KR20010024604A - 단백질 상호 작용 및 이들의 기능적 상관관계를 나타내는검출 시스템 - Google Patents

단백질 상호 작용 및 이들의 기능적 상관관계를 나타내는검출 시스템 Download PDF

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KR20010024604A
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fusion
gene
cell
reporter gene
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로저 브렌트
씨.윌슨 수
앤드류 알. 멘델손
월터 엘. 록
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제너럴 하스피톨 코포레이션
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Abstract

본 발명은 단백질들의 복잡한 상호 작용 및 단백질의 기능적 상관 관계를 검출하는 방법 및 상기 방법의 수행용 시약에 관한것이다.

Description

단백질 상호 작용 및 이들의 기능적 상관 관계를 나타내는 검출 시스템{DETECTION SYSTEMS FOR REGISTERING PROTEIN INTERACTIONS AND FUNCTIONAL RELATIONSHIPS}
＜110＞ THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION
＜120＞ PROTEIN INTERACTINS AND FUNCTIONAL RELATIONSHIPS
＜150＞ PCT/US 60/065,273
＜151＞ 1997-11-10
＜160＞ 16
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 14
＜212＞ DNA
＜213＞ Saccharomyces cerevisiae
＜400＞ 1
gatccgcggc cgcg 14
＜210＞ 2
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＜212＞ DNA
＜213＞ Saccharomyces cerevisiae
＜400＞ 2
aaaaggaaaa gcggccgctt agttttgctg gccgcatctt c 41
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＜212＞ DNA
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cggaattctt tcgaaagcta catataagga ac 32
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＜212＞ DNA
＜213＞ Escherichia coli
＜400＞ 4
tcgagcactc cctatcagtg atagagaaaa cactccctat cagtgataga gaaaag 56
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＜212＞ DNA
＜213＞ Escherichia coli
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cgtgagggat agtcactatc tcttttgtga gggatagtca ctatctcttt tcagct 56
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＜211＞ 14
＜212＞ DNA
＜213＞ Saccharomyces cerevisiae
＜400＞ 6
ggccgcggta ccgc 14
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＜400＞ 7
gcctgaattc atgacggaat ataagctgg 29
＜210＞ 8
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＜212＞ DNA
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 8
cccgaactcg agtcaggaga gcactgcctt gcagc 35
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＜211＞ 25
＜212＞ DNA
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＜400＞ 9
gcctgaattc aaagcaggaa ctgtt 25
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cccgaactcg agctatcgtg gttctatttc tag 33
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cccgaactcg agttatcgaa ataacctaga agg 33
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＜212＞ DNA
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＜212＞ PRT
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Asp Met Asp Trp Phe Phe Arg Phe Tyr Ala Ser Val Ser Arg Leu Phe
1 5 10 15
Arg His Leu His
20
＜210＞ 16
＜211＞ 20
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 16
Phe Trp Gln Ala Thr Leu Arg Leu Val Ser Asp Lys Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Pro Asp Pro
20
본 발명은 단백질 상호 작용 검출 시스템에 관한다.
유전자 분석법은 생물학적 공정을 지배하는 단백질 네트워크를 이해하는 수단이 된다. 유전학자들에 의하여 수행되는 조작(예를 들어, 온도 감수성 돌연변이, 이중 돌연변이의 구성과 분석 및 F1과 F2자손의 생산 및 관찰)은 유전자들 사이의 상관 관계를 규명하여 준다. 유전자들 사이의 추상적 상관 관계는 종종 근원적인 생물학적 실체를 반영한다. 예를 들어, 열성 유전 형질 잠재 상관 관계(epistasis relation)는 보통 다른 유전자에 영향을 주어 표현형을 발현시키는 유전자를, 대립 형질 특이적 억제 상관 관계(allelic specific suppression relation)는 물리적으로 상호 작용을 하는 2개의 유전자 산물을 제시할 수 있으며[Hartman and Roth, Adv. Genet. 17:1-105(1973); Jarvik and Botstein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2046-50(1973)], 종속 상관 관계(dependency relation)는 하나의 유전자 생산물의 활동이 시기 적절하게 다른 유전자 활동에 우선한다는 것을 제시할 수 있다[Hereford and Hartwell, J. Mol. Biol.84:445-61(1974)].
상기와 같은 유전자 조작으로부터 얻어진 정보는 통상적으로 질이 매우 우수하지만, 비교적 정보 획득이 어려운 경우도 종종 있다. 최근 들어 신규의 암호화 서열 검출률이 증가함에 따라 유전자 기능을 이해하기 위한 포괄적이며 조직적인 방법에 대한 새로운 관심이 생겨났다. 이와 같은 방법들에는 단일의 베이트(bait) 및 상호 작용 단백질 사이의 연락(contact)을 검정하기 위해서 개발된 "이중 혼성화(Two hybrid)" 또는 "상호 작용 트랩(interaction trap)"을 포함한다[Fields and Song, Nature 340:245-6(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-82(1991); Gyuris et al., Cell 75:791-803(1993); Durfee et al., Genes Dev. 7:555-69(1993); Estojak et al.,Mol. Cell. Biol. 15:5820-9(1995)]. 이와 같은 시스템내의 두 단백질간 연락은 때때로 생물학적으로 중요한 의미를 갖는 물리적 상관 관계를 규명해 주기도 한다.
[발명의 요약]
일반적으로, 본 발명의 제 1 양상은
(a)(ⅰ)제 1 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 1 리포터 유전자;
(ⅱ)제 2 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 2 리포터 유전자;
(ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자;
(ⅳ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 2 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자; 및
(ⅴ)제 3 융합 단백질을 발현하는 제 3 융합 유전자로서, 상기 제 3 융합 단백질이 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 3 융합 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b)상기 제 1 단백질과 제 3 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 제 1 리포터 유전자의 발현 아웃풋을 측정하는 단계;
(c)상기 제 2 단백질과 제 3 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 제 2 리포터 유전자의 발현 아웃풋을 측정하는 단계; 및
(d)단계 (b) 및 단계 (c)의 발현 아웃풋 결과를 해석하는 단계로서, (ⅰ)제 1 리포터 유전자 및 제 2 리포터 유전자 모두의 아웃풋이 증가된 경우는 제 3 융합 단백질이 제 1 융합 단백질 및 제 2 융합 단백질과 모두 상호 작용한다는 것을 가리키고;
(ⅱ)제 1 리포터 유전자의 아웃풋만 증가하고 제 2 리포터 유전자의 아웃풋은 증가되지 않은 경우는 제 3 융합 단백질이 제 1 융합 단백질과 상호 작용하지만 제 2 융합 단백질과는 상호 작용을 하지 않는다는 것을 가리키며;
(ⅲ)제 2리포터 유전자의 아웃풋만 증가하고 제 1 리포터 유전자의 아웃풋은 증가되지 않은 경우는 제 3 융합 단백질이 제 2 융합 단백질과 상호 작용하지만 제 1 융합 단백질과는 상호 작용을 하지 않는다는 것을 가리키고;
(ⅳ)제 1 리포터 유전자 또는 제 2 리포터 유전자 모두의 아웃풋에 변화가 없는 경우는 제 3 융합 단백질이 제 1 또는 제 2 융합 유전자와 상호 작용하지 않음을 가리키는 것으로 해석하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 방법은 단계(b) 및 단계(c)의 발현 아웃풋 결과를 다음중 하나의 숙주세포에서의 발현 아웃풋 결과와 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
즉,
(a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열과 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합될 수 있는 결합 부분에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
(ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부위에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자;
를 포함하는 제 1 비교 숙주 세포; 또는
(b)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 제 1 융합 단백질이 단백질 결합 부위와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
(ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자;
를 포함하는 제 2 비교 숙주 세포 또는
(c)상기 제 1 및 제 2 비교 숙주 세포 양자를 추가로 포함한다. 더욱이, 비교 횟수는 복수의 "2 베이트(two-bait)" 세포들 사이에서 또는 "2 베이트(two-bait)" 세포 및 복수의 "1 베이트(one-bait)" 세포들 사이에서 결정될 수 있거나, 또는 두가지 경우 모두에서 임의로 결정될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나 이상의 경우에 발현 수준이 감소될 수 있다; 제 1 또는 제 2 단백질 결합 부위중 어느 하나는 테트라싸이클린 작동 유전자이고; 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중의 어느 하나는 URA3 또는 lacZ이며; 제 1 또는 제 2 리포터 유전자는 제 2 세포에 의해서 수용후 검출되는 신호를 발생시키고; 숙주 세포는 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포이며; 제 1 및 제 2 리포터 유전자는 자발적으로 발현될 수 있고; 제 1 단백질 및 제 2 단백질은 대립형질 변이체(allelic variant)이다.
본 발명의 제 2 양상은
(a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
(ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 1 단백질과 상호 작용할 수 있고 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 2 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자
를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b)제 1 단백질과 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
(c)제 1 단백질과 제 2 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계;
(d)제 3 단백질을 발현하는 제 3 유전자를 세포내에 도입시키는 단계;
(e)리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계로서, 제 3 단백질 존재하에서 리포터 유전자의 발현이 변화되는 것은 제 3 단백질이 제 1 단백질 또는 제 2 단백질의 상태 변화를 매개하여 그 결과 제 1 단백질 및 제 2 단백질이 상호 작용하는 능력을 변화시키는 것임을 나타내는 리포터 유전자의 발현 측정 단계
를 포함하는, 다른 단백질 상태로 변화하는 것을 매개하는 단백질을 검출하는 방법에 관한다.
본 발명과 관련된 제 3 양상은
(a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
(ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 1 단백질과 상호 작용 가능하며 유전자 활성화 부분에 공유적으로 결합되는 제 2 단백질을 포함하며, 상기 제 1 단백질 또는 제 2 단백질중 하나 이상이 상태 변화 가능한 제 2 융합 유전자를 포함하는 제 1 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b)제 1 단백질 및 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
(c)제 1 단백질 및 제 2 단백질 사이의 상호 작용을 측정하는 방법으로서, 제 1 숙주 세포내에서 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계;
(d)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열과 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자;
(ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자; 및
(ⅳ)제 3 단백질을 발현하는 제 3 유전자
를 포함하는 제 2 숙주 세포를 제공하는 단계;
(e)제 3 단백질 존재하에서 제 1 단백질 또는 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
(f)제 3 단백질 존재하에서의 제 1 단백질과 제 2 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 제 2 숙주 세포내에서의 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계로서, 제 1 숙주 세포에서 측정한 발현 아웃풋에 비하여 제 2 숙주 세포내 리포터 유전자의 발현 아웃풋의 변화가 제 3 단백질이 제 1 단백질 또는 제 2 단백질의 상태 변화를 매개하여 그 결과, 제 1 단백질 및 제 2 단백질의 상호 작용 능력을 변화시킨다는 것을 나타내는 것임을 특징으로 하는 리포터 유전자의 발현 측정 단계
를 포함하는, 다른 단백질 상태로 전환시키는 것을 매개하는 또 다른 단백질 검출 방법에 관한다.
상기 각각 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 상태 변화는 구조상의 변화이고; 구조상에 변화를 나타내는 단백질은 Ras 단백질이며; 상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 포유 동물 세포이고; 제 1 융합 단백질 및 제 3 단백질은 세포외 자극에 대응하여 발현되며; 상기 리포터 유전자는 제 2 세포에 의해서 수용 및 검출되는 신호를 발생시킨다.
본 발명과 관련된 제 4 양상은
(ⅰ)제 1 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 1 리포터 유전자;
(ⅱ)제 2 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 2 리포터 유전자;
(ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자;
(ⅳ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 2 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자; 및
(ⅴ)제 3 융합 단백질을 발현하는 제 3 융합 유전자로서, 상기 제 3 융합 단백질이 유전자 활성화 부분과 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 3 융합 유전자
를 포함하는 세포에 관한다.
바람직한 구체예에서, 하나 이상의 제 1 또는 제 2 리포터 유전자는 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 즉,
제 1 또는 제 2 단백질 결합 부위중 하나는 테트라싸이클린 작동 유전자이고; 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나는 URA3 또는 lacZ이며; 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나는 제 2 세포에 의하여 수용 및 검출되는 신호를 발생시키고; 숙주 세포는 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포이다.
본 발명과 관련된 제 5 양상에서, 테트라싸이클린 작동 유전자는 검출 가능한 생성물을 코드화하는 유전자(예를 들어, URA3 유전자 또는 lacZ 유전자)에 작동 가능하도록 연결된다.
본 발명의 마지막 양상은
(a)(ⅰ)발현 수준을 감소시킬 수 있는 리포터 유전자로서, 상기 리포터 유전자가 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
(ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현시키는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부분에 공유 결합된 전사 촉진 인자(transcriptional activator)를 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
(ⅴ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부분(gene activating moiety)에 공유 결합된 후보 단백질(candidate protein)을 포함하는 제 2 융합 유전자
를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b)후보 단백질과 전사 촉진 인자 사이의 상호 작용의 지표로서 리포터 유전자의 발현 증가를 검출하는 단계
를 포함하는, 후보 단백질이 전사 촉진 인자와 상호 작용하는지 여부를 검출하는 방법에 관한다.
바람직한 구체예에서, 상기 리포터 유전자는 URA3유전자이며; 발현 수준은 6-아자우라실(6-azauracil)에 의하여 감소되고; 상기 단백질 결합 부위는 테트라싸이클린 작동 유전자(tetracycline operator)이며; 발현 수준은 테트라싸이클린 또는 테트라싸이클린 유도체에 의하여 감소되고; 상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 포유 동물 세포이다.
"리포터 유전자(reporter gene)"란, 발현이 측정될 수 있는 핵산으로서; 상기 유전자에는 lacZ, 아미노산 생합성 유전자 및 포유 동물의 클로람페니콜 트랜스아세틸라제(chloramphenicol transacetylase ; CAT) 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포터 유전자는 예를 들어, 세포 생육성(viability) 또는 유색 반응(color reaction)의 변화에 의하여 검정될 수 있다.
"발현 아웃풋(expression output)"이란, 리포터 유전자 발현이 측정 가능한 정도로 변화된 결과를 의미한다.
"단백질 결합 부위(protein binding site)"란, 단백질 또는 펩타이드에 의하여 인식되어 이들과 결합하는 핵산 서열을 의미한다.
"전사 촉진 인자(transcriptional activator)"란, 이것과 결합된 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. "유전자 활성화 부분(gene activating moiety)"란, 유전자 발현을 촉진시킬 수 있는 상기와 같은 전사 촉진 인자의 전부 또는 일부를 의미한다.
"테트라싸이클린 유도체(tetracyclin derivative)"란, 테트라싸이클린과 관련된 화합물로서, 테트라싸이클린 억제 물질(represser)이 테트라싸이클린 작동 유전자와 결합하는 것을 막을 수 있는 화합물을 의미한다.
"상태 변화(change in state)"란, 단백질의 활성을 변성시키는 단백질의 물리적 또는 화학적 변화를 의미한다. 상태 변화의 예에는 인산화 패턴 또는 구조상의 변화를 포함한다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 이하 발명의 상세한 설명 및 특허 청구 범위를 통하여 명확해 질 것이다.
도 1a-1C는 본 발명의 전형적인 2-베이트(2-Bait) 상호 작용 트랩을 개략적으로 도시한 3개의 연속적인 패널이다. 제 1 세포(도 1a)에서, 글루코즈 배지상의 전사-비활성 테트라싸이클린 억제 물질(TetR) 융합체(Bait1, Ba1) 및 LexA 융합체(Bait2, Ba2)는 각각 리포터의 Tet 및 LexA 작동 유전자의 업스트림에 결합되어 있다. 전사 촉진 도메인인 B42에 융합된 잠재적 상호 작용 단백질은 발현되지 않는다.[Gyuris et al., Cell 75:791-803(1993)] 상기 시스템에서 리포터 유전자 모두는 활성화되지 않으며, 상기 세포는 5-플루오로오로트산(5-FOA) 배지상에서는 생장하지만 우라실 배지상에서는 생장하지 않으며, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토시드(Xgal)상에서는 흰색을 나타내며 생장한다. 제 2 세포(도 1b)에서는, 갈락토즈 및 라피노즈 배지상에서 B42에 융합된 단백질 즉, 프레이 1(Prey 1)이 발현되지만, 상기 베이트와는 모두 상호 작용하지 않는다. 리포터들이 활성화되지 않기 때문에, 세포는 5-FOA 상에서 또는 우라실 배지상에서 생장하지 않으며, Xgal상에서는 흰색을 나타내며 생장한다. 제 3 세포(도 1c)에서는, 갈락토즈 및 라피노즈 배지상에서 기타 다른 프레이인 Prey 2가 발현되어 Ba1과 상호 작용하지만, Ba2와는 상호 작용하지 않는다. 리포터들이 활성화되지 않기 때문에 세포는 5-FOA 상에서 또는 우라실 배지상에서 생장하지 않으며, Xgal상에서는 흰색을 나타내며 생장한다. 상기 세포에서, URA3 리포터는 선택적으로 발현되며, 세포는 우라실 배지상에서 생장하지만 Xgal상에서도 흰색을 나타내며 생장한다.
도 2는 A1및 A2의 상호 작용 상관 관계에 있어서 논리어 "And"로 표시되며 구분 관계(discrimination relationship)("Ls1" 및 "Ls2")에 있는 세포를 보여주는 표이다. 세포들은 상기 베이트 및 프레이 단백질을 함유하는데; 프레이는 갈락토즈 및 라피노즈 배지상에서만 발현된다. 리포터 발현 아웃풋(Reporter output)는 상기 배지상에서 생장하는지의 여부 및 청색 발현 여부로써 판단된다. And 상관 관계에서, 상기 프레이 단백질은 양 베이트와 모두 접촉하게 되며 양 리포터 모두(즉 TetOp-URA3 및 LexOp-LacZ)를 활성화시킨다. Ls1 상관 관계에서, 프레이는 LexA 융합 베이트와만 상호 작용하고 LexOp-lacZ 리포터만을 활성화시킨다. 이와 유사하게 Ls2 상관 관계에서, 프레이는 TetR 융합 베이트와만 상호 작용하고 TetOp-URA3 리포터만을 활성화시킨다.
도 3a - 3C에서는 인풋 단백질(Input protein)에 대하여 논리어 And로 표시되는작동 방식을 나타내는 세포에 대한 일련의 결과들을 보여주고 있다. 도 3a는 CWXY2 세포 1 및 2에서의 LexOp-LacZ 리포터의 발현을 나타내는 표이며; 발현 여부는 LHWK/Gal+Raff+Xgal 플레이트상에 나타나는 청색의 농도에 의하여 판단될 수 있으며(하기 참조) β-갈락토시다제 활성(Miller 단위로서 나타냄)에 의해서도 판단될 수 있다. 도 3b는 Gal+Raff+Xgal 배지상에서 TetR-Cdc25(907-1589) 또는 TetR-GAP를 갖는 두개의 세포를 개략적으로 나타낸 것이다(하기 참조). Gal+Raff 플레이트상 세포1에서, TetR-Cdc25는 GTP와 함께 LexA-RasA186를 포함하고 있기 때문에, 더욱 많은 양의 B42-c-Raf1과 결합하여 LexAOp-lacZ 리포터의 전사를 증가시킨다. 제 2 세포에서, TetR-GAP은 Ras GTPase 활성을 촉진시켜 더욱 많은 LexA-Ras가 GDP-형태를 갖도록하여, 그 결과 B42-c-Raf1 결합량이 감소되어 LexAOp-LacZ 리포터의 전사를 감소시킨다. 도 3c는 단백질 인풋에 대한 작동 결과를 나타내는 진리표(truth table)이다. 여기서 2번째 칸의 "1"은 각각 TetR-Gap 또는 TetR-Cdc25가 존재한다는 것을 나타내는 것이며, 3번째 칸의 "0" 또는 "1"은 각각 β-갈락토시다제의 발현 정도가 낮고 높다는 것을 나타내는 것이다.
도 4는 생산자 세포(producer cell) 또는 제 2 세포, 즉 수용체 세포(recipient cell)에 의하여 확인될 수 있는 결과를 나타내는 세포를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 4가지 경우의 인풋-아웃풋 채널(input-output channel)을 갖는 세포를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 운반체(transistor)로서 작용하는 전반적인 생물 회로(biological circuit)를 개략적으로 나타낸 것이다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 2 이상의 단백질 사이의 복잡한 상관 관계(relationship)를 나타내거나 검출하는 시약 및 방법을 제공한다. 예를 들어 "가교(bridging)(또는 연결;connecting)" 및 "구분(discriminating)" 상호 작용과 같은 상관 관계들중 다수의 경우는 유전자 기능을 이해하는 데에 유용하다. 하기된 바와 같이, 신규의 현존 2-혼성 세포(2-hybrid cell)의 상호 작용에서의 표현형 발현 아웃풋에 대하여 논리 작동(logical operation)을 수행함으로써 경로 및 복합체에서의 단백질 기능에 대한 상세한 표본을 제시할 수 있는 것이다. 이와 같은 세포들에 의해 확인된 단백질 상관 관계는 열성유전형질 잠복현상(epistasis)과 같은 고전적인 유전자 상관 관계와 유사하지만, 이것들은 철저한 분석 체제내에서 해석될 수 있으며, 또한 이것들은 전체 게놈 산물에 대해서 체계적으로 수행될 수 있다. 더욱이, 이와 같은 상관 관계를 나타내는 세포들은 단백질 인풋 상에서 논리 작동이 수행될 수 있으며, 이로써 생물학적 연산 기구(biological computational device) 구성 경로를 정의할 수 있다.
예비적 고찰: 2-혼성 시스템(2-hybrid system)에서의 논리적 단백질 상관 관계(logical protein relationship)
고전적인("단일 베이트(one-bait)") 2-혼성 시스템에서, 리포터 유전자의 발현 아웃풋는 DNA-결합 베이트 및 활성화-태깅된(activation-tagged) 프레이 사이의 상호 작용에 의존한다. 예를 들어 URA3와 같은 몇몇 리포터에 의하여 발현된 유전적 마커는 리포터 전사에 대하여 선별될 수 있으므로 상호 작용성이 흠결되어 있는 것이다[Le Douarian et al., Nucl. Acids Res. 23:876-8(1995)]. 이와 같은 시스템에서 단백질들 사이의 상관 관계는 기호 논리학적 용어로 기술될 수 있다.
이러한 관점에 의해서, 베이트(Ba1) 및 프레이(P1) 사이의 접촉은 변수(A1)로 정의되는데, 이를 접촉 상관 관계(contact relationship)라고 한다. A1은 리포터 아웃풋에 의한 작동으로 정의되기 때문에, 여기서 "A1"은 역시 리포터 아웃풋를 나타내는 용어이기도 하다. 이러한 상관 관계에 있어서, 4가지 가능한 Boolean 작용 또는 기능이 존재한다[Schneeweiss, Boolean Functions:With Engineering Applications and Computer Programs(Springer-Verlag, Berlin, New York, 1998)]. 이들중 2개의 경우는 상수 함수로서 : F1(A1)=0이고 F2(A1)=1 이며, 나머지 2개의 경우는 진리 함수(true function)값으로서: F3(A1)=A1이고 F4(A1)는 Not A 이다.
단일-베이트 시스템에서, 리포터 발현 아웃풋에 대한 표현형은 접촉 상관 관계인, F3 및 F4 상에서 두 가지 작동을 나타낼 수 있다. 이에 관해서는 표 1에 나타내었다. 상기 표에서는 베이트 Ba1및 프레이 P1사이의 접촉 상관 관계를 A1으로 나타내었는데, 이는 양 접촉 상관 관계에 대한 변수 및 오프(OFF) 또는 온(ON) 상태의 리포터 아웃풋에 의하여 측정된다. "A1수치"는 A1의 2가지 가능한 값(0 및 1 즉, 오프 및 온)을 나타낸다. "작동(operation)"은 A1에서의 2가지의 가능한 작용값(함수)을 나타낸다. "작동 결과"라는 2개의 서브 컬럼은 A1에서의 아웃풋을 의미한다. 상기 작동 결과에 "임의의 명칭"을 부여할 수도 있다. "통역(interpretation)"이란 베이트와 프레이 단백질 사이의 상호 작용 상태를 의미한다. "표현형의 정의"는 단일 베이트 시스템에서의 접촉 상관 관계에 대한 표현형을 나타내며, "표본적인 생물학적 상관관계(Example biological correlates)"란 이러한 결과들을 나타낼 수 있는 생물학적 환경의 표본들을 의미하는 것이다.
표 1에서, F3 및 F4는 중요한 생물학적 상관관계를 갖는다. Ba1및 P1가 접촉[예를 들어, 상기 단백질들이 이종 이량체(heterodimer)를 형성하기 때문에]하는 단일 베이트 시스템에 있어서는 양성 아웃풋(X-Gal 상에서 청색을 나타내거나, Ura-배지상에서 생장하는 것과 같은)를 나타내는 반면에, 상기 접촉이 일어나지 않는 경우[예를 들어, 펩타이드 아프타머(aptamer)에 의해 돌연 변이되거나 또는 파괴되어]에는 음성 아웃풋(X-Gal 상에서 백색을 나타내거나, 5-FOA 배지상에서 생장하는 것과 같은)(표 1)를 나타낸다[Colas et al., Nature 380:548-550(1996)]. 5-FOA 배지상에서 생장하는 세포는 접촉 상관 관계에서 논리적으로 Not 작동(Not operation)을 수행하는 기구와 유사하거나 또는 이와 달리, 상태 "Not A1"을 나타내는 세포와도 유사하다.
더욱 복잡한 단백질 상관 관계를 검출하는 세포
2개의 구분되는 단백질-단백질 상호 작용에 대하여 그리고 이와 반대되는 선별이 동시에 가능하도록 세포를 구성하였다(도 1a-1C). 이러한 2-베이트 상호 작용 트랩에서는 LexA 및 세균성 트랜스포손인 Tn10의 테트라싸이클린 억제자인 TetR의 DNA 결합 부위가 이용되었다[Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547-51(1992)]. 상기 LexA 및 TetR 융합 베이트 단백질은 통합된 TetOp-URA3 리포터 및 에피솜 LexA Op-lacZ 리포터를 함유하는 효모 세포내에서 발현되었다. 이와 같은 "2-베이트(two-bait)" 세포내에서의 베이트 발현은 ADH1 프로모터의 제어를 받았다. 상기 TetOp-URA3 리포터는 LYS2 유전자내에 통합되었다. 상기 LexA Op-lacZ 리포터는 pSH18-34의 유도체로서 LYS2 마커를 가지며 2㎛인 pCXW24를 통해서 운반되었다. 프레이 벡터는 pJG4-5인데, 이때 Gal 1 프로모터는 TRP1 플라스미드로부터 얻어지는 활성화-태깅된 단백질의 발현 여부를 조건에 따라 결정한다[Gyuris et al., Cell 75:791-803(1993)].
2-베이트 상호 작용 트랩에서의 접촉 상관 관계에 대한 논리 작동
2-베이트 세포내에서, 2개의 접촉성 상관 관계(및 이에 상당하는 리포터의 발현 아웃풋)는 Boolean 변수인 A1및 A2로 표현되어 진다. 상기 변수에는 16가지의 가능한 작동 방식이 있는데[Schneeweiss, Boolean Functions: With Engineering Applications and Computer Programs(Springer-Verlag, Berlin, New York, 1989)], 이들중 4가지가 상기 세포내에서 나타난다. 이들 작동들은 And, Nor 및 2가지의 구분된 작동, 즉 논리형 1(logic state 1;Ls1) 및 논리형 2(logic state 2;Ls2)로 나타내어 진다. And, Ls1 및 Ls2는 구체적으로 단백질 기능을 결정하는 데에 유용한 작동을 나타내는 것이다. 이와 같은 작동을 요약한 것이 표 2이다. 표 2에서, Ba1및 P1사이의 접촉 상관 관계는 A1으로 나타내어지며, TetOp-URA3 리포터의 아웃풋에 의하여 측정된다. Ba2및 P1사이의 접촉 상관 관계는 A2로 나타내어 지며, 이는 LexA Op-lacZ 리포터의 아웃풋에 의하여 측정된다. 더욱이 A1및 A2값(0 및 1)은 양자 모두 접촉 상관 관계 변수 및 리포터의 수치(ON 및 OFF상태)를 의미한다. "수치"라는 4개의 서브 컬럼은 2개의 수치에 대한 4개의 상이하며 가능성 있는 조합을 나타낸다. "작동(operation)"은 상기 시스템에서 나올 수 있는 수치들에 대한 4가지 작동을 나타낸다. 상기 작동들에 대하여 "임의의 명칭"을 부여할 수 있다. "통역(interpretation)"이란 베이트 및 프레이 단백질 사이의 상호 작용 상태를 나타낸다. "표현형의 정의"는 단일 베이트 시스템에서의 접촉 상관 관계에 대한 표현형을 나타내며, "표본적인 생물학적 상관관계"란 이러한 결과들을 나타낼 수 있는 생물학적 환경의 표본들을 의미하는 것이다.
상기 시스템의 일반적 유용성을 시험하기 위하여, 다음과 같이 기술된 한 세트의 단백질이 사용되었다. 즉, RasA186, RasA15A186, RasV12A186, GAP, hSos1(잔기 601-1019), Cdc25(잔기 907-1589), c-Raf1(잔기 1-313), Max 및 Mxi1. Harvey ras 유전자 산물인 Ras는 GDP-결합형(불활성형) 및 GTP-결합형(활성형)과 같은 2가지의 특징적인 형태로서 존재하는 GTPase이다. 상기와 같은 형태 사이의 Ras 순환이 세포 증식을 조절하는 신호 전달 경로에서 단백질을 스위칭(switching)시켜준다[Boguski and McCormack, Nature 366:643-654(1993)]. 본원에 기술된 모든 Ras 단백질은 186부위에서 Cys 에서 Ala로 변경된 것으로서, 이는 파네실레이션 부위(farnesylation site)를 불활성화시키고 단백질의 핵 내 농축량을 증가시킨다. RasA186은 GDP 및 GTP 결합형의 혼합물인 반면에, RasA15A186및 RasV12A186은 각각 GDP 및 GTP 결합형이 월등히 많다. Ras의 GTPase 활성을 촉진시키는 GAP은 GTP-결합형 Ras와 결합한다. Ras의 다운스트림 타겟인 c-Raf1은 또한 GTP-결합형 Ras와도 결합한다. 이와는 대조적으로, hSos1 및 Cdc25 모두는 Ras를 활성화시키며 GDP-결합형 Ras에만 결합한다. 이종 이량체로서 강하게 결합된 Max 및 Mxil가 양성 대조구(positive control)로서 사용된다[Zervos et al., Cell79:388(1993)].
도 2는 And의 논리 작동을 보여주는 2-베이트 세포를 나타내는 것이다. 상관 관계는 경로에서의 가교 단백질(bridging protein)과 같이 양 베이트와 모두 상호 작용할 수 있는 단백질에 의하여 이루어진다. 상기 실험에서, 효모 균주 CWXY2는 B42-RasA186을 프레이로서, TetR-c-Raf1 및 LexA-hSos1을 베이트로서 그리고 TetOp-URA3 및 LexA Op-LacZ를 리포터로서 운반한다. B42-RasA186는 TetR-c-Raf1 및 LexA-hSos1 모두와 상호 작용한다. 상기 세포는 Xgal 상에서 청색을 나타내며 우라실 결핍 배지상에서 생장한다. 이와 같은 가교 또는 연결 상관 관계는 Ras가 양 단백질과 상호 작용하며, 양 리포터를 활성화시키는 단백질이 게놈-와이드 스크린(genome-wide screen)을 통해서 선별될 수 있다는 사실과 부합된다.
더욱이, 도 2는 2-베이트 시스템이 또한 Ls1 및 Ls2 즉, 구분된 상관 관계를 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 이와 같은 상관 관계는 하나의 베이트와 상호 작용하지만, 다른 것과는 상호 작용하지 않는 단백질에서 예상된다.
여기서 TetR-RasV12A186및 LexA-Max 베이트 및 B42-c-Raf1 프레이를 발현시키는 세포내에서, Ras-Raf 상호 작용은 상기 TetOp-URA3 리포터를 활성화시키며 그 결과 상기 세포는 우라실 결핍 배지에서 생장한다; Raf는 LexA-Max와 상호 작용하지 않으므로 상기 LacZ 리포터를 활성화시키지 않는다. 다른 한편으로는, TetR-RasV12A186및 LexA-Max 베이트 및 B42-Mxil 프레이를 발현시키는 세포내에서, 상기 Max-Mxil 상호 작용은 LexA Op-LacZ 리포터를 활성화시키며, 상기 세포는 Xgal 상에서 청색을 나타낸다; Mxil은 Ras와 상호 작용하므로 상기 URA3 리포터를 활성화시키지 않는다.
뿐만아니라, 도 2에 나타낸 결과는 이러한 세포들이 매우 가까운 상관 관계에 있는 2개의 대립 유전 형질 변이체를 구분(discrimination)할 수 있다는 것을 말해주는 것이다. TetR-RasA15A186, LexA-RasV12A186및 B42-c-Raf1을 발현하는 세포에서, Raf/RasV12A186의 상호 작용으로 LexAop-LacZ 리포터의 발현이 활성화되었으며; 상기 세포들은 Xgal상에서 청색을 나타냈지만 우라실 결핍 배지에서는 생장하지 않았다. 이와는 대조적으로, TetR-RasA15A186, LexA-RasV12A186및 B42-Cdc25를 발현하는 세포에서, Cdc25/RasA15A186의 상호 작용으로 TetOp-URA3 리포터의 발현이 활성화되었으며; 상기 세포들은 우라실 결핍 배지에서는 생장하였으나, Xgal상에서는 백색을 나타내었다. 이와 같은 결과는 상기 세포들이 게놈성 또는 조합성 라이브러리로부터 질병에 특이적인 대립 형질 단백질 변이체와 상호 작용하는 단백질 및 펩타이드를 동정할 수 있었다는 것을 제시하고 있는 것이다.
대립 형질 변이체를 구분하는 펩타이드 아프타머의 동정
TetR-RasV12및 LexA-RasA15를 함유하는 2-베이트 세포를 사용하여 RasV12와 특이적으로 상호 작용하는 펩타이드 아프타머 라이브러리(peptide aptamer library)의 멤버를 분리하였다. LexA-RasA15와 상호 작용하지 않는 아프타머(aptamer)를 함유할 것이라 예상되는 URA+라이브러리 형질전환체를 LacZ-세포에 대하여 스크리닝시켰다. LacZ+세포로부터 아프타머를 발현하는 플라스미드를 분리시킨후 이의 표현형을 재확인하였다. 상기 시스템을 이용하여, 2개의 구분되는 아프타머, 즉 Pep22 및 Pep104를 동정하였다. Pep22는 RasV12, RasA15와 모두 상호 작용한 반면에, Pep104는 RasV12와만 상호 작용하였다. 구체적으로, 상기 Pep22-함유 세포는 Ura_배지에서 생장하였으며 X-gal 배지에서는 청색을 나타내었다. 상기 Pep104-함유 세포는 Ura_배지에서 생장하였으나 X-gal 배지에서는 백색을 나타내었다. 이와 같은 결과는 상기 시스템이 특정 펩타이드 아프타머 선별에 유용하다는 것을 나타내어 주는 것이다. Pep22에 있어서, 두번째 베이트는 단일 리포터를 인위적으로 활성화시킴으로써 발생 가능한 잠재적 오류 발생을 제거시킴으로써 본 시스템의 선별성을 증가시켰다. Pep104에 있어서, 두번째 베이트는 신호 전달 과정에서 활성인 단백질의 대립 형질형에 특이적인 아프타머를 검출할 수 있었다. Pep22 및 Pep104의 서열은 각각 DMDWFFRFYASVSRLFRHLH(서열 번호 15) 및 FWQATLRLVSDKLILLYPDP(서열 번호 16)이다.
단백질 인풋에 있어서의 논리 작동
세포들은 또한 단백질 인풋(protein input)에 대하여 논리적으로 작동 가능하며, 상기 작동 결과는 발현 아웃풋를 변화시킴으로써 나타내어 진다. 도 3a-3C는 인풋(input) 단백질에 대한 논리어 And 작동에 관한 것이다. LexA-RasA186, B42-c-Raf1 및 TetR-GAP을 발현하는 세포에서, LexAop-lacZ 리포터의 아웃풋은 저조하였는데(Xgal 배지상에서 밝은 청색을 나타냄), 아마도 GAP이 대부분의 Ras를 GDP-결합형으로 만들었기 때문이라 생각된다. 이와는 대조적으로, Xgal 플레이트상의 청색 농도로 판단하건데 TetR-Cdc25를 인풋시킴에 따라 상기 RasA186/c-Raf1 상호 작용은 아마도 Ras를 Raf 결합형으로 전환시킬 것이라 생각된다. 상기 실험에서, 세포에서는 2회의 인풋이 있었는데, 그중 하나인 B42-c-Raf1(논리값 1)는 항상적으로 존재하였으며, 반면에 다른 하나는 TetR-GAP(논리값 0)이거나 또는 TetR-Cdc25(논리값 1)이었으며; 아웃풋은 높거나(1) 또는 저조(0)하였다. 상기의 경우에서, 형태가 인풋 수치에 의존하는 LexAOp-lacZ 리포터의 아웃풋은 LexA-Ras 스위치 부위 단백질에 의해서 조절되었다.
상기 시스템과는 달리, Cdc25는 hSos1과 치환될 수 있는데, 이 경우 유사한 결과가 도출되었다. 더욱이, 시스템 구성 요소들의 발현은 추가로 조절될 수 있다. 예를 들어, 상술한 시스템에서, B42-c-Raf1은 GAL1 프로모터를 이용하여 발현될 수 있으며, 또는 Cdc25 및 hSos1는 TetR-Sin3에 의해서 정상적으로 억제된 프로모터에 의해서 발현될 수 있다. B42-c-Raf1 발현은 생장 배지내 갈락토즈 존재 여부에 따라 좌우되며, Cdc25 및 hSos1 발현은 생장 배지내 테트라싸이클린 또는 테트라싸이클린 유도체의 존재 여부에 따라 죄우된다. 상기 시스템에서, 세포는 2개의 특징적인 세포외 인풋 즉, 개질성 단백질 발현을 조절하는 인풋 및 프레이 발현을 조절하는 인풋에 대응한다.
2-혼성 시스템에서의 단백질 상관 관계
상기 실험을 토대로 하여, 단일 베이트 2-혼성 시스템에서의 리포터 유전자 발현 아웃풋는 2개의 기본 논리 상태를 반영하여 나타낼 수 있다. 리포터 유전자 활성화는 베이트 1(Ba1) 및 프레이(P1) 사이의 접촉 상관 관계 A1을 구체화시킨다. Not A1(Ba1및 P1사이)이란, 예를 들어, 상호 작용 파트너에 돌연 변이를 일으키거나 또는 제 3 단백질이나 펩타이드 아프타머에 의해서 상호 작용을 파괴시킴으로써 유발되는 상호 작용 부존재 상태를 의미한다[Colas et al., Nature 380:548-550].
독립적으로 기능적 상호 작용을 하는 리포터로 세포를 구성하는 방법
상술한 바와 같이, LexA 및 TetR의 DNA 결합 부위, 즉 세균성 트랜스포손 Tn10의 테트라싸이클린 억제자를 이용한 상호 작용 트랩을 제조함으로써 더욱 복잡한 단백질 상관 관계를 검출하는 세포들을 구성하였다. TetOp-URA3 및 LexAOp-lacZ 리포터를 포함하는 세포내에서 이와 같은 부위들을 함유하는 융합 단백질을 2 베이트로서 발현시켰다. 상기 시스템은 단일 세포내에서 2개의 유전자간 상호 작용을 동시에 결정하였다.
TetR 베이트 및 TetOp-URA3 리포터 복합체는 상호 작용 트랩 적용을 상당히 촉진시켰다. 약한 상호 작용 검출을 촉진시키는 TetOp-URA3 리포터 의존성인 표현형은 lacZ 및 LEU2 리포터 표현형 의존성보다 더욱 민감하였다[예를 들어, Gyuris et al., Cell75:791-803(1993) 및 Estojak et al., Mol. Cell. Biol. 15:5820-9(1995) 참조]. 더욱이, URA3 및 lacZ 리포터 유전자 모두는 정량적으로 검정될 수 있다[Shostak et al., Anal. Biochem. 191:365-9(1990)]. 뿐만 아니라, 상기 URA3 리포터의 감수성은 2가지 방식으로 다운-레귤레이션(down- regulation)될 수 있다. URA3 리포터 발현 역가는 URA3 유전자 산물(오로티딘-5'-모노포스페이트 디카복실라제;OMPdecase)의 억제자인 6-아자우라실로 검정될 수 있다[Le Douarian et al., Nucl. Acids Res. 23:876-8(1995)]. 리포터 활성은 또한 테트라싸이클린 또는 그의 유도체(예를 들어, 언하이드로테트라싸이클린)에 의하여 감소될 수도 있는데, 이는 TetR 베이트가 Tet 작동 유전자에 결합하는 것을 방지함으로써 가능하다. 바람직하게는, 상기 화합물들은 플레이트상에서 100㎍/㎖ 이상의 농도로 사용된다. 두 종류의 억제자 모두는 상호 작용 친화성을 크루드하게 측정할 목적에 있어서, URA3 리포터의 감수성을 감소시켜 전사를 활성화하는 베이트 및 lacZ 와 함께 사용될 수 있도록 한다. 더욱이, 상기 URA3 리포터는 5-FOA를 사용하여 유전자 발현을 선별할 수 있도록 한다[Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197:345-6]. 이와 같은 경우, 테트라싸이클린 및 6-아자우라실은 특정 단백질 상호 작용을 파괴하는 펩타이드 아프타머의 선별을 촉진함으로써 전사의 역치량을 조절할 수 있다.
이원성 고등 단백질 상관 관계의 논리적 분석
표 2에 나타낸 바와 같이, 2 베이트 세포는 4가지 경우의 논리적 상관 관계를 보여주는데, Nor, And, Ls1 및 Ls2가 그것이다. 이들 중 3가지가 특히 중요하다. 양 베이트 모두와 접촉하는 프레이 단백질(연결 단백질)에 대하여 And 상관 관계 즉, A1(Ba1및 P1사이) 및 A2(Ba2및 P1사이)를 관찰하였다. 이와 같은 단백질의 동정은 유전적 네트 워크의 밀도 챠트를 연속적으로 구성하는 데에, 그리고 관련 분야에서 공지되어 있지 않은 연결 경로에 유용하다. 이러한 상호 작용 단백질 세트를 종종 "단백질 근접 관계(protein contigs)"라 한다.
Ls1 및 Ls2, 즉 구분 상관 관계 역시 중요하다. 이와 같은 상관 관계는 비교적 복잡하다: 예를 들어, 상기 Ls1 상관 관계에는 2가지 상호 작용에 대한 2가지 작동을 포함한다 : Not A1(Ba1및 P1사이) 및 A2(Ba2및 P1사이)이 그것이다. 이와 같은 작동은 상기와 같은 관계를 나타내는 세포가 연관되지 않은 단백질, 대립 형질 변이체 및 상이한 형태의 것들과 다르게 상호 작용하는 단백질을 검출할 수 있도록할 뿐만 아니라, 상이한 개질 상태의 것들과 다르게 상호 작용하는 단백질을 검출시킬 수 있다는 점에서 다수의 생물학적 근연성을 갖는다. 조합된 라이브러리 및 게놈 산물을 조사하기 위하여 이와 같은 상관 관계를 이용함으로써 질병 대립 형질에 의해서 코드화되는 단백질 또는 감별 스플라이싱(differential splicing) 또는 번역후 개질(posttranslational modification)로 인하여 야생형과 상이한 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 단백질을 선별해 낼 수 있는 것이다.
고등 단백질 상관 관계 분석
2-베이트 세포로부터 추론될 수 있는 단백질의 상관 관계는 1-베이트 세포에 의해서 밝혀지는 것과 항상 동일한 것은 아니다. 예를 들어, 만일 Ba1및 Ba2모두가 올리고머화되어 P와 상호 작용하는 표면을 형성한다면, Ba1/P 상호 작용 및 Ba2/P 상호 작용 모두는 1-베이트 세포내에서는 검출되지 않을 것이다. 1-베이트 또는 2-베이트 세포로부터 도출된 데이터를 결합시킴으로써 실험자가 단백질 상호 작용에 따른 위상(topology), 일시적 서열(temporal sequence) 및 번역후 개질(posttranslational modification)에 관하여 추측할 수 있도록 하기 때문에 접촉 상관 관계에서 나타나는 이와 같은 차이점들은 유용하다.
표3은 3개의 단백질 즉, X, Y 및 Z 사이의 물리적 상호 작용에 대한 추론을 나타낸다 :즉 이는 접촉 상관 관계들 즉, A1(X 와 Z 사이), A2(Y 와 Z 사이) 및 A3(X 와 Y 사이)를 검출하는 2-베이트 세포로부터 도출될 수 있는 아웃풋이다. 상기 표에서, "리포터 아웃풋(reporter output)"이란, 3개의 1-베이트 세포 및 하나의 2-베이트 세포내에서 리포터의 아웃풋으로써 나타내어 지는 접촉 상관 관계의 상태에 있음을 나타낸다. X 및 Z는 활성화 도메인에 융합되어 프레이들[P(X) 및 P(Z)]을 형성하고, Y 및 X는 DNA 결합 도메인에 융합되어 베이트[Ba(X) 및 Ba(Y)]를 형성한다. 2-베이트 세포내에서, 리포터 아웃풋은 2개의 DNA 결합 도메인[Ba1(X) 및 Ba2(Y)]중의 하나와 활성화 도메인[P(Z)]과 융합된, 단백질 X, Y 및 Z에 대한 접촉 상관 관계에 있음을 보여준다. "물리적 통역(Physical interpretation)"은 1-베이트 및 2-베이트 데이터의 조합 또는 1-베이트 데이터만에 대한 리포터 아웃풋 세트중 하나의 가능한 생물학적 통역을 나타낸다. 표 3에 나타낸 모든 패턴이 생물학적 유연관계에 있지 않음에도 불구하고, 다수의 경우가 관찰되는데, 예를 들어, 베이트1 및 프레이의 상호 작용은 베이트2의 존재 여부에 의존한다. 1-베이트 및 2-베이트 데이터들의 상호 관련성을 나타내는 표 3에 기술된 것들과 같은 실험 결과는 경로 및 복합체에서 단백질의 기능을 정리하는데에 유용하다.
유전자 기능 분석에의 적용
이와 같은 2-베이트 시스템, 구체적으로는 현존하는 1-베이트 시스템과 결합된 경우, 경로에 있어서의 유전자 기능을 분석하는 효모 상호 작용 기술을 확대 적용시킬 수 있다. 이는 단백질의 대립 형질 변이체간을 구별해 주는 단백질 및 펩타이드 아프타머를 동정하는 것을 도울 수 있다. 더욱이, 2-베이트 세포로부터 도출된 데이터(개개의 실험으로부터 결과된 바와 같은) 및 1-베이트 세포로부터 도출된 데이터(게놈- 와이드 조사에서 획득될 수 있는)를 연관시켜 경로 및 복합체에서의 단백질 기능 및 접촉 위상을 상세하게 분석할 수 있다. 이는 또한 다중- 단백질 복합체(multi-protein complexes)에서 단백질의 위상을 더욱 정확하게 분석할 수 있도록 하며, 단백질 상호 작용의 임의 모델중에서 구별해내는 확고하고, 측정가능하며, 반자동적인 방법을 제공한다. 뿐만 아니라, 이와 같은 방식으로 제한되는 단백질간 상관 관계가 그 자체로서 체계적 분석이 가능하도록 하기 때문에, 산업상 결정될 수 있다.
논리 회로에 근거한 단백질-및-전사 성향
상기 실험들은 2가지 형태 사이를 순환하는 단백질인 Ras와 상기 상태중 어느 하나의 Ras와 결합하는 활성화 태깅된 단백질인 Raf를 이용한다. Ras스위치 상태 및 전사에 의하여 측정될 수 있는 그의 아웃풋은 인풋 단백질이 GAP인지 또는 Cdc25인지의 여부에 따라 다양하게 나타난다. 이와 같은 실험에서 세포들은 And 게이트로서 작용하는데, 여기서 하나의 인풋 B42-c-Raf1이 항상적으로 존재하는 경우(논리값 1), 다른 하나는 Gap(논리값 0)이거나 또는 Cdc25(논리값 1)이었으며, 리포터 발현 아웃풋로 나타나는 표현형은 발현 아웃풋(output)을 이루었다. B42-c-Raf1 및 GAP이 존재하는 경우에는, β-갈락토시다제 활성의 발현 아웃풋은 저조하였다(0). B42-c-Raf1 및 Cdc25가 존재하는 경우에는, β-갈락토시다제 활성의 발현 아웃풋은 높았다(1). 리포터 발현 아웃풋로 평가한다 하더라도, 상기 And 작동은 전술한 바와 같은 접촉 상관 관계에 대한 작동은 아니었다. 오히려 상기 작동은 인풋 단백질에 대한 것이었으며, 이와 같은 경우에 세포들은 참 논리 게이트(true logic gate)로서의 작용을 한다.
본원에 기술된 세포에서, 인풋을 변경시키기 위해서는 상호 작용 단백질을 발현하는 상이한 DNA 구성물이 사용되며; 발현 아웃풋를 측정하기 위해서는 사람 또는 기타의 관찰자를 필요로 한다. 생물학적 전사-기초 논리 회로를 구성함에 있어서는 전체적으로 인풋 및 아웃풋을 분비성 펩타이드 페로몬 또는 빛과 같은 세포외 자극에 대해서 변이하는 논리적 인풋 및 이와 같은 자극을 발생시키는 아웃풋으로 대체하여야 한다.
이러한 생물학적 회로를 사용하는 표준적인 시스템을 도 4-6에 나타내었다. 구체적으로, 도 4에서, 세포는 생산자 세포 또는 인풋에 대한 수용체 세포인 제 2 세포에 의하여 판독될 수 있는 아웃풋을 발생시키는 것으로 나타나 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 인풋 단백질인 효모 α-인자를 가하면, G 단백질 경로를 통하여 TGF-β 발현 아웃풋물 즉, 동일한 세포 또는 제 2 세포에 의해서 수용될 수 있으며 수용체 세포내에서 표현형을 변화시킬 수 있는 발현 아웃풋물이 생성된다. 도 4는 또한 TGF-β 인풋 단백질이 그의 수용체와 결합하여 LexA-Madd(LexA-Smad라고도 함) 단백질을 활성화시켜 전위시키는 시스템을 나타내고 있다. 이와 같은 LexA-Madd 단백질은 효모의 α-인자 아웃풋 즉, 생산자 세포 또는 제 2 세포인 수용체 세포에 의하여 다시 판독되어 수용체 세포의 표현형을 변화시킬 수 있는 신호의 발현을 촉진시킨다.
도 5는 상기 시스템을 확장시켜 4개의 인풋-아웃풋 채널을 갖는 세포를 나타내며, 이로써 다수의 논리 작동이 가능하게 된다. 도 5에서는, 인풋 단백질들 즉, α-인자, TGF-β, 델타 및 브래디키닌이 α-인자 수용체, TGF-β 수용체, 노취(notch) 수용체 및 브래디키닌 수용체와 상호 작용하여 경로 즉, 예를 들어 세포 시스템의 전사가 변화됨에 따라서 세포 시스템으로 판독할 수 있는, 발현 아웃풋인 단백질을 발현시키는 경로를 활성화시킨다는 것을 나타내고 있다. 인풋 및 아웃풋 사양의 가지수가 증가됨에 따라, 프로그램화될 수 있는 채널의 가지수도 증가될 수 있다 ; 예를 들어, 10개의 인풋/아웃풋 채널을 갖는 세포는 210가지 또는 1000가지 이상의 상이한 상태로 프로그램화될 수 있다. 인풋/아웃풋 채널을 증가시키는 하나의 표본적인 연구 방법에서, 상술한 LexA-Smad 단백질과 같은 단백질은 상이한 아프타머 부위(여기서 각각의 부위는 키메라상에 상이한 수용체 특이성을 제공함)를 갖도록 조작될 수 있다. 더욱이, 상기 시스템에서--단백질이라기 보다는--인풋은 특정한 광수용 경로를 촉진시키는 빛, 구체적으로 빛의 파장과 같은 세포외 자극일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 시스템에서 발현 아웃풋물은 예를 들어, 녹색, 적색, 청색 형광 단백질과 같은 형광 단백질이다.
전반적인 생물학적 회로의 마지막 형태가 도 6에 도시되어 있다. 이와 같은 세포는 표본적인 "전위체(transitor)"를 나타낸다. 녹색 광선하, 상기 세포에서는 리포터 유전자가 HIV 프로테아제 발현을 촉진시킨다. 이후 상기 프로테아제는 청색 형광 단백질-녹색 형광 단백질 키메라를 연결시켜 주는 타겟 링커를 절단시켜 상기 양 성분을 생성시키고 그 결과 녹색광 발현 아웃풋물을 감소시키게 된다.
상기 생물학적 논리 기구는 신속한 결과를 도출해내지 못할 수도 있다. 상기 스위치 부위 단백질들, 즉 Ras는 1000분의 1초에 순환할 수 있으며 다수의 신호 전달 경로는 수분내에 인풋을 제공할 수 있으나[Bray, Nature 376:307-312(1995)], 리포터의 아웃풋은 수분 내지 수시간이 소요되어서야 검출될 수 있다. 그러나, 상기 DNA와 인접한 부위에서 요구되는 구성 작업(construction work)은 직접적인 기술에 의해서 수행될 수 있기 때문에, 유전자 발현은 유용한 아웃풋을 이끌어 낼 것이라 생각된다. 이러한 회로를 구성하는 것은 유용한 알로스테릭한 성질(allosteric property) 및 타겟팅 특성(targetting property)을 갖는 천연 및 인위적으로 선별된 단백질 도메인의 수를 급속하게 증가시킴으로써 촉진될 수 있다[Colas et al., Nature 380:548-550(1996)]. 그러므로 이와 같이 전사를 기초로한 기술은 생물학적 연산에 있어서 신속함을 제공한다.
재료 및 방법
2-베이트 시스템
상기 실험에서, 벡터 pEG202 및 pJG4-5는 Ba2및 프레이 발현 플라스미드로서 사용되었다[Gyuris et al., Cell 75:791-803(1993)]. 더욱이, Ba1발현 플라스미드, pCWX200, LexA Op-LacZ 리포터 플라스미드, pCWX24 및 TetOp-URA3 리포터 벡터를 구성한후 싸카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 유전자로 통합시켜 하기와 같이 CWXY1 및 CWXY2를 제조하였다.
TetR-융합 단백질 발현 벡터, pCWX200의 구성
pCWX200은 2㎛의 복제 유전자(replicator) 및 LEU2 마커를 운반한다. 프로모터 및 클로닝 부위는 pEG202으로부터 얻었으며 구조틀(backbone)은 Yeplac181의 유도체인 pBC100으로부터 얻었다[Gietz and Sugino, Gene74:527-534(1998)]. pBC100 폴리링커 부위(AccI에서 EcoRI까지) 및 β-갈락토시다제의 아미노말단 단편을 코드화하는 DNA를 분리하기 위하여 벡터를 NarI/AccI로 절단한후 다시 연결시켜 pCWX100을 제조하였다. 이후 HindIII로 pCWX100를 절단하여 상기 HindIII부위를 분리해낸후 Klenow를 사용하여 블런트 말단으로 만들어(blunt-ending) 다시 연결시켜서 pCWX100ΔHindIII를 제조하였다. 이후 ADH1 프로모터, LexA, 폴리링커 및 ADH1 종결유전자를 포함하는 pEG202의 SphI 단편을 pCWX100ΔHindIII의 SphI 부위에 삽입시켜 pCWX150을 제조하였다[Gyuris et al., Cell 75:791-803(1993) 및 Estojak et al., Mol. Cell. Biol.15:5820-9(1995)]. 마지막으로, 상기 pCWX150의 EcoRI/HindIII LexA 단편을 Tet 억제유전자(TetR)를 코드화시킨 EcoRI/HindIII 말단의 PCR 단편으로 대체시켰다[Zervos et al., Cell 79:388(1993)]. 결과로 제조된 플라스미드인 pCWX200은 pEG202의 것과 동일한 클로닝 부위를 갖게 되었다[Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci 89:5547-51(1992)].
LexA Op-lacZ 리포터, pCWX24의 구성
LexA Op-lacZ 리포터, LYS2 마커, 2㎛ 복제 유전자 및 pCWX24 플라스미드 구조틀의 나머지 부분을 각각 중간 플라스미드(immediate plasmid)인 pCWX221, pCWX01 및 pCWX21로부터 수득하였다.
pCWX221의 구성
본 플라스미드를 제조하기 위하여 SH18-34T를 절단하여 KpnI로 말단 처리하고, BamHI으로 부분 절단시킨후 상기 벡터를 BamHI/KpnI으로 절단된 pBluesscript 구조틀에 연결시켰다. LexA Op-LacZ 리포터는 pCWX221의 NotI/KpnI 단편상에 있었다.
pCWX01의 구성
pCWX01을 구성하기 위해서, YeP426을 SalI/ClaI으로 절단하여[Ma et al.,Gene 58:201-16 (1987)], LLYS2가 포함하고 있던 ~5600bp의 ClaI-XbaI 단편 및 pBR322 테트라싸이클린 내성 유전자 ~300bp를 수득하였다. 상기 단편을 (pBluesscriptΔKpnI를 사용하여) SalI/ClaI로 절단시킨 pBSΔKpnI 구조틀에 연결시켜 pCWX01을 제조하였다.
pCWX21의 구성
pRF24를 NotI으로 절단후 Klenow로 말단 처리하여 pCWX20ΔNotI을 제조하였다. pCWX24을 만들기 위하여, pCWX20ΔNotI을 BamHI으로 절단시킨후 자가-어닐링(self-annealing)된 5'-GATCCGCGGCCGCG-3'(서열 번호 1)에 연결시켜 새로운 NotI부위를 만들었다.
pCWX24의 조립
pCWX24를 조립하기 위하여 pCWX221의 NotI/KpnI LexOp-LacZ 단편을 pCWX21의 NotI/KpnI부위에 삽입시켜 pCWX22를 제조하였다. 이후, 자가-어닐링된 5'-CTAGGGCCCTAGCATG-3' 단편을 pCWX22의 SphI 부위에 삽입시켜 ApaI 부위 및 pCWX23을 제조하였다. pCWX23을 ApaI/PmeI으로 절단시킨후, pCWX01의 SmaI/ApaI 절단된 LYS2 단편을 삽입시켜 pCWX24를 제조하였다.
TetOp-URA3의 구성
TetOp-URA3 구성물을 중간 플라스미드(intermediate plasmid)인 pCWX211, pCWX213T2, pCWX213T10, pCWX02T2 및 pCWX02T10으로부터 제조하였다.
pCWX211의 구성
pSH200으로부터 수득한 URA3 유전자를 5'-AAAAGGAAAAGCGGCCGCTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTC-3'(서열 번호 2) 및 5'-CGGAATTCTTTCGAAAGCTACATATAAGGAAC-3'(서열 번호 3)으로 증폭시킨후, NotI/EcoRI 말단 PCR 산물을 NotI/EcoRI-절단된 pBS에 연결시켜 pCWX211을 제조하였다.
pCWX213T2 및 pCWX213T10의 구성
상기 벡터들을 제조하기 위하여, 특이적인 XhoI 부위를 갖는 효모의 Gal1/Gal10 프로모터 부위를 함유하는[West et al., Mol. Cell Biol. 4:2467-78(1984)], pLR1Δ1으로부터 수득한 BamHI 단편을 pBS의 BamHI 부위에 삽입시켜 pCWX210을 제조하였다. 이후 2가닥의 사슬을 합성시킨후 어닐링시켜 다음과 같이(서열 번호 4 및 5) 2개의 TetO2작동 유전자를 포함하는 XhoI/SalI-말단 DNA 단편을 제조하였다[Meier et al., EMBO J.7:567-72(1988)]
TCGAGCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAACACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAG
1--------------------------------------------------------56
CGTGAGGGATAGTCACTATCTCTTTTGTGAGGGATAGTCACTATCTCTTTTCAGCT
Tet 작동 유전자 DNA를 그 자체에 연결시킨후 XhoI/SalI으로 절단시키고 0.8% 아가로즈 겔상에서 분획화시켰다. 크기가 100bp 내지 200bp의 범위내에 있는 DNA를 pCWX210의 XhoI부위에 삽입시켰다. 이러한 방법으로 2개의 플라스미드 즉, pCWX210T2 및 pCWX210T10을 수득하였는데, 이들은 각각 4내지 6개의 TetO2작동 유전자를 포함하였다. 상기 pCWX210T2 및 pCWX210T10의 EcoRI-말단 Gal1/Gal10 프로모터 부위를 pCWX211의 EcoRI 부위에 삽입시켜 각각 pCWX210T2 및 pCWX210T10을 제조하였다. 더욱이, 이들 플라스미드내 KpnI 부위는 자가-어닐링된 올리고머(5'-GGCCGCGGTACCGC-3')(서열 번호 6)를 pCWX212T2 및 pCWX212T10을 형성하는 NotI 부위에 삽입시켜 제조하였다. 이들 벡터에서, TetOp-URA3 리포터는 KpnI 단편상에 부위하였다. 상기 플라스미드들내 ClaI 부위를 결실시킬 경우, pCWX213T2 및 pCWX213T10가 제조된다. pCWX213T2 및 pCWXT10으로부터 수득된 KpnI-말단 TetOp-URA3 구성물을 갖는 pCWX01로부터 얻은 LYS2의 KpnI 단편을 치환시켜 pCWX02T2 및 pCWX02T10을 제조하였다.
LYS2에서 TetOp-URA3 리포터의 통합화(integration)
pCWX02T2 및 pCWX02T10을 ClaI/XbaI으로 절단후, 이들 벡터를 전사 활성 유전자인 TetR-Cdi2 유전자를 발현시키도록 조작된 벡터[Finely and Brent, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12980-84(1984)], pCWX200Cdi2를 함유하는 싸카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) EGY40 균주에 형질전환시켰다[Gietz et al., Yeast 11:355-60(1995)]. 형질 전환체를 우라실 및 류신 결핍 배지상에서 선별하였다. 각각의 pCWX02T2 및 pCWX02T10 형질 전환체에 대한 10개의 독립적인 클론들을 골라낸후 이들을 알파-아미노아디프산 플레이트상에 스트레이킹시켜 LYS2가 불활성화된 클론들을 선별하였다[Chattoo et al., Genetics 93:51-65(1979)]. 상기 TetOp-URA3 유전자가 LYS2부위에서 통합된 사실은 LYS2의 KpnI 단편과 이웃하는 부위에 혼성화되는 프라이머를 사용한 PCR을 통하여 확인될 수 있다. 결과로 생성된 균주 CWXY1 및 CWXY2(MATα ura3 his3 trp1 leu2 lys2::TetOp-URA3)는 각각 URA3 유전자의 4 내지 6개의 TetO2작동 유전자 업스트림을 포함하였다.
And 및 구분 상관 관계에 대한 검정
상호 작용 관계를 검정하기 위하여, 일련의 벡터들을 제조하였다. c-Raf1(1-313)를 벡터 pCWX200 및 JG4-5의 EcoR1/Xho1부위에 클로닝하였다. RasA15A186, hSos1(601-1019) 및 Cdc25(907-1589)를 RasA15A186프라이머인 5'-GCCTGAATTCATGACGGAATATAAGCTGG-3' (서열 번호 7) 및 5'-CCCGAACTCGAGTCAGGAGAGCACTGCCTTGCAGC-3'(서열 번호 8)로 증폭시킨후, hSos1(601-1019) 프라이머인 5'-GCCTGAATTCAAAGCAGGAACTGTT-3'(서열 번호 9) 및 5'-CCCGAACTCGAGCTATCGTGGTTCTATTTCTAG-3'(서열 번호 10), 그리고 Cdc25 촉매성 도메인 (907-1589) 프라이머인 5'-GCCTGAATTCATGTCTTCGGTCTCCTCAG-3'(서열 번호 11) 및 5'-CCCGAACTCGAGTTATCGAAATAACCTAGAAGG-3'(서열 번호 12), RasA15A186의 EcoR1/XhoI-말단 PCR 산물, hSos1(601-1019) 및 Cdc25(907-1589) 또한 pEG202 및 pJG4-5 벡터의 EcoR1/Xho1 부위에 클로닝시켰다.
도 2에 도시된 바와 같이 2-베이트 및 프레이의 조합체와 pCWX24를 함유하는 형질 전환된 CWXY2를 보유하고 있는 형질 전환체들을 류신, 히스티딘, 리신 및 트립토판("LHKW")이 결핍되고 탄소 공급원으로서 글루코즈("Glu")를 함유하며 URA3의 억제 물질인 6-아자우라실을 100㎍/㎖ 첨가한 독립 플레이트(dropout plate)상에 스트레이킹시켰다[Le Douarin et al., Nucl. Acids Res.23:876-8(1995)] 상기 플레이트들을 30℃, 12-48 시간동안 인큐베이팅시켰다. 이후 상기 효모 스트레이킹 균주를 4개의 독립 플레이트 즉, 상기한 바와 같은 LHKW/Glu+X Gal, LHKW/Galactose(Gal)+Raffinose(Raff)+X Gal, LHKWU/Glu, 및 LHKWU/Gal+Raff 플레이트상에서 복제시켜 12-72 시간동안 30℃에서 인큐베이팅시킨후 결과를 평가하였다.
인풋 단백질상에서 And 작동에 대한 검정
추가의 검정을 수행하기 위하여, 인간 GAP1의 EcoRI/XhoI-말단 PCR 산물로서 프라이머들 즉, 5'-GCCTGAATTCATGAAGGGGTGGTATCACGGA-3'(서열 번호 13) 및 5'-CCCGAACTCGAGCTA-CTTGACATCATTGGTTTTTG-3'(서열 번호 14)로 증폭된 PCR 산물을 pCWX200에 클로닝시켰다. 여기에 EcoRI/XhoI-말단 Cdc25(907-1589)(도 2에 도시된 바와 같은)도 pCWX200에 클로닝시켰다. 이후 pEG202RasA186및 pJGRaf(1-313)을 함유하는 CWXY2를 pCWX200, pCWX200CDC25(907-1589) 또는 pCWX200GAP 중의 하나를 사용하여 추가로 형질전환시켰다. 50이상의 독립 형질 전환체로부터 수집한 스트레이킹시킨 형질 전환체를 LHKW/Glu+X Gal, LHKW/Galactose(Gal)+Raffinose(Raff)+X Gal 독립 플레이트상에 각각 복제시킨후, 30℃에서 2-3일 동안 인큐베이팅시켰다. 전자의 플레이트상에서는 청색을 나타내지 않았으며, 후자의 플레이트상에서는 다양한 농도의 청색을 나타내었다. 각각 50 이상의 독립 형질 전환체를 함유하는 세포 수집군(cell pool) 3개의 복사체에서 액체 검정법(liquid assays)으로 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다[Estojak et al., Mol.Cell. Biol.15:5820-9(1995)]. OD600값이 0.2이며 후기 정지기까지 생장한 결과 세포들로 구성된 얇은 막을 형성하였거나 LHKW/Glu 배양액에 포화된 LHKW/Gal+Raff 배지를 인큐베이팅시킨후, 상기 배지를 30℃에서 5시간동안 더 배양시킨후 Estojak et al.,Mol. Cell Biol.15:5820-29(1995)에 기술된 바와 같이 β-갈락토시다제 검정법을 수행하였다.
기타 구체예
상기 방법의 다른 형태에서, 본원에 기술된 2개의 리포터 유전자를 포함하는 시스템은 2개의 상이한 단백질 결합 부위에 결합될 수 있는 단백질을 선별 및 스크리닝하는데에 사용될 수 있다. 이와 같은 스크리닝을 수행하기 위하여, 2개의 상이한 DNA 단편을 상기 2개의 리포터 유전자(예를 들어, URA3 및 lacZ 유전자)의 업스트림에 삽입시킨후 원하는 결합 단백질을 발현시키는 유전자도 포함하고 있는 세포에서 상기 유전자 각각의 발현 정도를 검정하였다. 상기 원하는 결합 단백질은 본래의 형태 또는 활성화 도메인에 융합 단백질의 형태로 발현될 수 있다.
본원에 기술된 방법들중 임의의 것이 단백질, 펩타이드 또는 아프타머를 스크리닝하는데에 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예들은 청구 범위내에 존재한다.
우선 도면에 관하여 설명한다.

Claims (40)

  1. (a)(ⅰ)제 1 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 1 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 2 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 2 리포터 유전자;
    (ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자;
    (ⅳ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 2 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자; 및
    (ⅴ)제 3 융합 단백질을 발현하는 제 3 융합 유전자로서, 상기 제 3 융합 단백질이 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 3 융합 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b)상기 제 1 단백질과 제 3 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 상기 제 1 리포터 유전자의 발현 아웃풋을 측정하는 단계;
    (c)상기 제 2 단백질과 제 3 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 상기 제 2 리포터 유전자의 발현 아웃풋을 측정하는 단계; 및
    (d)단계 (b) 및 단계 (c)의 발현 아웃풋 결과를 해석하는 단계로서,
    (ⅰ)상기 제 1 리포터 유전자 및 제 2 리포터 유전자 모두의 아웃풋이 증가된 경우는 상기 제 3 융합 단백질이 상기 제 1 융합 단백질 및 제 2 융합 단백질과 모두 상호 작용한다는 것을 가리키고;
    (ⅱ)상기 제 1 리포터 유전자의 아웃풋만 증가하고 상기 제 2 리포터 유전자의 아웃풋은 증가되지 않은 경우는 상기 제 3 융합 단백질이 상기 제 1 융합 단백질과 상호 작용하지만 상기 제 2 융합 단백질과는 상호 작용을 하지 않는다는 것을 가리키며;
    (ⅲ)상기 제 2리포터 유전자의 아웃풋만 증가하고 상기 제 1 리포터 유전자의 아웃풋은 증가되지 않은 경우는 상기 제 3 융합 단백질이 상기 제 2 융합 단백질과 상호 작용하지만 상기 제 1 융합 단백질과는 상호 작용을 하지 않는다는 것을 가리키고;
    (ⅳ)상기 제 1 리포터 유전자 또는 제 2 리포터 유전자 모두의 아웃풋에 변화가 없는 경우는 상기 제 3 융합 단백질이 상기 제 1 또는 제 2 융합 유전자와 상호 작용하지 않음을 가리키는 것으로 해석하는 단계를 포함하는, 단백질-단백질 상호 작용 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법이 단계(b) 및 단계(c)의 상기 발현 아웃풋 결과를 다음중 하나의 숙주세포에서 측정된 발현 아웃풋 결과와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열과 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합될 수 있는 결합 부분에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
    (ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부위에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자;
    를 포함하는 제 1 비교 숙주 세포; 또는
    (b)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 단백질 결합 부위와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
    (ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자;
    를 포함하는 제 2 비교 숙주 세포 및
    (c)상기 제 1 및 제 2 비교 숙주 세포 양자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나 이상의 발현 수준이 감소될 수 있는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 단백질 결합 부위가 테트라싸이클린 작동유전자인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자가 URA3 또는 lacZ인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자가 제 2 세포에 의하여 수용 및 검출되는 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 리포터 유전자가 동시에 발현될 수 있는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 리포터 유전자 및 제 2 단백질이 대립 형질 변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. (a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
    (ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 1 단백질과 상호 작용할 수 있고 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 2 단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자
    를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b)상기 제 1 단백질과 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
    (c)상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계;
    (d)상기 제 3 단백질을 발현하는 제 3 유전자를 세포내에 도입시키는 단계;
    (e)상기 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계로서, 상기 제 3 단백질 존재하에서 상기 리포터 유전자의 발현이 변화되는 것은 상기 제 3 단백질이 상기 제 1 단백질 또는 제 2 단백질의 상태 변화를 매개하여 그 결과 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질이 상호 작용하는 능력을 변화시키는 것임을 나타내는 리포터 유전자의 발현 측정 단계
    를 포함하는, 다른 단백질 상태로 변화하는 것을 매개하는 단백질을 검출하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 상태 변화가 형태 변화(conformational change)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 형태 변화를 나타내는 단백질이 Ras 단백질인 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포인 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 상기 제 1 융합 단백질 및 제 3 단백질이 각각 세포외 자극에 반응하여 발현되는 방법.
  17. 제 11항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 제 2 세포에 의하여 수용 및 검출되는 신호를 발생하는 방법.
  18. (a)(ⅰ)단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
    (ⅲ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 1 단백질과 상호 작용 가능하며 유전자 활성화 부분에 공유적으로 결합되는 제 2 단백질을 포함하며, 상기 제 1 단백질 또는 제 2 단백질중 하나 이상이 상태 변화 가능한 제 2 융합 유전자를 포함하는 제 1 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b)상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
    (c)상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질 사이의 상호 작용을 측정하는 방법으로서, 제 1 숙주 세포내에서 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계;
    (d)(ⅰ)상기 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열과 작동 가능하도록 연결된 상기 리포터 유전자;
    (ⅱ)상기 제 1 융합 단백질을 발현하는 상기 제 1 융합 유전자;
    (ⅲ)상기 제 2 융합 단백질을 발현하는 상기 제 2 융합 유전자; 및
    (ⅳ)상기 제 3 단백질을 발현하는 상기 제 3 유전자
    를 포함하는 제 2 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (e)상기 제 3 단백질 존재하에서 상기 제 1 단백질 또는 제 2 단백질을 상호 작용시키는 단계;
    (f)상기 제 3 단백질 존재하에서의 상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 사이의 상호 작용의 척도로서 상기 제 2 숙주 세포내에서의 상기 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계로서, 상기 제 1 숙주 세포에서 측정한 발현 아웃풋에 비하여 상기 제 2 숙주 세포내 리포터 유전자의 발현이 상기 제 3 단백질이 상기 제 1 단백질 또는 제 2 단백질의 상태 변화를 매개하여 그 결과, 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질의 상호 작용 능력을 변화시킨다는 것을 나타내는 것임을 특징으로 하는 리포터 유전자의 발현 측정 단계
    를 포함하는, 다른 단백질 상태로 전환시키는 것을 매개하는 또 다른 단백질 검출 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 상태 변화가 형태 변화인 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 형태 변화를 나타내는 단백질이 Ras 단백질인 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 각각의 숙주 세포가 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포인 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 각각의 숙주 세포가 효모 세포인 방법.
  23. 제 18항에 있어서, 상기 각각의 제 1 융합 단백질 및 제 3 단백질이 세포외 자극에 반응하여 발현되는 방법.
  24. 제 18항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 제 2 세포에 의하여 수용 및 검출되는 신호를 발생시키는 리포터 유전자.
  25. (ⅰ)제 1 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 1 리포터 유전자;
    (ⅱ)제 2 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 제 2 리포터 유전자;
    (ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현하는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 상기 제 1 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 1 단백질을 포함하는 제 1 융합 유전자;
    (ⅳ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 상기 제 2 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위에 공유 결합된 제 2단백질을 포함하는 제 2 융합 유전자; 및
    (ⅴ)제 3 융합 단백질을 발현하는 제 3 융합 유전자로서, 상기 제 3 융합 단백질이 유전자 활성화 부분에 공유 결합된 제 3 단백질을 포함하는 제 3 융합 유전자를 포함하는 세포.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나 이상의 발현 수준이 감소될 수 있는 세포.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 단백질 결합 부위가 테트라싸이클린 작동 유전자인 세포.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자중 하나가 URA3이거나 또는 lacZ인 세포.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 리포터 유전자가 제 2 세포에 의해서 수용 및 검출되는 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 세포.
  30. 제 25항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  31. 제 25항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 세포.
  32. 테트라싸이클린 작동 유전자를 포함하는 리포터 유전자가 검출 가능한 산물을 코드화하는 유전자에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 검출 가능한 산물을 코드화하는 유전자가 URA3 유전자이거나 또는 lacZ 유전자인 리포터 유전자.
  34. (a)(ⅰ)발현 수준을 감소시킬 수 있는 리포터 유전자로서, 상기 리포터 유전자가 단백질 결합 부위를 포함하는 DNA 서열에 작동 가능하도록 연결된 리포터 유전자;
    (ⅲ)제 1 융합 단백질을 발현시키는 제 1 융합 유전자로서, 상기 제 1 융합 단백질이 단백질 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부분에 공유 결합된 전사 촉진 인자(transcriptional activator)를 포함하는 제 1 융합 유전자; 및
    (ⅴ)제 2 융합 단백질을 발현하는 제 2 융합 유전자로서, 상기 제 2 융합 단백질이 유전자 활성화 부분(gene activating moiety)에 공유 결합된 후보 단백질(candidate protein)을 포함하는 제 2 융합 유전자
    를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b)상기 후보 단백질과 상기 전사 촉진 인자 사이의 상호 작용의 지표로서 상기 리포터 유전자의 발현 증가를 검출하는 단계
    를 포함하는, 후보 단백질(candidate protein)이 전사 촉진 인자와 상호 작용하는지 여부를 검출하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 URA3 유전자인 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 발현 수준이 6-아자우라실에 의하여 감소되는 방법.
  37. 제 34항에 있어서, 상기 단백질 결합 부위가 테트라싸이클린 작동 유전자인 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 발현 수준이 테트라싸이클린 또는 테트라싸이클린 유조체에 의하여 감소되는 방법.
  39. 제 34항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포이거나 또는 포유 동물 세포인 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 방법.
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