KR20010070541A - 강화된 콜라겐층을 포함하는 생체조직 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강화된 콜라겐층을 포함하는 생체 조직, 이를 포함한 인공 피부 및 이의 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 스폰지 및 망사의 복합구조 형태를 취하는 콜라겐층과 세포를 포함하는 생체 조직을 제공하는데, 생체적합성이 우수한 콜라겐을 스폰지 및 망사의 복합구조로 제조함으로써 생체 적합성과 인장강도에 있어서의 개선을 가져온다. 이러한 생체조직은 인공피부를 만드는데 이용됨으로써, 이식수술시 조작이 편리하며 봉합하기가 용이한 잇점을 제공한다. 또한, 본 발명의 생체조직은 독성테스트용 분석키트로도 이용된다.

Description

강화된 콜라겐층을 포함하는 생체조직 및 이의 제조방법{BIO-ARTIFICIAL TISSUE COMPRISING REINFORCED COLLAGEN LAYER AND PROCESS}

본 발명은 인공 생체 조직, 보다 구체적으로, 강화된 콜라겐층을 포함하는 생체 조직, 이를 포함한 인공 피부 및 이의 용도에 관한 것이다.

인공 피부는 화상 및 기타 창상에 의한 피부의 일부 또는 전체 두께에 걸친 손상을 치료하기 위한 이식 수술시에 사용되며, 또한, 외래성 물질과 생체조직과의 친화성 내지는 적합성 유무를 확인하기 위한 독성 테스트용 키트로도 사용될 수 있다.

보다 구체적으로 설명하자면, 3도 이상의 심각한 화상에서는 피부의 표피 뿐 아니라 혈관이 뻗어있는 진피층까지 피부조직이 손실됨으로 해서 인체의 수분과 체액이 과다하게 방출되는 것과 감염에의 노출 등으로 생명이 위험하다. 이때는 인공적인 재료로만 만들어진 드레싱으로는 치료가 불가능하여 환자의 다른 건강한 부위의 피부를 환부로 옮겨 이식하여 치료하지만 넓은 부위의 화상을 입은 경우는 이러한 자가이식도 불가능하게 되므로 결국 실제 인체의 세포와 인공재료를 복합적으로 구성한 인공피부가 필요하고 조직공학[tissue engineering: 세포를 생물학적으로 적합한 재질에서 3차원적으로 배양하여 이 세포-재질 복합체가 생체 내 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 하여 실제로 생체조직 및 장기를 재생하는 학문]이 이를 실현시키고 있다.

이러한 인공피부에 관련된 종래기술로는 다음과 같은 것들이 개시되어 있다.

대한민국 출원공고번호 제 94-1379호에서 개시하는 생조직등가물은 겔상태의 콜라겐층 내에 섬유아세포로 수축시킨 콜라겐 격자 형태로 구성된 진피층으로 이루어진다.

대한민국 출원공개번호 제 93-700045호에서 개시하는 합성 생체피부 대체물은 기공이 없는 콜라겐층으로 이루어진 진피층과 기공이 있는 스폰지 형태의 콜라겐 내에 케라티노사이트세포를 배양한 구조물인 표피층으로 구성된다.

대한민국 출원공개번호 제 92-336호에서 개시하는 인공막은 천공막에 각질세포를 배양하여 이루어진다.

이 외에도 더글라스 일동(Douglas et al., 1980, In vitro 16:306-312) 및 양 일동 (Yang et al., 1981, Cancer res.41:1021-1027)은 인공피부 제조시 겔 형태의 콜라겐층을 개시하고 있으며, 레히톤 일동(Leighto et al., 1951, J. Natl. Cancer Inst. 12:545-561 and 1968, Cancer Res.28:286-296)은 인공피부 제조시 스폰지 형태의 셀룰로오즈 또는 젤라틴에 대해서 개시하고 있다.

그러나, 이러한 종래의 겔 상태 또는 스폰지 상태의 콜라겐, 젤라틴 또는 셀룰로오스층을 포함하는 인공피부는 이식시술시 봉합에 필요한 인장 강도를 갖지 못할 뿐 아니라, 그 강도가 약하여 둥글게 말리거나 찢어지는 등 시술 조작에 불편함이 따르고 이식 후의 체내에서의 콜라겐 효소에 의한 분해등으로 그 강도가 유지되지 못하고 상처치유 기간에 비하여 너무 빨리 분해되는 단점이 있다. 그래서, 인공피부의 강도를 강화시키기 위하여 대표적으로 글루타알데하이드와 같은 화학물질이나 자외선 조사법과 같은 물리적 방법으로 콜라겐을 가교결합시키는 연구가 진행되어왔다. 그러나, 이러한 화학적 물질과 물리적 방법도 생체조직의 인장강도를 증가시키기는 하나, 생체조직을 경화시킬 가능성이 있고, 정확한 메카니즘이 밝혀지지는 않았으나 생체 내에서의 세포 및 조직에 대한 독성 효과라는 부담을 안고 있기 때문에 바람직하지는 않다.

따라서, 인장강도를 증가시키면서도 생체적합성을 유지할 수 있는 인공피부가 오래동안 희구되어 왔다.

따라서, 본 발명의 목적은 인공적인 생체 조직을 제조함에 있어서 생체적합성이 우수한 물질을 이용하여 생착 효과를 증진시킴과 동시에 생체 조직의 인장강도를 증가시키고자 하는데 있다.

도 1 은 콜라겐으로 제조된 실의 직경에 대한 분포도이다.

도 2 는 콜라겐 용액으로 제조한 실을 이용하여 만든 직경 35 mm의 망사형 구조물이다.

도 3a 은 돼지건의 콜라겐을 이용하여 제조한 스폰지를 여러가지 방법으로 강화시킨 후 인장강도를 측정한 결과를 보여준다.

도 3b 는 송아지 피부의 콜라겐을 이용하여 제조한 스폰지에 대해서 도 3a와 같은 방법으로 인장강도를 측정한 결과를 보여준다.

도 4a 은 송아지 피부(Calf skin)에서 추출한 콜라겐으로 콜라겐실을 제조한 후 이 실로 망사를 제조하여 콜라겐 스폰지 제조시에 삽입시켜 제조한 인공피부 내부구조의 100배 전자현미경 사진이다.

도 4b 는 도 4a의 인공피부의 내부구조의 1500배 전자현미경 사진이다.

도 5 는 도 4a와 도 4b의 전층(全層)인공피부를 조직학적으로 염색한 단면사진이다.

상기 과제를 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명은 i) 생체적합성이 우수한 세포 기질 성분인 콜라겐을 실로 제조한 뒤 이를 망사 형태의 구조물로 제조하고, ii) 또 다른 콜라겐을 유공성 스폰지 형태로 제조하는데, 제조 도중에 i)에서 수득된 망사 형태의 콜라겐 구조물을 삽입시켜서, 스폰지 및 망사의 복합 구조를 취하는 콜라겐층을 형성하고, iii) ii)에서 수득된 복합 구조의 콜라겐 내에서 세포를 배양하는 단계로 이루어지는, 스폰지 및 망사의 복합 구조 형태를 띤 콜라겐과 세포를 포함하는 생체조직을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 핵심은 생체 조직의 지지층을 실제 생체구조단백질인 콜라겐 자체를 이용하여, 이를 스폰지 및 망사의 복합구조로 제조하는데 있다. 콜라겐 실로엮어진 망사를 콜라겐 스폰지 내에 삽입시킴으로써, 스폰지-망사의 복합 구조에 의하여 생체 조직의 인장강도가 향상되며 또한, 글루타알데하이드 또는 자외선 조사와 같은 임의의 화학적 처리를 가하지 않은 실제 생체 내 구조단백질인 콜라겐을 이용함으로써, 생체 유해 위험성을 배제하고 생착 효과도 향상된다.

이렇게 해서 만들어지는 생체 조직은 콜라겐층 내 세포가 섬유아세포일 경우에 전층인공피부의 지지층인 진피층으로 이용되어 인공피부 제조시에 사용될 수 있다. 또한, 어떤 제제가 세포 또는 조직에 적합한지 알아보고자 할때도 이용가능한데, 즉 독성 테스트용 분석 키트로도 이용될 수 있다. 본 발명의 생체 조직이 독성 테스트용 분석키트에 이용되는 경우에는 피부세포 또는 간세포를 사용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로, 본 발명의 생체 조직 제조시, 콜라겐 실은 논문[John F. Cavallaro and Paul D. Kemp., "Collagen fabric as Biomaterials" in Biotechnology and Bioengineering, Vol 43, p 781-791]에 따라 제조된다. 이때, 콜라겐 실은 35 내지 65 ㎛의 지름을 갖도록 제조되는 것이 바람직하며, 또한 타입 I 콜라겐 또는 탑입 I과 타입 III의 혼합 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다.

스폰지 및 망사의 복합구조 형태의 콜라겐은, 콜라겐 섬유를 산으로 녹여 교반시켜서 크림형태의 용액으로 제조한 뒤, 상기에서 제조된 콜라겐 실로 엮은 망사 형태의 콜라겐 구조물을 삽입하여 -20 내지 -85℃에서 6시간 이상 냉동시킨 다음, 동결건조함에 의하여 제조된다. 이때, 콜라겐 섬유를 펩신으로 처리함으로써 이식시술시의 면역반응으로 인한 부작용을 제거할 수 있다. 이때, 콜라겐 스폰지의기공 크기는 바람직하게는, 50 내지 150 ㎛이다. 한편, 진공동결건조직전에 순간적으로 표면에 더운 바람을 불어넣거나 콜라겐 액체를 발라 콜라겐 스폰지의 한쪽 면에 막을 형성시키는 것이 바람직한데, 그 이유는 이렇게 만들어진 콜라겐층이 인공피부의 진피층으로 이용될 때 그 위에 도말되는 표피세포가 콜라겐 스폰지의 기공으로 빠지는 것을 방지해주기 때문이다.

이리하여 수득되는 스폰지 및 망사의 복합구조 형태의 콜라겐을 페트리디쉬에 깔고 세포를 그 위에 분주하여 배양함으로써, 본 발명의 생체 조직은 완성된다. 여기에서 세포는 생체 조직의 용도에 따라 임의대로 선택할 수 있는데, 상기 생체 조직을 전층인공피부의 진피층으로 이용하는 경우에는 진피세포인 섬유아세포가 사용되고, 독성 테스트용 분석키트로 이용하는 경우에는 피부세포 또는 간세포가 바람직하게 사용된다.

전층인공피부는 스폰지 및 망사의 복합구조 형태의 콜라겐과 섬유아세포로 이루어진 진피층 위에 표피세포, 바람직하게는 각질세포를 배양함에 의하여 제조된다. 이때, 표피세포의 층은 증식, 분화된 표피세포들의 다중층으로 구성된다. 이렇게 제조된 전층인공피부는 실제 피부조직과 유사하며, 인장강도도 기존에 비하여 증가되었기 때문에, 시술시 조작이 편리하여 봉합하기가 용이하다.

하기에서는, 본 발명의 복합구조의 콜라겐층과 종래의 가교결합에 의한 콜라겐층의 인장강도 측정 실험과 본 발명의 복합구조의 콜라겐층을 이용하여 인공피부를 제조하는 방법에 대하여 도면과 결부시켜 기술하기로 한다.

가. 콜라겐층에 대한 인장강도 실험

실시예 1. 스폰지 및 망사의 복합구조를 띤 콜라겐층의 제조

1-1. 콜라겐 실의 제조

1) 콜라겐 용액을 20G 사이즈의 주사바늘이 부착된 실리콘 튜브를 통해 멀티스태틱 펌프(Multistatic Pump; Haake Buchler instrument Inc., No 426-2000, USA)를 이용하여 하기와 같이 구성되는 완충용액 I에 분당 1 내지 2 밀리리터의 속도로 주입한다.

# 완충용액 I : 염화칼륨 (KCl) 0.2 g

칼륨 디하이드로겐 포스페이트 (KH₂PO₄) 0.2 g

염화나트륨 (NaCl) 8 g

나트륨 하이드로겐 포스페이트 (NH₂HPO₄·12H₂O) 2.887 g

폴리에틸렌글리콜 (분자량#8000) 23.8 g

3차 증류수 1 리터, pH 7.55

이때, 완충용액을 3-4 cm/s의 속도로 순환시키거나 주사바늘을 3-4 cm/s로 이동시켜야 주입된 콜라겐이 엉기지 않고 실이 형성된다.

2) 겔화가 일어난 실모양의 콜라겐 가닥을 하기와 같이 구성되는 완충용액 II에 옮겨 5 내지 10분간 방치한다.

# 완충용액 II : 이염기 나트륨 포스페이트 5.5 mM

일염기 칼륨 포스페이트 0.5 mM

염화나트륨, pH 7.10 75 mM

3) 70% 이소프로판올에 옮겨 담아 18시간동안 세척한다.

4) 생성된 실 가닥들 건조대에 올려놓아 에어 블로우 오븐 (air blow oven, 40℃)에 넣어 30분간 건조시킨다. 만일 연속공정일 경우 실이 오븐의 롤러 표면에 달라붙지 않도록 계속 롤러를 회전시킨다. 이리하여, 콜라겐 실이 완성된다. 도 1은 이렇게 하여 제조된 콜라겐 실의 직경에 대한 분포도로서, 실의 직경은 약 35 ㎛ 내지 약 65 ㎛ 범위에 분포한다. 도 2는 상기 실을 이용하여 만든 직경 35 mm의 망사형 구조물을 도시한다.

1-2. 본 발명의 복합구조의 콜라겐층의 제조

1) 콜라겐을 초산으로 녹여 pH 4, 농도 0.5% (W/V)인 용액을 제조한 뒤 호모제나이저 (homogenizer)로 1500 rpm에서 5분동안 교반한다.

2) 크림형태가 된 용액 5 ml을 35 mm 페트리디쉬에 도포한 뒤 실시예 1-1에서 제조된 콜라겐 실로 엮은 콜라겐 망사를 넣어 -20 내지 -85℃의 초저온 냉동고에서 6시간 이상 냉동시킨다. 그리고 나서, 진공동결건조시켜서 스폰지 및 망사의 복합구조의 콜라겐층을 제조한다.

비교예 1. 가교결합시킨 콜라겐 스폰지의 제조

1) 콜라겐을 초산으로 녹여 pH 4, 농도 0.5% (W/V)인 용액을 제조한 뒤 호모제나이저 (homogenizer)로 1500 rpm에서 5분동안 교반한다.

2) 크림형태가 된 용액 5 ml을 35 mm 페트리디쉬에 도포한 뒤 -20 내지 -85℃의 초저온 냉동고에서 6시간 이상 냉동시킨다.

3) 0.25% 글루타알데하이드(GAD) 또는 UV 조사(8시간)에 의하여 콜라겐 스폰지를 가교결합시킨다.

이렇게 하여 만들어지는 본 발명의 복합구조의 콜라겐 스폰지층(가교결합되지 않음)과 종래기술인 가교결합에 의한 콜라겐 스폰지층의 인장강도에 대한 실험결과는 도 3에 도시되어 있다. 도 3a은 돼지건의 콜라겐을 이용하여 제조한 스폰지를 실시예 1과 같이 본 발명의 망사를 삽입시켜 강화시킨 콜라겐층과 비교예 1과 같이 글루타알데하이드 또는 자외선 조사로 가교결합시켜셔 강화시킨 콜라겐층의 인장강도를 도시한다. 콜라겐실로 만든 망사형태의 구조물을 스폰지 내에 삽입한 콜라겐층의 인장강도가 가교결합에 의한 콜라겐층의 인장강도보다 훨씬 우수하게 나타났음을 알 수 있다. 도 3b는 송아지 피부의 콜라겐을 이용한다는 점만 제외하고는 도 3a과 동일하며, 도 3a와 마찬가지로 복합구조의 콜라겐 스폰지층의 인장강도가 가교결합에 의한 콜라겐 스폰지층의 인장강도보다 훨씬 우수함을 도시해준다. 이때, 인장강도 측정시 사용되는 기기는 Texture analyser TA-XT2 (stable micro-system. 영국산)으로서, XTRAD라는 프로그램으로 데이타를 분석하였다. 가로 0.5 cm × 세포 2.0 cm의 콜라겐 샘플을 증앙부위를 맞추고 팽팽하게 집게로 양쪽을 고정시켜서 0.1 mm/s의 속도록 잡아 당겨서 얻어지는 데이타 값을 단면적으로 나누어 인장강도(ultimate tensile strength)를 구하였다.

나. 본 발명의 콜라겐층을 이용한 전층인공피부의 제조

1. 복합구조의 콜라겐층의 제조

실시예 1의 방법에 의하여 스폰지 및 망사의 복합구조를 취하는 콜라겐층을제조하는데, 이때, 콜라겐 스폰지 제조의 마지막 과정인 진공동결건조기에 넣기 전에 순간적으로 표면에 더운 바람을 불어넣거나(약 2 내지 3초간) 콜라겐 액체를 발라 표면의 막형성을 유도한다. 그 이유에 대해서는 상기에서 언급한 바 있다.

이렇게 해서 만들어진 복합구조의 콜라겐층은 에탄올에 18시간동안 세척한 뒤 멸균된 3차 증류수에 3회 이상 세척한 다음, PBS에 담가 배양기에 넣어 12시간 이상 보관한 뒤 배지에 담가 세포를 접종하기 전까지 둔다.

2. 전층 인공피부의 제조

2-1. 인공 진피층의 제조

1) 페트리디쉬(직경 3.5 cm)에 앞서 제조된 준비된 콜라겐 스폰지층을 넣는다.

2) 약 3백만개의 진피 섬유아세포를 10% FBS/DMEM 0.5 ml에 넣어 상기 스폰지에 분주한다.

3) 37℃, 5% CO₂인큐베이터에 넣어 4시간 정도 지난 후 2 ml의 배지를 첨가한다.

4) 다음날 배지를 교환하고, 이후, 3일 마다 배지를 교환한다.

2-2. 전층 인공피부의 제조

1) 2-1에서 제조된 인공진피 위에 각질세포를 이중배양하여 인공피부를 만든다.

2) 3 ㎛-구멍의 폴리카르보네이트 막이 달이 컬쳐 플레이트인서트(millicell, Millipore)를 6-웰 플레이트에 넣는다.

3) 배양, 수축된 인공진피를 그 인서트 위에 올려 놓는다.

4) 각질세포를 그 위에 접종한다. 직경 30 mm의 인서트 1 개당 오십만개의 각질세포를 준비하여 인공진피위에 접종하고 인서트 안팎에 각질세포용 무혈청 배지를 채운다. 인서트 직경이 30 mm인 경우 그 안에는 배지 2 ml, 밖에는 배지 2-3 ml로 채우는 것이 적당하고, 인서트 직경이 12 mm인 경우에는 그 안에 배지 0.2 ml, 밖에는 배지 3.5 ml로 채우는 것이 적당하다.

5) 이와 같이 만들어진 조직을 배지에 잠긴 상태로 1주일간 배양하면 각질세포가 빽빽히 자라서 표면을 가득 채운다.

6) 인서트 안의 배지를 제거하고 인서트 밖에만 배지로 채운다.

7) 이와 같이 대기상과 액체 배지의 경계면에서 2주일간 배양하여 각질세포를 다층으로 성장 및 분화시킨다.

8) 이때 모든 영양성분 및 성장인자들은 인공진피를 통한 확산에 의해서 표피세포층에 전달되므로 생체표피와 유사한 환경에 처해 있다고 볼 수 있다.

이렇게 해서 만들어지는 전층인공피부는 도 4에 도시되어 있다. 전자현미경 사진의 배경에 콜라겐 스폰지의 기공 구조가 보이고 그 사이에 굵은 콜라겐 실이 있으며 배양된 세포들이 보인다. 도 4b는 도 4a를 보다 확대한 사진으로서, 콜라겐 구조물의 표면에 둥근 공 모양의 각질세포와 길고 납작한 모양의 섬유아세포가 정상상태의 형태로 배양되었음을 확인할 수 있다. 도 5는 도 4의 전층인공피부를 조직학적으로 염색한 단면사진으로서, 전층인공피부가 진피층과 그 위에 다중층의 각질세포로 이루어진 표피층으로 구성되어 있음을 보여준다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 복합구조의 콜라겐층은 종래의 화학물질(예: 글루타알데하이드) 처리 또는 UV 조사에 의하여 가교결합시킨 것보다 인장강도면에서 우수하다. 또한, 생체적합성이 우수한 콜라겐만을 사용하였기 때문에, 화학물질이나 UV조사에 의한 생체조직의 경화 또는 세포 및 조직에 대한 독성 부담도 피할 수 있는 잇점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 콜라겐층은 피부이식 등에 사용되는 인공피부의 제조시에 진피지지층에 이용되어, 화상환자의 피부재건과 당뇨성 피부궤양, 정맥성 피부궤양, 욕창에 의한 궤양 등과 기타 심각한 피부결손에 대한 재건시에 봉합이 편리한 잇점을 제공한다. 또한, 실제 생체구조단백질인 콜라겐만을 이용하였기 때문에, 어떠한 화학제제가 세포 또는 조직에 적합한지 알아보고자 할때도 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (11)

1. i) 콜라겐 용액을 실로 엮어진 망사 형태로 제조하고;

   ii) 또 다른 콜라겐을 초산으로 녹여 크림상태의 용액으로 제조한 뒤, i)에서 수득된 콜라겐 실 또는 망사를 용액 내에 넣어서 -20 내지 -85℃에서 6시간 이상 냉동시킨 후, 진공동결건조함에 의하여 스폰지 형태로 제조함으로써 스폰지 및 망사의 복합구조 형태를 띤 콜라겐을 형성하고;

   iii) ii)에서 수득된 복합 구조의 콜라겐 내에서 세포를 배양하는 단계로 이루어지는, 스폰지 및 망사의 복합 구조 형태를 띤 콜라겐과 세포를 포함하는 생체 조직을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 세포가 섬유아세포임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 사용되는 콜라겐이 타입 I 콜라겐 또는 타입 I과 타입 III의 혼합 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 콜라겐이 펩신-처리된 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 실의 지름이 35 내지 65 ㎛인 방법.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 스폰지의 기공 크기가 50 내지 150 ㎛인 방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, ii) 단계의 진공동결건조 직전에 순간적으로 표면에 더운 바람을 불어넣거나 콜라겐 액체를 발라 콜라겐 스폰지의 한쪽 면에 막을 형성시킴을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는, 스폰지 및 망사의 복합구조 형태를 띤 콜라겐층과 그 내에 세포를 포함하는 생체조직.
9. 제 2 항의 방법에 따라 제조된 생체 조직을 지지층으로 하여, 그 위에 다중층의 표시 세포를 이중배양하여 인공피부를 만드는 방법.
10. 제 1 항의 방법에 따라 제조된 생체조직을 독성 테스트용 분석키트로 이용하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 세포가 간세포 또는 피부세포임을 특징으로 하는 방법.