BRPI0714932A2 - mÉtodos e composiÇÕes para aumento do tropismo tecidual de vetores adenovirais recombinantes - Google Patents
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Abstract
MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA AUMENTO DO TROPISMO TECIDUAL DE VETORES ADENOVIRAIS RECOMBINANTES.São fornecidos métodos que permitem a preparação de vetores adenovirais com tropismo alterado. Também são fornecidas composições que compreendem esses vetores e métodos de sua utilização.
Description
MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA AUMENTO DO TROPISMO TECIDUAL DE VETORES ADENOVIRAIS RECOMBINANTES
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção está relacionada aos métodos e às composições para aumento do tropismo tecidual de adenovírus recombinantes que compreendem a utilização de células recombinantes que fornecem ao adenovírus recombinante uma segunda fibra, alterando, dessa forma, o tropismo do adenovírus recombinante. A presente invenção também está relacionada aos métodos de produção e utilização dos adenovírus recombinantes que possuem tropismo alterado. FUNDAMENTO_S_ DA_ INVENÇÃO
Os adenovírus causam infecção entérica ou respiratória em seres humanos, bem como em animais domésticos e de laboratório. A proteína da fibra adenoviral tem uma participação essencial na adesão viral por interagir com receptores celulares específicos que facilitam a entrada em células hospedeiras suscetíveis. Dessa forma, a proteína da fibra determina o tropismo tecidual específico de um adenovírus em particular (Chroboczek e cols. , 1995) . A fibra é considerada, portanto, a molécula da superfície viral mais importante na adesão do vírion às células-alvo.
A fim de explorar essa propriedade de direcionamento, foram usados vários métodos para alterar a proteína da fibra carregada por adenovírus humanos específicos. Foram utilizadas várias abordagens para redirecionar partículas adenovirais a diferentes tipos de células, incluindo o uso de adenovírus recombinantes com estrutura da fibra modificada (Wickham e cols., 1997; Dimitriev e cols., 1998 ; Wirtz e cols., 1999), anticorpos de cadeia simples (scFv) (Watkins e cols., 1997; Douglas e cols., 1999), proteínas de fibra quiméricas (Krasnykh e cols., 1996; Stevenson e cols., 1997) e troca de proteínas da fibra de diferentes sorotipos (Gall e cols., 1996). Essas abordagens exigem a manipulação genética do genoma adenoviral, o que reduz o espaço já limitado para incorporação de genes estranhos no genoma viral, ou a formação de complexos de conjugados biespecíficos com partículas adenovirais.
Com a utilização de uma abordagem diferente, Von Seggern e cols. (1998) construíram uma linhagem de células que expressavam de forma estável a proteína da fibra do sorotipo 5 do Adenovírus Humano (HAdV5). Após passagem do HAdV 3 através dessa linhagem celular, partículas virais continham a proteína da fibra do sorotipo 5. O crescimento de um HAdV mutante com defeito de fibras nessa linhagem celular permitiu a geração de adenovírus humano fibra- positivo.
Adicionalmente, também foram relatadas linhagens de células que expressam genes que permitem a complementação de vetores adenovirais com eliminações de diversos genes reguladores (Wang e cols., 1995; Amalfitano e cols., 1996; Amalfitano e cols., 1997).
Todos os trabalhos publicados até hoje sobre direcionamento dirigido à fibra parecem se concentrar no redirecionamento do adenovírus de um tipo de tecido-alvo específico para outro tecido-alvo específico e, em alguns casos, restringindo enormemente as células-alvo às quais o adenovírus pode se aderir. Ainda são necessários métodos adicionais para ampliar os tipos de tecido-alvo no animal ao qual o adenovírus recombinante pode se ligar. Esses métodos podem ser úteis no aumento ou na supra-regulação da quantidade e/ou da qualidade da resposta imunológica gerada contra um antígeno específico ou do efeito terapêutico de uma molécula imunomoduladora.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção explora linhagens de células que expressam uma proteína da fibra a fim de permitir a adição de uma segunda fibra a um vetor de adenovírus recombinante, sem ter que inserir geneticamente o gene da segunda fibra no genoma do adenovírus recombinante. Ao fazê-lo, essas células e métodos de sua utilização permitem um aumento do tropismo tecidual específico de um adenovírus específico. Além disso, o fato de que o segundo gene não precisa ser inserido geneticamente no adenovírus recombinante dá um espaço maior no genoma viral que pode ser usado para inserção de genes estranhos.
Dessa forma, a presente invenção fornece, em um aspecto, um vetor adenoviral recombinante que compreende um adenovírus que compreende um gene de fibra nativo para o 2 0 adenovírus, e ainda compreende um gene da segunda fibra que é heterólogo ao adenovírus, em que o gene da segunda fibra é adquirido pelo adenovírus recombinante por crescimento do adenovírus recombinante em uma linhagem de células que expressam de forma estável o gene da segunda fibra. 0 vetor adenoviral pode ser qualquer vetor adenoviral, incluindo, sem limitação, um vetor adenoviral selecionado do grupo que consiste em adenovírus suíno, humano, aviário, bovino, eqüino e ovino. Aqueles habilitados na técnica sabem que há vários sorotipos de adenovírus, e deve-se entender que os vetores adenovirais para a presente invenção não se limitam a qualquer sorotipo específico. A invenção contempla particularmente composições que compreendem os vetores adenovirais recombinantes da presente invenção. Essas composições preferivelmente são composições farmacêuticas que compreendem um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Em modalidades específicas, o adenovírus pode ser um adenovírus suíno recombinante selecionado do grupo que consiste em adenovírus suíno recombinante sorotipo 1 (PAdV-
1), PAdV recombinante-2, PAdV recombinante-3, PAdV recombinante-4 e PAdV recombinante-5, PAdV recombinante-6 e PAdV recombinante-7. Os adenovírus suínos sorotipos PAdV-I a PAdV-5 são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e foram bem caracterizados. Também foi demonstrada
a existência e a caracterização de PAdV-6 e PAdV-7 por Kadoi (Kadoi e cols., New Microbiol., 20: 215-220, 1997; e Kadoi, New Microbiol., 20: 89-91, 1997). Em modalidades preferidas, o vetor adenoviral recombinante é um PAdV recombinante-3.
2 0 Em outras modalidades, o adenovírus é um HAdV
recombinante, um adenovírus bovino recombinante (BAdV), um adenovírus ovino recombinante (OAdV), um adenovírus murídeo recombinante (MAdV) , um adenovírus símio recombinante (SAdV) ou um adenovírus canino recombinante (CAdV).
Em vetores adenovirais recombinantes específicos da
invenção, a proteína da segunda fibra é a proteína de fibra selecionada de PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 e PAdV-5.
Em certos aspectos da invenção, o vetor adenoviral recombinante é um vetor adenoviral (por exemplo, um vetor
3 0 baseado no PAdV) que ainda compreende proteína de uma terceira fibra que é diferente da proteína da primeira ou da segunda fibra.
Em aspectos preferidos, a proteína da segunda fibra no vetor recombinante compreende a proteína da fibra de PAdV- 4 .
0 vetor adenoviral recombinante da invenção pode ser replicação-competente ou com replicação defeituosa. Por exemplo, o vetor com replicação defeituosa pode ser um PAdV recombinante que compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região essencial do genoma do PadV, e a linhagem celular que expressa de forma estável o gene de fibra também expressa a região essencial do genoma do PAdV na qual a seqüência de nucleotídeos heteróloga foi inserida.
Vetores adenovirais recombinantes exemplares que são
replicação-competentes são aqueles nos quais o adenovírus recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região não essencial do genoma adenoviral. A seqüência de nucleotídeos heteróloga pode 2 0 ser, em algumas modalidades, um gene heterólogo que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um hormônio do crescimento e uma citocina. Outro aspecto da invenção é dirigido a uma célula
hospedeira que compreende um adenovírus que compreende um gene de fibra nativo para o adenovírus suíno e em que a célula hospedeira é uma célula recombinante que expressa um gene de fibra que é heterólogo ao adenovírus e é capaz de ser infectada por adenovírus suíno. A célula pode ser uma célula mamífera ou uma célula aviária. Células mamíferas exemplares incluem, sem limitação, uma célula suína, uma célula humana, uma célula bovina e uma célula ovina. Em certos aspectos, a célula é uma célula suína recombinante.
Um aspecto adicional da invenção está relacionado a
uma composição capaz de induzir uma resposta imunológica em um indivíduo mamífero, a composição compreendendo um vetor adenoviral recombinante da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outros aspectos, a invenção descreve métodos para
despertar uma resposta imunológica em um indivíduo mamífero que compreende a administração de uma composição desse tipo ao indivíduo mamífero. Por exemplo, o indivíduo mamífero é um porco.
A invenção também se dirige a um método de preparação
de um adenovírus que compreende o cultivo de uma célula hospedeira recombinante que expressa um gene de fibra adenoviral sob condições adequadas à infecção da célula com adenovírus, o contato da célula com um vetor de adenovírus 2 0 recombinante que compreende a(s) seqüência(s) do adenovírus essencial à encapsidação e um gene heterólogo que codifica uma proteína heteróloga e em que o adenovírus recombinante compreende um gene de fibra que é diferente do gene de fibra na célula hospedeira; e, opcionalmente, a coleta do adenovírus. Em modalidades específicas, a proteína heteróloga é uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um hormônio do crescimento e uma citocina. Em modalidades específicas, esse método é aquele no qual o vetor adenoviral coletado compreende uma especificidade tecidual mais ampla, comparado com o vetor adenoviral que não entra em contato com a célula hospedeira recombinante.
Além disso, no método mencionado anteriormente, o
vetor adenoviral pode opcionalmente ser eliminado em parte ou em toda uma ou mais proteínas adenovirais que não são essenciais para a replicação.
A invenção também se dirige a uma vacina para a proteção de um hospedeiro mamífero contra infecção, que compreende o vetor de adenovírus recombinante da invenção e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em modalidades específicas, a região não essencial é selecionada do grupo que consiste na região E3, ORF 1-2 e 4-7 de E4, na região entre a extremidade de E4 e a ITR do genoma do adenovírus suíno.
Também são aqui descritos uma composição que compreende uma célula hospedeira que expressa um gene de fibra adenoviral e um vetor adenoviral recombinante que compreende ácido nucléico que codifica uma proteína heteróloga sob o controle de uma seqüência de controle de expressão, em que o vetor adenoviral recombinante compreende um gene de fibra que é nativo para o adenovírus do vetor. Em aspectos preferidos, a célula hospedeira foi infectada com o vetor adenoviral suíno recombinante.
A invenção ainda está relacionada aos métodos de tratamento como, por exemplo, métodos de vacinação de um animal que compreende a administração ao animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina aqui descrita. Outros métodos da invenção estão relacionados ao aumento da especificidade celular para o tecido do hospedeiro de um vetor de adenovirus recombinante que compreendem o crescimento do adenovirus recombinante em uma célula hospedeira que compreende uma proteína da segunda fibra que é diferente da proteína da fibra do adenovirus recombinante. Nesses métodos, o vetor de adenovirus recombinante pode ser um PAdV recombinante selecionado do PAdV recombinante-1, PAdV recombinante- 2, PAdV
recombinante-3, PAdV recombinante-4 e PAdV recombinante- 5 . De preferência, a proteína da segunda fibra é a proteína de fibra selecionada de PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 e PAdV- 5. Nos métodos da invenção, o PAdV recombinante pode ainda compreender proteína de uma terceira fibra que é diferente da proteína da primeira ou da segunda fibra.
Nos métodos preferidos de aumento da especificidade celular para o tecido do hospedeiro de um vetor de adenovirus recombinante, o PAdV recombinante usado é um PAdV recombinante-3. Em modalidades específicas, esse PAdV recombinante-3 compreende a proteína da fibra de PAdV-4 . Nesses métodos, o PAdV recombinante pode ser replicação- competente ou com replicação defeituosa. Em modalidades específicas preferidas, o PAdV recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região não essencial do genoma do PAdV. Em modalidades exemplares, a seqüência de nucleotídeos heteróloga é um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um 3 0 hormônio do crescimento e uma citocina. Outras características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada que será apresentada a seguir. Deve-se entender, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração, na medida em que várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os desenhos a seguir formam parte da presente especificação e são incluídos para ilustrar ainda mais aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida por referência aos desenhos, em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.
Figura 1. Construção de plasmídeos que contêm o gene de fibra de PAdV-4. a) 0 gene de fibra de PAdV-4 foi amplificado a partir do DNA de PAdV-4 por PCR, e clonado em pGEM-T (Promega) , resultando no plasmídeo PJJ392. b) O fragmento BamHl/Bglll de pJJ392 que contém o gene de fibra de PAdV-4 foi inserido no sítio BamHI do líder tripartite do plasmídeo pCI-PAdV-3 (TPL) abaixo da seqüência promotora do promotor-intensificador inicial imediato do
citomegalovírus humano (CMV) e de PAV-3 TPL, resultando em ρJJ741. c) 0 vetor de transferência pJJ743 foi construído por inserção do fragmento Nhel/Notl de pJJ741 que contém o gene de fibra de PAdV-3TPL e PAdV-4 em pCI-neo (Promega) . Figura 2. Detecção por PCR do DNA de fibra do PAdV-4 em linhagens celulares. DNA genômico de células transfectadas foi purificado e testado por PCR quanto à presença do gene de fibra de PAdV-4 . a) raia 1 = clone de PK15 8, raia 2 = clone de PK15 9, raia 3 = controle de PJJ74 3, M = DNA ladder de 1 Kb. b) raias 1-5 = clones de ST 2-6, raia 6 = DNA de ST não transfectada, raia 7 = DNA do PADV-4, raia 8 = controle de pJJ743. c) raias 9-15 = clones de ST 7-14, M = DNA ladder de 1 Kb.
Figura 3. Detecção por PCR de transcrição reversa (RT- PCR) de mRNA de fibra do PAdV-4 a partir de linhagens celulares. O RNA total de células transfectadas Foi preparado, e os clones positivos por PCR para o gene de fibra de PAdV-4 foram testados quanto à síntese de mRNA de fibra do PAdV-4 por RT-PCR. a) raia 1 = clone de PK15 8, raia 2 = clone de PK15 9, M= DNA ladder de 1 Kb. b) raias 1-6 = clones de ST 2, 3, 5, 6, 7e8, M= DNA ladder de 1 Kb.
Figura 4. As seqüências de aminoácidos completas de proteínas da fibra de PAdV-3 e PAdV-4 e localização de peptídeos. As seqüências dos peptídeos comuns e específicos usados para a geração de anti-soros de coelho estão realçadas em negrito e sublinhadas (Reddy e cols., 1995; Kleiboeker 1995).
Figura 5. Demonstração de fibras de PAdV-3 e de PAdV-4 em vacina modificada. Glicoproteína de PAdV recombinante 55 (gp5 5) cresceu em células PK15A (não modificadas) ou células PK743 (modificadas). As proteínas presentes em amostras de vírus em duplicata foram separadas por SDS/PAGE, blotted em nitrocelulose e coradas com um 3 0 anticorpo de coelho desenvolvido contra um peptídeo de fibra comum (painel a) ou contra um peptídeo de fibra específico para PAdV-4 (painel b) . Raia 1 = vírus não modificado, raia 2 = vírus modificado. São mostrados marcadores de peso molecular de alta amplitude, posição e peso molecular aproximado de proteínas da fibra.
Figura 6. Temperaturas dos porcos pós-ataque. Os porcos foram vacinados no dia 0 e receberam uma dose de reforço no 22° dia. Os porcos foram atacados no 49° dia com vírus da febre suína clássica (CSFV). As temperaturas retais de cada porco foram medidas diariamente após o ataque com CSFV. São mostradas barras de temperaturas médias e de erro padrão para cada grupo de porcos. ♦ rPAdV-gp55 não modificado s/c, ■ = rPAdV-gp55 modificado s/c, a = rPAdV-gp55 modificado oral, π = Controles, + = sacrificados (eutanásia).
Figura 7. Titulações de NPLA pós-vacinação. Os porcos foram vacinados no dia 0 e receberam uma dose de reforço no 22° dia. Os porcos foram atacados no 49° dia com CSFV. Foram coletadas amostras de sangue total no dia 0 e depois em intervalos semanais, com o soro testado quanto à presença de anticorpos de NPLA. São mostradas as titulações médias de NPLA para grupos vacinados. □ = rPAdV-gp55 não modificado s/c, π = rPAdV-gp55 modificado s/c, ■ = rPAdV- gp55 modificado oral. -I = vacinação. Figura 8. Desenvolvimento de anticorpos neutralizantes
específicos para CSFV em porcos vacinados por via oral. Os porcos foram vacinados por via oral no dia 0, e receberam uma dose de reforço no 22° dia. Os porcos foram atacados no 49° dia com CSFV. Foram coletadas amostras de sangue total 3 0 no dia 0, e depois em intervalos semanais, com o soro testado quanto à presença de anticorpos de NPLA. São mostradas as titulações médias de NPLA para grupos vacinados. = rPAdV-gp55 não modificado*, ΓΊ = rPAdV-gp55 modificado. * = dados experimentais separados em Hammond e cols. , 2003. -I = vacinação.
Figura 9. Comparação do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes específicos para CSFV em porcos vacinados. Os porcos foram vacinados por via oral no dia 0, e receberam uma dose de reforço no 22° dia. Os porcos foram atacados no 49° dia com CSFV. Foram coletadas amostras de sangue total no dia 0, e depois em intervalos semanais, com o soro testado quanto à presença de anticorpos de NPLA. São mostradas as titulações médias de NPLA para grupos vacinados, i = vacinação. s/c = vacina não modificada administrada por via subcutânea, mod s/c = vacina modificada administrada por via subcutânea, oral = vacina não modificada administrada por via oral*, mod oral vacina modificada administrada por via oral. * = dados experimentais separados em Hammond e cols., 2003. Figura. 10. Detecção de antígeno do CSFV nos baços de
porcos. Após o sacrifício dos animais, as amostras de baço foram analisadas por ELISA por captura de antígeno quanto à presença de antígeno do CSFV. São mostradas as titulações médias de antígeno para os grupos. Pos = amostra de baço de controle positivo, neg = amostra de baço de controle negativo, + = sacrificados (eutanásia).
DESCRIÇÃO_ DETALHADA DE _MODALIDADES _ EXEMPLARES DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada à descoberta e construção de vetores adenovirais aperfeiçoados. Embora os métodos e as composições aqui descritas sejam exemplificados com a utilização de vetores de adenovirus suino como sistemas-modelo, ficará evidente que os métodos da presente invenção podem ser facilmente adaptados para uso na preparação de vetores adenovirais recombinantes que infectam outros hospedeiros, além de porcos. Os métodos e as composições da invenção são usados para alterar o tropismo do vetor adenoviral recombinante, aumentando, dessa forma, a utilidade do vetor, direcionando-os aos tecidos que normalmente não infectariam. Na presente invenção, é fornecido um gene de uma segunda fibra ao adenovirus recombinante por crescimento do vetor adenoviral recombinante em uma linhagem celular que expressa esse gene de uma segunda fibra, em que crescimento nessa linhagem celular está associado a uma alteração no tropismo do vetor adenoviral recombinante. A segunda fibra, contida na linhagem celular na qual o adenovirus recombinante é propagado, permite que o adenovirus infecte o tecido para o qual o gene de fibra na linhagem celular é especifico. Métodos e composições para exploração desse achado são contemplados pela presente invenção.
0 termo "vetor de adenovirus" é aqui usado de forma intercambiável com o termo "vetor adenoviral". Os vetores adenovirais aqui empregados são vetores recombinantes que compreendem uma construção de polinucleotideo para a expressão de uma proteína que deve ser liberada pelo vetor adenoviral. A construção de polinucleotideo compreenderá pref erivelmente o DNA que codifica a proteína a ser liberada. Esse DNA pode ser composto pelas bases de nucleotídeos A, T, C e G, mas também pode incluir quaisquer análogos ou formas modificadas dessas bases. Esses análogos e bases modificadas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e incluem, sem limitação, nucleotideos metilados, modificações internucleotideos como, por exemplo, ligações não carregadas e tioatos, o uso de análogos de açúcares e estruturas centrais modificadas e/ou alternativas, como, por exemplo, poliamidas.
Os vetores adenovirais aqui usados podem ser replicação-competentes ou com replicação defeituosa em uma célula-alvo. Caso os vetores possuam a replicação defeituosa, os vetores poderão necessitar do uso de uma célula auxiliar ou um vírus auxiliar para facilitar a replicação. 0 uso de células auxiliares ou de vírus auxiliares para promover a replicação de vetores adenovirais com replicação defeituosa é rotineiro e bem conhecido na técnica. Tipicamente, essas células auxiliares fornecem a função da entidade que foi retirada do vetor adenoviral recombinante para tornar sua replicação defeituosa. Um vetor replicação-competente, por outro lado, pode ser denominado um "vetor viram sem auxiliar", pelo fato de que ele não necessita de um segundo vírus ou de uma linhagem celular para fornecer algo defeituoso no vetor.
Como observado acima, a presente invenção é usada para alterar o tropismo de certo vetor adenoviral, ou seja, para alterar a especificidade de um adenovírus. O termo "tropismo alterado" engloba alteração da especificidade de espécie, além de alteração de especificidade tecidual ou celular de um adenovírus. Em modalidades exemplares da presente invenção, a especificidade de um vetor adenoviral 3 0 é alterada fornecendo ao vetor uma proteína da segunda fibra. A presença de duas proteínas de fibra no vetor adenoviral obtém a alteração desejada no tropismo do vetor adenoviral.
A. Genes de fibras A presente invenção fornece uma segunda fibra ao
adenovírus recombinante a fim de alterar o tropismo daqueles vetores. Em modalidades preferidas, os métodos da presente invenção compreendem a alteração do tropismo de um vetor adenoviral suíno recombinante. A infecção por PAdV foi associada à encefalite, pneumonia, lesões renais e diarréia (Derbyshire (1992) Em: "Diseases of Swine" (ed. Leman e cols.), 7a edição, Iowa State University Press, Ames, Iowa. pp. 225-227). Além disso, o PAdV é capaz de estimular tanto a resposta humoral quanto respostas de anticorpo mucoso no intestino de leitões infectados. Tuboly e cols. (1993) Res. in Vet. Sei. 54: 345-350. Há pelo menos sorotipos de PAdV que foram descritos (PAdV-1, PAdV-2, PAdV- 3, PAdV-4, PAdV-5; Derbyshire e cols. (1975) J. Comp. Pathol. 85: 437-443; e Hirahara e cols. (1990) Jpn. J. Vet. Sei. 52: 407-409.). Cada um desses sorotipos pode facilmente ser usado para preparar os vetores adenovirais recombinantes para uso, por exemplo, na produção de vacinas para porcos. Toda a seqüência de PAdV-3 foi clonada (Reddy e cols., 1998; Patente U.S. N0 6.492.343, aqui incorporada por referência). Além disso, houve intensas caracterizações do genoma de PAdDV-3, bem como de PAdV-I e PAdV-2, com o uso de mapeamento de restrição e clonagem de fragmentos de restrição. Veja Reddy e cols. (1993) Intervirology 36: 161- 168; Reddy e cols. (1995b) Arch. Virol. 140: 195-200. Seqüências de nucleotídeos para diversos segmentos de vários sorotipos de PAdV são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, E3 de PAdV-3, pVIII e genes de fibra são mostrados em Reddy e cols. (1995) Virus Res. 36: 97-106. E3 de PAdV-I e de PAdV-2, pVIII e genes de fibra são mostrados em Reddy e cols. (1996) Virus Res. 43: 99-109. Kleibocker fornece as seqüências de E3 de PAdV-4, pVIII e seqüências gênicas de fibra (Kleiboeker 1994 Vírus Res. 31:17-25). A seqüência gênica da fibra de PAdV-4 foi determinada por Kleiboeker (1995) Virus Res. 39: 299-309. Seqüências de repetição terminal invertida para cada um de PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 e PAdV-5 também são conhecidas na técnica (Reddy e cols. (1995) Virology 212: 237-239) . 0 penton da seqüência de PAdV-3 foi determinado por McCoy e cols. (1996) Arch. Virol . 141: 1.367-1.375. A seqüência de nucleotídeos da região El de PAdV-4 foi mostrada em Kleiboeker (1995) Virus Res. 36: 259-268. A seqüência do gene de protease (23 K) de PAdV-3 foi determinada por McCoy e cols. (1996) DNA Seq. 6: 251-254. A seqüência do gene do héxon de PAdV-3 (e dos 14 códons do terminal N do gene de protease de 23 K) foi depositada na base de dados GenBank sob o N0 de acesso U34592. A seqüência do gene de PAdV-3 de 100 K foi depositada na base de dados GenBank sob o N0 de acesso U82628. A seqüência da região E4 de PAdV-3 é conhecida na técnica (Reddy e cols. (1997) Virus Genes 15: 87-90). Vrati e cols. (1995, Virology, 209:400-408) revelam seqüências para OAdV. As seqüências da fibra e de HNF-61 pVIII, 0RF2, ORF3, ORF4 para PAdV-5 são mostradas no N0 de acesso no Genbank AF18 6621. A seqüência genômica completa de PAdV-5 é mostrada no N0 de acesso no Genbank AC 000009 BK000411, na qual o gene de fibra é mostrado como estando entre 26487 .. 27989, e recebe o N0 de acesso no Genbank AP_000254 . A seqüência completa do adenovírus suíno C é fornecida no N0 de acesso no Genbank NC_002702, na qual o gene de fibra é mostrado como estando entre 26487..27989, e recebe o N0 de acesso no Genbank NP_108675.1. Uma seqüência de fibra para PAdV-4 é mostrada no N0 de acesso no Genbank U25120.
Os adenovírus humanos HAdV-3, HAdV-4, HAdV-5, HAdV-9 e HAdV- 3 5 são todos bem caracterizados na técnica, e estão disponíveis pela "American Tissue Culture Collection" (ATCC). 0 número de acesso do "National Center for Biotechnology Information" GenBank para Ad5 é M73260/M29978; para Ad9 X74659; e para Ad35, U10272. Chow e cols. (1977, Cell 12:1-8) revelam seqüências do adenovírus humano 2; Davison e cols. (1993, J. Mole. Biol. 234: 1.308- 1.316) revelam a seqüência de DNA de HAdV-40; Sprengel e cols. (1994, J. Virol. 68: 379-389) revelam a seqüência de DNA para o DNA de HAdV-12; Vrati e cols. (1995, Virology, 209: 400-408) revelam seqüências para OAdV; Morrison e cols. (1997, J. Gen. Virol. 78: 873-878) revelam seqüência de DNA de CAdV-1; e Reddy e cols. (1998, Virology, 251: 414) revelam as seqüências de DNA para PAdV. As seqüências de fibra de vários adenovírus humanos estão disponíveis no GenBank sob o N° de acesso Y14241 (gene de fibra de HAdV- 28) , Y14241 (gene de fibra de HAdV-17) ; uma seqüência genômica completa para HAdV-17 é mostrada no genoma completo em AC_000006 BK000406, na qual o CDS da fibra está entre 30935 .. 32035, e recebe o N0 de acesso no Genbank AP_0 0 015 7.1; X76706 (HAdV-15H9 (Morrison) gene de fibra), X76548 (gene de HAdV-31 para proteína da fibra); AB125751 (CDS completo para gene de fibra de HAdV-6), AB125750 (CDS completo para gene de fibra de HAdV-1) , AB073168 (CDS completo para gene de fibra de HAdV-34); N0 de acesso no Genbank S75136 mostra uma seqüência para o gene de fibra de HAdV-8. A seqüência parcial de gene de fibra de HAdV-3 está depositada no Genbank sob o N0 de acesso AB244095, e a seqüência genômica completa de adenovírus humano, dada no N0 de acesso no Genbank DQ086466, que mostra a seqüência de fibra estando localizada nas posições 31368..32327, recebe o N° de acesso no Genbank ABB17809.1. A seqüência completa para HAdV-12 é mostrada em AC_000005 BK000405, na qual o CDS do gene de fibra está nas posições 29368 .. 31131, e recebe o N° de acesso no Genbank AP_000135.1. A seqüência completa de adenovírus humano 5 é mostrada no N0 de acesso no Genbank AC_000008, na qual o CDS da Fibra está em 31042 .. 32787, e recebe o N0 de acesso no Genbank AP_00 0 2 2 6.1. A seqüência completa de adenovírus humano 2 é mostrada no N0 de acesso no Genbank AC_000007 BK000407, na qual o CDS da fibra está em 31030..32778, e recebe o N0 de acesso no Genbank AP_000190.1. A seqüência do gene de HAdV- 9 para proteína da fibra cepa:130H é mostrada no N0 de acesso no Genbank AB098565. Outra seqüência do gene da fibra de HAdV-9 está localizada no N0 de acesso no Genbank X74659. O gene de fibra para HAdV-37 é mostrado no N° de acesso no Genbank X94484. O gene de fibra para HAdV-19 é mostrado no N° de acesso no Genbank X94485. O gene de fibra para HAdV-15 é mostrado no N0 de acesso no Genbank X72934 . O gene de fibra para a HAdV-7 (juntamente com a região E3) é mostrado no N° de acesso no Genbank Z48954. Uma seqüência para o gene da fibra de HAdV-4 é mostrada no N0 de acesso no Genbank X76547. Uma seqüência para o gene de fibra de HAdV-31 é mostrada no N° de acesso no Genbank X76548. Uma seqüência para o gene de fibra de HAdV-8 é mostrada no N0 de acesso no Genbank X74660. Uma seqüência para o gene de fibra de HAdV-3 é mostrada no N0 de acesso no Genbank X01998 M12411. Uma seqüência para gene de fibra de HAdV-21 é mostrada no N° de acesso no Genbank AY380332. Uma seqüência para o gene de fibra de é HAdV-7 mostrada no Nc de acesso no Genbank AY380326. O genoma completo do adenovírus símio 1 é mostrado no
N0 de acesso no Genbank NC_006879, no qual a fibra está localizada nas posições 28731..29822, e recebe o N0 de acesso no Genbank YP_213988.1 com uma variante da fibra 2 no N0 de acesso no Genbank YP_213989.1. A seqüência completa do adenovírus símio A é fornecida no N0 de acesso no Genbank NC_006144, a fibra estando localizada em 29606..31246 e recebe o N0 de acesso no Genbank YP_067930. A seqüência genômica completa para o adenovírus símio 25 é mostrada no N° de acesso no Genbank AF394196, na qual o CDS da fibra é 32137..33414 e recebe o N0 de acesso no Genbank AAL3 5 5 3 6.1.
Reddy e cols. (1998) (Journal of Virology 72: 1.3 94) revelam seqüências de nucleotídeos para BAdV-3. Naquela seqüência, as regiões penton de BAdV-3 começam em 12919 e terminam em 14367; a região héxon começa em 17809 e termina em 20517; a região da fibra de BAdV-3 começa em 27968 e termina em 30898. A seqüência de fibra e a seqüência gênica de pVIII do adenovírus bovino tipo 3, da região inicial 3 e da proteína da fibra foram depositadas no GenBank sob o N° de acesso D16839. 0 genoma completo do adenovírus bovino D é fornecido em NC_002685, em que o gene de fibra é anotado como estando localizado entre 22343..23950, e o gene de fibra é apresentado no N° de acesso no Genbank NP__077404 . 1. Da mesma forma, o genoma completo para o adenovírus bovino A é fornecido no N0 de acesso no Genbank NC_006324, em que a fibra está localizada nas posições 27483..29294 e revelada no N0 de acesso no Genbank YP_094049.1. O genoma completo do adenovírus bovino 4 cepa THT/62 é mostrado no N0 de acesso no Genbank AF036092, com o gene de fibra estando localizado nas posições 22343..23950, e recebe o N0 de acesso no Genbank AAK13185.1. A seqüência completa de BAdV-3 é mostrada no N0 de acesso no Genbank AC_000002 BKO0 0401, em que o CDS da fibra está em 27968 .. 30898, e recebe o N0 de acesso no Genbank AP_000041.1. As seqüências da fibra de BAdV-2 e da proteína de 17 K são mostradas em AF308811.
A seqüência genômica completa para CAdV-I é fornecida no N0 de acesso no Genbank AC_000003 BK000402, em que o CDS da fibra está anotado como estando nas posições 25887..27518, com a proteína e a seqüência codificadora relacionada estando depositadas no N0 de acesso no Genbank AP__0 0 0 0 6 9.1. A seqüência codificadora para CAdV-2 é mostrada no N° de acesso no Genbank AC_000020 BK000403, em que o CDS da fibra é anotado como estando nas posições 26592 .. 28220, com a proteína e a seqüência codificadora relacionada estando depositadas no N° de acesso no Genbank AP_0 0 0 6 3 2.1. O N0 de acesso no Genbank Z37498 mostra uma seqüência gênica da fibra de CAdV-2.
A seqüência genômica completa para OAdV-7 é fornecida no N0 de acesso no Genbank NC_004037, em que o CDS da fibra é anotado como estando nas posições 22273..23904, com a proteína e a seqüência codificadora relacionada estando depositadas no N0 de acesso no Genbank NP_659529.1.
A seqüência de fibra do adenovírus felino foi depositada no GenBank sob o N0 de acesso AY518270.
O genoma completo do adenovírus murídeo A é mostrado no N0 de acesso no Genbank NC_000942, em que o CDS do gene da fibra está localizado em 25412.. 27253 e recebe o N0 de acesso no Genbank NP_015554 .1. O N0 de acesso no Genbank AC_000013 BK001451 mostra o
genoma completo de adenovírus de ave 9, em que o CDS da fibra é anotado como estando nas posições 30161..31876, com a proteína e a seqüência codificadora relacionada estando depositadas em AP_000390.1. A seqüência da fibra de FAdV-IO é mostrada no N° de acesso no Genbank AF007579. O genoma completo do adenovírus de aves D é mostrado no Nu de acesso no Genbank NC_000899, em que o CDS do gene da fibra está localizado em 30161..31876, e recebe o N0 de acesso no Genbank NP_050293.1. O genoma completo do adenovírus de aves A é mostrado no N0 de acesso no Genbank NC__001720, em que o CDS do gene de fibra está localizado em 28363..30495 e recebe o N0 de acesso no Genbank NP_043891.1. O genoma completo do adenovírus do peru 3 é mostrado em Genbank AC_000016 BKO01454, com a fibra destes estando anotada nas posições 22518..23882, e recebe o N" de acesso no Genbank AP_0 0 0 4 9 5.1.
A seqüência genômica adenoviral de sapo é fornecida no N0 de acesso no Genbank NC_002501, em que o CDS da fibra está localizado nas posições 22343.-23632, que recebe o N0 de acesso no Genbank NP 062452.1. Em modalidades exemplares específicas, a presente invenção usa a seqüência de fibra de PAdV-4. A seqüência de nucleotídeos de uma nova seqüência codificadora de fibra de PAdV - 4 é dada no ID. DE SEQ. N°: 1. A seqüência de nucleotídeos de uma nova seqüência codificadora da fibra de PAdV-I é mostrada no ID. DE SEQ. N0 :2. A seqüência de nucleotídeos de uma nova seqüência codificadora da fibra de PAdV-2 é mostrada no ID. DE SEQ. N°: 3.
Como é facilmente evidenciado pela descrição acima, aqueles habilitados na técnica têm ciência de várias seqüências codificadoras para genes de fibra de vários tipos de adenovírus. Deve-se entender que a invenção aqui apresentada não se limita ao uso de qualquer uma dessas seqüências de fibra. Na verdade, os métodos e as composições da invenção podem ser praticados com o uso de qualquer uma das fibras mencionadas acima, quaisquer variantes dessas fibras, além de fibras identificadas a partir de várias outras cepas de adenovírus. Aqueles habilitados na técnica serão facilmente capazes de identificar essas fibras adicionais por meio do conhecimento da organização genômica dos adenovírus e por meio do conhecimento das seqüências exemplificadas discutidas acima. A esse respeito, deve-se observar que, na Publicação de Patente U.S. Nti 20020034519 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) , as figuras 12-17 desta são de particular interesse, já que mostram a seqüência de várias proteínas da fibra, incluindo a proteína da fibra de HAdV- 5 (figura 12), BAdV-3 (figura 13); proteína da fibra do Adenovírus ovino 287 (figura 14); proteína da fibra de 3 0 PAdV-3 (figura 15) ; proteína da fibra de CAdV-2 (figura 16) ; e figuras 17A-17G, que revelam um alinhamento de aminoácidos de regiões de fibra de adenovírus mamífero com o uso do método "clustal" do programa de muitialinhamentos.
Na presente invenção, em modalidades exemplares, um vetor adenoviral recombinante que foi preparado por meio de métodos convencionais usados para a preparação de vetores adenovirais recombinantes é propagado em uma linhagem celular que é uma linhagem celular recombinante que expressa um gene de fibra que é diferente do gene de fibra que está presente no adenovírus recombinante. Deve-se entender que, embora o adenovírus recombinante contenha preferivelmente o gene de fibra que está associado àquele sorotipo (por exemplo, caso o adenovírus recombinante seja um adenovírus recombinante baseado em PAdV-3, o gene de fibra naquele adenovírus recombinante será o gene de fibra de PAdV-3 nativo) , também será possível utilizar a presente invenção para alterar o tropismo de adenovírus recombinantes nos quais o gene de fibra nativo foi modificado (por exemplo, substituído por uma fibra de outro adenovírus, ou mutado para ser diferente do gene de fibra nativo do tipo selvagem).
Como aqui usado, o termo "propagar" é usado de forma intercambiável com "replicar" e refere-se à habilidade do vetor adenoviral para se reproduzir ou proliferar. Esses termos são bem compreendidos na técnica. Como aqui usado, replicação envolve a produção de proteínas adenovirais, e geralmente se dirige à reprodução do vetor adenoviral. A replicação pode ser medida com o uso de ensaios padronizados na técnica e aqui descritos como, por exemplo, um ensaio burst ou um ensaio em placa. "Replicação" e "propagagao" incluem qualquer atividade envolvida direta ou indiretamente no processo de fabricagao viral, incluindo, sem limitagao, expressao do gene viral; produgao de proteinas, acidos nucleicos ou outros componentes virais,· a embalagem de componentes virais em virus completos; e a Iise de celulas.
Em modalidades exemplares, parte ou toda uma seqiiencia de polinucleotideos que codifica a proteina da segunda fibra e expiressa em uma celula hospedeira recombinante na qual ο vetor adenoviral deve ser propagado. A propagagao do vetor adenoviral recombinante naquela celula hospedeira altera ο tropismo do adenovirus. Em uma modalidade especifica aqui revelada, sao preparadas celulas recombinantes que expressam ο gene de fibra de PAdV-4. Em modalidades exemplares, foram geradas linhagens celulares que expressam de forma estavel ο gene de fibra de PAdV-4. A f ibra de PAdV-3 facilita a adesao viral as celulas no intestino de porcos, enquanto a fibra do s〇r〇tip〇 PAdV-4 permite a adesao as celulas do trato respirat0:ri〇 suino. Um vetor de adenovirus recombinante existente suino que expressa 〇 gene de gp5 5 de CSFV [Hammond e cols. , 2000] poderia ereseer nessas linhagens celulares com ο virus progenitor resuitante contendo tanto a fibra de PAdV-3 nativa quanto a proteina da fibra de PAdV-4 adicional. A presenga de duas proteinas de fibra diferentes no capsideo viral ampliaria ο tropismo celular do vetor. Dessa forma, isso permitiria que ο vetor tivesse como alvo uma variedade maior de tipos de celulas dentro do animal e exporia ο gene estranho liberado a uma variedade maior de respostas
3 O imun〇10gicas do hospedeiro. Alem disso, vetores de PAdV projetados para ter 〇 gene de fibra eliminado para gerar mais espago para a insergao de genes estranhos poderiam ser complementados por sua passagem atraves dessas linhagens de celulas que expressam a proteina da fibra. Essa abordagem permitiria a produgao de virus com fibra positiva com capacidade de brotamento de DNA adicional.
Espera-se que ο crescimento de PAdVs recombinantes atraves dessas linhagens celulares aumente a eficacia dos vetores ao ampliar sua gama de celulas hospedeiras-alvo e aumente a quantidade de material de gene estranho que possa ser nelas inserido, permitindo, dessa forma, a incorporagao e subseqiiente liberagao de varios antigenos, ou antigenos mais imun〇m〇dulad〇res como, por exemplo, citociraas, em um vetor.
Uma 、、celula hospedeira" e uma celula que f 〇i
transformada, ou que e capaz de transformagao, por uma sequencia de DNA exogeno. Na presente invengao, as celulas hospedeiras sao aquelas que podem apoiar a replicagao de um vetor adenoviral (ou se j a, pode se tornar inf ectada pelo adenovirus e permitir que ο adenovirus nela se replique) e que f〇i transfortnado por uma sequencia de DNA exogeno que c〇difica toda ou parte de uma proteina da fibra. A "transformagao" de uma celula engloba a intirodugao de DNA exogeno na celula. Embora se entenda que ο DNA exogeno possa ou nao ser integrado (ligado de forma covalente) ao DNA cr〇m〇ss6mic〇 que constitui ο genoma da celula, na presente invengao, as celulas sao transformadas de forma estavel com ο polinucleotideo que codifica a fibra. Uma celula transformada de forma estavel e aquela na qual ο DNA
3O exogeno se tornou integrado no cromossomo de modo que ele e herdado por celulas-filhas por meio de replicagao do cromossomo. Para celulas mamiferas, essa estabilidade e demonstrada pela habilidade da celula para estabelecer linhagens celulares ou clones compostos por uma populagao de celulas-filhas que contem ο DNA exogeno.
Em modalidades exemplares, a presente inven?ao fornece exemplos de celulas suinas transformadas de forma estavel que foram transformadas de forma estavel com DNA exogeno que codifica a fibra do PAdV-4. Mais particularmente, duas linhagens ceIulares exemplares continuas (estaveis), celulas suinas de rim de porco 15 (PKlB) e de testiculo (ST) foram proj etadas para conter e expressar 〇 gene de fibra de PAdV- 4. Essas linhagens celulares foram denominadas PK-743 e ST-743, respectivamente. A expressao do gene da f ibra f 〇i comprovada por demons tragao da presenga de mRNA de fibra do PAdV-4 em ambas as linhagens celulares. A analise por Western blot com 〇 uso de anticorpo policlonal de coelho desenvolvido contra um peptideo comum a ambas as fibras ou contra um peptideo especifico para a fibra do PAdV-4 demonstrou claramente a presenga de ambas as fibras no virus modificado. As linhagens celulares foram usadas em estudos de infecgSo nos quais celulas PK15A (controle nao m〇dificad〇) e PK—743 (modificadas) foram infectadas com 〇 PAdV recombinante- 3 - gp5 5 e a prole viral f〇i colhida quando as celulas apresentavam 80% de efeito citopatico.
A prole viral pode ser analisada com ο uso de tecnicas padronizadas conhecidas por aqueIes habilitad〇s na tecnica· Por exemplo, a analise por Western blot do teor de proteina
3O da prole viral demonstrou a presenga de ambas as proteinas dS fibra' de PAdV_3 e pAdV-4, no virion. Uma banda do peso molecular esperado para a fibra de PAdV-3 (45 kD) estava
PreSente em ambas as Preparagoes de virus, enquanto uma banda do peso molecular esperado da fibra do PAdV-4 (77 kD)
f0i deteCtada especificamente na preparagao de virus modificado.
Embora a presente inven?ao forne?a celulas hospedeiras
SUlnaS SXemplares' out^s celulas hospedeiras adequadas p〇dem facilmente ser preparadas, e incluirao qualquer cglula que apoie a recombinagao entre um genoma adenoviral e a fibra adenoviral na celula hospedeira. As celulas hospedeiras sao transfectadas com um plasmideo que contem ο gen°ma adenoviral recombinante, para a geragao de particulas virais naquelas celulas hospedeiras. 〇 crescimento de celulas eucanotxcas e de Ixnhagens de
Cglulas mamiferas sSo procedimentos bem conheddos por aqueles habilitados na t^cnica.
C〇mo observado acima, a preparagao do vetor adenoviral recombinante empregara tecnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na tecnica. Com a utiliza?ao dessas tecnicas, uma ou mais sequencias heterologas de polinucleotideos sao inseridas em uma ou mais regioes do genoma adenoviral para a geragao de um vetor adenoviral recombinante. A preparagao deSSeS vetores 30 έ limitada pela capacidade de insergao do genoma adenoviral especifico, e pela habilidade do vetor adenoviral recombinante para expressar as sequencias heterologas inseridas. Em geral, genomas adenovirals podem aceitar inser?5es que aumentam ο tamanho do adenovirus recombinante ate ser aproximadamente 105% do comprimento do genoma do tipo selvagem, e permanecem capazes de serem compactados em particulas virais. A capacidade de insergao pode ser aumentada por eliminagao de regimes nao essenciais e/ou eliminagao de regides essenciais como, por exemplo, a fungao de El, cuja fungao pode entao ser fornecida por uma linhagem celular auxiliar, por exemplo, uma que fornega a fungao de El. Em algumas modalidades, um p〇linucle〇tide〇 heterologo que codifica uma proteina e inserido em uma regiao do gene de E3 do adenovirus. Em outras modalidades, as porgoes nao essenciais da regiao E3 sao eliminadas, e ο polinucleotideo heterologo que codifica uma proteina e inserido naquela lacuna deixada pela eliminagao. Em algumas modalidades preferidas, quando ο vetor adenoviral ire comb inante for um vetor adenoviral baseado em PAdV-3, ο gene heterologo podera ser inserido na regiao do genoma de PAdV-3 localizada apos ο sinal de poliadenilagao para E3 de PAdV-3 e antes do inicio d〇 ORF para 〇 gene de fibra de PAdV-3.
Em algumas modalidades, e criado um adenovirus no qual a insergao ou a eliminagao, seguida pela insergao, ocorre na regiao do gene de El do adenovirus ; ο vetor e entao propagado em uma linhagem celular auxiliar que fornece a fungao de El. Outras regides nas quais ο gene heterologo pode ser inserido incluem a regiao E4 . Quando 〇 vetor adenoviral recombinante for um vetor baseado em PAdV-3, toda a regiao E4, exceto aquela regiao que codifica 0RF3 , podera ser eliminada para abrir espago para ο gene heterologo. Com mostrado em Li e cols, (Virus Research 104 (2004) 181-190), a regiao E4 de PAdV-3 localizada na extremidade direita do genoma e transcrita na diregao a
esquerda, e possui ο potencial para codificar sete (pi—ρ7) ORFs. Destes, apenas ORF p3 e essencial para a replicagao. Dessa forma, a maior parte, se nao toda a regiao E4, pode ser rapidamente eliminada, sem tornar a replicagao do virus defeituosa, ο que gera, dessa forma, mais espago para insergSes heterologas.
Em uma modalidade da invengao, a inserqao pode ser obtida por construgao de um plasmideo contendo a regiao do genoma adenoviral na qual a insergao e desej ada, por exemplo, um polinucleotideo que codifica uma proteina terapeutica desej ada.〇 plasmideo e entao digerido com uma enzima de restrigao que possui uma sequencia de reconhecimento naquela porgao adenoviral do plasmideo, e uma seqiiencia de p〇linucle〇tideos heterologa e inserida no local da digestao por restrigao.〇 plasmideo, que contem uma porgao do genoma adenoviral com uma sequencia heterologa 士nserida, e co- trans formado, juntamente com um genoma adenoviral ou um plasmideo linearizado contendo ο genoma adenoviral em uma celula bacteriana (como, por exemplo, E. coli) . A recombinagao homologa entre os plasmideos gera um genoma adenoviral recombinante que contem seqiiencias heterologas inseridas. Nessas m〇dalidades, ο genoma adenoviral pode ser um genoma de comprimento total ou pode conter uma ou mais eliminagSes, como aqui discutidas, A eliminagao de seqiiencias adenovirais, por exemplo,
para f ornecer um si tio para a insergao de seqiiencias heterologas ou para fornecer capacidade adicional para a inse:rga〇 em um sitio dif erente, pode ser obtida por metodos bem conhecidos por aqueles habilitados na tecnica. Por
exemplo, para seqiiencias adenovirals clonadas em um plasmideo, a digestao com uma ou mais enzimas de restriqSo (com pelo menos uma seqiiencia de reconhecimento na insergao adenoviral) , seguida por ligagao, ira, em alguns casos, resultar na eliminagao de sequencias entre os sitios de reconhecimento de enzima de restrigao. Alternativamente, a digestao em um iinico sitio de reconhecimento de enzima de restrigao dentro da insergao adenoviral, seguida por tratamento com exonuclease, seguida por ligagao, resultara na eliminagao de sequencias adenovirais adjacentes ao sitio de restrigao. Um plasmideo que contem uma ou mais porgoes do genoma adenoviral com uma ou mais eliminagoes, construido como descrito acima, pode ser co-transfeetado em uma ceIula bacteriana, juntamente com um genoma adenoviral (de comprimento total ou eliminado) , ou um plasmideo que contem um genoma de comprimento total ou um genoma eliminado para gerar, por recombinagao homologa, um plasmideo que contem um genoma recombinante com uma elimina_ga〇 em um ou ma_is si tios especi f ic〇s · Podem entao ser obtidos virions adenovirais que contem a eliminagao por transfecgao de celulas mamiferas incluindo, sem limitagSo, as celulas transformadas de forma estavel que contem ο gene de fibra adicional aqui descrito, com ο plasmideo que contem 〇 genoma adenoviral recombinante.
Os sitios de insergao podem ser adjacentes e abaixo da transcriga〇 de promotores endogenos no adenovirus. Um promoter, intensificador ou regiao de controle "endogena" e nativo ou derivado de adenovirus. SequSncias de reconhecimento de enzima de restrigao abaixo de certos promotores podem ser usadas como sitios de insergao, e podem ser facilmente determinadas por aqueles habilitados na técnica a partir do conhecimento de parte ou de toda a seqüência do genoma adenoviral no qual inserção é desejada. Alternativamente, estão disponíveis várias técnicas in vitro para permitir a inserção de uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição em um sítio em particular, ou para a inserção de seqüências heterólogas em um sítio que não contém uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição. Esses métodos incluem, sem limitação, formação de heteroduplex mediada por oligonucleotídeo para a inserção de uma ou mais seqüências de reconhecimento de enzima de restrição (veja, por exemplo, Zoller e cols. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6.487-6.500; Brennan e cols. (1990) Roux's Arch. Dev. Biol. 199: 89-96; e Kunkel e cols. (1987) Meth. Enzymology 154: 367-382) e métodos mediados por PCR para a inserção de seqüências mais longas. Veja, por exemplo, Zheng e cols. (1994) Virus Research 31: 163- 186 .
A expressão de uma seqüência heteróloga inserida em um sítio que está abaixo de um promotor endógeno também pode ser obtida, fornecendo-se, com a seqüência heteróloga, seqüências reguladoras da transcrição que são ativas em células eucarióticas. Essas seqüências reguladoras da transcrição podem incluir promotores celulares como, por exemplo, os promotores virais como, por exemplo, promotores de herpesvírus, adenovírus e papovavírus, e cópias de DNA de seqüências retrovirais da repetição terminal longa (LTR) . Nessas modalidades, o gene heterólogo é introduzido em uma construção de expressão na qual o gene heterólogo é ligado operacionalmente a esses elementos reguladores da transcrição. Em modalidades exemplares específicas, o gene de fibra de PAdV-4 foi colocado sob o controle do promotor de CMV a fim de fornecer forte transcrição constitutiva. É desejável que a produção de fibra continue durante o brotamento viral que ocorre durante a fase tardia da infecção viral. Foi demonstrado que adenovírus humanos desativam a síntese protéica da célula hospedeira por inativação de um fator de iniciação da tradução da célula hospedeira (Zhang e cols., 1994) . Esperava-se, portanto, que a tradução eficiente de mensagens virais tardias mantivesse a inclusão da seqüência do TPL de PAdV-3. O TPL é composto por três éxons que totalizam 248 nucleotídeos (nt) que são unidos à extremidade 5' de mRNAs virais tardios (Reddy e cols., 1998). Acredita-se que a seqüência funcione fornecendo uma estrutura menos ordenada na extremidade 5' do mRNA, conferindo independência do complexo de iniciação da célula hospedeira (Dolph e cols., 1988; Dolph e cols., 1990). A fim de assegurar a tradução continuada do mRNA recombinante da fibra, o gene de fibra de PAdV-4 foi colocado abaixo da seqüência de TPL de PAdV-3 em pCI-TPL. Foi relatado que a adição do TPL de HAdV 5 às construções que expressam luciferase aumenta os níveis de expressão, mesmo em células não infectadas (Sheay e cols., 1993).
Seqüências reguladoras que podem ser usadas para regular a expressão de genes heterólogos podem ser, por exemplo, uma seqüência reguladora da transcrição, um promotor, um intensificador, um domínio regulador acima, um sinal de splicing, um sinal de poliadenilação, uma seqüência de terminação da transcrição, uma seqüência reguladora da tradução, um sítio de ligação de ribossomo e uma seqüência de terminação da tradução.
Deve-se entender que a preparação dos vetores adenovirais recombinantes inclui a propagação do genoma adenoviral clonado como um plasmideo e o resgate do vírus infeccioso das células que contêm plasmideo.
A presença de ácidos nucléicos virais pode ser detectada por tecnologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica, incluindo, sem limitação, ensaios de hibridização, reação em cadeia de polimerase e outros tipos de reações de amplificação. Da mesma forma, métodos para a detecção de proteínas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e incluem, sem limitação, vários tipos de imunoensaio, ELISA, Western blotting, ensaio enzimático, imunoistoquímica etc. Kits diagnósticos que compreendem as seqüências de nucleotídeos da invenção também podem conter reagentes para ruptura das células e purificação de ácido nucléico, além de tampões e solventes para a formação, seleção e detecção de híbridos. Os kits diagnósticos que compreendem os polipeptídeos ou as seqüências de aminoácidos da invenção também podem compreender reagentes para isolamento de proteínas e para a formação, isolamento, purificação e/ou detecção de complexos imunes.
A presente invenção fornece a modificação de vetores adenovirais recombinantes para alterar seu tropismo. Aqueles vetores preferivelmente são usados para liberar vários genes estranhos ou seqüências de nucleotídeos ou seqüências codificadoras (procarióticas e eucarióticas) a uma célula-alvo. Esses vetores são particularmente úteis 3 0 como vacinas para fornecer proteção contra uma ampla gama de doenças, e muitos desses genes já são conhecidos na técnica. As vacinas virais incluem, sem limitação, vacinas de DNA (ou seja, que usam plasmideos, vetores ou outros veículos convencionais para injetar diretamente DNA em porcos), vacinas vivas, vacinas vivas modificadas, vacinas inativadas, vacinas de subunidade, vacinas atenuadas, vacinas geneticamente projetadas etc.
A seqüência de nucleotídeos exógena (ou seja, estranha) que é incorporada no adenovirus pode consistir em um ou mais genes de interesse ou em outras seqüências de nucleotídeos que não são genes, mas que possuem outras funções e, preferivelmente, de interesse terapêutico. No contexto da presente invenção, uma seqüência de nucleotídeos ou gene de interesse pode codificar um RNA anti-senso, RNA de hairpin curto, uma ribozima ou um mRNA que então será traduzido em uma proteína de interesse. Uma seqüência de nucleotídeos ou gene desse tipo pode compreender DNA genômico, DNA complementar (cDNA) ou do tipo misto (minigene, em que pelo menos um íntron é eliminado) . A seqüência de nucleotídeos ou gene pode codificar uma função reguladora ou terapêutica, uma proteína madura, um precursor de uma proteína madura, em particular um precursor que compreende um peptídeo sinalizador, uma proteína quimérica que se origina da fusão de seqüências de origens diversas, ou um mutante de uma proteína natural que exibe propriedades biológicas aprimoradas ou modificadas. Um mutante desse tipo pode ser obtido por eliminação, substituição e/ou adição de um ou mais nucleotídeos do gene que codifica a proteína natural, ou qualquer outro tipo de alteração na seqüência que codifica a proteína natural como, por exemplo, transposição ou inversão.
O gene que está sendo liberado pelo vetor pode ser colocado sob o controle de elementos (seqüências de controle de DNA) adequados à sua expressão em uma célula hospedeira. Seqüências de controle de DNA adequadas significam o conjunto de elementos necessários para a transcrição de um gene em RNA (RNA anti-senso ou mRNA) e para a tradução de um mRNA em proteína. Por exemplo, esses elementos incluiriam pelo menos um promotor. 0 promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor regulável, e pode ser isolado de qualquer gene de origem eucariótica, procariótica ou viral, e até mesmo de origem adenoviral. Alternativamente, ele pode ser o promotor natural do gene de interesse. Em termos gerais, um promotor usado na presente invenção pode ser modificado de modo a conter seqüências reguladoras. Promotores exemplares podem incluir promotores tecido-específicos quando o gene tiver como alvo certo tipo de tecido. Outros promotores convencionais que podem ser usados incluem, sem limitação, o promotor do gene de TK de HSV-I (timidina quinase do herpesvírus tipo 1) , MLP adenoviral (promotor principal tardio), o LTR (repetição terminal longa) de RSV (vírus do sarcoma de Rous), o promotor inicial imediato de CMV, promotor inicial imediato de SV-40 e o promotor do gene de PGK (fosfoglicerato quinase), por exemplo, que permitem a expressão em um grande número de tipos de células.
Os genes a serem liberados pelos vetores adenovirais podem ser quaisquer genes, incluindo, sem limitação, genes que codificam citocinas como, por exemplo, interferons e interleucinas; genes que codificam linfocinas; genes que codificara receptores da membrana como, por exemplo, os receptores reconhecidos por organismos patogênicos (vírus, bactérias ou parasitas) , preferivelmente pelo vírus do HIV (vírus da imunodeficiência humana); genes que codificam fatores da coagulação como, por exemplo, fator VIII e fator IX; genes que codificam distrofinas; genes que codificam epitopos antigênicos a fim de aumentar a imunidade da célula hospedeira; genes que codificara proteínas do complexo de histocompatibilidade principal das classes I e II, além dos genes que codificara as proteínas que são indutoras desses genes; genes que codificam anticorpos; genes que codificam imunotoxinas; genes que codificam toxinas; genes que codificam fatores do crescimento ou hormônios do crescimento; genes que codificam receptores celulares e seus ligantes; genes que codificam supressores tumorais; genes envolvidos em doenças cardiovasculares incluindo, sem limitação, oncogenes; genes que codificam fatores do crescimento incluindo, sem limitação, fator do crescimento de fibroblastos (FGF), fator do crescimento vascular endotelial (VEGF) e fator do crescimento de nervos (NGF) ; e-nos, genes supressores de tumor incluindo, sem limitação, o gene Rb (retinoblastoma); lipoproteína lipase; superóxido disrautase (SOD); catalase; removedores de oxigênio e radical livres; apolipoproteínas; e PAI-I (inibidor do ativador de plasminogênio-1); genes que codificam enzimas celulares ou aquelas produzidas por organismos patogênicos; e genes suicidas.
Em certas modalidades preferidas, as vacinas da 3 0 presente invenção são preparadas para a vacinação de suínos contra doenças que ocorrem nesses animais. Por exemplo, as vacinas podem ser dirigidas para a gp50 do vírus da pseudo- raiva (PRV); gene S do vírus da gastrenterite transmissível (TGEV); genes VP7 e VP8 do rotavírus suíno; genes do vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRS), em particular ORFs 3, 5 e 7; genes do vírus da diarréia epidêmica suína; genes do vírus da cólera de leitões; genes do parvovírus suíno; e genes do vírus da febre aftosa; genes associados ao circovírus suíno; e genes do vírus influenza suíno. Antígenos de patógenos bovinos representativos incluem vírus do herpes bovino do tipo 1; vírus da diarréia bovina; coronavírus bovino; e genes do vírus da febre aftosa. Antígenos de patógenos humanos representativos incluem, sem limitação, antígenos do vírus do HIV e antígenos do vírus da hepatite.
Citocinas e fatores do crescimento como, por exemplo, fator do crescimento vascular endotelial (VEGF), fator do crescimento epidérmico, fator do crescimento de fibroblastos, pleiotrofina, fator do crescimento derivado de plaquetas, eritropoietina, fator de células - tronco (SCF) , TNF-α; um interferon, por exemplo, interferon-y, interf eronf}, interferon-α, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); fator derivado de células estromais-1, fator estimulador de colônias de macrófagos, RANTES, IGF-I, SDF-1, MIPla, MCP-I e MCP-2, eotaxina, eotaxina-3, eotaxina-4, LKNl, MPIF-2 e LD78-beta, fator inibidor de leucemia (LIF), interleucinas como, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, receptores e ligantes TOLL-Iike, receptores integrina, e semelhantes, também podem ser liberados com a utilização dos vetores da presente invenção.
Deve-se entender que, embora em alguns casos possa ser
desejável incorporar todo o gene no vetor, podem ser construídos outros vetores que compreendem apenas uma porção das seqüências de nucleotídeos de genes que podem ser usadas (quando essas forem suficientes para gerar uma resposta imunológica protetora ou um efeito biológico específico), em vez da seqüência completa encontrada no organismo do tipo selvagem. Quando os genes contiverem um grande número de íntrons, poderá ser preferido um cDNA.
Como observado acima, o gene pode ser inserido sob o controle de um promotor adequado. Além disso, o vetor também pode compreender elementos intensificadores e seqüências de poliadenilação. Promotores e seqüências de poliadenilação que permitam a expressão bem sucedida de genes estranhos em células mamíferas e a construção de cassetes de expressão são conhecidos na técnica, por exemplo, na Patente U.S. N0 5.151.267, cujas revelações são aqui incorporadas por referência.
O termo "cassete de expressão" refere-se a uma molécula de ácido nucléico natural ou produzida de forma recombinante que é capaz de expressar um gene ou uma seqüência genética em uma célula. Um cassete de expressão tipicamente inclui um promotor (que permite a iniciação da transcrição) e uma seqüência que codifica uma ou mais proteínas ou RNAs. Opcionalmente, o cassete de expressão pode incluir intensificadores da transcrição, seqüências não codificadoras, sinais de splicing, sinais de terminação da transcrição e sinais de poliadenilação. Um cassete de expressão de RNA tipicamente inclui um códon da iniciação da tradução (que permite a iniciação da tradução) e uma seqüência que codifica uma ou mais proteínas. Opcionalmente, o cassete de expressão pode incluir sinais de terminação da tradução, uma seqüência de poliadenosina, sítios internos de entrada de ribossomo (IRES) e seqüências não codificadoras. Opcionalmente, o cassete de expressão pode incluir um gene ou uma seqüência gênica parcial que não é traduzida em uma proteína. O ácido nucléico pode efetuar uma alteração no DNA ou seqüência de RNA da célula- alvo. Isso pode ser obtido por hibridização, formação de ácido nucléico multifitas, recombinação homóloga, conversão gênica, interferência de RNA ou outros mecanismos que ainda serão descritos. Os vetores adenovirais podem compreender mais de um gene estranho. Os métodos da invenção podem ser usados para fornecer proteção contra uma ampla variedade de doenças que afetam porcos, seres humanos, gado e outros mamíferos. Qualquer um dos determinantes antigênicos recombinantes ou vírus vivos recombinantes da invenção pode ser formulado e usado basicamente da mesma forma como descrito para vacinas de determinante antigênico ou vetores de vacina viva.
Embora modalidades exemplares da presente invenção
caracterizem-se pelo fato de que o nucleotídeo heterólogo (também aqui denominado ácido nucléico heterólogo) seja aquele que codifica uma proteína, deve-se entender que o nucleotídeo heterólogo pode, na verdade, ser qualquer 3 0 polinucleotídeo que contenha uma seqüência cuja presença ou transcrição em uma célula é desejada. Dessa forma, os vetores podem ser usados para liberar qualquer polinucleotideo que, por exemplo, cause degradação ou inibição seqüência-especifica da função, transcrição ou tradução de um gene. Esses nucleotideos heterólogos podem ser selecionados do grupo que compreende: siRNA, microRNA, RNA interveniente ou RNAi, dsRNA, ribozimas,
polinucleotideos anti-senso e cassetes de expressão de DNA que codificam siRNA, microRNA, dsRNA, ribozimas ou ácidos nucléicos anti-senso. SiRNA compreende uma estrutura de fita dupla tipicamente que contém 15-50 pares de bases e, preferivelmente, 19-25 pares de bases, e que possui uma seqüência de nucleotideos idêntica ou quase idêntica a um gene ou RNA-alvo expresso dentro da célula. Um siRNA pode ser composto por dois polinucleotideos anelados ou um único polinucleotideo que forma uma estrutura de hairpin. MicroRNAs (mRNAs) são pequenos polinucleotideos não codificadores, cerca de 22 nucleotideos de comprimento, que dirige a destruição ou repressão da tradução de seus alvos de mRNA. Polinucleotideos anti-senso compreendem uma seqüência que é complementar a um gene ou mRNA. Polinucleotideos anti-senso incluem, sem limitação: morfolinos, 2'-0-metil polinucleotideos, DNA, RNA, e semelhantes. Essas seqüências de nucleotideos heterólogas podem ser polimerizadas in vitro, ser recombinantes, conter seqüências quiméricas, ou podem ser derivados desses grupos. Essas seqüências podem conter ribonucleotideos, desoxirribonucleotideos, nucleotideos sintéticos ou qualquer combinação adequada, de forma que um RNA-alvo e/ou 3 0 um gene seja inibido. Em modalidades exemplares, rPAdV-gp55 modificado cresceu em células PK15-743, ou rPAdV-gp55 cresceu em células PK15A não modificadas. Ele foi então administrado a suínos da raça "Large White" disponíveis comercialmente por via subcutânea ou oral. A vacina modificada protegeu completamente os porcos do ataque letal com CSFV, quando administrada como injeção subcutânea ou pela via oral. Além disso, a vacina modificada administrada pela via subcutânea gerou os maiores níveis de anticorpos de NPLA, maiores do que aqueles detectados no grupo da vacina não modificada. Um trabalho anterior demonstrou que, quando a vacina não modificada é administrada pela via oral, não pode ser detectado anticorpo de NPLA antes do ataque, até mesmo após uma dose de reforço [Hammond e cols., 2001; Hammond e cols., 2003]. No entanto, níveis muitos significativos de anticorpos de NPLA foram detectados no grupo oral após uma dose única da vacina modificada, e esses níveis foram reforçados pela administração de uma segunda dose. Isso é uma evidência de que a vacina modificada que contém ambas as proteínas da fibra de PAdV-3 e PAdV-4 está sendo dirigida a uma variedade mais ampla de tecidos no porco do que a vacina não modificada e, conseqüentemente, está gerando uma resposta imunológica mais extensa no hospedeiro.
São aqui contempladas especificamente composições
farmacêuticas que compreendem uma quantidade
terapeuticamente eficaz de um vetor de adenovírus recombinante, adenovírus recombinante ou proteína recombinante, preparados de acordo com os métodos da invenção, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante. Uma composição farmacêutica desse tipo pode ser preparada e as dosagens determinadas de acordo com metodologias que são bem conhecidas na técnica. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer via de administração conhecida, incluindo, sem limitação, por via sistêmica (por exemplo, intravenosa, intratraqueal, intravascular, intrapulmonar, intraperitoneal, intranasal, parenteral, entérica, intramuscular, subcutânea, intratumoral ou intracraniana), por administração oral, por aerossolização ou instilação intrapulmonar. A administração pode ocorrer em uma dose única ou em doses repetidas, uma ou mais vezes após certos intervalos de tempo. A via de administração e as dosagens apropriadas irão variar, de acordo com a situação (por exemplo, o indivíduo tratado, o distúrbio a ser tratado ou o gene ou polipeptídeo de interesse), mas podem ser determinadas por aqueles habilitados na técnica.
A invenção ainda fornece métodos de tratamento nos quais uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor adenoviral recombinante (por exemplo, um vetor adenoviral de PAdV-3) que possui tropismo alterado (quando comparado com o vetor recombinante que não foi propagado em uma linhagem celular que contém um gene de fibra) é administrada a um indivíduo mamífero que necessita de tratamento.
Os antígenos usados na presente invenção podem ser polipeptídeos ou fragmentos antigênicos nativos ou recombinantes. Eles podem ser seqüências parciais, seqüências de comprimento total ou até mesmo fusões (por exemplo, que possuam seqüências líderes apropriadas para o hospedeiro recombinante, ou com uma seqüência de antígeno adicional para outro patógeno). 0 polipeptídeo antigênico preferido a ser expresso pelos sistemas virais da presente invenção contém seqüências de comprimento total (ou quase de comprimento total) que codificam antígenos. Alternativamente, podem ser usadas seqüências mais curtas que sejam antigênicas (ou seja, que codificam um ou mais epitopos). A seqüência mais curta pode codificar um "epitopo neutralizante" , que é definido como um epitopo capaz de despertar anticorpos que neutralizam a inf ectividade do vírus em um ensaio in vitro. De preferência, o peptídeo deve codificar um "epitopo protetor" que é capaz de despertar no hospedeiro uma "resposta imunológica protetora", ou seja, uma resposta imunológica mediada por anticorpo e/ou mediada por células que protege um hospedeiro imunizado contra a infecção.
Os antígenos usados na presente invenção, particularmente quando compostos por oligopeptídeos curtos, podem ser conjugados a um veículo de vacina. Veículos de 2 0 vacina são bem conhecidos na técnica: por exemplo, albumina sérica bovina (BSA), albumina sérica humana (HSA) e hemocianina keyhole limpet (KLH).
Genes para os antígenos desejados, ou seqüências codificadoras destes, que podem ser inseridos, incluem aqueles de organismos que causam doença em mamíferos, particularmente patógenos bovinos como, por exemplo, vírus da febre aftosa, rotavírus bovino, coronavírus bovino, herpesvírus bovino tipo 1, vírus respiratório sincicial bovino, vírus parainfluenza bovino do tipo 3 (BPI-3), vírus da diarréia bovina, Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus e semelhantes. Genes que codificam antigenos de patógenos humanos também são úteis na prática da invenção. As vacinas da invenção que carregam genes ou fragmentos estranhos também podem ser administradas oralmente em um veículo oral adequado, por exemplo, em uma forma de dosagem com revestimento entérico. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregados, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose de sacarina sódica, carbonato de magnésio, e semelhantes. Composições de vacina oral podem ser administradas na forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós, contendo de cerca de 10% a cerca de 95% do ingrediente ativo, preferivelmente cerca de 25% a cerca de 70%. A vacinação oral e/ou intranasal pode ser preferível para o desenvolvimento de imunidade mucosa (que tem uma participação importante na proteção contra patógenos que infectam os tratos respiratório e gastrintestinal) em combinação com imunidade sistêmica. Além disso, a vacina pode ser formulada em um
supositório. Para supositórios, a composição da vacina incluirá aglutinantes e veículos tradicionais, por exemplo, glicóis polialcalinos ou triglicerídeos. Esses supositórios podem ser formados por misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10% (p/p), preferivelmente cerca de 1% a cerca de 2%.
Protocolos para a administração a animais das composições de vacina da presente invenção fazem parte dos conhecimentos da técnica à luz da presente especificação. Aqueles habilitados na técnica selecionarão uma concentração da composição de vacina em uma dose eficaz para despertar uma resposta imunológica mediada por anticorpos e/ou por células T ao fragmento antigênico ou qualquer tipo de efeito terapêutico ou profilático. Dentro de limites amplos, acredita-se que a dosagem não seja critica. Tipicamente, a composição de vacina é administrada de modo a liberar entre cerca de 1 a cerca de 1.000 microgramas do antígeno de subunidade em um volume conveniente de veiculo, por exemplo, cerca de 1-10 cc. De preferência, a dosagem em uma imunização única irá liberar de cerca de 1 a cerca de 500 microgramas de antigeno de subunidade, mais preferivelmente cerca de 5-10 a cerca de 100-200 microgramas (por exemplo, 5-200 microgramas).
O momento da administração também pode ser importante. Por exemplo, uma inoculação primária preferivelmente pode ser seguida por inoculações de reforço subseqüentes, se necessário. Também pode ser preferido, embora de forma opcional, administrar uma segunda imunização, de reforço, ao animal, várias semanas a vários meses após a imunização inicial. Para assegurar altos níveis sustentados de proteção contra doença, pode ser útil re-administrar uma imunização de reforço aos animais em intervalos regulares, por exemplo, uma vez a cada vários anos. Alternativamente, uma dose inicial pode ser administrada oralmente, seguida por inoculações posteriores, ou vice-versa. Podem ser estabelecidos protocolos de vacinação preferidos por meio de experimentos rotineiros de protocolos de vacinação.
A dosagem para todas as vias de administração da vacina de vírus recombinante in vivo depende de vários fatores, que incluem o tamanho do hospedeiro/paciente, natureza da infecção contra a qual a proteção é necessária, do veículo, e semelhantes, e pode ser facilmente determinada por aqueles habilitados na técnica. Como exemplo não limitante, pode ser usada uma dosagem entre IO3 PFU e IOlb PFU, preferivelmente entre IO4 e IO13 PFU, mais pref erivelmente entre IO5 a IO11 PFU e semelhantes. Como ocorre com vacinas de subunidade in vítro, podem ser administradas dosagens adicionais de acordo com os fatores clínicos envolvidos. Em algumas modalidades da invenção, são produzidas
linhagens celulares recombinantes por construção de um cassete de expressão que compreende uma região de fibra, por exemplo, a região de fibra de PADV-4, como mostrado nos exemplos, e a transformação de células hospedeiras com ele, para fornecer as células que contêm o gene de uma segunda fibra para os objetivos da presente invenção, para alterar o tropismo dos adenovírus recombinantes. Essas linhagens celulares recombinantes são capazes de permitir que uma segunda fibra seja inserida no vetor adenoviral. Essas linhagens celulares também são extremamente úteis na geração de vetores recombinantes que possuem uma eliminação do gene de fibra substituída por uma seqüência de nucleotídeos heteróloga que codifica um gene ou fragmento estranho, por recombinação in vivo após co-transfecção mediada por DNA. Além disso, as células hospedeiras também podem fornecer uma ou mais funções essenciais codificadas pelo genoma adenoviral, em que a linhagem celular fornece uma função ou funções que estejam ausentes em um vetor adenoviral recombinante defeituoso em particular. Dessa 3 0 forma, as linhagens celulares recombinantes que contêm a fibra também podem ser linhagens celulares complementares que podem fornecer funções virais por meio, por exemplo, de co-infecção com um virus auxiliar, ou por integração ou por manutenção em forma estável de um fragmento de um genoma viral que codifica uma função viral em particular.
As linhagens celulares recombinantes de mamíferos, particularmente suínas, da invenção também poderiam ser usadas para a produção recombinante de proteínas.
A invenção também inclui um método para o fornecimento de liberação de gene a um mamífero, por exemplo, um suíno, bovino, humano, ovino, canino, felino ou outro mamífero que dele necessite, para controlar uma deficiência gênica, para fornecer um gene ou seqüência de nucleotídeos terapêutica e/ou para induzir ou corrigir uma mutação gênica. O método pode ser usado, por exemplo, no tratamento de condições que incluem, sem limitação, doença hereditária, doença infecciosa, doença cardiovascular e infecção viral. Esses tipos de técnicas estão sendo usados atualmente por aqueles habilitados na técnica para tratamento de diversas 2 0 condições de doença. Exemplos de genes estranhos, seqüências de nucleotídeos ou porções destas que podem ser incorporadas para uso em uma terapia gênica convencional incluem gene regulador da condutância transmembrana da fibrose cística, gene da minidistrofina humana, gene da alfa-l-antitripsina, genes envolvidos em doenças cardiovasculares, e semelhantes.
Em particular, a prática da presente invenção em relação à liberação de genes em seres humanos se destina à prevenção ou ao tratamento de doenças que incluem, sem limitação, doenças genéticas (por exemplo, hemofilia, talassemias, enfisema, doença de Gaucher, fibrose cística, distrofia muscular de Duchenne, miopatia de Duchenne ou de Becker etc.), cânceres, doenças virais (por exemplo, AIDS, infecção por herpesvírus, infecção por citomegalovírus e infecção por papilomavírus), doenças cardiovasculares, e semelhantes. Para os objetivos da presente invenção, os vetores, as células e as partículas virais preparadas pelos métodos da invenção podem ser introduzidos em um indivíduo tanto ex vivo (ou seja, em uma célula ou células removidas do paciente) quanto diretamente In vivo no corpo a ser tratado. Exemplos:
São fornecidos nos presentes exemplos ensinamentos exemplares de métodos e composições para a produção de linhagens celulares que expressam de forma estável o gene de fibra de PAdV-4. Os vetores de adenovírus recombinante suíno existentes, por exemplo, vetores de PAdV-3 que expressam o gene de gp55 do vírus da febre suína clássica (CSFV) [Hammond e cols., 2000] poderiam crescer nessas linhagens celulares com o vírus progenitor resultante contendo tanto a proteína da fibra de PAdV-3 nativa quanto à proteína da fibra de PAdV-4 adicional. A presença de duas proteínas de fibras diferentes no capsídeo viral amplia o tropismo celular do vetor. Ao fazê-lo, o vetor é capaz de ter como alvo uma variedade maior de tipos de células dentro do animal e de expor o gene estranho liberado a uma variedade maior de respostas imunológicas do hospedeiro. Além disso, os vetores recombinantes podem ser projetados para ter o gene de fibra eliminado para gerar mais espaço para a inserção de genes estranhos que poderiam ser complementados por sua passagem através dessas linhagens celulares que expressam a proteína da fibra. Essa abordagem permitiria a produção de vírus fibra-positivo com capacidade adicional de brotamento de DNA.
Exemplo 1: Materiais e métodos
Células e vírus: células renais suínas (PK-15) obtidas da "American Type Culture Collection" número CCL-33 (ATCC- CCL- 33) cresceram em meio de Eagle modificado por Earle (EMEM) suplementado com soro fetal de bezerro 5% (FCS), 10 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etano-sulfônico (HEPES) , Na-piruvato 1% e 2 mM de glutamina. Células de testículo suíno (ST) do "United States Department of Agriculture - Animal and Plant Health Inspection Services" (USDA-APHIS) foram mantidas em EMEM suplementado com FCS 10%, 10 mM de HEPES, Na-piruvato 1%, hidrolisado de lactalbumina 0,25% (LAH) e 2 mM de glutamina.
O adenovírus suíno cresceu em células renais primárias suínas (I0PK) mantidas em EMEM suplementado com FCS 2% e coletadas quando 90% das células mostravam efeito citopático (CPE). Todos os meios foram ainda suplementados com 2,5 ng/ml de fungizona (Squibb), 100 unidades/ml de penicilina e 100 ng/ml de estreptomicina (CSL).
Preparação de DNA viral: o DNA viral foi preparado pelo método de Hirt (1967) com pequenas modificações, como descrito por Shinagawa e cols. (1983), e digestões com enzima de restrição foram feitas de acordo com as instruções do fabricante.
Preparação de DNA de plasmídeo: o DNA de plasmídeo foi preparado com o uso do sistema Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. Isolamento do gene de fibra de PAdV-4 de DNA de PAdV-
4: o gene da fibra de PADV-4 foi amplificado a partir do DNA de PAdV - 4 por PCR com a utilização do par de iniciadores:
PADV-4 5' TTTTGGATCCATGAAGCGGTCCGTCCCGTC comprimento 3 0 BaiTTHI
PADV-4 3' TTTTAGATCTCTACAGTATCTGAGGGTAAAC comprimento 31 Bgl II
A PCR foi realizada com o uso do "PCR supermix" (Life Technologies) em um protocolo de extensão de 30 ciclos de 94 ° C - 1 minuto, 50°C - 2 minutos e 72°C - 30 segundos, com uma extensão de 3 0 segundos cada ciclo.
Construções de plasmídeo: o produto de PCR da fibra do PAdV-4 foi purificado em gel e ligado em pGEM-T (Promega) para gerar o plasmídeo PJJ392 (Fig. IA) . Após a digestão por enzima de restrição, um fragmento BamUl/BglTl de pJJ3 92 contendo o gene de fibra de PAdV-4 foi inserido no sítio BainHI do plasmídeo pCI-TPL, para gerar pJJ741 (Fig. IB) . O vetor de transferência pJJ743 foi então construído por inserção de um fragmento Nhel/Notl de pJJ741 contendo o gene da fibra de TPL-PADV-4 em pCIneo (Promega) (Fig. 1C) . As construções de plasmídeo foram verificadas quanto à presença da inserção correta por digestões com enzima de restrição e confirmadas por seqüenciamento usando o iniciador 5' ITT ACT GGG CTT GTC GAG ACA G 3', que se liga a 5' da seqüência de TPL.
Produção e caracterização de linhagens celulares estáveis: células ST e PK-15 cresceram em seus respectivos meios e aproximadamente 5 χ IO6 células foram submetidas à eletroporação com 20 ^ig de DNA de plasmídeo linearizado XmnI pJJ743, com o uso de um "Bio-Rad Genepulser" com os seguintes ajustes: 300 V, 960 μΡ e <χΩ. As células se recuperaram de um dia para o outro em seus respectivos meios suplementados com DMSO 1,25% (Melkonyan e cols., 1996) . As células resistentes a G418 foram então selecionadas com a adição de 800 (ST) ou 1.000 (PK15) μ9/πι1 de G418 (Promega) às culturas. Os clones individuais foram isolados por diluições limitantes, e expandidas. Os clones foram testados quanto à presença de genes de fibra por PCR e a expressão de mRNA de fibra confirmada por RT-PCR.
Purificação de DNA genômico: DNA genômico de células transfectadas foi purificado com a utilização do kit "DNeasy Tissue" (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.
Condições de PCR e iniciadores: a PCR foi realizada
com o uso do "PCR supermix" (Gibco BRL) em um protocolo padronizado de 1 ciclo a 94°C por 10 minutos, 30 ciclos de 94 ° C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 2 minutos, e uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Os pares de iniciadores 5' GCA CTG GAC TCG GAT GGA CA
e 3' AGC TGC TTG GTC CTG CGT CT 3' foram usados na detecção do gene da fibra de PADV-4 com uma banda esperada de 8 04 bp.
Purificação por RT-PCR de mRNA celular: o RNA total de células transf ectadas foi purificado com o uso do kit "RNeasy Mini Kit" (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.
Síntese do cDNA da primeira fita por RT-PCR: o mRNA foi convertido em cDNA com o uso do sistema de pré- amplificação SUPERSCRIPT para Síntese do cDNA da primeira fira (Gibco 25 BRL) de acordo com as instruções do fabricante.
Amplificação por RT-PCR de cDNA-alvo: o cDNA-alvo foi amplificado com o uso do protocolo de PCR e iniciadores descritos acima.
Produção de estoque de rPAdV-gp55: células PK15A, PK15-743, ST e ST-74 3 foram cultivadas até 90% de confluência, antes de infecção com rPAdV-gp55. Duzentos μΐ de rPAdV-gp5 5 foram adicionados à lâmina de células, e foram adsorvidos a 37°C por 1 hora. Vinte ml de EMEM (suplementado com FCS em concentração final de 2%) foram acrescentados. Os frascos foram incubados a 37°C em CO2 5% e observados diariamente quanto ao CPE. Quando os frascos apresentavam 70-80% de CPE, o vírus era coletado por congelamento/descongelamento três vezes.
Preparação de estoque de vírus purificado: o sobrenadante de cada grupo de frascos foi reunido em pool e depurado por centrifugação por 20 minutos a 2.000 rpm em uma centrífuga de bancada Jouan C3 000. 0 sobrenadante foi então decantado em tubos de ultracentrífuga SW28, e centrifugado por 9 0 minutos a 25.000 rpm a 20 0C em uma ultracentrífuga Beckman LM-80. O sobrenadante foi descartado e os péletes virais re-suspenso em 500 μΐ de TE. O material foi armazenado a -20°C em tubos com tampa de rosca de 1,5 ml (Sarstedt) até ser utilizado.
Purificação com o uso de um gradiente de densidade descontínua de sacarose: preparações de vírus bruto foram adicionalmente purificadas com o uso de um gradiente descontínuo de sacarose preparado em tubos de ultracentrífuga SW28 que compreendem 3 concentrações de sacarose a 60% (p/v), 30% (p/v) e 20% (p/v) em ΝΤΕ. Um ml do estoque viral foi cuidadosamente estratifiçado sobre o gradiente, e os tubos foram centrifugados a 28.000 rpm por 2 horas a 4°C em uma ultracentrifuga Beckman LM-80. O vírus purificado foi removido com o uso de uma seringa de 5 ml e uma agulha de 19 gauge, e colocado em um tubo de ultracentrifuga SW28, que foi então preenchido com TE. 0 vírus purificado foi então peletizado em uma ultracentrifuga Beckman LM-80 por 90 minutos a 25.000 rpm a 200C para remoção da sacarose. Os péletes foram finalmente re-suspensos em TE e armazenados a -20°C até serem usados.
Geração anti-soros de coelho de peptídeo fibra- específicos: as seqüências de aminoácidos de proteínas da fibra de PAdV-3 e PAdV-4 (Reddy e cols., 1995; Kleiboeker 1995) foram comparadas, e dois peptídeos sintéticos (Auspep Pty Ltd. Austrália) foram designados e gerados. Peptídeo 1 era composto por uma região da proteína da fibra que era conservada entre PAdV-3 e PAdV-4, e o peptídeo 2 era composto por uma seqüência específica para a fibra do PAdV- 4 .
Peptídeo comum de PAdV-3/PAdV-4: CGGDFDPVYPYD Peptídeo específico de PAdV-4: CAAASEEMPAPPEA As seqüências de aminoácidos completas de proteínas da fibra de PAdV-3 e PAdV-4 e as localizações dos 2 peptídeos são mostradas na Figura 5. A fim de gerar uma resposta imunológica em coelhos, ambos os peptídeos foram conjugados à KLH (hemocianina keyhole limpet) . Ambos os conjugados peptídicos foram injetados em coelhos para a produção de anti-soros específicos, como mostrado na Tabela 1. 3 0 Tabela 1: Os coelhos foram sangrados antes de qualquer *
tratamento em cada data. Duas fêmeas de coelhos brancos
ν
receberam a administração do peptideo especifico em adjuvante e 2 fêmeas de coelhos brancos receberam a administração do peptideo comum em adjuvante. 0 adjuvante usado para as primeiras duas doses foi QuilA, e o adjuvante para as doses restantes foi IFA (adjuvante incompleto de Freund). Um ml total de peptideo (4 χ 250 μΐ) em adjuvante foi administrado pela via subcutânea. No 113° dia, os coelhos foram sangrados e os soros foram separados e armazenados a -20°C até serem usados.
Dia Sangrados e receberam Adjuvante Quantidade de peptideo 0 + QuilA 4 X 50 μ9/τη1 22 + QuilA 4 X 50 Mg/ml 34 + IFA 4 X 50 Mg/ml 44 + IFA 4 X 50 μ9/πι1 70 + IFA 4 X 50 μ9/τη1 89 + IFA 4 X 50 μg/ml 99 + IFA 4 X 50 μg/ml 113 Sangramento N/A N/A
Exame de vírus purificado quanto à presença de fibra do PAdV-4: análise em gel de SDS-PAGE. Amostras de vírus purificado foram analisadas quanto â presença de proteínas da fibra de PADV-3 e PADV-4 em géis pré-moldados de SDS- PAGE de Bis-Tris 8-12% (Invitrogen). Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose por imunoblotting por 1 hora a 100 V. As membranas foram então bloqueadas em TBS/albumina sérica bovina 3% a 40C de um dia para o outro.
Exame de vírus purificado quanto ã presença de fibra do PAdV-4: análise por Western blot. Todas as lavagens e incubações de anticorpo foram realizadas em temperatura ambiente. As membranas foram lavadas duas vezes por 5 minutos em TBS-Tween/Triton, e uma vez por 10 minutos com TBS. Anticorpo policlonal antifibra de coelho em uma diluição de 1/200 em TBS/ BSA 3% foi adicionado às membranas, que foram então incubadas por 1 hora. As membranas foram lavadas por 2x5 minutos em TBS- Tween/Triton, e uma vez por 10 minutos em TBS. As membranas foram então incubadas com anticorpo anticoelho de cabra conjugado à peroxidase de raiz-forte (HRP) (Sigma) em uma diluição de 1/500 em uma solução de leite desnatado 5%/jbIofcfco. As membranas foram então lavadas como acima, e as bandas de proteína visualizadas com o uso de detecção por quimiluminescência intensificada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech Ltd).
Análise in vivo com a utilização de experimentos em porcos. rPAdV-gp55 modificado desenvolvido em células PK15- 743, ou rPAdV-gp5 5 desenvolvido em células PK15A não modificadas, foi administrado a suínos da raça "Large White" disponíveis comercialmente com a utilização do seguinte regime: Dia 0: todos os porcos sangrados e vacinados
Grupo 1: Ia dose - 2 χ IO5 TCID50 vacina de rPAdV-gp55 não modificado por injeção subcutânea.
Grupo 2: Ia dose - 2 χ 10ÍJ TCIDb0 rPAdV-gp55 modificado por injeção subcutânea. Grupo 3: Ia dose - 2 χ IOb TCID50 rPAdV-gp55 modificado pela via oral.
22° Dia:
Grupo 1: 2a dose de reforço - 2 χ IO5 TCID50 vacina de rPAdV-gp55 não modificado por injeção subcutânea.
Grupo 2: 2a dose de reforço - 2 χ IOb TCID50 vacina de
rPAdV-gp55 modificado por injeção subcutânea.
Grupo 3: 2a dose de reforço - 2 χ IO5 TCID50 rPAdV-gp55 modificado pela via oral.
47° Dia: dois porcos limpos com idade e peso equivalentes foram usados como controles do virus de ataque.
49° Dia: todos os porcos, incluindo controles limpos, foram atacados com uma dose letal da cepa "Weybridge" de CSFV (1.000 TCID50) por injeção subcutânea. As temperaturas retais foram registradas diariamente após o ataque, e todos os porcos monitorados diariamente quanto aos sinais clínicos de doença manifestados como perda de apetite, posição recostada, diarréia e vermelhidão acima dos pés. Os porcos foram sacrificados (eutanásia) ao final do experimento ou quando apresentavam doença clínica grave, e os baços foram removidos para detecção de antígeno do CSFV. Foram feitos exames postmortem em todos os porcos sacrificados.
Detecção de anticorpos séricos neutralizantes contra CSFV: os porcos foram sangrados em intervalos semanais, e os soros testados quanto à presença de anticorpos neutralizantes contra CSFV pelo ensaio neutralizante ligado à peroxidase (NPLA), como descrito por Terpstra e colaboradores [1984] . As titulações de NPLA foram expressas na recíproca da diluição de soro que neutralizava 200 TCID50 da cepa Weybridge em 50% das culturas replicadas.
ELISA por captura de antígeno: a presença de antígeno do CSFV nos baços dos porcos atacados foi determinada por ELISA por captura de antígeno [Shannon e cols., 1993].
Exemplo 2: Resultados da preparação de vetores, linhagens celulares e vírus
Geração do vetor de transferência que contém a fibra do PAdV-4. O seqüenciamento de nucleotídeos confirmou que o vetor de transferência pJJ743 continha o gene de fibra de PAdV-4 abaixo da seqüência de TPL de PAdV-3 (Fig. lc) .
Geração de linhagens celulares que expressam constitutivamente a proteína da fibra de PAdV-4: células ST e PK-15 foram transfectadas com o vetor de transferência pJJ743, seguida por seleção com G418 para o estabelecimento de clones que contêm DNA integrado. Dois clones de PK-15 (8 e 9) foram testados, e foi demonstrado por PCR que contêm o gene de fibra de PAdV-4 (Fig. 2A) . Doze clones de ST transfectados com pJJ743 (2-14) foram testados por PCR, e (2, 3, 5, 6, 7, 8 e 11-14) demonstraram que contêm o gene de fibra de PAdV-4 (Figs. 2B e C). Os clones positivos foram então denominados com o tipo de célula, seguido pelo prefixo 743 e o número do clone, ou seja, PK15-743-9.
A expressão de mRNA de fibra nesses clones celulares foi então avaliada por RT-PCR. Grandes quantidades de mRNA de fibra 4 foram
detectadas nas linhagens celulares PK15-743-9 e ST-743-2, 5, 6 e 8 (Figs. 3A e B) .
Características de crescimento: após inserção do gene de fibra, as células PK-15-743 e ST 743 se desenvolveram 3 0 mais lentamente do que as linhagens parentes. Exame de vírus purificado quanto à presença de fibra do PAdV-4: a linhagem celular PK15-743-9 foi infectada com rPAdV-gp55, e o vírus coletado quando as células apresentavam 80% de CPE. O vírus foi purificado, e foram separadas amostras em géis de SDS-PAGE 8-12%. Após transferência para membranas de náilon, as amostras foram analisadas por western blot quanto à presença de proteínas da fibra de PAdV-3 e PAdV-4 com o uso de anti-soro de coelho desenvolvido contra os dois peptídeos descritos acima.
Quando tratados com o peptídeo, anti-soros desenvolvidos contra o epitopo comum de fibras de PadV-3 e -4, podia ser observado um dupleto de bandas que correspondem ao peso molecular esperado (45 kD) da fibra de PAdV-3 na raia que contém rPAdV-gp55 desenvolvido em células PK15 não modificadas (Fig. 5A, raia 1). Em contraste, a raia que contém rPAdV-gp55 desenvolvido em células PK15- 743 - 9 modificadas continha um dupleto que corresponde à fibra de PAdV-3, e também uma banda adicional no peso molecular esperado (77 kD) da fibra do PAdV-4 (Fig. 5A, raia 2) . Quando tratados com o peptídeo, anti-soros desenvolvidos contra o epitopo específico na fibra do PAdV- 4, nenhuma banda foi detectada na raia que contém rPAdV- gp5 5 desenvolvido em células PK15 não modificadas (Fig. 5B, raia 1) , enquanto foi observada uma única banda no peso molecular esperado da fibra do PAdV-4 na raia que contém rPAdV-gp5 5 desenvolvido em células PK15-743-9 modificadas (Fig. 5B, raia 2).
Exemplo 3: Resultados dos estudos de vacinação em porcos Experimento em porcos para testar a eficácia de rPAdV- gp55 com perfil de fibra modificada. A fim de testar a eficácia da vacina de rPAdV-gp55 modificado contendo as fibras dos sorotipos PAdV-3 e PAdV-4, grupos de suínos da raça "Large White" receberam duas doses de vacina modificada ou de vacina modificada, e sua suscetibilidade ao ataque letal com CSFV foi determinada. Além disso, foi testada a habilidade da vacina modificada para induzir anticorpos neutralizantes e para gerar proteção quando administrada pela via oral. Reação dos porcos à vacinação: não houve efeitos
adversos nos porcos após vacinação com ambas as preparações vacina, por uma das vias. Não houve aumento da temperatura corporal ou surgimento de sinais clínicos.
Temperaturas dos porcos pós-ataque: a temperatura diária média e o erro padrão para os porcos de controle e para cada grupo de porcos vacinados são mostrados na Figura 6 .
Porcos de controle: os porcos de controle desenvolveram febre e apresentaram sinais clínicos de CSF por volta do 4o dia, com a morte de um porco de um dia para o outro no 4o-5o dia, e um porco sacrificado com doença grave no 7o dia pós-ataque (p.c.).
Grupo 1: nenhum dos porcos que recebeu doses subcutâneas de rPAdV-gp55 não modificado desenvolveu febre nem mostrou qualquer sinal clínico de CSF até o término do experimento.
Grupo 2: nenhum dos porcos que recebeu doses subcutâneas de rPAdV-gp55 modificado desenvolveu febre nem mostrou qualquer sinal clínico de CSF até o término do 3 0 experimento. Grupo 3: dois dos 3 porcos que receberam as doses orais de rPAdV-gp55 modificado não desenvolveram febre nem apresentaram quaisquer sinais clínicos de CSF até o término do experimento. Um porco apresentou uma temperatura acima de 4 00 C em 2 dias separados, não sucessivos, mas não apresentava nenhum outro sinal clínico de CSF até o término do experimento. É importante ressaltar que a temperatura média do grupo não se elevou acima de 4 0°C durante o período de ataque. Desenvolvimento de anticorpo neutralizante específico
para CSFV: todos os porcos foram sangrados no dia 0, e depois em intervalos semanais até o término do experimento e, os soros testados quanto à presença de anticorpos neutralizantes contra CSFV por NPLA (Terpstra e cols., 1984). As titulações de NPLA são mostradas nas Figuras 7-9.
Porcos de controle: os porcos de controle não desenvolveram anticorpos neutralizantes de CSFV detectáveis.
Grupo 1: todos os porcos desenvolveram anticorpos neutralizantes de CSFV detectáveis por volta do 14° dia pós-vacinação, com um porco apresentando uma titulação detectável por volta do 7o dia. Os níveis foram reforçados por administração da segunda dose. Todos os porcos sobreviveram ao ataque e tiveram titulações pós-ataque de > 8.192.
Grupo 2: todos os porcos desenvolveram anticorpos neutralizantes de CSFV detectáveis por volta do 14° dia pós-vacinação, e esses níveis foram reforçados por administração da segunda dose. Todos os porcos sobreviveram ao ataque e tiveram titulações pós-ataque de > 8.192. Grupo 3: todos os porcos desenvolveram anticorpos neutralizantes de CSFV detectáveis por volta do 14° dia pós-vacinação e esses níveis foram reforçados por administração da segunda dose. Todos os porcos sobreviveram ao ataque e tiveram titulações pós-ataque de > 8.192.
Teste quanto à presença de antígeno do CSFV no baço dos porcos: a presença de antígeno do CSFV no baço dos porcos atacados foi determinada por ELISA por captura de antígeno [Shannon e cols. , 1993] , e os níveis são mostrados na Figura 9.
Porcos de controle: os porcos de controle tinham níveis elevados de antígeno em seus baços, indicativos de infecção em andamento no término.
Grupo 1: nenhum dos porcos era positivo para antígeno do CSFV no baço, demonstrando que nenhum deles tinha doença ou vírus ao final do experimento.
Grupo 2: nenhum dos porcos era positivo para antígeno do CSFV no baço, demonstrando que nenhum deles tinha doença ou vírus ao final do experimento.
Grupo 3: nenhum dos porcos era positivo para antígeno do CSFV no baço, demonstrando que nenhum deles tinha doença ou vírus ao final do experimento.
A partir dos estudos descritos acima, foi demonstrado que um vetor de plasmídeo que contém o gene de fibra de PAdV-4 foi transfectado em células PK15 e ST, e que foram produzidas linhagens de células transfectadas de forma estável que expressam a fibra do PAdV-4.
Foi demonstrado que PADV-3 recombinante (rPAdV-gp55) contém fibras dos sorotipos PAdV-3 e PAdV-4 após passagem através da linhagem de células PK15-743 que expressam a fibra do PAdV-4. Essa vacina recorabinante modificada foi administrada aos porcos, e sua eficácia avaliada em um experimento de ataque com CSFV.
A vacina modificada protegeu completamente os porcos do ataque letal com CSFV quando administrada como injeção subcutânea ou pela via oral. Não foram detectadas diferenças nas respostas de temperatura pós-ataque, ou na depuração de antígeno do CSFV do baço entre porcos que receberam as vacinas modificadas e as vacinas não modificadas. No entanto, a vacina modificada administrada pela via subcutânea gerou os maiores níveis de anticorpos de NPLA de todos os 3 grupos, maiores do que aqueles detectados no grupo da vacina não modificada. Além disso, os inventores demonstraram previamente que, quando a vacina não modificada é administrada pela via oral, não pode ser detectado anticorpo de NPLA antes do ataque, até mesmo após uma dose de reforço [Hammond e cols. , 2001; Hammond e cols., 2003]. Nesse experimento, foram detectados níveis muitos significativos de anticorpos de NPLA no grupo oral após uma dose única, e esses níveis foram reforçados pela administração de uma segunda dose. Esse achado fornece evidências excelentes de que a vacina modificada que contém proteínas da fibra tanto de PADV-3 quanto de PAdV-4 tem como alvo uma variedade mais ampla de tecidos no porco do que a vacina não modificada e, conseqüentemente, gera uma resposta imunológica mais extensa no hospedeiro.
A partir dos dados acima, pode-se concluir que rPAdV- gp55 modificado é eficaz na geração de anticorpos séricos neutralizantes contra gp55, quando administrado oralmente, enquanto a vacina não modificada não o é. Dessa forma, essa vacina quimérica com ambas as fibras, de PAdV-3 e de PAdV- 4, alterou e/ou aumentou a magnitude da resposta imunológica nos porcos. Essas vacinas podem ser produzidas para permitir liberação oral eficaz. Considerando-se as modalidades exemplares aqui ensinadas, as técnicas desenvolvidas permitirão que a fibra do PAdV-4 seja incorporada em qualquer vacina baseada em PAdV-3 para aumentar a eficácia por liberação direcionada. Além disso, podem ser produzidos outros vetores adenovirais e outras linhagens celulares, nos quais os usos de um sistema de fibra dupla permitirão um tropismo aumentado da vacina adenoviral recombinante.
Há várias referências na literatura que fornecem mais fundamentos para a presente invenção. Algumas dessas referências são apresentadas abaixo e são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
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ID. DE SEQ. N0 : 1 - gene da fibra de PAdV-4 de 2.250 bases de seqüência da fibra em direção à extremidade da direita (rhe) . Há uma boa compatibilidade com a fibra de PAdV-3 (negrito), mas toda a seqüência subseqüente é inédita.
AAi CC ACC i GCiAACACCAAG I GCi AGA rOrrí CAG ΓΙΊ Γ Γ'ΓΓΤΛ CCGCGGGAGTTTCGA AAGTTTA CCCTCAGATACTGTAGTCAG ACACAA AGAT G1\\AíyiOCCVVX;CA1XI!AGAAAGTrrA1TGGCAATAAAGC'rAC'l'GGAAACGA'r GCGTG TGGTG ATCTTTCCCCCTCCCCC A A ATTTC ΑΤΤΤΓ0ΤΑ AC ATACCC'I"AT GGGAACKICCCCGGCCCACAGTCAGCCACAGTCTCAAGTTGCTCCAGCTCAGGTC»
AGG I'AA'TGCl GA I GAACCCAGGCGA l A I CAG ICICGCA I CCAAGGTÜTGATCCA AACTCTGTGAAAATCATACTCCGCTTGTAAACTTTCGCCAAGGCACCGGGGITCC ATACACCA-FCAATCTTCGCAGACGTCGCCGCCGTGCGCCGTCCCGAAAAGCCGG G'IAGAACACI CTCGGI CGAGGTCCCCCAACICTCAGCA ACCl'ΆAA A GCC JCCTG A
A Ci C A A Cl "CC CTGC.....rCTCiAACCCiCACACTCiCCTCACATCACGTTCATGCAGAGACA
TACATCCAGTACACAAGCGTATAAAGTAGTAA'ITAG1TGCAGTACAGAGAAATTT
CACAGACGGGCCTGACAGITGCTGCTTCAAAAGCCAAAAGTCATTCCCCTGTCTG CAGCAAAACACCACA A AGTGCAGCCCCCiCCACC ATATAGGAGCCCCTGC A AGAG ATAGCTriAGGrAAGTCAACACACACCCl C Γ JCl GCATACCAGA IGAAGCrGCGG TTA A AGA AACAGCCCCTGGG ATCACAG ACGTAGCCA A AGGTCTTCACC ACCACA (TCCTAGCCCTACATTGCAAGACiAGTGRGCiCiCTCiTCaCAGKTCiRMCAATGTATAG 2 0 AAAG('ACCT("TCGACCATACAAGTAATFtCCCCS AAWaCAGATlGtTTAACTCCAAG
G S CCC GG Ci G gc C A Ci A CC C A TCC C A GTtCT AC G G A G A C A Ί TCi C A A A GT G Cl A G CC A G AAGCAACCAAATCCCAAGGC ACXXiGAAG AlXTA AGTAACiCTGTCiA AACATCiCTCi
CAGGTGGAGTGGTGCTTACCGCTCCAACTAGATGCI.....Γ AG AGTC ACATGGTTC A AC
ACl A AGTC ATTGTCCTCiCi A ACiACiG A ACi ACiCiCi AA ACjC"!ATT'A A AGC ACCG A A AC ACi CTCAATCiCiCiCKiCiCiCTCKiTCiTCiGTACACACiCCACCATACXiCiGAACrAAGAAAACiT
2 5 CAACAGGCCAGAGGCCAAATCCTGCTGGGACTCCGGAGTTGCAAACAGCCGAGA
(!(XXXKX^CiTCi ACTCiTCiATACiTCÍTCKXTCií XTTCiACiCiTA A,ATC'AACiC''ATCK-1ACK-tAA ('AATCi('ACiAAAACiACTCACiACiCCiACiTACCAGCi(iCXiA(iTrrCCAAATCAAACiCXiA ATCAGCAAGTAATCATAAACCAAGGATCfG ATCACATCCAgCCAA AGSWCKWCM (XÍAACKÍC:AAAC;TA(j(ÍATCXXXT(KÍ('A('ATC'(XÍTCÍAT(ÍTA('ACÍCjTCKX,ACÍCíAC,(,A AGCGCI GTACACGAAAG fGCCGGACGCCA ICl TGCCi I ACAGA lCACfGACCCG f
3 0 GG AGCCGA AACCGCCGGCACCCCTGTCGGTAGGCTGCAGGTCGTCC ACC AGCTG GC ACACGGG'TCTCTCAAArn CAGGAA AAtCAGCl GCGCGATCCGGTCCCCGGG A G C G A T A Λ A C Λ C Λ G GC A G A GGCCC A CTG TlT -G CC Λ Λ C A G C A C TTTC A C TC GCCT GT AAGTCCGGGTCAATTGrrCCCGCACAGACGT AC ACGCCGCGC AACGAC AACT CG ATC GTG A A ΑΛΛ ATCTGCCCGTAGGGCCC AGGCGG AGGACTT'ATGGCG ATCCC AG Λ ACGGATG ΛΤΛ GTTCGGTCCCCCGGTTCCATG ATACG AGCCTCCGGCGAGCA AAACG'IT.TATCCCCCGTGAAGCCGCCGTACCGAAAACAGCCGGCCCCCCCCGTCC CGCTAACTTCCCCTTTAAGATCCGGAGTGGTCCTGACGGCTCAGAGGGAAAAACC GC(iAAAAAATTCX:CKX}AACTCCGCAAAAACYXX)AACXiCLACíTACCCK'CC(:(:CiGCiA ATCCCÍTCjAACTGA(:'ATTGGCrGACllll-AlXJCÍCXiCCCGGCA'rGTCGATAG'rCÍACA AT ACGGGAAGGGAACCAA'TTCACGCATTCTGGGCAGTGTGGGAGAAAGCGGACT
10
TAC^ACA ATCiTCiTCTTCXiC^ACC^ACXiCiCi A A AACj ATTACTCCiATACXTC'ATAAGC JTCJ A
TCi
ID. DE SEQ. N0: 2 - 1.858 bases da seqüência da fibra de PadV-I em direção à extremidade da direita (rhe) . Há uma boa compatibilidade com PAdV-3 em algumas seções (em negrito); seqüência inédita com fonte normal.
TAT AAACCAGTTCCACCATGGGACCGAAGAAGC AG AAGCGCG A GCTCCCCGAGGACTTCGATCCAGTCTACCCCTATGACGCC CCGCAGCTGCA G ATCA ATCC AC CCTTCGTC AGCGGGG A CGG ATTCCACCA ATCCG TGG ACGG
2 0
GGTGCTGTCCCTGCACATCGCACCGCCCCTCGTCTTTG ACAACACCAGGGC CCTCACCCTGGCCTTCGGGGATGGTCTACAGCTCTTTAACAACAAGCTCATC GTTGCCACTGAGGGATCTGGGCTGGTCATCACCACGGATGGCAAGCTGGTC CTCC AGGTC ACCTCCCCCCTCACCCTAGC ACCCG ATGGCATCTcCCcTGTCCC TGGGcCCCcGGTCTCTCTAGCTCAaGATGACAaGACTCAGCCsTGCAAGGTCA CATCTCCCCTGCAGCTCCaAAAGCAACTCCCTCGCCCTTTCCCTCGGCAGCG GTCTCCA A AAC ACCG AGGGTGGCcGTAGCtTGTCA AG CTGGGGG CTGGTCTC ACCACGGACAACAGTCAGTCAGTGACAGTCAAGGTGGGAGACGGTCTrAAG CTGAACG AAGGAGGGCTGCTCACCGTCCCCGTAACAGCACCACTTGTGTCCGGC CÍC"A(XXXiGACTATCAC,TTrAACTACT(XT(T?AC,T(iATTTXXJAACTT(iATAA(,Ciü('' AGCCrCCG'rcrGCGTCC*I"AAGCCGATCrCCGTCACGGCGCCACTGCAATCTACCG CTG AC ACC ATCTCCCTG A AGT ATTCTG AC ACTG A CTTCTCTTTG G A G G ATA AC AC
CACCC'rC'AC*r'rrAACACC'l"AAA'rrAAAACCG'l'ACACAC"rG'rGGACCGG'rAATrCA G AT ACAGCTAATGTG ATCCTC A ATC ACAGCTCCACCCXT'A ATGGT AC ATT ATITC TATGTCTGACACGTGTGGGTGGRTAGTTTTAGCACTTTGCCCTGAAGACATCATC CCTACAll!"AGTGATATGACAAACAGCl'ATCTTATTTTTGATAC'rTTG'irGACTCA GACrCTCACTTATAGGAGTTTGATTAGATCAACACGACGTCATT-AGCCCACAGtCC AC.AGCÍ AC! 'CACITCC ACiCCT'GGTTA ATGCC A AC.CACCrTTAITTACCCTAACTCAT
10
CGGGCTCAACTTTGACATCATrCGTAAGAATTAAAGCAACAA ATGlTΧ.ΆΊ.XiTGGA TATCA GAGTCA ACAGCCTCTCC ACTA ACGGTTTT AGTCTTC AGTTTG A ATTTGA A AACATGATCATCTCCAGTGCCTTCTCCACCTCC1^\CGGGACCTTCTGCTACGT GCCCCAGAGTGCCTAGAGAACCCTGGCCGTCAGCCGGCCTCCCCC I TCCCA TA CC ACCCG GTA G AC C ACCCG CTCC A TG TTTCTGT ATGTG TTCTCCTCCCG C CGCTTGTCCAGCACCACCTCCCGCTGCTCGAGCTGAGGATCCÍJTGATGGAC ACAAAGCCAGGAAGACACATCCTCAGCTCCGTGGGGGCGTCCAACA ACTGT TTG TGC A A G G Λ Λ A Λ T A TG Λ Λ Λ C A A T A A A G A C TC A Ci A G A A A A A C A λ G TT C A T A T G ATTTTTTCTTTTATTGATTGGGG G ATTTG ATTC AGGTGG GGTGTAC A TATC ACAAAAAAATCACATCAGCAGCTACACCCTGGAAACATTCAGACAGGGGTA AGGACAGC:GCCCTCAGCT1XnX;GAACAAACAl'TAGAAA1\\T11'AAC,TCXjTC,TT (ÍCJACKTAACAC^TTTTrCXX,ACiAACA("ATAAA(:ATCCTCiTAGA
ID. DE SEQ. N0: 3 - 969 bases da seqüência da fibra de PAdV-2 em direção à extremidade da direita (rhe). Há uma boa compatibilidade com PAdV-3 em algumas seções (em negrito), o que inclui a rhe completa de PAdV-3. Seqüência inédita com fonte normal.
AGTGGGGrITCAAAA A AGITAC ATA AnCGCGCTTCTCGTGCAG A G AG ACiCXXÍCJCJnAnnCJCXKXTC^CACiCAGTCiGCÍTCGTCIGCÍCCCÍTGACiAGGGGGCT GATCJGGAAGATGGCCGGTGACTCCTCTCGCCCCGCTTTCGGCTTCTCCTCGT -> η CTCGCTCTCCrrGTCTCTCTCTCiTGTCAGCGCAGAAACTAGTGTGAGCGAAC AACGCGAGGGGGCCCGTGATATACCCnCAGCTGATCTGG CCACAG CTGCTA TCGGnTAATCACTACCCCATCGTACGATCGnAATTCCCCCGCCTCCTCGITnC GATTAACCCACCCAGAAGTCTCGGGAATTCCCGCCAGCCGGGCTCC GACCC GCG ACGTGCGG ACTTTGACCCCGCnCCTCGG ACATTG ACCGGTCCC ACGCC ACGTCACITTCCCACTCGACGTCCCGITCCCGCGCTnCGTCACACCCCrCTC CATGAATCTGCTGCAACCGCCTCGAACCCTCTCTTCCAATCAACTCGCCATT
AAAGGGGCAATAAAAGTGTAGGGTATAI'GGArITGATGATGGCCCAGGT1GACCA GG'TCCGAGCGCTT'GA'I CGATTCCGTGGGAAGTGGA'T'GTCAGCFAAGC I CCl AAl G
ACAACCGCCAACCACGGCTGCAGAAGCTCTTCCCTCTAGAGACGCGAGCTAGCA TAGACAT ACIXTC ATCT AT ACACTCGCCGT AGAC AAIOTCATACGCAAATGGGAGG
1 o ACTA AGG AC ATCCCGG ATCCACC ACCTGGG ATGT ACTCC ATCC ATCGGG AC ACTT
A A ACAGC^ ATAAGAA AGACGCAATTGTTG ACGC AGA AATTTGGCTAGAGAGGCG GGCAG(]ACT'C:ATGAGCCrAGAGACCAC(X;AAT'rGGGAAAGTGACCTCCCCTCCC
CCCGTGGAAAACGTGGTATCAAACGAGATCGACAATGCAATÍ"CGGTCACTI......IAG
G G G T A (X ι A G G A T A T A T C A C G G A ID. DE SEQ. N° : 4 - fibra de PadV-2 do segundo
conjunto de dados. 1.176 bases de seqüência dão uma boa combinação com PadV-3, mas em orientação reversa para a extremidade da esquerda (negrito), o que sugere que o último iniciador removeu gradualmente ambas as extremidades
2 0 do genoma, provavelmente a partir de ITR, e gerou uma
informação de seqüência dupla.
AAAAAAGGCAGGAGCGATGATTGATAGCTCGAGGAATAGCTCAGT CACCAC \AT<XX,TTÍXXTCK,A(X\AC,TTATAA( j(jC'.T ATAT ATACKKnACiACi AC^AC^ACIA CAATCAG'I'CATCATCACATGCTG'nTA1TGAGG'l'TAA'IsGATTAATCGCGGGGGCG CTTC ATAGAC AGGTCC A AAGGTTGTTCGCTGCATG AGTC ATAGC AGT ACTTCCTC TTCiCXiTCX"TCXiCACXiTC
AAACAGCITCTAAAAAGACAAAAAATGGGAAATAGCACATGAGATrrCTrACAA C}C'ACTTTTrCX'TTTTTTTCCACATAATCCCACAAATGTCCAAAAAf\\ClXv\CCA
T A G A C A G C A A A G G C A T G C A T C C T C A TG TA G C A C A G A C TCi C A C TTC A G A TTC ti GCTCCTTGGAG'ΤΓ,ΑΛΛΓ,ΓΓ,Α TGGTAATCACAAGAGCGGCAG'T1TCACACCAG G T A C C T C G G G C C A G T C C A A C A C A A A C G G A G A G G G T G G C G C A A G T G G G T C C T C A A A Γ A Γ C A Γ A TC A G C Γ A G T TC A G A C A G Γ A Γ Γ TC C G C A G C Γ A Γ C G Γ G C FG A TATCCTCCTCATTACTGTCCCCCTCTTCTGGGGGGTCCATCTCAAAGACCCC CTGAGAGCCACCTGAGTCACCAGCGGCACTCCCACCACTGTCCTCAGCTAC ACCCCCCTCAGTCACAATCACCTCCACCTCGTCCACACTGTCCAGCCACTCG TCCGGC AGTCCATCG ACCAG ACTCTCCCAGCACGGCTCACAGA AGCCCTC A T C C C C C G G A G A G G G G T C G C G C A G A T C C A C C G G G T C C C ATT C C AGC A CCGG C ACCACCTCGGGGTTTCCGITCCAGTCCAGGTGAAGTCTGTTCGCCATGTCGA GGGTCTGTTCCGCTGAGAGAAAACTCTACTCCCTTCGGACTCAAGAGTAGTG ACrCICGGGCGCTGCGCGGACTAIAFACAClGAGGAGAAAAAArACACCCA C:A( ACG rCATCTC(;GGCGGGCGCCGCGACC I CI CAGCGC GAAGGAAACCCC G GCTCA G G TG A ATGGTG TCX^CGTCGTC AGTCGCiGATACGAGCGGCG ACGGTG FG rGGAAA rGCrACACX;GGAGGCiCGAGGG rCA(}l C:CAAAACjCAAAAAT"I'CCCX}C I AACTK Χ 'ACI I Ci Π GGA Α Λ Ι Α I ( 'TC I GC
ID. DE SEQ. N0 :5 - Complemento reverso do contig de
PAdV-2.
GCA G AG ATATTTCCA ACA AGTGG A AGTTA GCGG G Λ A TTTTTGCTTT ΊΌGACΊΌACCCΊ·CGCCCΊ'CCGGΊ'G'ΓGGCAΊΊΊ·CCACACACC,GΊ'CGCCGCΊ'CG·ΓAΊ, CCCC A CTG A CG A CCj G G AC' A CC ATTC A CCTG A G CCG G G G TTTCC TTC Ci CG CTG A G A 2 0 GGTCGCGGC^CXCGCCCG AGATG ACGTGTGTGGGTG^
A I A I AG I CrGCOCAGCGCCCGAGAG rCAC I ACrC r rGAG I CCGAAGGGAG rAGA
GTl.....ITCTCTC AGCGG A AC AG ACCCTCG AC ATGGCG A A C A G A CTTC A C C TG G A CTG
GGACGGAAACCCCGAGGTGGTGCCGGTGCrGGAATGGGACCCGGTGGATCTGCG C GACCCCrC I CCGGGGGA I GAGGGCi rCl G l GAGCCG l GCvI GGGAGAG I Ci GG I C' 2 5 G ATGG ACTGCCGGACGAGTGGCTGG AC AGTGTGG ACG AGGTGG AGGTG ATTGTG ACTG AGGGGGGTGTAGCTGAGGACACyiOGTGGG AGTG
GGCTCTCAGGGGGTCTTTGAGATGGACCCCCCAGAAGAGGGGGACAGTAATGAC. G A G G Al A TC A Cj C GCCj GTG Cj CTGCG G A G GTG CT GTC TG A A CTG G CTG A TG T G G TCS 'nTGAGGACCCAClTGCGCCACCCTCTCCGTTTGTGrrGGACTGCCCCGAGGl-AC C[Ci0I cíici vcicKccicrcirciiCr/XTi/XCx xrccicfi.....I'CACIC('AA(:ÍCÍACX;'('(.....Α A TC TG A ACiTC/CAGTCTGTCKTAC ATGACXj ATC JC^ ATCiCX^TTTC iC^TGTCT ATCiCTrCi ACi TGTrnTGGACATITGTGGGATrATGTCGAAAAAAAGGAAAAAGTGCTTGTAACiA
A ATCTC ATGTCiCT ATTTCCC ATTTTTTCiTCTl.....I......ΓΤΛ G Λ AGCTGTTTCTCC AGC ACCT
C:AC,AGCiTCCjGGTTCrCXXiCKjAC:mjCiACÍACXTCi(X^ACiGACTiCAACjAGGAACiTAC
TGCT ATG ACTCATGC AGCG A AC A ACCTTTGCiACCT GTCTATGAAGCGCCCCCGCG
ATTA ATC ATTA ACCTC A ATA Λ AC AGC ATGTG ATG ATG ACTG ATTGTCTGTGTCTC TCiCCTATATATACCCTT ATA AGTGGTCX:AGGGAAG(KjATGTGGTGACTCj ACiCTAT TCCTCG A GCTATC A ATC ATCGCTCCTGCCTTrTTT LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
PAdV 1
TATAAACCAGTTCCACCATGGGACCGAAGAAGCAGAAGCGCGAGCTCCCCGAGGACTTCGATCCAG
TCTACCCCTATGACGCCCCGCAGCTGCAGATCAATCCACCCTTCGTCAGCGGGGACGGATTCCACC
AATCCGTGGACGGGGTGCTGTCCCTGCACATCGCACCGCCCCTCGTCTTTGACAACACCAGGGCCC
TCACCCTGGCCTTCGGGGATGGTCTACAGCTCTTTAACAACAAGCTCATCGTTGCCACTGAGGGAT
CTGGGCTGGTCATCACCACGGATGGCAAGCTGGTCCTCCAGGTCACCTCCCCCCTCACCCTAGCAC
CCGATGGGATCTcCCcTGTCCCTGGGcCCCcGGTCTCTCTAGCTCAa GATGACAaGACTCAGCCsT
GCAAGGTCACATCTCCCCTGCAGCTCCaAAAGCAACTCCCTCGCCCTTTCCCTCGGCAGCGGTCTC
CAAAACACCGAGGGTGGCcGTAGCt TGTCAAGCTGGGGGCTGGTCTCACCACGGACAACAGTCAGT
CAGTGACAGTCAAGGTGGGAGACGGTCTTAAGCTGAACGAAGGAGGGCTGCTCACCGTCCCCGTAA
C AGCACC ACTTGTGTCCGGCGCACCCGGACT ATCACTTTAACTACXCCTCCACTGATTTCGAACTT
GATAACGGCAGCCTCCGTCTGCGTCCTAAGCCGATCTCCGTCACGGCGCCACTGCAATCTACCGCT
GACACCAXCTCCCTGAAGTATTCTGACACTGACTTCTCTTTGGAGGATAACACCACCCTCACTTTA
ACACCXAAATTAAAACCGTACACACTGTGGACCGGTAATTCAGATACAGCTAATGTGATCCTCAAT
CACAGCTCCACCCCCAATGGTACATTATTTCTATGTCTGACACGTGTGGGTGGRTAGTTTTAGCAC
TTTGCCCTGAAGACATCATCCCTACATTTAGTGATATGACAAACAGCTATCTTATTTTTGATACTT
TGTCGACTCAGACTCTCACTTATAGGAGTTTGATTAGATCAACACGACGTCATTAGCCCACAGtCC
AC AGG ACTCAGTCCAGCCTGGTTAATGCCAAGC ACCTTT ATTTACCC T AACTC ATCGGGCTCAACT
TTGAC AT C ATTCGT AAGAATTAAAGCAACAAATGTTCATGTGGAT ATC AGAGTC AAC AGCCTCTCC
ACTAACGGTTTTAGTCTTCAGTTTGAATTTGAAAACATGATCATCTCCAGTGCCTTCTCCACCTCC
TACGGGACCTTCTGCTACGTGCCCCAGAGTGCCTAGAGAACCCTGGCCGTCAGCCGGCCTCCCCCT
TCCCATACCACCCGGTAGACCACCCGCTCCATGTTTCTGTATGTGTTCTCCTCCCGCCGCTTGTGC
AGCACCACCTCCCGCTGCTCGAGCTGAGGATCCGTGATGGACACAAAGCCAGGAAGACACATCCTC
AGCTCCGTGGGGGCGTCCAACAACTGTTTGTGCAAGGAAAATATGAAACAATAAAGACTCAGAGAA
AAACAAGTTCATATGATTTTTTCTTTTATTGATTGGGGGATTTGATTCAGGTGGGGTGTACATATC
ACAAAAAAATCACATCAGCAGCTACACCCTGGAAACATTCAGACAGGGGTAAGGACAGCGCCCTCA
GCTTCTGGAACAAACATTAGAAATATTTAACTCGTCTTGGAGCTAACACTCTTTTTCCCAGAACAC
ATAAACATCCTGTAGA
Genoma completo de sorotipo 3 de adenovírus suíno,
filtração IAF. Comprimento = 34094
Contagem(score) = 454 bits (229), suposto (expect) = 3e-124 Identidades (identities) = 238/241 (98%), Intervalos (gaps) = 0/241 (0%)
Margem (strand)= Plus/Plus
Query 1211
Sbjct 30947
30888
Query 1301
Sbjct 31007
Query
Sbjet 31067
30948
Query 14 21
Sbjet 31127
CC TTCTCC ACCTCCT AC GGGAC CTTCTGC T AC GTGCCCC AG AGTGCCTAGAGAACCCTGG
....... ι ι ι ι 1 M I ! ι I I I I I I I I I I I I I I I Il I I I I I ι M ι > ι ι ι ι I I I ! I I 1 ι ι ! ι I
CCTTCTCCACCTCCTACGGGACCTTCTGCTACGTGCCCCAGAGTGCCTAGAGAACCCTGG
CCGTCAGCCGGCCTCCCCCTTCCCATACCACCCGGTAGACCACCCGCTCCATGTTTCTGT
I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I Il I I I M I Il I I I I I Illlllilllllllllllllll
CCGTCAGCCGGCCTCCCCCTTCCCAGGCCACCCGGTACACCACCCGCTCCATGTTTCTGr
1 3 6 1 ATGTGTTCTCCTCCCGCCGCTTGTGCAGCACCACCTCCCGCTGCTCGAGCTGAGGATCCG
i I II I I I I I ι I ι I M M........I I I I I I I I I I.....I .................
310 08 ATGTGTTCTCCTCCCGCCGCTTGTGCAGCACCACCTCCCGCTGCTCGAGCTGAGGATCCG
TGATGGACACAAAGCCAGGAAGACACATCCTCAGCTCCGTGGGGGCGTCCAACAACTGTT
1 ι ι ι 1 i ι ι I i M ι I I η M I : ι ι ι π I I I I I ; I I ι I I I ! I IlI ! M ι ι ι ι M ι ι ι i I I I I
1300
1360
1420
1480
310 68 TG ATGGAC AC AAAGC C AGGAAoAC AC ATCCTC AGC TCCGTGGGGGCGTC C AAC AAC TGTT Query 1481
14 81
SbjCt 31128 T 31128 Score = 429 bits (216), Expect Identities = 487/567 (85%), Gaps Strand=PIus/PIus
2e-116 9/567 (1%)
Query
Sbjct 28978
28919
Query 61
Sbjct 28979 29038
tataaaccagttccaccatgggaccgaagaagcagaagcgcgagctccccgaggacttcg
IIII Il Il Il.....Il I I Il I I I I ι M Il M I I I I I I Μ I I I I I I Il Il I I I I I IM
tatagaccagttccaccatgggaccgaagaagcagaagcgcgagctacccgaggact1cg atccagtctacccctatgacgccccgcagctgcagatcaatccacccttcgtcagcgggg
Il ι ι ι ι ι ι ι Il I Il | ι | Il Il I I I I I Il I I Il Il I I I I I I I..................
atccagtctacccctatgacgtcccgcagctgcagatcaatccacccttcgtcagcgggg
60
120
Query 121
Sbjet 29098
acggattccaccaatccgtggacggggtgctgtccctgcacatcgcaccgcccc tcgtct 180
I I I M Il I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I ι I ι I I I I ι ι ι ι I I I I I I ι ι ι ι ι M I ι Il I I
2 90 3 9 IÍgÍÍUÍaaÍcÀaÍccgÍggacggggtgctgtccctgcacatcgcaccgcccctcgttt
Query 181
Sbjct 29158
29099
Query 241
Sbjet 29218
29159
ttgacaacaccagggccctcaccctggccttcggggatggtctacagctctttaacaaca
I I M I I I I I I I I IlIl I Il I I I 1 I ι ι ι Il I IlI 1 I ι Il I I I I I I I I I I I 111
ÍtcÍÍÍIÍIccagggccctcaccctggccttcgggggaggtctacagctctcgggcaagc
agctcatcgttgccactgagggatcxgggctggtcatcaccacggatggc^gctggtcc
MM! ι ι ι Il 1 I I Il IlllI Il Illll M Il I I I Il I I I I M I I M M '
Í^ÍÍgÍ-ÍgIÍgÜÍccgÍ^Íc^ggggctaaccaccaacccggatggcaagctggttc
Query 301
Sbjet 29276
tccaggtcacctcccccctcaccctagcacccgatggcatctc
M I MII ι M Il I Il I Il I I ι MM Illlll I Il I Il I I Il I I I M
29219 ^aÍagÍcIagÍccÜÍaÍcÍcÜtgaccgccgagggcatct-ccctgtccctggg-tcc
240
300
360
Query
Sbjet 29332
Query
Sbjet 29390
cggtctctctagctcaagatgacaagactcagccstgcaaggtcacatctcccctc 420
...... MII .......M I Il Il I I IMII I ι I Il I Illll MMM
tgcaa-gtcacagctcccctgcagt
361 -----
IMIII Mll Ill Ill Ill I I I Il
2 9277 cggtctttctaactc-aga-gaccggcctcagtc
421 TCCAAAAGCAACTCCCTCGCCCTTTCCCTCGGCAGCGGTC^
MI I MIM I I Il I I Ill Illlll Il I I I I Il Il ι ι ι M IIIII
29333 tcc^gggÍIÍÍgÍÍÍtcactcÍtcccctcgccgccggtctccaaaacaccgatggtgg-
Query 481
Sbjet 29449
cgxagct1otcaagctgggggctggtctcaccacggacaacagtcagtcagtgacagtca • MMII I Il I Il I I I Il Il I Il I I Il Il I I 11 I I I I I Illll M
11111 -accacggacaacagtcaggcggtgaccgttc
480
540
2 9391 -aatgggtgtcaaactggggagcggtctcac
Query 541 Sbjet 29450
aggtgggagacggtcttaagctgaacg
Ullllll I Il III I Il II Il I I
aggtgggaaatggacttcagctgaacg
567
29476
Score = 149 bits (75), Expect = 3e-32 Identities = 164/181 (90%), Gaps = 7/181 (3%) Strand=Plus/PIus
Query 1502
Sbjct 31198
31140
Query 1561
Sbjct 31256
Query
Sbjct 31314
31199
aataaagactcagagaaaaac-aagttcatatgattttttcttttattgattgggggatt
Mini Ill Mllll Illl I lllllll Ml IIIMI I I I I I 1 I I M I I I I Ml M I
aataaagactcagagaaaatccaagttcatatgattttt-cttttattgattgggggaat
TGATTCAGGTGGGGTGTACAT-ATCACnnnnnnnTCACATCAGCAGCTACACCCTGGAAA
MMMIIMI........ M I I I M M M I I M M I M I I I I I I I I IM
TGATTCAGGTGGGGTGTGCATAATCAC—AAAAATCACATCAGCAGGTACACACCTGAGA
162 0 CATTCAGACAGGGGTAAGGACAGCGCCCTCAGCTTCTGGAACAAACATTAGAAAT ATTTA
Il M il I I I Il M M I Il Il I Il I I I Il I M M I I I I M I I Mll I I Il M Il I Il
312 57 CA-TCAGACAGGGGTAAGGACAGCG-CCTCAGCTTCTGGAACAGACATCAGAAATATTTA
1560
1619
1679
Query Sbjct
1680 31315
1680 31315
Score =85.8 bits (43), Expeet = 4e-13 Identities = 43/43 (100%), Gaps = 0/43 (0%) Strand=Plus/PIus
Query 1058
CAGGACTCAGTCCAGCCTGGTTAATGCCAAGCACCTTTATTTA 1100
I I I Il I Il I I I Il I I Il Il Il M I I I I M M I Il I I Il I I I Il Sbjct 29978 caggactcagtccagcctggttaatgccaagcacctttattta 30020
Score =85.8 bits (43), Expect = 4e-13 Identities = 43/43 (100%), Gaps = 0/43 (0%) Strand=PIus/PIus
Query 1058 Sbjct 30702
caggactcagtccagcctggttaatgccaagcacctttattta 1100
ι ι ι ι Μ Il Il Il Il Il I M Il Il Il.....M I M Il I Il M I
caggactcagtccagcctggttaatgccaagcacctttattta 30/44
Score - 77.9 bits (39), Expeet = 9e-ll Identities = 39/39 (100%), Gaps = 0/39 (0%) Strand=PIus/Plus
ouerv 1241 CCTTCTCCACCTCCTACGGGACCTTCTGCTACGTGCCCC 1279
ü Y M M I M I M M M M I........M I I M M M M M
SbjCt 30164 CCTTCTCCACCTCCTACGGGACCTTCTGCTACGTGCCCC
30202
PAdv 2
Estado; Temporariamente completo
969 bases de seqüência de fibras voltadas para o lado direito (rhe).
Boa comparação com PAdV3 em algumas seções (em negrito) que incluem o rhe completo do PAdV3 . Seqüência nova em fonte normal
Ação: 1 primer adicional para rhe AGTGGGGTTCAAAAAAGTT ACAT AAnCGCGCTTCTCGTGC AGAGAGAGCCGGGn AnnGCGCCTCTT
CAGCAGTGGGTCGTGGGCCGTGAGAGGGGGCTGATGGGAAGATGGCCGGTGACTCCTCTCGCCCCG
CTTTCGGCTTCTCCTCGTCTCGCTCTCCTTGTCTCTCTCTGTGTCAGCGCAGAAACTAGTGTGAGC
GAACAACGCGAGGGGGCCGGTGATATACCCnCAGCTGATGTGGCCACAGCTGCTATCGGnTAATCA
CTACCCCATCGTACGATCGnAATTCCCCCGCCTCCTCGTTnCGATTAACCCACCCAGAAGTCTCGG
GAATTCCCGCCAGCCGGGCTCCGACCCGCGACGTGCGGACTTTGACCCCGCnCCTCGGACATTGAC
CGGTCCCACGCCACGTCACTTTCCCACTCGACGTCCCGTTCCCGCGCTnCGTCACACCCCTCTCCA
TGAATCTGCTGCAACCGCCTCGAACCCTCTCTTCCAATCAACTCGCCATTAAAGGGGCAATAAAAG
TGTAGGGTATATGGATTGATGATGGCCCAGGTGACCAGGTCCGAGCGCTTGATCGATTCCGTGGGA
AGTGGATGTCAGCTAAGCTCCTAATGACAACCGCCAACCACGGCTGCAGAAGCTCTTCCCTCTAGA
GACGCGAGCTAGCATAGACATACTCCATCTATACACTCGCCGTAGACAATGTCATACGCAAATGGG
AGGACTAAGGACATCCCGGATCCACCACCTGGGATGTACTCCATCCATCGGGACACTTAAACAGCA
ATAAGAAAGACGCAATTGTTGACGCAGAAATTTGGCTAGAGAGGCGGGCAGGACTCATGAGCCTAG
AGACCACCCAATTGGGAAAGTGACCTCCCCTCCCCCCGTGGAAAACGTGGTATCAAACGAG ATCGA
CAATGCAATTCGGTCACTTTAGGGGTACGAGGATATATCACGGA
C2 versus banco de dados
Genoma de adenovírus suíno de sorotipo 3, filtração IAF
Comprimento = 34094
Score = 480 bits (242), Identitiea = 419/475 (88 Strand=Plus/PIus
Expect = 4e-132 O, Gaps = 5/475 (1%)
Query 67
Sbjct 33672
Sbjct 33792
Sbjct 33852
33613
Query 127
Sbjct 33732
Query 187
33733
Query 24 7
Query 306
Sbjet 33909
Query 366
Sbjet 33968
Query 426
CAGCAGTGGGTCGTGGGCCGTGAGAGGGGGCTGATGGGAAGATGGCCGGTGAnnnnnnnn 126
ι ι ι ι ι Il I Il Il I I I I I I I I I I Il I Il I I I I I I I I I I I I M I I I I I..........
CAGCAGTCGGTCGTGGGCCATGAGAGGGGGCTGATGGGAAGATGGCCGGTGACTCCTCTC
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGTGTCAGCGCAGAA
Μ......mil I I I I I I I I I I Il I I I 1 1 I I I I I I 1 I Il I M I I M I I M I I Il
33673 GCCCCGCTTTCGGTTTCTCCTCGTCTCGCTCTCAGTGTCTCTCTCTGTGTCAGCGCCGAG
ACTAGTGTGAGCGAACAACGCGAGGGGGCCGGTGATATACCCNCAGCTGATGTGGCCACA
.....I I IIIMII I I IIIMI I I I I I I M M I I M I I I IMI Il I I I MM M
ACGAGTGTGAGCGAACACCGCGAGCGGGCCGGTGATATACCCACAGCGGATGTGGCCACG
GCTGCTATCGGNTAATCACTACCCCATCGTACGATCGNAATTCCCCCGCCTC
IMI IIiI I I M I I I I Il Il I I ........ I I I Il Il II I Il Il I Illl
3 37 93 CCTGCGGTCGGTTAATCAGTACCCCATCGTCCGATCGGAATTCCCCCGCCTCCGCGTTAA
CGATTAACCCACCCAGAAGTCTCGGGAATTCCCGCCAGCCGGGCTCCGACCCGCGACGTG
IMIMM.......Il I I I I I I I M I I M I M I M M IIIMII I I I I I M Il
3 3853 CGATTAACCCGCCCAGAAGTCCCGGGAATTCCCGCCAGCC-GGCTCCG CCGCGACCTG
33910
186
246
TCCTCGTT-N 30 5
CGGACTTTGACCCCGCNCCTCGGACATTGACCGGTCCCACGCCACGTCACTTTCCCACTC
ι IIIIM.......I MIMlM I.....I ......MMMII I I I M 1 I I I
C-GACTTTGACCCCGCCCCTCGGACTTTGACCGTTCCCACGCCACGTCATTTTCCCACGC GACGTCCCGTTCCCGCGCTNCGTCACACCCCTCTCCATGAATCTGCTGCAACCGC CTCGA
Mllll I I I I Il I Illl Il I I IlIl I I I I I I Il I MII ι ι MIII I I
365
425
485 Sbjct 33969 GACGTCACGTTCCCACGCTACGTCACACCCCTCTCCACCAATCACCGCCCGCCGCCCCCA
34028
Query 486 ACCCTCTCTTCCAATCAACTCGCCATTAAAGGGGCAATAAAAGTGTAGGGTATAT 540
MMIIM MMIII I IIMI I M I Il Il I I Il Il I Il Il MIMII
Sbjct 3 402 9 ACCCTCTCCGCCAATCACCACGCCACAAAAGGGGCAATAAAAGTGTGCGGTATAT 3 408 3
Segundo grupo dos dados de seqüência PAdV 2
Estado; Temporariamente completo
1176 bases de seqüência dando bom resultado em comparação com PAdV3, porém em orientação reversa ao lado esquerdo (negrito) sugerindo que último primer removeu gradualmente ambos finais do genoma provavelmente a partir de ITR e entregou informação seqüenciada ambivalente.
aaaaaaggcaggagcgatgattgatagctcgaggaatagctcagtcaccacatcccttccctgcac
c act tat aagggtat at at aggcagagacacagacaat cagt c atcatc acatgct gttt att gag gttaatgattaatcgcgggggcgcttcatagacaggtccaaaggttgttcgctgcatgagtcatag cagtacttcctcttgcgtcctggcaggtctccaagtcccggggaacccgacctgtgaggt gctgga
gaaac agcttct aaaaag ac aaaaaatgggaaat agc ac atgagatttctt ac aagc ac^
TTTTTTTCCACATAATCCCACAAATGTCCAAAAACACTCACCATAGACAGCAAAGGCATGCATCCT CATGTAGCACAGACTGCACTTCAGATTGGGGTCCTTGGAGTGAAAGCGATGGTAATCACAAGAGCG
SESESSS^^
CCACTCGTCCGGCAGTCCATCGACCAGACTCTCCCAGCACGGCT
AGAGGGGTCGCGCAGATCCACCGGGTCCCATTCCAGCACCGGCACCACCTCGGGGTTTCCGTCCCA GTCCAGGTGAAGTCTGTTCGCCATGTCGAGGGTCTGTTCCGCTGAGAGAAAACTCTACTCCCTTCG
GACTCAAGAGTAGTGACTCTCGGGCGCTGCGCGGACTATATACACTGAGGAGAAAAAATACACCCA
CACACGTCATCTCGGGCGGGCGCCGCGACCTCTCAGCGCGAAGGAAACCCCGGCTCAGGTGAATGG
tgtcccgtcgtcagtggggatacgagcggcgacggtgtgtggaaatgccacaccggagggcgaggg
t cagtcc aaaagc aaaaattcccgct aacttccacttgttggaaat atctctgc
C2 versus base de dados
Genoma completo de adenovirus suíno sorotipo 3, filtragem IAF.
Comprimento = 34094 Query 458
Sbjct 957
Query 518
Sbjct 897
Query 578
Sbjct 837
Query 638
Sbjct 777
Query 698
Sbjct 717
Query 758
Sbjct 657
Qusry 818
Sbjct 597
Query 878
Sbjet 537
Query 938
Sbjet 477
Query 998
Sbjet 417
gagcggcagttcacaccaggtacctcggggcagtccaacacaaacggagagggtggcgca
IMlllllllllllMllllllllMlllllllllllillllllllllllNliIIIIII
gagcggcagttcacaccaggtacctcggggcagtccaacacaaacggagagggtggcgca
517
ϊ 9 8
agtgggtcctcaaacaccacatcagccagttcagacagcacctccgcagccaccgcgctg 57 7
MllllllllMllllllMllMllllllllMlllllllllllMllllIIIIiMII
agtgggtcctcaaacaccacatcagccagttcagacagcacctccgcagccaccgcgctg
838
ATATCCTCCTCATTACTGTCCCCCTCTTCTGGGGGGTCCATCTCAAAGACCCCCTGAGAG 637
Μ Il Il............Il Il Il Il Il Il M.....Il I Il I I Il Il I Il Μ I M Il Μ
ATATCCTCCTCATTACTGTCCCCCTCTTCTGGGGGGTCCATCTCAAAGACCCCCTGAGAG / '«
697
CCACCTGAGTCACCAGCGGCACTCCCACCACTGTCCTCAGCTACACCCCCCTCAGTCACA
ι Il Il.......Il I Il Il I I Il I I I I Il M M Il I I I I I M M I I I Il Il M I II
CCACCTGAGTCACCAGCGGCACTCCCACCACTGTCCTCTGACTCACCCCCCTCAGTCACA ATCACCTCCACCTCGTCCACACTGTCCAGCCACTCGTCCGGCAGTCCATCGACCAGACTC
IlIl I Il Il Il I Il I I Il.......Il I I Il I Il Il Il I Il I Il I Il I M I M Il I M I I
ATCACCTCCACCTCGTCCACACTGTCCAGCCACTCGTCCGGCAGTCCATCGACCAGACTC TCCCAGCACGGCTCACAGAAGCCCTCATCCCCCGGAGAGGGGTCGCGCAGATCCACCGGG 817
Il Μ I Il I Il I Il I I IlIl I IlIl Il I I Il I Il Il IlIlIl I I I I Il Il Il I I
718
757
658
IIII
TCCCAGCACGGCTCACAGAAGCCCTCATCCCCCGGAGAGGGGTCGCGCAGATCC ACCGGG TCCCATTCCAGCACCGGCACCACCTCGGGGTTTCCGTCCCAGTCCAGGTGAAGTCTGTTC
M I I I I I M M M I I I M I M M M M I I M M M I I M I I I I M M M I M I I I M 1 M
TCCCATTCCAGCACCGGCACCACCTCGGGGTTTCCGTCCCAGTCCAGGTGAAGTCTG1TC
Query 1057 TGTC-CCGTCGTCAG 1070
Illl Il I Il Il Il I Sbjet 358 TGTCACCGTCGTCAG 344
598
ϊ 7 7
538
937
gccatgtcgagggtctgttccgctgagagaaaactctactcccttcggactcaagagtag
I ι ι ι ι μ I Il M M M Il Il M M I I Il M M I Il Il M......M M I I 1 I Il IMM
gccatgtcgagggtctgttccgctgagagaaaactctactcccttcggactcaagagtag 4 7
tgactctcgggcgctgcgcggactatatacactgaggagaaaaaatacacccacacacgt
π Μ M Il Il Il I I I Il I Il Il I Il Il I Il Il..... 1 I Il 11 11 I I IlIlIl I Il M I
tcÍcÍctcgggcgctgcgcggactatatacactgaggggaaaaaatacac
catctcgggcgggcgccgc-gacctctcagcgcgaaggaaaccccggctcaggtgaatgg
ι II M M M I M IIIIIi Il Il I Μ I I Il I I Il Il I I Il I Il M Il I Il Il I Ill
ÍÍÍÜcÍggcgÍccgc^ÍggÍÍcÍctcagcgcgaaggacacccc-gctcaggtgagtgg
997
418
1056
359
Reverse complement of contig
gcagagatatttccaacaagtggaagttagcgggaatttttgcttttggactgaccctcgccctcc
™ttctctcagcggaacagacc ctcgacatggcgaacagacttcacctggactgggacggaaac
PCCGAGSGSGCC^
cccrr^
PArrAGGTGGAGGTGATTGTGACTGAGGGGGGTGTAGCTGAGGACAGTG
cactcaggtggctctcagggggtctttgagatggacccc^ GCGCCACCCTCTCCGTTTGTGTTGGACTGCCCCGAGGTACCTGGTGTGAACTGCCGCTCTTGTGAT T ACC ATCGCT TTC ACTCC AAGGACCCCAATCTGAAGTGCAGTCTGT GCT ACAT GAGGATGC ATGCC TTTGCTGTCTATGGTGAGTGTT TTTGGAC ATTTGTGGGAT TAT GTGGAAAAAAAGGAAAAAGTGCT TGTAAGAAATCTCATGTGCTATTTCCCATTTTTTGTCTTTTTAGAAGCTGTTTCTCCAGCACCTCA C AGGT CGGGT TCCCCGGGACTTGGAGACCTGCCAGGACGCAAGAGG AAGT ACTGCT AT GACT C ATG C AGCGAAC AACCT TTGG ACCTGTCTATGAAGCGCCCCCGCGATT AATC ATT AACCT C AATAAAC AG CATGTGATGATGACTGATTGTCTGTGTCTCTGCCTATATATACCCTTATAAGTGGTGCAGGGAAGG
GATGTGGTGACTGAGCTATTCCTCGAGCTATCAATCATCGCTCCTGCCTTTTTT
Genoma completo de adenovírus suíno sorotipo 3, filtraçao IAF.
Comprimento = 34 094
Score - 1861 bits (939), Expect = Identities = 1027/1044 (98%), Gaps Strand=PIus/Plus
0.0
- 9/1044 (0%)
;-GCGG 163
Query 106 Sbjct 344 Query 164 Sbjct 403 Query 224 Sbjct 463 Query 284 Sbjet 523 Query 344 Sbjct 583 Query 404 Sbjet 643 Query 464 Sbjet 703 Query 524 Sbjet 763 Query 584 Sbjet 823 Query 644 Sbjet 883 Query 704 Sbjct 943
CTGACGACGG-GACACCATTCACCTGAGCCGGGGTTTCCITCGCGCTGAGAGGTC-
I I M I I I I I I I I I I 1 I I I I Il I I ι Il ι I M I I I II 1 I I I I 111 I M Il I I I Mll
CT
CGCCCGCCCGAGATGACGTGTGTGGGTGTATTTrrrCTCCTCAGTC
II ι ι ι ι M I I I I I I I I 1 I I I I M Il Il I I M 1 I Il I I I I I I I I I I I I 1 I 1 1 1 1 1 11 1 1
AGCGCCCGAGAGTCACTACTCTTGAGTCCGAAGGGAGTAGAGTTTTCTCTCAGCGGAACA
ι ι ι M ι I M I M Il I I I I I I ι ι ι ι μ ι I I I I Il ι ι Il I Il I I I I I ι I ι ι ι μ I I I ι ι ι μ
ÍÍÜÜcÍÍÍÍctcÍc^cÍctÍgagtccgaagggagtagagttttctctcagcggaaca
gaccctcgacatggcgaacagacttcacctggactgggacgg^ ...................................................
ÍmÍctcÍÍcmoÍÜIÍÍÍgÍcttcacctggactgggacggaaaccccgaggtggtgcc
ggtgctggaatgggacccggtggatctgcgcgacccctctccgggggatgagggcttc
■ , M ι ι Μ ι 1 ι II I I Il 1 I I I I I M I I I M I M Il I I I M I I ......... 1 1 1 1 1 111'
ÍctÍÍtcgIÍtcggacccggtggatctgcgcgacccctctccgggggatgagggcttctg
tgagccgxgctgggagagtctggtcgatggactgccggacgagtggctggacagtgtgga
,...... II M I I I M M I M I I I I I I I Il I I I I Il I I I Il M I Il Il I I I I I I Il I I I
Í^ÍÍ^Íc^ggIÍÍÍÍÍtggÍcÍÁtggactgccggacgagtggctggacagtgtgga
cgaggtggaggtgattgtgactgaggggggtgtagctgaggacact
223
I I
ι I I I I Il I I I I Il Il I Il I I I I I I I Il I
462
283
522
343
582
403
642
463
702
523
762
CGAGGTGI
gaggtgattgtgactgaggggggtgagtcagaggacagtggtgggagtgccgc tggtgactcaggtggctctcagggggtctttgagatggacc^
μ μ ι I I 1 I I I Il Il Il Il I Il I I I I I I I Il I I I I I I I I I I Il M I I I I I I Il I I Il I Il
UÍÍÍÍcÍcÍ^tggcÍctcaÍggggtctttgagaxggaccccccagaagagggggacag
TAATGAGGAGGATATCAGCGCGGTGGCTGCGGAGGTGCTGTCTGAACTGGCTGAT
ι M ι I I M I Il I I I Il I I I I Il I I I I I I I I I IlIi Il I Il Il I I I I M Il I Il Il I Il M IaIÍgÍÍgÍggÍtÍÍcagcÍcggtggcigcggaggtgctgtctgaactggctgatgtggt
gtttgaggacccacttgcgccaccctctccgtttgtgttggactgccccgaggta^
ι μ I I M Ml I I I M I Il I I I Il Il I I I Il Il I I I Il I I I I I Il I I I I I11 I Il I I Il M iií^iüicciicÍTGcicCACCCTCTCCGTTTGTGTTGGACTGCCCCGAGGTACCTGG
tgtgaactgccgctcxtgtgattaccatcgctttcactccaaggacccc^tcxg^gtg 763
, M , ι , M ι II ι Μ ι ι ι ι II ........I M I Il I I I I I I Il I I Il I I I Il Μ Il I I Μ I
Íct^ÍÍccgÍtÍÍUÍgatÍaccatcgctttcactccaaggaccccaatctgaagtg
583
822
643
882
703
942
1002 Query 7 64 Sbjct 1003 Query 824 Sbjct 1063 Query 884 Sbjct 1123 Query 944 Sbjct 1183 Query 1004 Sbjct 1243 Query 1064 Sbjet 1303 Query 1122 Sbjet 1359
CAGTCTGTGCTACATGAGGATGCATGCCTTTGCTGTCTATGGTGAGTGTTTTTGGACATT
III I I I I I I I I I I I Il I Il I I I I I Il I I I Il Il 111IIIII11 M I I I M I I I I I M 111
CAGTCTGTGCTACATGAGGATGCATGCCTTTGCTGTCTATGGTGAGTGTTTTTGGACATT
823 1062
TGTGGGATTATGTGGnnnnnnnnnnnnnnGTGCTTGTAAGAAATCTCATGTGCTATTTCC 883
IMlllMMMlMMllllllMMlMlllMMilMlMlMlllMMIIIIIl
TGTGGGATTATGTGGAAAAAAAGGAAAAAGTGCTTGTAAGAAATCTCATGTGCTATTTCC 1122
CATTTTTTGTCTTTTTAGAAGCTGTTTCTCCAGCACCTCACAGGTCGGGTTCCCCGGGAC 943
Il I Il I Il I Il I Il Il Il Il M Il I Il Il Il11Il Il I Il I IlIl I 11 I Il Il Il Il Il I
CATTTTTTGTCTTTTTAGAAGCTGTTTCTCCAGCACCTCACAGGTCGGGTTCCCCGGGAC 11H
TTGGAGACCTGCCAGGACGCAAGAGGAAGTACTGCTATGACTCATGCAGCGAACAACCTT 1003
M Il I IlIlIl I Il I Il I Il IlIl I Il I Il M I IlIlIl I Il I Il Il I 1.....I.....
TTGGAGACCTGCCAGGACGCAAGAGGAAGTACTGCTATGACTCATGCAGCGAACAACCTT 12 4^
TGGACCTGTCTATGAAGCGCCCCCGCGATTAATCATTAACCTCAATAAACAGCATGTGAT 1063
ι Il M I M M I I I M M I M M M I I I.......I M I M I M Il M I Il I M M I I M I
TGGACCTGTCTATGAAGCGCCCCCGCGATTAATCATTAACCTCAATAAACAGCATGTGAl 130 2
1121
GATGACTGATTGTCTGTGTCTCTGCCTATATATACCCTT-----GTGGTTTGCAGGGAAGG 135 8
GATGACTGATTGTCTGTGTCTCTGCCTATATATACCCTTATAAGTGG—TGCAGGGAAGG
Μ 1 I Il Il I Il Il 1 I Il I I Il1Il I IlIlIl1Il Il Il Illl Il Il Il I Il Il
GATGTGGTGACTGAGCTATTCCTC 114 5 IlIlIlIl Il Il Il Il Il I Il I Il GATGTGGTGACTGAGCTATTCCTC 1382
PAdV4
Estado = Incompleto
2250 bases de seqüência da fibra voltada para porção final direita (rhe).
Boa comparação com fibra PAdV4 (negrito) , porém todas as
seqüências subseqüentes são novas.
Nenhum tamanho conhecido para genoma PAdV 4.
Ação: Pelo menos 2 primers a mais para completar
Contig Length: Dases
AACCCACCTGGAACACCAAGTGCCAGATGCTCCAGTTTTTTCTACCGCGGGAGTTTCGAAAGTTTA CCCTCAGATACTGTAGTCAGACACAAAGATGTAACTGCCWGCATGAGAAAGTTTATTGGCAATAAA GCTACTGGAAACGATGCGTGTGGTGATCTTTCCCCCTCCCCCAAATTTCATTTTGTAACATACCCT
atgggaaggccccggcccacagtcagccacagtctcaagttgctccagctcaggtgaggtaatgct gatgaacccaggcgatatcagtctcgcatccaaggtgtgatccaaactctgtg aaaatc at actcc gcttgtaaactttcgccaaggcaccggggttccatacaccatcaatcttcgcagacgtcgccgccg tgcgccgtcccgaaaagccgggtagaacactctcggtcgaggtcccccaactctc agc aacct aaa
agcctcctgaagcaactccctgctctgaaccgcacactgcctcacatcacgttcatgcagagacat ac atcc agt ac ac aagcgt ataaagt agt aatt agttgc agtac agagaaatttcacagacgggcc
tgacagttgctgcttcaaaagccaaaagtcattcccctgtctgcagcaaaacaccacaaagtgcag ccccgccaccatataggagcccctgcaagagatagctttaggtaagtcaacacacaccctcttctg
C AT ACC AGATG AAGCTGCGGTT AAAGAAACAGCCCCTGGGATCAC AGACGT AGCC AAAGGTCT TCA CCACCACACTCCTAGCCCTACATTGCAAGAGAGTGRGGGCTGTCaCAGKTGRMCAATGTATAGAAA GCACCTCTCGACCATACAAGTAATTt CCCC SAAWaCAGATt Gt TTAACTCCAAGGSCCCGGGGgcC AGACCCATCCCAGTt CTACGGAGACATTGCAAAGTGGAGCCAGAAGCAACCAAATCCCAAGGCACC GGAAGATCTAAGTAAGCTGTGAAACATGCTGCAGGTGGAGTGGTGCTTACCGCTCC AACT AGATGC
TTAGAGTCACATGGTTCAACAGAAGTCATTGTCCTGGAAGAGGAAGAGGGAAAGCATTAAAGCACC
GAAACAGCTCAATGGGGGGGCTGGTGTGGTACACAGCCACCATACGGGAACCAAGAAAAGTCAACA
GGCCAGAGGCCAAATCCTGCTGGGACTCCGGAGTTGCAAACAGCCGAGAGCCCGCCGTGACTGTGA
TAGTGTGCCTGCCTTGAGGTAAATCAAGCATGCAGCAACAATGCAGAAAAGACTCAGAGCGAGTAC
CAGGGCGAGTTTCCAAATCAAAGCGAATCAGCAAGTAATCATAAACCAAGGATCTGATCACATCCA
gCCAAAGSWCKWCMCGAAGGCAAAGTAGGATCCCCTGGCACATCCGTGATGTACAGGTGCCAGGAC
CAAGCGCTGTACACGAAAGTGCCGGACGCCATCTTGCGTACAGATCACTGACCCGTGGAGCCGAAA
CCGCCGGCACCCCTGTCGGTAGGCTGCAGGTCGTCCACCAGCTGGCACACGGGTCTCTCAAATTTC
AGGAAAACCAGCTGCGCGATCCGGTCCCCGGGAGCGATAAACACAGGCAGAGGCCCACTGTTCGCC
AACAGCACTTTCACTCGCCTGTAAGTCCGGGTCAATTGTTCCCGCACAGACGTACACGCCGCGCAA
CGACAACTCGATCGTGAAAAAATCTGCCCGTAGGGCCCAGGCGGAGGACTTATGGCGATCCCAGAA
CGGATGATAGTTCGGTCCCCCGGTTCCATGATACGAGCCTCCGGCGAGCAAAACGTCT ATCCC CCG
TGAAGCCGCCGTACCGAAAACAGCCGGCCCCCCCCGTCCCGCTAACTTCCCCTT TAAGAT CCGGAG TGGTCCTGACGGCTCAGAGGGAAAAACCGCGAAAAAATTCCGCGAACTCCGCAAAAACCCGAACGG AGTACCGCCCCCGGGAATCCGTGAACTGACATTGGCCGACTTTTATGGCGCCCGGCATGTCGATAG
T GAC AAT ACGGGAAGGGAACC AATTCACGCATT CTGGGC AGTGTGGGAGAAAGCGGACTT AC ACAA
TGTGTCTTCGCACCACGGGAAAAGATTACTCGATACCTCATAAGGTGATG
Gene de proteína de fibra suposta , Cds completos. Comprimento = 2 559
Score = 297 bits (149), Expect = le-76 Identities = 179/187 (95%), Gaps = 2/187 (1%) Strand=Plus/Plus
Query 1 AACCCACCTGGAACACCAAGTGCCAGATGCTCCAGTTTTTTCTrA^ ^0
0 Y I I M Μ I I I I I I I ! M ! I I M I I ι Il Il I I I I I I I I I I 1 I I I M I I I I .........
SbjCt 2360 241
Query 61 agtttaccctcagatactgtagtcagacacaaagatgtaactgccwgcatgaga^gttt 120
IIMIIM MMMIM UM Il Mlllll! Il Il M I Il Il Il MMIMI Ml IM
Sbjct 2420 ÍgÍUacÍcIcAG^ACTGTAGTCAGACACAAAGATGTAACTGCTTGCATGAGAAAGTTT 2479 Query 121 ATTGGCAATAAAGCTACTGGAAACGATGCGTGTGGT-GATC-TTTCCCCCTCCCCC^ 178
Ml IIIMMMM M I I I I M I I I I I I I I M Il Mli I M M I M M M M I I M
Sbjet 2480 Ít^GCAATAAAGCTCCTGGAAACGATGCGTGTGGTGGATCTTTTCCCCCTCCCCCAAAT 2539
Query 17 9 TTCATTT 185 Mlllll
SbjCt 2540 TTCATTT 2546
Claims (41)
1. Vetor adenoviral recombinante caracterizado por compreender um adenovírus que compreende um gene de fibra nativo para o referido adenovírus e ainda compreende um gene de uma segunda fibra que é heterólogo para o referido adenovírus, em que o referido gene de uma segunda fibra é adquirido pelo referido adenovírus recombinante por crescimento do referido adenovírus recombinante em uma linhagem celular que expressa de forma estável o referido gene de uma segunda fibra.
2. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vetor adenoviral é um vetor adenoviral selecionado do grupo que consiste em adenovírus suíno, humano, aviário, bovino, eqüino e ovino.
3. Composição caracterizada por compreender o vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3 caracterizada por compreender ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
5. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus suíno recombinante selecionado do grupo que consiste em PAdV recombinante-1, PAdV recombinante-2, PAdV recombinante-3, PAdV recombinante-4 , PAdV recombinante-5, PAdV recombinante- 6 e PAdV recombinante- 7.
6. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus humano recombinante (HAdV), um adenovírus bovino recombinante (BAdV), um adenovírus ovino recombinante (OAdV), um adenovírus murídeo recombinante (MAdV), um adenovírus símio recombinante (SAdV) ou um adenovírus canino recombinante (CAdV).
7. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida proteína da segunda fibra é a proteína de fibra selecionada de PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 e PAdV-5.
8. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vetor adenoviral recombinante ainda compreende proteína de uma terceira fibra que é diferente da referida proteína da primeira ou da referida proteína da segunda fibra.
9. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido PAdV recombinante é PAdV recombinante- 3.
10. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vetor recombinante compreende a proteína da fibra de PAdV-4 .
11. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido vetor adenoviral recombinante é replicação-competente.
12. Vetor adenoviral suíno recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido PAdV recombinante possui um defeito na replicação.
13. Vetor adenoviral suíno recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido PAdV recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região essencial do genoma do PAdV e a referida linhagem celular que expressa de forma estável o referido gene de fibra também expressa a região essencial do genoma do PAdV na qual a seqüência de nucleotídeos heteróloga foi inserida.
14. Vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido adenovírus recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região não essencial do genoma adenoviral.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência de nucleotídeos heteróloga é um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um hormônio do crescimento e uma citocina.
16. Célula hospedeira caracterizada por compreender um adenovírus que compreende um gene de fibra nativo para o referido adenovírus suíno e em que a referida célula hospedeira é uma célula recombinante que expressa um gene de fibra que é heterólogo para o referido adenovírus e é capaz de ser infectada por adenovírus suíno.
17. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula mamífera ou uma célula aviária.
18. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula mamífera selecionada do grupo que consiste em uma célula suína, uma célula humana, uma célula bovina e uma célula ovina.
19. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma célula suína recombinante.
20. Composição capaz de induzir uma resposta imunológica em um indivíduo mamífero, a referida composição caracterizada por compreender um vetor adenoviral recombinante, de acordo com a reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. Método para despertar uma resposta imunológica em um indivíduo mamífero caracterizado por compreender a administração de uma composição de acordo com a reivindicação 20 ao indivíduo mamífero.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo mamífero é um porco.
23. Método de preparação de um adenovírus caracterizado por compreender: a. o cultivo de uma célula hospedeira recombinante que expressa um gene de fibra adenoviral sob condições adequadas à infecção da referida célula com adenovírus, b. o contato da referida célula com um vetor de adenovírus recombinante que compreende a(s) seqüência (s) do adenovírus essencial para encapsidação e um gene heterólogo que codifica uma proteína heteróloga e em que o referido adenovírus recombinante compreende um gene de fibra que é diferente do gene de fibra na referida célula hospedeira; e, opcionalmente, a coleta do referido adenovírus.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral coletado compreende uma especificidade tecidual mais ampla, comparado com o vetor adenoviral que não entra em contato com a referida célula hospedeira recombinante.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido vetor adenoviral é opcionalmente eliminado em parte ou em toda uma ou mais proteínas adenovirais que não são essenciais para a replicação.
26. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um hormônio do crescimento e uma citocina.
27. Vacina para a proteção de um hospedeiro mamífero contra infecção caracterizada por compreender o vetor de adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 1 e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.
28. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida região não essencial é selecionada do grupo que consiste na região E3, ORF 1-2 e 4-7 de E4, a região entre a extremidade de E4 e a ITR do genoma do adenovírus suíno.
29. Composição caracterizada por compreender uma célula hospedeira que expressa um gene de fibra adenoviral e um vetor adenoviral recombinante que compreende ácido nucléico que codifica uma proteína heteróloga sob o controle de uma seqüência de controle de expressão, em que o referido vetor adenoviral recombinante compreende um gene de fibra que é nativo para o adenovírus do referido vetor.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 29 caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira foi infectada com o referido vetor adenoviral suíno recombinante.
31. Método de vacinação de um animal caracterizado por compreender a administração ao referido animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina de acordo com a reivindicação 27.
32. Método para aumento da especificidade celular para o tecido do hospedeiro de um vetor de adenovírus recombinante caracterizado por compreender o crescimento do referido adenovírus recombinante em uma célula hospedeira que compreende uma proteína da segunda fibra que é diferente da proteína da fibra do referido adenovírus recombinante.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido vetor de adenovírus recombinante é um adenovírus suíno recombinante selecionado do adenovírus PADV recombinante-1, PADV recombinante-2, PADV recombinante-3 , PADV recombinante-4 e PADV recombinante-5 .
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a referida proteína da segunda fibra é a proteína de fibra selecionada de PADV-1, PADV-2, PADV-3, PADV-4 e PADV-5.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante ainda compreende proteína de uma terceira fibra que é diferente da proteína da referida primeira fibra ou da referida proteína da segunda fibra.
36. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante é PADV recombinante-3.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante-3 compreende a proteína da fibra de PADV-4.
38. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante é replicação-competente.
39. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante possui a replicação defeituosa.
40. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido PADV recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos heteróloga inserida em uma região não essencial do genoma do PADV.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência de nucleotídeos heteróloga é um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em um imunomodulador, um antígeno, um patógeno, um polipeptídeo imunogênico, um polipeptídeo terapêutico, um hormônio do crescimento e uma citocina.
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