JP2009544303A - 組換え型アデノウイルスベクターの組織親和性を増大させるための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換え型アデノウイルスの組織親和性(tissue tropism)を増大させるための方法および組成物であって、組換え型アデノウイルスに第2の繊維を提供する組換え細胞を使用し、それによって組換え型アデノウイルスの親和性を変更することを含む方法および組成物に関する。本発明はまた、親和性が変更された組換え型アデノウイルスを製造および使用する方法に関する。
アデノウイルスは、腸感染症または呼吸感染症をヒト並びに家畜および実験用動物に生じる。アデノウイルス繊維タンパク質は、感受性の宿主細胞中への侵入を促進する特異的細胞受容体と相互作用することによって、ウイルスの付着に必須の役割を果たす。したがって、繊維タンパク質は、特定のアデノウイルスの特異的な組織親和性を決定する(非特許文献1)。したがって、この繊維は、標的細胞に対するビリオンの付着において、最も重要なウイルス表面分子であると考えられる。
本発明は、第2の繊維遺伝子を組換え型アデノウイルスゲノム中に遺伝子挿入することを必要とせずに、第2の繊維の添加を組換え型アデノウイルスベクターに提供するために、繊維タンパク質を発現する細胞株を活用する。そのため、これらの細胞、およびこの細胞を使用する方法は、特定のアデノウイルスの特異的な組織親和性を増大させることを可能にする。さらに、第2遺伝子を組換え型アデノウイルス中に遺伝子挿入する必要がないという事実によって、ウイルスゲノム中でより大きな空間を外来遺伝子の挿入に使用することが可能になる。
本発明は、改良されたアデノウイルスベクターの知見および構築に関連する。本明細書に記載する方法および組成物は、ブタアデノウイルスベクターをモデルシステムとして使用して例示されるが、本発明の方法を、ブタ以外の宿主に感染する組換え型アデノウイルスベクターを調製する際の使用に容易に適応させることができることは、容易に明らかである。本発明の方法および組成物は、組換え型アデノウイルスベクターの親和性を変更し、それによって、このベクターが通常はベクターが感染しない組織を標的とするようにしてこのベクターの有用性を高めるために使用される。本発明では、第2の繊維遺伝子を、このような第2の繊維遺伝子を発現する細胞株中で、組換え型アデノウイルスベクターを増殖させることによって組換え型アデノウイルスに提供し、このような細胞株中の増殖が、組換え型アデノウイルスベクターの親和性の変化に関連する。組換え型アデノウイルスを繁殖させる細胞株中に含まれる第2の繊維は、細胞株中の繊維遺伝子が特異的である組織にアデノウイルスが感染することを可能にする。この知見を活用するための方法および組成物が、本発明により意図されている。
本発明は、これらのベクターの親和性を変更するために、組換え型アデノウイルスに第2の繊維を提供する。好ましい実施態様では、本発明の方法は、組換え型ブタアデノウイルスベクターの親和性を変更することを包含する。PAdV感染症は、脳炎、肺炎、腎臓障害および下痢と関連付けられた。(Derbyshire(1992年)In:「Diseases of Swine」(編集者Leman等),第7版,Iowa State University Press、Ames,Iowa.225〜227ページ)。さらに、PAdVは、感染した子豚の腸における体液性応答および粘膜抗体応答の両方を刺激することができる。Tuboly等(1993年)Res.in Vet.Sci.54:345〜350ページ。記載されている少なくとも5つのPAdV血清型がある(PAdV−1、PAdV−2、PAdV−3、PAdV−4、PAdV−5;Derbyshire等(1975年)J.Comp.Pathol.85:437〜443ページ;およびHirahara等(1990年)Jpn.J.Vet.Sci.52:407〜409ページ)。これらの血清型の各々は、たとえばブタ用のワクチン製造に使用される組換え型アデノウイルスベクターを調製するために、容易に使用することができる。PAdV−3の配列全体はクローニングされた(Reddy等、1998年;米国特許第6,492,343号、引用することにより本明細書に援用する)。さらに、制限マッピングを使用し、制限フラグメントをクローニングすることで、PAdDV−3並びにPAdV−1およびPAdV−2のゲノムの広範囲にわたる特徴付けが行われている。Reddy等(1993年)Intervirology 36:161−168;Reddy等(1995b)Arch.Virol.140:195〜200ページを参照。
細胞およびウイルス:American Type Culture Collection番号CCL−33(ATCC−CCL−33)から取得したブタ腎臓細胞(PK−15)を、5%のウシ胎児血清(FCS)、10mMのN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタン−スルホン酸(HEPES)、1%のピルビン酸Naおよび2mMのグルタミンを補充したEarleの改変イーグル培地(EMEM)中で増殖させた。United States Department of Agriculture−Animal and Plant Health Inspection Services(USDA−APHIS)からのブタ睾丸細胞(ST)を、10%FCS、10mM HEPES、1%ピルビン酸Na、0.25%ラクトアルブミン加水分解物(LAH)および2mMのグルタミンを補充したEMEM中で維持した。
0日目:すべてのブタを採血し、ワクチンを接種した
グループ1:第1回用量−2×105 TCID50非改変rPAdV−gp55ワクチンを皮下注射
グループ2:第1回用量−2×105 TCID50改変rPAdV−gp55を皮下注射
グループ3:第1回用量−2×105 TCID50改変rPAdV−gp55を経口経路
22日目:
グループ1:第2回ブースター用量−2×105 TCID50非改変rPAdV−gp55ワクチンを皮下注射
グループ2:第2回ブースター用量−2×105 TCID50改変PAdV−gp55ワクチンを皮下注射
グループ3:第2回ブースター用量−2×105 TCID50改変rPAdV−gp55経口経路
47日目:2匹の、感染の無い、年齢および体重が一致するブタを、チャレンジウイルス対照として持ち込んだ
49日目:無感染対照を含めてすべてのブタに、致命的な用量のCSFV「Weybridge」株(1000TCID50)を皮下注射によりチャレンジした。抗体投与後、直腸温度を毎日記録し、すべてのブタについて、食欲減退、横臥姿勢、下痢、および足の発赤として明らかになる疾病の臨床的徴候を毎日監視した。ブタを実験の終わりかまたは臨床的に重症な疾病を示した時に安楽死させ、CSFV抗原を検出のために脾臓を取り出した。安楽死させたすべてのブタについて、死後検査を実施した。
PAdV−4繊維を含む転移ベクターの生成。ヌクレオチドを配列決定したところ、転移ベクターpJJ743が、PAdV−3 TPL配列の下流にPAdV−4繊維遺伝子を含むことが確認された(図1c)。
改変繊維プロファイルを有するrPAdV−gp55の効力をテストするためのブタ臨床試験。PAdV−3およびPAdV−4の血清型の両方の繊維を含む改変rPAdV−gp55ワクチンの効力をテストするため、大型白色ブタのグループに、非改変または改変のワクチンを2回投与し、致命的CSFVチャレンジに対する感受性を決定した。さらに、経口経路で投与した場合に、改変ワクチンが中和抗体を誘発して防御を与える能力をテストした。
Claims (41)
- アデノウイルスを含む組換え型アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含み、該アデノウイルスに対して異種である第2の繊維遺伝子をさらに含み、該第2の繊維遺伝子が、該第2の繊維遺伝子を安定して発現する細胞株中で該組換え型アデノウイルスを増殖させることにより該組換え型アデノウイルスによって取得される、組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、ブタ、ヒト、トリ、ウシ、ウマおよびヒツジのアデノウイルスからなる群より選択されるアデノウイルスベクターである、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクターを含む、組成物。
- 薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスが、組換え型PAdV−1、組換え型PAdV−2、組換え型PAdV−3、組換え型PAdV−4、組換え型PAdV−5、組換え型PAdV−6、および組換え型PAdV−7からなる群より選択される組換え型ブタアデノウイルスである、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記アデノウイルスが、組換え型ヒトアデノウイルス(HAdV)、組換え型ウシアデノウイルス(BAdV)、組換え型ヒツジアデノウイルス(OAdV)、組換え型マウスアデノウイルス(MAdV)、組換え型サルアデノウイルス(SAdV)、または組換え型イヌアデノウイルス(CAdV)である、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記第2の繊維タンパク質が、PAdV−1、PAdV−2、PAdV−3、PAdV−4およびPAdV−5から選択される繊維タンパク質である、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記組換え型アデノウイルスベクターが、前記第1の繊維タンパク質または前記第2の繊維タンパク質とは異なる第3の繊維タンパク質をさらに含む、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記組換え型PAdVが組換え型PAdV−3である、請求項5に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記組換え型ベクターが、PAdV−4由来の繊維タンパク質を含む、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記組換え型アデノウイルスベクターが複製可能型である、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記組換え型PAdVが複製欠損型である、請求項1に記載の組換え型ブタアデノウイルスベクター。
- 前記組換え型PAdVが、前記PAdVゲノムの必須領域に挿入される異種ヌクレオチド配列を含み、前記繊維遺伝子を安定して発現する前記細胞株が、該異種ヌクレオチド配列が内部に挿入された該PAdVゲノムの該必須領域も発現する、請求項12に記載の組換え型ブタアデノウイルスベクター。
- 前記組換え型アデノウイルスが、前記アデノウイルスゲノムの非必須領域内に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
- 前記異種ヌクレオチド配列が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項14に記載の方法。
- ブタアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含むアデノウイルスを含む宿主細胞であって、該宿主細胞が、該アデノウイルスとは異種であってブタアデノウイルスによって感染され得る繊維遺伝子を発現する組換え細胞である、宿主細胞。
- 前記細胞が哺乳類細胞またはトリ細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、ブタ細胞、ヒト細胞、ウシ細胞、およびヒツジ細胞からなる群より選択される哺乳類細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が組換え型ブタ細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 哺乳類被験体に免疫応答を誘発することが可能な組成物であって、該組成物が、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
- 哺乳類被験体に免疫応答を誘発するための方法であって、請求項20に記載の組成物を該哺乳類被験体に投与することを含む、方法。
- 前記哺乳類被験体がブタである、請求項21に記載の方法。
- アデノウイルスを調製する方法であって、
a.アデノウイルス繊維遺伝子を発現する組換え型宿主細胞を、該細胞がアデノウイルスに感染するのに適する条件下で培養することと、
b.キャプシド形成に必須の前記アデノウイルス配列と、異種タンパク質をコードする異種遺伝子とを含む組換え型アデノウイルスベクターに該細胞を接触させることであって、該組換え型アデノウイルスが、該宿主細胞中の該繊維遺伝子とは異なる繊維遺伝子を含むことと、
必要に応じて該アデノウイルスを収集することと
を包含する、方法。 - 前記収集されたアデノウイルスベクターが、前記組換え型宿主細胞に接触しない前記アデノウイルスベクターと比べて、より広範な組織特異性を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターは、複製に非必須の1つ以上のアデノウイルスタンパク質の一部または全部が必要に応じて欠失されている、請求項23に記載の方法。
- 前記異種タンパク質が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質である、請求項23に記載の方法。
- 哺乳類宿主を感染症に対して防御するためのワクチンであって、請求項1に記載の組換え型アデノウイルスベクター、および必要に応じて薬学的に許容可能な賦形剤を含む、ワクチン。
- 前記非必須領域が、ブタアデノウイルスゲノムの、E3領域、E4のORF1−2および4−7、E4の末端とITRとの間の領域からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- アデノウイルス繊維遺伝子を発現する宿主細胞、および発現制御配列の制御下に異種タンパク質をコードする核酸を含む組換え型アデノウイルスベクターを含む組成物であって、該組換え型アデノウイルスベクターが、該ベクターのアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含む、組成物。
- 前記宿主細胞が、前記組換え型ブタアデノウイルスベクターに感染している、請求項29に記載の組成物。
- 動物にワクチンを接種する方法であって、治療上有効な量の請求項27に記載のワクチンを該動物に投与することを包含する、方法。
- 組換え型アデノウイルスベクターの宿主組織細胞特異性を増大させる方法であって、該組換え型アデノウイルスの繊維タンパク質と異なる第2の繊維タンパク質を含む宿主細胞中で該組換え型アデノウイルスを増殖させることを包含する、方法。
- 前記組換え型アデノウイルスベクターが、組換え型PADV−1、組換え型PADV−2、組換え型PADV−3、組換え型PADV−4、および組換え型PADV−5から選択される組換え型ブタアデノウイルスである、請求項32に記載の方法。
- 前記第2の繊維タンパク質が、PADV−1、PADV−2、PADV−3、PADV−4、およびPADV−5から選択される繊維タンパク質である、請求項33に記載の方法。
- 前記組換え型PADVが、前記第1の繊維タンパク質または前記第2の繊維タンパク質と異なる第3の繊維タンパク質をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記組換え型PADVが組換え型PADV−3である、請求項33に記載の方法。
- 前記組換え型PADV−3が、PADV−4由来の繊維タンパク質を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記組換え型PADVが複製可能型である、請求項33に記載の方法。
- 前記組換え型PADVが複製欠損型である、請求項33に記載の方法。
- 前記組換え型PADVが、PADVゲノムの非必須領域に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記異種ヌクレオチド配列が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項40に記載の方法。
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