CZ20001594A3 - Detekční systémy pro zaznamenávání proteinových interakcí a funkčních vztahů - Google Patents

Abstract

Jsou popsány způsoby pro určování komplexních proteinových interakcí a funkčních vztahů mezi proteiny a činidla pro provádění těchto metod.

Description

Detekční systémy pro zaznamenávání proteinových interakcí a funkčních vztahů.

Oblast vynálezu

Tento vynález pojednává o detekčních systémech proteinových interakcí.

Dosavadní stav techniky

Genová analýza je nástrojem pro porozumnění proteinovým sítím, které řídí biologické procesy Postupy prováděné genetiky (např. dělení termosenzitivních mutantů, vytváření a analýza dvojitých mutantů a vytváření a pozorování F1 a F2 generací) určují vztahy mezi geny. Tyto abstraktní vztahy mezi geny často odrážejí základní biologické zákonitosti. Například, epistatický vztah nasvědčuje tomu, že jeden gen normálně působící na druhý dává vznik fenotypu, vztah specifické alelické suprese nasvědčuje tomu, že dva genové produkty reagují vzájemně (Hartman a Roth, Adv. Genet. 17:1-105 (1973); Jarvik a Botstein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 70:2046-50 (1973)) a vztah závislosti může nasvědčovat tomu, že jeden genový produkt působí před druhým (Hereford a Hartwell, J. Mol. Biol. 84:445-61 (1974)).

Informace získané těmito genovými manipulacemi mají obvykle velmi vysokou kvalitu, ale často je velmi obtížné je získat. Nedávné zvýšení úrovně identifikace nových kódujících úseků obnovilo zájem o celkové systematické způsoby pro porozumnění genové funkci. Tyto způsoby zahrnují způsob „dvouhybridní“ a způsob „interakční pasti“, které byly vyvinuty pro zhodnocení kontaktu mezi jedním cílovým proteinem a vzájemně • · -» · · « » · · · reagujícími proteiny (Fields a Song, Nátuře 340:245-6 (1989); Chien et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:9578-82 (1991); Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993); Durfee et al., Genes Dev. 7:555-69 (1993); Estojak et al.. Mol. Cell. Biol. 15:5820-9 (1995)). Spojení mezi dvěma proteiny v těchto systémech určuje fyzikální vztah, který má často biologický význam.

Podstata vynálezu

Vynález všeobecně charakterizuje způsob určování interakcí protein - protein, který zahrnuje: (a) přípravu hostitelské buňky, která obsahuje (i) první reporterový gen účinně spojený s úsekem DNA, který obsahuje vazebné místo pro první protein;

(ii) druhý reporterový gen účinně spojený s úsekem DNA, který obsahuje vazebné místo pro druhý protein; (iii) první tužní gen, který exprimuje první tužní protein, první tužní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopná se specificky navázat na vazebné místo pro první protein; (iv) druhý tužní gen, který exprimuje druhý tužní protein, druhý tužní protein obsahující druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopná se specificky vázat na vazebné místo pro druhý protein; a (v) třetí tužní gen, který exprimuje třetí tužní protein, třetí tužní protein obsahující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen; (b) měření úrovně exprese prvního referenčního genu jako stupně interakce mezi prvním a třetím proteinem; (c) měření úrovně exprese druhého reporterového genu jako stupně interakce mezi druhým a třetím proteinem; a (d) zhodnocení výsledků úrovně exprese kroku (b) a (c), kde (i) zvýšená úroveň obou reportérových genů znamená, že třetí tužní protein reaguje s prvním i druhým ťuzním proteinem; (ii) zvýšená úroveň prvního reportéro-

• · · • · · • · · · • · • · • · ·« vého genu, ale ne druhého reporterového genu, znamená, že třetí fuzní protein reaguje s prvním fuzním proteinem, ale ne s druhým fuzním proteinem; (iii) zvýšená úroveň druhého reporterového genu, ale ne prvního reporterového genu, znamená, že třetí fuzní protein reaguje s druhým fuzním proteinem, ale ne s prvním fuzním proteinem; a (iv) žádná změna v úrovni prvního ani druhého reporterového genu znamená, že třetí fuzní protein nereaguje ani s prvním ani s druhým fuzním genem.

V navrhovaném provedení tento způsob dále zahrnuje srovnání výsledků úrovně exprese v kroku (b) a kroku (c) s výsledky úrovně exprese měřenými buď (a) u první srovnávací hostitelské buňky, která obsahuje (i) reporterový gen účinně spojený s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro protein; (ii) první fuzní gen, který exprimuje první fuzní protein, první fuzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopná se specificky navázat na vazebné místo pro protein; a (iii) druhý fuzní gen, který exprimuje druhý fuzní protein, druhý fuzní protein obsahující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen; nebo (b) u druhé srovnávací hostitelské buňky, která obsahuje (i) reporterový gen účinně spojený s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro protein; (ii) první fuzní gen, který exprimuje první fuzní protein, tento první fuzní protein obsahující druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopná se specificky vázat na vazebné místo pro protein; a (iii) druhý fuzní gen, který exprimuje druhý fuzní protein, tento druhý fuzní protein obsahující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen; nebo (c) u obou srovnávacích hostitelských buněk. Dále může být jakýkoliv počet srovnání udělán mezi více buňkami s dvěmi cílovými proteiny nebo mezi buňkou s dvěmi cílovými proteiny a více buňkami s jedním • ·

• · cílovým proteinem nebo oběma.

V jiném navrhovaném provedení může být snížena úroveň exprese nejméně jednoho reporterového genu (prvního nebo druhého); vazebným místem pro první nebo druhý protein je tetracyklinový operátor; prvním nebo druhým reportérovým genem je URA3 nebo lacZ; první nebo druhý reportérový gen vytváří signál, který je přijímán a detekován druhou buňkou; hostitelskou buňkou je kvasinka nebo savčí buňka; první a druhý reportérový gen mohou být exprimovány současně; a první a druhý protein jsou alelickými variantami.

Druhým aspektem vynálezu je charakterizování způsobu určení proteinu, který působí změnu stavu jiného proteinu, zahrnující: (a) vytvoření hostitelské buňky, která obsahuje (i) referenční gen účinně spojený s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro protein; (ii) první fuzní gen, který exprimuj e první fuzní protein, tento první fuzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopná se specificky navázat na vazebné místo pro tento protein; a (iii) druhý fuzní gen, který exprimuj e druhý fuzní protein, tento druhý fuzní protein obsahující druhý protein, který je schopný reagovat s prvním proteinem a který je kovalentně navázán na skupinu aktivující gen, kde aspoň první nebo druhý protein je schopen změnit stav; (b) umožnění prvnímu a druhému proteinu vzájemně reagovat; (c) změření exprese reportérového genu jako míry interakce mezi prvním a druhým proteinem; (d) vložení třetího genu exprimuj ícího třetí protein do buňky; (e) měření exprese reportérového genu, změna exprese reportérového genu za přítomnosti třetího proteinu naznačuje, že třetí protein způsobuje změnu stavu prvního nebo druhého proteinu vedoucí ke změně schopnosti prvního • · • · a druhého proteinu vzájemně reagovat.

Podobně vynález charakterizuje alternativní způsob pro určování proteinu působícího změnu stavu jiného proteinu, zahrnující: (a) vytvoření první hostitelské buňky, která obsahuje (i) reportérovy gen účinně spojený s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro protein; (ii) první fuzní gen, který exprimuje první fuzní protein, první fúzní protein obsahující první protein kovalentně spojený s vazebnou skupinou, která je schopná se specificky navázat na vazebné místo pro první protein; a (iii) druhý fúzní gen, který exprimuje druhý fúzní protein, tento druhý fúzní protein obsahující druhý protein, který je schopný reagovat s prvním proteinem a který je kovalentně navázán na skupinu aktivující gen, kde aspoň první nebo druhý protein je schopen změny stavu; (b) umožnění prvnímu a druhému proteinu vzájemně reagovat; (c) měření exprese reporterového genu v první hostitelské buňce jako míry interakce mezi prvním a druhým proteinem;

(d) vytvoření druhé hostitelské buňky, která obsahuje (i) reportérový gen účinně spojený s DNA úsekem obsahujícím vazebné místo pro protein; (ii) první fúzní gen, který exprimuje první fúzní protein; a (iii) druhý fúzní gen, který exprimuje druhý fúzní protein; (iv) třetí gen, který exprimuje třetí protein; (e) umožnění prvnímu a druhému proteinu vzájemně reagovat za přítomnosti třetího proteinu; (f) měření exprese reportérového genu v druhé hostitelské buňce jako míry interakce mezi prvním a druhým proteinem za přítomnosti třetího proteinu, změna v expresi reportérového genu v druhé hostitelské buňce v porovnání s tou, změřenou v první hostitelské buňce znamená, že třetí protein působí změnu stavu prvního nebo druhého proteinu, která má za následek změnu schopnosti prvního a druhého proteinu vzájemně reagovat.

• ·

V navrhovaném provedení každého výše uvedeného způsobuje změna stavu konformační žíněnou; protein, u kterého dochází ke konformační změně, je Ras protein; hostitelská buňka je kvasinka nebo savčí buňka; exprese prvního fuzního proteinu a třetího proteinu je odpovědí na extracelulární podnět; a reportérový gen vytváří signál, který je přijmut a rozpoznán druhou buňkou.

V jiném podobném pohledu vynález charakterizuje buňku, která obsahuje (i) první reportérový gen účinně spojený s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro první protein; (ii) druhý reportérový gen účinně spojený s DNA úsekem obsahujícím vazebné místo pro druhý protein; (iii) první fúzní gen, který exprimuje první fúzní protein, tento první fúzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopna se specificky vázat na vazebné místo pro první protein; (iv) druhý fúzní gen, který exprimuje druhý fúzní protein, druhý fúzní protein obsahující druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopna se specificky vázat na vazebné místo pro druhý protein; a (v) třetí fuzní gen, který exprimuje třetí fuzní protein, třetí fúzní protein obsahující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen.

V navrhovaných provedeních může být snížena úroveň exprese aspoň u prvního nebo druhého reporterového genu; vazebným místem pro první nebo druhý protein je operátor pro tetracyklin; jedním z reportérových genů je URA3 nebo lacZ; buď první nebo druhý reporterový gen vytváří signál, který je přijmut a rozpoznán druhou buňkou; a hostitelská buňka je kvasinka nebo savčí buňka.

• ·

V dalším podobném pohledu vynález charakterizuje reportéra vý gen, který obsahuje operátor pro tetracyklin účinně spojený s genem kódujícím zjistitelný produkt (např. URA3 gen nebo lacZ gen).

V posledním pohledu vynález charakterizuje způsob zjišťující, zda určitý protein reaguje s transkripčním faktorem, který zahrnuje: (a) vytvoření hostitelské buňky, která obsahuje (i) reportéra vý gen, jehož úroveň exprese může být snížena, reportérovy gen je účinně spojen s úsekem DNA obsahujícím vazebné místo pro protein; (iii) první ťuzní gen, který exprimuje první tužní protein, tento první ťuzní protein obsahující transkripční aktivátor kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopna se specificky navázat na vazebné místo pro protein; a (v) druhý tužní gen, který exprimuje druhý tužní protein, tento druhý tužní protein obsahující měřený protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen; (b) určení zvýšení exprese reportéra vého genu jako známky interakce mezi měřeným proteinem a transkripčním faktorem.

V navrhovaných provedeních je reportérovým genem URA3 gen; úroveň exprese je snížena 6-azauracilem; vazebným místem pro protein je operátor pro tetracyklin; úroveň exprese je snížena tetracyklinem nebo tetracyklínovým derivátem; a hostitelská buňka je kvasinka nebo savčí buňka.

„Reportérovým genem“ se míní úsek nukleové kyseliny, jehož exprese může být analyzována; mezi takové geny patří, bez omezení, lacZ, aminokyselinové biosyntetické geny a gen pro savčí transacetylasu chloramfenikolu (CAT). Reportérové geny mohou být analyzovány například pomocí změny v životaschop• · • · • ·· · · ·· · • ··· · ·· · • · · ··· ·· · • ·· · · ·· · • · · · · · · · nosti buňky nebo barevnou reakcí.

„Výstupem exprese“ se míní jakákoliv měřitelná změna exprese reportérového genu.

„Vazebným místem pro peptid“ se míní úsek nukleové kyseliny, který může být rozpoznán a vázán proteinem nebo peptidem.

„Transkripčním aktivátorem“ se míní úsek aminokyselin, který je schopný zvýšit expresi genu, ke kterému se váže. „Skupina aktivující gen“ je celý, nebo část takového transkripčního aktivátoru, která je schopna zvýšit expresi genu.

„Tetracyklinovým derivátem“ se míní sloučenina, která je odvozena od tetracyklinu, a která je schopna inhibovat navázání represoru tetracyklinu na operátor pro tetracyklin. Příkladem tetracyklinového derivátu je anhydrotetracyklin.

„Změnou stavu“ se míní fyzikální nebo chemická změna proteinu, která pozměňuje jeho aktivitu. Příklady změny stavu zahrnují změny ve fosfory lačním profilu nebo konformaci.

Další rysy a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a z nároků.

Nejdříve budou popsány kresby.

• ·

.......... · • ······· ·· ··· ·· ·· · ···· ··· • · · ·· ·· ··

Přehled obrázků ve výkresech

Obrázky 1A až 1C jsou sledem tří panelů, které schematicky znázorňují typickou interakční past tohoto vynálezu s dvěma cílovými proteiny. V buňce 1 (Obr. 1 A), na mediu s glukosou jsou fuze (cílový protein 1, Cpi) transkripčně inertního tetracyklinového represoru (TetR) a LexA fuze (cílový protein 2, Cp2) navázány, v tomto pořadí, na Tet a LexA operátory, které jsou umístěny ve směru 5' od reportérových genů. Potencionálně reagující protein, který je sloučený s transkripční aktivační doménou B42, není exprimován (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)). V tomto systému není aktivován ani reportérový gen, buňka roste na médiu s 5-fluoroorotovou kyselinou (5-FOA) a neroste na médiu s uracilem a je bílá na médiu s 5-brom-4-chlor3-indoyl-P-D-galaktosidem (Xgal). V buňce 2 (Obr. IB) v galaktosovém a rafínosovém mediu je lovící protein 1, což je protein spojený s B42, exprimován, ale nereaguje s jiným substrátem. Reportérové geny nejsou aktivovány, buňka roste na 5-FOA nebo neroste na uracilovém mediu, a je bílá na Xgal. V buňce 3 (Obr. 1C) na galaktosovém a rafínosovém mediu je exprimován lovící protein 2, který reaguje s Cpi, ale ne s Cp2. V této buňce je selektivně exprimován referenční gen URA3, buňka roste na uracilovém mediu, aleje bílá na Xgal.

Obrázek 2 je tabulka výsledků zobrazující buňky, které zaznamenávají logické „a“ a rozlišující vztah („Lsl“ a „Ls2“) na interakčních vztazích Aj a A₂. Buňky obsahují označené cílové a lovící proteiny; lovící proteiny jsou exprimovány pouze na galaktosovém a rafínosovém mediu. Pro produkci reportéru svědčí růst nebo modrá barva na označeném mediu. Pro A vztah, lovící protein se spojí s oběmi návnadami a aktivuje oba reportéry (TetOp• · • ·

URA3 a LexOp-LacZ). Pro Lsl vztah, lovící protein reaguje pouze s návnadou spojenou s LexA a aktivuje pouze reportér LexOp-lacZ. Obdobně v Ls2 vztahu, lovící protein reaguje pouze s návnadou spojenou s TetR a aktivuje pouze reportér TetOpURA3.

Obrázky 3A až 3C jsou sledem výsledků zobrazujících buňky, které zaznamenávají logické A na vložených proteinech. Obrázek 3 A je tabulka znázorňující expresi reportéru LexOp-LacZ u CWXY2 buněk 1 a 2; exprese je vyjádřena intenzitou modré barvy na plotnách LHWK/Gal+Raff+Xgal (viz níže) a jejich βgalaktosidásovou aktivitou (vyjádřenou v Millerových jednotkách). Obrázek 3B je schematickým zobrazením dvou buněk s TetR-Cdc25 (907-1589) nebo TetR-GAP v mediu Gal+Raff+ +Xgal (viz níže). V buňce 1 na plotně Gal+Raff, TetR-Cdc25 nabíjí LexA-RasA186 s GTP, čímž umožňuje navázání více B42c-Rafl a zvýšenou transkripci reportéru LexAOp-lacZ. V buňce 2 TetR-GAP stimuluje Ras GTPásovou aktivitu tak, že LexA-Ras je v GDP formě, což má za následek menší vázání B42-c-Rafl a sníženou transkripci reportéru LexAOp-LacZ. Obrázek 3C je tabulka přesně vystihující výsledky působení na vstupy proteinů.

Na tomto obrázku „1“ v druhém sloupci označuje přítomnost TetR-Gap nebo TetR-Cdc25 a „0“ nebo „1“ v třetím sloupci označuje malý nebo velký výstup β-galaktosidásy.

Obrázek 4 je schematickým zobrazením buňky, která vytváří produkt, který může být čten výrobní buňkou nebo druhou, příjmovou buňkou.

Obrázek 5 je schematickým zobrazením buňky, která má čtyři kanály vstup -výstup.

Obrázek 6 je schematickým zobrazením plně biologického obvodu, který funguje jako tranzistor.

Jak je zde popsáno, uvedený vynález nabízí způsoby a činidla pro zjišťování nebo zaznamenávání komplexních vztahů mezi dvěma nebo více proteiny. Mnoho z těchto vztahů, například, „přemosťování“ (nebo spojování) a „rozlišující“ interakce, jsou užitečné pro porozumnění genové funkci. Jak je prokázáno níže, aplikací logických operací na fěnotypové výsledky nových i existujících dvouhybridních buněčných interakcí, mohou být určeny podrobné modely funkce proteinů v cestách a komplexech. Vztahy mezi proteiny určené těmito buňkami jsou analogní klasickým genetickým vztahům jako je epistáze, ale mohou být interpretovány uvnitř pevného analytického rámce, a mohou být systematicky předvedeny na produktech celého genomu. Navíc buňky, které zaznamenávají takové vztahy, mohou provádět logické operace na vložených proteinech, a tím mohou určit cesty pro konstrukci biologických výpočetních zařízení.

Příklady provedení vynálezu

Předběžné úvahy: Logické vztahy mezi proteiny ve dvouhybridních systémech

V klasickém (Jeden cílový protein“) dvouhybridním systému, výstup reportérového genu závisí na interakci mezi cílovým proteinem vázaným na DNA a aktivovaným lovícím proteinem. Genové produkty exprimované některými reportéry, například URA3, umožňují selekci proti transkripci reportéru a tím také proti nedostatku interakcí (Le Douaarin et al., Nucl. Acids Res. 23:876-8 (1995)). Vztah mezi proteiny v těchto systémech • · • · může být popsán logickými výrazy.

Podle tohoto pohledu, spojení mezi cílovým proteinem (Cpi) a lovícím proteinem (Li) určuje variabilní (Al), zde nazývaný kontaktní vztah. Protože je Al určená výstupem reportéru, je výraz Al použit také pro označení výstupu reportéru. Existují čtyři Booleanské operace nebo funkce pro tyto vztahy (Schneeweiss, Boolean Functions: With Engineering Applications and Computer Programs (Springer-Verlag, Berlin, New York, 1989)). Dvě z nich jsou konstantní funkce: Fl (Al) = 0 a F2 (Al) = 1 a dvě jsou pravé funkce: F3 (Al) = Al a F4 (Al) = ne A.

V systémech s jedním cílovým proteinem mohou fenotypové důsledky výstupu reportéru nabývat podle kontaktního vztahu dvě z těchto funkcí, F3 a F4. To je zobrazeno v tabulce 1. V této tabulce je označen kontaktní vztah mezi cílovým proteinem Cpi a lovícím proteinem Ll jako Al a je měřen jako výstup reportéru. Takže se hodnoty Al (0 a 1) vztahují k oběma hodnotám kontaktního vztahu a k vypnutému a zapnutému stavu reportéru. „Hodnota Al“ má dvě možné hodnoty A 1(0 a 1 nebo vypnuto a zapnuto). „Operace“ má dvě možné hodnoty (funkce) na Al. Dva podsloupce „Výsledky operace“ se vztahují k výstupu operací na Al. „Alternativní označení“ dává běžná jména pro operace. „Interpretace“ popisuje stav interakce mezi cílovým a lovícím proteinem. „Definování fenotypu“ dává fenotyp pro kontaktní vztah v systému s jedním cílovým proteinem a „Příklad biologických korelátů“ dává příklady biologických okolností, které mohou způsobit takové výsledky.

V tabulce 1, F3 i F4 mají důležité biologické koreláty. Uvažte systém s jedním cílovým proteinem, v kterém spojení

• ft · · • ftftft · • · · · · • · · · · · • ftftft · • · · · mezi Cpi a Ll (tento příklad, protože tyto proteiny tvoří heterodimery) dává pozitivní výsledek (modrá barva na X-Gal, růst na Ura-mediu), zatímco ztráta tohoto kontaktu (například mutací nebo rozrušením peptidového aptameru) (Colas et al., Nátuře 380: 548-550 (1996)) dává negativní výsledek (bílá barva na X-Gal, růst na 5-FOA mediu) (Tabulka 1). Buňka rostoucí na 5-FOA mediu je analogní k prostředku, který předvádí logickou Ne operaci při kontaktním vztahu nebo eventuelně k buňce, která zaznamenává stav (Ne Al).

Buňky, které detekují komplexnější vztahy mezi proteiny

Byly vytvořeny buňky, které umožnili současnou selekci pro a proti dvěma interakcím protein - protein (Obrázek 1A až 1C). Tato interakční past s dvěmi cílovými proteiny využila vazebné skupiny DNA LexA a TetR, tetracyklinového represoru bakteriálního transposonu TnlO (Gossen a Bujard, Proč. Nati. Acad. Sci. 89:5547-51 (1992)). LexA a TetR fuzní cílové proteiny byli exprimovány v kvasince, která také obsahovala integrovaný TetOp-URA3 reportér a episomální LexAOp-lacZ reportér. Exprese cílových proteinů v těchto buňkách s dvěmi cílovými proteiny byla pod kontrolou ADH1 promotoru. TetOp-URA3 reportér byl integrován do LYS2 genu. LexAOp-lacZ reportér, derivát pSH18-34, byl přenesen na pCXW24, 2 pm plasmid s LYS2 markérem. Lovícím vektorem byl p JG4-5, jehož GAL1 promotor podmíněně usměrňoval expresi aktivací označeného proteinu z 2 pm TRPÍ plasmidu (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)).

Logické operace u kontaktního vztahu v interakční pasti s dvěmi cílovými proteiny • · • ·

U buněk s dvěma cílovými proteiny byly dva kontaktní vztahy (a výdej příslušných reportérů) vyjádřeny jako Booleanské proměnné, Al a A2. Na těchto proměnných bylo možných 16 operací (Schneeweiss, Boolean Functions: With engineering Applications and Computer Programs (Springer - Verlag, Berlin, New York, 1989)), u těchto buněk byli zjištěny čtyři z nich. Tyto operace byly označeny jako A, ANI, a dvě rozlišující operace, logický stav 1 (Lsl) a logický stav 2 (Ls2). Bylo určeno, že Lsl a Ls2 reprezentují velmi užitečné operace pro určování funkcí proteinů. Přehled těchto operací je zobrazen v tabulce 2. V této tabulce je kontaktní vztah mezi Cpi a Ll označen jako Al a je měřen výdejem TetOp-URA3 reportéru. Kontaktní vztah mezi Cp2 a Lije označen jako A2 a je měřen výdejem LexAop-lacZ reportéru. Znovu jsou hodnoty Al a A2 (0 a 1) užity pro označení obou hodnot kontaktního vztahu a hodnot (stav vypnuto a zapnuto) reportéru. Čtyři podsloupce „Hodnota proměnných“ označují čtyři rozdílné možné kombinace hodnot pro obě proměnné. „Operace“ ukazuje čtyři operace na těchto proměnných, které jsou možné v tomto systému. „Alternativní jména“ dává běžná jména těmto operacím. „Interpretace“ popisuje stav interakcí mezi cílovým a lovícím proteinem. „Určující fenotyp“ dává fenotyp pro kontaktní vztah v systému s jedním cílovým proteinem a „Příklad biologických korelátů“ dává příklady biologických okolností, které můžou mít za následek takovou produkci.

Pro testování celkové funkčnosti systému byla použita sestava názorných proteinů nazvaných RasAigó, RasAi₅Ai₈₆, RasV₁₂Ai₈₆, GAP, hSosl (zbytky 601 - 1019), Cdc25 (zbytky 907 - 1589), c-Rafl (zbytky 1-313), Max a Mxil. Produkt Harvey ras genu, Ras, je GTPasa, která má dvě odlišné konformace, GDP vázanou (neaktivní) formu a GTP vázanou (aktivní) • · · • · · • · * • · « · * · * * * • ····· · · • · · · formu. Skutečnost, že Ras cykluje mezi těmito dvěma konformacemi mu umožňuje být přepínačovým proteinem v signálních převodních cestách, které kontrolují buněčnou proliferaci (Boguski a McCormack, Nátuře 366:643-654 (1993)). Všechny zde popsané Ras proteiny obsahovali záměnu Cys za Ala na 186, která inaktivovala místo famesylace a zvýšila zřejmou jadernou koncentraci proteinu. RasAi₈₆ existuje ve směsi GDP a GTP vázaných forem, zatímco RasAi₅Ai8₆ a RasVi₂Ai₈₆ jsou převážně v GTP a GDP vázaných formách, v tomto pořadí. GAP, který stimuluje GTPásovou aktivitu Ras, se váže k Ras vázanému na GTP. c-Rafl, který je cílem pro Ras ve směru ke konci 3', také váže Ras vázaný na GTP. Naopak hSosl a Cdc25, kteří oba aktivují Ras, se váží pouze na Ras vázaný na GDP. Max a Mxi 1, které tvoří pevné heterodimery, byly použity jako pozitivní kontroly (Zervos et al., Cell 79:388 (1993)).

Obrázek 2 ukazuje, že buňka s dvěma cílovými proteiny zaznamenala operaci logické A. Tento vztah je naplněn proteiny, jako např. přemosťující proteiny v cestách, které mohou reagovat s oběma cílovými proteiny. V tomto experimentu kvasinkový kmen CWXY2 nesl B42-RasA_]86 jako lovící protein, TetR-c-Rafl a LexA-hSosl jako cílové proteiny a TetOp-URA3 a LexAOpLacZ jako reportéry. B42-RasAi₈₆ reagoval s TetR-c-Rafl i LexA-hSosl. Buňka byla modrá na Xgal a rostla na mediu bez uracilu. Tento přemosťující nebo spojující vztah byl v souladu s myšlenkou, že Ras reagoval s oběma proteiny a naznačoval, že proteiny, které aktivují oba reportéry, mohou být vybrány z celogenomové knihovny.

Navíc obrázek 2 ukazuje, že systém s dvěma cílovými proteiny také zaznamenal rozlišující vztahy Lsl a Ls2. Tyto vztahy • « • · · se předpokládají pro proteiny, které reagují s jedním cílovým proteinem, ale ne s druhým. U buněk exprimujících TetR-RasVi₂Ai₈₆ a LexA-Max cílové proteiny a lovící protein B42-c-Rafl, tato Ras -Raf interakce aktivovala TetOp-URA3 reportér, a buňky rostly na mediu bez uracilu; Raf nereagoval s LexA-Max, a proto neaktivoval lacZ reportér. Na druhé straně u buňky exprimující TetRasVi₂Ai86 a LexA-Max cílové proteiny a lovící protein B42Mxil, interakce Max- Mxil aktivovala LexAop-LacZ reportér a tyto buňky na Xgal zmodraly; Mxil nereagoval s Ras, a proto neaktivoval URA3 reportér.

Kromě toho výsledky na obrázku 2 naznačily, že tyto buňky by od sebe mohly odlišit dvě blízké alelické varianty. U buněk exprimujících TetR-RasAi₅Ai₈6, LexA-RasVi₂Ai₈₆ a B42-c-Rafl, RafRasVi₂Ai₈₆ interakce aktivovala expresi LexAop-LacZ reportéru; buňky zmodraly na Xgal, ale nerostly na mediu bez uracilu. Naopak u buněk exprimujících TetR-RasAi₅Ai₈₆, LexA-RasVj₂ Ai₈₆ a B42-Cdc25, Cdc25/RasAi₅Ai₈₆ interakce aktivovala TetOp-TJRA3 reportér a umožnila buňkám růst na mediu bez uracilu, ale způsobila, že zůstaly bílé na Xgal. Tento výsledek naznačil, že tyto buňky by mohly identifikovat, z genomových nebo kombinatomích knihoven, proteiny a peptidy, které reagují s variantami alelických proteinů specifických pro různá onemocnění.

Identifikace peptidových aptamerů, které odlišují alelické varianty

Buňka s dvěma cílovými proteiny obsahující TetR-RasVi₂ a LexA-Rasis byla použita pro izolování prvků knihovny peptidových aptamerů, které reagovaly specificky s RasVj₂. Transformované buňky knihovny TJRA+ byli prohledány pro lacZ buňky, • · 4 » 4 « • « · * * 4 · · · 4

4» «4 * • « 4 · · » « 4 · · • · · · · · · * 4 « · » ·

4 4 4 · · které pravděpodobně obsahovaly apíamery, které pravděpodobně nereagovaly s LexA-RasAi₅. Potom byly plasmidy kódující aptamery uvolněny z těchto lacZ+ buněk a potvrzeny jejich fenotypy. S použitím tohoto systému byly identifikovány dva rozlišující aptamery, Pep22 a Pepi04. Pep22 reagoval s RasVi2 i s RasAi₅, zatímco Pepi04 reagoval pouze s RasVi₂. Buňky obsahující Pep22 rostli na Ura” mediu a na Xgal mediu byly modré. Buňky obsahující Pepi04 rostly na Ura” mediu, ale na Xgal mediu byly bílé. Tyto výsledky ukázaly užitečnost tohoto systému při vybírání specifických aptamerů peptidů. Pro Pep22 zvýšil druhý cílový protein selektivitu systému vyloučením možných falešně pozitivních signálů, které mohly vzniknout artefaktovou aktivací jediného reportéru. Pro Pepi04 umožnil druhý cílový protein detekci aptamerů specifických pro alelickou formu proteinu aktivního při přenosu signálu. Sekvence Pep22 a Pepi04 jsou DMDWFFRFY ASVSRLFRHLH (SEQ ID NO: 15) a FWQATLRLVSDKLILL YPDP (SEQ ID NO: 16) v daném pořadí.

Logické operace pro vstupy proteinů

Buňky mohou také provádět logické operace pro vstup proteinů a zaznamenávat výsledky těchto operací změnami ve výstupu. Obrázky 3A až 3C znázorňují operaci logické A pro vstup proteinů. U buněk exprimuj ících LexA-Rasi₈₆, B42-c-Rafl a TetR-GAP byl výstup LexAop-lacZ reportéru nízký (bledě modrá na Xgal mediu), pravděpodobně proto, že GAP vedl většinu Ras do konformačního stavu s navázaným GDP. Naopak vstup TetRCdc25 zvýšil interakci RasAi₈₆/c-Rafl, což ukázala intenzita modré barvy na Xgal plotnách, pravděpodobně změnou konformace Ras na konformaci vázající Raf. V tomto experimentu měla buňka dva vstupy, jeden z nich, B42-c-Rafl (logická hodnota 1) «τ • ft « ft · · • · ? * • ft ···· • > » ·· · ftft ** • · « i ft ft r · i • ft « • ft ·« • t • ft • • · byl přítomen stále; a výstup byl buď vysoký (1) nebo nízký (0).

V tomto případě byl tedy výstup reportéru LexAop-lacZ kontrolován přepínacím proteinem LexA-Ras, jehož konformace byla závislá na hodnotách vstupu.

Alternativou výše zmíněného systému může být nahrazení Cdc25 pomocí hSosl a výsledky budou podobné. Navíc může být exprese systémových komponent dále regulována. V systémech popsaných výše může být například B42-c-Rafl exprimován pomocí GAL1 promotoru a/nebo mohou být Cdc25 a hSos exprimovány z promotoru normálně potlačovaného TetR-Sin3. Tyto výsledky exprese B42-c-Rafl jsou závislé na přítomnosti galaktosy v růstovém mediu a exprese Cdc25 a hSosl je závislá na přítomnosti tetracyklinu nebo tetracyklinového derivátu v růstovém mediu. Buňka v těchto systémech odpovídá na dva odlišné extracelulámí vstupy, první, který řídí expresi modifikujícího proteinu, a druhý, který řídí expresi lovícího proteinu.

Vztahy mezi proteiny ve dvouhybridních systémech

Na základě experimentů zmíněných výše mohou být výstupy reportérových genů ve dvouhybridních systémech s jedním cílovým proteinem vyjádřeny dvěma základními logickými stavy. Aktivace reportérového genu je vyjádřena kontaktním vztahem Al mezi cílovým proteinem 1 (Cpi) a lovícím proteinem (Ll).

Ne Al (mezi Cpi a Ll) znamená nepřítomnost interakce, která může být způsobená například mutací reagujících proteinů, nebo narušením interakce třetím proteinem, nebo peptidovým aptamerem (Colas et al., Nátuře 380:548-550 (1996)).

• β • · • · • · · ···· ···· • · · * · ··· · ·· · • ······· · · · « · · · · ·· · ···· · · · · • · · «· ·· ·· · ·

Vytvoření buněk s nezávisle fungujícími interakčními reportéry

Jak je popsáno výše, byly vytvořeny buňky, které odhalily komplexnější vztahy mezi proteiny pomocí varianty interakční pasti, která využívala skupiny vážící DNA LexA a TetR, což je tetracyklinový represor bakteriálního transpozonu TnlO. Fůzní proteiny obsahující tyto skupiny byly exprimovány jako dva cílové proteiny v buňce, která také obsahovala TetOp-URA3 a LexAop-lacZ reportéry. Tento systém umožnil souběžné určení dvou genetických interakcí v jedné buňce.

Využití TetR cílových proteinů a TetOp-URA3 reportérů značně usnadnilo aplikace s interakční pastí. Fenotyp závislý na TetOp-URA3 reportéru byl citlivější, než ten, závislý na lacZ a LEU2 reportérech (viz například Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993) a Estojak et al., Mol. Cell. Biol. 15: 5820-9 (1995)), což usnadňuje detekci slabých interakcí. Navíc oba reportérové geny URA3 a LacZ mohou být kvantitativně otestovány (Shostak et al., Anal. Biochem. 191:365-9 (1990)). Navíc senzitivita tohoto URA3 reportéru může být snížena dvěma způsoby. Exprese reportéru URA3 může být titrována pomocí 6-azauracilu, inhibitoru genového produktu URA3 (orotidin-5 '-mono fosfát dekarboxylasa (OMPdekasa))(Le Douarin et al., Nucl. Acids Res. 23:876-8 (1995)). Aktivita reportéru může být také snížena tetracyklinem, nebo jeho deriváty (například anhydrotetracy klínem), které rozrušují navázání cílového proteinu TetR na operátory Tet. Takové sloučeniny se používají v koncentraci pokud možno do 100 pg/ml na destičkách. Oba typy inhibitorů snižují senzitivitu URA3 reportéru, což umožňuje jejich použití s cílovými proteiny aktivujícími transkripci a, společně s s lacZ, pro hrubé odhadnutí inter• · • · • · ··· ·*·· · · · » • ··· · ··· · · · · • ······· ·· ··· ·· · akčních afinit. Navíc reportér URA3 umožňuje použití 5-FOA pro selekci proti genové expresi (Bceke et al., Mol. Gen. Genet. 197:345-6 (1984)). V tomto případě může tetracyklin a 6-azauracil regulovat prahové množství transkripce zvolené proti usnadnění výběru peptidových aptamerů, které ruší specifické vazby mezi proteiny.

Logická analýza vazeb mezi proteiny binárního a vyššího řádu

Jak je zobrazeno v tabulce 2, buňky s dvěma cílovými proteiny zaznamenaly čtyři logické vztahy, Ne, A, Lsl a Ls2. Tři jsou obzvláště důležité. Vztah A (Al (mezi Cpi a Ll) a A2 (mezi Cp2 a Ll)) byl zjištěn pro lovící proteiny (spojující proteiny), které se spojily s oběma cílovými proteiny (tabulka 2). Identifikace takových proteinů je užitečná pro spojitou konstrukci hustých map genových sítí a pro spojování cest, o kterých nebylo dříve známo, že by byly spojené. Takové sady vzájemně reagujících proteinů se někdy nazývají „protein contigs (styčné proteiny)“.

Odlišující vztahy Lsl a Ls2 byly také důležité. Tyto vztahy jsou relativně komplexní: například, vztah Lsl zahrnuje dvě operace na dvou interakcích: Ne Al (mezi Cpi a Ll) a A2 (mezi Cp2 a Ll). Tyto operace mají četné biologické koreláty. Buňka, která zaznamenává tento vztah, umožňuje detekci proteinů, které reagují odlišně s nesouvisejícími proteiny, alelickými variantami a rozdílnými konformačními stavy (obrázek 2), a také umožňuje detekci proteinů, které reagují odlišně s různě modifikovanými stavy. Využití těchto stavů pro vytváření přehledů produktů kombinatomích knihoven a genomů umožňuje výběr proteinů reagujících specificky s proteiny kódovanými alelami ve stavu nemoci, • · • · · · · · • · · · · · · nebo s proteiny, které se liší od normálních v důsledku rozdílného sestřihu nebo posttranslační modifikace.

Analýza vztahů vyššího řádu mezi proteiny

Vztahy mezi proteiny, které mohou být odvozeny z buněk s dvěma cílovými proteiny, nejsou vždy stejné jako ty získané pomocí buněk s jedním cílovým proteinem. Jestliže například Cpi i Cp2 vytvoří oligomer s povrchem reagujícím s L, potom nezjistíme v buňkách s jedním cílovým proteinem ani Cpl/L ani Cp2/L interakci. Takové rozdíly v kontaktních vztazích jsou užitečné, protože sloučení dat z buněk s jedním a se dvěmi cílovými proteiny umožňuje experimentátorovi vytvářet domněnky o topologii, temporální sekvenci a posttranslační modifikaci v závislosti na proteinových interakcích.

Tabulka 3 znázorňuje hypotézy fyzikálních interakcí mezi třemi proteiny, X, Y a Z: (i) z možných výstupů buňky se dvěma cílovými proteiny, která zaznamenává kontaktní vztahy Al (mezi X a Z), A2 (mezi Y a Z) a A3 (mezi X a Υ). V této tabulce zobrazuje „výdej reportéru“ stav kontaktních vztahů určený výdejem reportérů ve třech buňkách s jedním cílovým proteinem a v jedné buňce se dvěmi cílovými proteiny. X a Z jsou připojeny k aktivační doméně, čímž vytvoří lovící proteiny [L(X) a L(Z)] a Y a X jsou připojeny k doméně vážící DNA, čímž vytvoří cílové proteiny [Cp(X) a Cp(Y)]. V buňce se dvěma cílovými proteiny, které jsou spojeny s jednou ze dvou domén vážících DNA [Cpl(X), nebo Cp2(Y)] a aktivační doménou [L(Z)], ukazují výdeje reportérů stav kontaktního vztahu proteinů X, Y a Z. “Fyzikální vyhodnocení” ukazuje jeden možný biologický výklad tohoto souboru výdejů reportérů pro kombinaci dat s jedním a se dvěma cílovými • · ·

• · proteiny, nebo pouze pro data s jedním cílovým proteinem. Všechny vzory v tabulce 3 nemusí mít biologické koreláty, ačkoliv řada z nich byla pozorována, např. interakce cílového proteinu 1 a lovícího proteinu závisí na přítomnosti cílového proteinu 2. Takové experimenty jako ty popsané v tabulce 3, které určují vztahy dat s jedním a se dvěma cílovými proteiny, jsou užitečné při stanovování funkcí proteinů v kaskádách a komplexech.

Aplikace pro funkční genovou analýzu

Tento systém s dvěma cílovými proteiny, především pokud je spojen s existujícími systémy s jedním cílovým proteinem, rozšiřuje možnosti technologie kvasinkových interakcí o analýzu genových funkcí. Může pomoci identifikovat proteiny a aptamery peptidů, které rozliší alelické varianty proteinů. Navíc spojení dat z buněk se dvěma cílovými proteiny (pravděpodobně jako výsledek samostatných experimentů) a z buněk s jedním cílovým proteinem (snad získaných z genové mapy) umožňuje detailní analýzu funkce proteinů a kontaktní topologii v cestách a komplexech. Dále umožňuje přesnější analýzu topologie proteinů v multiproteinových komplexech a poskytuje pevné, měřitelné, poloautomatické možnosti pro rozlišování mezi alternativními modely proteinových interakcí. A navíc mohou být určeny průmyslově, protože vztahy mezi proteiny určené tímto způsobem jsou předurčeny pro systematickou analýzu.

K logickému obvodu založenému na proteinu a transkripci

Výše zmíněné experimenty využívaly protein, Ras, který cykluje mezi dvěmi konformačními stavy, a protein připojující se při aktivaci, Raf, který se váže na Ras v jednom z těchto stavů.

Bylo zjištěno, že okolnosti přeměny Ras a jeho výdej měřený transkripcí kolísají v závislosti na tom, zda vloženým proteinem byl GAP nebo Cdc25. V těchto experimentech se buňky chovaly jako A brány, v kterých byl jeden vstup, B42-c-Rafl, udržován konstantní (logická hodnota 1), druhý byl buď Gap (logická hodnota 0) nebo Cdc25 (logická hodnota 1) a fenotypy vzniklé expresí reportérů vytvořily výstupy. S B42-c-Rafl a Gap byla výstupem nízká aktivita β-galaktosidázy (0). S B42-c-Rafl a Cdc25 byla výstupem vysoká aktivita β-galaktosidázy (1). Ačkoliv toto bylo měřeno také expresí reportéru, tato A operace nebyla operací kontaktního vztahu jako ty popsané dříve. Tato operace byla, přesněji řečeno, na vstupy proteinů a buňky se v tomto případě chovaly jako pravé logické brány.

Aby došlo ke změně vstupů, v buňkách zde popsaných byly využity rozdílné konstrukce DNA, které označily vzájemně působící proteiny; pro měření výstupů bylo zapotřebí lidských nebo jiných pozorovatelů. Vytvoření plně biologického na transkripci založeného logického obvodu vyžaduje nahrazení těchto vstupů a výstupů logickými vstupy, jež kolísají v závislosti na mimobuněčných podnětech jakými jsou např. peptidové feromony, nebo světlo a výstupech, které vytvářejí takové podněty.

Příklady systémů využívajících takové biologické obvody jsou zobrazeny na obrázku 4 až 6. Především je na obrázku 4 popsána buňka, která vytváří výstup, který může být čten produkující buňkou nebo druhou recipientní buňkou jako odpověď na vstup. Jak je zobrazeno na obrázku 4, přidání vstupního proteinu, kvasinkového α-faktoru, má za následek expresi, cestou G proteinu, TGF-β výstupu, jenž může být přijmut stejnou nebo druhou buňkou, a který může vytvořit změnu ve fenotypu recipientní buňky. Obrázek 4 také popisuje systém, v kterém se vstupní protein TGF-β váže na svůj receptor, což má za následek aktivaci a translokaci proteinu LexA-Madd (také označovaného jako LexASmad). Tento LexA-Madd protein spouští expresi výstupu kvasinkového α-faktoru, signálu, který může být čten výrobní buňkou nebo druhou recipientní buňkou a může způsobit změnu ve fenotypu recipientní buňky.

Obrázek 5 rozšiřuje tento systém a zobrazuje buňku, která má čtyři rozdílné vstupní a výstupní kanály, čímž umožňuje řadu logických operací. Na obrázku 5 vstupní proteiny α-faktor, TGFβ, delta a bradykinin interagují s receptorem pro α-faktor, receptorem pro TGF-β, „notch“ receptorem a receptorem pro bradykinin, v daném pořadí, čímž aktivují kaskády, která mají za následek expresi výstupních proteinů, které mohou být čteny buněčnými systémy, např. jako změny v transkripci. Jak se zvyšuje počet vstupních i výstupních variant, zvyšuje se i počet kanálů, které mohou být programovány; například buňka, která má 10 vstupních/výstupních kanálů může být naprogramována na 2¹⁰ nebo více než 1 000 rozdílných stavů. V jednom z typických přístupů ke zvyšujícímu se počtu vstupních/výstupních kanálů může být protein, jako např. LexA-Smad protein zmíněný výše, vytvořen tak, že bude obsahovat různé aptamerické skupiny s různou receptorovou specifícitou. Kromě toho v těchto systémech může být vstupem, spíše než nějaký protein, jiný mimobuněčný podnět, takový jako např. světlo nebo určitá vlnová délka světla, která spustí specifickou fotoreceptorovou cestu. V takovém systému je výstupem, pokud možno, fluorescenční protein, jako například zelený, červený nebo modrý fluorescenční protein.

Jeden definitivní typ plně biologického obvodu je popsán

na obrázku 6. Tato buňka představuje vzorový „tranzistor“. V této buňce je za přítomnosti zeleného světla spuštěn reportérový gen exprimující HIV proteázu. Tato proteáza potom štěpí cílovou spojku, která spojuje dohromady chiméru modrého fluorescenčního proteinu se zeleným fluorescenčním proteinem, jejichž rozpojení má za následek značné snížení výstupu zeleného světla.

Plně biologické logické prostředky popsané výše nemusí být příliš rychlé. Ačkoliv jeden z těchto přepínacích proteinů,

Ras, může cyklovat v milisekundách a řada signálních transdukčních cest může poskytnout vstupy během minut (Bray, Nátuře 376:307-312 (1995)), reportérové výstupy mohou vyžadovat minuty až hodiny, aby byly detekovatelné. Přestože požadované konstrukční úpravy v blízkosti DNA mohou být provedeny pomocí přímočarých technik, je pravděpodobné, že genová exprese zůstane užitečných výstupem. Vytváření takových obvodů je usnadněno rychlým růstem počtu přirozených a uměle vybraných proteinových domén s užitečnými allosterickými a cílovými vlastnostmi (Colas et al., Nátuře 380:548-550 (1996)). Proto je možné, že takové technologie založené na transkripci připraví prvotní cestu k biologickým výpočtům.

Materiály a metody

Systém s dvěma cílovými proteiny

V experimentech popsaných výše byly vektory pEG202 a pJG4-5 použity jako plazmidy Ba₂ a lovícího proteinu (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)). Dále byly vytvořeny Bai expresní plazmid, pCWX200, LexAOp-LacZ reportérový plazmid, pCWX24 a TetOp-URA3 reportérové vektory, které byly integrovány do řetězců Saccharomyces cerevisiae, aby vytvořily CWXY1 • · • · · · ··· · ·· · • · · · · ··· • ·· ·· ·· · · a CWXY2 jak bude dále popsáno.

Vytvoření expresního vektoru pCWX200 fuzního proteinu TetR.

pCWX200 nesl 2 pm replikátor a znak LEU2. Promotor a klonovací oblast byly odvozeny z pEG202 a kostra z pBCIOO, derivátu Yeplacl81 (Gietz and Sugino, Gene 74:527-534 (1988)). Aby došlo k odstranění vícespojkové oblasti pBCIOO (od AccI po EcoRI), stejně tak jako DNA kódující aminoterminální úsek βgalaktosidasy, byl vektor rozštěpen NarUAccl a znovu spojen, aby vznikl pCWXlOO. Místo Hindlll bylo potom vymazáno rozštěpením pCWXlOO pomocí Hindlll, konce upraveny Klenowem a znovu spojeny za vzniku pCWXlOOA/fzWIII. Sphl fragment pEG202 obsahující ADH1 promotor, LexA vícevaznou spojku a ADH1 terminátor byl potom vložen do Sphl místa pCWXl 00A//zWIII za vzniku pCWX150 (Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993) and Estojak et al., Mol. Cell. Biol. 15:5820-9 (1995)). Nakonec byl EcoBl/Hindlll LexA fragment pCWX150 nahrazen PCR fragmentem zakončeným EcoRI/Hindlll, který kódoval represor Tet (TetR) (Zervos et al., Cell 79:388 (1993)). Výsledný plazmid pCWX 200 měl klonovací místa obdobná těm pEG202 (Gossen and Bujard, Proč. Nati. Acad. Sci. 89:5547-51 (1992)).

Vytvoření pCWX24, reportéru LexAop-lacZ.

LexAop-lacZ reportér, markér LYS2,2 pm replikátor a zbytek plasmidové kostry pCWX24 byly získány ze středních plazmidů pCWX221, pCWXOl a pCWX21, v daném pořadí.

Vytvoření pCWX221.

Pro vytvoření tohoto plasmidu byl SH18-34T plně rozštěpen pomocí Kpnl, částečně naštěpen BamHI a vektor byl spojen s kos• · trou pBluescript naštěpenou BamHUKpnl. LexAop-LacZ reportér byl na NotUKpnl fragmentu pCWX221.

Vytvoření pCWXOl.

Pro vytvoření pCWXOl byl YeP426 rozštěpen SalUClal (Ma et al., Gene 58:201-16 (1987)) a byl získán fragment Clal-Xbal o ~5600 bp, který nesl LYS2 (Bames and Thomer, Mol. Cell. Biol. 6:2828-38 (1986)) a gen tetracyklinové rezistence pBR322 o asi 300 bp. Tento fragment byl spojen s kostrou pBSAKpnl (pBluescriptAXpwI) naštěpenou ClaUSall za vzniku pCWXOl.

Vytvoření pCWX21.

pRF24 byl naštěpen Notl a konce opracovány Klenowem za vzniku pCWX20AWo/I. Pro vytvoření pCWX21 byl pCWX20AWo/I naštěpen BamHl a spojen s 5'-GATCCGCGGCCGCG-3' (SEQ ID NO:1) za vzniku nového Notl místa.

Vytvoření pCWX24.

Pro vytvoření pCWX24 byl NotUKpnl LexOp-LacZ fragment pCWX221 vložen do NotUKpnl místa pCWX21 za vzniku pCWX22. Dále byl 5'-CTAGGGCCCTAGCATG-3' fragment vložen do Sphl místa pCWX22 za vzniku Apál místa a vektoru pCWX23. Po rozštěpení pCWX23 pomocí ApaUPmel, byl vložen LYS2 fragment pCWXOl rozštěpený Smal/Apal za vzniku pCWX24.

Vytvoření TetOp-URA3.

TetOp-URA3 byl vytvořen z plazmidů pCWX211, pCWX213T2, pCWX213T10, pCWX02T2 apCWX02T10.

• · • ·

Vytvoření pCWX211.

Po amplifikaci genu URA3 z pSH200 s 5'-AAAAGGAAAAGC GGCCGCTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTC-3' (SEQ ID NO:2) a 5'-CGGAATTCTTTCGAAAGCTACATATAAGGAA C-3' (SEQ ID NO: 3) byl PCR produkt zakončený Notl/EcoRI spojen s pBS rozštěpeným pomocí EcoRl/Notl za vzniku pCWX211.

Vytvoření pCWX213T2 a pCWX213T10.

Pro vytvoření těchto vektorů byl TtowjHI fragment pLRlAl obsahující kvasinkovou promotorovou oblast s jedinečným Xhol místem (West et al., Mol. Cell Biol. č:2467-78 (1984)) vložen do RuwHI místa pBS za vzniku pCWX210. Potom byly syntetizována dvě vlákna a spojena za vzniku DNA fragmentu zakončeného Xhol/Sall, který obsahoval dva TetO₂ operátory (Meier et al., EMBO J. 7:567-72 (1988)), jako následující (SEQ ID NO:4 a 5):

* *

TCGAGcactccctatcagtgatagagaaaacactccctatcagtgatagagaaaaG 1-------------+---------+----------+----------+---------+-------56

CgtgagggatagtcactatctcttttgtgagggatagtcactatctcttttCAGCT

Tet operátor DNA byl po připojení k sobě samému rozštěpen pomocí Xhol/Sall a rozdělen na Trakce na 0,8 % agarosovém gelu. DNA o velikostech od 100 bp do 200 bp byla vložena do Xhol místa pCWX210. Pomocí tohoto protokolu byly získány dva plazmidy, pCWX210T2 a pCWX210T10, které obsahovaly 4 a 6 TetO₂ operátorů, v daném pořadí. TscoRI zakončené Gal 1/Gal 10 promotorové oblasti pCWX210T2 a T10 byly vloženy do EcoRI místa pCWX211 za vzniku pCWX211T2 a to • · • · · · · ·· · · ♦ « · · · · · · f · • · · · · ··· * · · • ······· ·· · » · · I pCWX211T10, v daném pořadí. Dále bylo v těchto plazmidech vytvořeno Kpnl místo vložením oligo (5'-GGCCGCGGTACCG C-3') (SEQ ID NO: 6) v Notl místě za vzniku pCWX212T2 a pCWX212T10, v daném pořadí. V těchto vektorech byl TetOpURA3 reportér umístěn na Kpnl fragment. Delece Clal místa v těchto plazmidech vytvořila plazmidy pCWX213T2 a pCWX213T10. Nahrazení Kpnl fragmentu LYS2 z pCWXOl pomocí Kpnl zakončeným TetOp-URA3 z pCWX213T2 a pCWXTIO vytvořilo pCWX02T2 a pCWX02T10.

Integrace TetOp-URA3 reportéru do LYS2.

Po rozštěpení pCWX02T2 a pCWX02T10 pomocí CláUXbál byly tyto vektory transformovány do kmene Saccharomyces cerevisiae EGY40 obsahujícího pCWX200Cdi2 (Gietz et al., Yeast 11: 355-60 (1995)), což je vektor, který řídil expresi TetR-Cdi2 genu transkripčního aktivátoru (Finley and Brent, Proč., Natl.Acad.Sci 91:12980-84 (1984)). Transformované buňky byly vybírány na médiu postrádajícím uráčil a leucin. Pro každou transformaci, pCWX02T2 i pCWX02T10, bylo vybráno deset nezávislých klonů, které byly naneseny na plotny s kyselinou alfa-aminoadipovou pro odlišení těch, v kterých byl LYS2 inaktivován (Chattoo et al., Genetics 93:51-65 (1979)). Integrace genu TetOp-URA3 v místě LYS2 byla potvrzena PCR pomocí primerů, které hybridizovaly v oblastech lemujících Kpnl fragment LYS2. Vzniklá vlákna CWXY1 a CWXY2 (MATa ura3 his3 trpí leu2 lys2kkpn ;:TetOp-URA3) obsahovala 4 a 6 TetO₂ operátorů ve směru k 5' od URA3 genu, v daném pořadí.

Testy pro vztahy „A“ a diskriminační vztahy

Pro otestování interakčních vztahů byla vyvinuta řada vektorů. c-Rafl (1-313) byl klonován do EcoRMXhoY míst vektorů pCWX200 a JG4-5. Po amplifikací RasAi₅Ai₈₆, hSosl(601-1019) a Cdc25(907-1589) pomocí RasA₁₅Ai₈6 primerů 5'-GCCTGAA TTCATGACGGAATATAAGCTGG-3' (SEQ ID NO:7) a 5'CCCGAACTCGAGTCAGGAGAGCACTGCCTTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 8), hSosl (601-1019) primerů 5'-GCCTGAATTC AAAGCAGGAACTGTT-3' (SEQ ID NO: 9) a 5'-CCCGAACT CGAGCTATCGTGGTTCTATTTCTAG-3' (SEQ ID NO: 10) a primerů katalytické domény Cdc25 (907-1589) 5'GCCTGAATT CATGTCTTCGGTCTCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 11) a 5 '-CCCG AACTCGAGTTATCGAAATAACCTAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 12), byly PCR produkty RasAi₅Ai₈₆, hSosl(601-1019) a Cdc25(907-1589) zakončené EcoRXJXhol klonovány do EcoRI/Xhol míst vektorů pEG202 a pJG4-5. Po transformaci CWXY2 obsahující pCWX24 s variantami dvou cílových a lovících proteinů, viz. výše obrázek 2, transformované buňky byly naneseny na plotny postrádající leucin, histidin, lyzin a tryptofan („LHKW“) s glukosou jako zdrojem uhlíku („Glu“) a obohacené 6-azauracilem, inhibitorem URA3, v množství 100 pg/ml (Le Douarin et al., Nucl. Acids Res. 23:876-9 (1995)). Tyto plotny byly inkubovány při 30°C 12 až 48 hodin. Potom byly proužky kvasinek rozděleny do čtyř dalších ploten, LHKW/Glu+X Gal, LHKW/Galaktosa (Gal)+rafinosa (Rafť)+X Gal, LHKWU/Glu a LHKWU/Gal+Raff, viz výše, a výsledky byly hodnoceny po inkubaci při 30°C po 12-72 hodin.

Testy pro „A“ operace pro proteinové vstupy

Pro provedení doplňujících testů byl klonován do pCWX200 PCR produkt lidského GAP1 ohraničený EcoRI/Xhol, který byl amplifikován pomocí primerů 5'-GCC TGAATTCATGAAGGGGTGGTATCACGGA-3' (SEQ ID NO:13) a 5'-CCCGAACTCGAGCTA-CTTGACATCATTG GTTTTTG-3' _{(S£Q ID NQ: Cdc2}5(907_i589)(jako na obrázku 2) ohraničený EcoRI/Xhol byl také klonován do pCWX200. CWXY2 obsahující pEG202RasAi₈₆ apJGRaf(l313) byl poté dále transformován buď s pCWX200, pCWX200CDC25(907-1589) nebo s pCWX200GAP. Proužky transformovaných buněk vybrané z > 50 nezávisle transformovaných buněk byly vloženy do ploten LHWK/Glu+Xgal a LHWK/Gal+Raff+Xgal a tyto plotny byly inkubovány při 30°C

2-3 dny. Buňky na první plotně nezískaly modrou barvu, ale na druhé získaly modrou barvu o různé intenzitě. Aktivita β-galaktosidázy byla měřena kapalnými testy trojmo v buněčných poolech (Estojak et al., Mol. Cell. Biol. 15:5820-29 (1995)), z nichž každý obsahoval >50 nezávislých transformovaných buněk. Po inokulaci LHWK/Gal+Raff media při OD₆₀₀ 0,2 se stočenými buňkami vyrostlými do pozdní log fáze nebo saturace v kapalném médiu LHKW/Glu, byly kultury inkubovány při 30°C dalších 5 hodin a byly provedeny β-galaktosidázové testy, tak jak to popisuje Estojak et al. (Mol. Cell. Biol. 15:5820-29 (1995)).

cq

Tabulka 1

X o

&

o >2

X <D >/ O

Έ * >c

Pl ti > Ř .« £ ti 2 §

a>

Q <D O Ctí +-> <D 5—( <D

Ci a

>

ω

Ci <u *cš ti • ·

		• ·	•	• ·
		es
		o
		ti		ti
	es o Cl	<u X» o	js	c <υ
	><u	CO	ω
	a	°es	+->
°§	es N ctí es o	CL N es ti	o ti CL O X	CL c7 O r§
♦ <D H-> O	)CO	ω H—> O tH	o	> O Ό
J-i Λ 1 4—>	ti o o 7Š	CL 2 o ti	O • 4-» O Λ	• 4-^ CL 57 CL
es	<3 es	Ό Q 1 >	2 o	-8 ti

<

O

Ph

I ctí a

°2 ‘2

7tí tl <D

Ci • w-M

^ctí ><u

Ph <D

O ctí tn <U m

Ph

O o

<3

N

O

Xi

Ph • · · · cn

H

Alternativní označení Definovaný fenotyp Interpretace

-Q >§ ε

o cu

O ^1 α

Ό O

-cO >D

S

Ph

CN

CN č •S li

O

-Oj α

-co >N o

o cO li

O

Λ o o <D Ό ω «3 í>

<D <N

O Ri

CO li <U

CU

O d

Ή.

o

CN

CU

		1—4 CU		o
		O		cn
<u	CN CU	CZ3 1> o	<U	<D C
g	O cO	'|S	bO cO	cO 1-1
cú <U	i—4 Ph		o li	CU O
i—4	O	u	, Ί	CO
u	«3	fe <*>	H-l

c ><u

Ί»

W

O s

ω >li

CU <N

O\

Pr m

fe »n fe • * • · • · · « · ·· » • ··« · ·· · • · · · · ♦ · · · • · · · · ·· « • * ·· ·· »»

Ν Ν Ν Ν >£ >4 > >Γ ’ χ' X' X“ X *

Τ3 Ό Ť3 Ť3 ω ο u ? 5 ? % !·§.§££££ 22 2 χ„χχ*

Ο Ο ο > > > > S-žž-Stetece^

Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν χ χ χ' χ > X > X

ο £ £ χ χ' <β σ, Ν Ν X χ'

Č* <3 4>

*Ο a £ χ'χ

Λ Λ Ν Ν χ X

CC

rt Ν Λ λ > a> Ν x“ χ χ: χ r^-M

Výstup reportéru

N.

o O '—· O O O O ’—' ,-¹ o o g (VOOOO — -I — ’-'ΟΟΟΟΟΟΟΟ'—τ-Ι—l,-l,-lr-<rtr-l

S!?§ oooooooo—i^i'—ΐ'-ιοοοο'—— — oooo

O d oooooooooooo—·—'^-i — oooo—' — • ft >

o >o

Cd o

Pl m

cd

H

£ £ <e Ν N ^N. > > X

B d ^d

Ν N >1 x“ x x

N	N	<D
tí	tí	tí
tí X	tí	h N3
χυ X)	>o -A

flO g > >

- Ή’^-?

X U Ih ».

šin ;

o O O ví jh —

ŠNN 7, > X ;

£?£?£?&; <L> O O O f

X

O >tí

XD o

I >o

O

CL

Ό 73 Ό Ό x x x x o o o o Z £ č £ fc* ω

Š š č |

Ν Ν Ν N 33 > >; >; >; o C9 (B CB (B Z Ν Ν Ν N > X~ X X“ X~ X č?

o g N i2 o Ό >N x

o > >o £ -8 N -§ sf x

” *o

Ϊ-Ό

Χϋ o

CL

X £?

<u

N g >8 73 «se

0^0 sjs * -o «

N d N x lx

Rj (B sč s >1 Ν > N x~ 8.

X a.X“ »· * • · » • < · 4 • · 4 9 » 9 • · · • · λ ft. * ft • » · · • ftft· • * · · · • ftft · · ftft

Jako alternativa k výše zmíněným postupům mohou být použity systémy zde popsané, využívající dva reportérové geny pro vybírání a vyhledávání proteinů, které se váží na dvě rozdílná místa vážící protein. Pro provedení těchto vyhledávání jsou vloženy dva rozdílné fragmenty DNA ve směru k 5 'od dvou reportérových genů (např. URA3 a lacZ genů) a exprese každého z těchto genů je testována v buňce, která také obsahuje gen exprimuj ící kandidátský vážící protein. Tento kandidátský vážící protein může být exprimován ve svém nativním stavu nebo jako fůzní protein spojený s aktivační doménou.

Všechny postupy popsané zde mohou být použity k vyhledávání proteinů, peptidů nebo aptamerů, a to bez omezení.

Další provedení jsou součástí právních nároků.

Claims (40)

1. Způsob pro detekci interakce protein-protein, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) připravení hostitelské buňky, která obsahuje (i) první reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro první protein;

(ii) druhý reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro druhý protein;

(iii) první fůzní gen exprimuj ící první fůzní protein, zmíněný fůzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopna se specificky vázat na vazebné místo zmíněného prvního proteinu;

(iv) druhý fůzní gen exprimuj ící druhý fůzní protein, zmíněný druhý fůzní protein zahrnující druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopná se specificky vázat na vazebné místo zmíněného druhého proteinu; a (v) třetí fůzní gen exprimuj ící třetí fůzní protein, zmíněný třetí fůzní protein zahrnující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen;

(b) měření výstupu exprese zmíněného prvního reportérového genu jako míry zmíněné interakce mezi zmíněným prvním a třetím proteinem;

(c) měření výstupu exprese zmíněného druhého reportérového genu jako míry zmíněné interakce mezi zmíněným druhým a zmíněným třetím proteinem; a (d) zhodnocení výstupních výsledků exprese kroku (b) a kroku (c), čímž • · * · · (i) zvýšený výstup zmíněného prvního i zmíněného druhého reportérového genu znamená, že zmíněný třetí fuzní protein reaguje se zmíněným prvním i zmíněným druhým fůzním proteinem;

(ii) zvýšený výstup zmíněného prvního reportérového genu, ale ne zmíněného druhého reportérového genu, znamená, že zmíněný třetí fuzní protein reaguje se zmíněným prvním fuzním proteinem, ale ne se zmíněným druhým fuzním proteinem;

(iii) zvýšený výstup zmíněného druhého reportérového genu, ale ne zmíněného prvního reportérového genu, znamená, že zmíněný třetí fuzní protein reaguje se zmíněným druhým fůzním proteinem, ale ne se zmíněným prvním fuzním proteinem; a (iv) žádná změna ve výstupu zmíněného prvního nebo zmíněného druhého reportérového genu znamená, že zmíněný třetí fuzní protein nereaguje ani se zmíněným prvním ani se zmíněným druhým fuzním genem.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje porovnání zmíněných výsledků výstupů exprese kroku (b) a kroku (c) s výsledky výstupů exprese měřených buď v (a) první srovnávací hostitelské buňce, která obsahuje (i) reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro protein;

(ii) první fuzní gen exprimuj ící první fuzní protein, zmíněný první fuzní protein zahrnující zmíněný první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopna se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro protein; a • · (iii) druhý fuzní gen exprimuj ící druhý fuzní protein, zmíněný druhý fuzní protein obsahující zmíněný třetí protein kovalentně vázaný ke skupině aktivující gen; nebo (b) druhé srovnávací hostitelské buňce, která obsahuje (i) reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro protein;

(ii) první fuzní gen exprimuj ící první fuzní protein, zmíněný první fuzní protein obsahující zmíněný druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopna se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro protein; a (iii) druhý fuzní gen exprimuj ící druhý fuzní protein, zmíněný druhý fuzní protein obsahující zmíněný třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen; nebo (c) zmíněné první i zmíněné druhé srovnávací hostitelské buňce.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aspoň jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen může mít sníženou úroveň exprese.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buď zmíněné první nebo zmíněné druhé vazebné místo pro protein je tetracyklinový operátor.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buď zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen je URA3 nebo lacZ.

• ·

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buď zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen vytváří signál, který je přijímán a detekován druhou buňkou.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněná hostitelská buňka je kvasinka nebo savčí buňka.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že zmíněná hostitelská buňka je kvasinka.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný první a zmíněný druhý reportérový gen mohou být exprimovány současně.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný první a zmíněný druhý protein jsou alelickými variantami.

11. Způsob pro určení proteinu, který zprostředkovává změnu stavu jiného proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) vytvoření hostitelské buňky, která obsahuje (i) reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro protein;

(ii) první fuzní gen exprimující první fuzní protein, zmíněný první fuzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která je schopna se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro protein; a (iii) druhý fuzní gen exprimující druhý fuzní protein, zmíněný druhý fuzní protein obsahující druhý protein, který je schopen reagovat se zmíněným prvním proteinem, a který je kovalentně vázán na skupinu aktivující gen, a kde aspoň • · · jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý protein mohou prodělat změnu stavu;

(b) umožnění zmíněnému prvnímu a zmíněnému druhému proteinu spolu reagovat;

(c) měření exprese zmíněného reportérového genu jako míry zmíněné interakce mezi zmíněným prvním a zmíněným druhým proteinem;

(d) vložení třetího genu exprimuj ícího třetí protein do zmíněné buňky;

(e) měření exprese zmíněného reportérového genu, změna v expresi zmíněného reportérového genu za přítomnosti zmíněného třetího proteinu je znamením, že zmíněný třetí protein zprostředkuje změnu stavu zmíněného prvního nebo zmíněného druhého proteinu, která vede ke změně schopnosti zmíněného prvního proteinu a zmíněného druhého proteinu vzájemně reagovat.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněná změna stavuje konformacní změnou.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že zmíněný protein vykazující konformacní změnu je protein Ras.

14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka nebo savčí buňka.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka.

16. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že exprese zmíněného prvního fuzního proteinu a zmíněného třetího proteinu je odpovědí na mimobuněčný podnět.

17. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný reportérový gen vytváří signál, který je přijímán a detekován druhou buňkou.

18. Způsob pro určení proteinu, který působí změnu stavu jiného proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) vytvoření první hostitelské buňky obsahující (i) reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro protein;

(ii) první fůzní gen exprimující první fůzní protein, zmíněný první fůzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopná se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro první protein; a (iii) druhý fůzní gen exprimující druhý fůzní protein, zmíněný druhý fůzní protein obsahující druhý protein, který je schopný reagovat se zmíněným prvním proteinem, a který je kovalentně navázán na skupinu aktivující gen, a kde aspoň jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý protein mohou prodělat změnu stavu;

(b) umožnění zmíněnému prvnímu a zmíněnému druhému proteinu spolu reagovat;

(c) měření exprese zmíněného reportérového genu ve zmíněné první hostitelské buňce jako míry zmíněné interakce mezi zmíněným prvním a zmíněným druhým proteinem;

(d) vytvoření druhé hostitelské buňky, která obsahuje (i) zmíněný reportérový gen účinně spojený se zmíněnou DNA sekvencí obsahující zmíněné vazebné místo pro protein;

(ii) zmíněný první fůzní gen exprimující zmíněný první fůzní protein; a • · · • · · • · • · • · · · (iii) zmíněný druhý fuzní gen exprimuj ící zmíněný druhý fuzní protein;

(iv) třetí gen exprimuj ící třetí protein;

(e) umožnění zmíněnému prvnímu a zmíněnému druhému proteinu vzájemně reagovat za přítomnosti zmíněného třetího proteinu;

(f) měření exprese zmíněného reportérového genu ve zmíněné druhé hostitelské buňce jako míry zmíněné interakce mezi zmíněným prvním a zmíněným druhým proteinem za přítomnosti zmíněného třetího proteinu, změna exprese zmíněného reportérového genu ve zmíněné druhé hostitelské buňce v porovnání s tou, naměřenou ve zmíněné první hostitelské buňce znamená, že zmíněný třetí protein působí změnu stavu zmíněného prvního nebo zmíněného druhého proteinu, což má za následek změnu schopnosti zmíněného prvního proteinu a zmíněného druhého proteinu vzájemně reagovat.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněná změna stavuje konformační změnou.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že zmíněný protein vykazující konformační změnu je protein Ras.

21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka nebo savčí buňka.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že obě zmíněné hostitelské buňky jsou kvasinky.

23. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že exprese zmíněného prvního fuzního proteinu i zmíněného třetího • · « · proteinu je odpovědí na mimobuněěný podnět.

24. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněný reportérový gen vytváří signál, který je přijímán a detekován druhou buňkou.

25. Buňka, vyznačující se tím, že obsahuje (i) první reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro první protein;

(ii) druhý reportérový gen účinně spojený s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro druhý protein;

(iii) první fuzní gen exprimuj ící první fuzní protein, zmíněný první fuzní protein obsahující první protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopná se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro první protein;

(iv) druhý fuzní gen exprimuj ící druhý fuzní protein, zmíněný druhý fuzní protein obsahující druhý protein kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, kteráje schopná se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro druhý protein; a (v) třetí fuzní gen exprimuj ící třetí fuzní protein, zmíněný třetí fuzní protein obsahující třetí protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen.

26. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že aspoň jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen může mít sníženu úroveň exprese.

27. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že aspoň jedno zmíněné první nebo zmíněné druhé vazebné místo pro protein je tetracyklinový operátor.

• ·

28. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen je URA3 nebo lacZ.

29. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že jeden zmíněný první nebo zmíněný druhý reportérový gen vytváří signál, který je přijímán a detekován druhou buňkou.

30. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka nebo savčí buňka.

31. Buňka podle nároku 25, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka.

32. Reportérový gen, vyznačující se tím, že obsahuje tetracyklinový operátor účinně spojený s genem kódujícím detekovatelný produkt.

33. Reportérový gen podle nároku 32, vyznačující se tím, že zmíněným genem kódujícím detekovatelný produkt je URA3 gen nebo lacZ gen.

34. Způsob pro detekování toho, zda kandidátský protein reaguje s transkripčním aktivátorem, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) vytvoření hostitelské buňky, která obsahuje (i) reportérový gen, u kterého může být snížena úroveň exprese, zmíněný reportérový gen je účinně spojen s DNA sekvencí obsahující vazebné místo pro protein;

(ii) první fůzní gen exprimuj ící první fůzní protein, zmíněný první fůzní protein obsahující zmíněný transkripční aktivátor kovalentně navázaný na vazebnou skupinu, která • · « · je schopná se specificky vázat na zmíněné vazebné místo pro protein; a (iii) druhý fuzní gen exprimující druhý fuzní protein, zmíněný druhý fuzní protein obsahující zmíněný kandidátský protein kovalentně navázaný na skupinu aktivující gen;

(b) detekování nárůstu exprese zmíněného reportérového genu jako známky interakce mezi zmíněným kandidátským proteinem a zmíněným transkripčním aktivátorem.

35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že zmíněným reportérovým genem je gen URA3.

36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že zmíněná úroveň exprese je snížena 6-azauracilem.

37. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že zmíněné vazebné místo pro protein je tetracyklinový operátor.

38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že zmíněná úroveň exprese je snížena tetracy klínem nebo derivátem tetracyklinu.

39. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka nebo savčí buňka.

40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že zmíněnou hostitelskou buňkou je kvasinka.