CN1234720C - 记录蛋白质相互作用及功能关系的检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了复杂蛋白质相互作用和蛋白质功能关系的检测方法，以及实施这些方法所用的试剂。

Description

记录蛋白质相互作用及功能关系的检测系统
发明背景
本发明涉及蛋白质相互作用检测系统。
遗传分析是了解调节生物过程的蛋白质网络的工具。遗传学家进行的操作(例如，温敏突变体的分离，双突变体的构建和分析，以及F1和F2子代的产生和观测)定义了基因间的关系。基因间的这些抽象关系常常反映了基本生物事实。例如，上位性关系可提示：一个基因正常地作用于另一个基因，使产生一种表型；等位特异性抑制关系可提示：两个基因产物物理地相互作用(Hartman和Roth，遗传学进展(Adv.Genet.)17：1-105(1973)；Jarvik和Botstein，美国国家科学院院报70：2046-50(1973))，依赖关系可提示：一个基因产物的作用在时间上优先于另一个基因产物的作用(Hereford和Hartwell，分子生物学杂志84：445-61(1974))。
从这些遗传操作中得到的信息的特点是质量非常高，但要获得这些信息常常非常困难。近来对新编码序列识别速率的提高重新唤起了人们对用于了解基因功能的全局系统方法的兴趣。这些方法包括“双杂交体”或“相互作用俘获”法，它们已开发用于测定一个单饵与相互作用蛋白质之间的接触(Fields和Song，自然340：245-6(1989)；Chien等，美国国家科学院院报88：578-82(1991)；Cyuris等，细胞75：791-803(1993)；Durfee等，基因发展(Genes Dev.)7：555-69(1993)；Estojak等，分子与细胞生物学15：5820-9(1995))。这些系统中两种蛋白质之间的接触定义了一种物理关系，这种关系经常在生物学上具有重要意义。
发明概述
总的来说，本发明的特征在于用于检测蛋白质之间相互作用的方法，该方法涉及：(a)提供一个宿主细胞，它含有(i)一个第一报道基因，其可通过操作与包括第一蛋白质结合位点的DNA序列相连；(ii)一个第二报道基因，其可通过操作与包括第二蛋白质结合位点的DNA序列相连；(iii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，所述结合部分能特异性结合到第一蛋白质结合位点上；(iv)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第二蛋白质，所述结合部分能特异性结合到第二蛋白质结合位点上；和(v)一个表达第三融合蛋白的第三融合基因，该第三融合蛋白包括一个与基因活化部分共价结合的第三蛋白质；(b)测量第一报道基因的表达输出，作为第一蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；(c)测量第二报道基因的表达输出，作为第二蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；(d)解释步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果，由此(i)第一报道基因和第二报道基因二者输出的增加指示第三融合蛋白与第一和第二融合蛋白相互作用；(ii)第一报道基因输出增加而第二报道基因输出不增加，指示第三融合蛋白与第一融合蛋白相互作用，而不与第二融合蛋白作用；(iii)第二报道基因输出增加而第一报道基因输出不增加，指示第三融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，而不与第一融合蛋白作用；(iv)第一和第二报道基因的输出均没有变化，指示第三融合蛋白不与第一或第二融合基因相互作用。
在一个优选的实施方案中，该方法还涉及将步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果与用下述宿主细胞测得的表达输出结果进行比较，所述宿主细胞是(a)一个第一比较宿主细胞，它含有(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括与能特异性结合到蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的第一蛋白质；和(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的第三蛋白质；或者(b)一个第二比较宿主细胞，它含有(i)可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括与能特异性结合到蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的第二蛋白质；和(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的第三蛋白质；或者(c)第一比较宿主细胞和第二比较宿主细胞。此外，在多个“双饵”细胞之间或者在一个“双饵”细胞和多个“单饵”细胞之间或者在二者之间可以进行许多种比较。
在另一个优选的实施方案中，至少第一或第二报道基因之一的表达水平可以降低；第一或第二蛋白质结合位点之一是四环素操纵基因；第一或第二报道基因之一是URA3或lacZ；第一或第二报道基因之一产生一个可被第二细胞接收和检测的信号；宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞；第一和第二报道基因可以同时表达；第一蛋白质和第二蛋白质是等位变体。
在第二个方面，本发明的特征在于一种检测蛋白质的方法，该蛋白质介导另一种蛋白质的状态变化，所述方法涉及：(a)提供一个宿主细胞，它含有(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，所述结合部分能特异性结合到蛋白质结合位点上；和(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括一个能与第一蛋白质相互作用并且与基因活化部分共价结合的第二蛋白质，其中至少第一或第二蛋白质之一可以显示状态变化；(b)使第一和第二蛋白质相互作用；(c)测量报道基因的表达，作为第一蛋白质和第二蛋白质之间相互作用的量度；(d)向细胞中引进一个表达第三蛋白质的第三基因；(e)测量报道基因的表达，在第三蛋白质存在下报道基因表达的变化指示，第三蛋白质介导第一或第二蛋白质的状态变化，从而导致第一蛋白质和第二蛋白质相互作用的能力改变。
在一个相关方面，本发明的特征在于另一种检测蛋白质的方法，该蛋白质介导另一种蛋白质的状态变化，所述方法涉及：(a)提供一个第一宿主细胞，它含有(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，所述结合部分能特异性结合到第一蛋白质结合位点上；和(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括一个能与第一蛋白质相互作用并且与基因活化部分共价结合的第二蛋白质，其中至少第一或第二蛋白质之一可以显示状态变化；(b)使第一和第二蛋白质相互作用；(c)测量第一宿主细胞中报道基因的表达，作为第一蛋白质和第二蛋白质之间相互作用的量度；(d)提供一个第二宿主细胞，它含有(i)可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；(ii)表达第一融合蛋白的第一融合基因；(iii)表达第二融合蛋白的第二融合基因；(iv)表达第三蛋白质的第三基因；(e)使第一和第二蛋白质在第三蛋白质的存在下相互作用；(f)测量第二宿主细胞中报道基因的表达，作为在第三蛋白质存在下第一蛋白质和第二蛋白质之间相互作用的量度，与在第一宿主细胞中测得的报道基因表达相比，在第二宿主细胞中报道基因表达的变化指示，第三蛋白质介导第一或第二蛋白质的状态变化，从而导致第一蛋白质和第二蛋白质相互作用的能力改变。
在上述各方法的优选实施方案中，状态的变化是构象变化；显示构象变化的蛋白质是Ras蛋白质；宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞；第一融合蛋白和第三蛋白质为响应细胞外刺激而发生表达；报道基因产生可被第二细胞接收和检测的信号。
在另一个相关方面，本发明的特征在于一种细胞，它包括(i)一个可通过操作与包括第一蛋白质结合位点的DNA序列相连的第一报道基因；(ii)一个可通过操作与包括第二蛋白质结合位点的DNA序列相连的第二报道基因；(iii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，所述结合部分能特异性结合到第一蛋白质结合位点上；(iv)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第二蛋白质，所述结合部分能特异性结合到第二蛋白质结合位点上；和(v)一个表达第三融合蛋白的第三融合基因，该第三融合蛋白包括一个与基因活化部分共价结合的第三蛋白质。
在优选的实施方案中，至少第一或第二报道基因之一的表达水平可以降低；第一或第二蛋白质结合位点之一是四环素操纵基因；第一或第二报道基因之一是URA3或lacZ；第一或第二报道基因之一产生一个可被第二细胞接收和检测的信号；宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
在另一个相关方面，本发明的特征在于一种报道基因，它包括一个可通过操作与编码可检测产物的基因(例如URA3基因或lacZ基因)相连的四环素操纵基因。
在最后一个方面，本发明的特征在于一种检测候选蛋白质是否与转录激活物相互作用的方法，该方法涉及：(a)提供一个宿主细胞，它含有(i)一个表达水平可以降低的报道基因，该报道基因通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连；(iii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，该第一融合蛋白包括与结合部分共价结合的转录激活物，所述结合部分能特异性结合到蛋白质结合位点上；和(v)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，该第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的候选蛋白质；(b)检测报道基因表达的增加，作为候选蛋白质与转录激活物之间相互作用的指示。
在优选的实施方案中，报道基因是URA3基因；表达水平是由6-氮尿嘧啶降低的；蛋白质结合位点是四环素操纵基因；表达水平是由四环素或四环素衍生物降低的；宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
“报道基因”是指其表达可以被测定的核酸序列；这类基因包括但不限于lacZ，氨基酸生物合成基因，和哺乳动物氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。例如，报道基因可以通过细胞活力的变化或颜色反应来测定。
“表达输出”是指报道基因表达的任何可测量的变化。
“蛋白质结合位点”是指可被蛋白质或肽识别和结合的核酸序列。
“转录激活物”是指能够增加其结合的基因的表达的氨基酸序列。“基因活化部分”是指能够增加基因表达的这种转录激活物的全部或一部分。
“四环素衍生物”是指与四环素有关并能抑制四环素阻抑物与四环素操纵基因结合的化合物。举例性的四环素衍生物是无水四环素。
“状态的变化”是指蛋白质的改变其活性的任何物理或化学变化。状态变化的实例包括磷酸化模式或构象的变化。
通过下列详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
详细描述
首先描述附图。
附图的描述
图1A-1C是一系列三组实验对象，它们用图示说明了本发明的例举性双饵相互作用阱。在细胞1(图1A)中，在葡萄糖培养基上，转录惰性的四环素阻抑物(TetR)融合基因(饵1，Ba1)和LexA融合基因(饵2，Ba2)分别结合到报道基因的Tet和LexA操纵基因上游。与转录激活域B42融合的潜在的相互作用蛋白质未表达(Gyuris等，细胞75：791-803(1993))。在此系统中，报道基因均未被激活，细胞在5-氟乳清酸(5-FOA)培养基上生长而不在无尿嘧啶培养基上生长，并且细胞在5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Xgal)培养基上是白色的。在细胞2(图1B)中，在半乳糖和棉子糖培养基上，一种与B42融合的蛋白质-“牺牲者1”被表达，但是没有与任何一个饵相互作用。报道基因未被激活，细胞在5-FOA上生长或者不在无尿嘧啶培养基上生长，并且在Xgal上是白色的。在细胞3(图1C)中，在半乳糖和棉子糖培养基上，另一个牺牲者-“牺牲者2”被表达并与Ba1相互作用，但不与Ba2相互作用。在该细胞中，URA3报道基因被选择性表达，细胞在无尿嘧啶培养基上生长，但在Xgal上是白色的。
图2是一张表，显示了记录有关相互作用关系A1和A2的逻辑“与”和判别关系(“Ls1”和“Ls2”)的细胞。细胞含有所示的饵和牺牲蛋白质；牺牲者仅在半乳糖和棉子糖培养基上表达。在所示培养基上的生长或蓝色反应指示了报道基因输出。对于“与”关系来说，牺牲蛋白质与两个饵接触并激活两个报道基因(TetOp-URA3和LexOp-LacZ)。对于Ls1关系来说，牺牲蛋白质仅与LexA融合基因饵接触，并仅激活LexOp-LacZ报道基因。类似地，在Ls2关系中，牺牲蛋白质仅与TetR融合基因饵接触，并仅激活TetOp-URA3报道基因。
图3A-3C是一系列结果，显示了记录有关输出蛋白质的逻辑与运算的细胞。图3A是一张显示LexOp-LacZ报道基因在CWXY2细胞1和2中的表达的表；表达由在LHWK/Gal+Raff+Xgal平板(见下文)上的蓝色强度以及它们的β-半乳糖苷酶活性(以Miller单位表示)来指示。图3B用图式说明了在Gal+Raff+Xgal培养基(见下文)上的、带有TetR-Cdc25(907-1589)或TetR-GAP的两个细胞。在Gal+Raff平板上的细胞1中，TetR-Cdc25给LexA-RasA186加载上GTP，使得更多的B42-c-Raf1结合并使LexAOp-lacZ报道基因的转录增加。在细胞2中，TetR-GAP刺激Ras GTP酶活性，使得更多的LexA-Ras为GDP形式，从而导致较少的B42-c-Raf1结合，并使LexAOp-lacZ报道基因的转录降低。图3C是一张真值表，描述了有关蛋白质输入的运算结果。在该图中，第二列中的“1”分别表示存在TetR-Gap或TetR-Cdc25，第三列中的“0”或“1”分别表示低或高输出的β-半乳糖苷酶。
图4用图式说明了产生可被生产者细胞或第二、受体细胞阅读的输出的细胞。
图5用图式说明了具有四个输入-输出通道的细胞。
图6用图式说明了充当晶体管的整个生物学回路。
如本文所述，本发明提供了用于检测或记录两个或多个蛋白质之间的复合关系的方法和试剂。许多这样的关系，例如，“桥连”(或连接)和“判别”相互作用，可用于了解基因功能。如下所述，通过对新的和现有的双杂交细胞相互作用的表型输出进行逻辑运算，可以确定各途径和复合物中蛋白质功能的详细模型。由这些细胞检测的蛋白质关系与经典遗传关系如上位关系类似，但它们可以在严格的分析准则内进行解释，并且它们可以针对整个基因组的产物系统地进行。此外，记录这类关系的细胞可以就蛋白质输入进行逻辑运算，并因此可以定义构造生物学计算装置的路径。
初步考虑：双杂交系统中的蛋白质逻辑关系
在经典的(“单饵”)双杂交系统中，报道基因的输出取决于与DNA结合的饵和激活标记的牺牲者之间的相互作用。由一些报道基因，例如URA3表达的遗传标记允许对报道基因的转录进行选择，并因此缺乏相互作用(Le Douarin等，核酸研究23：876-8(1995))。这些系统中的蛋白质之间的关系可以用符号逻辑项来描述。
从这方面来考虑，饵(Ba1)和牺牲者(P1)间的接触定义了一个变量(A1)，此处叫做接触关系。由于A1是由报道基因输出运算定义的，因此A1项也用来指报道基因输出。关于此关系有四种可能的布尔运算或函数(Schneeweiss，布尔函数：工程学应用与计算机程序(Springer-Verlag，Berlin，New York，1989))。其中两种是常数函数：F1(A1)＝0和F2(A2)＝1，两种是真函数：F3(A1)＝A1和F4(A1)＝非A。
在单饵系统中，报道基因输出的表型结果可记录这些有关接触关系的运算中的两种-F3和F4。结果显示在表1中。在该表中，A1表示饵Ba1和牺牲者P1之间的接触关系，该关系由报道基因的输出来测量。因此，A1值(0和1)指的是接触关系的计算结果和报道基因的断续状态。“A1值”显示了两种可能的A1值(0和1或断开和连续)。“运算”显示了有关A1的两种容许的运算(函数)。两小列“运算结果”指的是关于A1的运算结果。“替代名称”给出了这些运算的俗名。“解释”描述了饵和牺牲者蛋白质之间相互作用的状态。“定义表型”给出了单饵系统中接触关系的表型，“生物学关系举例”给出了可导致这类输出的生物学状况的实例。
在表1中，F3和F4都具有重要的生物学关系。从单饵系统考虑，其中Ba1和P1间的接触(例如由于这些蛋白质发生异源二聚合)产生了一个正输出(在X-Gal上为蓝色，在无尿嘧啶培养基上生长)，而没有这种接触(例如由于突变或被肽aptamer破坏)(Colas等，自然380：548-550(1996))则产生一个负输出(在X-Gal上为白色，在5-FOA培养基上生长)(表1)。在5-FOA培养基上生长的细胞与进行有关接触关系的逻辑非运算的装置类似，或者另一方面，作为记录状态(非A1)的细胞。
检测更复杂蛋白质关系的细胞
构建可同时选择和对抗两种不同蛋白质间相互作用的细胞(图1A-1C)。这种双饵相互作用阱利用了LexA和TetR的DNA结合部分，LexA和TetR是细菌转座子Tn10的四环素阻抑物(Gossen和Bujard，国家科学院院报89：5547-51(1992))。LexA和TetR融合饵蛋白质是在酵母细胞中表达的，该酵母细胞中还含有整合型TetOp-URA3报道基因和附加型LexAOp-lacZ报道基因。饵在这些“双饵”细胞中的表达处于ADH1启动子的控制下。TetOp-URA3报道基因整合到LYS2基因中。pSH18-34的衍生物-LexAOp-lacZ报道基因携带在pCXW24上，pCXW24是带有LYS2标记的2μm质粒。牺牲者载体是pJG4-5，其GAL1启动子有条件地指导激活标记的蛋白质从2μm TRP1质粒的表达(Gyuris等，细胞75：791-803(1993))。
双饵相互作用阱中有关接触关系的逻辑运算
在双饵细胞中，两种接触关系(和相应的报道基因的输出)表达为布尔变量A1和A2。关于这些变量有16种可能的运算(Schneeweiss，布尔函数：工程学应用与计算机程序(Springer-Verlag，Berlin，New York，1989))，其中4种记录在这些细胞中。这些运算称作“与”、“或非”，以及两种判别运算-逻辑状态1(Ls1)和逻辑状态2(Ls2)。“与”、“Ls1”和“Ls2”被认为代表了特别有用的确定蛋白质功能的运算。这些运算综合显示在表2中。在该表中，A1表示Ba1和P1之间的接触关系，该关系由TetOp-URA3报道基因的输出来测量。A2表示Ba2和P2之间的接触关系，该关系由LexAOp-lacZ报道基因的输出来测量。A1和A2值(0和1)再次用于指接触关系的计算结果和报道基因的计算结果(断续状态)。四小列“变量值”表示两个变量值的可能的四种不同组合。“运算”显示了在此系统中有关这些变量的四种可能的运算。“替代名称”给出了这些运算的常用名。“解释”描述了饵和牺牲者蛋白质之间相互作用的状态。“定义表型”给出了单饵系统中接触关系的表型，“生物学关系举例”给出了可导致这类输出的生物学状况的实例。
为了测试该系统的一般利用，使用一组说明性蛋白质，称作RasA186，RasA15A186，RasV12A186，GAP，hSos1(残基601-1019)，Cdc25(残基907-1589)，c-Raf1(残基1-313)，Max和Mxil。Harveyras基因产物Ras是一种GTP酶，它以两种不同构象存在，一种是与GDP结合的(失活)形式，一种是与GTP结合的(活化)形式。Ras在这些构象之间循环的事实使得它是控制细胞增殖的信号转导途径中的开关蛋白质(Boguski和McCormack，自然366：643-654(1993))。本文中所述的所有Ras蛋白质的186位上Cys变化为Ala，这使得法尼基化位点失活，蛋白质的表观核浓度增加。RasA186以GDP和GTP结合形式的混合物存在，而RasA15A186和RasV12A186分别主要以GDP和GTP结合形式存在。刺激Ras的GTP酶活性的GAP结合到与GTP结合的Ras上。c-Raf1是Ras的一个下游目标，它也结合与GTP结合的Ras。与此相对，hSos1和Cdc25二者均激活Ras，它们仅结合到与GDP结合的Ras上。Max和Mxil紧密地异源二聚合，它们用作阳性对照(Zervos等，细胞79：388(1993))。
图2显示了记录逻辑与运算的双饵细胞。该关系是由可以与两个饵相互作用的蛋白质完成的，诸如各种途径中的桥连蛋白质。在该实验中，携带B42-RasA186的酵母菌株CWXY2作为牺牲者，TetR-c-Raf1和LexA-hSos1作为饵，TetOp-URA3和LexAOp-lacZ作为报道基因。B42-RasA186与TetR-c-Raf1和LexA-hSos1均相互作用。细胞在Xgal上是蓝色的，并且在没有尿嘧啶的培养基上生长。这种桥连或连接关系与“Ras与两种蛋白质均相互作用”的观念一致，并且提示：激活两种报道基因的蛋白质可以从基因组范围的筛选(genome-widescreens)中选择。
另外，图2显示了还记录判别关系-Ls1和Ls2的双饵系统。这些关系预期在与一种饵相互作用而不与另一种饵作用的蛋白质中存在。此时，在表达TetR-RasV12A186和LexA-Max饵以及B42-c-Raf1牺牲者的细胞中，Ras-Raf相互作用激活了TetOp-URA3报道基因，这些细胞在没有尿嘧啶的培养基中生长；Raf不与LexA-Max相互作用，因此不激活lacZ报道基因。另一方面，在表达TetR-RasV12A186和LexA-Max饵以及B42-Mxil牺牲者的细胞中，Max-Mxil相互作用激活了LexAop-LacZ报道基因，这些细胞在Xgal上变为蓝色；Mxil不与Ras相互作用，因此不激活URA3报道基因。
此外，图2中的结果显示：这些细胞可以把两种密切相关的等位变体区别开来。在表达TetR-RasA15A186、LexA-RasV12A186和B42-c-Raf1的细胞中，Raf/RasV12A186相互作用激活了LexAop-LacZ报道基因的表达；这些细胞在Xgal上变蓝，但不在没有尿嘧啶的培养基上生长。与此相对，在表达TetR-RasA15A186、LexA-RasV12A186和B42-Cdc25的细胞中，Cdc25/RasA15A186相互作用激活了TetOp-URA3报道基因，并允许这些细胞在没有尿嘧啶的培养基上生长，但使其在Xgal上保持白色。此结果提示，这些细胞可以从基因组文库或组合文库中鉴别出与对疾病状态具有特异性的等位蛋白质变体相互作用的蛋白质和肽。
将等位变体区别开的肽aptamers的鉴别
用含有TetR-RasV12和LexA-RasA15的双饵细胞来分离特异性地与RasV12相互作用的肽aptamer文库中的成员。URA+文库转化体针对lacZ-细胞进行筛选，据推测lacZ-细胞含有不与LexA-RasA15相互作用的aptamers。然后将编码aptamers的质粒从这些lacZ+细胞中拯救出来并重新确认它们的表型。使用该系统，鉴别出两种有差别的aptamers-Pep22和Pep104。Pep22既与RasV12相互作用，也与RasA15相互作用，相反，Pep104仅与RasV12相互作用。特别是，含有Pep22的细胞在无尿嘧啶培养基上生长，并且在X-gal培养基上为蓝色。含有Pep104的细胞在无尿嘧啶培养基上生长，但在X-gal培养基上为白色。这些结果证明了该系统在特异性肽aptamers的选择中的功用。对于Pep22，第二个饵通过消除潜在的假阳性而增加了该系统的选择性，所述假阳性有可能是由于单报道基因的假象激活引起的。对于Pep104，第二个饵容许检测对在信号转导中有活性的蛋白质等位形式具有特异性的aptamers。Pep22和Pep104的序列分别是DMDWFFRFYASVSRLFRHLH(SEQ ID N0：15)和FWQATLRLVS DKLILLYPDP(SEQ ID NO：16)。
有关蛋白质输入的逻辑运算
细胞也可以对蛋白质输入进行逻辑运算，并通过在输出中的改变记录那些运算的结果。图3A-3C显示了有关蛋白质输入的逻辑与运算。在表达LexA-RasA186、B42-c-Raf1和TetR-GAP的细胞中，LexAop-lacZ报道基因的输出低(在Xgal培养基上为淡蓝色)，大概是由于GAP使大多数Ras成为与GDP结合的构象状态。相反，TetR-Cdc25的输入增加了RasA186/c-Raf1相互作用，正如在Xgal平板上的蓝色的强度所显示的，大概是由于Ras变成了Raf结合构象。在该实验中，细胞有两个输入，其中之一-B42-c-Raf1(逻辑值1)是经常存在的，而另一个要么是TetR-GAP(逻辑值0)要么是TetR-Cdc25(逻辑值1)；输出或高(1)或低(0)。在这种情况下，LexAop-lacZ报道基因的输出因此受到LexA-Ras开关蛋白质的控制，该开关蛋白质的构象取决于输入的值。
在可代替上述系统的另一个系统中，Cdc25可以替换为hSos1，所得到的结果类似。另外，可以进一步调节系统成分的表达。例如，在上述系统中，B42-c-Raf1可以使用GAL1启动子表达，和/或Cdc25和hSos1可以从通常被TetR-sin3阻抑的启动子表达。这导致B42-c-Raf1的表达依赖于生长培养基中半乳糖的存在，Cdc25和hSos1的表达依赖于生长培养基中四环素或四环素衍生物的存在。在这些系统中，细胞对两种不同的细胞外输入作出反应，一种控制修饰蛋白质的表达，另一种控制牺牲者的表达。
双杂交系统中的蛋白质关系
在上述实验的基础上，报道基因在单饵双杂交系统中的输出可以看作是反映了两种基本逻辑状态。报道基因的激活具体表达了饵1(Ba1)和牺牲者(P1)之间的接触关系A1。非A1(Ba1和P1之间)定义了没有相互作用，例如由相互作用对中的突变引起的，或者定义了第三蛋白质或肽aptamer的相互作用的破坏(Colas等，自然380：548-550(1996))。
具有独立功能性相互作用报道基因的细胞的构建
如上所述，构建能通过制备相互作用阱的变型而检测更复杂的蛋白质关系的细胞，相互作用阱的变型是利用LexA和TetR的DNA结合部分，LexA和TetR是细菌转座子Tn10的四环素阻抑物。含有这些部分的融合蛋白在还含有TetOp-URA3和LexAop-lacZ报道基因的细胞中表达为两个饵。该系统容许在单个细胞中同时测定两组基因的相互作用。
包含TetR饵和TetOp-URA3报道基因显著促进了相互作用阱的应用。依赖于TetOp-URA3报道基因的表型比依赖于lacZ和LEU2报道基因的表型更敏感(参见，例如：Gyuris等，细胞75：791-803(1993)和Estojak等，分子与细胞生物学15：5820-9(1995))，它们促进弱相互作用的检测。另外，URA3和LacZ报道基因均可定量测定(Shostak等，分析生物化学191：365-9(1990))。而且，该URA3报道基因的敏感度可以以两种方式下调。URA3报道基因的表达可以用6-氮尿嘧啶滴定测量，6-氮尿嘧啶是URA3基因产物(乳清苷-5’-一磷酸脱羧酶)(OMP脱羧酶)的一种抑制剂(Le Douarin等，核酸研究23：876-8(1995))。四环素或其衍生物(例如无水四环素)也可以降低报道基因的活性，它们破坏了TetR饵与Tet操纵基因的结合。优选地，这类化合物在平板上以不超过100μg/ml的浓度使用。这两种抑制剂减小了URA3报道基因的敏感度，使其可以与激活转录的饵一起使用，并使其与lacZ一起用于相互作用亲和力的粗略估计。此外，URA3报道基因容许使用5-FOA来针对基因表达进行选择(Boeke等，分子与普通遗传学197：345-6(1984))。在这种情况下，四环素和6-氮尿嘧啶可以调节所选定的转录的阈值，促进打断特异性蛋白质相互作用的肽aptamers的选择。
二元和高级蛋白质关系的逻辑分析
如表2中所示，双饵细胞记录四种逻辑关系：或非、与、Ls1和Ls2。三种是特别重要的。与两个饵均接触的牺牲蛋白质(连接蛋白质)发现为与关系A1(Ba1和P1之间)和A2(Ba2和P1之间)(表2)。这类蛋白质的鉴别可用于稠密的基因网络图的连续构建和以前不知道是相关的连接途径。这样的各组相互作用蛋白质有时称作“蛋白质重叠群”。
判别关系Ls1和Ls2也是重要的。这些关系相对复杂：例如，Ls1关系涉及有关两种相互作用的两种运算：非A1(Ba1和P1之间)和A2(Ba2和P1之间)。这些运算具有许多生物学联系，其中记录这种关系的细胞容许检测与无关蛋白质、等位变体、和不同构象态发生不同相互作用的蛋白质(图2)，还容许检测与不同修饰态发生不同相互作用的蛋白质。使用这些关系来观测组合文库和基因组产物，使得可选择与由疾病状态等位基因编码的蛋白质特异性相互作用的蛋白质，或者与因不同的剪接或翻译后修饰而与野生型不同的蛋白质特异性相互作用的蛋白质。
高级蛋白质关系的分析
可从双饵细胞中推断出的蛋白质关系并不总是与单饵细胞显示的那些相同。例如，如果Ba1和Ba2均发生低聚反应形成一个与P相互作用的表面，则无论是Ba1/P还是Ba2/P相互作用都不会在单饵细胞中检测到。接触关系中的这种差异是有用的，因为从单饵细胞和双饵细胞获得的综合数据可使实验者作出有关拓扑结构、时序序列、和翻译后修饰与蛋白质相互作用的关系的推断。
表3显示了有关三种蛋白质X、Y和Z之间物理相互作用的推论：(i)从检测接触关系A1(X和Z之间)、A2(Y和Z之间)和A3(X和Y之间)的双饵细胞的可能的输出入手。在该表中，“报道基因输出”显示了由在三个单饵细胞中和单个双饵细胞中的报道基因的输出记录的接触关系的状态。X和Z融合到活化域中形成牺牲者[P(X)和P(Z)]，Y和X融合到DNA结合域中形成饵[Ba(X)和Ba(Y)]。在双饵细胞中，报道基因的输出显示了蛋白质X、Y和Z的接触关系的状态，其中它们与两个DNA结合域[Ba1(X)或Ba2(Y)]之一和活化域[P(Z)]融合。“物理解释”显示了有关组合的单饵和双饵数据或者仅有关单饵数据的该组报道基因输出的一种可能的生物学解释。尽管表3中的所有模式可以不具有生物学关系，但许多已被观察到，例如，饵1和依赖于饵2存在的牺牲者的相互作用。诸如表3中描述的那些指示单饵和双饵数据的结合的实验可用于定序蛋白质在各途径和复合物中的功能。
有关基因功能分析的应用
该双饵系统，特别是与现有的单饵系统结合时，扩大了酵母相互作用技术在分析各途径中基因功能时的应用范围。它可帮助鉴别将蛋白质的等位变体区别开的蛋白质和肽aptamers。另外，来自双饵细胞的数据(或许由单独的实验产生)和来自单饵细胞的数据(可能从基因组范围的观测得到)的结合使得可详细地分析各途径和复合物中的蛋白质功能和接触拓扑结构。它还使得可更精确地分析多蛋白质复合物中蛋白质的拓扑结构，并且它提供了稳健的、可度量的、半自动的方式来区别蛋白质相互作用的可供选择的模型。此外，由于以这种方式定义的蛋白质间的关系能对它们自身进行系统分析，因此它们可以在工业上被确定。
朝向以蛋白质和转录为基础的逻辑环路
上述实验使用了在两种构象态之间循环的蛋白质Ras，和与处于构象态之一的Ras结合的激活标记的蛋白质Raf。Ras开关的状态及其由转录测量的输出显示根据输入蛋白质是否为GAP或Cdc25而变化。在这些实验中，细胞充当与门，其中一个输入B42-c-Raf1保持恒定(逻辑值1)，另一个或者是GAP(逻辑值0)或者是Cdc25(逻辑值1)，由报道基因的表达引起的表型构成输出。对于B42-c-Raf1和GAP，输出具有低β-半乳糖苷酶活性(0)。对于B42-c-Raf1和Cdc25，输出具有高β-半乳糖苷酶活性(1)。尽管它还由报道基因的表达计分，但这种与运算不是有关早先描述的那些接触关系的运算。相反，该运算是关于蛋白质输入的，在这种情况下，细胞充当真逻辑门。
在本文所描述的细胞中，为了改变输入，使用不同的DNA构造表达相互作用蛋白质；为了测量输出，需要人或其他观察者。整个基于生物学转录的逻辑环路的构建需要用逻辑输入代替这些输入，所述逻辑输入会响应细胞外刺激而发生变化，诸如分泌型肽信息素或光的刺激，并用产生这种刺激的输出代替这些输出。
图4-6中显示了应用这种生物学环路的示范性系统。特别是，在图4中，描述了一个生产可被生产者细胞阅读或被一个响应输入的第二受体细胞阅读的输出的细胞。如图4中所述，输入蛋白质酵母α-因子的加入导致了TGF-β输出通过G蛋白质途径的表达，输出可被相同或第二细胞接受，并可在受体细胞中产生表型变化。图4还描述了一个系统，其中TGF-β输入蛋白质结合到其受体上，导致LexA-Madd(也叫做LexA-Smad)蛋白质的激活和易位。该LexA-Madd蛋白质触发酵母α-因子输出的表达，信号再次可被生产者细胞阅读或被一个第二受体细胞阅读，并可在受体细胞中产生表型变化。
图5扩展了该系统并说明了一个具有四个不同输入-输出通道的细胞，由此允许各种各样的逻辑运算。在图5中，输入蛋白质α-因子、TGF-β、δ和缓激肽分别与α-因子受体、TGF-β受体、凹口受体和缓激肽受体相互作用，激活各途径产生可被细胞系统例如作为转录变化阅读的输出蛋白质的表达。当输入和输出选项的数目增加时，可被编程的通道的数目增加；例如，具有10个输入/输出通道的细胞可以以210编程，或多于1000个不同状态。在一个增加输入/输出通道的示范性方法中，蛋白质，诸如上面所讨论的LexA-Smad蛋白质，可以人工改造成含有不同aptameric部分，每个都带来在嵌合体上的不同受体特异性。另外，在这些系统中，输入可以是一些其他细胞外刺激，诸如光或特定波长的触发特殊感光途径的光，而不仅仅是蛋白质。优选地，在这样一个系统中，输出是荧光蛋白质，例如绿色、红色或蓝色荧光蛋白质。
图6中描述了一个最终类型的完全生物学回路。该细胞代表一个示范性“晶体管”。在该细胞中，在绿光的存在下，报道基因被触发来表达HIV蛋白酶。然后该蛋白酶切割开将蓝色荧光蛋白质-绿色荧光蛋白质嵌合体连接在一起的靶接头，释放出这两种成分，并导致绿光输出大大降低。
上述完全生物学逻辑装置可能不是非常迅速的。尽管这些开关蛋白质之一-Ras可以在数毫秒内循环，大量信号转导途径可以在数分钟内提供输入(Bray，自然376：307-312(1995))，但报道基因输出可需要数分钟到数小时成为可检测的。不过，由于所需的接近DNA的构建工作可以使用简单的工艺完成，因此有可能基因表达将保持有用的输出。通过迅速增加自然和人工选定的、具有有用的变构和寻靶性能的蛋白质域的数目，可以促进这类回路的构建(Colas等，自然380：548-550(1996))。因此有可能这种基于转录的技术提供了进行生物学计算的及早途径。
材料与方法
双饵系统
在上述实验中，用载体pEG202和pJG4-5作为Ba2和牺牲者表达质粒(Gyuris等，细胞75：791-803(1993))。另外，构建Ba1表达质粒、pCWX200、LexAOp-LacZ报道基因质粒、pCWX24和TetOp-URA3报道基因载体，并将它们整合到酿酒酵母菌株中，如下所述建造CWXY1和CWXY2。
TetR-融合蛋白表达载体pCWX200的构建。pCWX200携带2μm复制基因和LEU2标记。启动子和克隆区由pEG202产生，骨架来自于pBC100，pBC100是Yeplac181的衍生物(Gietz和Sugino，基因74：527-534(1988))。为了除去pBC100多接头区(从AccI到EcoRI)以及编码β-半乳糖苷酶的氨基酸末端片段的DNA，载体用NarI/AccI消化并再连接得到pCWX100。然后通过用HindIII消化pCWX100而删除HindIII位点，用Klenow使突出端平钝，并再连接得到pCWX100ΔHindIII。然后将含有ADH1启动子、多接头LexA和ADH1终止子的pEG202的SphI片段插入到pCWX100ΔHindIII的SphI位点，得到pCWX150(Gyuris等，细胞75：791-803(1993)和Estojak等，分子与细胞生物学15：5820-9(1995))。最后，用编码Tet阻抑物(TetR)的具有EcoR1/HindIII末端的PCR片段代替pCWX150的EcoRI/HindIII LexA片段(Zervos等，细胞79：388(1993))。所得质粒pCWX200具有与pEG202等价的克隆位点(Gossen和Bujard，国家科学院院报89：5547-51(1992))。
LexAop-lacZ报道基因pCWX24的构建。LexAop-lacZ报道基因、LYS2标记、2μm复制基因、和pCWX24质粒骨架的其余部分分别来自中间质粒pCWX221、pCWX01和pCWX21。
pCWX221的构建。为了构建该质粒，SH18-34T用KpnI完全消化，用BamH1进行部分消化，并将该载体连接到pBluescript的BamHI/KpnI消化的骨架上。LexAOp-LacZ报道基因在pCWX221的NotI/KpnI片段上。
pCWX01的构建。为了构建pCWX01，YeP426用SalI/ClaI消化(Ma等，基因58：201-16(1987))，得到一个约5600bp的ClaI-XbaI片段，它携带LYS2(Barnes和Thorner，分子与细胞生物学6：2828-38(1996))和约300bp的pBR322四环素抗性基因。该片段与用ClaI/SalI消化的(pBluescriptΔKpnI)pBSΔKpnI骨架连接，生成pCWX01。
pCWX21的构建。pRF24用NotI消化并用Klenow平端化处理得到pCWX20ΔNotI。为了制备pCWX21，pCWX20ΔNotI用BamHI消化并连接到自退火的5’-GATCCGCGGCCGCG-3’(SEQ ID NO：1)上，生成一个新的NotI位点。
pCWX24的装配。为了装配pCWX24，将pCWX221的NotI/KpnILexOp-LacZ片段插入到pCWX21的NotI/KpnI位点，制成pCWX22。接着，在pCWX22的SphI位点插入自退火的5’-CTAGGGCCCTAGCATG-3’片段，生成ApaI位点和载体pCWX23。pCWX23用ApaI/PmeI消化后，插入pCWX01的SmaI/ApaI消化的LYS2片段，制成pCWX24。
TetOp-URA3的构建。从中间质粒pCWX211、pCWX213T2、pCWX213T10、pCWX02T2和pCWX02T10生成TetOp-URA3构建物。
pCWX211的构建。从pSH200用5’-
AAAAGGAAAAGCGGCCGCTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTC-3’(SEQ ID NO：2)和
5’-CGGAATTCTTTCGAAAGCTACATATAAGGAAC-3’(SEQ ID NO：3)扩增URA3基因后，将具有NotI/EcoRI末端的PCR产物连接到EcoRI/NotI消化的pBS上，生成pCWX211。
pCWX213T2和pCWX213T10的构建。为了构建这些载体，将来自pLR1Δ1的、含有带有单一XhoI位点的酵母Gal1/Gal10启动子区的BamHI片段(West等，分子与细胞生物学4：2467-78(1984))插入到pBS的BamHI位点，制成pCWX210。然后将两个链合成并自退火，制成具有XhoI/SalI末端的DNA片段，该片段含有两个TetO2操纵基因(Meier等，欧洲分子生物学组织杂志7：567-72(1988))，如下所述(SEQ ID NO：4和5)：
                 *                          *
      —————————-——   ————————————
TCGAGcactccctatcagtgatagagaaaacactccctatcagtgatagagaaaaG
1--------------+-----------+------------+----------+-----------+--------56
CgtgagggatagtcactatctcttttgtgagggatagtcactatctcttttCAGCT
Tet操纵基因DNA与其自身连接后，将其用XhoI/SalI消化并在0.8％琼脂糖胶上分级分离。将大小在100bp到200bp范围内的DNA插入pCWX210的XhoI位点。使用该方案得到了两种质粒pCWX210T2和pCWX210T10，它们分别含有4和6个TetO2操纵基因。将pCWX210T2和T10的具有EcoRI末端的Gal1/Gal10启动子区插入到pCWX211的EcoRI位点，分别生成pCWX211T2和pCWX211T10。另外，在这些质粒中通过在NotI位点插入自退火的寡(5’-GGCCGCGGTACCGC-3’)(SEQ IDNO：6)而生成KpnI位点，从而分别制成pCWX212T2和pCWX212T10。在这些载体中，TetOp-URA3报道基因位于KpnI片段上。删除这些质粒中的ClaI位点，生成质粒pCWX213T2和pCWX213T10。用来自pCWX213T2和pCWXT10的具有KpnI末端的TetOp-URA3构建物代替来自pCWX01的LYS2的KpnI片段，制成pCWX02T2和pCWX02T10。
TetOp-URA3报道基因在LYS2上的整合。pCWX02T2和pCWX02T10用CalI/XbaI消化后，将这些载体转化到含有pCWX200Cdi2的酿酒酵母菌株EGY40中(Gietz等，酵母11：355-60(1995))，pCWX200Cdi2是一种指导转录激活物TetR-Cdi2基因表达的载体(Finley和Brent，国家科学院院报91：12980-84(1984))。转化体在没有尿嘧啶和亮氨酸的培养基上选择。挑选每个pCWX02T2和pCWX02T10转化的10个独立的克隆，并将它们划线到α-氨基己二酸平板上，以选择其中LYS2被灭活的那些(Chattoo等，遗传学93：51-65(1979))。TetOp-URA3基因在LYS2位点的整合利用PCR证实，其中使用杂交到LYS2的KpnI片段的旁侧区的引物。所得菌株CWXY1和CWXY2(MATaura3 his3 trp1 leu2 lys2Δkpn::TetOp-URA3)分别含有URA3基因上游的4和6个TetO2操纵基因。与和判别关系的测定
为了测定相互作用关系，构建一系列载体。将c-Raf1(1-313)克隆到载体pCWX200和JG4-5的EcoR1/Xho1位点中。RasA15A186、hSos1(601-1019)和Cdc25(907-1589)用RasA15A186引物5’-GCCTGAATTCATGACGGAATATAAGCTGG-3’(SEQ ID NO：7)和5’-CCCGAACTCGAGTCAGGAGAGCACTGCCTTGCAGC-3’(SEQ ID NO：8)、hSos1(601-1019)引物5’-GCCTGAATTCAAAGCAGGAACTGTT-3’(SEQ IDNO：9)和5’-CCCGAACTCGAGCTATCGTGGTTCTATTTCTAG-3’(SEQ ID NO：10)、    和   Cdc25    催  化   域  (907-1589)引物 5’-GCCTGAATTCATGTCTTCGGTCTCCTCAG-3’(SEQ ID NO：11)和5’-CCCGAACTCGAGTTATCGAAATAACCTAGAAGG-3’(SEQ ID NO：12)扩增后，将RasA15A186、hSos1(601-1019)和Cdc25(907-1589)的具有EcoRI/XhoI末端的PCR产物也克隆到载体pEG202和pJG4-5的EcoR1/Xho1位点中。含有pCWX24的CWXY2用上述图2中所示的两个饵和牺牲者的组合物转化后，将转化体划线到没有亮氨酸、组氨酸、赖氨酸和色氨酸的离去(dropout)平板(“LHKW”)上，含有葡萄糖作为碳源(“Glu”)，并添加100μg/ml 6-氮尿嘧啶，它是URA3的抑制剂(Le Douarin等，核酸研究23：876-8(1995))。这些平板在30℃下培养12-48小时。然后将酵母菌落影印到四个离去平板上：如上所示的LHKW/Glu+X Gal、LHKW/半乳糖(Gal)+棉子糖(Raff)+Xgal、LHKWU/Glu和LHKWU/Gal+Raff，所得产物在30℃下培养12-72小时后评分。
有关蛋白质输入的与运算的测定
为  了  进  行  其  他  测  定，  将  用  引  物 5’-GCCTGAATTCATGAAGGGGTGGTATCACGGA-3’(SEQ ID NO：13)和5’-CCCGAACTCGAGCTA-CTTGACCATCATTGGTTTTTG-3’(SEQ ID NO：14)扩增的人GAP1的具有EcoRI/XhoI末端的PCR产物克隆到pCWX200中。具有EcoRI/XhoI末端的Cdc25(907-1589)(如图2中所示)也克隆到pCWX200中。然后将含有pEG202RasA186和pJGRaf(1-313)的CWXY2进一步用pCWX200、pCWX200CDC25(907-1589)或pCWX200GAP转化。将从＞50个独立的转化体合并的转化体的菌落影印到LHKW/Glu+Xgal和LHKW/Gal+Raff+Xgal离去平板上，并将这些平板在30℃下培养2-3天。前一个板上的细胞没有显示蓝色，而在后一个板上显示了不同强度的蓝色。β-半乳糖苷酶活性以三等份细胞集合体利用液体测定来测量(Estojak等，分子与细胞生物学15：5820-9(1995))，每个集合体含有50个以上的独立转化体。LHKW/Gal+Raff培养基在0.2OD600下接种生长到晚对数期或在LHKW/Glu液体培养基中饱和的洗涤细胞，培养物在30℃下再培养5小时，如Estojak等所述进行β-半乳糖苷酶测定(分子与细胞生物学15：5820-29(1995))。
                                              表1
替代名称   解释   定义表型   生物学关系举例
变量      A1值 一致非   相互作用未相互作用   在URA-上生长在5-FOA上生长   蛋白质接触相互作用因一个蛋白质中的突变而中断，被第三蛋白质或肽aptamer竞争
A1     0     1
运算   运算结果
F3F4     01     10
                                                         表2
   替代名称     定义表型   解释
    变量        变量的值 或非与，桥接，A1与A2Ls1，判别，(非A1)与A2Ls2，判别，A1与(非A2)     在X-Gal上为白色，不在URA-上生长，或者在5-FOA上生长在X-Gal上为蓝色并在URA-上生长在X-Gal中为白色并且在URA-上生长在X-Gal上为蓝色，不在URA-上生长，或者在5-FOA上生长   没有Ba1/P1或Ba2/P1相互作用P1与Ba1和Ba2相互作用P1与Ba2相互作用而不与Ba1作用P1与Ba1相互作用而不与Ba2作用
    A1A2  00  10  01   11
    运算        运算结果
    F2F9F3F5  1000   0001   0010   0100
                                                         表3
                   报道基因输出   物理解释(单饵和双饵结合) 物理解释(仅为单饵数据)
         单饵细胞        双饵细胞
 A1   A2   A3   A1   A2
 Ba(X)P(Z)   Ba(Y)P(Z)   Ba(X)P(Y)   Ba1(X)P(Z)   Ba2(Y)P(Z)
 000000000000   000000001111   000011110000   001100110011   000101010101   X，Y，Z不相互作用X，Y，Z弱缔合，修饰Y和/或Z相互作用X，Y，Z弱缔合，修饰X和/或Z相互作用X，Y，Z形成三聚体，需要X，Y和ZX，Y形成二聚体X修饰Y，修饰Y结合ZY修饰X，修饰X结合ZX，Y形成二聚体，Z结合X/Y二聚体形成X/Y/Z三聚体X打断Y/Z二聚体Y，Z形成二聚体，Z将X和Y区别开Y修饰Z，修饰Z结合XY，Z形成二聚体，X结合Y/Z二聚体形成X/Y/Z三聚体 X，Y，Z不相互作用X，Y，Z不相互作用X，Y，Z不相互作用X，Y，Z不相互作用X，Y形成二聚体X，Y形成二聚体X，Y形成二聚体X，Y形成二聚体Y，Z形成二聚体Y，Z形成二聚体Y，Z形成二聚体Y，Z形成二聚体
    111100001111     000011110000     000011111111     001100110011     010101010101     Y打断X/Z二聚体X修饰Z，修饰Z结合YX，Z形成二聚体，Z将X和Y区别开X，Z形成二聚体，Y结合X/Z二聚体形成X/Y/Z三聚体X，Y和Y，Z形成二聚体，X/Y二聚体阻止Y结合ZX，Y和Y，Z形成二聚体，Y/Z二聚体阻止X结合YY修饰X，修饰X结合ZX/Y和Y/Z二聚体通过Y相互作用形成X/Y/Z三聚体X，Y和X，Z形成二聚体，X/Y二聚体阻止X结合ZX修饰Y，修饰Y结合ZX，Y和X，Z形成二聚体，X/Z二聚体阻止X结合YX/Z和X/Y二聚体通过X相互作用形成X/Y/Z三聚体   X，Z形成二聚体X，Z形成二聚体X，Z形成二聚体X，Z形成二聚体Y，Z和Y，X形成二聚体Y，Z和Y，X形成二聚体Y，Z和Y，X形成二聚体Y，Z和Y，X形成二聚体X，Z和X，Y形成二聚体X，Z和X，Y形成二聚体X，Z和X，Y形成二聚体X，Z和X，Y形成二聚体
    11111111     11111111     00001111     00110011     01010101     X，Z和Y，Z形成二聚体，两个二聚体相互灭活X，Z和Y，Z形成二聚体，Y/Z二聚体阻止X结合ZX，Z和Y，Z形成二聚体，X/Z二聚体阻止Y结合ZX，Z和Y，Z形成二聚体X，Y形成二聚体，X/Y二聚体灭活ZX，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，Y修饰X，修饰X与Z弱结合X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，X修饰Y，修饰Y与Z弱结合X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，可形成X/Y/Z三聚体     X，Z和Y，Z形成二聚体X，Z和Y，Z形成二聚体X，Z和Y，Z形成二聚体X，Z和Y，Z形成二聚体X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，可形成X/Y/Z三聚体X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，可形成X/Y/Z三聚体X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，可形成X/Y/Z三聚体X，Y和X，Z和Y，Z形成二聚体，可形成X/Y/Z三聚体
其他实施方案
在上述方法的一个替代方法中，本文中描述的涉及两个报道基因的系统可用于选择或筛选与两个不同的蛋白质结合位点结合的蛋白质。为了进行这些筛选，将两个不同的DNA片段插入两个报道基因(例如，URA3和lacZ基因)的上游，在还含有表达候选结合蛋白质的基因的细胞中测定每个基因的表达。该候选结合蛋白质可以以其天然状态表达，或者作为与活化域连接的融合蛋白表达。
本文中所述的任何一种方法都可以用于筛选蛋白质，肽或aptamers，但不限于此。
其他实施方案包含在权利要求书中。
                              序列表
<110>The General Hospital Corporation
<120>记录蛋白质相互作用及功能关系的检测系统
<130>00786/317WO2
<150>60/065，273
<151>1997-11-10
<160>16
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>14
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>1
gatccgcggc  cgcg                                                      14
<210>2
<211>41
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>2
aaaaggaaaa gcggccgctt agttttgctg gccgcatctt c                         41
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>3
cggaattctt tcgaaagcta catataagga ac                                   32
<210>4
<211>56
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>4
tcgagcactc cctatcagtg atagagaaaa cactccctat cagtgataga gaaaag         56
<210>5
<211>56
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>5
cgtgagggat agtcactatc tcttttgtga gggatagtca ctatctcttt tcagct         56
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>6
ggccgcggta ccgc                                                       14
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人类
<400>7
gcctgaattc atgacggaat ataagctgg                                       29
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人类
<400>8
cccgaactcg agtcaggaga gcactgcctt gcagc                               35
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人类
<400>9
gcctgaattc aaagcaggaa ctgtt                                         25
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>10
cccgaactcg agctatcgtg gttctatttc tag                                33
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>11
gcctgaattc atgtcttcgg tctcctcag                                     29
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>12
cccgaactcg agttatcgaa ataacctaga agg                              33
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人类
<400>13
gcctgaattc atgaaggggt ggtatcacgg a                                31
<210>14
<211>35
<212>DNA
<213>人类
<400>14
cccgaactcg agctacttga catcattggt ttttg                            35
<210>15
<211>20
<212>PRT
<213>人类
<400>15
Asp Met Asp Trp Phe Phe Arg phe Tyr Ala Ser Val Ser Arg Leu Phe
 1               5                  10                  15
Arg His Leu His
            20
<210>16
<211>20
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Phe Trp Gln Ala Thr Leu Arg Leu Val ser Asp Lys Leu Ile Leu Leu
 1               5                  10                  15
Tyr Pro Asp Pro
            20

Claims (39)

1、一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包含：
(a)提供一个宿主细胞，它含有
(i)一个第一报道基因，其可通过操作与包括第一蛋白质结合位点的DNA序列相连；
(ii)一个第二报道基因，其可通过操作与包括第二蛋白质结合位点的DNA序列相连；
(iii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述第一蛋白质结合位点上；
(iv)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第二蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述第二蛋白质结合位点上；和
(v)一个表达第三融合蛋白的第三融合基因，所述第三融合蛋白包括一个与基因活化部分共价结合的第三蛋白质；
(b)测量所述第一报道基因的表达输出，作为所述第一蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；
(c)测量所述第二报道基因的表达输出，作为所述第二蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；
(d)解释步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果，由此
(i)所述第一报道基因和第二报道基因二者输出的增加指示所述第三融合蛋白与所述第一和第二融合蛋白相互作用；
(ii)所述第一报道基因输出增加而第二报道基因输出不增加，指示所述第三融合蛋白与第一融合蛋白相互作用，而不与第二融合蛋白作用；
(iii)所述第二报道基因输出增加而第一报道基因输出不增加，指示所述第三融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，而不与第一融合蛋白作用；和
(iv)所述第一或第二报道基因的输出均没有变化，指示所述第三融合蛋白不与所述第一或第二融合蛋白相互作用；
(e)将所述步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果与用下述宿主细胞测得的表达输出结果进行比较，所述宿主细胞是
(i)一个第一比较宿主细胞，它含有
(a)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(b)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括与能特异性结合到所述蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的所述第一蛋白质；和
(c)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的所述第三蛋白质；或者
(ii)一个第二比较宿主细胞，它含有
(a)可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(b)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括与能特异性结合到所述蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的所述第二蛋白质；和
(c)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的所述第三蛋白质；或者
(iii)所述第一比较宿主细胞和所述第二比较宿主细胞两者。
2、权利要求1所述的方法，其中至少所述第一或所述第二报道基因之一的表达水平可以降低。
3、权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二蛋白质结合位点之一是四环素操纵基因。
4、权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二报道基因之一是URA3或lacZ。
5、权利要求1所述的方法，其中所述第一或所述第二报道基因之一产生一个可被第二细胞接收和检测的信号。
6、权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
7、权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
8、权利要求1所述的方法，其中所述第一和所述第二报道基因可以同时表达。
9、权利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质是等位变体。
10、一种检测蛋白质的方法，该蛋白质介导另一种蛋白质的状态变化，所述方法包含：
(a)提供一个宿主细胞，它含有
(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述蛋白质结合位点上；和
(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一个能与所述第一蛋白质相互作用并且与基因活化部分共价结合的第二蛋白质，
其中至少所述第一或所述第二蛋白质之一可以显示状态变化；
(b)使所述第一和所述第二蛋白质相互作用；
(c)测量所述报道基因的表达，作为所述第一蛋白质和所述第二蛋白质之间相互作用的量度；
(d)向所述细胞中引进一个表达第三蛋白质的第三基因；
(e)测量所述报道基因的表达，在所述第三蛋白质存在下所述报道基因表达的变化，指示所述第三蛋白质介导所述第一或第二蛋白质的状态变化，从而导致所述第一蛋白质和所述第二蛋白质相互作用的能力改变。
11、权利要求10所述的方法，其中所述状态的变化是构象变化。
12、权利要求11所述的方法，其中所述显示构象变化的蛋白质是Ras蛋白质。
13、权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
14、权利要求13所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
15、权利要求10所述的方法，其中所述第一融合蛋白和所述第三蛋白质为响应细胞外刺激而各自发生表达。
16、权利要求10所述的方法，其中所述报道基因产生可被第二细胞接收和检测的信号。
17、一种检测蛋白质的方法，该蛋白质介导另一种蛋白质的状态变化，所述方法包含：
(a)提供一个第一宿主细胞，它含有
(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述第一蛋白质结合位点上；和
(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一个能与所述第一蛋白质相互作用并且与基因活化部分共价结合的第二蛋白质，
其中至少所述第一或第二蛋白质之一可以显示状态变化；
(b)使所述第一和所述第二蛋白质相互作用；
(c)测量所述第一宿主细胞中所述报道基因的表述，作为所述第一蛋白质和所述第二蛋白质之间相互作用的量度；
(d)提供一个第二宿主细胞，它含有
(i)可通过操作与包括所述蛋白质结合位点的所述DNA序列相连的所述报道基因；
(ii)表达所述第一融合蛋白的所述第一融合基因；和
(iii)表达所述第二融合蛋白的所述第二融合基因；
(iv)表达第三蛋白质的第三基因；
(e)使所述第一和所述第二蛋白质在所述第三蛋白质的存在下相互作用；
(f)测量所述第二宿主细胞中所述报道基因的表达，作为在所述第三蛋白质存在下所述第一蛋白质和所述第二蛋白质之间相互作用的量度，与在所述第一宿主细胞中测得的报道基因表达相比，在所述第二宿主细胞中报道基因表达的变化指示，所述第三蛋白质介导所述第一或第二蛋白质的状态变化，从而导致所述第一蛋白质和所述第二蛋白质相互作用的能力改变。
18、权利要求17所述的方法，其中所述状态的变化是构象变化。
19、权利要求18所述的方法，其中所述显示构象变化的蛋白质是Ras蛋白质。
20、权利要求17所述的方法，其中所述宿主细胞各自是酵母细胞或哺乳动物细胞。
21、权利要求20所述的方法，其中所述宿主细胞各自是酵母细胞。
22、权利要求17所述的方法，其中所述第一融合蛋白和所述第三蛋白质为响应细胞外刺激而各自发生表达。
23、权利要求17所述的方法，其中所述报道基因产生可被第二细胞接收和检测的信号。
24、一种检测候选蛋白质是否与转录激活物相互作用的方法，该方法包含：
(a)提供一个宿主细胞，它含有
(i)一个表达水平可以降低的报道基因，所述报道基因通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连；
(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括与结合部分共价结合的所述转录激活物，该结合部分能特异性结合到所述蛋白质结合位点上；和
(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的所述候选蛋白质；和
(b)检测所述报道基因表达的增加，作为所述候选蛋白质与所述转录激活物之间相互作用的指示。
25、权利要求24所述的方法，其中所述报道基因是URA3基因。
26、权利要求25所述的方法，其中所述表达水平是由6-氮尿嘧啶降低的。
27、权利要求24所述的方法，其中所述蛋白质结合位点是四环素操纵基因。
28、权利要求27所述的方法，其中所述表达水平是由四环素或四环素衍生物降低的。
29、权利要求24所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
30、权利要求29所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
31、一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，该方法包含：
(a)提供一个宿主细胞，它含有
(i)一个第一报道基因，其可通过操作与包括第一蛋白质结合位点的DNA序列相连；
(ii)一个第二报道基因，其可通过操作与包括第二蛋白质结合位点的DNA序列相连，其中所述第一报道基因或第二报道基因之一产生一个可被第二细胞接受和检测的信号；
(iii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第一蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述第一蛋白质结合位点上；
(iv)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括一个与结合部分共价结合的第二蛋白质，该结合部分能特异性结合到所述第二蛋白质结合位点上；和
(v)一个表达第三融合蛋白的第三融合基因，所述第三融合蛋白包括一个与基因活化部分共价结合的第三蛋白质；
(b)测量所述第一报道基因的表达输出，作为所述第一蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；
(c)测量所述第二报道基因的表达输出，作为所述第二蛋白质和第三蛋白质之间相互作用的量度；
(d)解释步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果，由此
(i)所述第一报道基因和第二报道基因二者输出的增加指示所述第三融合蛋白与所述第一和第二融合蛋白相互作用；
(ii)所述第一报道基因输出增加而第二报道基因输出不增加，指示所述第三融合蛋白与第一融合蛋白相互作用，而不与第二融合蛋白作用；
(iii)所述第二报道基因输出增加而第一报道基因输出不增加，指示所述第三融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，而不与第一融合蛋白作用；和
(iv)所述第一或第二报道基因的输出均没有变化，指示所述第三融合蛋白不与所述第一或第二融合蛋白相互作用。
32、权利要求31所述的方法，该方法进一步包含将所述步骤(b)和步骤(c)的表达输出结果与用下述宿主细胞测得的表达输出结果进行比较，所述宿主细胞是
(a)一个第一比较宿主细胞，它含有
(i)一个可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括与能特异性结合到所述蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的所述第一蛋白质；和
(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的所述第三蛋白质；或者
(b)一个第二比较宿主细胞，它含有
(i)可通过操作与包括蛋白质结合位点的DNA序列相连的报道基因；
(ii)一个表达第一融合蛋白的第一融合基因，所述第一融合蛋白包括与能特异性结合到所述蛋白质结合位点上的结合部分共价结合的所述第二蛋白质；和
(iii)一个表达第二融合蛋白的第二融合基因，所述第二融合蛋白包括与基因活化部分共价结合的所述第三蛋白质；或者
(c)所述第一比较宿主细胞和所述第二比较宿主细胞两者。
33、权利要求31所述的方法，其中至少所述第一或所述第二报道基因之一的表达水平可以降低。
34、权利要求31所述的方法，其中所述第一或所述第二蛋白质结合位点之一是四环素操纵基因。
35、权利要求31所述的方法，其中所述第一或所述第二报道基因之一是URA3或lacZ。
36、权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞或哺乳动物细胞。
37、权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
38、权利要求31所述的方法，其中所述第一和所述第二报道基因可以同时表达。
39、权利要求31所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质是等位变体。
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