KR20010034752A - 백신용 폐렴 구균의 콜린 결합성 단백질의 유도체 - Google Patents

백신용 폐렴 구균의 콜린 결합성 단백질의 유도체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간과 인간을 제외한 동물에서 면역 반응을 자극하기 위하여 박테리아의 면역원성 약제를 생산하는 것이다. 보다 구체적으로, 병원성 박테리아 종의 감염에 대항하여 백신의 수용체를 보호하기 위한 항체의 생산을 촉진하는 메카니즘에 관한 것으로, 알파 헬릭스를 포함하나 콜린과의 결합 영역을 제외시킨 폐렴 구균의 유도된 폴리펩타이드를 이용하여 포유류 종을 예방 접종하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양상은 병원성 박테리아 종에 대하여 진단 및/또는 보호/치료 약제로 사용할 수 있는 그러한 단백질 및 단백질 합성물에 대항하는 항체를 생산하는 것이다.

Description

백신용 폐렴 구균의 콜린 결합성 단백질의 유도체{DERIVATIVES OF PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS FOR VACCINES}
구체적인 양상에서, 본 발명은 폐렴 구균 박테리아에 의해 야기되는 중이, 비강인두, 폐와 기관지 영역, 혈액, CSF 등의 감염과 같이, 폐렴 구균에 의한 감염의 예방과 치료에 관한 것이다. 이러한 점에서, Streptococcus pneumoniae의 특정 타입이 특히 흥미롭다.
S. pneumoniae는 동물 및 인간에서 침입성 감염, 예컨대 패혈증, 뇌막염, 중이염 및 엽성 페렴의 주요한 원인이 되는 그램 양성의 박테리아이다(Tuomanen 외, NEJM 322:1280-1284(1995)). 감염 과정의 일부분으로, 폐렴 구균이 용이하게 비-감염된 인간 호흡기관의 상부 및 하부에 있는 상피세포와 결합한다. 이것은 렉틴-같은 방법으로 진핵세포의 탄수화물에 결합함으로써 이루어진다(Cundell 외, Micro. Path. 17:361-374(1994)). 결합한 박테리아가 침입성 폐렴 구균의 감염으로 전환한다는 것은 그 표면 위에 존재하는 수용체의 수와 타입을 변화시키기 위하여 상피 세포를 활성화시키는 염증성 인자가 국부적으로 발생한 것을 의미한다 (Cundell 외, Nature, 377:435-438(1995)). 명백하게, 그러한 하나의 수용체, 혈소판 활성 인자(PAF)는 폐렴 구균 박테리아와 결합하고 PAF의 출현으로부터 매우 단시간(분) 내에 폐렴 구균이 조직으로의 증가된 부착력과 침입성을 나타낸다. 특정한 수용성 수용체의 동족체가 폐렴 구균 감염의 진행을 저해하는 것으로 보여진다(Idanpaan-Heikkila 외, J. Inf. Dis., 176:704-712(1997)).
포스포릴콜린에 비-공유적으로 결합되어 있는, 콜린 결합성 단백질 족(CBPs)이 폐렴 구균의 표면에 위치하여 테이코산 또는 리포테이코산과 비-공유 회합한다. 그러한 족의 예로써 유일한 N-말단 도메인, 프롤린이 많은 영역 및 콜린과 결합하기 위해 반복되는 다수의 20 아미노산으로 이루어진 C-말단 도메인을 포함하는 CBP의 약 75kD 중량 타입으로서 콜린 결합성 단백질 A(CbpA)를 들 수 있다. CbpA 단백질의 N-말단 부분의 단편은 그 삼차원 구조의 일부로서 알파-헬릭스를 형성한다.
부가적으로, 폐렴 구균에 대항하여 넓은 보호 범위를 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 것이 본 발명의 목적이다.
정의
하기의 기술 내용의 이해를 돕기 위하여 빈번히 쓰이는 특정 방법 및/또는 용어를 구체적으로 기술한다.
"플라스미드"는 선행하는 소문자 p로 나타내고/또는 이어서 대문자 및/또는 숫자로 표시한다. 여기서 출발 플라스미드는 제한없이 공공연히 구할 수 있는 시판물이거나 이미 공개된 방법을 이용하여 유효한 플라스미드로부터 구성할 수 있다. 더욱이, 기술한 바와 동등한 플라스미드가 당해 분야에 알려져 있고 통상의 지식을 가진 자라면 명백할 것이다.
DNA의 "절단"은 DNA의 특정 서열에만 작용하는 제한 효소를 이용하여 DNA를 촉매적 절단하는 것을 의미한다. 여기서 이용되는 다양한 제한 효소는 시판되며 그 제한 조건, 보조 인자 및 다른 요구조건들은 당업자에게 알려진 대로 사용하였다. 분석적인 목적을 위해, 약 20㎕의 완충액 용액에서 통상 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 단편을 약 2유니트의 효소와 함께 사용하였다. 플라스미드 구성을 위한 DNA 단편을 분리하기 위하여 보다 큰 부피에서 20 내지 250 유니트의 효소와 함께 통상 5 내지 50㎍의 DNA를 절단하였다. 특정 제한 효소에 대해 제조자가 적절한 완충액과 기질의 양을 임의로 정할 수 있다. 일반적으로 37℃에서 약 1시간의 배양 시간을 이용하나 공급자의 지시에 따라 달라질 수 있다. 절단 후, 소망하는 단편을 분리하기 위하여 폴리아크릴아미드 겔 위에서 반응물을 곧이어 전기영동한다.
절단된 단편들은 Goeddel, D.외, Nucleic Acis Res., 8:4057(1980)에 기술된대로 8% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 크기에 따라 분리한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 단일 가닥 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성될 수 있는 두개의 상보적인 폴리데옥시뉴클레오타이드 가닥을 의미한다. 그러한 합성 올리고뉴클레오타이드는 5'포스페이트를 갖지 않으므로 키나아제가 존재할 때 ATP의 포스페이트를 포함하지 않으면서 또 다른 올리고뉴클레오타이드와 결찰하지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈포스포릴화된 단편에 결찰할 것이다.
"결찰"은 두개의 이중 가닥 핵산 단편들 간에 포스포디에스테르 결합이 형성되는 과정을 의미한다(Maniatis, T. 외, Id.,P. 146). 달리 언급하지 않는 한, 결찰은 결찰된 DNA 단편의 몰당량 약 0.5㎍에 대하여 T4 DNA 리가아제("ligase") 10 유니트를 이용하여 알려진 완충액 및 조건에 따라 수행한다.
여기서 이용된 "HPS 부분"은 CBP의 총 아미노산 서열의 프롤린이 많은 부분에 대하여 폐렴 구균 박테리아의 콜린 결합성 단백질("CBP")의 아미노 말단에 위치하는 SEQ ID NO:2 배열의 아미노산 서열이다.
본 출원에서 사용된 용어 "동일성", "% 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 "최적 적합"(서열 요소들, 여기서 요소들은 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 에 상응하여 정렬한 동일성이 가장 큰 수가 생산되도록)을 위해 정렬한 두개의 접촉한 서열간에 차이를 계산한 것이고 모든 개개의 차이들은 동일성에 있어서 각각의 차이로서 고려된다. 여기에서 참조 서열의 길이 위의 개개 요소들의 모든 차이(초기 서열("참조 서열")에 대하여 삽입 및 삭제에 의해 야기된) 및 다른 요소들의 각각의 치환들(참조 서열의 개개 요소에 있어서)이 두 서열간의 차이에 대한 총 수를 계산하는데 개개의 차이로서 고려된다. 개개의 차이는 초기 서열(참조 서열)이 다른 서열(상대 서열)을 얻어서 변하거나 새로운 서열(상대 서열)이 단순히 정렬되는 경우 두 서열간에 비교하는 것이고 그 참조 서열과 비교하는 것이다. 두개의 정렬된 서열을 비교할 때, 참조 서열의 길이 위의 "최적 적합" 정렬에 의해 야기된 두 서열간의 모든 개개의 차이는 동일성의 목적을 위한 개개의 차이로서 고려된다. 만약 규정된 가장 낮은 동일성을 만족하는 정렬이 존재하면 그 정렬이 참조 서열에 대해 가장 낮은 동일성을 갖는 것이다. 예를 들어, 다음은 각 100 요소들을 갖는 두개의 서열을 비교 가정한 것으로, 두 서열을 최적 적합을 위해 정렬하고 여기서 하나의 서열은 "참조 서열"로, 다른 하나는 "상대 서열"로 간주한다. 두 서열간에 개개의 모든 정렬 차이를 참조 서열의 길이 위에서 계수하고 요소 변화의 총수를 알기 위해 상대 서열에서 개개 요소의 치환 변화의 수(다르게 정렬된 요소들)를 더한다. "백분율 차이"를 구하기 위해 차이의 총수(예를 들어 차이 7 및 치환 3)를 참조 서열의 길이에서 요소들의 총수(100 요소)로 나눈다(10/100). 얻어진 백분율 차이(10%)를 100%에서 빼면 "% 차이"로서 90% 동일성을 얻는다. 동일성 계산에서 두 서열에 존재하는 개개의 모든 차이는 동일성 측정을 위해 최적 적합 정렬된 두개의 서열에 존재하는 불연속적인 비교 길이(참조 서열의 길이)에 대하여 상기 방법에 의해 고려된다. 따라서 그러한 동일성 계산을 위해 다른 연산 방법은 불필요하다.
본 발명의 문맥에서 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드에 대하여 "분리된"이란 물질이 본래의 환경(예컨대, 천연적으로 발생한다면 천연 상태)으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 존재하는 천연 발생의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않은 것이고 자연계에 존재하는 공-존재하는 물질의 일부 또는 전체로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된 것이다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부가 될 수 있고/또는 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분이 될 수 있으며 그러한 벡터 또는 조성물에서 여전히 분리되어 있으므로 그 자연 환경의 일부가 되지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 분리된 형태로 생산되며 균질하게 정제된 것이 바람직하다.
본 발명의 요약
본 발명의 한 양상은 폐렴 구균 박테리아의 감염을 치료하거나 예방하기 위한 백신에 관한 것으로서, 다른 종류의 폐렴 구균 박테리에 대해, 고도로 보존된(highly conserved) 면역원성 알파-헬릭스 부분(일반적으로 SEQ ID NO:1에 제시된 "일치(consensus)" 아미노산 서열에 상응)을 갖는 폐렴 구균의 표면-결합 단백질, 동족체 또는 변종의 한가지 이상의 폴리펩타이드 단편(truncate)(이 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다)을 면역원으로서 이용한다. 바람직하게는, C-말단 콜린과 결합하는 부분은 그러한 폴리펩타이드에 존재하지 않는 것이 좋다. HPS 아미노산 서열이 존재하지 않는 폴리펩타이드가 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO:1에 제시된 "일치" 아미노산 서열에 일반적으로 상응하는 고도로 보존된 면역원성 알파-헬릭스 부분이 SEQ ID NO:19에 제시된 아미노산 배열과도 일치하는 폴리펩타이드인 것이 좋다(SEQ ID NO:19의 아미노산 1 내지 103이 SEQ ID NO:1의 아미노산 1 내지 103과 동일하다). 또한 재조합으로 생산된, HPS 부분 및 콜린과의 결합 부분을 모두 잃은 분리된 폴리펩타이드가 백신으로서 바람직하다.
가장 바람직한 백신은 폐렴 구균의 여러 타입에 대하여 고도로 보존된 면역원성 알파-헬릭스 부분을 포함하며 폐렴 구균의 표면-결합하는 단백질, 동족체 또는 변종의 하나 이상의 폴리펩타이드 단편이고, 이 때 폴리펩타이드는 C-말단의 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다. 추가로, 재조합으로 생산되고 그러한 구조를 갖는 분리된 폴리펩타이드가 바람직하다. 또한 C-말단 콜린과의 결합 부분 또는 HPS 부분의 어느 쪽도 포함하지 않는 폴리펩타이드가 바람직하다.
본 발명은 알파 헬릭스를 형성할 수 있는 면역원성 부분을 포함한 폴리펩타이드로 이루어진 백신을 추가로 생산하며, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 87%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 이 때 분리된 폴리펩타이드는 C-말단 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다. SEQ ID NO:19의 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성, 바람직하게는 적어도 87%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열로 구성된 폴리펩타이드가 부가로 바람직하다. 바람직하게도, 분리된 폴리펩타이드의 서열이 HPS 부분(SEQ ID NO:2)도 C-말단 콜린과의 결합 부분도 포함하지 않는다. 추가로, 재조합으로 생산되고 그러한 구조를 갖는 분리된 폴리펩타이드가 바람직하다. 보다 구체적으로, S. pneumoniae 박테리아의 여러 타입의 알파 헬릭스 구조에 상응하는 그러한 폴리펩타이드가 고려된다. 그러한 S. pneumoniae 박테리아의 혈청타입 1-5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F가 보다 바람직하다. 박테리아의 혈청타입에 대한 예는 표준 ATCC 카탈로그에서 쉽게 알 수 있다.
부가적인 양상에서, 본 발명은 S. pneumoniae에 대항하는 백신을 추가로 생산한다. 이것은 천연 발생의 S. pneumoniae 콜린과 결합하는 다른 폴리펩타이드로부터 각각 유도된, 대다수의 알파-헬릭스 부분으로 이루어진 합성 또는 재조합 폴리펩타이드로 구성되고 알파-헬릭스 부분은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 가지며 분리된 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다. 부가로 알파-헬릭스 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:19의 아미노산 배열과 적어도 85% 동일한 것이 바람직하다. 바람직하게도 그러한 합성 폴리펩타이드는 HPS 부분도 콜린과의 결합 부분도 포함하지 않는다. 알파 헬릭스 부분이 합성 변종의 아미노산 서열(또는 천연 발생과 변종 서열의 혼합물)인 그러한 사슬 구조 폴리펩타이드의 동족체 및 변종이 또한 본 발명에서 고려되어진다. 바람직한 양상에서, S. pneumoniae의 혈청타입 1-5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F에 상응하여 적어도 10개의 다른 알파 헬릭스 구조를 갖는 사슬 백신 폴리펩타이드가 생산된다. 부가로 바람직한 것은 적어도 15개, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 그러한 알파-헬릭스 구조를 포함하는 폴리펩타이드이고 그리고 그보다 바람직하게는 S. pneumoniae의 혈청타입 1-5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F 각각에 대해 적어도 하나씩의 알파-헬릭스 구조를 포함하는 폴리펩타이드이다. 또 다른 바람직한 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1에 일치하는 SEQ ID NOS:3-18의 아미노산 서열로부터 각각의 알파 헬릭스 구조를 포함하는 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 여러 타입의 폐렴 구균 박테리아에 대하여 고도로 보존된 면역원성 부분을 포함하며 폴리펩타이드에 대항하는 항체로 형성된 수동 면역 백신에 관한 것이다. 면역원성 부분은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 하기에 기술하는 동일성을 갖는 알파-헬릭스를 형성할 수 있고 폴리펩타이드는 C-말단 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않으며, 상기 항체는 하나 이상의 S. pneumoniae 종과 결합할 것이다. 바람직하게도, 그러한 폴리펩타이드가 천연 폐렴 구균의 표면 결합성 단백질의 단편이라면 그 HPS(적용 가능한) 및 콜린과의 결합 부분 모두가 폴리펩타이드로부터 제거된다. 그러한 수동 면역 백신을 면역 절충 환자, 미숙한 면역계를 가진 환자(예컨대, 어린아이) 또는 이미 감염이 진행되고 있는 환자의 폐렴 구균 감염을 예방 및/또는 치료하는데 이용할 수 있다. 이러한 방법에서 본 발명의 부가의 양상에 따라서, 합성 또는 재조합 폴리펩타이드로부터 백신을 생산할 수 있다. 이 때 폴리펩타이드는 S. pneumoniae의 두가지 이상의 다른 콜린과 결합하는 폴리펩타이드의 보존된 알파 헬릭스 부분을 포함한다.
본 발명은 또한 분리된 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 폴리펩타이드는 여러 타입의 폐렴 구균 박테리아에 대하여 고도로 보존된 면역원성 부분을 가지며 그 부분은 알파-헬릭스(일반적으로 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:19에 상응하여)를 형성할 수 있고, 인간이 아닌 포유류 종에서 유용한, 예를 들어 진단제 및 백신과 같이, 항체를 증가시키기 위하여, 분리된 폴리펩타이드는 콜린과 결합하는 부분을 포함하지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 여러 타입의 페렴 구균 박테리아에 대하여 고도로 보존된 면역원성 부분을 포함하고 그 부분은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열에 일반적으로 상응하는 서열을 갖는 알파 헬릭스를 형성할 수 있으며, 이 때 분리된 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는, 폴리펩타이드의 생산에 관한 것이다. 바람직하게도 그러한 재조합 생성물은 HPS 부분(적용 가능한) 및 콜린과의 결합 부분이 존재하지 않는, 천연 폐렴 구균의 표면과 결합하는 단편화된 폴리펩타이드이다.
또 다른 양상에서 본 발명은 콜린과 결합하는 분리된 폴리펩타이드에 관한 것으로, 이 폴리펩타이드에서 콜린과 결합하지 않는 영역은 천연 발생의 폐렴 구균의 표면과 결합하는 단백질에 상응하고 SEQ ID NOS:3-18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 부분에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 본 발명은 일반적으로 SEQ ID NO:1에 상응하는 보존된 알파-헬릭스 부분을 포함하고 적어도 85%의 동일성을 가지며, 여기서 분리된 폴리펩타이드가 바람직하게 콜린과의 결합 영역을 갖지 않는 그러한 폴리펩타이드의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 SEQ ID NO:3-18로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 분리된 폴리펩타이드를 생산하는 것이다. 바람직하게도, 그러한 분리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:3-18로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95% 이상 및 보다 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 부가로 본 발명은 그러한 폴리펩타이드 단편에 관한 것이다.
부가의 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NOS:1과 3-18로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산를 가지며 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 보체와 고도의 긴축 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 S. pneumoniae CBP 폴리펩타이드를 생산한다. 구체적으로 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 단편으로 이루어진 폴리펩타이드가 바람직하다. 보다 바람직한 것은 그러한 폴리펩타이드가 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 근접한 아미노산 서열로 이루어지는 것이다. 그리고 보다 바람직한 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것이다.
또 다른 양상에서 본 발명은 상기 기술한 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 생산하는 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 형태이고, DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA이다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥이고, 만약 단일 가닥이라면 코딩하는 가닥이거나 비-코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다. SEQ ID NOS:3-18 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(또는 그러한 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS:20-35에서 보여지는 코딩 서열 중 하나이거나 서열을 코딩하는 다른 코딩 서열, 유전 코드의 과잉 또는 퇴화의 결과, SEQ ID NOS:20-35의 DNA로서 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 서열일 수 있다.
SEQ ID NOS:3-18의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 단지 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열; 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열(및 선택적으로 부가의 코딩 서열) 및 비-코딩 서열, 예컨대 인트론 또는 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 비-코딩 서열. 코딩되는 폴리펩타이드는 단지 단일 알파-헬릭스 부분 또는 다중 알파-헬릭스 부분으로 이루어지고 독립적으로 또는 집합적으로 그러한 알파 헬릭스 영역의 N-말단 서열 5' 및/또는 "X" 구조 또는 프롤린이 많은 영역에 일치하는 서열을 포함한다(예컨대, 도 1에 표시)
본 발명은 부가로 SEQ ID NO:3-18 중 하나의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95%의 동일성 및 바람직하게는 적어도 97%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 부가로 본 발명은 SEQ ID NO:1에 상응하는 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 최소한의 폴리뉴클레오타이드 부분을 포함하는 그러한 폴리뉴클레오타이드의 단편에 관한 것이다.
따라서, "폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드"란 용어는 부가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 단지 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 구체적으로 폴리펩타이드는 도 1에 개략적으로 기술한 어떠한 또는 모든 타입의 구조를 포함할 수 있다.
본 발명은 부가로 SEQ ID NOS:3-18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체를 코딩하는 상기 기술한 폴리뉴클레오타이드의 변종에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드의 변종은 천연적으로 발생하는 대립 유전자의 폴리뉴클레오타이드의 변종이거나 또는 비천연적인 것일 수 있다. 그러한 코딩 폴리뉴클레오타이드에 대한 보체는 동일한 또는 유사한 폴리펩타이드를 코딩하기 위한 폴리뉴클레오타이드의 분리를 위해 사용할 수 있다. 구체적으로 그러한 방법은 S. pneumoniae의 다른 혈청타입으로부터 단편을 코딩하는 알파 헬릭스를 얻는데 유용하고 특히 다중 알파 헬릭스 단편을 포함하는 "사슬" 폴리펩타이드 백신의 생산에 유용하다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NOS:3-18을 갖는 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체를 코딩하는 변종들에 대한 폴리뉴클레오타이드의 변종 뿐만 아니라 SEQ ID NOS:3-18의 서열 목록에서 보여지는 동일한 폴리펩타이드를 포함하여 그러한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 그러한 뉴클레오타이드 변종은 삭제, 치환 변종 및 첨가 또는 삽입 변종을 포함한다.
상기 기술한대로, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS:20-35로서 서열 목록에서 보여지는 코딩 서열의 천연 발생적인 대립 유전자 변종이 되는 코딩 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 알려져 있듯이, 대립 유전자 변종은 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 삭제 또는 첨가된 폴리뉴클레오타이드 서열의 교체 형태이고 이 때 코딩된 폴리펩타이드의 실질적인 기능은 변하지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 폴리펩타이드의 정제를 위해 필요한 마커 서열에 구조적으로 융합되는 코딩 서열을 갖는다. 마커 서열은, 예를 들어 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙한 폴리펩타이드를 정제하기 위하여 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그(Tag)이거나 또는 예를 들어 포유류 숙주, 예컨대 COS-7 세포를 이용하는 경우 헤마글루티닌(HA) 태크일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프와 일치한다(Wilson, I. 외, Cell, 37:767(1984)).
부가로 본 발명은 표적 서열과 서열의 보체간에 적어도 70% 및 바람직하게는 80%의 동일성이 있다면 상기 기술한 서열들의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드(혼성화 표적 서열)에 관한 것이다. 표적 서열과 혼성화하기 위하여 적어도 85%의 동일성이 바람직하다. 혼성화하기 위하여 표적 서열과 폴리뉴클레오타이드 보체 서열간의 동일성이 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 보다 바람직하게는 적어도 97%인 서열이 바람직하다. 본 발명은 부가로 표적 서열 및 SEQ ID NOS:3-18로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 모두의 보체에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 긴축 조건하에 그 보체 뿐만 아니라 상기 기술한 폴리뉴클레오타이드의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 여기서 이용된 "긴축 조건"은 혼성화를 위하여 표적 서열과 폴리뉴클레오타이드의 보체 서열간에 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의 동일성만 있다면 상응하는 서열과 폴리뉴클레오타이드의 보체가 혼성화를 일으키는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서 상기 기술한 폴리뉴클레오타이드의 보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드는 항체와 상호-반응하는 면역원성 부분을 보유하며 SEQ ID NOS:3-18에 따른 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
부가의 양상에서, 본 발명은 히스티딘 라벨(또는 다른 적절한 라벨)을 가지며 그 라벨로 인하여 상기 논의한 총-길이 단백질, 단편, 동족체 또는 변종으로 분리가능한 상기의 폴리펩타이드 및 백신을 생산한다.
본 발명의 또 다른 양상은 표면-결합하는 CBP 단백질을 갖는 폐렴 구균 박테리아에 의해 매개되는 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 알파-헬릭스(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진다)를 형성하는 CBP 표면-결합 단백질을 가지며 S.pneumoniae에 의해 매개되는 감염성 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 대한 것이다. 부가의 바람직한 양상에서 본 발명은 인간에서 그러한 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 생산한다.
본 발명의 또 다른 양상은 CBP 표면-결합 단백질을 포함한 폐렴 구균 박테리아에 의해 매개되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 기술한대로 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 항체(단일 클론, 다중 클론 또는 혈청)를 이용하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 SEQ ID NO:1의 일치 서열에 대해 상기 기술한 동일성을 갖는 알파 헬릭스 부분을 포함하는 S. pneumoniae CBP 단백질에 의해서 매개되는 감염성 질병의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 부가의 바람직한 양상에서, 본 발명은 항체를 상기 기술한 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드를 포함하는 알파-헬릭스에 이용함으로써 인간에게 발생하는 이염 매개체, 비강인두염, 기관지 감염 등을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 1998. 5. 15. 선출원된 미국 특허 출원 제 60/085,743호 및 1998. 4. 7. 선출원된 미국 특허 출원 제 60/080,878호의 이득을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 박테리아 항원과 그 용도 분야, 예를 들어 인간과 동물에서 면역 반응을 자극하기 위한 면역원성 약제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 병원성 박테리아 종의 감염에 대항하여 백신의 수용체를 보호하기 위한 항체의 생산을 촉진하는 메카니즘에 관한 것으로, 콜린 결합성 폴리펩타이드로부터 얻은 알파 헬릭스-형성의 폴리펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드를 이용하여 포유류 종을 예방 접종하는 것에 관한 것이다. 부가로, 본 발명은 그러한 폐렴 구균의 감염을 진단 및 치료하는데 있어서 진단과 수동 면역 치료에 유용한 그러한 폴리펩타이드에 대항하는 항체와 길항제에 관한 것이다.
도 1은 N-말단에서 C-말단까지 각각에서 보여지는 폐렴 구균 CBP 단백질의 다이아그램이다. (a)N-말단 서열, (b)몇몇 CBP 폴리펩타이드에서는 존재하지 않는 보존된 단편 영역(R1)을 형성하는 하나의 가능한 알파-헬릭스, (c)두개의 보존된 알파-헬릭스 단편을 연결하는 선택적이며 작은 아미노산의 연결 서열(X), (d)첫번째 일치 서열(SEQ ID NO:1에 일치)과 관련하여 일치 서열 영역(R2)을 형성하는 두번째 가능한 알파-헬릭스, (e)프롤린이 많은 영역 서열, (f)콜린과 결합 반복 영역 및 (g)C-말단 꼬리 서열. 여기에 연관하여 선택적인 HPS 서열이 프롤린이 많은 서열의 5' 그리고 R1, X 및 R2 영역의 3'에서 천연 발생할 수 있다.
도 2는 1600 cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae SP317(생쥐에서)에 대항하여, 폐렴 구균 CBP 단편 폴리펩타이드, NR1XR2(프롤린과 콜린 결합 영역을 잃고 두개의 보존된 알파-헬릭스 영역 R1과 R2를 포함하는 단편)을 이용하여 31일째 된 토끼 면역 혈청에 의해 생산된 수동 면역 보호 결과를 나타낸 것이다. 감염에 앞서 단편 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 80%가 관찰 기간 14일 동안 살아남았다. 대조적으로 컨트롤 혈청(면역전 토끼 혈청)으로 면역된 모든 생쥐는 7일 안에 모두 죽었다.
도 3은 3450 cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae SP317(생쥐에서)에 대항하여, 폐렴 구균 CBP 단편 폴리펩타이드, NR1XR2(프롤린과 콜린 결합 영역을 잃고 두개의 보존된 알파-헬릭스 영역 R1과 R2를 포함하는 단편)을 이용하여 52일째 된 토끼 면역 혈청에 의해 생산된 수동 면역 보호 결과를 나타낸 것이다. 감염에 앞서 단편 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 100%가 관찰 기간 10일 동안 살아남았다. 대조적으로 컨트롤 혈청(면역전 토끼 혈청)으로 면역된 생쥐의 90%가 10일 안에 모두 죽었다.
도 4는 580 cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae SPSJ2(생쥐에서)에 대항하여, 폐렴 구균 CBP 단편 폴리펩타이드, NR1XR2(프롤린과 콜린 결합 영역을 잃고 두개의 보존된 알파-헬릭스 영역 R1과 R2를 포함하는 단편)을 이용하여 31일째 된 토끼 면역 혈청에 의해 생산된 수동 면역 보호 결과를 나타낸 것이다. 감염에 앞서 단편 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 50%가 관찰 기간 10일 동안 살아남았다. 대조적으로 컨트롤 혈청(면역전 토끼 혈청)으로 면역된 모든 생쥐는 8일 안에 모두 죽었다.
도 5는 560 cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae SPSJ2(생쥐에서)에 대항하여, 폐렴 구균 CBP 단편 폴리펩타이드, NR1X(프롤린과 콜린 결합 영역 뿐 아니라 두번째 보존된 알파-헬릭스 영역 R2를 잃은 단편)에 의해 생산된 능동 면역 보호 결과를 나타낸 것이다. 감염에 앞서 NR1X CBP 단편으로 능동 면역된 생쥐의 80%가 관찰 기간 14일 동안 살아남았다. 대조적으로 PBS의 컨트롤(겉보기 생쥐) 및 보조제로 면역된 모든 생쥐는 8일 안에 모두 죽었다.
도 6은 680 cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae SPSJ2(생쥐에서)에 대항하여, 폐렴 구균 CBP 단편 폴리펩타이드, NR1XR2(프롤린과 콜린 결합 영역을 잃고 두개의 보존된 알파-헬릭스 영역 R1과 R2를 포함하는 단편)에 의해 생산된 능동 면역 보호 결과를 나타낸 것이다. 감염에 앞서 NR1XR2 CBP 단편으로 능동 면역된 생쥐의 50%가 관찰 기간 14일 동안 살아남았다. 대조적으로 컨트롤(SP90) 단백질 및 보조제로 면역된 모든 생쥐는 9일 안에 모두 죽었다.
도 7은 여러 타입의 S. pneumoniae로부터 얻은 CBP 폴리펩타이드의 아미노 말단에 대한 정렬 결과이며 비교를 위해 각 줄(행들의 세트)의 상부에 일치 서열을 기록한다. 비교를 위한 일치 서열은 "대다수(majority)" 서열(SEQ ID NO:36)로서 표시한다. 하나의 문자 코드는 "최적 적합"을 위해 정렬된 서열을 대표하며 여기서 서열간에 표시된 대시(dash)는 인접한 서열과의 공간적인 차이를 나타낸다.
도 8은 도 7 및 거기에 기술된 아미노산 서열에 대한 서열쌍의 차이를 표시한 것이다. 동일성 잔사량 표를 이용한 클러스탈(clustal) 방법을 사용한다. 도 7에 기술한 아미노산 서열에 대하여 그러한 비교를 위한 퍼센트 동일성을 보고한다.
도 9는 여러 타입의 S. pneumoniae로부터 얻은 CBP 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 첫번째 헬릭스 영역에 대한 정렬 결과이며 비교를 위해 각 줄(행들의 세트)의 상부에 일치 서열을 기록한다. 비교를 위한 일치 서열은 "대다수(majority)" 서열(SEQ ID NO:38)로서 표시한다. 하나의 문자 코드는 "최적 적합"을 위해 정렬된 서열을 대표하며 여기서 서열간에 표시된 대시(dash)는 인접한 서열과의 공간적인 차이를 나타낸다.
도 10은 도 9 및 거기에 기술된 아미노산 서열에 대한 서열쌍의 차이를 표시한 것이다. 동일성 잔사량 표를 이용한 클러스탈(clustal) 방법을 사용한다. 도 9에 기술한 아미노산 서열에 대하여 그러한 비교를 위한 퍼센트 동일성을 보고한다.
도 11은 여러 타입의 S. pneumoniae로부터 얻은 CBP 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 영역 X에 대한 정렬 결과이며 비교를 위해 각 줄(행들의 세트)의 상부에 일치 서열을 기록한다. 비교를 위한 일치 서열은 "대다수(majority)" 서열(SEQ ID NO:37)로서 표시한다. 하나의 문자 코드는 "최적 적합"을 위해 정렬된 서열을 대표하며 여기서 서열간에 표시된 대시(dash)는 인접한 서열과의 공간적인 차이를 나타낸다.
도 12는 도 11 및 거기에 기술된 아미노산 서열에 대한 서열쌍의 차이를 표시한 것이다. 동일성 잔사량 표를 이용한 클러스탈(clustal) 방법을 사용한다. 도 11에 기술한 아미노산 서열에 대하여 그러한 비교를 위한 퍼센트 동일성을 보고한다.
도 13은 여러 타입의 S. pneumoniae로부터 얻은 CBP 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 두번째 헬릭스 영역 A에 대한 정렬 결과이며 비교를 위해 각 줄(행들의 세트)의 상부에 일치 서열을 기록한다. 비교를 위한 일치 서열은 "대다수(majority)" 서열(SEQ ID NO:1)로서 표시한다. 하나의 문자 코드는 "최적 적합"을 위해 정렬된 서열을 대표하며 여기서 서열간에 표시된 대시(dash)는 인접한 서열과의 공간적인 차이를 나타낸다.
도 14는 도 13 및 거기에 기술된 아미노산 서열에 대한 서열쌍의 차이를 표시한 것이다. 동일성 잔사량 표를 이용한 클러스탈(clustal) 방법을 사용한다. 도 13에 기술한 아미노산 서열에 대하여 그러한 비교를 위한 퍼센트 동일성을 보고한다.
도 15는 여러 타입의 S. pneumoniae로부터 얻은 CBP 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 두번째 헬릭스 영역 B에 대한 정렬 결과이며 비교를 위해 각 줄(행들의 세트)의 상부에 일치 서열을 기록한다. 비교를 위한 일치 서열은 "대다수(majority)" 서열(SEQ ID NO:19)로서 표시한다. 하나의 문자 코드는 "최적 적합"을 위해 정렬된 서열을 대표하며 여기서 서열간에 표시된 대시(dash)는 인접한 서열과의 공간적인 차이를 나타낸다.
도 16은 도 15 및 거기에 기술된 아미노산 서열에 대한 서열쌍의 차이를 표시한 것이다. 동일성 잔사량 표를 이용한 클러스탈(clustal) 방법을 사용한다. 도 15에 기술한 아미노산 서열에 대하여 그러한 비교를 위한 퍼센트 동일성을 보고한다.
본 발명에서 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 구성요소를 포함하는 폴리펩타이드를 적용시킴으로써 S. pneumoniae 감염에 대항하여 보호 반응을 생산하는 백신을 생산한다:
(a)알파 헬릭스 구조를 생산하고 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 가지며 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않는 아미노산 서열,
(b)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 알파 헬릭스 부분으로 구성되고 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않으며 천연적으로 발생한 S. pneumoniae 폴리펩타이드로부터 분리된 단편, 및
(c)SEQ ID NO:19의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 알파 헬릭스 부분으로 구성되고 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않으며 천연적으로 발생한 S. pneumoniae 폴리펩타이드로부터 분리된 단편. 바람직한 양상에서 그러한 분리된 단편 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:3-18로 구성되는 군으로부터 선택되며 콜린과의 결합 영역 및, 적절하다면 HPS 영역을 포함하지 않는다; 또는 최소한 SEQ ID NO:1의 일치 서열에 상응하는 알파 헬릭스 부분을 포함하는 단편. 구체적으로 적어도 그러한 알파 헬릭스 영역을 포함하는 단편 폴리펩타이드를 사용하거나 그러한 알파 헬릭스 단편을 두개 이상 포함하는 재조합 면역원 폴리펩타이드를 사용하는 백신이 바람직하다. 그러한 폴리펩타이드는 하나 이상의 단편의 다중 알파 헬릭스 부위를 포함하는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다. 부가로 다른 타입의 폐렴 구균 박테리아로부터 얻은 두개 이상의 단편의 알파 헬릭스 부위에 일치하는 적어도 두개의 알파 헬릭스 영역을 포함하는 재조합 면역원 폴리펩타이드가 바람직하다. 그러한 폴리펩타이드는 하나 이상의 다른 타입의 폐렴 구균 박테리아로부터 얻은 다중 알파 헬릭스 부위를 포함하는 재조합 폴리펩타이드이다.
본 발명에서, S. pneumoniae로부터 유도된 단편화 표면-결합 폴리펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드, 즉 알파 헬릭스 부위를 포함하고 그 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 일반적으로 일치하며 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않는 분리된 폴리펩타이드를 생산한다. 바람직하게도 상기 분리된 폴리펩타이드는 또한 천연적으로 발생하는 알파-헬릭스 형성 영역의 반복을 제거하며 존재할 수 있는 어떠한 HPS 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 목적은 알파 헬릭스 부분을 갖는 폐렴 구균의 표면-결합 폴리펩타이드로 이루어지며 여기에 콜린과의 결합 영역이 존재하지 않는 면역원성 폴리펩타이드로 구성되는 백신(진단 백신 또는 수동 백신으로 이용하는 항체를 생산하기 위하여)을 면역원성 조성물로서 이용하는 것이다. 한 구체예에서 S. pneumoniae 박테리아로부터 그러한 단편화 단백질(기능적 동족체 뿐 아니라, 천연 또는 조합으로 생산된)을 유도한다. 보다 구체적으로, 어떠한 발생하는 HPS 영역 및 원 단백질의 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않고 단일 알파 헬릭스 부분을 갖는 S. pneumoniae 폴리펩타이드를 유도한다.
바람직한 구체예에서, 그러한 면역원성 조성물은 백신(또는 진단에 이용하는 항체를 생산하기 위한 면역원 또는 백신)으로서의 용도를 위한 것이고 여기서 면역원성 조성물의 활성 성분은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 하나 이상 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다:
(a)SEQ ID NOS:3-19에서 선택된 아미노산 서열,
(b)(a)와 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 또는
(c)(a) 또는 (b)의 단편, 여기서 그러한 단편은 SEQ ID NO:1의 일치 서열에 상응하는 적어도 하나의 알파 헬릭스 부분을 포함하고 콜린과의 결합 영역을 포함하지 않는다. 바람직하게도, 그러한 백신은 원 단백질에서 아미노산 서열의 일부로서 발생하는 HPS 영역도 콜린과의 결합 영역도 포함하지 않는 폴리펩타이드를 이용한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, SEQ DI NO:1과 적어도 85%의 동일성(바람직하게는 87% 및 보다 바람직하게는 적어도 90%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 분리된 폴리펩타이드로 이루어진 백신을 생산한다. 이 분리된 펩타이드는 적용가능한 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않고 또한 바람직하게는 HPS 부분을 포함하지 않는다. 바람직한 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NOS:3-18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에서 알파 헬릭스 영역의 5'에 위치하는 하나 이상의 N-말단 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 또한 하나 이상의 프롤린 영역(도 1에서 영역 "P") 및/또는 연결 영역(도 1에서 영역"X")을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서 폐렴 구균의 감염을 진단하기 위한 항체를 생산하기 위해, 또는 면역원성 조성물의 면역원(들)에 대항하여 항체의 고농도를 유지하기 위한 이차 접종 백신 뿐 아니라 폐렴 구균의 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신을 생산하기 위해 그러한 면역원성 조성물을 이용할 수 있다.
폐렴 구균 감염의 진단 그리고 예방 및/또는 치료를 위한 항체를 생산하기 위해 다른 항원들을 고려하는 동안 진보되고 보다 효과적인 백신이 요구되었다. 그러한 백신은 표면-결합의 폴리펩타이드를 갖는 폐렴 구균에 의해 매개되는 박테리아성 감염을 억제하는데 향상 또는 진보된 효과를 가져야 한다. 부가로, 불필요한 비용을 억제하고 폐렴 구균 혈청 타입에 대해 넓은 보호 범위를 생산하기 위하여 다양한 폐렴 구균 중에서 고도로 보존된 폐렴 구균의 표면-결합 폴리펩타이드 부분에 일치하는 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 요구된다. 바람직하게도, 그러한 폴리펩타이드는 원 폴리펩타이드의 그 이외 부분들, 예컨대 콜린 과의 결합 영역 및/또는 HPS 영역에 일치하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
병원성 폐렴 구균 박테리아의 감염에 대항하여 보호하고 또한 진단 약제로서의 용도를 위해, 고농도 특정 면역 혈청을 촉진시키며 폐렴 구균 박테리아의 표면에 결합하는 폴리펩타이드의 고도로 보존된 부분으로 이루어진 진보된 항원성 조성물이 요구된다.
이러한 점에서, 본 발명의 단편화 폴리펩타이드, 기능성 변종 동족체 및 재조합으로 생산된 단편화 폴리펩타이드가 병원성 박테리아에 대항하는 면역성을 수여하는 항체의 생산을 촉진시키기 위하여 백신 조성물을 제조하기 위한 면역원으로서 유용하다. 부가로, 항원 성분으로서 정제된 단백질을 포함하는 백신의 제조가 당해 분야에 잘 알려져 있다.
일반적으로, 백신은 수용액 또는 현탁액의 형태로 주사 가능하게 제조된다. 오일 기제의 백신이 예컨대 인할링(inhaling)을 위해 잘 알려져 있다. 사용 전에 용해 또는 현탁되는 고체 형태를 또한 형성할 수 있다. 일반적으로 활성 성분과 양립할 수 있고 약리적 용도를 위해 허용가능한 약리적 담체를 첨가한다. 그러한 담체의 예로는 물, 살린 용액, 덱스트로스 또는 글리세롤을 들 수 있고 이에 제한하는 것이 아니다. 또한 담체의 혼합물을 사용할 수 있다.
부가로 백신의 효과를 향상시키기 위해 pH를 안정화시키는 물질 또는 보조제로서 작용하는 습윤제 또는 유화제를 백신 조성물에 혼입할 수 있다.
백신은 일반적으로 비경구적인 투여를 위해 배합되고 피하로 또는 근육내로 주입된다. 그러한 백신은 또한 당해 분야에 알려져 있는 방법을 이용하여, 좌약으로서 또는 경구 투여를 위해 배합될 수 있다.
병원성 박테리아에 대해 면역성을 부여하기에 충분한 백신의 양은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 측정한다. 이 양은 백신 수용체의 특성 및 요구되는 면역 정도에 기초하여 결정한다. 통상적으로, 투여되는 백신의 양은 의사의 판단에 따라 결정된다. 피하내 또는 근육내 주사로 백신을 투여하는 경우 정제된 단백질 50 내지 500㎍의 범위로 주어진다.
용어 "그것의 요구 환자"란 CbpA를 생산하는 병원성 폐렴 구균 박테리아, 또는 그런 종류의 다른 것, 바람직하게 S. pneumoniae에 의해 감염된 또는 아마도 감염될 사람을 언급한다(그러나 몇몇 경우에 그러한 환자를 모의 실험하기 위해 생쥐 모델을 이용할 수 있다).
백신으로서의 용도에 부가하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 수동 면역 치료의 용도, 진단 시약의 용도 및 친화성 크로마토그래피와 같은 다른 처리에서 시약의 용도로 항체의 생산을 자극하는 항원으로서 이용할 수 있다.
상기 기술한 면역원성 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 정제 가능하게 하는 마커 서열에 구조적으로 융합되는 코딩 서열을 가질 수 있다. 예를 들어 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합되는 성숙한 폴리펩타이드를 정제하기 위하여 pQE-9 벡터에 의해 제공되는 헥사-히스티딘 태그이거나, 포유류 숙주, 예컨대 COS-7 세포를 이용하는 경우 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. HA 태크는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다(Wilson, I. 외, Cell, 37:767(1984)).
본 발명에 따른 S. pneumoniae 폴리펩타이드에서 알파 헬릭스 아미노산 단편의 다중 코일 구조를 동정하는 것은 서로에 대하여 프롤린이 많은 영역의 위치에 따라 결정된다. 부가로 두개 이상의 알파-헬릭스 구조간에 위치하는 "X" 영역은 선택적으로 코일 구조내에 코일을 형성하는 역할을 할 수 있다. 그러한 구조의 상대적인 형태를 결정하는데 표준적인 삼차원 단백질 모델을 이용할 수 있다. 그러한 삼차원 단백질 모델링에 유용한 컴퓨터 프로그램의 예로 쌍코일 스코어링형 프로그램("쌍코일 프로그램"(PairCoil program))이 Berger 등에 의해 Proc. Natl. Acad. of Sci.(USA), 92:8259-8263(August 1995)에 기술되었다. 쌍코일 프로그램은 아미노산 서열에서 감긴-코일 영역의 위치를 예견하기 위해 수학적 연산방식을 이용하는 컴퓨터 프로그램이다. 그러한 컴퓨터 프로그램의 부가의 예로써 다중코일 스코어링형 프로그램("다중코일 프로그램")이 Wolf 등에 의해 Protein Science 6:1179-1189(June 1997)에 기술되었다. 다중코일 프로그램은 쌍코일 연산 방식에 기초한 것이며 이중 및 삼중으로 감긴 코일의 위치를 파악하는데 유용하다.
바람직한 양상에서 본 발명은 콜린과의 결합 영역을 갖는 원생의 표면-결합 폴리펩타이드를 포함하지 않기 위하여 S. pneumoniae 종 숙주보다 숙주 박테리아 세포에서 그러한 폴리펩타이드의 재조합 유전자를 생산한다. 바람직한 숙주는 본 발명의 폴리펩타이드가 세포로부터 분비되기 위한 조건 하에 배양될 수 있는 그러한 박테리아 종이다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 분리되고 실질적인 면역원의 순수한 형태에서 재조합 기술에 의해 그러한 면역원 폴리펩타이드를 생산하는 것을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 콜린과 결합하는 아미노산 서열의 코딩 영역을 포함하지 않으면서 고도로 보존된 알파-헬릭스 아미노산 서열을 포함한다.
숙주 세포는 고도로 보존된 알파 헬릭스 영역을 포함하나 콜린과의 결합 영역을 갖지 않으며 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 벡터, 예컨대 본 발명에 부합되는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 의해 유전적으로 조작된다(형질 도입, 형질 변환 또는 형질 감염). 그 벡터는 예를 들어 플라스미드 형태, 바이러스 입자, 파지(phage)등에 존재할 수 있다. 프로모터를 활성화시키고 형질 전환체를 선택하며 또는 그러한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키기 위하여 조작된 숙주 세포를 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 온도, pH 등의 배양 조건은 앞서 발현을 위해 선택한 숙주 세포에 이용한 것과 동일하고 당업자에게 명백할 것이다.
벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예컨대 SV40; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA, 백시니아와 같은 바이러스의 DNA, 아데노바이러스, 계두바이러스 및 유사광견병의 결합으로부터 유도된 벡터를 포함한다. 그러나 숙주에 적응하고 생존할 수 있는 한 다른 어떠한 벡터도 이용할 수 있다.
적절한 DNA 서열을 다양한 방법을 이용하여 벡터에 삽입한다. 일반적으로 당해 분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 DNA 서열이 삽입된다. 그러한 방법들 및 이외의 방법들이 당업자의 범위 내에서 고려된다.
발현 벡터에서 DNA 서열은 mRNA의 합성을 지시하기 위해 적절한 발현 조절 서열(들)(프로모터)과 효과적으로 결합한다. 그러한 프로모터의 대표적인 예로써 다음이 언급된다: LTR 또는 SV40 프로모터, E.coli. lac 또는 trp, 파지 람다 PL프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터들. 또한 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종료를 위한 리보솜 결합 부위를 포함한다. 그 벡터는 또한 발현을 증폭시키는 적절한 서열을 포함할 수 있다.
게다가, 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 가려내기 위해 표현형 특성을 부여하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 예컨대 진핵 세포 배양에서 디히드로폴레이트 리덕타아제 또는 네오마이신 내성, 또는 E.coli에서 테트라시클린 또는 암피실린 내성을 들 수 있다.
형질 전환을 위해, 상기 기술한 적절한 프로모터 또는 조절 서열뿐 아니라 적절한 DNA 서열을 포함하는 벡터를 단백질을 발현시킬 수 있는 적절한 숙주에 사용한다.
적절한 숙주의 대표적인 예로 다음을 들 수 있다: 박테리아 세포, 예컨대 E.coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; 펀자이 세포, 예컨대 효모; 곤충 세포, 예컨대 Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS 또는 보우스 멜라노마(Bowes melanoma); 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적절한 숙주를 선택하는 것은 당업자의 기술 범위 내에서 고려된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 또한 상기 폭넓게 기술된 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 구성물에 관한 것이다. 그 구성물은 정 또는 역 오리엔테이션에서 본 발명의 서열에 삽입된, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은, 벡터를 포함한다. 구체예의 바람직한 양상에서, 구조물은 서열과 실시 가능하게 연결된 조절 서열, 예컨대 프로모터를 부가로 포함한다. 많은 수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당해 분야에 알려져 있으며 시판되고 있다. 다음 벡터는 그 예이다. 박테리아: pQE70, pQE60, pQE09 (Qiagen, Inc.), pbs, pD10, 파지스크립트, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). 진핵 세포: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). 그러나 숙주에 적응하고 생존할 수 있는 한 다른 어떠한 플라스미드 또한 벡터도 이용할 수 있다.
선택 가능한 마커와 함께 CAT(클로람페니콜 트란스퍼라제) 벡터 또는 다른 벡터를 이용하는 어떠한 소망하는 유전자로부터 프로모터 영역을 선택할 수 있다. 적절한 두개의 벡터는 pKK232-8과 pCM7이다. 특정하게 명명된 박테리아 프로모터로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL및 TRP가 있다. 진핵 세포 프로모터는 CMV(immediate early), HSV 티미딘 키나아제, (early and late)SV40M, 레트로바이러스의 LTRs 및 쥐의 메탈로티오네인-I를 들 수 있다. 벡터와 프로모터는 당해 분야의 통상의 지식 수준 내에서 적절하게 선택될 수 있다.
부가의 구체예에서, 본 발명은 상기 기술한 구성물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등의 진핵세포, 예컨대 포유류 세포이거나 하등의 진핵 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고 박테리아 세포와 같이 원핵 세포일 수 있다. 구성물을 숙주 세포로 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질 감염, 형질 감염을 매개하는 DEAE-덱스트란 또는 전기영동에 의해 이루어진다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., 분자 생물학의 기본 방법 (1986)).
재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 생산하기 위한 통상적인 방법에 의해 숙주 세포 내의 구성물을 처리할 수 있다. 선택적으로 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 펩타이드 합성자에 의해 합성적으로 생산할 수 있다.
적절한 프로모터의 조건 하에, 성숙한 단백질이 포유류 세포, 효모, 박테리아 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNAs를 이용하는 그러한 단백질을 생산하기 위해 세포-없는 번역계를 또한 이용할 수 있다. 원핵 및 진핵 숙주에 이용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 베터가 Sambrook 외, 분자 클로닝; A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Habor, N.Y.,(1989)에 기술되어 있고 여기에서 참조로써 관계한다.
고등 진핵 세포에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 전사는 강화 서열을 벡터내에 삽입시킴으로써 보다 증가한다. 강화 인자는 그 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 일반적으로 약 10 내지 300bp의 DNA의 cis-작용 요소이다. 그 예로써 복제 발단의 100 내지 270의 후기부위에 SV40 강화인자를 포함한다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 발단과 숙주 세포의 형질 전환을 허용한 선택 가능한 마커, 예컨대 E.coli의 암피실린 내성 유전자 및 S.cerevisiae TRP1 유전자 및 다운스트림 구조 서열의 전사를 지시하는 고도의-발현 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함할 것이다. 그러한 프로모터는 해당 효소, 예컨대 3-포스포글리세레이트 키나아제(PGK), α-인자, 산 포스파타아제 또는 열 쇼크 단백질 등을 코딩하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종적인 구조 서열은 번역 개시 및 종료 서열과 함께 적절한 상에서 소집된다. 선택적으로 이종 서열은 소망하는 특성, 예컨대 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화 정제를 가능하게 하는 N-말단 동정 펩타이드를 비롯하여 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
박테리아의 사용을 위한 유용한 발현 벡터는 기능적 프로모터를 가진 실시 가능한 해석상에서 적절한 번역 개시 및 종료 신호를 포함하며 소망하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 삽입시킴으로써 구성된다. 벡터는 하나 이상의 표현형 선택 가능한 마커를 포함하며 벡터를 지속시키고, 가능하다면, 숙주 내에서 증폭시킬 수 있는 복제 발단을 포함한다. 형질 전환을 위해 적절한 원핵 세포 숙주는 E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium이고, 비록 그 이외의 것들이 선택적으로 사용될 수 있지만, Pseudomonas, Streptomyces 및 Staphylococcus 속에 포함되는 다양한 종들을 이용할 수 있다.
대표적이나 비제한적인 예로써, 박테리아의 사용을 위해 유용한 발현 벡터는 선택 가능한 마커 및 잘 알려진 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전 요소로 구성되는 시판 플라스미드로부터 유도된 박테리아의 복제 발단을 포함할 수 있다. 그러한 통상의 벡터는 예를 들어, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)를 포함한다. 이러한 pBR322 "지지(backbone)" 부분이 적절한 프로모터 및 발현되는 구조 서열과 결합한다.
숙주 균주의 형질을 전환시키고 적절한 밀도의 세포를 얻을 때까지 숙주 균주를 성장시킨데 이어서, 선택된 프로모터를 알맞은 방법(예컨대, 온도 변이 및 화학적 유도)으로 도입하고 추가의 기간 동안 세포를 배양한다.
통상적으로 원심 분리, 물리적 또는 화학적 방법에 의한 분쇄 및 생성된 조 추출물을 부가의 정제를 위해 보유함으로써 세포를 회수한다.
단백질의 발현에 이용하는 미생물 세포는 어떠한 편리한 방법, 예컨대 동결-해동 순환, 초음파 분해, 프렌치 프레스, 기계적 분쇄 또는 세포 용해(lysing)제의 사용으로 분쇄할 수 있고 그러한 방법은 당업자에게 잘 알려진 것이다. 그러나 숙주 세포가 본 발명의 폴리펩타이드를 분비하고 배양 매질에서 폴리펩타이드를 회수할 수 있는 것이 바람직하다.
또한 재조합 단백질의 발현을 위해 다양한 포유류 세포 배양계를 이용할 수 있다. 그 예로는 Gluzman, Cell, 23:175(1981)에 기술된 원숭이 신장의 섬유아세포에 존재하는 COS-7 계열 및 양립가능한 벡터를 발현시키는 다른 세포 계열들, 예컨대 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포 계열을 들 수 있다. 포유류 발현계는 복제 발단, 절적한 프로모터 및 강화인자를 포함하고 또한 어떠한 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데노실화 부위, 접목 도너 및 수용체 부위, 전사 종료 서열 및 5' 인접의 비전사된 서열을 포함한다. SV40 접목으로부터 유도된 DNA 서열과 폴리아데노실화 부위는 요구하는 비전사된 유전 요소를 생산하는데 이용할 수 있다.
폴리펩타이드는 잘 알려진 단백질 회수 및 정제 방법을 이용하여 재조합 세포 배양물로부터 회수 및/또는 정제된다. 그러한 방법학에는 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피가 있다. 필요하다면 성숙한 단백질의 구성을 완전하게 하기 위해 단백질의 재접지(refolding) 단계를 이용할 수 있다. 이 때 그러한 재접지 방법에 샤프롱(chaperones)을 이용할 수 있다. 마지막으로 최종 정제 단계에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있다.
본 발명의 면역원으로서 유용한 폴리펩타이드는 천연적으로 정제된 생성물 또는 화학적 합성 방법의 생성물, 또는 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 배양된 박테리아, 효소, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물일 수 있다. 재조합 생산 방법에 사용되는 숙주에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실화 되거나 비-글리코실화될 수 있다. 단일의 고도로 보존된 알파 헬릭스 영역을 포함하고 콜린과의 결합 영역 또는 HPS 영역을 포함하지 않는 단편화 폐렴 구균 폴리펩타이드가 보다 바람직한 면역원이다. 따라서, 그러한 폴리펩타이드에 대항하는 항체는 다른 폐렴 구균 박테리아 종(그러한 폴리펩타이드가 유도된 S.pneumoniae 종 이외의)에 결합해야 하고 S.pneumoniae 종에 대항하는 백신은 다른 폐렴 구균 박테리아의 감염에 대하여 보호할 수 있어야 한다.
폴리펩타이드를 포함하며 개별적으로 발현된 알파-헬릭스는 당해 분야에 잘 알려진 재조합 발현/분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 그러한 통상적인 분리의 예에서 단백질의 보존된 영역 또는 His 태크나 단백질 구조의 부분으로서 발현시키는 절단 가능한 리더 또는 테일에 항체를 이용할 수 있다.
항체를 생산하기 위하여 폴리펩타이드, 그 단편 또는 다른 유도체, 또는 그 동족체 또는 그들을 발현시키는 세포를 면역원으로서 이용할 수 있다. 이러한 항체들은 예를 들어 다중 클론 또는 단일 클론의 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물 뿐 아니라 키메릭의, 단일 사슬 및 인체에 적용시킨 항체를 포함한다. 당해 분야에 알려진 다양한 방법들을 이용하여 그러한 항체 및 단편을 생산할 수 있다.
본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩타이드를 동물에, 바람직하게는 인간을 제외하여, 곧바로 주입하거나 또는 투여하여 이에 대항하여 생성된 항체를 얻을 수 있다. 그렇게 얻어진 항체는 이후에 폴리펩타이드 그 자체와 결합할 것이다. 이러한 방법으로 단지 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 서열조차도 모든 원생의 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 생산하는데 이용할 수 있다.
단일 클론의 항체를 제조하기 위해 연속적인 세포 계열의 배양에 의해 항체를 생산하는 어떠한 기술도 이용할 수 있다. 예를 들어 하이브리도마 기술(Kohler 및 Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간의 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor 외, 1983, Immunology Today 4:72) 및 인간의 단일 클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole 외, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)이 있다.
단일 사슬의 항체를 생산하기 위한 기술(미국 특허 4,946,778)들을 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 단일 사슬 항체를 생산하는데 적용할 수 있다. 또한 변형된 유전자의 생쥐를 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 인간의 항체를 발현시키는데 이용할 수 있다.
상기 기술한 내용의 이해를 돕기 위하여 도면 뿐 아니라 구체예를 후술하며 여기에 첨부하여 SEQ ID NOS:3-18의 폴리펩타이드를 위한 박테리아 소스와 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(각각 SEQ ID NOS:20-35)를 표 1에 기술한다. 박테리아의 명칭 및/또는 타입을 열거하고 크레디트 또는 소스를 명시한다. 여기에 기술된 프로브 및/또는 프라이머를 사용함으로써 그러한 타입의 박테리아로부터 얻은 서열은 단지 예를 들기 위함이며 유사한 타입의 다른 서열들이 당해 분야의 통상적인 기술을 이용하여 용이하게 얻어질 수 있다.
SEQ ID NO. 폐렴 구균의 타입 소스 크레디트 또는 ATCC NO.
3 1 ATCC 33400
4 2 SPATCC 11733
5 2 ATCC2 (카탈로그 #6302)
6 4 ATCC4 (카탈로그 #6304)
7 6B ATCC 6B (카탈로그 #6326)
8 18C SPATCC 18C (ATCC 카탈로그 #10356)
9 4 노르웨이 타입 4;공중 위생의 Nat'l. Inst.,노르웨이 Ingeborg Aagerge
10 비캡슐화 R6X;록펠러 대학, Rob Masure(D39,타입 2)
11 6B SPB 105;보스톤 대학, 스티브 펠톤
12 23F SPB 328;보스톤 대학, 스티브 펠톤
13 14 SPB 331;보스톤 대학, 스티브 펠톤
14 23F SPB 365;보스톤 대학, 스티브 펠톤
15 9V SPR 332;록펠러 대학, Rob Masure
16 6B SPSJ 2p;성 쥬드 칠드런스 리서치 병원, Pat Flynn(독성으로 1x 접종된 생쥐에서 임상분리)
17 14 SPSJ 9;성 쥬드 칠드런스 리서치 병원, Pat Flynn(임상분리 - nares, pneumonia)
18 19A SPSJ 12;성 쥬드 칠드런스 리서치 병원, Pat Flynn(임상분리)
본 발명은 다음 구체예를 참고로 추가로 기술될 것이다; 그러나 이것은 본 발명을 이해하기 위함이고 그러한 구체예로 제한하는 것이 아니다. 다른 명시가 없는 한, 모든 부 또는 양은 중량이다.
실시예 1
CbpA 단편 단백질 벡터의 생산
A. 총 길이의 CbpA를 위한 벡터(NR1XR2PC)
독성 혈청 타입 4 S. pneumoniae 균주, 노르웨이 4(공중 위생의 국립 기관, 오슬로, 노르웨이, I. Aabege로부터 얻은)를 총 길이의 CbpA를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키기 위한 게놈 DNA 주형의 소스로서 사용하였다. 총 길이의 CbpA는 하기에 기술되는 PCR 프라이머 SJ533 및 SJ537을 이용하여 증폭한다.
정(forward) 프라이머 SJ533의 퇴화는 H.R. Masure(성 쥬드 칠드런스 리서치 병원, 멤피스, TN)에 의해 생산된 CbpA N-말단 서열 XENEG를 기초로 설계된다. SJ533 프라이머 = 5' GGC GGA TCC ATG GA(A,G) AA(C,T) GA(A,G) GG 3'. 이것은 BamHI 및 NcoI 제한 부위 및 ATG 개시 코돈 모두에 병합한다.
3' 역(reverse) 프라이머 SJ537 = 5' GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTC ACC ATT GGC 3'
이 프라이머는 클로닝을 목적으로 하는 SalI 제한 부위, 및 CbpA의 천연 정지 코돈에 병합하고, 타입 4 및 조직내에서 생성된 R6X 서열에 기초한다.
SJ533 및 SJ537을 갖는 게놈 DNA 주형으로부터 생산된 PCR 생성물은 BamHI 및 SalI로 분해되고 BamHI, XbaI 및 SmaI로 분해된 pQE30 발현 벡터(Qiagen, Inc)로 클로닝된다. 타입 R6X 주형은 총 길이의 벡터 PMI581을 생산하고 타입 4 주형 DNA는 총 길이의 벡터 PMI580을 생산한다.
B. CbpA 단편 단백질을 위한 벡터(NR1XR2)
유전자의 아미노 말단만을 포함하는 CbpA의 단편화 변형을 생산하기 위해 두번째 아미노 반복의 말단에서 천연 발생한 PvuII 부위(타입 4 서열의 핵산 1228)가 이용된다. 단편 클론을 생산하기 위해, 총 길이의 클론 PMI580(타입 4) 또는 PMI581(R6X)을 PvuII 및 XbaI로 분해시키고 발현 벡터의 부분과 함께 아가로스 겔 위에서 크기에 따라 아미노 말단을 분리한다. pQE30을 XbaI 및 SmaI로 분해시키고 벡터의 다른 절반에 해당되는 밴드를 또한 아가로스 겔 위에서 크기로 선택한다. 두개의 절반을 결찰시키고 제한적인 분해에 의해 클론을 동정한 후 발현시킨다. 이러한 예에서, 사용되는 정지 코돈은 발현 벡터에 존재하고 따라서 클로닝 부위의 5' 및 3' 말단에 존재하는 부가적인 아미노산으로 인하여 발현되는 단백질은 예견한 크기에 비해 크다.
C. CbpA 단편 단백질을 위한 벡터(NR1X)
CbpA의 첫번째 아미노 반복만을 발현시키기 위해 유사한 방법을 이용한다. 여기서 두 아미노 반복 간에 천연 발생한 XmnI 부위(타입 4 서열의 핵산 856)를 사용한다. CbpA 총 길이의 클론 PMI580을 XmnI 및 AatII로 분해시킨다. 발현 벡터 pQE30를 AatII 및 SmaI로 분해시킨다. 다시 한번, 두개의 크기로 된 단편을 결찰시키고 제한적인 분해 및 발현으로 클론을 가려낸다.
실시예 2
발현 벡터로부터 CbpA 단편 단백질의 발현
Qia 발현계(Qiagen)에서 E.coli 발현 벡터 pQE30을 이용하여, 실시예 1A-1C에 기술한 벡터로부터 모든 단백질이 발현된다. 항-히스티딘 항체 및 유전자 특이 항체 모두를 이용하여 웨스턴(western) 분석에 의해 아미노 말단 His6 태그된 단백질을 탐지한다.
발현된 CBP 단편을 다음과 같이 정제한다.
재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아를 배양하고 여기서 하나의 단일 콜로니를 선택한다. 이것을 50㎍/ml의 카나마이신 및 100㎍/ml의 암피실린을 포함한 6.0ml LB 완충액에서 37。로 하룻밤 동안 배양한다. 6.0ml의 배양액을 상기 농도의 항생 물질을 함유한 1L LB에 첨가한다. 배양액을 37℃에서 A600= ~0.400까지 흔들어준다. 1L 배양액에 1M IPTG를 첨가하여 최종 농도가 1mM이 되게 한다. 그리고 나서 배양액을 37℃에서 3-4시간 동안 흔든다. 1L 배양액을 모델 J-6B 원심분리기에서 250ml 코니칼 튜브를 이용하여 4000rpm으로 15분 동안 공전시킨다. 상등액을 폐기시키고 사용시까지 펠릿을 -20℃에서 저장한다.
1L 펠릿을 25ml의 50mM NaH2PO4, 10mM Tris, 6M GuCl, 300mM NaCl, pH 8.0(완충액 A)에 재현탁시킨다. 그리고 나서 그 혼합물을 실온에서 30분 동안 회전시킨다. 혼합물을 마이크로팁을 이용하여 초음파 처리기(VibraCell Sonicator, Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT)에 넣고 50% 듀티 싸이클(Duty Cycle)에서 2회, 30초간, 그리고 배출을 7로 조절한다. 혼합물을 JA20 로터에서 10K로 5분간 회전시키고 상등액을 제거하여 폐기한다. 상등액을 GradiFrac계(Pharmacia Biotech, Upsala, 스웨덴)에 부착된 10ml 탈론(Talon)(Clonetech, Palo Alto, CA) 수지 칼럼에 넣는다. 그 칼럼을 100ml 완충액 A를 이용하여 평형화시키고 이 완충액 200ml로 세척한다. 최종 표적 완충액으로서 100% 50mM NaH2PO4, 8M 우레아, 20mM MES, pH 6.0(완충액 B)을 이용하여 농도 구배에 기초한 부피는 총 부피 100ml에 이른다. 단백질은 ~30% 완충액 B에서 용출된다. 용출된 피크들을 모아서 통합한다.
재접지를 위해서 2L 부피의 PBS를 이용하여 실온에서 약 3시간 동안 투석을 수행한다. 분자량 14,000까지의 투석 튜브를 사용한다. 그리고 나서 2L의 PBS에서 하룻밤동안 4℃로 시료를 투석시킨다. Centriprep-30 스핀 칼럼을 이용한 단백질의 농축 중에 공전 투석유물 및 재공전에 PBS를 첨가시킴으로써 부가의 완충액 교환이 이루어진다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석기를 이용하여 측정하고 순도는 4-20% SDS-PAGE 겔로 염색된 Coomassie을 이용하여 가시화한다.
실시예 3
항-CbpA 단편 NR1XR2 면역 혈청을 이용한 수동 보호
A. 토끼의 면역 혈청 생산
코반스(Covance)(덴버, PA)에서 CbpA 단편에 대항하는 토끼의 면역 혈청을 생산하였다. 면역 전 혈청을 회수한 다음, 뉴질랜드 백색 토끼(#ME101)를 완전한 프로인트 보조액에 존재하는 250㎍의 CbpA 단편 NR1XR2(483:58로부터 제조된 알파 헬릭스 I 및 알파 헬릭스 II 두가지 모두의 아미노산 N-말단 반복을 포함하는)로 면역시켰다. 21일째 불완전한 프로인트 보조액에 존재하는 125㎍의 CbpA 단편을 토끼에게 보조 투여하고 31일 및 52일째 되는 날 방혈하였다.
B. 생쥐에서의 수동 보호
1:2로 희석된 100㎕의 토끼 혈청을 이용하여 무균 PBS(면역전 또는 31일째 면역 혈청)에서 C3H/HeJ 생쥐(5마리/그룹)의 복강내로 수동 면역시켰다. 혈청 투여 후 1시간, 생쥐를 1600cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae, 균주 SP317(H.R. Masure로부터 얻음)로 감염시켰다. 생쥐의 생존을 14일 동안 관찰하였다.
CbpA 단편 NR1XR2 단백질에 대하여 생성된 토끼의 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 80%가 감염 후 14일까지 생존해 있었다(도 2). 면역 전의 토끼 혈청으로 면역된 모든 생쥐는 7일까지 모두 죽었다.
C. 생쥐에서의 수동 보호(보다 높은 감염 투여량)
1:2로 희석된 100㎕의 토끼 혈청을 이용하여 무균 PBS(면역전 또는 52일째 면역 혈청)에서 C3H/HeJ 생쥐(10마리/그룹)의 복강내로 수동 면역시켰다. 혈청 투여 후 1시간, 생쥐를 3450cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae, 균주 SP317로 감염시켰다. 생쥐의 생존을 10일 동안 관찰하였다.
CbpA 단편 NR1XR2 단백질에 대하여 생성된 토끼의 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 100%가 감염 후 10일까지 생존해 있었다(도 3). 면역 전의 토끼 혈청으로 면역된 생쥐의 90%가 10일까지 죽었다.
D. 생쥐에서의 수동 보호(높은 독성에 대항하여)
1:2로 희석된 100㎕의 토끼 혈청을 이용하여 무균 PBS(면역전 또는 52일째 면역 혈청)에서 C3H/HeJ 생쥐(10마리/그룹)의 복강내로 수동 면역시켰다. 혈청 투여 후 1시간, 생쥐를 580cfu 독성 혈청 타입 6B S. pneumoniae, 균주 SPSJ2(성 쥬드 칠드런스 리서치 병원, 멤피스, TN P. Flynn에 의해 생산된)로 감염시켰다. 생쥐의 생존을 10일 동안 관찰하였다.
CbpA 단편 NR1XR2 단백질에 대하여 생성된 토끼의 면역 혈청으로 면역된 생쥐의 50%가 감염 후 10일까지 생존해 있었다(도 4). 면역 전의 토끼 혈청으로 면역된 생쥐는 8일까지 모두 죽었다.
이러한 수치는 CbpA 특이적인 항체가 조직의 폐렴 구균 감염에 대항하여 보호적이라는 것을 입증한다. 부가로 이 수치는 단편화 단백질 NR1XR2에 대해 특이적인 항체가 콜린과의 결합 반복을 결여했으나 충분히 보호가 가능하므로, 즉 콜린과의 결합 영역이 보호를 위해 불필요하다는 것을 명시한다. 게다가 혈청 타입 4 서열에 기초한 재조합 CbpA 단백질에 대항하는 혈청이 혈청 타입 6B의 다른 두개의 균주를 이용한 감염에 대하여도 부가로 보호적이다.
실시예 4
항-CbpA 단편 NR1X 및 NR1XR2를 이용한 능동 보호
A. NR1X 단편 백신 접종을 이용한 능동 보호
CbpA 단편 단백질 NR1X을 이용하여 C3H/HeJ 생쥐(10마리/그룹)의 복강내로 면역시켰다(50㎕ PBS와 50㎕ 완전한 프로인트 보조액에서 15㎍). 10마리의 겉보기 면역된 생쥐 그룹은 PBS와 보조액을 수용한다. 불완전한 프로인트 보조액과 함께 15㎍ 단백질(앞과 동일)을 이용한 두번째 예방주사를 4주 후에 투여하였다(PBS와 IFA를 수용한 겉보기 그룹). 면역 반응 분석을 위해 3, 6 및 9주째에서 방혈시켰다(레트로-오비탈 혈액). 10마리의 CbpA 면역된 생쥐로부터 9주째에서 얻은 통합 혈청은 ELISA 종료점의 항-CbpA 단편 농도 4,096,000을 갖는다. 겉보기 면역된 생쥐의 혈청에서는 어떠한 항체도 검출되지 않았다. 생쥐는 560cfu 혈청타입 6B S. pneumoniae 균주 SPSJ2를 이용하여 10주에서 감염된다. 생쥐의 생존을 14일동안 관찰하였다.
CbpA 단편 단백질 NR1X로 면역된 생쥐의 80%가 감염 후 14일까지 생존해 있었다(도 5). 겉보기(sham) 면역된 생쥐는 8일까지 모두 죽었다.
B. NR1XR2 단편 백신 접종을 이용한 능동 보호
CbpA 단편 단백질 NR1XR2을 이용하여 C3H/HeJ 생쥐(10마리/그룹)의 복강내로 면역시켰다(50㎕ PBS와 50㎕ 완전한 프로인트 보조액에서 15㎍). 10마리의 컨트롤 면역된 생쥐 그룹은 폐렴 구균의 재조합 단백질 SP90 및 보조액을 수용한다. 불완전한 프로인트 보조액과 함께 15㎍ 단백질(앞과 동일)을 이용한 두번째 예방주사를 4주 후에 투여하였다. 면역 반응 분석을 위해 3, 6 및 9주째에서 방혈시켰다(레트로-오비탈 혈액). 10마리의 CbpA 면역된 생쥐로부터 9주째에서 얻은 통합 혈청은 ELISA 종료점의 항-CbpA 단편 농도 4,096,000을 갖는다. 생쥐는 680cfu 혈청타입 6B S. pneumoniae 균주 SPSJ2를 이용하여 10주에서 감염된다. 생쥐의 생존을 14일동안 관찰하였다.
CbpA 단편 단백질 NR1XR2로 면역된 생쥐의 50%가 감염 후 14일까지 생존해 있었다(도 6). 컨트롤 면역된 생쥐는 9일까지 모두 죽었다.
이러한 수치는 재조합 CbpA 단편 단백질을 이용한 면역 주사가 조직의 폐렴 구균 감염 및 죽음에 대항하여 보호가능한 특이적인 항체를 생산한다는 결론을 도출한다. 부가로 이 수치는 면역원이 단편화된 단백질 NR1X 및 NR1XR2이었으므로, 콜린과의 결합 영역이 보호를 위해 불필요하다는 것을 명시한다. 게다가 그 결과는 보호 반응을 이끌어 내기 위해서는 단일 아미노 말단의 반복으로 충분하다는 것을 제안한다. 혈청 타입 4 DNA 서열에 기초하여 폐렴 구균 단백질이 생산되고 혈청 타입 6B를 분리하여 감염에 대한 보호를 관찰하므로 교차 보호가 입증되었다.
상기 기술 내용의 견지에서 본 발명의 다양한 변형이 가능하고 따라서 첨부한 청구항의 범위내에서, 구체적으로 기술된 것과 다르게 본 발명을 실행할 수 있다.
＜110＞ MEDIMMUNE, INC
＜120＞ DERIVATIVES OF PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS FOR VACCINES
＜130＞ KP-CH-004081
＜150＞ US 60/080,878
＜151＞ 1998-04-07
＜150＞ US 60/085,743
＜151＞ 1998-05-15
＜160＞ 38
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 103
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoiae
＜400＞ 1
Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr
20 25 30
Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys
35 40 45
Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala
65 70 75 80
Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala
100
＜210＞ 2
＜211＞ 141
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 2
Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Glu Ser Glu Lys Lys Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Lys Ile Ala
20 25 30
Glu Leu Glu Tyr Glu Val Gln Arg Leu Glu Lys Glu Leu Lys Glu Ile
35 40 45
Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro
50 55 60
Leu Gln Ser Lys Leu Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Ser Lys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Lys Leu
85 90 95
Glu Val Gln Leu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala Tyr
100 105 110
Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu Leu
115 120 125
Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu
130 135 140
＜210＞ 3
＜211＞ 431
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 3
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Pro Val Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ala
1 5 10 15
Asn Lys Ser Gln Thr Glu His Met Lys Ala Ala Glu Gln Val Asp Glu
20 25 30
Tyr Ile Asn Lys Met Ile Gln Leu Asp Lys Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Lys Glu Glu Leu Thr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Lys Lys Glu Ile Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Asn Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu
100 105 110
Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp His Arg Asn
115 120 125
Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser
130 135 140
Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
145 150 155 160
Lys Gly Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Lys Ala Lys Ala Glu Val
165 170 175
Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Lys Leu Glu Glu Ile Lys Thr Glu
180 185 190
Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu
195 200 205
Glu Val Lys Asn Lys Leu Lys Lys Arg Thr Lys Arg Gly Ala Phe Gly
210 215 220
Glu Pro Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp
225 230 235 240
Ser Ser Val Val Lys Lys Ser Ser Lys Pro Ile Leu Lys Ser Glu Lys
245 250 255
Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val
260 265 270
Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg
275 280 285
Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu
290 295 300
Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu
305 310 315 320
Ala Lys Glu Pro Gln Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys
325 330 335
Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr
340 345 350
Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Lys Val Ala Glu Glu Asp
355 360 365
Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
370 375 380
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys
385 390 395 400
Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg
405 410 415
Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Pro Leu Asp Leu Thr Ala Pro Ala Lys
420 425 430
＜210＞ 4
＜211＞ 251
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 4
Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala
1 5 10 15
Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile
20 25 30
Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln
35 40 45
Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu
100 105 110
Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp GlnLys Glu Glu Asp Arg Arg Asn
115 120 125
Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe
130 135 140
Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
145 150 155 160
Lys Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gln Ala Lys Glu Lys Val
165 170 175
Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp
180 185 190
Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp
195 200 205
Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Thr
210 215 220
Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro
225 230 235 240
Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu
245 250
＜210＞ 5
＜211＞ 413
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 5
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Gln Val Pro Thr Tyr Ser Asn Met Ala
1 5 10 15
Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Thr Ile
20 25 30
Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln
35 40 45
Asn Phe Ala Phe Asn Met Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Glu Tyr Leu
50 55 60
Tyr Gly Leu Lys Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu Val Lys
65 70 75 80
Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp Thr Leu Lys
85 90 95
Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu
100 105 110
Lys Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr
115 120 125
Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu
130 135 140
Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Glu Ala Lys Thr Arg
145 150 155 160
Asn Glu Asp Thr Ile Asn Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Thr Leu Lys Glu Glu Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala
180 185 190
Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Glu Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys
195 200 205
Asp Lys Leu Lys Arg Arg Thr Lys Arg Ala Val Pro Gly Glu Pro Ala
210 215 220
Thr Phe Phe Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val
225 230 235 240
Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Val
245 250 255
Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp
260 265 270
Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Thr Lys Thr
275 280 285
Leu Asp Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu
290 295 300
Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Gly Ser Arg Asn Glu Glu Lys
305 310 315 320
Ile Asn Gln Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr
325 330 335
Arg Leu Glu Lys Thr Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala
340 345 350
Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu
355 360 365
Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu
370 375 380
Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln
385 390 395 400
Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu
405 410
＜210＞ 6
＜211＞ 446
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 6
Thr Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gln Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala
1 5 10 15
Asn Glu Ser Gln Ala Glu Gln Gly Glu Gln Pro Lys Lys Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile
35 40 45
Val Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr
50 55 60
Val Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Lys Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gln Leu Gln Ile Leu Met Met
85 90 95
Glu Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser
115 120 125
Asp Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala
130 135 140
Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln
145 150 155 160
Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu
165 170 175
Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu
180 185 190
Glu Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Lys Gln Lys Ile
195 200 205
Lys Gln Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg
210 215 220
Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys
225 230 235 240
Arg Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gln Gly Lys Pro Lys Gly Arg Pro Lys
245 250 255
Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp
260 265 270
Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro
275 280 285
Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu
290 295 300
Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn
305 310 315 320
Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser
325 330 335
Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
340 345 350
Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val
355 360 365
Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp
370 375 380
Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp
385 390 395 400
Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Lys Thr Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu
420 425 430
Gln Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu
435 440 445
＜210＞ 7
＜211＞ 428
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 7
Glu Gly Val Arg Ser Gly Asn Asn Ser Thr Val Thr Ser Ser Gly Gln
1 5 10 15
Asp Ile Ser Lys Lys Tyr Ala Asp Glu Val Glu Ser His Leu Gln Ser
20 25 30
Ile Leu Lys Asp Val Asn Lys Asn Leu Lys Lys Val Gln His Thr Gln
35 40 45
Asn Ala Asp Phe Asn Lys Lys Leu Ser Lys Ile Lys Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
Tyr Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Thr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Lys Glu Thr Lys Glu Glu Leu Thr Ala Ala Phe Glu Gln Phe
85 90 95
Lys Lys Asp Thr Leu Ser Thr Glu Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala
100 105 110
Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu
115 120 125
Lys Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu
130 135 140
Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu
145 150 155 160
Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gln
165 170 175
Ala Glu Ala Lys Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
180 185 190
Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Gln Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn
195 200 205
Ile Lys Thr Asp Arg Glu Gln Ala Glu Glu Glu Ala Lys Val Lys Asp
210 215 220
Glu Pro Lys Lys Arg Thr Lys Arg Gly Val Leu Gly Glu Pro Ala Thr
225 230 235 240
Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly
245 250 255
Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala
260 265 270
Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln
275 280 285
Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu
305 310 315 320
Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val
325 330 335
Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg
340 345 350
Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys
355 360 365
Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln
370 375 380
Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Asp
385 390 395 400
Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gln Pro
405 410 415
Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu
420 425
＜210＞ 8
＜211＞ 219
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 8
Glu Gly Val Arg Ser Gly Asn Asn Ser Thr Val Thr Ser Ser Gly Gln
1 5 10 15
Asp Ile Ser Lys Lys Tyr Ala Asp Glu Val Glu Ser His Leu Gln Ser
20 25 30
Ile Leu Lys Asp Val Asn Lys Asn Leu Lys Lys Val Gln His Thr Gln
35 40 45
Asn Ala Asp Phe Asn Lys Lys Leu Ser Lys Ile Lys Pro Lys Tyr Leu
50 55 60
Tyr Glu Leu Lys Cys Leu Glu Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Thr Ser
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asn Lys Arg Arg Val Thr Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys
85 90 95
Lys Asp Thr Leu Ser Thr Glu Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Lys
115 120 125
Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu
130 135 140
Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val
145 150 155 160
Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala
165 170 175
Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys
180 185 190
Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala
195 200 205
Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala
210 215
＜210＞ 9
＜211＞ 446
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 9
Thr Glu Asn Glu Gly Ala Thr Gln Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Ala
1 5 10 15
Asn Glu Ser Gln Ala Glu Gln Gly Glu Gln Pro Lys Lys Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Arg Asp Lys Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Tyr Val Lys Lys Ile
35 40 45
Val Gly Glu Ser Tyr Ala Lys Ser Thr Lys Lys Arg His Thr Ile Thr
50 55 60
Val Ala Leu Val Asn Glu Leu Asn Asn Ile Lys Asn Glu Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Lys Ile Val Glu Ser Thr Ser Glu Ser Gln Leu Gln Ile Leu Met Met
85 90 95
Glu Ser Arg Ser Lys Val Asp Glu Ala Val Ser Lys Phe Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Pro Glu Ala Ser
115 120 125
Asp Thr Ala Lys Pro Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly Glu Lys Val Ala
130 135 140
Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln
145 150 155 160
Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu
165 170 175
Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu
180 185 190
Glu Leu Val Lys Val Lys Ala Asn Glu Pro Arg Asp Glu Gln Lys Ile
195 200 205
Lys Gln Ala Glu Ala Glu Val Glu Ser Lys Gln Ala Glu Ala Thr Arg
210 215 220
Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Lys
225 230 235 240
Arg Arg Ala Asp Ala Lys Glu Gln Gly Lys Pro Lys Gly Arg Ala Lys
245 250 255
Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp
260 265 270
Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro
275 280 285
Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu
290 295 300
Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn
305 310 315 320
Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser
325 330 335
Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
340 345 350
Lys Glu Pro Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val
355 360 365
Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp
370 375 380
Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp
385 390 395 400
Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu
420 425 430
Gln Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu
435 440 445
＜210＞ 10
＜211＞ 414
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 10
Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala
1 5 10 15
Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile
20 25 30
Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln
35 40 45
Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
Arg Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Lys Phe Lys Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu
100 105 110
Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn
115 120 125
Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe
130 135 140
Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
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Lys Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gln Ala Lys Glu Lys Val
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210 215 220
Ala Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
225 230 235 240
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro
245 250 255
Ser Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys
260 265 270
Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg
275 280 285
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Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu
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Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala
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Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys
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Thr Asp Arg Asp Asp Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu
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Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Gln Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu
405 410
＜210＞ 11
＜211＞ 425
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 11
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Arg Ala
1 5 10 15
Asn Glu Ser Gln Ala Gly His Arg Lys Ala Ala Glu Gln Phe Asp Glu
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Tyr Ile Lys Thr Met Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
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Glu Ser Arg Asp Asp Glu Lys Ile Lys Gln Ala Glu Ala Lys Val Glu
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Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp Arg
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Glu Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Glu Ala Lys Leu Lys
195 200 205
Glu Ala Val Glu Lys Asn Val Ala Thr Ser Glu Gln Asp Lys Pro Lys
210 215 220
Gly Arg Arg Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Gln Ala Thr Pro Asp Lys
225 230 235 240
Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Ala
245 250 255
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260 265 270
Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu
275 280 285
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290 295 300
Ile Ala Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ser Glu Leu Glu Leu Val
305 310 315 320
Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Val Asn Gln Ala
325 330 335
Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys
340 345 350
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385 390 395 400
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu
405 410 415
Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu
420 425
＜210＞ 12
＜211＞ 426
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 12
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ala
1 5 10 15
Asn Lys Ser Gln Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gln Val Asp Glu
20 25 30
Tyr Ile Lys Lys Lys Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Val Gly Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Ile Lys Thr Glu Tyr Leu His
50 55 60
Gly Leu Ser Val Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp Thr
85 90 95
Leu Pro Thr Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val
100 105 110
Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Lys Asp Leu Arg
115 120 125
Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Asp Ile Ala Glu
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Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu
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Ala Lys Glu Ser Arg Asp Glu Lys Lys Ile Asn Gln Ala Lys Ala Lys
165 170 175
Val Glu Asn Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Asn Ile Lys Thr
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Asp Arg Glu Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala Lys Leu
195 200 205
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Ala Lys Arg Glu Val Leu Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
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Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Thr
245 250 255
Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys
260 265 270
Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg
275 280 285
Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala
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Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu
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Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Val Lys Ala
325 330 335
Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys
340 345 350
Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Ala
355 360 365
Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala
370 375 380
Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala
385 390 395 400
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala
405 410 415
Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu
420 425
＜210＞ 13
＜211＞ 425
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 13
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ala
1 5 10 15
Asn Lys Ser Gln Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gln Val Asp Glu
20 25 30
Tyr Ile Lys Lys Lys Leu Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Val Gly Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Ile Lys Thr Glu Tyr Leu His
50 55 60
Gly Leu Ser Val Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp Thr
85 90 95
Leu Pro Thr Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val
100 105 110
Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Lys Asp Leu Arg
115 120 125
Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Asp Ile Ala Glu
130 135 140
Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu
145 150 155 160
Ala Lys Glu Ser Arg Asp Glu Lys Lys Ile Asn Gln Ala Lys Ala Lys
165 170 175
Val Glu Asn Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Asn Ile Lys Thr
180 185 190
Asp Arg Glu Lys Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala Lys Leu
195 200 205
Gln Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Glu Gln Asp Lys Ser Lys Arg Arg
210 215 220
Ala Lys Arg Glu Val Phe Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
225 230 235 240
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Thr
245 250 255
Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys
260 265 270
Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg
275 280 285
Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala
290 295 300
Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu
305 310 315 320
Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Val Lys Ala
325 330 335
Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys
340 345 350
Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Ala
355 360 365
Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala
370 375 380
Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Thr Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala
385 390 395 400
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala
405 410 415
Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu
420 425
＜210＞ 14
＜211＞ 424
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 14
Thr Glu Lys Glu Val Thr Thr Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Arg Ala
1 5 10 15
Asn Lys Ser Gln Thr Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gln Val Asp Glu
20 25 30
Tyr Ile Lys Lys Lys Leu Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Val Gly Leu Leu Thr Lys Leu Gly Val Ile Lys Thr Glu Tyr Leu His
50 55 60
Gly Leu Ser Val Ser Lys Lys Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Glu
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Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp Thr
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Leu Pro Thr Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val
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Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Lys Asp Leu Arg
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Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Asp Ile Ala Glu
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Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu
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Ala Lys Glu Ser Arg Asp Glu Lys Lys Ile Asn Gln Ala Lys Ala Lys
165 170 175
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195 200 205
Gln Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Glu Gln Asp Lys Ser Lys Arg Arg
210 215 220
Ala Lys Arg Glu Val Leu Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
225 230 235 240
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Glu Ser Asp Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu
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Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Val Lys Ala
325 330 335
Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys
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Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Lys Pro Lys Ala
405 410 415
Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala
420
＜210＞ 15
＜211＞ 419
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 15
Thr Glu Asn Glu Arg Thr Thr Gln Val Pro Thr Ser Ser Asn Arg Gly
1 5 10 15
Lys Pro Glu Arg Arg Lys Ala Ala Glu Gln Phe Asp Glu Tyr Ile Asn
20 25 30
Lys Met Ile Gln Leu Asp Lys Arg Lys His Thr Gln Asn Leu Ala Phe
35 40 45
Asn Ile Gln Leu Ser Arg Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Asn Gly Leu Lys
50 55 60
Glu Lys Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Lys Ile Lys Ala Glu Leu Asp
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100 105 110
Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu Asp His
115 120 125
Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Asp Leu Glu Ile Ala
130 135 140
Glu Phe Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys
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165 170 175
Lys Val Glu Ser Glu Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys
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Thr Asp Arg Glu Lys Ala Glu Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp
195 200 205
Ala Lys Glu Gln Asp Glu Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Gly Lys Arg
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Gly Ala Leu Gly Glu Gln Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala
225 230 235 240
Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser
245 250 255
Leu Lys Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu
260 265 270
Ala Asp Lys Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr
275 280 285
Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp
290 295 300
Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys
305 310 315 320
Glu Ser Arg Asn Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu
325 330 335
Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg
340 345 350
Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys
355 360 365
Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln
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Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Val Pro Ala Pro Lys
385 390 395 400
Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln
405 410 415
Gln Ala Glu
＜210＞ 16
＜211＞ 414
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 16
Thr Glu Asn Glu Gly Ser Thr Gln Ala Ala Thr Ser Ser Asn Met Ala
1 5 10 15
Lys Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr Ile
20 25 30
Glu Lys Met Leu Arg Glu Ile Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln
35 40 45
Asn Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Leu Lys Pro Gly Glu Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys Val Glu
100 105 110
Glu Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn
115 120 125
Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Phe
130 135 140
Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala
145 150 155 160
Lys Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Lys Gln Ala Lys Glu Lys Val
165 170 175
Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys Thr Asp
180 185 190
Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Asp Ala Lys Leu
195 200 205
Lys Glu Ala Asn Val Ala Thr Ser Asp Gln Gly Lys Pro Lys Gly Arg
210 215 220
Ala Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
225 230 235 240
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro
245 250 255
Ser Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys
260 265 270
Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg
275 280 285
Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Lys Thr Leu Asp Leu Glu Ile Ala
290 295 300
Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu
305 310 315 320
Glu Ala Lys Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala
325 330 335
Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Lys
340 345 350
Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu
355 360 365
Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro
370 375 380
Ala Thr Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu
385 390 395 400
Gln Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu
405 410
＜210＞ 17
＜211＞ 412
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 17
Glu Gly Val Arg Ser Glu Asn Asn Pro Thr Val Thr Ser Ser Gly Gln
1 5 10 15
Asp Ile Ser Lys Lys Tyr Ala Asp Glu Val Lys Ser His Leu Glu Lys
20 25 30
Ile Leu Ser Glu Ile Gln Thr Asn Leu Asp Arg Ser Lys His Ile Lys
35 40 45
Thr Val Asn Leu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Ile Lys Arg Thr Tyr Leu
50 55 60
Tyr Glu Leu Asn Val Leu Glu Asp Lys Ser Lys Ala Glu Leu Pro Ser
65 70 75 80
Lys Ile Lys Ala Glu Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp
85 90 95
Thr Leu Pro Thr Glu Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Lys Lys Lys
100 105 110
Val Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu Asp Tyr
115 120 125
Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala
130 135 140
Glu Ser Asp Val Lys Val Lys Glu Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys
145 150 155 160
Glu Ala Asp Glu Ser Arg Asn Glu Gly Thr Ile Asn Gln Ala Lys Ala
165 170 175
Lys Val Glu Ser Glu Gln Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys
180 185 190
Thr Asp Arg Glu Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala Asp Ala
195 200 205
Lys Glu Gln Asp Glu Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Val Lys Arg Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Glu Pro Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys
225 230 235 240
Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu
245 250 255
Lys Pro Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala
260 265 270
Glu Lys Lys Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp His Arg Asn Tyr Pro
275 280 285
Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val
290 295 300
Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Gly
305 310 315 320
Ser Arg Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser
325 330 335
Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys
340 345 350
Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val
355 360 365
Lys Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro
370 375 380
Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gln Pro
385 390 395 400
Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu
405 410
＜210＞ 18
＜211＞ 406
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 18
Thr Glu Asn Glu Gly Thr Thr Gln Ala Pro Thr Ser Ser Asn Arg Gly
1 5 10 15
Asn Glu Ser Gln Ala Glu His Met Lys Ala Ala Lys Gln Val Asp Glu
20 25 30
Tyr Ile Glu Lys Met Leu Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Val Gly Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Arg
50 55 60
Gly Leu Ser Val Ser Lys Glu Lys Ser Thr Ala Glu Leu Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Phe Lys Gln Phe Lys Lys Asp Thr
85 90 95
Leu Lys Pro Glu Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu
100 105 110
Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr
115 120 125
Pro Thr Ile Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp
130 135 140
Val Glu Val Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Val Lys Ala Asn
145 150 155 160
Glu Pro Arg Asp Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Glu Ala Glu Val Glu
165 170 175
Ser Lys Lys Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg
180 185 190
Glu Lys Ala Glu Glu Glu Ala Lys Arg Arg Val Asp Ala Lys Glu Gln
195 200 205
Asp Glu Ser Ser Lys Arg Arg Lys Ser Arg Val Lys Arg Gly Asp Leu
210 215 220
Gly Glu Gln Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu Asn Asp Ala Lys Ser Ser
225 230 235 240
Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro Ser Pro Ser Leu Lys Pro
245 250 255
Gly Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Asp Lys
260 265 270
Lys Ala Lys Ala Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn
275 280 285
Thr Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val
290 295 300
Lys Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Pro Arg
305 310 315 320
Asn Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys
325 330 335
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala
340 345 350
Glu Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu
355 360 365
Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys
370 375 380
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu Lys
385 390 395 400
Pro Ala Asp Gln Gln Ala
405
＜210＞ 19
＜211＞ 114
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA from the genome of Strept
ococcus pneumoniae
＜400＞ 19
Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ala Glu Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Asn Thr
20 25 30
Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys
35 40 45
Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala
65 70 75 80
Glu Ala Thr Arg Leu Glu Lys Ile Lys Thr Asp Arg Lys Lys Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Ala Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Asp Lys Val Lys Glu Lys
100 105 110
Pro Ala
＜210＞ 20
＜211＞ 1295
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from the genome S.pneumoniae
＜400＞ 20
acagagaagg aggtaactac cccagtagcc acttcttcta ataaggcaaa taaaagtcag 60
acagaacata tgaaagctgc tgaacaagtc gatgaatata taaacaaaat gatccaatta 120
gataaaagaa aacataccca aaatctcgcc ttaaacataa agttgagcgc aattaaaacg 180
aagtatttgc gtgaattaaa tgttttagaa gagaagtcga aaaaagaaga gttgacgtca 240
aaaacaaaaa aagagataga cgcagctttt gagcagttta acaaagatac attgaaacca 300
ggagaaaagg ttgaagaagc tgagaagaag gttgaagaag ctgagaaaaa agccaaggat 360
caaaaagaag aagatcaccg taactaccca accattactt acaaaacgct tgaacttgaa 420
attgctgagt ccgatgtgga agttaaaaaa gcggagcttg aactagtaaa agaggaagct 480
aagggatctc gaaacgagga aaaaattaag aaagcaaaag cggaagttga gagtaaaaaa 540
gctgaggcta caaagttaga agaaatcaag acagaacgta aaaaagcaga agaagaagct 600
aaacgaaaag cagaagcaga agaagaagtt aaaaataaac taaagaagcg gacaaaacga 660
ggagcttttg gagagccagc aacacctgat aaaaaagaaa atgatgcgaa gtcttcagat 720
tctagcgtgg tgaagaaatc ttccaagccc atcctgaaat cagaaaaaaa agtagcagaa 780
gctgagaaga aggttgcaga agctgagaag aaggttgcag aagctgagaa aaaagccaag 840
gatcaaaaag aagaagatcg ccgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt 900
gaaattgctg agtccgatgt gaaagttaaa gaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 960
gctaaggaac ctcaaaacga ggaaaaaatt aagcaagcaa aagcgaaagt tgagagtaaa 1020
aaagctgagg ctacaaggtt agaaaaaatc aagacagatc gtaaaaaagc agaagaagct 1080
aaacgaaaag tagcagaaga agataaagtt aaagaaaaac cagctgaaca accacaacca 1140
gctcctgcac caaaaccagc gccggctcct caaccagaaa aaccagctga acaaccaaaa 1200
gcagaaaaac cagctgatca acaagctgaa gaagactatg ctcgtagatc agaagaagaa 1260
tataacccgc ttgacttaac agcaccggca aaagc 1295
＜210＞ 21
＜211＞ 755
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA from Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 21
acagagaacg agggaagtac ccaagcagcc acttcttcta atatggcaaa gacagaacat 60
aggaaagctg ctaaacaagt cgtcgatgaa tatatagaaa aaatgttgag ggagattcaa 120
ctagatagaa gaaaacatac ccaaaatgtc gccttaaaca taaagttgag cgcaattaaa 180
acgaagtatt tgcgtgaatt aaatgtttta gaagagaagt cgaaagatga gttgccgtca 240
gaaataaaag caaagttaga cgcagctttt gagaagttta aaaaagatac attgaaacca 300
ggagaaaagg tagcagaagc taagaagaag gttgaagaag ctaagaaaaa agccgaggat 360
caaaaagaag aagatcgtcg taactaccca accaatactt acaaaacgct tgaacttgaa 420
attgctgagt tcgatgtgaa agttaaagaa gcggagcttg aactagtaaa agaggaagct 480
aaagaatctc gaaacgaggg cacaattaag caagcaaaag agaaagttga gagtaaaaaa 540
gctgaggcta caaggttaga aaacatcaag acagatcgta aaaaagcaga agaagaagct 600
aaacgaaaag cagcagaaga agataaagtt aaagaaaaac cagctgaaca accacaacca 660
gcgccggcta ctcaaccaga aaaaccagct ccaaaaccag agaagccagc tgaacaacca 720
aaagcagaaa aaacagatga tcaacaagct gaaga 755
＜210＞ 22
＜211＞ 1239
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA from Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 22
acagagaagg aggtaactac ccaagtaccc acttattcta atatggcaaa gacagaacat 60
aggaaagctg ctaaacaagt cgtcgatgaa tatatagaaa aaatgttgag ggagattcaa 120
ttagatagaa gaaaacatac ccaaaatttc gccttcaaca tgaagttgag cgcaattaaa 180
acggagtatt tgtatggatt aaaagagaag tcggaagctg agttgccgtc agaagtaaaa 240
gcaaagttag acgcagcttt tgagcagttt aaaaaagata cattgaaact aggagaaaag 300
gtagcagaag ctgagaagaa ggttgcagaa gctgagaaaa aagccaaggc tcaaaaagaa 360
gaagatcgcc gtaactaccc aaccaatact tacaaaacgc ttgaacttga aattgctgag 420
tccgatgtgg aagttaaaaa agcggagctt gaactattga aagaggaagc taaaactcga 480
aacgaggaca caattaacca agcaaaagcg aaagttgaga gtaaaaaagc tgaggctaca 540
aagttagaag aaatcaagac agatcgtaaa aaagcagaag aagaagctaa acgaaaagca 600
gaagcagaag aagataaagt taaagataaa ctaaagaggc ggacaaaacg agcagttcct 660
ggagagccag caacacctga taaaaaagaa aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta 720
ggtgaagaaa ctcttccaag cccatccctg aaatcaggaa aaaaggtagc agaagctgag 780
aagaaggttg cagaagctga gaaaaaagcc aaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac 840
tacccaacca atacttacaa aacgcttgac cttgaaattg ctgagtccga tgtgaaagtt 900
aaagaagcgg agcttgaact agtaaaagag gaagctaagg gatctcgaaa cgaggaaaaa 960
attaaccaag caaaagcgga agttgagagt aaaaaagctg aggctacaag gctagaaaaa 1020
atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa gaagctaaac gaaaagcagc agaagaagat 1080
aaagttaaag aaaaaccagc tgaacaacca caaccagcgc cggctcctca accagaaaaa 1140
ccaactgaag agcctgagaa tccagctcca gctccaaaac cagagaagcc agctgaacaa 1200
ccaaaagcag aaaaaacaga tgatcaacaa gctgaagaa 1239
＜210＞ 23
＜211＞ 1338
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA from Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 23
acagagaacg agggagctac ccaagtaccc acttcttcta atagggcaaa tgaaagtcag 60
gcagaacaag gagaacaacc taaaaaactc gattcagaac gagataaggc aaggaaagag 120
gtcgaggaat atgtaaaaaa aatagtgggt gagagctatg caaaatcaac taaaaagcga 180
catacaatta ctgtagctct agttaacgag ttgaacaaca ttaagaacga gtatttgaat 240
aaaatagttg aatcaacctc agaaagccaa ctacagatac tgatgatgga gagtcgatca 300
aaagtagatg aagctgtgtc taagtttgaa aaggactcat cttcttcgtc aagttcagac 360
tcttccacta aaccggaagc ttcagataca gcgaagccaa acaagccgac agaaccagga 420
gaaaaggtag cagaagctaa gaagaaggtt gaagaagttg agaaaaaagc caaggatcaa 480
aaagaagaag atcgtcgtaa ctacccaacc aattacttac aaacgcttga acttgaaatt 540
gctgagtccg atgtggaagt taaaaaagcg gagcttgaac tagtaaaagt gaaagctaac 600
gaacctcgag acaagcaaaa aattaagcaa gcagaagcgg aagttgagag taaacaagct 660
gaggctacaa ggttaaaaaa aatcaagaca gatcgtgaag aagcagaaga agaagctaaa 720
cgaagagcag atgctaaaga gcaaggtaaa ccaaaggggc ggccaaaacg aggagttcct 780
ggagagctag caacacctga taaaaaagaa aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta 840
ggtgaagaaa ctcttccaag cccatccctg aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag 900
aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc gaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac 960
tacccaacca atacttacaa aacgcttgaa cttgaaattg ctgagtccga tgtggaagtt 1020
aaaaaagcgg agcttgaact agtaaaagag gaagctaagg aacctcgaaa cgaggaaaaa 1080
gttaagcaag caaaagcgga agttgagagt aaaaaagctg aggctacaag gttagaaaaa 1140
atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa gaagctaaac gaaaagcagc agaagaagat 1200
aaagttaaag aaaaaccagc tgaacaacca caaccagcgc cggctccaaa aacagaaaaa 1260
ccagctccag ctccaaaacc agagaatcca gctgaacaac caaaagcaga aaaaccagct 1320
gatcaacaag ctgaagaa 1338
＜210＞ 24
＜211＞ 1284
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA prepared from Streptococcus pneumoniae genome
＜400＞ 24
gaaggggtta gaagtgggaa taactccacg gttacatcta gtgggcaaga tatatcgaag 60
aagtatgctg atgaagtcga gtcgcatcta caaagtatat tgaaggatgt caataaaaat 120
ttgaagaaag ttcaacatac ccaaaatgcc gacttcaaca aaaagttgag caaaattaaa 180
acgaagtatt tgtatgaatt aaatgtttta gaagagaagt cggaagctga gttgacgtca 240
aaaacaaaag aaacaaaaga agagttaacc gcagcttttg agcagtttaa aaaagataca 300
ttatcaacag aaccagaaaa aaaggtagca gaagctaaga agaaggttga agaagctaag 360
aaaaaagccg aggatcaaaa agaaaaagat cgccgtaact acccaaccat tacttacaaa 420
acgcttgaac ttgaaattgc tgagtccgat gtggaagtta aaaaagcgga gcttgaacta 480
gtaaaagtga aagctaacga acctcgagac gaggaaaaaa ttaagcaagc agaagcgaaa 540
gttgagagta aacaagctga ggctacaagg ttaaaaaaaa tcaagacaga tcgtgaacaa 600
gctgaggcta caaggttaga aaacatcaag acagatcgtg aacaagcaga agaagaagct 660
aaagttaaag atgaaccaaa gaagcggaca aaacgaggag ttcttggaga gccagcaaca 720
cctgataaaa aagaaaatga tgcgaagtct tcagattcta gcgtaggtga agaaactctt 780
ccaagcccat ccctgaaacc agaaaaaaag gttgcagaag ctgagaagaa ggttgaagaa840
gctaagaaaa aagccgagga tcaaaaagaa gaagatcgtc gtaactaccc aaccaatact 900
tacaaaacgc ttgaacttga aattgctgag tccgatgtgg aagttaaaaa agcggagctt 960
gaactagtaa aagaggaagc taaggaacct cgaaacgagg aaaaagttaa gcaagcaaaa 1020
gcggaagttg agagtaaaca agctgaggct acaaggttag aaaacatcaa gacagatcgt 1080
aaaaaagcag aagaagaagc taaacgaaaa gcagcagaag aagataaagt taaagaaaaa 1140
ccagctgaac aaccacaacc agcgccggct cctcaaccag aaaaaccagc tccaaaacca 1200
gaaaaaccag ctccagctcc aaaaccagag aatccagctg aacaaccaaa agcagaaaaa 1260
ccagctgatc aacaagctga agaa 1284
＜210＞ 25
＜211＞ 658
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 25
gaaggggtta gaagtgggaa taactccacg gttacatcta gtgggcaaga tatatcgaag 60
aagtatgctg atgaagtcga gtcgcatcta caaagtatat tgaaggatgt caataaaaat 120
ttgaaaaaag ttcaacatac ccaaaatgcc gacttcaaca aaaagttgag caaaattaaa 180
ccgaagtatt tgtatgaatt aaagtgttta gaagagaagt cggaagctga gttgacgtca 240
aaaccaaaga acaaaagaag agttaccgca gcttttgagc agtttaaaaa agatacatta 300
tcaacagaac cagaaaaaaa ggtagcagaa gctaagaaga aggttgaaga agctaagaaa 360
aaagccgagg atcaaaaaga aaaagatcgc cgtaactacc caaccattac ttacaaaacg 420
cttgaacttg aaattgctga gtccgatgtg gaagttaaaa aagcggagct tgaactagta 480
aaagaggaag ctaaggaacc tcgaaacgag gaaaaagtta agcaagcaaa agcggaagtt 540
gagagtaaac aagctgaggc tacaaggtta gaaaaaatca agacagatcg taaaaaagca 600
gaagaagaag ctaaacgaaa agcagcagaa gaagataaag ttaaagaaaa accagctg 658
＜210＞ 26
＜211＞ 1338
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 26
acagagaacg agggagctac ccaagtaccc acttcttcta atagggcaaa tgaaagtcag 60
gcagaacaag gagaacaacc taaaaaactc gattcagaac gagataaggc aaggaaagag 120
gtcgaggaat atgtaaaaaa aatagtgggt gagagctatg caaaatcaac taaaaagcga 180
catacaatta ctgtagctct agttaacgag ttgaacaaca ttaagaacga gtatttgaat 240
aaaatagttg aatcaacctc agaaagccaa ctacagatac tgatgatgga gagtcgatca 300
aaagtagatg aagctgtgtc taagtttgaa aaggactcat cttcttcgtc aagttcagac 360
tcttccacta aaccggaagc ttcagataca gcgaagccaa acaagccgac agaaccagga 420
gaaaaggtag cagaagctaa gaagaaggtt gaagaagctg agaaaaaagc caaggatcaa 480
aaagaagaag atcgtcgtaa ctacccaacc attacttaca aaacgcttga acttgaaatt 540
gctgagtccg atgtggaagt taaaaaagcg gagcttgaac tagtaaaagt gaaagctaac 600
gaacctcgag acgagcaaaa aattaagcaa gcagaagcgg aagttgagag taaacaagct 660
gaggctacaa ggttaaaaaa aatcaagaca gatcgtgaag aagcagaaga agaagctaaa 720
cgaagagcag atgctaaaga gcaaggtaaa ccaaaggggc gggcaaaacg aggagttcct 780
ggagagctag caacacctga taaaaaagaa aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta 840
ggtgaagaaa ctcttccaag cccatccctg aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag 900
aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc gaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac 960
tacccaacca atacttacaa aacgcttgaa cttgaaattg ctgagtccga tgtggaagtt 1020
aaaaaagcgg agcttgaact agtaaaagag gaagctaagg aacctcgaaa cgaggaaaaa 1080
gttaagcaag caaaagcgga agttgagagt aaaaaagctg aggctacaag gttagaaaaa 1140
atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa gaagctaaac gaaaagcagc agaagaagat 1200
aaagttaaag aaaaaccagc tgaacaacca caaccagcgc cggctccaaa agcagaaaaa 1260
ccagctccag ctccaaaacc agagaatcca gctgaacaac caaaagcaga aaaaccagct 1320
gatcaacaag ctgaagaa 1338
＜210＞ 27
＜211＞ 1242
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived form genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 27
acagaaaacg aaggaagtac ccaagcagcc acttcttcta atatggcaaa gacagaacat 60
aggaaagctg ctaaacaagt cgtcgatgaa tatatagaaa aaatgttgag ggagattcaa 120
ctagatagaa gaaaacatac ccaaaatgtc gccttaaaca taaagttgag cgcaattaaa 180
acgaagtatt tgcgtgaatt aaatgtttta gaagagaagt cgaaagatga gttgccgtca 240
gaaataaaag caaagttaga cgcagctttt gagaagttta aaaaagatac attgaaacca 300
ggagaaaagg tagcagaagc taagaagaag gttgaagaag ctaagaaaaa agccgaggat 360
caaaaagaag aagatcgtcg taactaccca accaatactt acaaaacgct tgaacttgaa 420
attgctgagt tcgatgtgaa agttaaagaa gcggagcttg aactagtaaa agaggaagct 480
aaagaatctc gaaacgaggg cacaattaag caagcaaaag agaaagttga gagtaaaaaa 540
gctgaggcta caaggttaga aaacatcaag acagatcgta aaaaagcaga agaagaagct 600
aaacgaaaag cagatgctaa gttgaaggaa gctaatgtag cgacttcaga tcaaggtaaa 660
ccaaaggggc gggcaaaacg aggagttcct ggagagctag caacacctga taaaaaagaa 720
aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta ggtgaagaaa ctcttccaag ctcatccctg 780
aaatcaggaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctga gaaaaaagcc 840
aaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgac 900
cttgaaattg ctgagtccga tgtgaaagtt aaagaagcgg agcttgaact agtaaaagag 960
gaagctaagg aacctcgaga cgaggaaaaa attaagcaag caaaagcgaa agttgagagt 1020
aaaaaagctg aggctacaag gttagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 1080
gaagctaaac gaaaagcagc agaagaagat aaagttaaag aaaaaccagc tgaacaacca 1140
caaccagcgc cggctactca accagaaaaa ccagctccaa aaccagagaa gccagctgaa 1200
caaccaaaag cagaaaaaac agatgatcaa caagctgaag aa 1242
＜210＞ 28
＜211＞ 1275
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 28
acagagaagg aggtaactac ccaagtagcc acttcttcta atagggcaaa tgaaagtcag 60
gcaggacata ggaaagctgc tgaacaattc gatgaatata taaaaacaat gatccaatta 120
gatagaagaa aacataccca aaatttcgcc ttaaacataa agttgagcag aattaaaacg 180
gagtatttgc gtaaattaaa tgttttagaa gagaagtcga aagctgagtt gccgtcagaa 240
acaaaaaaag agatagacgc agcttttgag cagtttaaaa aagataccaa cagaaccaaa 300
aaaacggtag cagaagctga gaagaaggtt gaagaagcta agaaaaaagc caaggctcaa 360
aaagaagaag atcaccgtaa ctacccaacc aatacttaca aaacgcttga acttgaaatt 420
gctgagtccg atgtggaagt taaaaaagcg gagcttgaac tagtaaaaga ggaagctaag 480
gaatctcgag acgatgaaaa aattaagcaa gcagaagcga aagttgagag taaaaaagct 540
gaggctacaa ggttagaaaa catcaagaca gatcgtgaaa aagcagaaga agaagctaaa 600
cgaagagcag aagctaagtt gaaggaagct gttgaaaaga atgtagcgac ttcagagcaa 660
gataaaccaa aggggcggag aaaacgagga gttcctggag agcaagcaac acctgataaa 720
aaagaaaatg atgcgaagtc ttcagattct agcgtaggtg aagaagctct tccaagccca 780
tccctgaaac cagaaaaaaa ggttgcagaa gctgagaaga aggttgcaga agctgagaaa 840
aaagccaagg ctcaaaaaga agaagatcgc cgtaactacc caaccaatac ttacaaaacg 900
cttgaacttg aaattgctga gtccgatgtg aaagttaaag aagcggagct tgaactagta 960
aaagaggaag ctaaggaatc tcgaaacgag gaaaaagtta atcaagcaaa agcgaaagtt 1020
gagagtaaaa aagctgaggc tacaaggtta gaaaaaatca agacagatcg taaaaaagca 1080
gaagaagaag ctaaacgaaa agcagcagaa gaagataaag ttaaagaaaa accagctgaa 1140
caaccacaac cagcgccggc tcctcaacca gaaaaaccaa ctgaagagcc tgagaatcca 1200
gctcccgcac caaaaccaga gaagccagct gaacaaccaa aagcagaaaa aacagatgat 1260
caacaagctg aagaa 1275
＜210＞ 29
＜211＞ 1278
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived form genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 29
acagagaagg aggtaactac ccaagtagcc acttcttcta ataaggcaaa taaaagtcag 60
acagaacata tgaaagctgc taaacaagtc gatgaatata taaaaaaaaa gctccaatta 120
gatagaagaa aacataccca aaatgtcggc ttactcacaa agttgggcgt aattaaaacg 180
gagtatttgc atggattaag tgtttcaaaa aagaagtcgg aagctgagtt gccgtcagaa 240
ataaaagcaa agttagacgc agcttttgag cagtttaaaa aagatacatt accaacagaa 300
ccaggaaaaa aggtagcaga agctgagaag aaggttgaag aagctaagaa aaaagccgag 360
gatcaaaaag aaaaagatct ccgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt 420
gacattgctg agtccgatgt ggaagttaaa aaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 480
gctaaggaat ctcgagacga gaaaaaaatt aatcaagcaa aagcgaaagt tgagaataaa 540
aaagctgagg ctacaaggtt aaaaaacatc aagacagatc gtgaaaaagc agaagaagct 600
aaacgaagag cagatgctaa gttgcaggaa gctaatgtag cgacttcaga gcaagataaa 660
tcaaagaggc gggcaaaacg agaagttctt ggagagctag caacacctga taaaaaagaa 720
aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta ggtgaagaaa ctcttacaag cccatccctg 780
aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc 840
gaggatcaaa aagaagaaga tcgtcgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgaa 900
cttgaaattg ctgagtccga tgtggaagtt aaaaaagcgg agcttgaact agtaaaagag 960
gaagctaagg aatctcgaaa cgaggaaaaa attaagcaag taaaagcgaa agttgagagt 1020
aaaaaagctg aggctacaag gctagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 1080
gaagaagcta aacgaagagc agcagaagaa gataaagtta aagaaaaacc agctgaacaa 1140
ccacaaccag cgccggctcc tcaaccagaa aaaccaactg aagagcctga gaatccagct 1200
ccagctccag ctccaaaacc agagaatcca gctgaaaaac caaaagcaga aaagccagct 1260
gatcaacaag ctgaagaa 1278
＜210＞ 30
＜211＞ 1276
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 30
acagagaagg aggtaactac ccaagtagcc acttcttcta ataaggcaaa taaaagtcag 60
acagaacata tgaaagctgc taaacaagtc gatgaatata taaaaaaaaa gctccaatta 120
gatagaagaa aacataccca aaatgtcggc ttactcacaa agttgggcgt aattaaaacg 180
gagtatttgc atggattaag tgtttcaaaa aagaagtcgg aagctgagtt gccgtcagaa 240
ataaaagcaa agttagacgc agcttttgag cagtttaaaa aagatacatt accaacagaa 300
ccaggaaaaa aggtagcaga agctgagaag aaggttgaag aagctaagaa aaaagccgag 360
gatcaaaaag aaaaagatct ccgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt 420
gacattgctg agtccgatgt ggaagttaaa aaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 480
gctaaggaat ctcgagacga gaaaaaaatt aatcaagcaa aagcgaaagt tgagaataaa 540
aaagctgagg ctacaaggtt aaaaaacatc aagacagatc gtgaaaaagc agaagaagct 600
aaacgaagag cagatgctaa gttgcaggaa gctaatgtag cgacttcaga gcaagataaa 660
tcaaagaggc gggcaaaacg agaagttttt ggagagctag caacacctga taaaaaagaa 720
aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta ggtgaagaaa ctcttacaag cccatccctg 780
aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc 840
gaggatcaaa aagaagaaga tcgtcgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgaa 900
cttgaaattg ctgagtccga tgtggaagtt aaaaaagcgg agcttgaact agtaaaagag 960
gaagctaagg aatctcgaaa cgaggaaaaa attaagcaag taaaagcgaa agttgagagt 1020
aaaaaagctg aggctacaag gctagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 1080
gaagaagcta aacgaagagc agcagaagaa gataaagtta aagaaaaacc agctgaacaa 1140
ccacaaccag cgccggctcc tcaaccagaa aaaccaactg aagagcctga gaatccagct 1200
ccagctccag ctccaaaacc agagaatcca gctgaaaaac caaaagcaga aaagccagct 1260
gatcaacaag ctgaag 1276
＜210＞ 31
＜211＞ 1272
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ cDNA derived from genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 31
acagagaagg aggtaactac ccaagtagcc acttcttcta atagggcaaa taaaagtcag 60
acagaacata tgaaagctgc taaacaagtc gatgaatata taaaaaaaaa gctccaatta 120
gatagaagaa aacataccca aaatgtcggc ttactcacaa agttgggcgt aattaaaacg 180
gagtatttgc atggattaag tgtttcaaaa aagaagtcgg aagctgagtt gccgtcagaa 240
ataaaagcaa agttagacgc agcttttgag cagtttaaaa aagatacatt accaacagaa 300
ccaggtaaaa aggtagcaga agctgagaag aaggttgaag aagctaagaa aaaagccgag 360
gatcaaaaag aaaaagatct ccgtaactac ccaaccaata cttacaaaac gcttgaactt 420
gacattgctg agtccgatgt ggaagttaaa aaagcggagc ttgaactagt aaaagaggaa 480
gctaaggaat ctcgagacga gaaaaaaatt aatcaagcaa aagcgaaagt tgagaataaa 540
aaagctgagg ctacaaggtt aaaaaacatc aagacagatc gtgaaaaagc agaagaagct 600
aaacgaagag cagatgctaa gttgcaggaa gctaatgtag cgacttcaga gcaagataaa 660
tcaaagaggc gggcaaaacg agaagttctt ggagagctag caacacctga taaaaaagaa 720
aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta ggtgaagaaa ctcttacaag cccatccctg 780
aaaccagaaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctaa gaaaaaagcc 840
gaggatcaaa aagaagaaga tcgtcgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgaa 900
cttgaaattg ctgagtccga tgtggaagtt aaaaaagcgg agcttgaact agtaaaagag 960
gaagctaagg aatctcgaaa cgaggaaaaa attaagcaag taaaagcgaa agttgagagt 1020
aaaaaagctg aggctacaag gctagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 1080
gaagaagcta aacgaagagc agcagaagaa gataaagtta aagaaaaacc agctgaacaa 1140
ccacaaccag cgccggctcc tcaaccagaa aaaccaactg aagagcctga gaatccagct 1200
ccagctccag ctccaaaacc agagaatcca gctgaaaaac caaaagcaga aaagccagct 1260
gatcaacaag ct 1272
＜210＞ 32
＜211＞ 1258
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Coding strand of cDNA derived from genome of Streptococcus pneumo
niae
＜400＞ 32
acagagaacg agagaactac ccaagtaccc acttcttcta ataggggaaa gccagaacgt 60
aggaaagctg ctgaacaatt cgatgaatat ataaacaaaa tgatccaatt agataaaaga 120
aaacataccc aaaatttagc cttcaacata cagttgagca gaattaaaac ggagtatttg 180
aatggattaa aagagaagtc ggaagctgag ttgccgtcaa aaataaaagc agagttagac 240
gcagctttta agcagtttaa aaaagataca ttaccaacag aaccagaaaa aaaagtagca 300
gaagctgaga agaaggttga agaagctgag aagaaggtag cagaagctaa gaaaaaagcc 360
aaggctcaaa aagaagaaga tcaccgtaac tacccaacca ttacttacaa aacgcttgac 420
cttgaaattg ctgagttcga tgtgaaagtt aaagaagcgg agcttgaact agtaaaaaag 480
gaagctgacg aatctcgaaa cgagggcaca attaaccaag caaaagcgaa agttgagagt 540
gaaaaagctg aggctacaag gttaaaaaaa atcaagacag atcgtgaaaa agcagaagaa 600
gaagaagcta aacgaagagc agatgctaaa gagcaagatg aatcaaagag gcgaaagagt 660
cggggaaaac gaggagctct tggagagcaa gcaacacctg ataaaaaaga aaatgatgcg 720
aagtcttcag attctagcgt aggtgaagaa actcttccaa gcccatccct gaaaccagga 780
aaaaaggtag cagaagctga gaagaaggtt gaagaagctg ataaaaaagc caaggctcaa 840
aaagaagaag atcgccgtaa ctacccaacc aatacttaca aaacgcttga acttgaaatt 900
gctgagtccg atgtgaaagt taaagaagcg gagcttgaac tagtaaaaga ggaagctaag 960
gaatctcgaa acgaggaaaa aattaagcaa gcaaaagcga aagttgagag taaaaaagct 1020
gaggctacaa ggttagaaaa aatcaagaca gatcgtaaaa aagcagaaga agaagctaaa 1080
cgaaaagcag cagaagaaga taaagttaaa gaaaaaccag ctgaacaacc acaaccagcg 1140
ccggctcctc aaccagaaaa accagctgaa gagcctgaga atccagttcc agctccaaaa 1200
ccagagaatc cagctgaaca accaaaagca gaaaaaccag ctgatcaaca agctgaag 1258
＜210＞ 33
＜211＞ 1242
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Coding strand of cDNA derived from genome of Streptococcus pneumo
niae
＜400＞ 33
acagagaacg agggaagtac ccaagcagcc acttcttcta atatggcaaa gacagaacat 60
aggaaagctg ctaaacaagt cgtcgatgaa tatatagaaa aaatgttgag ggagattcaa 120
ctagatagaa gaaaacatac ccaaaatgtc gccttaaaca taaagttgag cgcaattaaa 180
acgaagtatt tgcgtgaatt taatgtttta gaagagaagt cgaaggatga gttgccgtca 240
gaaataaaag caaagttaga cgcagctttt gagaagttta aaaaagatac attgaaacca 300
ggagaaaagg tagcagaagc taagaagaag gttgaagaag ctaagaaaaa agccgaggat 360
caaaaagaag aagatcgtcg taactaccca accaatactt acaaaacgct tgaacttgaa 420
attgctgagt tcgatgtgaa agttaaagaa gcggagcttg aactagtaaa agaggaagct 480
aaagaatctc gaaacgaggg cacaattaag caagcaaaag agaaagttga gagtaaaaaa 540
gctgaggcta caaggttaga aaacatcaag acagatcgta aaaaagcaga agaagaagct 600
aaacgaaaag cagatgctaa gttgaaggaa gctaatgtag cgacttcaga tcaaggtaaa 660
ccaaaggggc gggcaaaacg aggagttcct ggagagctag caacacctga taaaaaagaa 720
aatgatgcga agtcttcaga ttctagcgta ggtgaagaaa ctcttccaag ctcatccctg 780
aaatcaggaa aaaaggtagc agaagctgag aagaaggttg aagaagctga gaaaaaagcc 840
aaggatcaaa aagaagaaga tcgccgtaac tacccaacca atacttacaa aacgcttgac 900
cttgaaattg ctgagtccga tgtgaaagtt aaagaagcgg agcttgaact agtaaaagag 960
gaagctaagg aacctcgaga cgaggaaaaa attaagcaag caaaagcgaa agttgagagt 1020
aaaaaagctg aggctacaag gttagaaaac atcaagacag atcgtaaaaa agcagaagaa 1080
gaagctaaac gaaaagcagc agaagaagat aaagttaaag aaaaaccagc tgaacaacca 1140
caaccagcgc cggctactca accagaaaaa ccagctccaa aaccagagaa gccagctgaa 1200
caaccaaaag cagaaaaaac agatgatcaa caagctgaag aa 1242
＜210＞ 34
＜211＞ 1236
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Coding strand from cDNA derived from genome of Streptococcus pneu
moniae
＜400＞ 34
gaaggggtta gaagtgagaa taaccccacg gttacatcta gtgggcaaga tatatcgaag 60
aagtatgctg atgaagtcaa gtcacatcta gaaaaaatat tgagtgagat ccaaacaaat 120
ttagatagaa gtaaacatat caaaactgta aatctaatta acaaattgca agacattaag 180
agaacgtatt tgtatgaatt aaatgtttta gaagataagt cgaaagctga gttgccgtca 240
aaaataaaag cagagttaga cgcagctttt gagcagttta aaaaagatac attaccaaca 300
gaaccaggaa aaaaggtagc agaagctaag aagaaggttg aagaagctga gaaaaaagcc 360
aaggctcaaa aagaagaaga ttaccgtaac tacccaacca ttacttacaa aacgcttgaa 420
cttgaaattg ctgagtccga tgtgaaagtt aaagaagcgg agcttgaact agtaaaaaag 480
gaagctgacg aatctcgaaa cgagggcaca attaaccaag caaaagcgaa agttgagagt 540
gaacaagctg aggctacaag gttaaaaaaa atcaagacag atcgtgaaaa agcagaagaa 600
gaagctaaac gaagagcaga tgctaaagag caagatgaat caaagaggcg aaagagtcgg 660
gtaaaacgag gagattttgg agagccagca acacctgata aaaaagaaaa tgatgcgaag 720
tcttcagatt ctagcgtagg tgaagaaact cttccaagcc catccctgaa accaggaaaa 780
aaggtagcag aagctgagaa gaaggttgaa gaagctgaga aaaaagccaa ggatcaaaaa 840
gaagaagatc accgtaacta cccaaccatt acttacaaaa cgcttgaact tgaaattgct 900
gagtccgatg tggaagttaa aaaagcggag cttgaactag taaaagagga agctaaggga 960
tctcgaaacg aggaaaaagt taagcaagca aaagcggaag ttgagagtaa aaaagctgag 1020
gctacaaggt tagaaaaaat caagacagat cgtaaaaaag cagaagaaga agctaaacga 1080
aaagcagcag aagaagataa agttaaagaa aaaccagctg aacaaccaca accagcgccg 1140
gctcctcaac cagaaaaacc agctccagct ccaaaaccag agaatccagc tgaacaacca 1200
aaagcagaaa aaccagctga tcaacaagct gaagaa 1236
＜210＞ 35
＜211＞ 1218
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Coding strand from cDNA derived from genome of Streptococcus pneu
moniae
＜400＞ 35
acagagaacg agggaactac ccaagcaccc acttcttcta ataggggaaa tgaaagtcag 60
gcagaacata tgaaagctgc taaacaagtc gatgaatata tagaaaaaat gctccaatta 120
gatagaagaa aacataccca aaatgtcggc ttactcacaa agttgggcgc aattaaaacg 180
gagtatttgc gtggattaag tgtttcaaaa gagaagtcga cagctgagtt gccgtcagaa 240
ataaaagaaa agttaaccgc agcttttaag cagtttaaaa aagatacatt gaaaccagaa 300
aaaaaggtag cagaagctga gaagaaggta gcagaagcta agaaaaaagc cgaggatcaa 360
aaagaagaag atcgtcgtaa ctacccaacc attacttaca aaacgcttga acttgaaatt 420
gctgagtccg atgtggaagt taaaaaagcg gagcttgaac tagtaaaagt gaaagctaac 480
gaacctcgag acgaggaaaa aattaagcaa gcagaagcgg aagttgagag taaaaaagct 540
gaggctacaa ggttaaaaaa aatcaagaca gatcgtgaaa aagcagaaga agaagctaaa 600
cgaagagtag atgctaaaga gcaagatgaa tcatcaaaga ggcgaaagag tcgggtaaaa 660
cgaggagatc ttggagagca agcaacacct gataaaaaag aaaatgatgc gaagtcttca 720
gattctagcg taggtgaaga aactcttcca agcccatccc tgaaaccagg aaaaaaggta 780
gcagaagctg agaagaaggt tgaagaagct gataaaaaag ccaaggctca aaaagaagaa 840
gatcgccgta actacccaac caatacttac aaaacgcttg aacttgaaat tgctgagtcc 900
gatgtggaag ttaaaaaagc ggagcttgaa ctagtaaaag aggaagctaa ggaacctcga 960
aacgaggaaa aagttaagca agcaaaagcg gaagttgaga gtaaaaaagc tgaggctaca 1020
aggttagaaa aaatcaagac agatcgtaaa aaagcagaag aagaagctaa acgaaaagca 1080
gcagaagaag ataaagttaa agaaaaacca gctgaacaac caaaaccagc gccggctcct 1140
caaccagaaa aaccagctcc aaaaccagag aatccagctg aacaaccaaa agcagaaaaa 1200
ccagctgatc aacaagct 1218
＜210＞ 36
＜211＞ 102
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from consensus cDNA sequence
＜400＞ 36
Thr Glu Asn Glu Gly Thr Thr Gln Val Ala Thr Ser Ser Asn Arg Ala
1 5 10 15
Asn Gln Thr Glu His Arg Lys Ala Ala Lys Gln Val Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Ile Lys Lys Met Leu Glu Gln Leu Asp Arg Arg Lys His Thr Gln Asn
35 40 45
Val Ala Leu Asn Ile Lys Leu Ser Ala Ile Lys Thr Glu Tyr Leu Arg
50 55 60
Glu Leu Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ala Glu Leu Pro Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala Phe Glu Gln Phe Lys Lys Asp Thr
85 90 95
Leu Lys Thr Glu Pro Gly
100
＜210＞ 37
＜211＞ 55
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from a cDNA consensus sequence from t
he genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 37
Asp Ala Lys Leu Glu Ala Thr Ser Glu Gln Asp Lys Pro Lys Gly Arg
1 5 10 15
Ala Lys Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu Ala Thr Pro Asp Lys Lys Glu
20 25 30
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Ser Val Gly Glu Glu Thr Leu Pro
35 40 45
Ser Pro Ser Leu Lys Pro Glu
50 55
＜210＞ 38
＜211＞ 103
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence derived from consensus sequence of derived fr
om the genome of Streptococcus pneumoniae
＜400＞ 38
Lys Lys Val Ala Glu Ala Glu Lys Lys Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ala Lys Asp Gln Lys Glu Glu Asp Arg Arg Asn Tyr Pro Thr Ile Thr
20 25 30
Tyr Lys Thr Leu Glu Leu Glu Ile Ala Glu Ser Asp Val Glu Val Lys
35 40 45
Lys Ala Glu Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Ala Lys Glu Ser Arg Asp
50 55 60
Glu Gly Lys Ile Lys Gln Ala Lys Ala Lys Val Glu Ser Lys Lys Ala
65 70 75 80
Glu Ala Thr Arg Leu Lys Lys Ile Lys Thr Asp Arg Glu Lys Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Ala Lys Arg Arg Ala
100

Claims (21)

  1. 다른 타입의 폐렴 구균 박테리아에 대하여 고도로 보존된 면역원성 알파-헬릭스 부분을 갖는 폐렴 구균의 표면-결합 단백질, 동족체 또는 변종의 폴리펩타이드 단편인 면역원을 함유하는, 박테리아의 감염에 대항하는 백신: 단, 상기 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대하여 75% 이상의 동일성을 갖는 백신.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 백신.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 다음으로 구성되는 군의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 백신:
    (a)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 및
    (b)SEQ ID NO:19의 아미노산 서열.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 상기 아미노산 서열이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 요소의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 백신:
    (a)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 및
    (b)SEQ ID NO:19의 아미노산 서열.
  6. 제 1 항에 있어서, 중이염, 패혈증, 뇌막염 및 엽성 페렴의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 백신.
  7. 제 6 항에 있어서, 침입성 감염에 대한 백신.
  8. 제 6 항에 있어서, S. pneumoniae에 의해 야기된 중이염 감염에 대한 백신.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 단편이 SEQ ID NOS:3 내지 18 각각의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 요소에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 백신.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 단편이 SEQ ID NOS:3 내지 18 각각의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 요소에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 백신.
  11. 다른 타입의 폐렴 구균 박테리아에 대하여 고도로 보존된 면역원성 알파-헬릭스 부분을 갖는 폐렴 구균의 표면-결합 단백질, 동족체 또는 변종의 폴리펩타이드 단편인 면역원에 대항하여 증가되는 항체(단, 상기 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다).
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대하여 85% 이상의 동일성을 갖는 항체.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 요소의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 항체:
    (a)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 및
    (b)SEQ ID NO:19의 아미노산 서열.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 알파-헬릭스 부분의 아미노산 서열이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 요소의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 항체:
    (a)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열, 및
    (b)SEQ ID NO:19의 아미노산 서열.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 단편이 SEQ ID NOS:3 내지 18 각각의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 요소에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 항체.
  16. 제 11 항에 있어서, 상기 항체가 S. pneumoniae 감염을 탐지하는 항체.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 항체가 S. pneumoniae 감염의 예방 및/또는 치료에 대해 효과적인 항체.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 항체가 1-5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F 타입의 S. pneumoniae 박테리아에 의해 야기된 폐렴 구균의 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 항체.
  19. 다음으로 구성되는 군으로부터 선택한 요소를 이용하여 숙주를 면역시키는 것으로 이루어지는, 숙주에서 폐렴 구균의 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법:
    (a)제 2 항의 백신, 및
    (b)SEQ ID NOS:3 내지 18로 구성된 군으로부터 선택된 요소의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폐렴 구균의 표면-결합 단백질, 동족체 또는 변종의 폴리펩타이드 단편인 면역원에 대항하여 증가되는 한가지 이상의 항체(단, 상기 폴리펩타이드는 콜린과의 결합 부분을 포함하지 않는다).
  20. SEQ ID NOS:3 내지 18 각각의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 요소에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  21. 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 요소에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드:
    (a)SEQ ID NOS:3 내지 18 각각의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 요소를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열, 및
    (b)(a)의 보체.
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