WO2006062169A1 - 細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム - Google Patents

細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム Download PDF

Info

Publication number
WO2006062169A1
WO2006062169A1 PCT/JP2005/022581 JP2005022581W WO2006062169A1 WO 2006062169 A1 WO2006062169 A1 WO 2006062169A1 JP 2005022581 W JP2005022581 W JP 2005022581W WO 2006062169 A1 WO2006062169 A1 WO 2006062169A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
reporter gene
yeast
fusion protein
dna construct
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/022581
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Yanagawa
Shunichi Kosugi
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Priority to JP2006546756A priority Critical patent/JPWO2006062169A1/ja
Publication of WO2006062169A1 publication Critical patent/WO2006062169A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • Intracellular specific region localized protein ⁇ Peptide screening system Intracellular specific region localized protein ⁇ Peptide screening system
  • the present invention is used in a method and system for screening and identifying proteins localized in specific intracellular regions of eukaryotes, and a peptide containing a signal sequence that governs their translocation, and the method and system. Concerning DNA constructs.
  • Proteins migrate to specific intracellular organelles such as the cytoplasm, nucleus, and mitochondria of cells, and specific regions within cells to exert their functions. Many of these transitions are directed by intracellular organelle-specific signal sequences consisting of short peptides of less than 20 amino acids.
  • Non-patent documents 1 to 3 are functional screening methods for proteins performed using yeast and mammalian cultured cells.
  • a technology that uses the tetracycline rebreser 'operator system derived from Escherichia coli in yeast is a modification of the yeast two-hybrid system. It can be used for screening compounds (for example, see Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 1 Ueki N., Oda T., Kondo M., Yano K., Noguchi T., Muramatsu M. Selection system for genes encoding nuclear-targeted proteins. Nat. Biotechnol. 1998 Dec; 16 (13) : 1338— 13342.
  • Non-Patent Document 2 Tashiro K., Tada H “Heilker R” Shirozu M., Nakano T “Honjo T. Si gnal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane pr oteins. Science. 1993 Jul 30; 261 (5121): 600-603.
  • Non-Patent Document 3 Klein RD, Gu Q., Goddard A., Rosenthal A. Selection for genes enc oding secreted proteins and receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 Jul 9; 93 (14): 7108-71013.
  • Non-Patent Document 4 Shih HM, Goldman PS, DeMaggio AJ, Hollenberg SM, Goodman RH, Hoekstra MF A positive genetic selection for disrupting protein-protein int eractions: identification of CREB mutations that prevent association with the coacti vator CBP. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1996 Nov 26; 93 (24): 13896-13901. Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a screening method and system for proteins localized in specific intracellular regions such as eukaryotic cytoplasm, intracellular organelles, nucleolus, and nuclear specific chromatin region.
  • the present inventors incorporated the existing system of tetracycline rebresser (TetR) 'operator (TetOP) derived from E. coli into a yeast screening system in a specific manner, thereby identifying intracellular eukaryotic cells. It was found that it is possible to screen for proteins localized in the region. Based on the above findings, the present invention has been completed.
  • TetR tetracycline rebresser
  • TetOP 'operator
  • the present invention provides the following.
  • a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein is introduced into a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator to express the fusion protein.
  • a method for detecting the activity of a protein localized in a specific intracellular region other than the eukaryotic nucleoplasm which comprises detecting the expression of the reporter gene.
  • [0010] 3. (1) Introducing a DNA construct expressing a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein into yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator to express the fusion protein. (2) detecting the expression of the reporter gene, and (3) recovering the DNA construct from which the expression of the reporter gene is detected. A method for obtaining a nucleic acid encoding a protein localized in a region.
  • a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor, a visible protein, and a target protein is introduced into a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator. Expressing the fusion protein, (2) detecting the expression of the reporter gene, and (3) the ability of the DNA construct retained by the yeast in which the reporter gene was expressed.
  • a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor, a visualizeable protein, and a target protein is introduced into a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator. Expressing the fusion protein, (2) detecting the expression of the reporter gene, and (3) the ability of the DNA construct retained by the yeast in which the reporter gene was expressed. A region is identified by detection of a visible protein, and (4) yeast power in which localization of the fusion protein in the intracellular specific region is recognized, and recovery of the DNA construct.
  • a method for obtaining a nucleic acid encoding a protein localized in a region is identified by detection of a visible protein, and (4) yeast power in which localization of the fusion protein in the intracellular specific region is recognized, and recovery of the DNA construct.
  • [0015] 8. (1) Yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator, (2) DNA construct that expresses a fusion protein of tetracycline rebresser, visualizeable protein, and target protein, (3) Means for detecting expression of the reporter gene, (4) means for identifying a specific intracellular region where the fusion protein expressed from the DNA construct is localized by detection of a visible protein, and (5) the fusion Yeast power in which localization of a protein in a specific region in a cell is recognized
  • FIG. 1 is a plasmid pTet-a showing an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plasmid pTetGFP-a modified from the plasmid pTet-a showing one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a plasmid pTetGFP-c modified from the plasmid pTet-a showing one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the mechanism of the screening system of the present invention.
  • FIG. 5 shows an example of peptide sequences selected from the NESX library by this screening system.
  • FIG. 6 Shows examples of peptide sequences selected from this 12X library by this screening system and their subcellular localization.
  • a yeast that can handle a relatively large library size and that can be easily screened is used, and the endogenous intracellular translocation activity of the yeast is utilized. Fine Since the transition to a specific region in the vesicle is a mechanism conserved in all eukaryotes, it can handle protein libraries of all eukaryotes.
  • the basic principle of the present invention is that the existing system of tetracycline rebresser (TetR) 'operator (TetOP) derived from E. coli is incorporated into a yeast screening system and transferred to a specific intracellular region other than the nucleus of TetR. The target protein is detected and screened using the activity of the associated reporter gene as an index.
  • TetR tetracycline rebresser
  • TetOP tetracycline rebresser
  • TetOP When TetOP is incorporated into the promoter of the reporter gene, the expression of the reporter gene is maintained in a suppressed state by binding to TetR force TetOP.
  • TetR TetR force TetOP.
  • a protein is fused with TetR and expressed, if this protein contains an activity that promotes translocation to a specific region in the cell, the nuclear abundance of this TetR fusion protein will decrease.
  • the TetR fusion protein cannot bind to TetOP and induces expression of the reporter gene.
  • yeast is selected using the expression of this reporter gene as an index.
  • the detection method of the present invention includes (1) introducing a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein into a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator. And (2) detecting the expression of the reporter gene.
  • the yeast used in the present invention expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator.
  • the yeast may be a commonly used yeast without particular limitations.
  • the reporter gene may be any gene that functions in yeast.
  • a gene used as a selection marker can be used.
  • auxotrophic selection markers such as HIS3, L EU2, TRP1, URA3, ADE2, YAP1, AUR1-C (a marker gene contained in pAUR plasmids sold by TAKA RA), Zeocin (Invitrogen) And drug resistance markers, such as those included in pHybLex / Zeo plasmids!
  • Yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator can be obtained by ordinary genetic engineering techniques. In other words, put a tetracycline operator into the promoter of the reporter gene.
  • the DNA construct used in the present invention expresses a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein.
  • a DNA construct is usually a vector or plasmid that can be replicated in yeast, and contains the replication control region (also called the replication origin) necessary for plasmid replication in yeast (eg, 2 ⁇ ori, ARS, CEN, etc.). Have.
  • a DNA construct can be obtained by modifying a vector used in yeast so as to express a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein by a conventional genetic engineering technique.
  • Representative vectors include YEp, YRP, and YCP vectors.
  • the promoter and terminator used for expression are not limited as long as they function in yeast. Either the tetracycline libresser or the target protein may be located at the N-terminus.
  • the DNA construct preferably further has a selection marker in yeast. This allows selection of yeast that retains the DNA construct. Examples of the selectable marker include those similar to the above reporter gene, and those different from the reporter gene are used. When the DNA construct has a selectable marker gene, a yeast lacking the marker gene is used.
  • the DNA construct is preferably a shuttle vector that can be cloned between yeast and E. coli.
  • examples of the replication control region necessary for plasmid replication in E. coli include ColEl ori.
  • Examples that preferably have a selectable marker in E. coli include ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, and noidalomycin resistance gene.
  • a nuclear translocation signal is included in the fusion protein.
  • nuclear translocation signals include those derived from Xenopus nucleoplasmin (KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 61)), those derived from human cMyc ⁇ ! 1 ⁇ 1 and 0 (SEQ ID NO: 62)), artificial Sequence (KRKRY (SEQ ID NO: 63)) and the like.
  • the position to include the nuclear translocation signal is the nuclear translocation signal. N-terminal, C-terminal, tetracycline rebresser and target protein may be selected.
  • the expression of the reporter gene can be detected by a method suitable for the reporter gene.
  • a typical method for detecting the expression of a reporter gene is as follows.
  • TRP1 Presence or absence of growth in cultures lacking tributophan
  • a protein other than the eukaryotic nucleoplasm is detected. Proteins that localize in specific intracellular regions can be screened. Further, by recovering the DNA construct from the yeast in which the expression of the reporter gene is detected, a protein that is localized in a specific intracellular region other than the eukaryotic nucleoplasm can be obtained.
  • the tetracycline rebresser and the library protein become a fusion protein. It is preferable to use a DNA construct having a site that can be cleaved by a restriction enzyme such as a multicloning site, which incorporates a tetracycline repressor gene and DNA encoding a library protein.
  • the visible protein is not particularly limited as long as it can be visualized, and includes a protein that can be stained and a fluorescent or luminescent protein. It is preferable to use it.
  • a protein that exhibits fluorescence or luminescence is green fluorescent protein (GFP).
  • the visible protein can be detected by a method selected depending on the visible protein. For example, in the case of GFP, it can be detected by a fluorescence microscope.
  • the reporter gene When identifying a specific intracellular region in which the fusion protein expressed from the DNA construct retained by the yeast in which the reporter gene is expressed is localized by detecting a visible protein, the reporter gene
  • the specific region in the cell where the fusion protein is localized in the yeast in which expression is detected may be identified by detection of a visible protein, or a DNA construct may be obtained from the yeast in which expression of the reporter gene is detected.
  • the recovered DNA construct may be recovered and introduced into yeast to express the fusion protein, and a specific intracellular region where the fusion protein is localized may be identified by detecting a visible protein.
  • the yeast to be reintroduced may not be one that expresses the reporter gene, but when the DNA construct has a selection marker, it is preferable that the yeast or culture conditions to be used correspond to the selection marker.
  • the present invention also provides the following system for performing the above method.
  • a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator
  • a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor and a target protein
  • the reporter gene A system that detects the activity of a protein to localize to a specific intracellular region other than the eukaryotic nucleoplasm, including means for detecting expression
  • a yeast that expresses a reporter gene under the control of a tetracycline operator (2) a DNA construct that expresses a fusion protein of a tetracycline repressor, a visualizeable protein, and a target protein, (3) Means for detecting the expression of a reporter gene, (4) means for identifying a specific intracellular region in which the fusion protein expressed from the DNA construct is localized by detection of a visible protein, and (5) of the fusion protein
  • a method for detecting the activity of a protein to localize to a specific region in a eukaryotic cell including means for recovering the DNA construct from a yeast that has been localized to the specific region in a cell. Stem.
  • yeast of (1) and the DNA construct of (2) are as described for the method.
  • means for detecting the expression of the reporter gene means known for reporter gene detection are appropriately selected depending on the type of the reporter gene. For example, when the reporter gene is the HIS3 gene, a medium lacking histidine can be mentioned.
  • a means known for detection of a visible protein is appropriately selected according to the type of the visible protein. For example, in the case of GFP, which can be visualized, a fluorescent microscope is used.
  • Means for constructing a DNA construct is appropriately selected from means known for recovery of DNA constructs such as yeast strain.
  • means known for recovery of DNA constructs such as yeast strain.
  • FIGS. Several examples of DNA constructs related to TetR expression are shown schematically in FIGS. These are plasmids constructed based on a cloning vector pGAD424 (BD Biosciences, Genbank accession no. U07647) that can be selected between budding yeast and E. coli.
  • a DNA fragment from promoter 1 (1) to terminator 1 (4) is inserted between two Hindlll restriction enzyme sites present in the pGAD424 plasmid. Therefore, the selection marker LEU2 (7) in yeast, the selection marker amp f (9) in E. coli, the plasmid replication control region 2 ori (10) in yeast, and the plasmid replication control region ColEl ori (8) in E. coli
  • the base vector is not limited to the pGAD424 vector as long as it is a shuttle vector that can be cloned by yeast and E. coli.
  • TetR TetR of E. coli in yeast.
  • TetR gene (2) Genbank accession no. AJ307714
  • Tefl elongation factor 1-a gene promoter of budding yeast (1)
  • the terminator for bp the alcohol dehydrogenase (adhl) gene terminator (4) derived from the PGAD424 vector is used.
  • the promoter and terminator function in yeast. If it is, it will not be limited to the above.
  • FIG. 1 schematically shows the most basic DNA construct (pTet-a) of the present invention.
  • the TetR gene has a stop codon removed and a cloning site (MCS) (3) containing Spel, BamHI and Sad restriction enzyme sites at its 3 'end. Between the BamHI restriction site and the Sad restriction site, stop codons corresponding to three reading frames are arranged.
  • MCS cloning site
  • TetR Since the molecular weight of TetR is as small as about 23 KDa, the nuclear pore is also transferred into the nucleus by diffusion, and can bind to its own binding DNA sequence, TetOP. Therefore, a library that can be applied to screening using this plasmid is limited to a DNA library that encodes a peptide having a small molecular weight. This is because, when inserting cDNA that encodes a large protein, the expressed TetR fusion protein is inhibited from entering the nucleus by diffusion.
  • a cDNA library can be inserted and used for screening.
  • the cloning site 3 is defined as the Pte fl promoter (1) and the TetR gene (2 ), And insert the DNA library for screening.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a plasmid (pTetGFP-a).
  • the GFP cDNA used for the construction of this plasmid is sGFP (Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi) modified from GFP (Genbank accession no. M6z6o3) derived from Aequorea victoria. H., Sheen J. Engine GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol.
  • a DNA fragment encoding the nuclear translocation signal (5) is inserted between the TetR gene (2) and the GFP cDNA (6). For this reason, the TetR-NLS-GFP fusion protein is actively translocated into the nucleus.
  • the sequence used for the nuclear translocation signal can be any nuclear translocation signal sequence derived from SV40 large T antigen (PKKKRKV (SEQ ID NO: 51)). Any peptide and protein can induce nuclear translocation. It does not matter.
  • TetR-NLS-GFP fusion protein By adding GFP to TetR as a visible protein, a new protein is fused to the TetR-NLS-GFP fusion protein, which is originally localized in the nucleus.
  • the screening operation can be performed while confirming whether the local localization changes.
  • the plasmid shown in Fig. 2 is constructed so that a protein from the library is fused and expressed at the C-terminus of the TetR-GFP fusion protein.
  • the cloning site (3) is transferred between the Ptefl promoter (1) and the TetR gene (2), and a DNA library is inserted and used. Applicable to screening of proteins containing a null sequence.
  • pTetGF-c is a modified version of the LEU2 marker gene of plasmid pTetGF-a so that it is expressed in the form of a TetR-GFP-LEU2 fusion protein.
  • the schematic diagram is shown in Fig. 3. .
  • the LEU2 protein coding region 7 prepared using PCR was inserted into the 3, terminus of the GFP coding region (6) of the pTetGF-a plasmid from which the LEU2 marker gene had been previously removed by EcoRV and PvuII restriction enzyme treatment. ing.
  • the inserted LEU2 coding region (7) does not contain a stop codon, and the 3 ′ end is provided with the same cloning site (3) as the above plasmid.
  • the marker gene fused downstream of the GFP coding region is not limited to LEU2 as long as it is derived from a marker gene that can be selected in yeast! [0059]
  • the same cloning site as the plasmid (3) is transferred between the Ptefl promoter (1) and the TetR gene (2), and the DNA library is inserted and used, so that it is located at the N-terminal of the protein. Applicable to screening of functioning signal sequences and proteins containing signal sequences.
  • pG BT9 BD Biosciences, Genbank accession no. U07646
  • the DNA fragment sandwiched between the Aatll restriction site and Sphi restriction site was exchanged with the HIS3 gene (Genbank accession no. X03245) of budding yeast. is doing.
  • the HIS3 gene In this plasmid, 2 ori, the replication region in yeast, has been removed, so this vector is used as a yeast chromosome insertion plasmid.
  • the HIS3 gene consists of a promoter region from the transcription start point to upstream-292, a protein coding region, and a terminator region from the translation stop codon to 201 bp downstream.
  • the TISOP array (5, -ACTCTATCATTG ATAGAGT-3, (SEQ ID NO: 60)) is inserted into the HIS3 plug motor at two positions, -22 and -53, sandwiching the TATA box!
  • TetR A fusion protein (11) is expressed.
  • the TetR fusion protein is actively transported into the nucleus (14) by the force of translocation into the nucleus (14) or by the action of a vector-encoded nuclear translocation signal.
  • the yeast cell of the host into which the plasmid is introduced has a mutation in a gene related to auxotrophy used as a reporter and plasmid selection marker gene, and does not grow on a minimal medium unless the reporter and plasmid selection marker gene function. Use possible stocks. Furthermore, the yeast strain used is in the state of being integrated on the HIS3 reporter gene (13) force chromosome in which TetOP (12) is inserted into the promoter region.
  • TetR fusion protein (11) strongly binds to TetOP (12) and HIS3 repo Because it suppresses the expression of the one-ter gene (13), it cannot grow on yeast minimal medium lacking histidine.
  • the proteins and peptides fused to TetR contain a sequence that promotes the transition to a region other than the nucleus, that is, the transition to a specific intracellular region, the TetR fusion protein present in the nucleus The amount decreases.
  • the amount of TetR fusion protein that can bind to TetOP also decreases, leading to expression of the HIS3 reporter gene. Therefore, yeast cells having such clones can form colonies on a minimal medium lacking histidine.
  • TetR binds to tetracycline, thereby reducing its binding affinity to TetOP. Therefore, the suppression level of the reporter gene can be regulated by adding an appropriate amount of tetracycline and similar compounds to the medium. it can. By this operation, the selection pressure of the screening can be adjusted flexibly.
  • proteins localized in specific intracellular regions can be detected and screened from protein and peptide libraries.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various other configurations can be adopted without departing from the gist of the present invention.
  • a plasmid pTetGFP-a designed to express E. coli TetR in yeast was constructed.
  • the structure of plasmid pTetGFP-a is shown in FIG.
  • the pGAD424 vector cleaved with the restriction enzyme Hindlll and dephosphorylated was added to the translation start point of the budding yeast elongation factor 1-a (TEF1) gene promoter (1) (Genbank accession no. M10992). A DNA fragment containing 480 bp upstream was inserted.
  • This promoter fragment Ptefl (1) is a specific primer (5'-GAGAGGAGAA AAGCTTTTCGAGGACCGCGA ATCCTTAC-3, (SEQ ID NO: 47), 5'-GAGAGGAGAA AAGCTTGAGCTCGGTACC CTCGAGTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGCTATGC-3 '(SEQ ID NO: 48)), and a DNA fragment obtained by PCR using budding yeast chromosomal DNA as a saddle, It was cut with Hindlll. The obtained plasmid was cut with restriction enzymes Xhol and Sad, and the TetR gene (2) (Genbank accession no. AJ307714) was inserted.
  • TetR gene (2) DNA fragment using specific primer (5 GAGAGGAGAACTCGAGGCCATGGGTTC TAGATTAGATAAAAGTAAA GTG-3, (SEQ ID NO: 49), 5'-GAGAGGAGAAGAGCT CTTAGGATCCACTAGTTCTAGAAGACCC ACTTTCACATTTAAG-3 '(SEQ ID NO: 50))
  • a DNA fragment obtained by PCR using Escherichia coli genomic DNA as a saddle type was cleaved with restriction enzymes Xhol and Sad.
  • the resulting plasmid was cleaved with restriction enzymes Spel and Sad, and a DNA fragment encoding the nuclear translocation signal sequence (PKKKRKV (SEQ ID NO: 51)) (5) derived from SV40 large T antigen was attached to the 5 'end.
  • GFP cD NA (6) was inserted.
  • the inserted GFP cDNA (6) is sGFP (Chiu W., Niwa Y., Zen g W., Hirano T., Kobayashi H.) modified from GFP (Genbank accession no. M62653) derived from Aequorea victoria. , Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plant s. Curr. Biol. 1996 Mar 1; 6 (3): 325-330.)
  • CCTTGTACAGCTCGTCCATG-3 ′ (SEQ ID NO: 53) was used to cleave a DNA fragment obtained by PCR using sGFP cDNA as a saddle with restriction enzymes Nhel and Sad.
  • Primer A contains a sequence encoding the N-terminus of sGFP and a DNA sequence encoding a nuclear translocation signal sequence at its 5 ′ end.
  • Primer B also contains a sequence encoding the C terminus of sGFP from which the stop codon has been removed, and a Spel, BamHI and Sad restriction enzyme site at the 5 'end. The nucleotide sequences of all DNA fragments prepared by PCR have been confirmed by sequencing.
  • the plasmid pTetGFP-a constructed through the above steps has a Ptefl promoter (1) and TetR gene (2) between the two Hindlll restriction enzyme sites present in the pGAD424 plasmid.
  • a nuclear localization signal sequence (5), a GFP cDNA (6), a cloning site (3) containing a Spel and BamHI restriction enzyme site are arranged in this order.
  • an alcohol dehydrogenase (adhl) gene terminator (4) derived from the pGAD424 vector is arranged downstream of the crawling site.
  • LEU2 (7), a selection marker in yeast, selection marker amp 1 "(9) in E. coli, plasmid replication control region 2 ori (lO) in yeast, and plasmid replication control region ColEl ori (8) in E. coli PGAD424 originally exists.
  • a library was prepared by inserting the synthetic DNA encoding the peptide into the pTetGFP-a plasmid prepared above.
  • the synthetic DNA used was composed of two types of sequences containing arbitrary bases. One is of the type intended to express in yeast a 12X, 12 random amino acid sequence containing 36 consecutive arbitrary bases. When this random peptide sequence contains sequences that promote migration to a specific intracellular region, it was expected that these sequences could be cloned by this screening system.
  • Another type is a known consensus sequence of a nuclear export signal ⁇ L X X X (L / I / F / M / V) X X L X (L / I); X represents an arbitrary amino acid.
  • NESX encoding SEQ ID NO: 54 ⁇ , whose base sequence is 5,-CTC NNN NNN NNN NT (G / C) NNN NNN CTC NNN (A / C) T C-3, (SEQ ID NO: 55) there were. It was expected that the TetR-GFP fusion protein was excreted into the nuclear cytoplasm by the action of the nuclear export signal, and that this screening system could extract a sequence with true nuclear export activity.
  • sequence 5'-AGAGCCATCT AGAAACTTTGAGAAGGAGAATACCATG-3 '(SEQ ID NO: 56) containing the Xbal restriction enzyme site was added to the 5' end side of these sequences, and the BamHI restriction enzyme site and the 3 'end side were added.
  • sequence 5,-GACTACAAGGACGATGACGACAAGGGATCCGGTCAAA-3 '(sequence number 58), which encodes the FLAG tag (DYKDDDDK (sequence number 57)) was added.
  • PCR was performed using NESX synthetic oligonucleotides in a cage. Digest the amplified DNA fragment with Xbal and BamHI Thereafter, purification was performed and the product was inserted into the Spel-BamHI site of the pTetGFP-a vector.
  • a DNA construct in which the TetOP sequence was incorporated into the HIS3 gene promoter region was prepared as follows.
  • pGBT9 BD Biosciences, Genbank accession no. U0764o
  • the DNA fragment sandwiched between the Aatll restriction site and the Sph restriction site was exchanged with the HIS3 gene of budding yeast (Gen bank accession no. X03245). It consists of a promoter region from the transcription start point to upstream-292, a protein coding region, and a terminator region from the translation termination codon to 201 bp downstream, but the HIS3 promoter has positions -2 2 and -53.
  • TetOP sequence (5'-ACTCTATCATTGATAGAGT-3 '(SEQ ID NO: 60)) was inserted across the TATA box at two sites. This plasmid had the 2 ori replication region in yeast removed. This DNA construct was used as a yeast chromosome insertion plasmid.
  • the obtained plasmid was cleaved with PvuII and introduced into budding yeast SFY526 (BD Biosciences) to obtain a HIS3 reporter gene recombinant yeast strain.
  • This yeast strain was confirmed to be unable to grow on SD basic medium lacking histidine by introducing the pTetGF-a plasmid, which had grown on SD basic medium lacking histidine.
  • the yeast strain incorporating the HIS3 reporter gene is cultured in 100 ml of YPD liquid medium until 0 D reaches about 1.0, and 30 ⁇ g of the library plasmid is used for the lithium acetate method.
  • the yeast was transformed by Yeast cells into which the plasmid had been introduced were cultured at 30 ° C. for 5 days using SD agar medium lacking leucine and histidine. The resulting colonies were collected and collected, and the extracted plasmid was transformed into E. coli. A plasmid was also prepared for this E. coli force, sequence analysis was performed, and the plasmid was reintroduced into yeast (budding yeast SFY526), and the intracellular localization of the TetR-GFP fusion protein was confirmed by GFP fluorescence observation. Similarly, the library plasmid before screening was reintroduced into yeast and observed for GFP fluorescence.
  • the fluorescence of the TetR-GFP fusion protein spread to the cytoplasm or the whole cell in most cells. This indicates that most of the plasmids selected from the library by screening contain sequences with nuclear export activity and that the screening system is functioning effectively.
  • This example can screen and identify many types of intracellular signal and protein by using the screening system according to the present invention. It shows that.
  • a protein localized in a specific intracellular region can be detected and screened from a protein library.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　テトラサイクリンリプレッサー（TetR）・オペレーター（TetOP）システムを酵母に組み入れ、テトラサイクリンリプレッサー融合タンパク質の細胞内局在性の変化を指標とした検出およびスクリーニングを行う。TetR発現プラスミドライブラリーから発現されるTetR融合タンパク質(11)は、核移行シグナルの働きによって核(14)に移行する。TetR融合タンパク質(11)は、HIS3レポーター遺伝子プロモーターに挿入されたTetOP(12)に結合し、HIS3レポーター遺伝子(13)を抑制する。TetRに融合されたタンパク質に、細胞内特定領域(15)への移行を司る活性が含まれるとき、TetR融合タンパク質(11)は、核質から排出され、HIS3レポーター遺伝子(13)の発現が誘導される。従って、ヒスチジンを欠いた最少培地で生育するクローンを選択することで、細胞内特定領域移行活性を検出できる。

Description

細胞内特定領域局在化タンパク質 ·ペプチドをスクリーニングするシステ ム 技術分野
[0001] 本発明は、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質、およびこれらの 移行を司るシグナル配列を含むペプチドをスクリーニングおよび同定する方法および システム並びにその方法およびシステムで使用される DNA構築物に関する。
背景技術
[0002] タンパク質は、細胞の細胞質、核、ミトコンドリア等の特定の細胞内小器官および細 胞内特定領域に移行して機能を発揮する。この移行の多くは、 20アミノ酸以内の短 いペプチドからなる細胞内小器官特異的なシグナル配列によって指令される。
[0003] 従来、細胞内小器官へ移行するタンパク質のうち、核へ局在するタンパク質、分泌 性の細胞外移行タンパク質、およびレセプター型の膜タンパク質に対するスクリー- ングシステムが確立されている（例えば、非特許文献 1〜3参照)。これらのシステムは 、酵母やほ乳類培養細胞を用いて行うタンパク質の機能的スクリーニング方法である 力 核移行および細胞外移行タンパク質のスクリーニングに限定されるものである。
[0004] 一方、大腸菌由来のテトラサイクリンリブレッサー 'オペレーターシステムを酵母で利 用する技術が、酵母ツーハイブリッドシステム (yeast two-hybrid system)の変形として 、タンパク質間の相互作用を阻害するタンパク質変異や薬剤化合物のスクリーニング に利用されて ヽる（例えば、非特許文献 4参照)。
非特許文献 1 : Ueki N., Oda T., Kondo M., Yano K., Noguchi T., Muramatsu M. Sel ection system for genes encoding nuclear-targeted proteins. Nat. Biotechnol. 1998 Dec;16(13):1338— 13342.
非特許文献 2 : Tashiro K., Tada H" Heilker R" Shirozu M., Nakano T" Honjo T. Si gnal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane pr oteins. Science. 1993 Jul 30;261(5121):600- 603.
非特許文献 3 : Klein R.D., Gu Q., Goddard A., Rosenthal A. Selection for genes enc oding secreted proteins and receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996 Jul 9;93 (14):7108-71013.
非特許文献 4 : Shih H.M., Goldman P.S., DeMaggio A.J., Hollenberg S.M., Goodman R.H., Hoekstra M.F. A positive genetic selection for disrupting protein-protein int eractions: identification of CREB mutations that prevent association with the coacti vator CBP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996 Nov 26;93(24): 13896- 13901. 発明の開示
[0005] ある生物で発現する全タンパク質の細胞内局在性を網羅的に調査する場合や、 目 的の細胞内小器官へ移行するタンパク質を網羅的に解析およびクローユングしょうと する場合、効率的なスクリーニングシステムが要求される。しかし、前述のように、核移 行および細胞外移行タンパク質以外のスクリーニングシステムは未だ発明されていな い。
[0006] 本発明は、真核生物の細胞質、細胞内小器官、核小体、核内特定クロマチン領域 等の細胞内特定領域に局在化するタンパク質のスクリーニング方法およびシステム を提供することを目的とする。
[0007] 本発明者らは、大腸菌由来のテトラサイクリンリブレッサー (TetR) 'オペレーター (T etOP)の既存のシステムを、特定の様式で酵母スクリーニングシステムに取り入れるこ とで、真核細胞の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングすること が可能であることを見出した。以上の知見に基づき、本発明は完成された。
従って、本発明では、以下のものを提供する。
[0008] 1. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 に、テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DN A構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記レポーター遺伝子の 発現を検出することを含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域 に局在化する活性を検出する方法。
[0009] 2. 1記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質 以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を 選択することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク 質をスクリーニングする方法。
[0010] 3. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 に、テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DN A構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記レポーター遺伝子の 発現を検出し、（3)前記レポーター遺伝子の発現が検出された酵母力 前記 DNA構 築物を回収することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する タンパク質をコードする核酸を取得する方法。
[0011] 4. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 に、テトラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融 合タンパク質を発現する DNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、 (2 )前記レポーター遺伝子の発現を検出し、（3)前記レポーター遺伝子が発現された酵 母の保持する前記 DNA構築物力 発現される前記融合タンパク質が局在する細胞 内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定することを含む、タンパク質 の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
[0012] 5. 4記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の細胞 内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択するこ とを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする 方法。
[0013] 6. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 に、テトラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融 合タンパク質を発現する DNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、 (2 )前記レポーター遺伝子の発現を検出し、（3)前記レポーター遺伝子が発現された酵 母の保持する前記 DNA構築物力 発現される前記融合タンパク質が局在する細胞 内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定し、（4)前記融合タンパク質 の細胞内特定領域への局在が認められた酵母力 前記 DNA構築物を回収すること を含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取 得する方法。
[0014] 7. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 、（2)テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DN A構築物、および、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク 質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステ ム。
[0015] 8. (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母 、（2)テトラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融 合タンパク質を発現する DNA構築物、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手 段、（4)DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域 を、可視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、（5)前記融合タンパク 質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母力 前記 DNA構築物を回収する手 段を含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する システム。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]本発明の一実施形態を示すプラスミド pTet- aである。
[図 2]本発明の一実施形態を示すプラスミド pTet- aから改変されたプラスミド pTetGFP -aである。
[図 3]本発明の一実施形態を示すプラスミド pTet- aから改変されたプラスミド pTetGFP -cである。
[図 4]本発明のスクリーニングシステムの仕組みを示した模式図である。
[図 5]NESXライブラリーから、本スクリーニングシステムによって選択されたペプチド配 列の例を示したものである。
[図 6]12Xライブラリーから、本スクリーニングシステムによって選択されたペプチド配 列とその細胞内局在性の例を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本明細書においては、タンパク質とペプチドの語は互いに互換可能な意味の語とし て用いる。
[0018] 本発明では、比較的大きなライブラリーサイズを扱うことができ、スクリーニング操作 が容易である酵母を用い、酵母の内生の細胞内特定領域移行活性を利用する。細 胞内特定領域への移行は真核生物全般に保存された機構であるため、全真核生物 のタンパク質ライブラリーを扱うことができる。
[0019] 本発明の基本原理は、大腸菌由来のテトラサイクリンリブレッサー (TetR) 'オペレー ター（TetOP)の既存のシステムを酵母スクリーニングシステムに取り入れ、 TetRの核 質以外の細胞内特定領域への移行に伴うレポーター遺伝子の活性ィ匕を指標として、 目的のタンパク質を検出およびスクリーニングするものである。
[0020] レポーター遺伝子のプロモーター中に TetOPを組み込むと、 TetR力TetOPに結合 することでレポーター遺伝子の発現は抑制された状態に保たれる。 TetRにタンパク質 を融合させて発現させた時、このタンパク質に細胞内特定領域への移行を促す活性 が含まれる場合には、この TetR融合タンパク質の核内存在量が減少することになる。 これに伴って TetR融合タンパク質は TetOPに結合できなくなり、レポーター遺伝子の 発現が誘導される。最終的にこのレポーター遺伝子の発現を指標として、酵母の選 択を行う。
[0021] TetRに融合するタンパク質として、ライブラリーを用いること、つまり TetRをコードす る DNA構築物にタンパク質をコードする DNA断片を挿入すること、によりレポーター 遺伝子の発現を指標にしてスクリーニングが可能となる。
[0022] 従って、本発明の検出方法は、（1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポ一 ター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融 合タンパク質を発現する DNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、 (2 )前記レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする。
[0023] 本発明で使用される酵母は、テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター 遺伝子を発現する。酵母には、特に制限はなぐ通常に用いられる酵母でよい。
[0024] レポーター遺伝子は、酵母で機能するものであればよい。このようなレポーター遺 伝子としては、選択マーカーとして用いられる遺伝子が使用できる。例えば、 HIS3、 L EU2、 TRP1、 URA3、 ADE2などの栄養要求性選択マーカー、 YAP1、 AUR1- C (TAKA RA社より販売されている pAUR系プラスミドに含まれているマーカー遺伝子）、 Zeocin (Invitrogen社より販売されて!、る pHybLex/Zeoプラスミド等に含まれて!/、るマーカー 遺伝子)などの薬剤耐性マーカーが挙げられる。 [0025] テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母は、通 常の遺伝子工学的手法により得ることができる。すなわち、レポーター遺伝子のプロ モーターにテトラサイクリンオペレーターを^ aみ込めばよ 、。
[0026] 本発明で用いられる DNA構築物は、テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質 との融合タンパク質を発現する。 DNA構築物は、通常には、酵母で複製可能なベクタ 一またはプラスミドであり、酵母におけるプラスミド複製に必要な複製制御領域 (複製 開始点とも言う）（例えば、 2 μ ori、 ARS、 CENなど）を有する。
[0027] DNA構築物は、酵母で用いられるベクターを、通常の遺伝子工学手法により、テト ラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するように改変 することによって得ることができる。代表的なベクターとしては、 YEp系、 YRP系、 YCP 系などのベクターが挙げられる。発現のために、用いられるプロモーターおよびターミ ネーターは、酵母で機能するものであれば、制限されない。テトラサイクリンリブレッサ 一と、対象タンパク質とはどちらが N末端に位置してもよい。
[0028] DNA構築物は、さらに、酵母での選択マーカーを有することが好ましい。これにより 、 DNA構築物を保持する酵母を選択できる。選択マーカーの例としては、上記レポ一 ター遺伝子と同様のものが挙げられ、レポーター遺伝子とは異なるものが用いられる 。 DNA構築物が選択マーカー遺伝子を有する場合には、酵母として、マーカー遺伝 子が欠損して 、るものを用いる。
[0029] DNA構築物は、酵母と大腸菌とでクローユング可能なシャトルベクターであることが 好ましい。このための大腸菌におけるプラスミド複製に必要な複製制御領域としては 、 ColEl oriなどが挙げられる。また、大腸菌における選択マーカーをさらに有すること が好ましぐその例としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ノヽ イダロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
[0030] 対象タンパク質のサイズが大きぐ拡散による核内への侵入が阻害される場合には 、核移行シグナルを融合タンパク質に含ませる。このような核移行シグナルの例として は、 Xenopus (力エル） nucleoplasmin由来のもの（KRPAATKKAGQAKKKK (配列番 号 61))、ヒト cMyc由来のもの ^! 1^ 1し0(配列番号62))、人工的な配列（KRKRY( 配列番号 63))などが挙げられる。核移行シグナルを含ませる位置は、核移行シグナ ルの性質によって選択すればよぐ N末端、 C末端、テトラサイクリンリブレッサーと対 象タンパク質との間などが挙げられる。
[0031] レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子に適した方法により検出することが できる。代表的なレポーター遺伝子の発現の検出方法は、以下の通りである。
[0032] [表 1] 表 1
遺伝子 検出方法
HIS3 ヒスチジンを欠いた培地での培養における生育の有無
LEU2 ロイシンを欠いた培地での培養における生育の有無
TRP1 トリブトファンを欠いた培地での培養における生育の有無
URA3 ゥラシルを欠いた培地での培養における生育の有無
ADE2 アデニンを欠いた培地での培養における生育の有無
YAP1 シクロへキシミ ドを含んだ培地での培養における生育の有無
AUR1-C オーレォバシジン（Aureobasidin) Aを含んだ培地での培養における生育の有無
Zeocin ゼォシンを含んだ培地での培養における生育の有無
[0033] 本発明の検出方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質 以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出することにより、真核生物の核質以 外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングすることができる。また 、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母から、 DNA構築物を回収することにより 、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質を取得することが できる。
[0034] タンパク質ライブラリーから、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する タンパク質をスクリーニングする場合には、テトラサイクリンリブレッサーとライブラリー のタンパク質とが融合タンパク質となるように、テトラサイクリンリブレッサー遺伝子と、 ライブラリーのタンパク質をコードする DNAを組み込む、マルチクロー-ング部位など の制限酵素で切断できる部位を有する DNA構築物を用いることが好ま 、。
[0035] DNA構築物が発現する融合タンパク質にさらに可視化可能タンパク質を融合させ ると、可視化タンパク質の検出により、細胞内特定領域への局在化する活性を検出 することができる。
[0036] 可視化可能タンパク質としては、可視化可能であれば特に限定されず、染色可能 なタンパク質や蛍光や発光するものが挙げられるが、蛍光や発光を示すタンパク質を 用いることが好ましい。蛍光や発光を示すタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ GFP)が挙げられる。
[0037] 可視化可能タンパク質の検出は、可視化可能タンパク質に応じて選択される方法 により行うことができる。例えば、 GFPの場合には、蛍光顕微鏡により検出することが できる。
[0038] 前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記 DNA構築物から発現さ れる前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検 出により同定する際には、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母における前記 融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により 同定してもよいし、あるいは、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母から DNA構 築物を回収し、回収された前記 DNA構築物を酵母に導入して、前記融合タンパク質 を発現させ、前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパ ク質の検出により同定してもよい。再導入を行う酵母は、レポーター遺伝子を発現す るものでなくてもよいが、 DNA構築物が選択マーカーを有する場合は、用いる酵母ま たは培養条件を選択マーカーに対応したものすることが好ましい。
[0039] 本発明は、上記の方法を行うための、下記のシステムも提供する。
[0040] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、（2) テトラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DNA構 築物、および、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク質 の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム
[0041] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、（2) テトラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タ ンパク質を発現する DNA構築物、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段、 (4)DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、 可視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、（5)前記融合タンパク質 の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記 DNA構築物を回収する手段 を含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシ ステム。
[0042] (1)の酵母、および、（2)の DNA構築物は、方法に関して説明したとおりである。
[0043] レポーター遺伝子の発現を検出する手段は、レポーター遺伝子の検出に関して知 られている手段が、レポーター遺伝子の種類に応じて適宜選択される。例えば、レポ 一ター遺伝子が HIS3遺伝子の場合、ヒスチジンを欠 、た培地が挙げられる。
[0044] 細胞内特定領域の同定手段は、可視化可能タンパク質の検出に関して知られてい る手段が、可視化可能タンパク質の種類に応じて適宜選択される。例えば、可視化 可能タンパク質力 GFPの場合、蛍光顕微鏡が挙げられる。
[0045] DNA構築物を構築する手段は、酵母力ゝらの DNA構築物の回収に関して知られてい る手段が適宜選択される。例えば、 DNA回収キットとして入手可能な手段が挙げられ る。
[0046] 以下、本発明を実施するための形態についてさらに説明する。
[0047] TetR発現に関する DNA構築物の数例を、図 1〜図 3に模式的に示す。これらは出 芽酵母と大腸菌で選択可能なクロー-ングベクター pGAD424 (BD Biosciences社、 G enbank accession no. U07647)を基にして構築されたプラスミドである。これらの例で は、 pGAD424プラスミドに存在する 2箇所の Hindlll制限酵素部位の間に、プロモータ 一（1)からターミネータ一（4)までの DNA断片を挿入した形になって 、る。したがって 酵母での選択マーカーである LEU2 (7)、大腸菌での選択マーカー ampf (9)、酵母に おけるプラスミド複製制御領域 2 ori (10)、大腸菌におけるプラスミド複製制御領域 ColEl ori (8)は、 pGAD424に元々存在するものを利用している。なお、基となるベタ ターは、酵母と大腸菌でクローユングが可能なシャトルベクターであれば、 pGAD424 ベクターに限定されない。
[0048] これらのプラスミドは、 、ずれも大腸菌の TetRを酵母内で発現するようにデザインさ れたものである。 TetR遺伝子（2) (Genbank accession no. AJ307714)の発現のため のプロモーターとして、出芽酵母の elongation factor 1- a (Tefl)遺伝子プロモーター (1) (Genbank accession no. M10992)の翻訳開始点から上流 480 bpを、ターミネータ 一として PGAD424ベクター由来の alcohol dehydrogenase (adhl)遺伝子ターミネータ 一（4)を用いている。なお、プロモーターおよびターミネータ一は、酵母で機能するも のであれば上記のものに限定されない。
[0049] 図 1は、本発明の最も基本的な DNA構築物 (pTet-a)を模式的に示したものである。
TetR遺伝子は、終止コドンが取り除かれ、その 3'末端に Spel、 BamHIおよび Sad制限 酵素部位を含むクローニング部位 (MCS) (3)が挿入されている。 BamHI制限部位と S ad制限部位の間には、 3つの読み枠に対応した終止コドンが配置されている。
[0050] TetRは、分子量が約 23KDaと小さいために、拡散によって核膜孔カも核内に移行し て、自身の結合 DNA配列である TetOPに結合することができる。したがって、本プラス ミドを用いてスクリーニングに適用できるライブラリ一としては、分子量の小さなぺプチ ドをコードする DNAライブラリーに限定される。これは、大きなサイズのタンパク質をコ ードする cDNAを挿入する場合、発現される TetR融合タンパク質は、拡散による核内 への侵入が阻害されるためである。
[0051] なお、図 2および図 3に示すように核移行シグナルを付加することにより、 cDNAライ ブラリーを挿入してスクリーニングに用いることができる。
[0052] タンパク質の N末に位置することで機能するシグナル配列、およびシグナル配列を 含むタンパク質をスクリーニングする場合には、図 1の場合、クローユング部位 3を Pte flプロモーター（1)と TetR遺伝子（2)の間に移し、 DNAライブラリーを挿入してスクリ 一二ングに用いることができる。
[0053] 図 2は、図 1に示した TetR遺伝子 2の 3'末端に、緑色蛍光タンパク質（GFP) cDNA( 6)を挿入し、 TetR-GFP融合タンパク質が酵母内で発現するようにデザインされたプ ラスミド（pTetGFP-a)の模式図である。本プラスミドの構築に用いられた GFP cDNAは 、ォワンクラゲ（Aequorea victoria)由来の GFP(Genbank accession no. M6z6o3)を改 変した sGFP(Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engine ered GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 1996 Mar 1;6(3):325— 330.)であり 、さらに終始コドンを取り除いている。 GFP cDNAの 3，末端には、 Spel、 BamHIおよび S ad制限部位を含むクローユング部位（3)が挿入されている。 BamHI制限部位と Sacl 制限部位の間には、 3つの読み枠に対応した終始コドンが配置されている。なお、 G FPに相当するものとして蛍光や発光によってタンパク質の動態を観察できる可視化 可能タンパク質であれば、上記のものに限定されない。 [0054] TetR遺伝子（2)と GFP cDNA(6)の間には、核移行シグナル（5)をコードする DNA 断片が挿入されている。このため、 TetR-NLS-GFP融合タンパク質は、核内へ能動的 に移行される。核移行シグナルに用いる配列としては、 SV40ラージ T抗原由来の核 移行シグナル配列（PKKKRKV (配列番号 51))を用いることができる力 核移行を誘 導できるペプチドおよびタンパク質であればどのようなものであっても構わない。
[0055] GFPを可視化可能タンパク質として TetRに付加することにより、本来核に局在化さ れる TetR-NLS-GFP融合タンパク質に、新たなタンパク質が融合されることによって、 どのように酵母での細胞内局在性が変化するかを確認しながらスクリーニング操作を 進めることができる。
[0056] 図 2に示すプラスミドでは、 TetR- GFP融合タンパク質の C末端に、ライブラリーから のタンパク質を融合して発現するように構築されている。なお、クローユング部位（3) を Pteflプロモーター（1)と TetR遺伝子（2)の間に移し、 DNAライブラリーを挿入して 用いることで、タンパク質の N末に位置することで機能するシグナル配列およびシグ ナル配列を含むタンパク質のスクリ一ユングに適用できる。
[0057] これらのプラスミドに挿入するライブラリー由来の DNAの中で、酵母細胞内でのタン ノ ク質発現レベルが極端に低下する配列がある場合、融合タンパク質として発現さ れる TetRの発現レベルも低下することになる。このことは、 TetRによるレポーター遺伝 子の抑制状態力 STetR融合タンパク質の核質以外の細胞内特定領域への移行に非 依存的に解除されることにつながり、スクリーニングの際のバックグランドの上昇につ ながる。
[0058] これを解決するために、プラスミド pTetGF- aの LEU2マーカー遺伝子を、 TetR- GFP - LEU2融合タンパク質の形で発現するよう改変したものが pTetGF-cで、その模式図 を図 3に示す。 PCRを用いて調製した LEU2のタンパク質コード領域 7が、予め EcoRV と PvuII制限酵素処理によって、 LEU2マーカー遺伝子が除去された pTetGF-aプラス ミドの、 GFPコード領域（6)の 3，末端に挿入されている。挿入した LEU2コード領域（7 )に終止コドンは含まれず、その 3'末端には前記プラスミドと同じクローユング部位（3 )が設けられている。なお、 GFPコード領域の下流に融合されるマーカー遺伝子は、 酵母で選択可能なマーカー遺伝子由来のものであれば LEU2に限定されな!、。 [0059] 前記プラスミドと同じぐクローユング部位（3)を Pteflプロモーター（1)と TetR遺伝子 (2)の間に移し、 DNAライブラリーを挿入して用いることで、タンパク質の N末に位置 することで機能するシグナル配列、およびシグナル配列を含むタンパク質のスクリー ニングに適用できる。
[0060] 次にレポーター遺伝子の 1例の構成について説明する。基となるベクターとして pG BT9 (BD Biosciences社、 Genbank accession no. U07646)を用い、 Aatll制限部位と S phi制限部位に挟まれた DNA断片を出芽酵母の HIS3遺伝子（Genbank accession no. X03245)と交換している。このプラスミドでは、酵母での複製領域である 2 oriが取り 除かれているので、このベクターを酵母染色体挿入プラスミドとして用いる。 HIS3遺伝 子は、転写開始点から上流- 292までのプロモーター領域、タンパク質コーディング領 域および翻訳終止コドンから下流 201 bpまでのターミネータ一領域からなる。 HIS3プ 口モーターには、 -22および- 53の位置の 2力所に TetOP配列（5， - ACTCTATCATTG ATAGAGT-3，（配列番号 60))が TATAボックスを挟む形で挿入されて!ヽる。
[0061] このプラスミドの pGBT9由来 Trpl選択マーカーを指標にして、常法に従ってレポ一 ター遺伝子が染色体に組み込まれた組み換え体酵母を得る。なお、基となるベクタ 一およびレポーター遺伝子となるマーカー遺伝子は、酵母で機能するものであれば 、上述のものに限定されない。
[0062] 以上のことから、本実施の形態によれば、図 4に示されるように、 cDNAおよびぺプ チドをコードする DNAが挿入されたプラスミドライブラリーを、酵母に導入することで、 TetR融合タンパク質（11)が発現される。 TetR融合タンパク質は、核（14)内へ拡散 によって移行する力、またはベクターにコードされる核移行シグナルの働きにより、核 (14)内へ能動的に輸送される。
[0063] プラスミドを導入する宿主の酵母細胞は、レポーターおよびプラスミド選択マーカー 遺伝子として用いられる栄養要求性に関する遺伝子に変異を持ち、レポーターおよ びプラスミド選択マーカー遺伝子の働きがなければ最少培地で生育不可能な株を用 いる。さらに、用いる酵母株には、プロモーター領域に TetOP (12)が挿入されている HIS3レポーター遺伝子（13)力 染色体上に組み込まれた状態にある。
[0064] このような株では、 TetR融合タンパク質（11)力TetOP(12)に強く結合し、 HIS3レポ 一ター遺伝子（ 13)の発現を抑制するため、ヒスチジンを欠 、た酵母最少培地では 生育できない。ここで、 TetRに融合されたタンパク質およびペプチドに、核質以外の 領域への移行、つまり細胞内特定領域への移行を促す配列が含まれているとき、核 質内に存在する TetR融合タンパク質の量は減少する。それに伴って、 TetOPに結合 できる TetR融合タンパク質の量も減少するため、 HIS3レポーター遺伝子の発現が誘 導される。したがって、このようなクローンを持った酵母細胞は、ヒスチジンを欠いた最 少培地上でコロニーを形成することができる。
[0065] また、 TetRはテトラサイクリンと結合することによって、 TetOPへの結合親和性が減 少するため、培地中にテトラサイクリンおよびその類似化合物を適量加えることにより 、レポーター遺伝子の抑制レベルを調節することができる。この操作によって、スクリ 一-ングの選択圧を柔軟に調整することができる。
[0066] 以上の効果により、タンパク質およびペプチドライブラリーから、細胞内特定領域に 局在化するタンパク質を検出およびスクリーニングすることができる。
[0067] 本発明は上述の実施の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々 の構成を採り得ることはもちろんである。
[0068] 以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明について の具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例に より何ら限定されるものでない。
実施例 1
[0069] (1)ベクターの作製
出芽酵母と大腸菌で選択可能なクロー-ングベクター PGAD424 (BD Biosciences社 、 Genbank accession no. U07647)を基にして、大腸菌の TetRを酵母内で発現するよ うにデザインしたプラスミド pTetGFP- aを構築した。プラスミド pTetGFP- aの構造を図 2 に示す。
[0070] 制限酵素 Hindlllで切断後、脱リン酸ィ匕した pGAD424ベクターに、出芽酵母の elong ation factor 1- a (TEF1)遺伝子プロモーター（1) (Genbank accession no. M10992) の翻訳開始点カゝら上流 480 bpを含む DNA断片を挿入した。このプロモーター断片 Pt efl (1)は、特異的プライマー（5'- GAGAGGAGAA AAGCTTTTCGAGGACCGCGA ATCCTTAC- 3，（配列番号 47)、 5'- GAGAGGAGAA AAGCTTGAGCTCGGTACC CTCGAGTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGCTATGC-3' (配列番号 48))を 用い、出芽酵母染色体 DNAを铸型として行った PCRにより得られた DNA断片を、制 限酵素 Hindlllで切断したものである。得られたプラスミドを、制限酵素 Xholと Sadで切 断し、 TetR遺伝子（2) (Genbank accession no. AJ307714)を挿入した。 TetR遺伝子（ 2) DNA断片は、特異的プライマー（5し GAGAGGAGAACTCGAGGCCATGGGTTC TAGATTAGATAAAAGTAAA GTG- 3，（配列番号 49)、 5'- GAGAGGAGAAGAGCT CTTAGGATCCACTAGTTCTAGAAGACCC ACTTTCACATTTAAG- 3 ' (配列番 号 50))を用い、 TetR遺伝子を含んだ大腸菌ゲノム DNAを铸型として行った PCRによ り得られた DNA断片を、制限酵素 Xholと Sadで切断したものである。得られたプラスミ ドを、制限酵素 Spelと Sadで切断し、 SV40ラージ T抗原由来の核移行シグナル配列（ PKKKRKV (配列番号 51)) (5)をコードする DNA断片が 5'末端に付カ卩された GFP cD NA (6)を挿入した。挿入した GFP cDNA(6)は、ォワンクラゲ（Aequorea victoria)由 来の GFP(Genbank accession no. M62653)を改変した sGFP(Chiu W.， Niwa Y.， Zen g W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plant s. Curr. Biol. 1996 Mar 1;6(3):325- 330.)をコードするものであり、特異的プライマー（
TGAGCAAGGGCGAG-3 ' (配列番号 52)、 B: 5'- GGAGAGTGCTGAGCTCAACTA
CCTTGTACAGCTCGTCCATG-3 ' (配列番号 53))を用い、 sGFP cDNAを铸型とし て行った PCRにより得られた DNA断片を、制限酵素 Nhelと Sadで切断したものである 。プライマー Aには、 sGFPの N末をコードする配列と、その 5'末端に核移行シグナル 配列をコードする DNA配列が含まれている。また、プライマー Bには、終止コドンが取 り除かれた sGFPの C末をコードする配列と、その 5'末端に Spel、 BamHIおよび Sad制 限酵素部位が含まれている。 PCRにより調製された、全ての DNA断片の塩基配列は 、シークェンシングにより確認されている。
以上の工程を経て構築されたプラスミド pTetGFP- aは、 pGAD424プラスミドに存在 する 2箇所の Hindlll制限酵素部位の間に、 Pteflプロモーター（1)、 TetR遺伝子（2) 、核移行シグナル配列（5)、 GFP cDNA(6)、 Spelおよび BamHI制限酵素部位を含む クロー-ング部位（3)が順に配置されている。また、クローユング部位の下流には、 p GAD424ベクター由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（adhl)遺伝子ターミネータ一（4 )が配置されている。酵母での選択マーカーである LEU2 (7)、大腸菌での選択マー カー amp1" (9)、酵母におけるプラスミド複製制御領域 2 ori (lO)、大腸菌におけるプ ラスミド複製制御領域 ColEl ori (8)は、 pGAD424に元々存在するものである。
[0072] (2)ライブラリープラスミドの作製
上記で作製した pTetGFP- aプラスミドに、ペプチドをコードする合成 DNAを挿入した ライブラリーを作製した。
[0073] 用いた合成 DNAは任意の塩基を含む 2つのタイプの配列カゝら構成された。 1つは、 36の連続した任意塩基を含む 12Xで、 12のランダムなアミノ酸配列を持つペプチド を、酵母内で発現するように意図されたタイプのものである。このランダムペプチド配 列の中に、細胞内特定領域への移行を促す配列が含まれるとき、本スクリーニングシ ステムによって、それらの配列をクローユングできることが期待された。
[0074] もう 1つのタイプは、核外移行シグナルの既知コンセンサス配列 {L X X X (L/I/F/ M/V) X X L X (L/I) ;Xは任意アミノ酸を示す。（配列番号 54)}をコードする NESXで、 その塩基配列は、 5， - CTC NNN NNN NNN NT(G/C) NNN NNN CTC NNN (A/C)T C-3，（配列番号 55)であった。核外移行シグナルの働きで、 TetR-GFP融合タンパク 質が核力 細胞質へ排出され、本スクリーニングシステムによって真に核外移行活性 を持った配列を抽出できることが期待された。
[0075] これらの配列の 5 '末端側には、 Xbal制限酵素部位を含む配列 5 ' -AGAGCCATCT AGAAACTTTGAGAAGGAGAATACCATG-3 ' (配列番号 56)が付加され、 3 '末端 側には、 BamHI制限酵素部位および FLAGタグ（DYKDDDDK (配列番号 57))をコー ドする配列 5，- GACTACAAGGACGATGACGACAAGGGATCCGGTCAAA-3' (配 列番号 58)が付加された。ベクターに挿入するライブラリー DNAを調製するために、 5 '末端側配列を含んだプライマーおよび 3 '末端側配列のプライマー (5 ' - TTTGACC GGATCCCTTGTCGTCATC- 3，（配列番号 59))を用い、 12Xまたは NESX合成オリゴ ヌクレオチドを铸型として、 PCRを行った。増幅された DNA断片を Xbalと BamHIで消化 後、精製を行い、 pTetGFP- aベクターの Spel-BamHI部位に挿入した。
[0076] (3) HIS3レポーター遺伝子を組み込んだ酵母株の作製
HIS3遺伝子プロモーター領域に TetOP配列を組み入れた DNA構築物の作製は、 以下のように行った。 pGBT9 (BD Biosciences社、 Genbank accession no. U0764oノの 、 Aatll制限部位と Sph淛限部位に挟まれた DNA断片を出芽酵母の HIS3遺伝子 (Gen bank accession no. X03245)と交換した。 HIS3遺伝子は、転写開始点から上流- 292 までのプロモーター領域、タンパク質コーディング領域および翻訳終止コドンから下 流 201 bpまでのターミネータ一領域からなるものとしたが、 HIS3プロモーターには、 -2 2および- 53の位置の 2力所に TetOP配列（5 ' - ACTCTATCATTGATAGAGT- 3 ' (配 列番号 60))が TATAボックスを挟む形で挿入した。このプラスミドでは、酵母での複製 領域である 2 oriが取り除かれている。この DNA構築物を酵母染色体挿入プラスミド として用いた。
[0077] 得られたプラスミドを、 PvuIIで切断後、出芽酵母 SFY526 (BD Biosciences社）に導 入し、 HIS3レポーター遺伝子組み換え酵母株を得た。この酵母株はヒスチジンを欠 いた SD基本培地で生育した力 pTetGF-aプラスミドを導入することによって、ヒスチジ ンを欠いた SD基本培地で生育できなくなることが確認された。
[0078] (4)ライブラリーのスクリーニング操作
HIS3レポーター遺伝子を組み込んだ酵母株を、 100 mlの YPD液体培地を用いて 0 D が約 1.0になるまで培養し、ライブラリープラスミド 30 μ gを用いて、酢酸リチウム法
600
によって酵母を形質転換した。プラスミドを導入した酵母細胞を、ロイシンとヒスチジン を欠いた SD寒天培地を用いて、 30°Cで 5日間培養した。生じたコロニーをまとめて回 収し、抽出したプラスミドを大腸菌に形質転換した。この大腸菌力もプラスミドを調製 し、シークェンス解析を行うとともに、酵母（出芽酵母 SFY526)に再導入し、 TetR-GF P融合タンパク質の細胞内局在性について、 GFP蛍光観察による確認を行った。また 、スクリーニング前のライブラリープラスミドについても、同様に、酵母に再導入して GF P蛍光観察を行った。
[0079] このスクリーニング操作によって得られた結果は以下の通りであった。プラスミド 1 μ g当たりの酵母形質転換率は、 2xl04〜5xl04であった。一次スクリーニングの結果、ヒ スチジンを欠いた SD基本培地上に出現したコロニーの総数は、 12Xペプチドライブラ リーで 800〜1000個、 NESXライブラリーで 1.0xl04〜1.5xl04個のコロニーが形成され た。
[0080] スクリーニング前の NESXライブラリーを導入した酵母について、 GFPの蛍光観察を 行ったところ、半分以上の細胞で TetR-GFP融合タンパク質が核に局在していた。こ のことは、このライブラリ一中には核外移行活性を示さな 、多くの配列が含まれて!/ヽ ることを示している。 NESXライブラリーにおいて、このように多くの核外移行活性を含 まないクローンが存在するのは、 NESXライブラリー DNA中に生じる終止コドンによる 影響と、既知の核外移行シグナルのコンセンサス配列が完全なものではな 、と!、ぅ理 由による。
[0081] 一方、スクリーニング後の NESXライブラリーを導入した酵母では、ほとんどの細胞に ぉ 、て TetR-GFP融合タンパク質の蛍光が細胞質または細胞全体に広がって 、た。 このことは、スクリーニングによってライブラリーから選択されたほとんどのプラスミドは 、核外移行活性のある配列を含んでいることを示すとともに、本スクリーニングシステ ムが有効に機能していることを示す。
[0082] NESXライブラリーからのスクリーニングによって選抜された、 30個のプラスミドクロー ンについてシークェンスを行い、それらの配列力 翻訳されるペプチド配列を図 5に 示した。これらの配列は、すべて核外移行活性を持つことが、各々のプラスミドを酵母 に再導入して観察された、 GFPの細胞内局在性によって確認された。
[0083] さらに、 12Xライブラリーからのスクリーニングによって選抜された、 17個のプラスミド クローンについてシークェンスを行い、各配列から翻訳されるペプチド配列を図 6に 示した。これらのプラスミドクローンを酵母に再導入し、 GFPの細胞内局在性を観察し た結果を、各配列の右に示した。多くのクローンが核小体への移行を示し、そのうち の 4クローンは核内に顆粒状または繊維状に不均一な分布を示した。また、 1クロー ンが未特定の細胞内小顆粒への移行を示し、 4クローンにつ!/、ては GFPの蛍光を確 認できなかった。
[0084] この実施例は、本発明によるスクリーニングシステムを用いることによって、多くのタ イブの細胞内移行シグナルおよび移行タンパク質をスクリーニングおよび同定できる ことを示すものである。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、細胞内特定領域に局在化するタンパク質を検出でき、また、タン パク質ライブラリーからスクリーニングできる。

Claims

請求の範囲
[1] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テ トラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DNA構築 物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記レポーター遺伝子の発現を 検出することを含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在 化する活性を検出する方法。
[2] 請求項 1記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質 以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を 選択することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク 質をスクリーニングする方法。
[3] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テ トラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DNA構築 物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記レポーター遺伝子の発現を 検出し、（3)前記レポーター遺伝子の発現が検出された酵母力 前記 DNA構築物を 回収することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク 質をコードする核酸を取得する方法。
[4] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テ トラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タン パク質を発現する DNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記 レポーター遺伝子の発現を検出し、（3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の 保持する前記 DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特 定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定することを含む、タンパク質の、 真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
[5] 請求項 4記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の細胞 内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択するこ とを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする 方法。
[6] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テ トラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タン パク質を発現する DNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、（2)前記 レポーター遺伝子の発現を検出し、（3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の 保持する前記 DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特 定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定し、（4)前記融合タンパク質の細 胞内特定領域への局在が認められた酵母力 前記 DNA構築物を回収することを含 む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取得す る方法。
[7] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、（2)テ トラサイクリンリブレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する DNA構築 物、および、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク質の、 真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。
[8] (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、（2)テ トラサイクリンリブレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タン パク質を発現する DNA構築物、（3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段、（4 )DNA構築物力も発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可 視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、（5)前記融合タンパク質の 細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記 DNA構築物を回収する手段を 含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシス テム。
PCT/JP2005/022581 2004-12-08 2005-12-08 細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム WO2006062169A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006546756A JPWO2006062169A1 (ja) 2004-12-08 2005-12-08 細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004355944 2004-12-08
JP2004-355944 2004-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006062169A1 true WO2006062169A1 (ja) 2006-06-15

Family

ID=36577992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/022581 WO2006062169A1 (ja) 2004-12-08 2005-12-08 細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2006062169A1 (ja)
WO (1) WO2006062169A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001522598A (ja) * 1997-11-10 2001-11-20 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション タンパク質相互作用を記録するための検出システムおよび機能的関係
WO2002050259A2 (en) * 2000-12-18 2002-06-27 National Research Council Of Canada Compositions, methods and kits for identifying protein-protein interaction disrupting agents

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001522598A (ja) * 1997-11-10 2001-11-20 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション タンパク質相互作用を記録するための検出システムおよび機能的関係
WO2002050259A2 (en) * 2000-12-18 2002-06-27 National Research Council Of Canada Compositions, methods and kits for identifying protein-protein interaction disrupting agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIH H M ET AL: "A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP.", PROC NATL ACAD SCO USA., vol. 93, no. 24, 1996, pages 13896 - 13901, XP002916531 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006062169A1 (ja) 2008-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Transcriptional repression in Saccharomyces cerevisiae by a SIN3-LexA fusion protein
Jansen et al. Drag&Drop cloning in yeast
Bouley et al. The PDZ domain of OutC and the N-terminal region of OutD determine the secretion specificity of the type II out pathway of Erwinia chrysanthemi
JP2001512684A (ja) 新規のｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子配列およびそれらの使用方法
JP7521028B2 (ja) 標的タンパク質への検出可能なタグのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ制御組み込みに基づく細胞の選択方法
EP2268810B1 (en) Method of modifying target region in host dna and selectable marker cassette
WO2008049837A2 (en) Improved alpha factor signal peptide for producing a polypeptide
Annilo et al. Nuclear import and nucleolar accumulation of the human ribosomal protein S7 depends on both a minimal nuclear localization sequence and an adjacent basic region
EP1098987B1 (en) Method for transformation of animal cells
WO2021110119A1 (zh) 一种高活性转座酶及其应用
Rutgers et al. In vivo and in vitro analysis of structure-function relationships in ribosomal protein L25 from Saccharomyces cerevisiae
JP3689920B2 (ja) マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
Fahrenkrog et al. The yeast nucleoporin Nup53p specifically interacts with Nic96p and is directly involved in nuclear protein import
Mereshchuk et al. The yeast 2-micron plasmid Rep2 protein has Rep1-independent partitioning function
WO2006062169A1 (ja) 細胞内特定領域局在化タンパク質・ペプチドをスクリーニングするシステム
Nika et al. Ribosomal protein L9 is the product of GRC5, a homolog of the putative tumor suppressor QM in S. cerevisiae
US9611486B2 (en) Constructs and method for regulating gene expression or for detecting and controlling a DNA locus in eukaryotes
WO2015163745A1 (ko) 바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주
JP2004538002A (ja) 停止コドン抑制による組み換え遺伝子発現の新規方法
Tai et al. AtBS14a and AtBS14b, two Bet1/Sft1‐like SNAREs from Arabidopsis thaliana that complement mutations in the yeast SFT1 gene1
Stearman et al. YIpDCE1–an integrating plasmid for dual constitutive expression in yeast
KR101692966B1 (ko) 세포벽 결함 효모 변이주를 이용한 재조합 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 스크리닝 방법
EP3027752B1 (en) Signal sequence for protein expression in pichia pastoris
KR100631484B1 (ko) Ｐｌｋ1(Ｐｏｌｏ-ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ) Ｃ-말단 유래펩타이드 및 이를 이용한 Ｐｌｋ1 타겟 단백질의 스크리닝방법
Nonaka et al. Marker-free Insertion of a Series of C-terminal Epitopes Based on the 50: 50 Method in Saccharomyces cerevisiae

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006546756

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05814612

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1