KR20010020424A

KR20010020424A - 허혈성질환의 검출 또는 예지방법과 그 검출용키트

Info

Publication number: KR20010020424A
Application number: KR1019997010049A
Authority: KR
Inventors: 오다히로시; 사토노브유키; 니시카와마사쯔미; 세이키코수케; 우라데요시히로; 이구찌유타카; 이구찌나오미
Original assignee: 나까베 게이지로; 마루하 주식회사; 사지게이쪼; 오사카바이오사이엔스겐큐쇼
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2001-03-15
Also published as: WO1998049559A1; CA2289043A1; AU728558B2; AU7082898A; EP0999447A1; CA2289043C; US6461827B1; KR100546223B1; EP0999447A4; JP3654912B2

Abstract

본발명은 체액시료중의 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소 (이하 "hPGDS"라 칭한다.)의 농도를 지표로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법을 제공한다. 보다 특정하면 상기 방법은 피검자로 부터 채취한 체액시료중의 hPGDS 농도를 건강한 자에 대해서 설정한 기준범위와 비교하여 허혈성질환의 검출 또는 예측을 하는 방법이다.

Description

허혈성질환의 검출 또는 예지방법과 그 검출용키트 {Method for detecting or predicting ischemic disorders and the said detecting kit}

프로스타글라딘 D₂는 아라키돈산으로 부터 합성된 생리활성물질이며, 프로스타글라딘 H 로 부터 PGD 합성효소에 의해 생산된다. 이 hPGDS 는 근년 인간뇌척수액(human cerebrospinal fluid)중에 다량 존재하는 것이 알려져 있는 β-트레이스와 동일한 것이 명백해졌으며, 그 분포상태로 부터도 중추계질환과의 관련성이 기대되고 있다. 또한, 정액, 양수 등에도 분포하는 것으로 부터 생식능력의 판정(정자결핍증의 판단), 태아의 발육진단 등으로 이용도 고려되어 왔지만 허혈성질환과의 관련을 시사한 보고는 아직까지 없었다.

허혈성질환의 주요인인 동맥경화에는 비교적 두꺼운 동맥과 대동맥에 생기는 육상경화와 말초세소동맥에 보이는 세소동맥경화가 있다. 육상경화는 포말세포의 증생(增生), 섬유증식, 지질침착에 의한 내막비후(內膜肥厚), 혈전(血栓)형성, 석회화 따위를 초래하고, 내강(內腔)의 협착과 폐색에 이르며, 허혈에 의한 장애를 초래한다. 또 세소경맥동화는 내막에 결합직섬유가 증가하고 강한 초자화(硝子化)가 일어난다. 이 초자화는 중막에 미치는 일이 있으며, 동맥전체가 비후초자화되어 내강이 협소화되고, 허혈장애를 초래한다. 일반적으로 동맥경화의 성인에 관해서는 이하와 같이 고려되어 있다. 즉, 고지혈증, 고혈압 따위의 인자에 의해 내피세포의 장애가 일어나면 혈청성분과 함께 유혈중 단구가 동맥벽내에 침입해 마크로파아지

(macrophage)가 된다. 마크로파아지는 벽내에서 산화되어 변성된 산화 저비중 리포탄파크질(low density lipoprotein(LDL))을 넣어 포말세포가 된다.

자극받은 내피세포와 마크로파아지, 점착혈소판으로 부터는 성장인자와 유주(遊走)인자가 방출되어 내막으로의 평활근의 유주, 증식이 유도된다. 평활근도 지방을 축적해 팽화한다. 그 후, 내막비후, 육종형성, 협착, 유류형성, 반흔화를 초래하며, 병소가 완성되어 가는 것으로 된다.

관상동맥경화에 의해 혈류장애를 초래하는 것이, 협심증과 심근경색으로 되는 허혈성심질환이며, 뇌동맥에서는 뇌경색따위의 뇌순환장애가, 말초동맥에서는 폐색성동맥경화질환이 출현한다. 세소동맥경화는 내막, 중막의 초자화에 의한 비후, 변성(變姓)을 동반하며 뇌, 신(腎)장애가 현저하다.

어느 허혈성질환도 초기에는 전혀 증상이 없이 경과하며, 어느 정도 병변이 진행될 때까지 임상증상은 출현되지 않는다. 그러나 이 사이의 허혈성질환의 예측에 이용하는 유효한 생화학적 검출법은 아직까지 개발되어 있지 않다. 증상이 출현하고, 그것에 동반하는 임상검사의 이상을 초래하는 시점에서는 병소는 이미 종말상을 보이고 있다. 현시점에서는 초기병변을 정확히 반영하는 스크리닝법은 없으며, 혈청지질, 고혈압, 끽연등의 위험인자의 누적평가에 의존하고 있다.

상기와 같이 허혈성질환의 초기병변을 측정하는 방법은 없지만, 임상증상이 출현한 후에 있어서는 극히 엄격한 생활관리와 치료가 필요하기 때문에 초기병변을 정확히 반영하는 스크리닝법의 개발은 긴급한 과제로 되어 있다.

본발명은 체액시료중의 인간뇌형(human liptocalin-type) 프로스타글라딘 (prostagladin) D 합성효소 (이하 "hPGDS"라 칭한다.)의 농도를 측정하고, 그 농도를 지표로 허혈성질환을 검출 또는 예지하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 말초혈중에 있어서 hPGDS 농도와 HDL 농도와의 관계를 나타내는 그래프이다.

도 2는 좌심방심내막의 면역조직염색상이다.

도 3은 관상동맥의 초기동맥경화병변의 면역조직염색상이다.

도 4는 건강한 자와 협심증환자의 대심정맥혈중 hPGDS 농도를 비교한 그래프이다.

도 5는 PTCA 시행전의 관상동맥혈중과 대심정맥혈중 hPGDS 농도를 비교한 그래프이다.

도 6은 건강한 자와 협심증환자의 말초혈중 hPGDS 농도를 비교한 그래프이다.

도 7은 협심증환자의 대심정맥혈중 hPGDS 농도의 PTCA 시행후의 경시변화를 나타낸 그래프이다.

도 8은 건강한 자와 뇌경색환자의 뇌척수액중 hPGDS 농도를 비교한 그래프이다.

도 9는 건강한 자와 뇌경색환자의 말초혈중 hPGDS 농도를 비교한 그래프이다.

본발명자는 프로스타글라딘 D₂가 동맥경화에 동반하는 기질변화에 반대되는 작용-혈액응고억제작용등-을 나타내는 것으로 부터 프로스타글라딘 D₂를 합성하는 hPGDS 와 동맥경화와의 관계에 착안했다. 상기의 과제를 해결하기 위하여 먼저 건강한 자를 대상으로 혈액, 뇌척수액, 소변 등의 체액시료중의 hPGDS농도를 측정하고, 각각의 기준범위를 설정했다. 그리고 체액시료중의 hPGDS농도가 허혈성질환의 초기 표시로 되는 지 여부, 즉 체액시료중의 hPGDS농도와 허혈성질환과의 관계를 예의 검토한 결과 허혈성질환자로 부터 채취한 체액시료중의 hPGDS농도가 건강한 자로 부터 채취한 체액시료중의 hPGDS농도의 농도에 비해서 유의차가 있는 것을 보였다. 이와 같이 체액시료중의 hPGDS 의 동태를 추적하는 것에 의해 이러한 허혈성질환의 조기예측, 검출을 가능하게 하는데 이르렀다. 또한, 종래의 허혈성질환의 위험인자(고혈압, 혈청지질, 끽연)의 누적평가에 의한 예측방법과 본발명에 의한 예측방법과의 비교를 행한 결과, 종래의 방법에 비교해서 보다 초기단계에서 보다 높은 비율로 예측 가능한 것이 판명되었다.

즉, 본발명은 체액시료중의 hPGDS 를 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법이다. 체액시료로서는 혈액, 소변, 뇌척수액, 수액 또는 정액이 거론된다. 측정법으로서는 면역학적 측정법이 거론된다. 얻은 hPGDS 농도를 건강한 자의 hPGDS농도와 비교하는 것에 의해 허혈성질환을 검출 또는 예지하는 것이 바람직하다.

허혈성질환으로서는 동맥경화에 기인하는 질환, 색전(塞栓)에 기인하는 질환, 심근경색 또는 협심증 등의 허혈성심질환, 뇌경색, 뇌내출혈, 크모막하출혈 또는 경맥하출혈 등의 두개내출혈, 해이성동맥류 또는 복부대동맥류 등의 동맥류, 신경화증 또는 가와사키병의 후유증으로서 출현하는 심근경색 따위가 거론된다.

또한, 본발명은 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소에 특이한 항체를 포함하는 허혈성질환검출용 키트를 제공한다. 그 키트는 바람직하게는 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소에 특이한 제 1 및 제 2 항체를 포함한다. 이 경우에는 상기 제 2 항체는 바람직하게는 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소와 상기 제 1 항체와의 복합체에 결합하는 것이 가능하다. 게다가 상기 제 1 및 제 2 항체는 각각 모노크로날 항체인 것이 바람직하다. 상기 제 1 항체로서는 예를 들면 모노크로날 항체 7F5 (후술함)가 거론되며, 상기 제 2 항체로서는 예를 들면 모노크로날 항체 7F5

(후술함)가 거론된다.

이하에는 본발명을 상세히 설명한다.

허혈성질환환자의 체액시료중의 hPGDS 농도와 질환의 관계를 조사하면, 허혈성질환환자의 체액시료중의 hPGDS 농도는 건강한 자와 비교해서 변동하는 경향이 인정되고 있다. 따라서, 피검자의 체액시료를 채취해 hPGDS 농도를 측정하면 피검자가 허혈성질환을 일으키는 지 여부를 예측 또는 진단하는 것이 가능하다. 여기서 말하는 체액시료란 예를 들면 혈액, 소변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 정액 따위가 거론되지만 특별히 이것들에 한정되는 것은 아니다. hPGDS 농도의 측정은 통상의 분석법을 따르면 좋지만, 바람직하게는 면역학적측정법(EIA, ELISA, RIA, FIA 등)을 사용한다. hPGDS를 정확하고 간편하게 측정하는 방법이 가능하며, 구분임상검사의 경우에 있어서 다수의 생체시료를 동시처리하는 것이 가능한 실용성 관점으로 부터 볼 때 효소면역측정법 또는 방사면역측정법이 가장 바람직하다. 즉, hPGDS 에 대해서 특이한 반응성을 가지는 폴리크로날(polyclonal) 항체 또는 모노크로날 (monoclonal) 항체를 제조해 효소면역측정법 혹은 방사면역측정법에 의해 hPGDS를 직접적으로 정성적 및/또는 정량적으로 검출하는 방법이 실제 가능하다. 이러한 측정법으로서는 체액시료중의 hPGDS 양을 측정하는 목적이 달성되기만 하면 어떤 방법이라도 좋으며 특별히 한정하는 것은 아니다.

본발명의 바람직한 태양의 hPGDS의 검출방법으로서는 2항체 샌드위치 ELISA법을 사용한다. 2항체 샌드위치 ELISA법으로 사용하는 2개의 항체는 각각 별개의 에피타프(epitope)를 인식하는 항hPGDS 모노크로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 2개의 항체의 일방(제 1항체)는 얼마간의 담체, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 고상화되고, hPGDS를 고정화하기 위해서 사용하는 것이 가능하다. 타방의 항체(제 2항체)는 고정화된 hPGDS에 결합시키는 것이 가능한 항체라면 좋으며, 이 항체는 그 후의 검출을 위한 검출가능한 물질로서 표식해서 놓는 것이 바람직하다. 검출가능한 표식물질로서는 비오틴(biotin)을 들 수 있다. 비오틴을 검출하는 방법으로서는 공지의 방법을 이용하는 것이 가능하지만 바람직하게는 스트렙트아비딘(streptavidin)과 페록시다아제(peroxidase)와의 콘쥬게이트(conjugate)를 비오틴에 결합시키는 방법을 이용한다. 이와 같은 페록시다아제로서는 서양와사비(horseradish) 페록시다아제가 거론된다. 더우기 페록시다아제의 검출에는 그 페록시다아제의 작용에 의해 발색하는 물질을 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기의 두개의 항체 어느 것도 당업자라면 적절히 만드는 것이 가능하기 때문에 특별히 한정하지는 않지만 바람직하게는 세포주 1B7 이 생산하는 모노크로날 항체 1B7 및 세포주 7F5 이 생산하는 모노크로날 항체 7F5를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 세포주는 1B7에 대해서는 FERM BP-5709 (원기탁일 : 1995년 9월 21일)로 하며, 7F5에 대해서는 FERM BP-5711 (원기탁일 : 19968년 6월 6일)로 해서 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (일본 이바라키켄 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1번 3호)에 기탁되어 있다. 이러한 세포주로 부터 각각 대응하는 모노크로날 항체를 작성하는 방법으로서는 당업자에 공지된 방법을 이용하는 것이 가능하다. 상기의 항체를 사용하는 경우에는 바람직하게는 7F5를 제 1항체로 사용하고, 1B7을 제 2항체로 사용하는 것이 가능하다. 이상에 나타낸 물질을 사용하여 hPGDS 를 검출하기 위해서는 먼저 마이크로타이터 플레이트 등의 담체에 고상화된 제 1항체에 hPGDS를 결합시킨다. 이어서 고정화된 hPGDS에 비오틴으로 표식한 제 2항체를 결합시킨 후 비오틴 부분에 스트렙트아비딘-서양와사비 페록시다아제 콘쥬게이트를 결합시킨다. 최후에 서양와사비 페록시다아제의 작용에 의해 발색하는 물질을 첨가해서 발색시키고, 이것을 정량화한다. 발색물질로서는 TM-Blue (INTERGEN) 을 사용하는 경우에는 정지액으로서 0.5 N 황산을 가해서 교반한 후에 플레이트 리더 등을 이용하여 450 nm 의 경우에 흡광도를 측정하는 것에 의해 정량하는 것이 가능하다.

이와 같이 해서 얻은 값을 건강한 자에 대해서 설정한 기준범위와 비교한다. 이 기준범위는 액체시료의 종류에 따라 다르기 때문에 피검자에 대해서 측정하고자 하는 액체시료의 기준범위를 설정해 놓을 필요가 있다. 기준범위는 수인의 건강한 자로 부터 채취한 체액시료에 포함된 hPGDS 농도를 측정하고, 그 측정치에 기초한 기준범위를 설정하는 것이 가능하다. hPGDS 농도의 측정은 상술한 방법에 따라서 행하는 것이 가능하다. 측정치로 부터 기준범위의 설정은 당업자라면 적절히 설정하는 것이 가능하지만, 바람직하게는 측정치의 평균치±표준편차로 한다. 이와 같이 해서 설정한 기준범위와 피검자의 체액시료에서의 hPGDS 농도의 측정치를 비교하는 방법으로서는 당업자에 공지된 방법을 이용하는 것이 가능하지만 바람직하게는 상기 기준범위에 기초해서 결정한 기준치와의 비교방법을 이용한다. 이 경우에는 피검자에 관한 측정치가 기준치보다도 높다면 그 피검자는 허혈성질환에 이환(罹患)하거나 또는 이환되어 있는 가능성이 높다고 판단하는 것이 가능하다. 이와 같은 기준치로서는 바람직하게는 (평균치 + 2×표준편차) 를 이용한다.

본발명에 의해 심근경색, 협심증, 뇌경색, 뇌출형, 크모막하출혈, 경막하출혈, 해이성동맥류, 복부대동맥류, 신경화증 등의 허혈성질환의 검출 또는 예후관리 혹은 이러한 질환에 걸리는 가능성이 높은 자를 예지하는 것이 가능하게 된다. 허혈성질환의 검출 또는 허혈성질환에 이환할 가능성이 높은 자의 예지는 상술 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예후관리는 예를 들면 허혈설질환의 치료를 행한 후에 피검자로 부터 채취한 체액시료중의 hPGDS 농도를 모니터링하는 것에 의해 행하는 것이 가능하다.

더우기 본발명은 본발명을 실시하기 위해 사용가능한 허혈성질환검출용키트를 제공한다. 그 키트는 hPGDS에 특이한 항체를 포함하며, 이것에 의해 면역학적측정법에 의한 허혈성질환의 검출을 행하는 것이 가능하다. 면역학적 층정법으로서 2항체 샌드위치 ELISA 법을 이용한 경우에는 그 키트는 hPGDS 에 특이한 제 1 및 제 2항체를 포함하는 것이 가능하다. 제 2항체는 바람직하게는 hPGDS와 제 1항체와의 복합체에 결합하는 것이 가능하다. 이 목적을 달성하기 위해서는 예를 들면 인식하는 에피토프가 제 1항체가 인식하는 것과 다른 항체를 제 2항체로 이용하면 좋다. 또 제 1항체 및 제 2항체는 각각 모노크로날 항체인 것이 바람직하다. 이와 같은 제 1항체로서는 예를들면 모노크로날 항체 7F5가 거론되며 제 2항체로서는 예를 들면 모노크로날 항체 1B7 이 거론된다.

본발명의 키트는 더우기 항체의 고상화, 항체의 검출 등에 이용할 수 있는 물질 및/또는 기구를 포함해도 좋다. 항체의 고상화를 위해서는 마이크로타이터 플레이트 등의 담체, 탄산완충액 등의 고상화용 액체, 젤라틴 함유 PBS 등의 블로킹액(blocking solution) 등을 함유하는 것이 가능하다. 항체의 검출을 위해서는 항체를 미리 표식해 놓는 것이 바람직하며 그 경우에는 그 키트는 그 검출용 시약을 포함하는 것이 가능하다. 예를 들면 표식물질로서 비오틴을 사용하는 경우에는 검출용 시약으로서 스트렙트아비딘과 서양와사비 페록시다아제(HRP)의 콘쥬게이트 및 HRP 작용에 의해 발색하는 발색액을 포함하는 것이 가능하다. 또 필요하다면 설명서 등을 포함해도 좋다.

이하 실시예를 들어 본발명을 더욱 상세히 설명한다. 단 이러한 실시예에 의해서 본발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

건강한 자의 말초혈, 뇌척수액중의 hPGDS 농도측정과 각 샘플에 있어서의 기준범위 설정

건강한 자로 부터 상기 체액시료를 채취해 말초혈, 대심정맥혈, 뇌척수액중의 hPGDS 농도측정과 각 샘플에 있어서의 기준범위 설정을 했다. 말초혈은 12예, 대심정맥은 6예 또 뇌척수액은 8예 채취해서 이하의 방법에 따라 hPGDS 농도를 측정했다. hPGDS 농도측정은 2항체 샌드위치 ELISA 법에 의해 행했다. 즉, 처음으로 hPGDS와 결합가능한 항hPGDS 모노크로날 항체(크론 : 7F5)를 50 mM 탄산완충액 (pH 9.6)에 4.4 ㎍/ml 되도록 용해해서 96 웰(well) 마이크로타이터 플레이트에 300 ㎕/웰 씩 가해서 4 ℃에서 하룻밤 방치해 고상화한다. 다음에 이 플레이트를 인산완충생리식염수(PBS : pH 7.4)로 3회 세정한 후 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS (블로킹액 ; pH 7.4)를 300 ㎕/웰 씩 가해서 30 ℃에서 90분 인큐베이트 했다. 표준 hPGDS 용액은 뇌척수액(이하 CSF 라 한다)으로 부터 정제한 hPGDS 를 블로킹액에서 단계적 희석한 것을 이용해서 표준곡선을 작성했다. 전기와 같이 해서 조제한 블로킹 후의 플레이트를 0.05% Tween 20를 함유하는 PBS (T-PBS) 에서 3회 세정한 후 100 ㎕의 상기표준액 혹은 블로킹액으로 적절하게 희석한 샘플을 각 웰에 가해서 30℃에서 90분간 인큐베이트했다. 상기와 같이 항원을 반응시킨 플레이트를 T-PBS에서 3회 세정한 후 블로킹액에서 희석한 비오틴 표식화 항PGDS 모노크로날 항체(크론 : 1B7) 100 ㎕를 각 웰에 가해서 30℃에서 90분간 인큐베이트했다. 비오틴 표식화 항PGDS 모노크로날 항체는 hPGDS와 결합가능하며 고상화 모노크로날 항체 7F5와는 다른 에피토프를 인식하는 항 PGDS 모노크로날 항체 1B7을 비오틴화한 것을 이용했다. 이 플레이트를 세정한 후 블로킹액에서 희석한 스토렙토아비딘 HRP (서양와사비 페록시다아제) 콘쥬게이트 (Biosouce, Cat. : 6467) 100 ㎕를 각 웰에 가해서 30℃에서 90분간 인큐베이트했다. T-PBS에서 3회 세정한 후 발색액 (TM-blue : INTERGEN) 100㎕를 각 웰에 가해서 30℃에서 20분간 인큐베이트한 후, 정지액 (0.5N 황산)을 100㎕씩 웰에 가해서 플레이트 믹서에서 교반한후 반응을 정지시켰다. 시판 플레이트 리더(생화학공업사제 : 형번 Sk601)에 의해 450 nm의 흡광도를 측정했다.

이상의 방법에 있어서 사용한 2종의 모노크로날 항체 1B7 및 7F5 를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)는 WO 97/16461에 기재되어 있는 것과 같이 hPGDS로 면역한 동물로 부터 얻은 항체생산세포와 미에로마(myeloma) 세포와의 세포융합에 의해서 제작했다.

또 상기 모노크로날 항체를 생산하는 세포주는 각각 상기 모노크로날 항체명에 일치하며, 각각의 세포주는 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (일본 이바라키켄 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반3호)에, 1B7에 대해서는 FERM BP-5709 (원기탁일 : 1995년 9월 21일), 7F5에 대해서는 FERM BP-5711(원기탁일 : 1996년 6월 6일) 로 기탁되어 있다. 또 모노크로날항체의 제조는 이하와 같이 시행했다. 먼저, 쥐의 복강내에 프리스탄(pristane) 1.0 ml를 주사하고, 그 후 2주일째에 상기 세포주 1B7 또는 7F5 1 × 10⁸개를 쥐의 복강내에 이식하고, 2주간후에 복수(腹水)를 채취했다. 얻은 복수를 프로틴 A 어피너티 컬럼 (Protein A affinity column) 크로마토그래프에 의해서 분획하여 상기 모노크로날 항체를 3∼10 mg/ml 얻었다.

측정결과, 건강한 자로 부터 얻은 기준치범위는 말초혈에서는 0.373±0.024 ㎍/ml, 대심정맥에서는 0.424±0.034 ㎍/ml, 뇌척수액에서는 11.61±3.08 ㎍/ml 이였다 (평균치 ± 표준편차, 이하 같다).

실시예 2

건강한 자의 말초혈 hPGDS 농도와 각종혈액생화학 항목과의 관련

건강한 자로 부터 말초혈을 채취하고, hPGDS 농도측정을 하였다. 말초혈은 230예 채취하고, 실시예 1과 같은 방법에 의해 혈중 hPGDS 농도를 측정했다. 더우기 총콜레스테롤 (T-CHO), 고비중 리포탄파크질(high density lipoprotein(HDL)), 저비중 리포탄파크질(low density lipoprotein(LDL)), 트리글리세리드 (triglyceride(TG)) 및 요산의 농도도 동시에 일상방법에 의해 측정했다.

그결과, 말초혈에 관련하여 동맥경화의 위험요인의 판정에 이용되는 혈중 HDL치와 혈중 hPGDS 농도와의 사이에 부상관이 있는 것이 명백해졌다(도 1). 혈중 HDL 이외의 값과 혈중 hPGDS 농도와의 사이에는 특별한 상관관계가 보이지 않았다.

실시예 3

면역조직염색

hPGDS 와 결합가능한 항hPGDS 모노크로날 항체를 이용한 면역조직염색에 의해서 심장 각조직에 있어서 hPGDS 분포를 검토하였다.

표본제작수순은 이하와 같다. 고정은 4% 파라포름알데히드액(10%슈크로스 (sucrose)액함유, pH 7.5)에 의해 후고정을 하고(4℃, 3∼4시간) 이 조성의 고정액에 pH 3.5∼4.0 으로 되도록 초산을 첨가(5% 정도)한 고정액에 4 ℃에서 5시간에서 일주야 방치한다. 표본제작은 통상의 파라핀 표본제작법에 준해서 두께 6∼10μm의 절편(切片)을 제작한다. 이어서 통상의 탈파라핀 처리를 행하고 , 그 후 블로킹 처리까지 2 스텝처리를 필요로 한다. 즉, 처음에 0.3% 고산화수소함유 메탄올용액에 실온에서 플레이트를 30분 침적하고, 이어서 0.3% 펩신 0.01N 초산용액에 실온에서 5분간 침적한다. 다음에 10% Normal Sheep Serum Tris Buffer Seline, 0.05% Triton X100 에 실온에서 1시간 블로킹을 행한 후 1차항체를 반응시켜 계속해서 비오틴화한 2차항체를 반응시킨다. 발색에는 Histofine PAP 키트 (니치레이 社製) 를 이용해서 3', 3'-디아미노벤지딘과 과산화수소로 발색시킨다. 그 염색은 1% 크레실바이오렛트(cresyl violet) 30% 에탄올 용액으로 행하고, 탈수, 크실렌(xylene) 봉입을 하고, 관찰을 하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 hPGDS 는 좌심방의 심내막의 세포에서 양성이고, 형태학적으로 내피세포로 생각되었다. 또 관상동맥에 있어서도 일부의 내피세포에 일치해서 hPGDS 양성소견이 인정되었다. 이 일로 부터 hPGDS는 내피세포에 있어서 생산되고 있는 것이 명백해졌다. 게다가 도 3에 나타낸 바와 같이 관상동맥의 내막내의 초기육상동맥경화병변 (합성형 평활근의 콜로니) 주변에 hPGDS 의 양성소견이 인정되었다.

이것으로 부터 hPGDS는 동맥경화의 초기병변에 밀접하게 관련되어 있는 것이 명백해졌다.

실시예 4

협심증과 혈중 hPGDS 농도변동과의 관련성 검토

협심증환자의 경피경관적관혈관형성술 (Percutaneous Translumimal Coronary Angioplasty, 이하 "PTCA"로 생략함) 전의 혈액을 채취해 그 혈중 hPGDS 양을 측정하는 것에 의해 동맥경화와 동반하는 협심증과 혈중 hPGDS 농도와의 관계를 검토했다.

협심증환자 5예로 부터 PTCA 시행전에 말초혈, 대심정맥혈을 채취했다. 또 PTCA 시행후 시간경과에 따라 대심정맥으로 부터 채혈을 하고, 혈액을 원심분리하여 샘플로 했다. 혈중 hPGDS 농도의 측정은 실시예 1의 방법을 따랐다.

결과를 도 4,5,6,7에 나타내었다. 협심증환자의 대심정맥혈중 hPGDS 농도는 0.691±0.109 ㎍/ml 에서, 건강한 자의 대심정맥혈중 hPGDS농도 0.424±0.017 ㎍/ml에서 유의성이 높았고 또 PTCA 시행전의 대심정맥혈중 hPGDS농도 (0.691 ±0.109 ㎍/ml)가 관상동맥혈중 hPGDS농도 0.537±0.144 ㎍/ml 보다 유의성이 높으므로 관상동맥혈관의 동맥경화에 의해 반응적으로 hPGDS 생산량이 증가하고 있는 것이 명확해졌다.

또, 협심증환자의 말초혈중 hPGDS 농도도 0.480±0.098 ㎍/ml 로 건강한 자의 말초혈중 hPGDS농도 0.373±0.024 ㎍/ml와 비교하면 유의차가 인정되며, 심장혈관에서의 현상이 말초레벨에 반영되어 있다. 이것으로 부터 건강한 자의 말초혈중 hPGDS 농도의 값과의 비교에 의해서 협심증의 검출이 가능한 것이 명백해졌다.

PTCA 시행후의 시간경과에 따른 대심정맥혈중 hPGDS 농도는 시간경과와 함께 저하되며, 회복단계에서는 건강한 자의 대심정맥혈중레벨까지 저하되어 있었다. 이것으로 부터 본발명에 의해 협심증의 PTCA 시행후의 예후관리가 가능한 것으로 판명되었다.

실시예 5

혈중지질치와 혈중 hPGDS 치의 협심증환자에 있어서의 비교

내경동맥벽 에코소견, 상지(上肢)와 하지(下肢)의 혈압차, 부하심전도, 혈소판응집능, 안저(眼底)검사로 부터 동맥경화가 진행되고 있는 것으로 생각되는 협심증환자 3예, 건강한 자 3예의 말초혈중지질 및 말초혈중 hPGDS치를 측정하고, 동맥경화와의 관련성을 비교검토하였다. 또한 혈중지질에 관해서는 동맥경화의 위험인자인 고비중 리포탄파크질(이하 HDL로 칭한다), 저비중 리포탄파크질(이하 LDL로 칭한다)을 일상방법에 의해 측정했다. 일반적으로 HDL과 LDL에서 동맥경화의 위험성이 높다고 판단되는 것은 HDL 이 낮은 값, LDL이 높은 값을 나타내는 경우로 되어 있는 것으로 부터 각각 40 mg/dl 이하, 150 mg/dl 이상을 위험성 판정의 기준치로 하였다. 또 혈중 hPGDS 농도의 측정은 실시예 1의 방법에 준해서 하였으며, hPGDS 농도에 의한 동맥경화의 판정기준은 0.373 + 0.048 (평균치 + 2 × 표준편차) ㎍/ml 이상으로 하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

협심증 진단용 데이타로서의 혈중지질치와 혈중 hPGDS치의 비교

	hPGDS 농도(㎍/ml)	HDL(mg/dl)	LDL(mg/dl)
건강한 자 1	0.40	42	112
건강한 자 2	0.35	61	105
건강한 자 3	0.33	50	145
협심증환자 1	1.10	29 *	201 *
협심증환자 2	0.93	43	120
협심증환자 3	0.78	49	222 *
기준선	0.426 이상	40 이하	150 이상

위험성이 추측되는 값에는 * 표시를 하였다.

건강한 자 3예의 hPGDS 값은 어느 측정치도 정상이다. 협심증환자는 3예 모두 혈중 PGDS 농도의 기준치를 초과하고 있으며, 혈중 HDL 농도는 3예중 1예가 정상범위기준치 40 mg/dl 보다 적었다. 또 혈중 LDL 은 3예중 2예(1예는 저 HDL치를 나타내는 환자와는 다른 사람임)가 기준치 150mg/dl 을 초과하고 있다. 이 결과로 부터 혈중 PGDS 농도는 종래의 위험인자인 혈중 HDL, LDL 농도보다도 동맥경화라는 병태를 보다 반영하고 있으며, 동맥경화의 예측에 유용한 것을 알았다.

실시예 6

뇌경색과 뇌척수액중 hPGDS 농도와의 관련성 검토

뇌경색환자의 뇌척수액을 채취해서 그 뇌척수액중의 hPGDS 양을 측정하는 것에 의해 동맥경화에 동반하는 뇌경색과 혈중 hPGDS 농도와의 관계를 검토하였다.

뇌경색환자 5예로 부터 뇌척수액을 채취하고, 실시예 1과 같은 방법으로 hPGDS 농도를 측정하여 결과를 도 8에 나타내었다. 이와 같이 뇌경색환자의 뇌척수액중 hPGDS 농도는 27.308±3.52 ㎍/ml 로 건강한 자와 유의차가 있는 것이 판명되었다. 이것으로 부터 건강한 자의 뇌척수액중 hPGDS 농도의 값과의 비교에 의해 뇌경색의 검출이 가능한 것이 명백해졌다.

실시예 7

뇌경색과 혈중 hPGDS 농도와의 관련성 검토

뇌경색환자의 말초혈을 채취해서 그 말초혈중의 hPGDS 양을 측정하는 것에 의해 동맥경화에 동반하는 뇌경색과 혈중 hPGDS 농도와의 관계를 검토하였다.

뇌경색환자 5예로 부터 말초혈을 채취하고, 실시예 1과 같은 방법으로 hPGDS 농도를 측정하여 결과를 도 9에 나타내었다. 이와 같이 뇌경색환자의 말초혈 hPGDS 농도는 0.716±0.258 ㎍/ml 로 건강한 자의 값(0.373±0.024 ㎍/ml)과 유의차가 있는 것이 판명되었다. 이것으로 부터 건강한 자의 말초혈중 hPGDS 농도와의 비교에 의해 뇌경색의 검출이 가능한 것이 명백해졌다.

실시예 8

허혈성질환의 예측

동맥경화의 초기병변과 혈중 hPGDS 농도의 인과관계를 명백히 하기 위해, 또한 종래의 예측방법인 위험인자의 누적평가와 비교하기 위하여 동맥경화와 동반되는 허혈성질환을 가진 환자 7예에서 진단이 내려지기 전에 채취해 보관하고 있는 혈액을 측정하고, 본발명에 의해 예측된 양성율과 종래의 방법에 의해 예측되는 양성율에 대해서 비교검토를 하였다. 누적평가에는 일반방법에 의해 측정한 T-CHO, HDL, LDL, TG, 혈당, 요산, 끽연 유무의 7인자로 정해 각각 200 mg/dl 이상, 40 mg/dl 이하,150 mg/dl 이상, 150 mg/dl 이상, 140 mg/dl 이상, 7.5 mg/dl 이상, 20개피/일 이상에서 끽연경력 10년이상을 위험성의 판단기준으로 하여 종합적으로 판단하였다. 또한, 본발명에서는 실시예 1의 방법에 준해서 환자의 혈청을 측정하고, 혈중농도가 0.373 + 0.048 (평균치 + 2 × 표준편차) ㎍/ml 이상을 판단기준으로 하였다. 결과를 표 2,3에 나타냈다.

혈중 hPGDS 농도에 의한 허혈성질환의 예측

	피검자 1	피검자 2	피검자 3	피검자 4	피검자 5	피검자 6	피검자 7
hPGDS농도(㎍/ml)	1.13 *	0.72 *	0.56 *	0.98 *	1.31 *	0.40	0.69 *
판정	+	+	+	+	+	-	+

기준치 : 0.426 ㎍/ml 이상. 기준치를 초과하는 값에는 *를 표시하였다.

T-CHO, HDL, LDL, TG, 혈당, 요산, 끽연 유무의 누적평가에 의한 허혈성질환 예측

	피검자 1	피검자 2	피검자 3	피검자 4	피검자 5	피검자 6	피검자 7
T-CHO	200	275 *	190	263 *	287 *	220 *	253 *
HDL	51	29 *	58	24 *	43	59	35 *
LDL	123	222 *	150 *	205 *	211 *	120	-
TG	142	157 *	40	162 *	155 *	56	82
혈당	100	94	88	111	184 *	126	96
요산	5	5.5	6.2	7.8 *	6.1	6.3	6.0
끽연	有 *	有 *	有 *	無 *	無 *	有 *	無 *
판정	-	+	-	+	+	-	+

기준치 : T-CHO : 220 이상, HDL : 40 이하, LDL : 150 이상, TG : 150 이상, 혈당 : 140 이상, 요산 7.5 이상, 끽연 : 有.

기준치를 초과하는 값에는 * 를 표시했다.

이것에 의하면, 종래법에서는 7예중 4예에서 위험율이 높다고 판정된 것에 대해서, 본발명에 의한 예측에서는 7예중 6예의 예측이 가능하였다. 이것으로 부터 본발명은 종래의 방법에 비해서 허혈성환자를 고율로 예측하는 것이 가능하다고 판명되었다.

본발명의 방법에 의해 허혈성질환의 검출 및 예지를 간편하고 고율로 행하는 것이 가능하다.

Claims

체액시료중의 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소의 농도를 지표로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항에 있어서, 상기 체액시료중의 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소의 농도가 면역학적 측정법에 의해 측정된 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 또는 제 2항에 있어서, 상기 체액시료중의 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소의 농도를, 건강한 자의 체액시료중의 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소의 농도와 비교하는 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 3 항에 있어서, 상기 체액시료가 혈액, 소변, 뇌척수액, 타액 또는 정액인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 동맥경화에 기인하는 질환인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 색전(塞栓)에 기인하는 질환인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 허혈성심질환인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 7 항에 있어서, 상기 허혈성심질환이 심근경색 또는 협심증인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 뇌경색인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 두개내출혈인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 10 항에 있어서, 상기 두개내출혈이 뇌내출혈, 크모막하출혈 또는 경막하출혈인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 동맥류인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 12 항에 있어서, 상기 동맥류가 해이성동맥류 또는 복부대동맥류인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 신경화증인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 허혈성질환이 가와사키병의 후유증으로 출현하는 심근경색인 것을 특징으로 하는 허혈성질환의 검출 또는 예지방법.
인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소에 특이한 항체를 포함하는 허혈성질환 검출용 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 허혈성질환 검출용 키트는 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소에 특이한 제 1 및 제 2항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성질환 검출용키트.
제 17 항에 있어서, 상기 제 2항체가 인간뇌형 프로스타글라딘 D 합성효소와 상기 제 1항체와의 복합체에 결합하는 것이 가능한 것을 특징으로 하는 허혈성질환 검출용키트.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 제 1항체 및 제 2항체의 일방 또는 쌍방이 모노크로날 항체인 것을 특징으로 하는 허혈성질환 검출용키트.