 수용액 중의 기계적 전단 응력에 대한 내성이 대체로 구조 안정성의 요소를 부여할 수 있는 중복 접철을 겪는 보다 큰 펩티드의 용량으로 인해 전적으로 예견될 수 없기 때문에 필요할 수 있다. 다른 한편으로, 서서히 작용하는 기계 혼합 장치를 선택함으로써 애초에 문제점들을 피할 수도 있다. 상기 장치를 현저한 수준의 용액 중의 전단 응력을 피하고자 하는 관점으로 선택하면 상기 언급한 시험 중 어떤것도 사용할 필요가 없을 것이다.
다수의 적합한 기계적 혼합 장치는 그 자체가 숙련가에게 쉽게 제시될 수 있다. 예를 들어 혼합 용기는 고정된 것일 수 있으며, 봉, 패들 또는 부드러운 교반을 통해 혼합을 수행하는 다른 유형의 교반기와 같은 요소들의 회전 또는 다른 유형의 동작을 이용할 수도 있다. 축합 공정을 연속적으로 수행할 것이 요구되는 경우, 혼합 장치는 출발 물질 반응물이 한쪽 끝에서 유입되고 반응 혼합물 및 최종 축합 부가 생성물은 다른 쪽 끝에서 방출되는 수반의 형태를 취할 수도 있다. 이러한 장치에서의 교반은 용액 중에서 작동하고 최종 생성물을 가열 표면 위로 들어올려 이를 상기 용액을 통해 분배시키고 이를 상기 수반을 통해 서서히 운반하는 느린 이동식 웜을 사용하여 성취될 수 있다. 상기 수반에서의 용액의 체류 시간을 증가시키는 배플과 함께 전체 수반의 흔들림을 또한 사용할 수도 있다. 이들 두 가지 유형의 혼합 장치는 모두 낮은 열 전달 계수를 특징으로 하며, 반응 혼합물이 중심 파이프에 있고 파이프 들 사이의 환에 역류의 가열 매질이 흐르는 이중-파이프 장치를 사용하여 보다 빠른 열 교환을 성취할 수도 있다. 이러한 유형의 장치에서 교반은 종종 중심 파이프에서 회전하고 열 전달 표면을 긁는 블레이드를 가져서 높은 열 전달 계수가 얻어지는 샤프트의 사용에 의해 성취된다.
혼합 장치는 예를 들어 교반식 반응 용기와 같이 디자인이 보다 수동적일 수 있으며 열 전달을 이용하지 않을 수 있다. 보다 대규모의 생산 수준에 대해서, 가열을 위해 캘린더를 사용할 수 있고, 반응 혼합물의 흐름을 수용하기에 충분히 크고, 통상적으로는 바퀴날개가 있으며, 반응 혼합물로의 열 전달을 증가시키는 강제 순환되는 다운커머가 사용될 수 있다. 최종 생성물의 철저한 조절이 중요한 연속 공정을 반응 혼합물을 농축시키는 혼합 장치를 사용하여 수행할 수도 있다. 진공 반응기 용기에서, 전형적으로는 고온의 농축된 반응 혼합물이 저압에서 유지된 교반식 반응 챔버내로 공급될 것이다. 반응 혼합물은 상기 용기의 작동 압력에 상응하는 비등점으로 단열 비등 및 냉각될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합할 수 있는 혼합 장치의 또 다른 유형은 예를 들어 성분들의 긴밀한 혼합을 보장하기 위해서 스트림에 충분한 와동을 유발시키는 수력 펌프에 의해 생성된 반응 혼합물의 스트림을 사용한다. 상기 선택된 기계 작용은 또한 각각의 출발 물질 반응물이 서로에 대해 소적의 최대 혼합, 충돌 및 접촉을 획득하는 방식으로 향하는 분리된 분무의 형태를 취할 수도 있다. 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하는데 필요한, 상기 출발 물질 반응물을 함유하는 수성 스트림을 상기 개시된 크기 범위 이내의 소적으로 분할하는데 필요한 에너지를 부여하기에 충분한 단순한 기계적 또는 수력 펌핑 수단을 포함하는 분무 장치를 상기 공정에 사용할 수도 있다.
상기 개시된 펌핑 수단을 노즐 수단과 함께 사용하여 기계적 전단력을 상기출발 물질 반응물의 수성 스트림에 가한 결과, 상기 스트림을 목적하는 소적 크기가 얻어질 때까지 연속적으로 보다 작은 소적 부피로 분할시킬 수 있다.
목적하는 소적 크기를 갖는 소적 형태로 비말 동반되도록, 함유된 출발 물질 반응물의 수성 스트림을 분산시키는 수단 및 기체 스트림 발생기를 포함하는 분무 장치를 또한 본 발명의 제조 공정에 사용할 수 있다. 특히, 상기 기체는 상기 출발 물질 반응물 및 상기 최종 축합 부가 생성물에 대해서 실질적으로 불활성이며, 상기 출발 물질 반응물의 소적들을 비말 동반하고, 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)를 제거하는데 충분한 최대 혼합, 접촉 및 충돌을 보장하는데 필요한 부피 및 속도를 갖는 기체 스트림을 제공하기에 충분히 높은 압력으로 압축된, 다른 것들 중에서도 특히 공기, 질소 또는 헬륨을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 분무 장치는 상기 개시된 기계 또는 수력 펌핑 수단 및 결합된 노즐 수단과 함께 상기 개시된 기체 스트림 발생기 및 결합된 분산 수단의 임의의 적합한 조합을 포함한다. 반응 혼합물을 포함하는 수성 환경의 온도를 물의 통상적인 비등점, 즉 100 ℃ 이상에서 유지시켜야 하는 경우, 이는 상기 시스템을 승압 하에서 유지시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 승압은 상기시스템 중의 물의 비등점을 예견가능한 방식으로 상승시킬 것이다. 또한, 일단 반응 혼합물 및 수성 시스템이 분무 장치에 의해 미세한 소적으로 방출되면, 상기 소적의 온도가 즉각적이고 현저하게 떨어질 것은 물론이다. 예를 들어, 상기 분무 장치의 유입구 부분에서 상기 반응 혼합물 및 수성 환경의 온도를 승압을 사용하여 115 ℃의 온도로 유지시킬 수 있으며, 일단 반응 혼합물 및 수성 시스템이 상기 분무 장치의 노즐 수단을 떠나면, 그의 온도는 80 ℃로 떨어지는 게 관찰될 것이다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 소적 형태의 상기 출발 물질 반응물들의 긴밀한 혼합이 상기 각 반응 출발 물질을 포함하는 수성 스트림이 향하는 표면 위에서 고속으로 회전하는 원반 형태의 기계적 작용에 의해 성취된다. 각각의 출발 물질 반응물에 대해 별도의 원반을 사용하거나, 또는 달리 상기 출발 물질 반응물 수성 스트림들을 모두 수용하는 방식의 단일 원반을 사용할 수도 있다. 상기 각각의 수성 스트림은 소적 형태로 상기 원반의 테두리로부터 추진되는 방식으로 상기 원반을 횡단하며; 상기 원반의 회전 속도는 상기 소적의 최대 혼합, 충돌 및 접촉이 성취되는 크기 및 속도를 갖는 소적으로 상기 각 수성 스트림을 분할시키기에 충분한 에너지를 부여하기 위해서 가변적이다.
상기 출발 물질 반응물들의 혼합은 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉상기 최종 축합부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기 위해서 온도, 습도 및 압력과 관련하여 조절된 조건 하에서 일어난다. 예를 들어 상기 온도는 일반적으로 상기 개시된 범위 내에 들어있을 것이며, 전형적으로는 상기 반응 혼합물을 경우에 따라 승압 하에서 액체 상중의 수성 환경을 유지시키면서, 25 내지 125 ℃, 바람직하게는 40 내지 120 ℃, 보다 바람직하게는 50 내지 115 ℃, 보다 더 바람직하게는 60 내지 110 ℃, 가장 바람직하게는 75 내지 105 ℃의 온도로 가열한다.
회전 원반은 비록 전형적인 장치는 아니지만 예를 들어 진공 펌핑 수단을 사용함으로써 감압을 유지시키는 것이 가능한 장치내에 수용될 수 있다. 이러한 승압은 상기 논의된 바와 같이 반응 혼합물 및 수성 시스템의 비등점을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 회전 원반 문무기의 예로 니로 아토마이저(Niro Atomizer of Denmark)로부터 입수할 수 있는 니로 이동식 분무 건조기가 있다. 이 장치는 원통 높이 600 ㎜ 및 직경 800 ㎜의 챔버를 가지며, 원뿔형 기부는 60°각도의 원뿔도를 갖는다. 대기압에서 작동될 때, 상기 원반의 속도는 35,000 내지 40,000 rpm의 범위일 것이며, 건조 공기의 유속은 80 ㎏/시간일 것이다.
반응 혼합물 및 수성 환경의 상기 개시된 가열과, 상기 혼합물을 작은 소적으로 분리시키는 동안 상기에 부여된 기계 에너지와의 조합은 함유된 물 분자가 기상 또는 증기 상으로 가도록 충분하게 에너지화될 것이다. 물을 반응 혼합물 및 수성 환경으로부터 제거하는 것을 더욱 용이하게 하기 위해서, 기화된 물을 운반하는 공기 스트림을 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 이동하는 공기 스트림으로부터의 에너지 투입은 물의 기화를 향상시키며, 일반적으로는 공기 스트림의 속도가 높을수록 기화의 강화도 커진다. 기화의 강화는 승온, 예를 들어 75 내지 150 ℃, 바람직하게는 90 내지 110 ℃의 공기 스트림의 사용에 의해 더욱 개선된다. 가열된 공기는 기화 공정에 추가의 에너지를 부여한다. 물의 기화는 건조한, 즉 습도가 낮아 가열된 공기 스트림이 추가량의 수증기를 함유하는 능력이 개선되는 가열된 공기 스트림을 사용함으로써 더욱 향상된다. 가열된 공기 스트림의 습도는 바람직하게는 1% 내지 20%의 상대 습도, 바람직하게는 2% 내지 10%의 상대 습도이다.
따라서, 본 발명의 제조 방법의 마지막 단계는 (c) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 상기 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기와 같이 형성된 상기 소적들에, 통과하는 것에 대해 불활성인 기체를 기준으로 최고의 상대 속도를 제공함을 포함한다.
반응 혼합물 및 수성 환경의 소적뿐만 아니라 형성된 최종 축합 부가 생성물의 소적 모두에 대해서 언급된 "통과하는 것에 대해 불활성인 기체"란 표현은 상기 최종 생성물에 대해 불활성인 임의의 기체를 의미한다. 질소 및 헬륨과 같은 통상의 기체가 쉽게 입수될 수 있고 이들 환경하에서 불활성이므로 사용가능하다. 그러나, 실제적인 문제로서, 주변 공기보다 더 적합한 불활성 기체를 찾는 것은 통상적으로 어려울 것이다. 공기가 또한 가장 본 발명의 제조 방법을 수행하는데 최적으로 효율적이고 경제적일 듯하다.
상기 소적에 가해지는 상대 속도는 0.1 내지 5.0 ㎧, 바람직하게는 0.2 내지 4.0 ㎧, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3.0 ㎧, 보다 더 바람직하게는 0.4 내지 2.0 ㎧, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1.0 ㎧이다. 이러한 속도는 상기 소적의 스트림에 대해 대향되거나, 가로지르거나, 또는 임의의 각으로 흐를 수 있는 불활성 기체 스트림의 상대 속도를 고려한 것이다.
상기 공정에 따라, 상기 수성 환경 하의 반응 혼합물을 1.0 ㎛ 내지 5.0 ㎜, 바람직하게는 10 ㎛ 내지 1.0 ㎜, 보다 바람직하게는 100 ㎛ 내지 900 ㎛, 보다 더 바람직하게는 200 ㎛ 내지 800 ㎛, 가장 바람직하게는 300 ㎛ 내지 700 ㎛의 평균 직경을 갖는 소적으로 분할시킬 수 있다. 소적이 작을수록, 반응 혼합물 및 수성 환경으로부터의 물의 기화 및 제거가 더 효율적일 것임은 물론이다. 이는 주로 물 분자가 액상에서 증기 상으로 이동하여 주변의 불활성 기체 스트림에 의해 운반될 수 있는 상기 물 분자에 대해 이용할 수 있는 크게 팽창된 표면적에 기인한다.
수 제거 속도를 가속화시키기 위해서 상기 축합 공정들을 수분이 감소된 조건 하에서 수행하는 것도 또한 가능하다. 이는 축합 반응의 완료를 지원할 것이며, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양의 상기 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 0.001 중량%, 바람직하게는 2.0 내지 3.0 중량%이라는 것과 일치한다. 그러나, 소성에 내성이고 개선된 안정성 및 다른 취급 특성을 갖는 보다 건조한 최종 생성물을 제공하기 위해서 추가량의 수분을 추가로 제거하는 것도 또한 가능하다. 따라서, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 최종 생성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 0.001 중량% 또는 0.05 내지 0.005% 정도로 낮거나, 심지어는 0.03 내지 0.01% 정도로 낮을 수 있다. 다른 한편으로 최종 생성물 중에는 실질적으로 보다 많은 양의 수분이 존재할 필요가 있을 수도 있음에 주의해야 하는데, 그 이유는 많은 단백질들이 상기 생성물이 완전히 탈수된다면 불안정성을 나타내기 때문이다. 최종 생성물의 완전성을 유지하는 목적과 일관되게, 최종 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 5.0 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 8.0 내지 12.0 중량%의 범위일 수 있다.
상기에 추가로 언급한 바와 같이, 본 발명의 제조 방법이 취하는 2 가지 접근법이 있다. 하나의 접근법으로, 물을 증기나 기체로 바꾸어 예를 들어 분무-건조에 의해 제거하는 것이며, 본 발명의 상기 실시태양을 0 ℃ 이상의 온도에서 수행되는 것으로서 언급하고 있다. 다른 접근법에서는, 물을 고체로 바꾸어 예를 들어 동결건조에 의해 제거하며, 본 발명의 상기 실시태양을 0 ℃ 이하의 온도에서 수행되는 것으로 언급하고 있다.
본 발명의 제조 방법에서 취하는 두 번째 접근법은 물을 액상에서 고체 상으로 변화시킴으로써 상기 물을 제거하는 것이다. 이러한 단계는 대개 증기상으로의 전환 단계에서처럼 신속하게 수행되지 않는다. 물이 액상에서 고체 상으로 변하는 경우, 물의 결빙이 수반되며, 이는 반응 혼합물의 수성 환경으로부터의 에너지의 제거를 필수적으로 요구한다. 그러나, 상기 수성 환경으로부터 에너지를 제거하기 위해서, 즉 온도를 낮추어 궁극적으로는 물을 고체 상으로 변화시키기 위해서는 본 발명의 제조 방법에 에너지를 사용하는 것이 필요할 것이다. 예를 들어,이는 냉동 또는 급속 열 교환 시스템의 사용 및 이를 수성 환경과 접촉시키는 것을 포함할 것이다. 결과적으로, 함유된 물의 주어진 단위 중량에 대해 그의 온도를 감소시키고 궁극적으로는 고체 상으로 변화시키기에 충분한 열 에너지를 제거하기 위해서 상기 제조 방법에 에너지를 투입하는 것이 필요할 것이다.
상기 개시된 상기 제조 방법의 수성 환경으로부터 열 에너지를 제거하는 한가지 방법은 반응 혼합물을 포함한 상기 수성 환경의 동결 건조에 의한 것이다. 본 발명에 따라서, 상기와 같은 동결 건조 공정은 수성 환경을 고체상태로, 즉 냉동된 상태로 유지시키면서 상기 반응 혼합물을 -110 내지 0 ℃, 바람직하게는 -45 내지 -5 ℃, 보다 바람직하게는 -40 내지 -10 ℃, 보다 더 바람직하게는 -35 내지 -15 ℃, 가장 바람직하게는 -30 내지 -20 ℃로 냉각시키는 방식으로 수행될 것이다. 상기 건조 공정은 필수적으로 수성 용매를 먼저 동결시키고 이어서 상기를 진공 환경 하에서 승화에 의해 제거하는 것이다.
수 제거 속도를 증가시키기 위해서 상기 수성 환경 하의 상기 냉각된 반응 혼합물에 가해지는 감압은 5.0 내지 0.0001 mmHg(절대), 바람직하게는 1.0 내지 0.0005 mmHg(절대), 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.001 mmHg(절대), 보다 더 바람직하게는 0.2 내지 0.005 mmHg(절대), 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.01 mmHg(절대)이다. 이러한 감압은 다양한 용량 및 공지된 구조를 갖는 진공 펌프를 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 고려된 유형의 동결 건조 공정을 수행하는 통상적인 방식에서, 반응 혼합물 수용액을 바이알과 같은 적합한 용기에 충전시킨 다음 큰 건조 챔버와같은 온도-조절된 환경하에 둔다. 함유된 최종 축합 부가 생성물은 최종적으로 인간 및 동물의 질병 및 질병 상태의 치료에 사용될 것이다. 따라서, 이러한 생성물들을 바이알과 같은 작은 배치들로 수거하는게 유효한데, 그 이유는 이들이 개별적으로 동결 건조를 수행에 적합한 부피 대 표면 비율을 제공하며 다수의 바이알을 한번에 가공할 수 있기 때문이다.
이어서 상기 건조 챔버의 온도를 약 -40 ℃로 만들어 유지시키며, 그 후에 반응 혼합물 수용액은 급속히 얼음과 고체 용질로 이루어진 고체, 즉 최종 축합 부가 생성물로 된다. 함유된 최종 생성물 및 수행되는 동결 건조 공정의 성질에 따라, 상기 얼음은 결정화되고 용질은 결정화되거나 유리질 용질로된다. 이어서 상기 건조 챔버를 진공 펌프를 사용하여 배기시키고, 건조 챔버의 온도를 증가시켜 동결 건조의 증기 단계로의 얼음의 승화를 개시시킨다(종종 1 차 건조 단계라 칭한다). 승화에 의해 생성된 수 증기는 약 -60 ℃의 훨씬 낮은 온도(여기에서 상기 증기는 응축되어 제거된다)에서 유지된 표면이 있는 응축기 챔버로 가는 도중에 부분 건조된 축합 부가물을 통해 운반된다. 축합 부가 생성물의 온도가 증가함에 따라 1 차 건조 속도가 증가하지만, 생성물의 완전성을 유지하기 위해서는 최대 온도가 초과되지 않도록 주의해야 한다.
1 차 건조 단계는 초기 축합 부가 생성물 중의 얼음을 모두 제거한다. 그러나, 상기 생성물의 비결정성 부분 중에 용해된 상태로 함유된, 상기 생성물 중의 수분의 양은 상기 생성물의 조성에 따라 약 20 내지 약 50 중량% 정도로 여전히 상당하다. 이러한 잔류 수의 제거는 2 차 건조 단계 동안 수행되며, 이는 전형적으로 승온된 생성물 온도에서 수행된다. 그러나, 이 온도는 본 원에 개시된 본 발명의 건조 분무 공정에 사용된 온도만큼 높지 않다. 통상적으로, 본 발명의 분무 건조 공정 보다는 동결 건조 공정을 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 저온인 동결 건조 공정이 보다 단백질 함유 최종 생성물에 대해 어떠한 파괴 효과도 가하지 않을 것 같기 때문이다. 동결 건조 공정은 또한 세균과 미립자 오염의 방지를 보다 쉽게 얻을 수 있게 한다는 이점을 갖는다. 다른 한편으로, 동결 건조 공정은 분무 건조 공정 보다 제작에 보다 많은 자본의 설비 비용과 보다 많은 에너지 소비 비용을 수반하는 단점이 있다. 그러나, 상기 공정들 중 어느 유형의 공정에 대해서도, 최종 생성물의 단백질 성질은 최종 생성물 중에서 형태적 안정성을 유지하는데 상당한 모험이 발생한다.
상기 언급한 축합 부가물의 비결정성 상은 결정화되지 않은 생성물 용질과 결정화되지 않은 물을 포함한다. 실제적인 문제로서, 물은 평형점에서 얼음으로 결정화되지 않으나, 상기가 핵을 형성하고 결정화되기 전에 상기 물을 상기 평형점 보다 10 내지 15 ℃ 아래로 과 냉각시켜야 한다. 필요한 과 냉각의 정도는 용질의 구성 및 건조 챔버의 온도 및 체류 시간뿐만 아니라 바이알 용기의 크기 및 물질 구성에 의해서, 및 얼음 형성을 위한 이종 핵 형성 부위를 제공할 수 있는 축합 부가물 수용액 중의 임의의 미립자 물질의 존재에 의해서 지시된다. 이 점에 있어서 규모 확대의 문제가, 축합 부가 생성물로 대부분 이루어지는 동물 및 인간의 치료제 생산과 관련된 제작 장소의 멸균된 미립자 비 함유 환경에 의해 발생된다. 이러한 환경은 미립자 핵 형성 부위의 기회를 제한하여 부가 생성물의 보다 큰 과냉각 정도가 필요하게 되며, 이는 차례로 형성된 얼음 결정의 크기를 조절한다. 얼음 결정 크기는 상기에 의해 승화 도중 얼음 결정 중에 생성되는 공극 또는 채널의 크기가 조절되며, 이는 승화 공정 중에 이용할 수 있는 이들 공극의 표면적에 영향을 미치기 때문에 중요하다.
궁극적으로, 승화 속도뿐만 아니라 2 차 건조 속도는 이러한 인자들에 의해 현저한 영향을 받는다. 과 냉각에서 10 ℃의 증가는 1 차 건조 시간의 큰 증가 정도를 도출시킬 수 있다. 과 냉각 정도는 10에서 15 ℃로 제한해야 하며 건조 챔버 전체를 통해서 및 바이알에서 바이알 전체를 통해 균일해야 한다.
균일한 정도의 과 냉각 및 동결 양상을 얻는 것이 목적인 최적의 결과를 제공하도록 선택된 건조 챔버 온도 및 체류 시간 변수들은 먼저 축합 부가 생성물 전부를 0 ℃ 아래, 그러나 핵 형성 및 결정화를 일으키는 온도보다 높은 온도인 약 -5 내지 -10 ℃로 냉각시키는 것을 포함한다. 결과적으로, 건조 챔버 온도를 적합한 수준, 약 -20 내지 -30 ℃로 낮추어 모든 바이알 용기의 얼음 결정화를 유도한다. 상기가 일어난 후에, 건조 챔버 온도를 또한 용질이 결정화되는 최저 융해 온도 아래, 또는 용질이 비결정성인 유리-전이 온도 아래, 즉 -40 ℃로 낮춘다. 일단 상기 융해 시스템이 결정화되면, 이는 완전하게 고체이며 이어서 1 차 건조를 수행할 수 있다.
용질 시스템이 비결정성으로 남으려는 경향이 있는 경우, 축합 부가 생성물 온도를 상기 용질의 결정화가 허용되도록 수 시간 동안 유리 전이 온도보다 최소한 몇도 높게 증가시키고, 그 후에 건조 챔버의 온도를 1 차 건조가 시작되기 전에 다시 낮추는 템퍼링 또는 어닐링 공정을 사용할 수도 있다. 상기 공정 동안의 얼음 형성은, 예를 들어 축합 부가 생성물이 온화한 염수 용액에 용해된 경우를 포함하여, 용해된 염을 포함하는 모든 용질의 농축을 유발시킴을 또한 유의해야 한다. 그 결과 최종적으로 상기 생성물의 분해를 일으킬 수도 있는 NaCl의 농도가 증가될 것이다.
1 차 건조 단계를 생성물 분해를 방지하기 위해서 가능한 한 최고의 온도 보다는 최대의 허용가능한 온도에서 수행한다. 이 온도는 용질이 결정성인 융해 온도 및 용질이 비 결정성인 와해 온도 또는 융해 용융 온도일 것이다. 상기 최대의 허용가능한 온도 이상에서의 건조는 명확한 기하학이 결여된 허용되지 않는 생성물이 생성된다. 생성물 대 온도의 열-분석 방법, 전기 저항 측정 또는 현미경 분석에 의해 쉽게 측정될 수 있는 상기 최대의 허용가능한 온도를 상당한 범위에 걸쳐 변화시킬 수 있으며 동결 건조 공정 변수들을 정하는 첫 번째 단계로서 측정해야 한다.
상기 개시된 제조 방법들을 또한 감소된 수분 조건하에서 수행할 수도 있으며, 상기 의해 수 제거 속도가 가속화되며 전체적인 제거량이 증가된다. 이는 상기 축합 반응 도중 생성되거나 또는 이미 존재하는 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)함으로써 축합 반응을 완료시키는 목적과 일치한다.
상기 목적과 일관되게, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 상응하게 상기 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 0.001 중량%, 바람직하게는 2.0 내지 3.0 중량%일 것이다. 그러나, 상기 축합 반응을 완료한 후에, 소성을 방지하고, 안정성을 향상시키고, 취급을 개선시키기 위해서, 또는 숙련가에게 명백한 다른 목적들을 위해서 요구되는 추가량의 수분을 또한 최종 생성물로부터 추가로 제거할 수도 있다. 따라서, 최종 축합 부가 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 최종 생성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 0.001 중량%, 또는 0.05 내지 0.005 중량% 정도로 낮거나, 또는 0.03 내지 0.01 중량% 정도로 훨씬 낮을 수도 있다.
그러나, 최종 축합 부가 생성물, 특히 그의 단백질 성분의 성질에 따라, 최종 생성물 중에는 실질적으로 보다 많은 양의 수분이 존재할 필요가 있을 수 있는데, 그 이유는 많은 단백질들이 상기 생성물이 완전히 탈수된다면 불안정성을 나타내기 때문이다. 따라서, 최종 생성물의 완전성을 유지하는 목적과 일관되게, 최종 생성물 중에 존재하는 수분의 양은 최종 생성물의 중량을 기준으로 3.0 내지 20.0 중량%, 바람직하게는 5.0 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 8.0 내지 12.0 중량%의 범위일 수 있다.
하기 실시예들을 본 발명의 신규한 방법 및 생성물을 추가로 예시하기 위해서 나타내지만, 이들이 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
동결 건조에 의해 제조된 Met-pST와 다른 알데하이드와의 축합 부가물
ο-바닐린의 2.50 mM 용액을 증류수 200 ㎖ 중의 ο-바닐린 76.1 ㎎을 용해시켜 제조하였다. 알데하이드를 완전히 용해시키는데는 최소의 가열과 초음파 처리가 필요하였다. 바닐린, 살리실알데하이드 및 벤즈알데하이드(모두 2.50 mM)의 수용액을 유사한 방식으로 제조하였다. 건조한 동결건조된 met-pST(21.9 ㎎, 21858 g/m, 1.00 μ몰)를 실온에서 각각의 알데하이드 용액 2.00 ㎖에 용해시켰다. pH를 묽은 수산화 나트륨 용액(pH를 하향 조절하는 것이 필요한 경우에는 묽은 아세트산을 사용하였다)을 사용하여 8.0으로 조절하였다. 최종 용액은 단백질 1.00 μ몰과 알데하이드 5.00 μ몰을 함유하였다. 상기 용액을 실온에서 1 시간 동안 정치시킨 후에, 20 ㎖의 동결 건조 플라스크에 넣고 16 시간 동안 -28 ℃의 동결기에서 동결시켰다. 이어서 동결된 샘플을 다기관 유형의 동결 건조기에 넣고 상기 플라스크를 배기시켰다. 압력을 <1.00 mm에서 24 시간 동안 유지시켰다. 이어서 상기 플라스크를 다시 대기압으로 올려놓고 회수된 물질의 중량을 측정하였다. 각각의 경우에 측정된 중량은 알데하이드와 단백질 출발 물질을 합한 중량을 기준으로 실험 오차 범위 이내에 있었다. 상기 반응 규모에서 어떠한 알데하이드의 손실도 측정되지 않았다. 역상 HPLC 분석은 단지 met-pST 단량체와 적합한 알데하이드에 대한 피이크들만을 >95%의 단량체 회수율로 나타냈다. 전기분무 질량 분광 분석법을 또한 각 샘플에 대해 실행하였다. 전기분무 샘플을 2-메톡시에탄올 중의 0.1% 트리플루오로아세트산 용액(∼0.1 ㎎/㎖)에 초음파처리에 의해 용해시켰다. 상기 용액을 보다 장기간 동안 정치시키면 상기 물질의 부분적인 가수분해가 발생함을 지적하는 대조용 실험에 따라, 상기 샘플을 분석 5 분 전에 제조하였다.
상기 개시된 제조 방법은 본 발명의 범위 내에 있는 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물뿐만 아니라, 방향족 ο-하이드록시 알데하이드 이외의 것을 사용하여 제조하였기 때문에 본 발명의 범위 내에 있지 않은 부가물 모두를 나타낸다. 하기 표 1-A는 각 시험 샘플의 제조방법을 요약한다. 하기 표 1-B는 쉬프 염기 부가물 형성의 완료에 대해 예견된 단백질에 대한 알데하이드의 당량 수를 포함하여, 상기 샘플 각각에 대한 분석을 나타낸다. 각 샘플에 대한 수율%을 상기 개시된 것을 기준으로 측정한다. 동결 건조 공정에 대한 수율 중량%는, 물질의 유일한 손실이 승화된 알데하이드로부터의 것이고 이는 비 ο-하이드록시 알데하이드를 사용한 경우, 및 심지어는 상기 손실이 측정하기에 너무 작은 경우에만 해당되기 때문에 모든 알데하이드 및 단백질 출발 물질에 대한 실험 오차 범위 내에서 항상 정량적이다. 쉬프 염기의 수율%는 최종 생성물의 질량과 동일하며, 이는 항상 바로 앞에서 언급한 이유로 이론치의 100%이다(X 전환 수율). 차례로, 전환 수율은 전기 분무 질량 분광측정법에 의해 측정된 알데하이드의 실제적인 평균 당량수를 취하여 이를 이론치를 근거로 예견된 당량수로 나누고, 여기에, 전환 수율을 백분율로 나타내기 위해서, 100을 곱하여 얻는다. 이에 의해 얻어진 값들은 본 발명의 제조 방법을 사용하여 수득된 쉬프 염기로의 전환 효율을 추가로 나타낸다.
최종적으로, 높은 수율을 얻기 위해서는 pH를 7.0 이상에서 유지시켜야 하는 중요성을 입증하기 위해서 관련된 시험 공정을 수행하기 전에 각 샘플의 pH를 측정하였다.
0 ℃ 이상의 온도에서 수행된 본 발명의 제조 방법을 하기 실시예에 예시한다.
실시예 2
분무 건조에 의해 제조된 Met-pST와 ο-바닐린과의 축합 부가물
건조한 동결건조된 met-pST(45.7 μ몰) 샘플 1.00 g을 증류수 100.0 ㎖에 용해시켰다. 상기 용액에 ο-바닐린(34.8 ㎎, 228.5 밀리몰, 5.00 당량)을 가하였다. 상기 ο-바닐린을 40 ℃에서 1 시간 동안 교반하여 용해시켰다. 이어서 pH를 0.1 N 수산화 나트륨 용액으로 7.50으로 조절하였다. 상기 샘플을 2.0 ㎖/분의 속도로 부치(Buchi) 모델 190 소형 분무 건조기에 공급하였다. 흡입기를 -25 밀리바에서 고정시켰으며, 샘플 입구 온도는 110 ℃였고 샘플 출구 온도는 75 ℃였다. 생성물을 사이클론 수거기에서 수거하고, 역상 HPLC 및 전기분무 질량 분광측정법에 의해 분석하였다.
상기 개시된 제조 방법들은 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물이 본 발명의 범위 내에 있음을 나타내는데, 왜냐하면 상기 생성물들은 모두 방향족 ο-하이드록시 알데하이드인 ο-바닐린을 사용하여 제조되었기 때문이다. 다른 알데하이드에 유사한 조건들을 사용하였다. 하기 표 2-A는 각각의 시험 샘플의 제조방법을 요약한다. 하기 표 2-B는 쉬프 염기 부가물 형성의 완료에 대해 예견된 단백질에 대한 알데하이드의 당량 수를 포함하여, 상기 샘플 각각에 대한 분석을 나타낸다. 분무 건조 건조 공정에 대한 수율 중량%는, 물질의 유일한 손실이 승화된 알데하이드로부터의 것이고 이는 비 ο-하이드록시 알데하이드를 사용한 경우, 및 심지어는 상기 손실이 측정하기에 너무 작은 경우에만 해당되기 때문에 모든 알데하이드 및 단백질 출발 물질에 대한 실험 오차 범위 내에서 항상 정량적이다. 쉬프 염기의 수율%는 최종 생성물의 질량과 동일하며, 이는 항상 바로 앞에서 언급한 이유로 이론치의 100%이다(X 전환 수율). 차례로, 전환 수율은 전기 분무 질량 분광측정법에 의해 측정된 알데하이드의 실제적인 평균 당량수를 취하여 이를 이론치를 근거로 예견된 당량수로 나누고, 여기에, 전환 수율을 백분율로 나타내기 위해서, 100을 곱하여 얻는다.
상기에 의해 얻어진 값들은 본 발명의 제조 방법을 사용하여 수득된 쉬프 염기로의 전환 효율을 추가로 나타낸다. 상기 개시된 분무 건조 공정에 대한 질량 수율은 상기 공정이 수행된 감소된 규모의 직접적인 결과로서 상대적으로 낮다. 상당량의 최종 생성물이 회수되는 대신에 건조 장치에 들러붙어 끝났다. 따라서, 상기 개시된 생성물로의 전환 수율은 본 발명의 방법의 상대적인 우수성을 입증하는데 보다 정확한 기준이 된다.
최종적으로, 높은 수율을 얻기 위해서는 pH를 7.0 이상에서 유지시켜야 하는중요성을 입증하기 위해서 관련된 시험 공정을 수행하기 전에 각 샘플의 pH를 측정하였다.
상기 표의 데이터에서, 수율 값(%)은 인용된 수의 5 내지 10% 이내로 정확하다. 방향족 ο-하이드록시 알데하이드가 사용되고 pH가 ≥7.0인 모든 제조 방법에 대해서 수율은 ≥90%임을 알 것이다. 상기 전환에 대한 유일한 예외는 관련된 상기 인용된 표에 지적되어 있다. 대조적으로, 방향족 비-ο-하이드록시 알데하이드를 사용한 경우 수율은, ο-하이드록시 알데하이드 샘플을 사용한 경우와 같이 pH가 ≥7.0이라 하더라도, 모두 ≤70%이다. 상기 전환에 대한 유일한 예외는 관련된 상기 인용된 표에 지적되어 있다.
높은 수율을 얻는데 결정적으로 중요한 것은 pH를 ≥7.0에서 유지시키는 것임이 상기 인용된 표 1-B에서 샘플 1y 내지 1dd에 대한 값에 의해 예시된다. 이들 샘플은 모두 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 사용하며, 따라서 pH를 ≥7.0에서 유지시키는 경우 ≥90%의 수율을 예상할 수 있을 것이다. 그러나, pH를 3.31의 낮은 값에서 시작하여 8.52의 높은 값으로 점진적으로 증가되는 범위에 걸쳐 상이한 값들로 설정하였다. 수율%는 33%의 낮은 값에서 시작하여 93%의 높은 값으로 규칙적으로 증가하는 상응하는 진행을 나타내었다.

Claims (15)

  1. 함유 성분들로서 동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질 및 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 포함하는 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물을 제조하기 위한 개선된 제조 방법으로,
    축합 및 최종 부가 생성물을 보존하면서, 이미 존재하는 물 또는 축합 반응 도중 생성된 물의 약 97.0 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거함으로써, 상기 축합 반응을 실질적으로 완료시키고, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상이 되도록 하는, 효과적인 반응 조건하에서 수성 환경 중에서 상기 성분들을 함께 pH 7.0 이상에 놓아두어 반응 혼합물을 형성시킴을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    방향족 ο-하이드록시 알데하이드가 하나 이상의 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 방법:
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR7; -OC(=O)R7; -S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9); -S(=O)2R7; -S(=O)2OR7; -C(=O)NR7R9; -C(=O)R9; 및 -N(R7)(R9)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C4)알킬이며; 여기에서 상기 R1및 R4를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있고;
    X 및 Y는 독립적으로 N, 또는 각각 CHR2또는 CHR3이고, 이때 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR11; -OC(=O)R11; -S(=O)2; -S(=O)2N(R11)(R13); 및 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R13은 (C1-C4)알킬이다)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 여기에서 상기 R2및 R3를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있다.
  3. 제 2 항에 있어서,
    방향족 ο-하이드록시 알데하이드가 ο-바닐린; 살리실알데하이드; 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드; 2,6-디하이드록시벤즈알데하이드; 2-하이드록시-3-에톡시벤즈알데하이드; 또는 피리독살을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질이 하기의 물질들로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원을 포함하는 방법:
    μ, κ 및 δ 오피오이드 수용체 서브유형의 선택적 및 비선택적인 작용물질 및 길항물질인 엔케팔린, 엔돌핀 및 다이놀핀을 포함하는 단백질성 내생 및 합성 오피오이드 진통제 및 길항물질, 예를 들어 [Leu5] 및 [Met5]엔케팔린; 다이놀핀 A 및 B; α- 및 β-네오엔돌핀; [D-Ala2,MePhe4, Gly(올)5]엔케팔린(DAMGO); [D-Pen2, D-Pen5]엔케팔린(DPDPE); [D-Ser2,Leu5]엔케팔린-Thr6(DSLET); [D-Ala2,D-Leu5]엔케팔린(DADL); D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP); [D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-올]엔케팔린(FK-33824); Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val- Val-Gly-NH2([D-Ala2]델톨핀 I; Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2, Glu4]델톨핀 II; Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(몰피세핀); Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL -017); 및 [D-Ala2,Leu5,Cys6]엔케팔린;
    조직 손상, 바이러스 감염 및 알러지 반응들 중에서 선택된 염증성 사건들에 응하여 단백질 분해 반응에 의해 생성된 브래디키닌 및 칼리딘을 포함한 오타코이드(여기에서 상기 단백질들은 국소적으로 작용하여 통증, 혈관 확장, 증가된 혈관 침투성 및 프로스타글란딘의 합성을 생성시키며, 작용 활성 및 길항 활성을 갖고, 남성 불임의 치료, 혈액-뇌 장벽을 넘어선 암 화학요법제의 전달, 및 통증, 천식 및 다른 만성적인 염증 질환들의 치료에 유용하다), 예를 들어 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser- Pro-Phe-Arg(브래디키닌); Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(데스-Arg9-브래디키닌); Lys-Arg-Pro-Pro- Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(데스-Arg10-칼리딘); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(데스-Arg9-[Leu]8-브래디키닌); Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D- Phe7]-브래디키닌); 및 [D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)(여기에서 Hyp는 트랜스-4-하이드록시-Pro이고; Thi는 β-(2-티에닐)-Ala이고; Tic는 [D]-1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀린-3-일-카보닐이고; Oic는 (3as,7as)-옥타하이드로인돌-2-일-카보닐이다);
    각각 기능촉진 반응 및 항 이뇨 반응을 매개하는 바소프레신 수용체 서브 유형 V1및 V2에서 활성인 단백질, 예를 들어 울혈성 심장 마비, 고혈압, 수술 후 장폐색 및 복부 팽만의 치료에 이로운 V1길항물질, 다뇨증 및 다음증의 억제에 의한 중추 요붕증의 치료, 및 폰빌레브란드 질병을 포함한 출혈성 질환의 치료에 사용되는 V2작용물질, 예를 들어 구체적으로 천연 바소프레신-형 펩티드: 하기 일반식의 아르기닌 바소프레신(AVP):
    및 리프레신([Lys8]-AVP; 합성 바소프레신 펩티드: V1a-선택성 작용물질 [Phe2, Ile2, Orn8]AVP; V1b-선택성 작용물질 데아미노 [D-3-(3'-피리딜)-Ala2]AVP; V2-선택성 작용물질 데즈모프레신(dDAVP); 및 데아미노[Val4, D-Arg8]AVP; 및 펩티드 길항물질, 예를 들어 하기 일반식의 V1a-선택성 길항물질 d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP:
    및 V1b-선택성 길항물질 dp[Tyr(Me)2]AVP; 및 V2-선택성 길항물질 데스 Gly-NH2 9-d(CH2)5[D-Ile2, Ile4]AVP, 및 d(CH2)5[D-Ile2, Ile4, Ala-NH2 9]AVP;
    위장 분비 지표로서 사용되는, 일반식: N-t-부틸옥시카보닐-β-Ala-Trp-Met-Asp- Phe-NH2의 펜타가스트린;
    위장관 종양, 다른 치료에 대한 설사 불응, 운동 장애 및 위장 출혈 증상들의 치료에 유용한, 일반식: L-시스테인아미드-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr- N-[2-하이드록시-1-(하이드록시-메틸)프로필]-환상(2→7)-디설파이드, [R-(R*,R*)]의 옥트레오티드;
    면역억제제로서 유용한 항체 시약, 예를 들어 항흉선세포 글로불린; 뮤로모냅-CD3 단클론 항체; 및 Rho(D) 면역 글로불린; 및 면역결핍 상태의 치료에 유용한 단백질 면역자극제, 예를 들어 면역 글로불린;
    백혈구에 의해 생산되고 다양한 면역조절 효과를 갖는 시토킨, 예를 들어 인터페론, 콜로니-자극 인자 및 인터류킨, 및 구체적으로 α-인터페론; 인터페론-γ(IFN-γ); 과립성 백혈구 콜로니-자극 인자(G-CSF); 과립성 백혈구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF); 및 인터류킨-1(IL-1) 내지 인터류킨-12(IL-12);
    성숙한 혈액 세포를 연속적으로 대체하는 과정의 조절과 관련되고, 1 차 혈액작용 질병의 치료에 유용하며, 심각한 감염의 치료, 및 화학요법 또는 골수 이식 하에 있는 환자들의 관리에 보조약으로서 사용되는 조혈 성장 인자, 예를 들어 구체적으로 에리쓰로포에틴(EPO); 간 세포 인자(SCF); 인터류킨(IL-1-12); 단핵세포/대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF, CSF-1); P1XY321(GM-CSF/IL-3 융합 단백질); 및 트롬보포에틴을 포함한 성장 인자;
    혈관 손상 부위의 병적인 혈전 및 피브린 침착물 모두의 용해에 유용한 혈전용해성 단백질, 예를 들어 스트렙토키나제; 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA); 및 유로키나제;
    뇌하수체 전엽 호르몬 및 그의 사용을 조절하는 시상하부 인자, 예를 들어 (a) 성장 호르몬(GH), 프로락틴(Prl) 및 태반 락토젠(PL)을 포함한 성장성 호르몬; (b) 황체화 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH) 및 타이로이드-자극 호르몬(TSH)을 포함한 당단백질 호르몬; 및 (c) POMC-유도된 호르몬, 예를 들어 코르티코트로핀(ACTH), α-멜라닌세포-자극 호르몬(α-MSH), β-멜라닌세포-자극 호르몬(β-MSH), β-리포트로핀(β-LPH) 및 γ-리포트로핀(γ-LPH); 상기 호르몬들의 방출을 조절하는 시상하부 인자, 예를 들어 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 인슐린-형 성장 인자(IGF-1 및 IGF-2), 소마토스타틴 및 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH);
    성장-호르몬 결핍 아동의 대체 요법으로서 유용한 성장 호르몬, 예를 들어 소마토스타틴, 상기 소마토스타틴의 합성 동족체인 옥트레오티드; 생식선 자극 호르몬, 예를 들어 LH, FSH, 및 재생성 질환의 진단 및 불임 치료에 유용한 코리온 고나도트로핀(GC), 예를 들어 유로폴리트로핀, 배란 유도에 유용한, 거의 대부분의 LH가 제거된 인간 폐경기 고나도트로핀(hMG), 및 고나도트로핀 분비의 자극에 유용한 합성 인간 GnRH인 고나도렐린; 생식선 스테로이드의 감소에 반응하는 내분비 질환의 치료에 유용한 합성 GnRH 작용물질, 예를 들어 류프롤리드, 히스트렐린, 나파렐린 및 고세렐린;
    갑상선 기능 저하증 환자의 호르몬 대체 요법 및 무독성 갑상선종 환자 또는 갑상선 암 치료 후의 환자의 티로트로핀(TSH) 억제에 유용한, 티로트로핀-방출 호르몬(TRH)에 의해 분비가 조절되는 티로트로핀(TSH);
    인슐린-의존성 당뇨병 환자 및 비-인슐린-의존성 당뇨병 환자의 치료를 위한 인슐린; 글루코스 및 케톤 체내 대사의 조절에서 생리적 역할을 하고 위장관의 억제를 위해 방사선 기사에 의해 사용되는, 심각한 저혈당증의 치료에 유용한 글루카곤; 내분비성 종양에서 호르몬 방출을 차단하는데 유용한 소마토스타틴, 예를 들어 인슐리노마스, 글루카고노마스, VIP오마스, 칼시노이드 종양 및 소마토트로피노마스, 및 합성 동족체인 옥트레오티드;
    골 재흡수를 억제하기 위해 조골세포에 특이적으로 작용하며, 고칼슘혈증 및 증가된 골격 리모델링 질환, 예를 들어 파제씨 병의 관리에 유용한 호르몬인 칼시토닌; 척수 골다공증 환자의 치료에 유용한 파라티로이드 호르몬;
    항신생물제 및 면역자극제로서 유용한 알데스류킨, 125-L세린-2-133-인터류킨 2; 글루코세레브로시다제 효소의 보급자로서 유용한, 인간 태반 조직 β-글루코세레브로시다제의 변형된 형태로 497 개의 아미노산을 갖는 단량체성 당단백질인 알글루세라제; 합성 코르티코트로핀 동족체인 알새크티드: 1-β-Ala-17[L-2,6-디아미노-N-(4-아미노부틸)헥산아미드]-α1-17-코르티코트로핀; 플라스미노겐 활성화제로서 유용한, 서열이 혈관벽의 내피 세포에 의해 생산된 천연 프로테아제와 동일한 527 개 아미노산의 세린 프로테아제인 알테플라제; 항바이러스제로서 유용한, 2 개의 링커 잔기를 통해 CD4의 세포외 영역의 처음 178 개 아미노산이 슈도모나스 엑토톡신 A의 아미노산 1 내지 3 및 253 내지 613에 결합되도록 조작된 합성 키메릭 단백질인 알비르셉트 수도톡스; 당뇨병 치료제로서 유용한, 37 개 아미노산의 단백질인 암린티드; 아모가스트린: N-카복시-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-페닐-L-알라닌아미드; 비스테로이드성 염증 치료제로서 및 염증성 장 질환의 치료를 위한 억제제로서 유용한 아나킨라: N2-L-Met-인터류킨 1 수용체 길항물질; 고혈압 치료제로서 및 이뇨제로서 유용한 아나라티드 아세테이트, 아트리오펩틴-21(래트), N-L-Arg-8-L -Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-, 아세테이트; 혈관수축제로서 유용한 안지오텐신 아미드, 안지오텐신 II, 1-L-Asn-5-L-Val-; 효소 억제제(프로테이나제)로서 유용한, 58 개 아미노산을 갖는 췌장 트립신 억제제인 아프로티닌; 고혈압 치료제로서 유용한 아르팔라신, 1-숙신암산-5-L-Val-8-(L-2-페닐글리신)안지오텐신 II; 이뇨증 치료제로서 유용한 알지프레신 탄네이트, 바소프레신, 8-L-Arg-, 탄네이트; 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에 의해 생산된 항생제로서 유용한 아스파르토신, 옥시토신, 4-L-Asn-; 옥시토신 길항물질로서 유용한 아토시반, 옥시토신, 1-(3-머캅토프로판산)-2-(O-에틸-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-; 스트렙토마이세스 칸디두스(Streptomyces candidus)로부터 수득된 글리코펩티드 항생물질인 아보파르신; 항진균제로서 유용한 바시펀진, N-[(2R,3R)-2-하이드록시-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-알로-Ile-N-L-MeVal-L- Leu-3-하이드록시-N-L-MeVal α1-락톤; 간엽-유래된 세포의 증식을 증진시킴으로써 만성적인 피부 궤양의 치료에 유용한, 내생성 인간 PDGF-BB 단독이량체의 아미노산 조성과 생물 활성이 유사한, 유전자 조작된 사카로마이세스 세레비지아에에 의해 생산된 재조합 단백질인 베카플러민, 재조합 인간 혈소판-유래된 성장 인자 B; 20 개의 아미노산을 갖는 항응고성 혈전방지제인 비발리루딘; 카베토신, 1-부티르산-2-[3-(p-메톡시페닐)-L-Ala]옥시토신; 카르구토신, 1-부티르산-6-(L-2-아미노부티르산)-7-글리신옥시토신; 위액 분비 자극제로서 유용한 세룰레티드, 5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-설포-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp -L-Met-L-α-Asp-L-Phe-아미드; 112 개의 아미노산을 갖는 인간 성장 인자 β2를 전달하는 세터민; 조혈제(대식세포 콜로니-자극 인자)로서 유용한, 1-233-콜로지-자극 인자 1(인간 클론 p3ACSF-69 단백질 잔기), 환상(7→90), (48→139), (102→146)-트리스(디설파이드)·이량체인 실모스팀; 항균제로서 유용한 콜리스틴 A 성분인 콜리스티메테이트 나트륨; 부신피질 부족 및 쿠싱 증후군에 대한 진단 보조제로서 및 코르티코트로핀-방출 호르몬으로서 유용한, 코르티코트로핀-방출 인자(양) 트리플루오로아세테이트 염인 코르티코렐린, 양 트리플루테이트; 부신피질자극 호르몬으로서 유용한 코신트로핀, 테트라코색티드 아세테이트, α1-24-코르티코트로핀; 면역억제제로서 유용한, 11 개의 아미노산 및 6번 위치에 3-하이드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노일 잔기를 함유하는 환상 단백질인 사이클로스포린; 면역억제제로서 유용한, 디설파이드 가교를 통해 연결된 4 개의 서브유니트를 포함하고 대략 150 kD의 분자량을 갖는 인간화된 항-TAC 단클론 항체인 다클리시맵(Ro-24-7375); 다클리주맵; 단백질성 항균제인 다프토마이신; 항응고제로서 유용한, 63 개의 아미노산을 갖는 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터의 63-데설포히루딘인 데시루딘; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 데슬로렐린; 항이뇨제로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 데즈모프레신 아세테이트, 바소프레신, 1-(3-머캅토프로판산)-8-D-Arg-, 모노아세테이트 염, 트리하이드레이트; LHRH 길항물질로서 유용한 10 개의 아미노산을 포함하는 데티렐릭스 아세테이트; 27-L-Leu-44a-Gly 성장 호르몬 방출 인자(인간)인 듀모렐린; 엘카토닌, 1-부티르산-7-(L-2-아미노부티르산)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala 칼시토닌(연어); 2 개의 Cys 가교를 갖는 72 개의 아미노산을 포함하는 인터류킨 8(인간)인 에목타킨; 빈혈 치료제 및 보혈제로서 유용한, 적혈구 세포의 생산을 조절하고 중국 햄스터 난소 세포를 인간 에리쓰로포에틴 유전자내에 삽입시켜 제조된 165 개 아미노산 당단백질인 에포에틴 알파; 상처 치유제로서 유용한, 인간 태반으로부터 단리되고 이 콜라이에서 클로닝되고 발현된 비-글리코실화된 단백질인 157 개의 아미노산을 포함하는 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)인 에르소페르민; 혈관수축제로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 바소프레신 2-L-Phe-8-L-Lys인 펠리프레신; 호중구감소 억제제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 비-글리코실화되고 이 콜라이에 의해 발현된 175 개 아미노산 폴리펩티드 단일 쇄인 필그라스팀; 당뇨병 치료제로서 유용한, 29 개 아미노산의 단일 쇄 단백질인 글루카곤; 생식선-자극 원소로서 유용한, 10 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자 아세테이트의 디아세테이트 염인 고나도렐린 아세테이트; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 고세렐린; LHRH 작용물질로서 유용한 9 개의 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 히스트렐린; 글루코세레브로시다제의 효소 보충물로서 유용한, 495-L-히스티딘글루코실세라미다제 태반 이소엔자임 단백질인 이미글루세라제; 당뇨병 치료제로서 유용한, 인슐린의 B 쇄로부터 C-말단 알라닌을 제거하여 제조된 인슐린 유도체인 달란화된 인슐린; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 유용한, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 αA(환원된 인간 백혈구 단백질 잔기)인 인터페론 알파-2a; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 유용한, 165 개 아미노산을 포함하는 인터페론 α2b(환원된 인간 백혈구 클론 Hif-SN206 단백질 잔기)인 인터페론 알파-2b; 항신생물제로서 및 생물 반응 조절제로서 또한 유용한, 인간 인터페론 베타에 대해 조작된 유전자를 함유하는 배양된 중국 햄스터 난소 세포로부터 생산된 166 개 아미노산을 포함하는 글리코실화된 폴리펩티드인 인터페론 베타-1a; 면역조절제로서 또한 유용한, 이 콜라이로부터 생산된 165 개 아미노산 잔기로 이루어진 비-글리코실화된 폴리펩티드인 인터페론 베타-1b; 항신생물제로서 및 면역조절제로서 유용한 인터페론 감마-1b, 1-139 인터페론 γ(환원된 인간 림프구 단백질 잔기), N2-L-Met; 2 개의 Cys 가교를 갖는 71 개 아미노산 잔기를 포함하는 N-메티오닐 혈소판 인자(인간 서브유니트)인 이로플랙트; 플라스미노겐 활성화제 및 혈전 용해제로서 유용한, 펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포유동물 숙수 세포에서 발현시켜 생성된 Asn 117 내지 Gln 117의 변이, 및 피브로넥틴-유사 및 EGF-유사 영역의 결실에 의해 인간 t-PA로부터 유도된 조직 플라스미노겐 활성화제 단백질인 라노테플라제; 항신생물제로서 유용한, 8 개의 아미노산 및 1 개의 디설파이드 가교를 포함하는 란레오티드 아세테이트; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 인간 구강의 비늘모양 세포 주-mRNA로부터 유도된 인간 과립세포 콜로니-자극 인자-cDNA의 발현에 의해 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 174 개 아미노산 잔기로 이루어진 당단백질인 레노그라스팀; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 루트렐린 아세테이트; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 127 개 아미노산을 포함하는 콜로니-자극 인자 2(환원된 인간 클론 pHG25단백질 잔기)인 몰그라모스팀; 표피 성장 인자(마우스 침샘)인 뮤로더민; LHRH 작용물질로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 나파렐린 아세타템; 69 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는 26-L-알라닌림포킨 MiP 1α(인간 클론 pAT 464) 염증성 대식세포인 나그레스티펜; 펩신 효소 억제제로서 유용한, 펩스타틴, N-(3-메틸-1-옥소부틸)-L-Val-L-Val-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵타노일-L-Ala-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산; 당뇨병 치료제로서 유용한, 37 개 아미노산을 포함하고 1 개의 디설파이드 가교를 갖는 단백질인 프라밀린티드; 당뇨병 치료제로서 유용한, 86 개 아미노산 잔기를 포함하고 3 개의 디설파이드 가교를 갖는 프로인슐린(돼지)인 인간 프로인슐린; 항신생물제로서 및 조혈 자극제로서 유용한, 사카로마이세스 세레비지아에로부터 발현된 127 개 아미노산 잔기를 갖는 단일 쇄의 글리코실화된 폴리펩티드인 살그라모스팀, 콜로니-자극 인자 2(인간 클론 pHG25 단백질 잔기), 23-L-Leu; 재조합을 포함하여 천연 및 합성적으로 유도된 인간 및 동물 소마토트로핀(성장 호르몬), 특히 소 및 돼지 소마토트로핀; 갈락토스형성제로서, 특히 수의학적 용도에 유용한, 191 개 아미노산을 포함하는 소마그레보브, 소마토트로핀(환원된 소), 1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-글루타민]-; 호르몬(성장, 돼지)으로서 유용한, 총 191 개 아미노산을 포함하는 N-L-알라닐-성장 호르몬인 소말라포르, 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1); 성장 호르몬으로서 유용한, 191 개 아미노산을 포함하고 2 개의 디설파이드 가교를 갖는 N-L-Met 소마토트로핀(인간)인 소마트렘; 성장 호르몬으로서 유용한, 인간 뇌하수체의 전엽으로부터 수득된 주요 성장 자극 호르몬의 정상적인 구조를 갖는 191 개 아미노산을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄인 소마토트로핀; 재조합체 형태로 수득할 수 있는 소마토트로핀; 갈락토스형성제로서 유용한, 소 뇌하수체 소마토트로핀의 4 개의 천연 분자 변형체들 중 하나인 소마토트로핀(소)인 소마부보브, 127-L-Leu;돼지 성장 호르몬으로서 유용한, 190 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1)인 소메노포르, N-L-Ala-32-de-L-Glu-33-de-L-Arg-34-de-L-Ala-35-de-L-Tyr-36-de-L-Ile- 37-de-L-Pro-38-de-L-Glu-; 수의학적 성장 자극제로서 유용한, 191 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(소)인 소메트리보브, 1-L-Met-127-L-Leu-; 소메트리포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C979H1527N265O287S8; 솜파세포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C938H1465N257O278S6; 소미도보브, 소마토트로핀(소 재조합체) C1020H1596N274O302S9; 안지오텐신-전환 효소 억제제로서 유용한, 9 개 아미노산을 포함하는 브래디키닌 강화제 B인 테프로티드, 2-L-Trp-3-de-L-Leu-4-de- L-Pro-8-L-글루타민-; 골 재흡수 억제제 및 골다공증 치료 보조약으로서 유용한, 34 개 아미노산을 포함하는 단백질인 테리파라티드; 항신생물제로서, 간염 및 감염성 질병의 치료에, 및 백신 강화제로서 유용한, 28 개 아미노산을 포함하는 티모신 α1(소)인 티말파신; 면역조절제로서 유용한 펜타펩티드인 티모펜틴; 항신생물제로서 유용한, 10 개 아미노산을 포함하는 황체화 호르몬 방출 인자(돼지)인 트리프토렐린, 6-D-Trp; 항신생물제로서 유용한, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 8 개의 아미노산을 포함하는 바프레오티드; 항이뇨 호르몬으로서 유용한, 하나의 디설파이드 가교를 갖고 9 개의 아미노산을 포함하는 8-L-Arg- 또는 8-L-Lys-형태의 바소프레신; 미오글로빈; 헤모글로빈; β-락토글로불린; 면역글로불린-G(lgG); 항혈우인자(인자 VIII); 리소자임; 유비퀴틴; 혈소판 활성 인자(PAF); 종양 괴사 인자-α(TNF-α); 종양 괴사 인자-β(TNF-β); 대식세포 염증성 단백질(MIP); 헤파린; 호산구양이온 단백질(ECP); 재조합 인자 IX; 비-호즈킨 B-세포 병에 대한 단클론 항체; C형 간염의 치료에 유용한 인터페론 알파; 및 상처 및 화상의 치료를 위한 섬유아세포-유래된 인공 피부.
  5. 제 1 항에 있어서,
    축합 반응을 실질적으로 완료시키기에 유효한 조건들이
    (a) 임의의 존재하는 물을 액상에서 기상 또는 고체 상으로 변화시킴으로써 상기 물을 상기 축합 반응의 수성 환경으로부터 제거하는 조건; 및
    (b) 상기 축합 반응 자체에 의해 생성된 물을 포함하여, 축합 반응이 일어나는 상기 수성 환경의 상기 물을 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물로부터 가장 효율적으로 분리시키는데 필요한, 상기 공정에 대한 에너지 투입을 최적화시키는 조건을 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    0 ℃ 이상의 온도에서 임의의 존재하는 물을 액상에서 기상으로 변화시키고 공정에 대한 에너지 투입을 최적화시키는 조건이 (a) 단백질인 출발 물질 반응물 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 수성 환경 하의 반응 혼합물을 최고 온도로 가열하는 것; (b) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 수성 환경 하의 반응 혼합물을 최소의 소적으로 세분화시키는 것; 및 (c) 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 상기 축합 반응을 포함한 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되게, 상기와 같이 형성된 상기 소적들에, 통과하는 것에 대해 불활성인 기체를 기준으로 최고의 상대 속도를 제공하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    반응 혼합물을 소적으로 세분시키는 것을 고압의 수력 펌핑 수단 및 결합된 노즐 수단과 함께 고압의 기체 스트림 발생기 및 결합된 분산 수단의 임의의 적합한 조합을 포함하는 분무 장치를 사용하여 수행하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    반응 혼합물을 소적 형태로 세분화시키는 것을, 각 출발 물질 반응물을 포함하는 수성 스트림이 향하고 상기 수성 스트림이 소적 형태로 상기 원반의 테두리로부터 추진되는 방식으로 상기 원반을 횡단하는 표면 위에서 고속으로 회전하는 원반 형태의 기계적 작용을 사용하여, 이미 존재하는 물 또는 축합 반응 도중 생성된 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기 위해서 온도, 습도 및 압력이 조절된 조건 하에서 수행하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    0 ℃ 이하의 온도에서 임의의 존재하는 물을 액상에서 고체 상으로 변화시키고 공정에 대한 에너지 투입을 최적화시키는 조건이 (a) 수성 환경 하의 반응 혼합물을 상기 수성 환경 중에 존재하는 비 결합된 액체 수의 거의 모두를 동결시키기에 충분히 낮은 온도로 냉각시키는 것(이때 상기 온도는 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 축합 반응을 포함한 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관되는 것이다); (b) 상기 동결된 수성 환경 중의 상기와 같이 냉각된 반응 혼합물에 상기에 대해 불활성인 기체의 존재 하에서 감압을 가하는 것(이는 단백질인 출발 반응 물질 및 최종 축합 부가 생성물의 완전성의 유지뿐만 아니라 축합 반응을 포함한 제조 방법의 수행에 최적인 효율성 및 경제성과 일관된다)을 포함하는 방법.
  10. 이미 존재하는 물 또는 축합 반응 도중 생성된 물의 약 97.0 내지 약 99.0 중량%, 바람직하게는 약 98.0 내지 약 99.0 중량%를 제거(이는 상기 축합 반응물 및 최종 부가 생성물의 완전성을 유지하면서, 상기 최종 축합 부가 생성물로의 전환율을 보장하는 것, 즉 상기 최종 축합 부가 생성물의 생성 수율이 반응물의 중량을 기준으로 약 98.5 중량% 이상, 바람직하게는 약 99.5 중량% 이상인 것과 일치한다)하기에유효한 조건하에서 제조된
    단백질과 방향족 ο-하이드록시 알데하이드를 포함하는 최종 쉬프 염기 축합 부가 생성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    방향족 ο-하이드록시 알데하이드가 하나 이상의 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 생성물:
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1및 R4는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR7; -OC(=O)R7; -S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9); -S(=O)2R7; -S(=O)2OR7; -C(=O)NR7R9; -C(=O)R9; 및 -N(R7)(R9)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 이때 R7은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R9는 (C1-C4)알킬이며; 여기에서 상기 R1및 R4를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있고;
    X 및 Y는 독립적으로 N, 또는 각각 CHR2또는 CHR3이고, 이때 R2및 R3는 독립적으로 수소; 하이드록시; 할로; 니트로; 시아노; 트리플루오로메틸; (C1-C6)알킬; (C1-C6)알콕시; (C3-C6)사이클로알킬; (C2-C6)알케닐; -C(=O)OR11; -OC(=O)R11; -S(=O)2; -S(=O)2N(R11)(R13); 및 -N(R11)(R13)(여기에서 R11은 수소 또는 (C1-C4)알킬이고, R13은 (C1-C4)알킬이다)로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 여기에서 상기 R2및 R3를 한정하는 알킬, 사이클로알킬 및 알케닐 그룹들은 임의로 할로; 하이드록시; (C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시; (C1-C2)알콕시-(C1-C2)알킬; (C1-C2)알콕시카보닐; 카복실; (C1-C2)알킬카보닐옥시; 니트로; 시아노; (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 아미노; 설포닐; 및 (C1-C2)알킬에 의해 이치환된 설폰아미도로 필수적으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 또는 2 개의 치환체에 의해 독립적으로 치환될 수도 있다.
  12. 제 11 항에 있어서,
    방향족 ο-하이드록시 알데하이드가 ο-바닐린; 살리실알데하이드; 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드; 2,6-디하이드록시벤즈알데하이드; 2-하이드록시-3-에톡시벤즈알데하이드; 또는 피리독살을 포함하는 생성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질이 제 4 항에 한정된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원을 포함하는 생성물.
  14. 제 4 항에 있어서,
    동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질이 천연 돼지 소마토트로핀; 총 191 개의 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1), N-L-알라닐-성장 호르몬인 소말라포르; 190 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1), N-L-Ala-32-de-L-Glu-33-de-L-Arg-34-de-L-Ala-35-de-L-Tyr-36- de-L-Ile-37-de-L-Pro-38-de-L-Glu-인 소메노포르; 소마토트로핀(돼지 재조합체) C979H1527N265O287S8; 및 솜파세포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C938H1465N257O278S6로 필수적으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 일원을 포함하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    동물들에서 이로운 활성을 갖는 단백질이 천연 돼지 소마토트로핀; 총 191 개의 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1), N-L-알라닐-성장 호르몬인 소말라포르; 190 개 아미노산을 포함하는 소마토트로핀(환원된 돼지 클론 pPGH-1), N-L-Ala-32-de-L-Glu-33-de-L-Arg-34-de-L-Ala-35-de-L-Tyr-36- de-L-Ile-37-de-L-Pro-38-de-L-Glu-인 소메노포르; 소마토트로핀(돼지 재조합체) C979H1527N265O287S8; 및 솜파세포르, 소마토트로핀(돼지 재조합체) C938H1465N257O278S6로 필수적으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 일원을 포함하는 생성물.
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