KR20010022882A

KR20010022882A - 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터

Info

Publication number: KR20010022882A
Application number: KR1020007001486A
Authority: KR
Inventors: 존슨마이클안토니; 해몬드제프리마이클
Original assignee: 피그 리서치 디벨로프먼트 코포레이션; 월커 존 허버트; 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2001-03-26
Also published as: CN100366292C; ATE357250T1; KR100746524B1; DE69837390D1; CY1106565T1; JP2001514871A; AU2011224111A1; NZ503039A; ES2283068T3; ID24174A; JP4365023B2; WO1999008706A1; US20090226485A1; HK1032755A1; US7473428B2; MXPA00001562A; PT1007088E; JP2009213495A; US7785602B2; WO1999008706A8

Abstract

본 발명은 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시켜 발현시킬 수 있는 재조합 돼지 아데노바이러스를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 뉴클레오티드 서열은 돼지 콜레라 바이러스 또는 가성광견병 바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 서열이 바람직하다. 또한, 본 발명은 재조합 벡터의 제조 방법, 이 벡터를 주성분으로 하는 백신의 제조 방법, 투여 방법 및 질병으로부터 돼지를 보호하는 방법을 제공한다.

Description

재조합 돼지 아데노바이러스 벡터{RECOMBINANT PORCINE ADENOVIRUS VECTOR}

집중적인 돼지 산업의 생산성은 감염성 질병의 제어에 좌우된다. 양호한 위생 상태 및 검역 조치로 부분적으로 질병을 제어할 수 있지만, 산업상 무리를 보호하기 위해서는 여전히 예방접종에 의존해야 한다. 상업적 상황에서, 동물 1 마리당 비용은 먹이 및 현재의 질병 제어 비용의 측면에서 높고, 따라서 임의의 새로 제안된 백신으로 질병 예방 및 제어하는데 있어서 비용은 싸고, 전달은 효과적이며 용이해야 한다.

통상적으로, 백신을 구성하는 생바이러스 입자는 바이러스의 계대 배양과 약화된 형태의 선별로 제조된다. 대안적으로, 사백신은 독성 바이러스로부터 제조된다.

돼지의 질병 제어에 있어서 가장 최근에 사용한 바이러스 벡터 종류는 아우제스키병의 제어용 가성광견병 바이러스의 결실 돌연변이이다. 벡터로서 헤르페스바이러스를 사용하면 체액 및 세포 매개된 반응을 자극할 수 있는 장점이 있어서, 장기간 생명체를 보호할 수 있다. 또 다른 장점은 이 벡터내 기타 이종 서열을 삽입시키는 능력이며, 이 서열은 적절한 프로모터하에 발현되어 동물 면역계에 노출시키기 위한 항원을 생산하여 2종의 질병에 대해 보호할 수 있다. 이 시스템에는 단점이 있다. 먼저, 잠재의 문제가 있다. 헤르페스바이러스는 동물의 생존을 위해 신경절에서 뉴런내로 통합하는 능력이 있다. 바이러스의 재활성화와 그 결과 생기는 전적 질병을 유발하기 위해서 동물에 적절한 스트레스만 주면된다. 그러나, 특정 유전자, 당단백질 E를 결실시키면 바이러스를 약화시키고 잠재되어 있다가 재활성화되는 것을 방지하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 결실 벡터는 아우제스키병에 대한 박멸 벡터로서 널리 사용되며, 따라서 기타 항원의 전달용으로 적절한 벡터로서 이용되지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 대규모로 투여하기에 특히 적합한 유전자 물질의 이종 서열에 대한 전달 매개체를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 일반적인 돼지 질병에 감염되는 것으로부터 보호할 수 있도록 항체 또는 세포 매개된 면역성의 형성 및/또는 최적화를 위한 수단을 제공 또는 개선시키는 것이다. 추가의 목적은 돼지가 일반적인 돼지 질병에 감염되는 것을 보호하기 위해서 항체 또는 세포 매개된 면역성의 형성 및/또는 최적화를 위한 적절한 수단을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 질병에 의한 대량 사망에 감수성이 있는 상업용 돼지에서 면역 반응을 형성하는데 사용되는 항원 생성 유전자(이종 유전자 서열 또는 이의 단편)용 전달 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 질병에 대하여 돼지를 보호하기 위해서 대규모로 쉽게 투여할 수 있는 벡신의 제제에 특히 유용하다. 본 발명은 적절한 전달 벡터의 생성 방법, 이 벡터를 주성분으로 하는 백신의 제조 방법, 투여 방법 및 질병으로부터 돼지를 보호하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 전체 PAV 혈청형 3의 게놈 DNA 제한 효소 지도를 도시한 것이다.

도 2는 PAV 혈청형 3의 주요 후기 프로모터 및 스플라이스 리더 서열의 서열 특성과 클로닝에 대하여 도시한 것이다.

도 3은 주요 후기 프로모터, 상방 인헨서 서열 및 스플라이스 리더 1, 2 및 3의 서열을 도시한 것이다.

도 4는 게놈의 우측 말단쪽 720개 말단 염기를 도시한 것이다.

도 5는 E3의 프로모터 영역과 중첩 L4 영역을 도시한 것이다.

도 6은 PAV 벡터를 작제하는 바람직한 방법을 도시한 것이다.

도 7은 CSFV 항원 투여후 PAV계 백신으로 예방접종된 돼지의 체온 데이터를 나타낸 것이다.

도 8은 PAV계 백신 예방접종 전과 후의 돼지에서 ELISA로 검출되는 항PAV 항체량을 나타낸 그래프이다.

도 9는 CSFV 항원의 투여전과 투여후 PAV계 백신으로 예방접종된 돼지에서 형성되는 중화 항체의 발생을 그래피로 도시한 것이다.

도 10은 돼지 G-CSF를 발현하는 재조합 PAV 백신으로 예방접종된 돼지의 평균 백혈구(WBC) 수를 그래프로 도시한 것이다.

도 11은 돼지 G-CSF를 발현하는 재조합 PAV 백신으로 예방접종한 후의 백혈구(WBC) 수의 변화율을 그래프로 도시한 것이다.

도 12는 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 후의 단핵구 세포군의 변화율을 그래프로 도시한 것이다.

도 13은 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 후의 림프구 세포군의 변화율을 그래프로 도시한 것이다.

도 14는 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 후의 T 세포 자극의 변화를 그래프로 도시한 것이다.

바람직한 양태의 상세한 설명

이하, 본 발명에 있어 PAV 분리물 혈청형 3과 혈청형 4를 기초로 한 바람직한 양태에 대하여 설명하겠다. 이 2가지 분리물을 선택한 이유는 돼지에 감염되는 부위 때문이지만, 전술한 선택 기준을 충족시킨다면 다른 돼지 아데노바이러스 분리물도 백신 벡터 작제에 적합하다는 것은 명백한 것이다.

일반적으로, PAV는 이 분야에서 중요도가 적은 저 병원성균으로 간주되었고, PAV의 유의적 병원성에 대해서는 문헌[Derbyshire, 1989]에서 검토된 바 있다. PAV가 분리된 최초 보고는 설사병에 걸린 12일령의 돼지에서 유래하였다(Haig et al., 1964). 2년 후, PAV 제4형이 원인 불명의 뇌염을 앓고 있는 돼지의 뇌에서 처음으로 분리되어 보고되었다(Kasza, 1966). 그 이후부터, 보통 그 정도는 낮지만 설사에 주로 관여하는 균이 PAV라고 보고되었다. 또한, PAV는 질병의 증후가 전혀 없는 건강한 동물에서 일정하게 분리되는 바, 병에 걸린 동물로부터의 분리는 병원성의 지표라기 보다는 우연하게 우세한 것일 가능성이 크다. 하지만, 혈청형 4와 호흡기 질병 간의 연관성이 보고되었고(Watt, 1978), 이것은 실험 감염을 통해 입증되었다(Edington et al., 1972). 이 바이러스의 위장 혈청형(예컨대, 혈청형 3)을 이용한 실험 감염은 설사를 유발할 수 있었지만, 유발된 병리적 변화는 임상적으로 유의적이지 않았다.

선택된 PAV 혈청형 3의 게놈은 통상적인 방법으로 특성 분석하였다. 그 게놈 전체의 DNA 제한 효소 지도는 도 1에 도시하였다. 이 게놈은 좌에서 우로 배향시켰다. 통상적으로 아데노바이러스 게놈은 후기 mRNA 전사체가 합성되지 않는 말단 영역이 좌측 말단에 위치되도록 배향하는 것이 일반적이다. 지도 작성에 사용된 효소는 각 지도의 둘레에 표시하였다.

PAV 혈청형 3의 주요 후기 프로모터(MLP)와 스플라이스 리더 서열(LS)의 특성규명

PAV MLP의 동정 및 클로닝

PAV 혈청형 3 게놈의 제한 효소 및 유전자 지도를 사용하여 MLP와 리더 서열을 포함하는 영역을 찾아 내었다(도 1). 이 영역에서 확인된 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝하고 서열분석하였다.

MLP 프로모터 서열은 서열분석된 영역에 유일하게 존재하는 전형적인 TATA 서열과, 상방 인자를 포함하는 것으로 확인되었고, 이어서 리더 서열과 전사 개시 부위의 위치를 확인하였다.

도 2 및 도 3은 PAV 혈청형 3의 주요 후기 프로모터와 스플라이스 리더 서열의 서열 특성을 도시한 것이다.

후기 mRNA에 스플라이스된 리더 서열의 구조와 서열을 결정하기 위하여 PAV로 돼지 신장 세포를 감염시키고, 감염 사이클의 후기까지 감염을 진행시켰다(보통, 20 내지 24 시간, 복강내 주사). 그 후, RNAgents 총 RNA 정제 킷트(프로메가)를 사용하여 감염 세포로부터 총 RNA를 정제하였다. 분리된 RNA를 이소프로판올을 사용하여 침전시키고 200 ㎕씩 필요할 때까지 -70 ℃에 보관하였다. 총 RNA로부터 폴리AT 트랙 시스템(프로메가, 미국)을 사용하여 폴리 A(mRNA)를 분리하였다. 분리된 mRNA를 사용하여 cDNA를 생산하였다.

cDNA 생산을 위하여, MLP 전사체인 헥손 유전자와 펜톤 염기 유전자의 상보 가닥에 대한 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 또한, TATA 박스의 24 염기 하방에 있는 주요 후기 전사체의 제안된 캡 부위에 해당하는 다른 올리고뉴클레오티드도 생성하였다. 이 올리고뉴클레오티드를 Taq 폴리머라제 연쇄 반응시 cDNA 생성에 사용된 것과 함께 사용하였다. 그 결과 얻어지는 양성 클론에서 생성된 DNA를 적당한 제한 효소로 분해하여 삽입된 단편의 크기를 측정하였다. 사슬 종결 기법의 변법(Sanger, F., Nicklen, S and Gulson, A.R., 1977, DNA sequencing with chain terminating inhibitors. PNAS USA 74: 5463-5467)을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제 연장반응(프로메가, 미국)시켜 이들 삽입된 단편의 DNA 서열분석을 실시하였다.

리더 서열의 캡 부위를 확인하기 위하여, 새 cDNA를 제조하고, 여기에 dGTP 잔기의 테일을 첨가하였다. 간략히 설명하면, cDNA를 1 mM dGTP와 약 15 유니트의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라제(프로메가)와 함께 2 mM CaCl₂완충액 중에서 37 ℃하에 60 분 동안 항온처리하였다. 이 반응액을 70 ℃에서 10분동안 가열하여 반응을 정지시켰다. 그 다음, DNA를 에탄올 침전시키고 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용하기에 적합한 용량으로 재현탁시켰다. 전술한 바와 같이 5' 말단에 XbaI 부위를 가진 폴리(dC) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 실시하였다. 그 결과 얻어지는 단편을 과량의 뉴클레오티드의 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 37 ℃하에 30 분 동안 반응시켜 평활말단화시키고 pUC18 벡터의 SmaI 부위에 클로닝하였다.하이브리드화가 양성인 것으로 보이는 클론에서 전술한 바와 같이 DNA를 제조하고 서열분석하였다.

도 3은 cDNA 연구로부터 측정된 주요 후기 프로모터, 상방 인헨서 서열 및 스플라이스 리더 1, 2 및 3의 서열을 각각 도시한 것이다. 도 2는 각 구성인자를 함께 결합시킨 완전한 프로모터 카세트의 DNA 서열을 도시한 것이다.

바이러스 게놈의 비필수 영역에 대한 특성규명

약 1.8 Kbp인 PAV 혈청형 3 ApaI 단편 J을 클로닝하고 완전 서열분석하여 우측 말단을 동정하였다. RHE 서열과 좌측 말단의 서열을 비교하여 역위된 말단 반복 서열(ITR)을 측정하였다. ITR은 길이가 144개 염기이고 잠재적 삽입이 이루어질 수 있는 출발점이다. 도 4는 말단 720 염기의 서열을 도시한 것이다. 이 말단 서열에 이종 DNA를 삽입할 수 있는 해당 제한 효소 부위를 표시하였다. E4 프로모터의 추정상의 TATA 부위는 삽입 가능 부위의 가장 좌측 말단인 것으로 확인되었다. 초기 삽입은 SmaI 또는 EcoRI 부위에 실시될 수 있다.

또한, 비필수 영역인 게놈의 E3 영역도 위치를 규명하고 클로닝하였다. E3의 프로모터 영역 역시 동정하고 중첩된 L4 영역도 서열분석하였다(도 5). 또한, L4의 폴리아데닐화 시그널 다음의 E3 영역도 삽입 가능 부위로서, 결실시키면 보다 큰 카세트 삽입부를 제공할 수 있다.

PAV 벡터의 작제

도 6은 PAV 벡터를 작제하는 바람직한 방법을 예시한 것이다. PAV 혈청형 3의 우측 말단 ApaI 단편 J를 클로닝하고 역위된 반복 부위로부터 230 bp 떨어진 고유 SmaI 제한 효소 부위를 삽입 부위로서 사용하였다.

고전적 돼지 열 바이러스(돼지 콜레라 바이러스)의 E2(gp55) 유전자를 포함하는 주요 후기 프로모터 발현 카세트를 RHE 단편의 SmaI 부위에 클로닝하였다.

바람직한 동종 재조합법은 게놈 PAV 3 DNA를 게놈 중의 고유 부위인 HpaI로 절단하고, gp55를 포함하는 ApaI 절단된 발현 카세트 플라스미드로 이 DNA를 형질감염시키는 것이다.

이 DNA 혼합물을 사용하여 바람직하게는 원시 돼지 신장 세포를 표준 염화칼슘 침전법에 따라 형질감염시켰다.

이 바람직한 형질감염 방법은 게놈 PAV 3과 플라스미드간의 동종 재조합을 통해 재조합 바이러스를 생성한다(도 6).

발명의 상세한 설명

PAV 벡터의 작제

다음 실시예는 본 발명의 대표적인 재조합 돼지 아데노바이러스를 작제하는 방법을 예시한 것이다. 또한, 이 재조합 바이러스를 증식시켜, 원시 돼지 신장 세포를 이용하여 역가를 측정하였다.

1. PAV-gp55의 작제

돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 고전적 돼지열 바이러스(CSFV) 유전자(gp55) 및 SV40 폴리A로 이루어진 발현 카세트를 돼지 아데노바이러스 혈청형 3의 우측 말단(MU 97-99.5)에 있는 SmaI 부위에 삽입하고 이것을 돼지 원시 신장 세포내에 재조합 PAV 3을 생성시켰다. 발현 카세트의 크기는 2.38 킬로베이스쌍이었고, 게놈 PAV 3을 전혀 결실시키기 않았다. 중간 크기의 게놈(∼36kb)을 가진 포유류 아데노바이러스는 야생형 게놈 길이의 최고 105%까지 보유하는 것으로 밝혀져 있으며, 이 크기 이상의 게놈은 패키징될 수 없거나 극도로 불안정하며 종종 DNA 재배열을 일으키기도 한다[Betts, Prevec and Graham, Journal of Virology 67, 5911-5921(1993), Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors: Parks and Graham, Journal of Virology, 71, 3293-3298(1997), A helper dependent system for adenovirus vector production helps define a lower limit for efficient DNA packaging]. 본 발명에서, PAV 게놈 길이는 34.8 kb로서, 어떤 결실없이 2.38 kb의 발현 카세트에 삽입되어 있다. 그 결과 얻어지는 본 발명에 따른 재조합 돼지 아데노바이러스의 게놈 DNA 길이는 106.8%이었고, 따라서 안정한 재조합체의 작제시 추정되는 죄대 한계치를 초과하는 것이었다. 이 재조합 바이러스를 3회 플라크 정제하고 원시 돼지 신장 세포를 통해 안정하게 계대시켰다. 이 재조합체는 서던 블롯 하이브리드화를 통해 gp55를 포함함을 확인하였다. gp55의 발현은 유리 커버 슬립상에 증식시킨 원시 PK 세포주를 재조합 돼지 아데노바이러스로 감염시켜 증명하였다. 24 시간 후, 면역형광 염색법(IF)을 통해 gp55를 발현하는 감염 세포를 관찰하였다.

2. 재조합 PAV-G-CSF의 작제

돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 돼지 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 암호화하는 유전자 및 SV40 폴리A로 이루어진 발현 카세트를 돼지 아데노바이러스 혈청형 3의 우측 말단(MU 97-99.5)에 있는 SmaI 부위에 삽입하고, 돼지 원시 신장 세포에서 재조합 PAV3을 생성시켰다. 발현 카세트의 크기는 1.28 킬로베이스 쌍이었고, 게놈 PAV3을 결실시키지 않았다. 이 재조합 바이러스를 2회 플라크 정제하고 원시 돼지 신장 세포를 통해 안정하게 계대시켰다. 이 재조합체는 서던 블롯 하이브리드화 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 G-CSF를 포함함을 확인하였다. G-CSF의 발현은 원시 신장 세포를 재조합 PAV G-CSF로 감염시켜 증명하였다. 그 다음 감염된 원시 신장 세포의 조직 배양 상청액을 SDS-PAGE 겔을 통해 전기영동시키고 필터로 이동시켰다. G-CSF를 발현하는 감염 세포는, 정제된 재조합 이.콜리에 의해 발현되는 돼지 G-CSF에 대한 래빗 폴리클론 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다.

3. 재조합 PAV-gp55T/GM-CSF의 작제

돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 돼지 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 성숙 형태 또는 전길이를 암호화하는 유전자에 프레임에 맞게 융합된 고전적 돼지 열 바이러스 유전자 gp55의 절두 형태 및 SV40 폴리A로 이루어진 발현 카세트를 돼지 아데노바이러스 혈청형 3의 우측 말단(MU 97-99.5)에 있는 SmaI 부위에 삽입하고, 돼지 원시 신장 세포내에 재조합 PAV3을 생성하였다. 발현 카세트의 크기는 2.1 킬로베이스 쌍이었다. 게놈 PAV3을 결실시키지 않았다. 이 재조합 바이러스를 2회 플라크 정제한 후, PCR을 통해 gp55 및 GM-CSF를 포함하는 것을 확인하였다.

4. 재조합 PAV-gp55/E3의 작제

돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 고전적 돼지 열 바이러스 유전자 gp55 및 SV40 폴리A로 이루어진 발현 카세트를 돼지 아데노바이러스 혈청형 3의 E3 영역(MU 81-84)에 있는 BsrgI/SnaBI 부위 사이에 삽입하고, 이것을 돼지 원시 신장 세포에 재조합 PAV3을 생성시켰다. 발현 카세트의 크기는 2.38 킬로베이스 쌍이었고, 게놈 PAV3에 620 염기쌍의 결실부를 만들었다. 이 재조합 바이러스를 2회 플라크 정제한 후 PCR을 통해 gp55를 포함하는 것을 확인하였다.

예방접종 방법

1. PAV-gp55 예방접종

이 실험에는 5 내지 6주령의 새끼 돼지를 사용하여 면역적격성 돼지를 만들었다. 일군의 새끼 돼지(#2, 6 및 7)에게 재조합 PAV-gp55를 1마리 새끼 돼지당 1 x 10⁷pfu의 투여량으로 피하 투여하여 예방접종시켰다. 새끼 돼지 대조군(#3, 8, 11, 12, 13 및 14)은 예방접종하지 않았다. 예방접종된 새끼 돼지군에게 어떤 임상 증후(체온 증가)도 관찰할 수 없었다(표 1).

rPAV::gp55로 예방접종한 돼지의 체온

rPAV::gp55 CSFV로 예방접종한 후의 체온(℃)
돼지 번호	경과 일0	1	2	3	6	9	10	13
2	39.7	39.2	39.4	39.8	39.6	39.8	39.6	39.2
3(대조군)	39.5	39.2	39.4	39.0	38.8	39.3	39.0	39.7
6	39.7	39.1	39.1	39.0	39.1	39.8	39.1	39.8
7	39.4	39.8	39.8	39.4	39.9	38.9	39.6	39.7
8(대조군)	39.6	39.5	39.4	39.0	40.5	39.4	39.1	39.7

재조합 PAV-gp55를 예방접종하고 5주 후 양 돼지군에게 치사량(1 x 10^3.5TCID₅₀)의 독성 돼지 콜레라 바이러스(고전적 돼지 열 바이러스)를 피하 투여하였다. 그 후 돼지 체온을 모니터하고 그 결과를 표 2에 도표화하고, 도 7에 그래프로 도시하였다.

이와 같은 결과를 통해, 대조군은 5일 까지 고온(40.5 ℃ 이상)과 질병의 임상 증후를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 예방접종된 군은 질병의 어떤 임상 증후도 나타내지 않았다. 대조군의 돼지는 9일이내에 사망하거나 안락사시켰다. 예방접종된 군은 16일째 안락사시켰다. 검시 결과, 모든 대조군 돼지로부터는 상당한 임상 질병을 확인하였고, 예방접종된 돼지로부터는 질병의 어떤 임상 징후도 관찰하지 못하였다.

이와 같은 결과는 재조합 PAV-gp55로 피하 예방접종된 돼지가 치사 투여량의 고전적 돼지 열 바이러스를 이용한 항원투여에도 생존한다는 것을 시사하는 것이다.

양 돼지군의 혈청을 수거하여 PAV에 대한 항체의 존재에 대하여 ELISA 시험하였다. 이 시험 결과 예방접종 전에도 PAV에 대한 항체가 이미 존재한다는 것을 알 수 있었다. 그리고, 재조합 PAV-gp55를 예방접종한 후 이 항체의 농도가 예방접종 후 28일 내지 36일 사이에 최고치까지 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 도 8에 기재하였다.

또한, CSFV를 투여하기 전과 투여한 후 백신접종된 돼지군의 혈청을 수거하고 CSFV에 대한 중화 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 재조합 PAV-gp55를 예방접종한 후 0일째와 28일째(항원투여 전)에 얻은 혈청을 시험하고 항원투여후 16일(예방접종후 52일)째 다시 시험하였다. 도 9에 기재한 시험 결과는 0일째 중화 항체가 전혀 검출되지 않고, 28일째 소량의 중화 항체가 존재하며, 52일째 다량이 존재함을 나타낸다.

이와 같은 결과로부터 재조합 PAV-gp55는 기존의 PAV에 대한 항체의 존재하에 치사 투여량의 고전적 돼지 열 바이러스에 대하여 돼지를 보호할 수 있음을 알 수 있다.

2. PAV-G-CSF 예방접종

이 실험에는 5 내지 6주령의 새끼 돼지를 사용하여 면역적격성 돼지를 만들었다. 일군의 돼지(n =4)에게 재조합 PAV-G-CSF를 새끼 돼지 1마리당 1 x 10⁷pfu의 투여량으로 피하 투여하여 예방접종하였다. 제2군(n =4)은 PAV 야생형(wt)에게 1마리당 1 x 10⁷pfu의 투여량으로 피하 투여하여 예방접종하였다. 대조군(n=4)은 예방접종하지 않았다. 예방접종 후 104 시간 동안 8시간 마다 돼지로부터 채혈하였다. 전체 적혈구 수를 측정하고, 각 군당 평균 백혈구(WBC) 수를 모니터하였다. 이와 같은 결과를 도 10에 그래프로 도시하고 평균 WBC수의 변화율을 도 11에 도시하였다.

PAV wt 또는 PAV-G-CSF를 예방접종한 돼지는 예방접종후 24 내지 72시간 내에 약간의 설사 같은 임상 증후를 나타내었다. 하지만, 예방접종후 80 내지 96시간이 경과한 후 양 돼지군은 완전히 회복되었다. 대조군의 돼지는 질병의 어떤 임상적 증후도 나타내지 않았다.

전혈액의 스크리닝 결과는 실험 동안 대조군 돼지의 평균 WBC 수가 증가한다는 것을 보여주었다.

PAV wt 예방접종된 돼지 역시 WBC 수의 증가를 보였는데, 예방접종후 48 내지 80 시간 사이에는 WBC 수가 감소하다가 80 내지 96시간 이후에는 회복되었다.

재조합 PAV-G-CSF로 예방접종된 돼지는 실험 기간 동안 WBC 수의 유의적인 감소를 나타내었다. 이와 같은 결과에 대한 통계적 분석은 표 3에 제시하였다. 이 분석을 통해 평균 WBC 수의 차이(대조군 대 PAV-G-CSF; PAV wt 대 PAV-G-CSF)가 유의적인 수준으로 재조합 PAV-G-CSF가 면역성과 관련있는 세포의 비율을 변화시켰음을 시사한다는 것을 알 수 있었다.

PAV 야생형(wt), G-CSF를 발현하는 PAV 재조합체(PAV-G-CSF)로 예방접종한 돼지군과 예방접종하지 않은 대조군의 평균 WBC 수 사이의 t-검정 결과

	예방접종전0 시간	8 내지 24 시간^d	32 내지 48 시간	56 내지 72 시간	80 내지 104 시간
대조군 대 PAV-G-CSF^a	p＞ 0.2^b	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＜ 0.005
대조군 대 PAV wt	p＞ 0.1	p＞ 0.01^c	p＞ 0.02	p＞ 0.2	p＜ 0.05
PAV-G-CSF 대 PAV wt	p＞ 0.2	p＜ 0.05	p＜ 0.05	p＜ 0.05	p＜ 0.001
a: 무효 가설; 평균 WBC 수의 차이가 없음.b: 95% 신뢰도하에 무효 가설을 기각하기에 불충분한 p＞0.05는 평균 백혈구 수간의 차이가 없는 것으로 단정한다.c: 95% 신뢰도 하에 무효 가설이 기각되는 p＜0.05는 평균 백혈구 수의 차이가 있는 것으로 단정한다.d: 각 군 당 4 마리의 돼지로부터 8 시간마다 채혈하였다.

각 군 마다 차별적인 WBC 수를 측정하고 모니터하였다. 평균 단핵구 세포 군의 변화율은 도 12에 그래프로 도시하고, 평균 림프구 세포 군의 변화율은 도 13에 그래프로 도시하였다. 도 12는 돼지에게 PAV wt를 예방접종한 후에는 단핵구 세포군이 급격히 증가되지만 재조합 PAV-G-CSF를 예방접종한 경우에는 단핵구 세포수가 억제된다는 것을 보여주고 있다. 이와 같은 효과는 재조합체에 의해 G-CSF가 발현되기 때문이다. 이와 같은 결과의 통계적 분석 결과를 표 4에 기재하였다. 이 분석을 통해 예방접종후 32 내지 96 시간 사이에 PAV wt와 PAV-G-CSF 간의 유의적인 차이가 나타난다는 것을 알 수 있었다. 도 13은 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 후의 림프구 세포군 수에 변화가 있음을 보여주고 있다. 예방접종하지 않은 대조군은 실험 기간 동안 안정한 림프구 세포수를 나타내는 반면, PAV wt로 예방접종된 돼지는 감염에 대한 응답 반응으로서 림프구 세포군의 유의적 증가를 보였다. 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 돼지는 림프구 세포군의 감소를 나타내었다. 이와 같은 결과의 통계적 분석을 표 5에 기재하였다. 이 분석 결과 예방접종 후 8 내지 96 시간 사이에 PAV wt와 재조합 PAV-G-CSF 간의 유의적 차이가 나타난다는 것을 알 수 있었다. 이러한 재조합 PAV-G-CSF 및 PAV wt로 예방접종한 후 나타나는 림프구 세포 증식의 상이한 반응은 재조합체에 의한 G-CSF의 발현 때문이다. 이와 같은 결과를 통해, 재조합 PAV-G-CSF의 예방접종으로 면역성과 관련된 세포 아군수가 변화한다는 것을 알 수 있었다.

PAV 야생형(wt), 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 돼지군과 예방접종하지 않은 대조군의 평균 단핵구 세포군 사이의 t-검정 결과

	예방접종전	8 내지 24 시간^d	32 내지 48 시간	56 내지 72 시간	80 내지 96 시간	104 시간
대조군 대 PAV-G-CSF^a	p＞ 0.1^b	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞0.2
대조군 대 PAV wt	p＞ 0.2	p＞ 0.002^c	p＞ 0.2	p＜ 0.001^c	p＞ 0.2	p＞0.2
PAV wt 대 PAV-G-CSF	p＞ 0.2	p＜ 0.001^c	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞ 0.1	p＞0.05
a: 무효 가설; 평균 단핵구 세포 수의 차이가 없음.b: 90% 신뢰도하에 무효 가설을 기각하기에 불충분한 p＞0.1은 평균 단핵구 수간의 차이가 없는 것으로 단정한다.c: 95% 신뢰도 하에 무효 가설이 기각되는 p＜0.05는 평균 단핵구 수의 차이가 있는 것으로 단정한다.d: 각 군 당 4 마리의 돼지로부터 8 시간마다 채혈하였다.

PAV 야생형(wt), 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 돼지군과 예방접종하지 않은 대조군의 평균 림프구 세포군 사이의 t-검정 결과

	예방접종전	8 내지 24 시간^d	32 내지 48 시간	56 내지 72 시간	80 내지 96 시간	104 시간
대조군 대 PAV-G-CSF^a	p＞ 0.2	p＞ 0.05^b	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＞0.2
대조군 대 PAV wt	p＞ 0.2	p＞ 0.2	p＜ 0.01^c	p＜ 0.001^c	p＜ 0.001^c	p＞0.2
PAV wt 대 PAV-G-CSF	p＞ 0.2	p＜ 0.05^c	p＜ 0.002^c	p＜ 0.005^c	p＜ 0.001^c	p＞0.05
a: 무효 가설; 평균 단핵구 세포 수의 차이가 없음.b: 95% 신뢰도하에 무효 가설을 기각하기에 불충분한 p＞0.05는 평균 림프구 수간의 차이가 없는 것으로 단정한다.c: 95% 신뢰도 하에 무효 가설이 기각되는 p＜0.05는 평균 림프구 수의 차이가 있는 것으로 단정한다.d: 각 군 당 4 마리의 돼지로부터 8 시간마다 채혈하였다.

도 14는 콘카나발린 A(Con A)로 자극한 후 각 군이 나타내는 T세포 증식의 변화를 그래프로 도시한 것이다. 이 결과를 통해, PAV wt로 예방접종한 후에는 2일째 T 세포가 유의적으로 증식하는 반면, 재조합 PAV-G-CSF로 예방접종한 경우에는 3일까지 T 세포 증식이 억제된다는 것을 알 수 있었다.

돼지 G-CSF를 발현하는 재조합 PAV로 예방접종한 후의 결과는, G-CSF가 면역 반응에 관여하는 세포에 대해 유의적 효과가 있다는 것을 증명하는 것이다.

본 명세서는 본 발명의 범위와 영역에 대하여 기재한 것이지만, 이종 유전자, 삽입 부위, 프로모터와 혈청형 종류 등에 관한 본 발명의 범위에 속하는 모든 양태가 본 발명에서 제공되는 보호범위에 속하는 것은 당연하지만 모두 구체적으로 예시되지 않았다는 것은 자명한 것이다.

발명의 개요

본 발명의 제1 양태는 해당 DNA를 발현할 수 있는 재조합 돼지 아데노바이러스를 제공하는 것으로서, 이 해당 DNA는 재조합 돼지 아데노바이러스 게놈의 적절한 부위내로 안정하게 통합된다.

본 발명의 제2 양태는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시키는 재조합 돼지 아데노바이러스를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다. 이종 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드로서 발현가능한 것이 좋다. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 항원성 폴리펩티드는 숙주 벡터에 대해 외래성인 것이 좋다.

본 발명의 제3 양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 면역강화 분자로서 발현될 수 있다.

또한, 이종 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화 및/또는 발현할 수 있다는 것도 인지해야 한다.

재조합 벡터는 비리온 구조 단백질이 천연 돼지 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변경되지 않은 재조합 돼지 생아데노바이러스를 포함할 수 있는데, 여기서 재조합 돼지 아데노바이러스는 천연 돼지 아데노바이러스로부터 제조한 것이다.

본 발명은 부분적으로는 기타 아데노바이러스에 대해 이전에 특성규명된 것에 해당되지 않는 돼지 아데노바이러스 게놈내 비필수 영역이 있어서 이 영역이 바이러스를 이종 서열의 전달에 특히 적합하게 만든다는 발견에 입각한 것이다.

또한, 본 발명은 돼지 아데노바이러스가 돼지내 지속된 반응을 형성함으로써 백신 매개체로서 적합하다는 발견에 입각한 것이다. 추가로, 기도 또는 위장관에 특이적인 다수의 혈청형이 존재하면 표적 기관 및 필요한 면역반응 유형에 적합한 백신 매개체를 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 돼지 아데노바이러스가 중간 크기 게놈을 가진 포유류 아데노바이러스에 대한 105% 규칙보다 큰 게놈 DNA를 패키징할 수 있고, 그 결과 패키징된 비리온이 시험관내 및 생체내에서 안정하다는 발견에 입각한 것이다.

아데노바이러스는 인간 및 기타 포유류 뿐 아니라 각종 조류를 비롯하여 여러 현존하는 종으로부터 분리된 거대하고 다양한 과(科)이다. 결과적으로 아데노바이러스는 2개 이상의 속, 즉 마스토아데노비리대(Mastoadenoviridae) 및 아비아데노비리대(Aviadenoviridae)로 분리되어 있다. 더 최근에는 제3의 속, 즉 아트아데노비리대(Atadenoviridae)가 제안되었는데, 이는 일부 소 및 조류 아데노바이러스(난 강하 증후군(egg drop syndrom))을 포함한다(Benko and Harrach, Archives of Virology 143, 829-837, 1998).

돼지 아데노바이러스는 유력한 돼지의 감염제이며, 현재까지 4개의 별개 혈청형이 알려져 있으며(Adair and McFerran, 1976) 하나 이상의 증거가 있다(Derbyshire et al., 1975). 발견된 4종의 혈청형 중 3종(혈청형 1 내지 3)은 위장관에서 분리되고 제4의 혈청형은 호흡계에서 회수되었다. 돼지 아데노바이러스는 발병성이 낮은 널리 분포된 제제로 생각되며, 일반적으로 병에 걸린 동물로부터 분리되지만 아데노바이러스는 2차 감염으로서만 존재하는 것 같다. 아데노바이러스는 설사병 및 호흡 감염에 걸린 돼지로부터 분리되지만, 적어도 위장 아데노바이러스 감염은 보통 무증상인 것으로 보인다(Sanford and Hoover, 1983). 돼지 아데노바이러스는 섭취 및 흡입으로 유포되며, 경구, 비강내 및 기관내 접종을 통한 실험적 감염은 바이러스 흡수를 초래하였다. 실험적 병원성 연구로부터 감염의 1차 부위가 하부 소장, 아마도 편도라는 것을 확인하였다(Sharpe and Jessett, 1967; Shadduck et al., 1968). 혈청형 4 감염의 경우, 바이러스 혈증이 실험적 감염에서 형성되는 것으로 보인다. 그러나, 이는 위장 혈청형의 경우보다 덜 공통적인 징후일 수 있다(Shadduck et al., 1968). 변 배설물은 PAV 유포의 가장 공통적인 원인이며, 감염후 수주 동안 존재한다. 실험 조건하에서 비강 발산(shedding)이 발생할 수 있다. 폐렴에서 PAV의 역할은 소인 인자 또는 상승인자 중 하나인 것으로 제안되어 있지만(Kasza et al., 1969; Schiefer et al., 1974), 혈청형 4에 의한 보유한 실험적 폐렴은 질병을 발생시키기 위해서 제2 제제를 필요로하지 않았다(Smith et al., 1973).

돼지 아데노바이러스는 더 상세하게 조사되어야 하며, 질병에 있어서의 역할 또는 어느 정도 일반적인지에 대해 알려진 것이 거의 없다. 이는 돼지 아데노바이러스가 무리내에서 임의의 중요한 질병을 생성하지 않고 생산력 상실을 통하여 산업상 관심을 끌지 못했다는 사실에 기인한 것이다. 돼지 아데노바이러스의 혈청형 수는 4종보다 휠씬 많으며, 통상의 공생물로서 대다수의 돼지 무리에 존재하는 것 같다.

형태학 및 분자 생물학 측면에서 돼지 아데노바이러스를 연구하여 검사된 기타 마스트아데노바이러스(Mastadenoviruses)와 일부 유사한 점을 발견하였다. 돼지 아데노바이러스의 형태학은 2본쇄 DNA 게놈의 코어를 함유하는 20면체 캡시드를 가진 검사된 기타 아데노바이러스의 것과 같다. PAV 게놈의 특성에 대해서 공개된 것은 거의 없다(Benko et al., 1990, Kleiboeker et al., 1993, Reddy et al., 1993, Kleiboeker, 1994). PAV 게놈의 크기(약 34.8 kb)는 인간 아데노바이러스 게놈 크기(약 35.9 kb)보다 약간 작다. 돼지 아데노바이러스와 인간 아데노바이러스간에 적당한 DNA 상동성이 있는 인간 아데노바이러스 2형의 전체 게놈으로부터 얻은 DNA 프로브와의 하이브리드화를 이용하여 연구하였다(Benko et al., 1990). 혈청형 4 PAV에 대한 최근의 보고는, 서열 상동성이 예상할 수 있는 것 만큼 강하지는 않지만 게놈 배치가 L4 및 E3 영역(33K 및 pVIII 유전자 포함)의 범위내 인간 아데노바이러스의 게놈 배치와 유사하다는 것을 입증하였다(Kleiboeker, 1994).

돼지에 백신을 전달하기 위한 생벡터 개발용으로 적절한 PAV를 선택하는 동시에, 천연 혈청형의 보급을 참작하는 것이 중요하다. 이 분야에서 통상적으로 접할 수 없는 이들 혈청형은 돼지가 종종 노출되어 면역성을 형성하는 혈청형보다 명백한 장점이 있다.

추가로 초유내 모계 항체가 출생 직후 돼지를 보호하는 기간을 경과하여 벡터가 돼지내에서 활성을 유지하는 능력을 고려해야 한다.

유효 PAV 벡터를 선택하는데 있어서 기타 중요한 사항은 병원성 및 면역성이다. 바람직하게는 벡터 생바이러스는 고도의 감염성은 있으나 병원성이 없어(또는 적어도 약화되어야 함) 이들 자체가 표적 종에 역효과를 주지 않아야 한다.

백신 벡터로서 바람직한 후보는 혈청형 4(호흡계) 및 혈청형 3(위장)의 비병원성 분리물이다. 혈청형 3은 연속적인 돼지 신장 세포주에서 우수한 성장 능력 때문에 선택 혈청으로서 선택하였다. 기타 혈청형의 분리는 이러한 선별을 변경시킬 것이다. 독성이 더 강한 균주는 더 강한 항체 반응을 형성한다.

바이러스 게놈의 비필수 영역내로 도입되고 항체 또는 세포 매개된 면역성 형성이 바람직한 감염성 유기체의 항원성 결정인자를 암호화할 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열은 위장 바이러스가 유발하는 장 감염, 예컨대 로타바이러스 또는 파르보바이러스 감염, 또는 호흡 바이러스, 예컨대 파라인플루엔자 바이러스 또는 일본 뇌염 바이러스의 항원성 결정인자를 발현하는 서열이다.

도입될 수 있는 이종 뉴클레오티드 서열은

돼지 파르보바이러스

마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia)

돼지 파라인플루엔자

전달성 위장염(돼지 코로나바이러스)

돼지 로타바이러스

돼지 콜레라 바이러스(고전적인 돼지 열병)

돼지 이질

아프리카 돼지 열 바이러스

가성광견병 바이러스(아우제스키병 바이러스), 특히 가성광견병 바이러스의 당단백질 D

돼지 호흡 및 생식 증후군 바이러스(PRRSV)의 제제의 항원성 결정인자를 포함한다.

본 발명의 벡터 도입에 더욱 바람직한 이종 뉴클레오티드 서열은 돼지 파르보바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 코로나바이러스 및 고전적인 돼지 열 바이러스의 항원성 결정인자를 발현하는 서열이다.

또한, 도입되는 이종 서열은 시토킨 또는 성장 프로모터와 같은 면역강화 분자, 예컨대 돼지 인터루킨 4(IL4), 감마 인터페론(γIFN), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), FLT-3 리간드 및 인터루킨 3(IL-3)일 수 있다.

후보 벡터가 자극한 면역 반응의 유형은 그 내부의 삽입체에 대한 이종 뉴클레오티드 서열의 선별에 영향을 줄 수 있다. PAV 혈청형 1, 2 및 3은 위장을 통해서 자연적으로 감염시키는데, 국부 점막 면역성을 유도할 수 있으므로 장의 감염에 더욱 적절하다(예, 고전적인 돼지 열 바이러스). PAV 혈청형 4는 호흡계를 통해서 자연적으로 감염시키는데, 기도의 감염에 더욱 적절하며(예, 돼지 파라인플루엔자) 우수한 국부적 면역성을 유도할 수 있다.

항원성 결정인자 또는 면역강화 분자를 암호화하는 이종 유전자를 포함할 수 있는 해당 DNA는 바이러스 게놈의 하나 이상의 비필수 영역에 배치할 수 있다.

이종 뉴클레오티드 서열로 치환하거나 이 서열을 삽입하기에 적절한 바이러스 게놈의 비필수 영역은 지도 유닛 97 내지 99.5에서 게놈의 우측 말단 단부의 비암호 영역일 수 있다. 바람직한 비암호 영역은 지도 유닛 81 내지 84의 초기 영역(E3)을 포함한다.

이종 유전자 서열은 뉴클레오티드 서열이 가능한 효과적으로 동일계 발현될 수 있도록 프로모터 및 리더 서열과 연합될 수 있다. 이종 유전자 서열은 돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 및 스플라이스 리더 서열과 연합되어 있는 것이 바람직하다. 포유류 아데노바이러스 주요 후기 프로모터는 아데노바이러스 유전자 지도상에 16∼17 지도 유닛 부근에 있으며 전형적인 TATA 서열 모티프를 포함한다(Johnson, D.C., Ghosh-Chondhury, G., Smiley, J.R., Fallis, L. and Graham, F.L. (1988), 아데노바이러스 벡터를 사용한 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 gB의 풍부한 발현. Virology 164, 1-14).

고려중인 돼지 아데노바이러스 혈청형의 스플라이스 리더 서열은 모든 후기 유전자의 mRNA의 5' 말단에 스플라이스된 3분된 서열이다.

이종 유전자 서열은 폴리아데닐화 서열과 연합될 수 있다.

돼지 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 대신에, 임의의 기타 적절한 진핵 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, SV40 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 또는 인간 아데노바이러스의 프로모터를 사용할 수 있다.

돼지 아데노바이러스의 프로세싱 및 폴리 아데닐화 시그널 이외의 프로세싱 및 폴리 아데닐화 시그널, 예컨대 SV40의 것을 생각할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 돼지내 감염성 유기체에 의한 감염에 대한 보호를 제공 또는 개선시키도록 항체 또는 세포 매개된 면역성을 형성 및/또는 최적화시키는 용도의 재조합 백신을 제공하는데, 이 백신은 적절한 담체 및 부형제와 배합된 1종 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시킨 하나 이상의 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드 또는 면역강화 분자로서 발현 가능한 것이 바람직하다. 이종 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화 및/또는 발현할 수 있는 것이 더욱 바람직하다.

하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 항원성 폴리펩티드는 숙주 벡터에 대해 외래성인 것이 바람직하다. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 프로모터/리더 서열 및 폴리 A 서열과 연합되어 있을 수 있다.

재조합 백신은 비리온 구조 단백질이 천연 돼지 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변경되지 않은 재조합 돼지 생아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있는데, 여기서 재조합 돼지 아데노바이러스는 천연 돼지 아데노바이러스로부터 제조한 것이다.

재조합 백신에 사용하기 적절한 바람직한 벡터 후보는 혈청형 3 및 4의 PAV 분리물이다. 무리에 존재하는 면역성 및 그 환경에 따라 기타 혈청형을 사용하는 것도 가능하다.

백신은 각종 제제에 의해 유발된 호흡 감염 및 장 감염에 대해 유도할 수 있다. 특정 감염성 유기체에 대해 백신을 유도하기 위해서, 이들 감염성 유기체의 항원성 결정인자를 암호화하는 이종 유전자 서열을 벡터를 포함하는 돼지 아데노바이러스의 게놈의 비필수 영역내로 도입시킬 수 있다. 백신이 질병에 대한 보호를 최적화하기 위해서 사용된 경우, 적절한 이종 뉴클레오티드 서열은 시토킨 또는 성장 프로모터와 같은 면역강화 인자의 서열일 수 있다.

백신은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.

이러한 백신용으로 적절한 담체는 등장 완충된 염수일 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서는, 돼지내 감염성 유기체에 대한 보호를 유도 또는 증강시키도록 항체 또는 세포 매개된 면역성의 형성 및/또는 최적화를 위한 백신의 제조 방법이 제공되는데, 이 방법은 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시키는 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 작제하는 단계, 및 상기 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 투여하기에 적절한 형태로 두는 단계를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 면역강화 분자일 수 있지만, 항원성 펩티드로서 발현가능한 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화 및/또는 발현할 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 뉴클레오티드 서열은 숙주 벡터에 대해 외래성인 것이 편리하다.

뉴클레오티드 서열이 프로모터/리더 및 폴리 A 서열과 연합된 것이 더욱 더 바람직하다.

투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 돼지 아데노바이러스내로 삽입시키는 단계를 포함하여 돼지 아데노바이러스 백신 벡터를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 면역강화 분자일 수 있지만 항원성 폴리펩티드로서 발현할 수 있는 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 서열은 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화 및/또는 발현할 수 있다.

하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 항원성 폴리펩티드는 숙주 벡터에 대해 외래성인 것이 바람직하다.

이종 뉴클레오티드 서열은 프로모터/리더 및 폴리 A 서열과 연합되어 있는 것이 더욱 바람직하다.

적절한 벡터를 작제하는 한 방법에서, 외래 DNA를 도입시키기 위해서 변경하고자 하는 비필수 영역은 상동 재조합을 통해서 작제할 수 있다. 이 방법으로 비필수 영역을 클로닝하고 프로모터, 리더 및 폴리 아데닐화 서열과 함께 외래 DNA를 인접 서열 사이에 상동 재조합으로 삽입하는 것이 바람직하다. 또한, 이 방법으로 비필수 영역의 일부를 결실시켜 바이러스의 통상적인 패킹 제한을 초과하는 더 큰 DNA 삽입체에 대한 여분의 공간을 형성할 수 있다.

이 방법으로, 외래 유전자 서열 뿐 아니라 리더 서열 및 폴리아데닐화 인지 서열과 함께 적절한 PAV 프로모터를 포함하는 DNA 발현 카세트를, PAV 게놈내로 쉽게 삽입할 수 있는 카세트에 인접한 고유 제한 효소 부위를 이용하여 작제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 백신을 투여하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

한 방법으로서, 이종 항원 및 시토킨과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수 있다.

본 발명의 한 방법에서, PAV 벡터를 주성분으로 하는 백신은 상이한 외래 유전자 또는 면역강화제를 보유하는 2 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다.

본 발명의 바람직한 예방접종 방법에서, "칵테일", 또는 동시에 PAV 혈청형 3 및 혈청형 4를 주성분으로 하는 백신을 사용한다.

또 다른 바람직한 방법으로서, 염기 재조합 혈청형 3 돼지 아데노바이러스를 작제하고, 혈청형 3의 섬유 유전자를 대체한 혈청형 4에서 유래한 섬유 유전자 또는 혈청형 4에서 유래한 섬유를 백신내로 클로닝시켜 장 및 호흡 전달에 대한 본 발명의 표적화를 확장시킨다.

본 발명의 대안적인 방법에서, PAV 벡터를 주성분으로 하는 백신은 초기 PAV 예방접종에 후속되는 일부 단계에서 추가 백신 또는 신규 백신을 투여하여 서로 연속 투여할 수 있다. 사용된 백신은 이종 PAV 분리물을 주성분으로 하는 것이 바람직하다.

"연속" 단계의 바람직한 형태에서, 혈청형으로 무관한 분리물을 주성분으로 하는 백신을 선별하여 감염에 대해 최대로 보호할 수 있다. 이러한 방법의 한 예로서, PAV 혈청형 3을 주성분으로 하는 백신을 PAV 혈청형 4를 주성분으로 하는 백신의 예방접종 후 또는 그 전에 투여한다.

돼지는 임의의 연령에서 본 발명의 벡터 백신을 편리하게 접종한다. 새끼 돼지는 1일령에 예방접종할 수 있고, 양육자는 출생시 및 그 이후에 일정 시점까지 규칙적으로 예방접종을 할 수 있다.

바람직하게는 연속 방법 또는 칵테일 방법에 따라서, 완전히 면역타협시키지 않고 돼지에게 예방접종한다. 더욱 편리하게는, 초기 예방접종한지 4주 후에 재감염에 대해 보호하기 위해서 햇돼지에게 예방접종할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 재조합 백신의 유효량을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 돼지내 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다. 유효량은 면역 반응을 유발하기에 충분한 양, 바람직하게는 용량당 10⁴이상의 TCID₅₀이다.

물론 본 발명의 백신은 투여 시간에 아우제스키병 또는 파르보바이러스와 같은 기타 바이러스 또는 유기체에 대한 백신과 조합할 수 있다.

본 발명의 양태의 바람직한 양상은 경구 전달 또는 비강내로 투여하는 것이다.

본 발명의 재조합 벡터 및 백신을 작제 및 시험하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 엔도뉴클레아제 분해, 결찰 및 전기 영동에 대한 표준 과정은 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 표준 기법을 상세히 기술하지는 않았으나, 당업자에게는 표준 기법이 자명할 것이다.

Claims

해당 DNA가 재조합 돼지 아데노바이러스 게놈의 적절한 부위내로 안정하게 통합되는, 해당 DNA를 발현할 수 있는 재조합 돼지 아데노바이러스.
안정하게 통합되어 해당 DNA를 발현할 수 있는 재조합 돼지 아데노바이러스를 포함하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 재조합 돼지 아데노바이러스가 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있는 것이 특징인 재조합 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 재조합 돼지 아데노바이러스는 이 바이러스가 유래된 천연 돼지 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않은 비리온 구조 단백질을 보유한 돼지 생아데노바이러스를 포함하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열이 항원성 폴리펩티드로서 발현가능한 것이 특징인 재조합 벡터.
제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열이 면역강화 분자로서 발현가능한 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지내 장 질병을 유발하는 감염성 제제의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지내 호흡 질병을 유발하는 감염성 제제의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 이종 서열이 가성광견병 바이러스(아우제스키병 바이러스)의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 이종 서열이 가성광견병 바이러스의 당단백질 D의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 이종 서열이 돼지 호흡 및 생식 증후군 바이러스(PRRSV)의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지(Hog) 콜레라 바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 파르보바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 코로나바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 로타바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 파라인플루엔자 바이러스의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia)의 항원성 결정인자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 FLT-3 리간드를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 인터루킨 3(IL-3)을 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 인터루킨 4(IL4)를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 감마 인터페론(γIFN)을 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 돼지 과립구 콜로니 자극 인자(G-SCF)를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제3항 또는 제4항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 벡터.
제2항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 돼지 아데노바이러스가 혈청형 3 및 혈청형 4로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 재조합 벡터.
제2항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해당 DNA가 돼지 아데노바이러스 게놈의 비필수 영역내로 안정하게 통합되는 것이 특징인 재조합 벡터.
제2항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해당 DNA가 게놈의 우측 말단내로 안정하게 통합되는 것이 특징인 재조합 벡터.
제27항에 있어서, 해당 DNA가 지도 유닛 97 내지 99.5에서 게놈의 우측 말단내로 안정하게 통합되는 것이 특징인 재조합 벡터.
제2항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해당 DNA가 게놈의 E3 영역내로 안정하게 통합되는 것이 특징인 재조합 벡터.
제29항에 있어서, 해당 DNA가 지도 유닛 81∼84에서 게놈의 E3 영역내로 안정하게 통합되는 것이 특징인 재조합 벡터.
돼지 아데노바이러스 게놈의 비필수 영역내로 효과적인 프로모터 서열과 연합된 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 삽입시키는 단계를 포함하여 백신용의 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법.
제31항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 전에, 제한 효소 부위를 돼지 아데노바이러스 게놈의 비필수 영역내로 삽입하는 것이 특징인 백신용의 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법.
백신이 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시켜 발현시킬 수 있는 1종 이상의 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터와 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것이 특징인, 돼지내 감염성 유기체에 의한 감염에 대한 보호를 제공 또는 증가시키기 위해서 항체 또는 세포 매개된 면역성을 형성 및/또는 최적화하는 용도의 재조합 백신.
제33항에 있어서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열이 항원성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 것이 특징인 재조합 백신.
제33항에 있어서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열이 면역강화 분자로서 발현가능한 것이 특징인 재조합 백신.
제33항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 항원성 폴리펩티드 및 면역강화 분자를 암호화하는 것이 특징인 재조합 백신.
제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 담체 및/또는 부형제는 상기 백신이 에어로졸 분무, 장용피 용량 단위체 또는 접종물의 형태로 전달가능하도록 선택되는 것이 특징인 재조합 백신.
적절한 담체 및/또는 부형제와 함께 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시켜 이를 발현시킬 수 있는 1종 이상의 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 혼합하는 단계를 포함하는 제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 재조합 백신의 제조 방법.
예방접종이 필요한 질병의 항원성 결정인자를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 안정하게 도입시켜 발현시킬 수 있는 제1 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터를 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여 질병에 대해 돼지를 예방접종시키는 방법.
제39항에 있어서, 제1 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터내에 도입된 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열과 상이한 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 돼지 아데노바이러스 벡터를 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 것이 특지인 예방접종 방법.
제40항에 있어서, 제2 돼지 아데노바이러스 벡터가 제1 돼지 아데노바이러스 벡터의 혈청형과 다른 혈청형을 포함하는 것이 특징인 예방접종 방법.
제39항에 있어서, 제2 돼지 아데노바이러스 벡터가 면역강화 분자를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 도입시키고, 발현시킬 수 있는 것이 특징인 예방접종 방법.